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特開2024-109885抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート投与によるＨＥＲ３変異がんの治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024109885
(43)【公開日】2024-08-14
(54)【発明の名称】抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート投与によるＨＥＲ３変異がんの治療
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4745 20060101AFI20240806BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240806BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240806BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20240806BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4745
A61K47/68
A61P35/00
A61K39/395 N
C07K16/30
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024086183
(22)【出願日】2024-05-28
(62)【分割の表示】P 2020548575の分割
【原出願日】2019-09-19
(31)【優先権主張番号】P 2018175510
(32)【優先日】2018-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】小山 久美子
(72)【発明者】
【氏名】塩瀬 能伸
(72)【発明者】
【氏名】上野 傑
(57)【要約】 （修正有）
【課題】抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを有効成分として含有する、ＨＥＲ３変異がんの治療剤を提供する。
【解決手段】抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、下式で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、治療剤。
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す。）
【選択図】図６
【解決手段】抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、下式で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、治療剤。
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す。）
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを有効成分として含有する、ＨＥＲ３変異がんの治療剤であり、
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、治療剤。
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【化1】
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを含有する、ＨＥＲ３変異がんの治療剤、及び／又は、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３変異がんを有することが確認された患者に投与することを特徴とする、がんの治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３；ＥｒｂＢ３としても知られる）は、受容体蛋白質チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体サブファミリーに属する膜貫通受容体である。ＨＥＲ３は、乳がん、肺がん、大腸がん等、様々な種類の癌において発現しており、ＨＥＲ２やＥＧＦＲ等のチロシンキナーゼ受容体等とヘテロ二量体を形成することによって、リン酸化を受け、がん細胞の増殖やアポトーシス抑制シグナルを誘導することが知られている（非特許文献１～３）。
【0003】
ＨＥＲ３には変異体が存在し、がんのドライバー変異の一つであることが知られている（非特許文献４～６）。このようなＨＥＲ３変異がんは、例えば、乳がんの４％（非特許文献７）、胃がんの１０％（非特許文献８）、卵巣がんの１％（非特許文献９）、大腸がんの１％（非特許文献５）、及び頭頸部がんの１％（非特許文献１０）に存在することが報告されている。
【0004】
ＨＥＲ２が過剰発現している状況下において、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、及びラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）等の抗ＨＥＲ２薬が、ＨＥＲ３変異がんに対し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで有効性を示したことが報告されている（非特許文献１１）。
【0005】
一方で、抗ＨＥＲ２薬であるネラチニブ（Ｎｅｒａｔｉｎｉｂ）を用いた臨床試験では、ＨＥＲ３変異がんに対する有効性が認められなかったことも報告されている（非特許文献１２）。
【0006】
抗ＨＥＲ２薬がＨＥＲ３変異がんに対し有効性を示さないケースが存在する理由の一つとして、ＨＥＲ３変異がんがＨＥＲ２の過剰発現とは独立して機能する状況が示唆されている。すなわち、ＨＥＲ３変異がんはＨＥＲ２が過剰発現していない状況下においてもがん細胞の増殖を誘導し得ることが報告されており（非特許文献１３、１４）、ＨＥＲ２が過剰発現していない状況下においては、抗ＨＥＲ２薬は、ＨＥＲ３変異がんに対し抗腫瘍効果を及ぼすことができないと考えられている。
【0007】
また、抗ＨＥＲ３抗体のＨＥＲ３変異がんに対する有効性を検証した研究も知られている（非特許文献１１）。しかし、ＨＥＲ２の過剰発現の有無にかかわらず抗ＨＥＲ３抗体がＨＥＲ３変異がんに対し明確な有効性を示した旨の報告は知られていない。また、通常、ＨＥＲ３の変異に伴い抗ＨＥＲ３抗体のＨＥＲ３への結合性が低下することが想定され、各種のＨＥＲ３変異に対して恒常的に優れた抗腫瘍活性を示す抗ＨＥＲ３抗体を取得することは困難と考えられる。従って、ＨＥＲ３変異がんの有効な治療法は未だに確立されていない。
【0008】
がん細胞表面に発現する抗原に結合し、かつ細胞に内在化できる抗体に、細胞毒性を有する薬物を結合させた抗体－薬物コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）は、がん細胞に選択的に薬物を送達できることによって、がん細胞内に薬物を蓄積させ、がん細胞を死滅させることが期待できる（非特許文献１５～１９）。
【0009】
抗体－薬物コンジュゲートの一つとして、抗ＨＥＲ３抗体とトポイソメラーゼＩ阻害剤であるエキサテカンの誘導体を構成要素とする抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが知られている（特許文献１）。抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのＨＥＲ３変異がんに対する有効性に関する報告は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】国際公開第２０１５／１５５９９８号
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Alimandi et al., Oncogene (1995) 10, 1813-1821.
【非特許文献2】deFazio et al., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498.
【非特許文献3】Naidu et al., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390.
【非特許文献4】Sergina et al., Nature (2007) 445, 437-41.
【非特許文献5】Jeong et al., Int. J. Cancer (2006) 119, 2986-7.
【非特許文献6】Ding et al., Nature (2008) 455, 1069-75.
【非特許文献7】Kan et al., Nature (2010) 466, 869-73.
【非特許文献8】Wang et al., Nat. Genet. (2011) 43, 1219-23.
【非特許文献9】Greenman et al., Nature (2007) 446, 153-8.
【非特許文献10】Stransky et al., Science (2011) 333, 1157-60.
【非特許文献11】Jaiswal et al., Cancer cell (2013) 23, 603-17.
【非特許文献12】Hyman et al., Cancer Res. (2017) Abstract CT001.
【非特許文献13】Mishra et al., Oncotarget (2017) 69, 114371-114392.
【非特許文献14】Mishra et al., Oncotarget (2018) 45, 27773-27788.
【非特許文献15】Ducry et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
【非特許文献16】Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
【非特許文献17】Damle, Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
【非特許文献18】Senter et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
【非特許文献19】Howard et al., J Clin Oncol (2011) 29, 398-405.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを含有する、ＨＥＲ３変異がんの治療剤、及び／又は、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３変異がんを有することが確認された患者に投与することを特徴とする、がんの治療方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、ＨＥＲ３変異がんに対し、優れた抗腫瘍活性を示すことを見出し、本発明を完成した。
【0014】
すなわち、本発明は、以下の［１］～［８５］を提供する。
［１］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを有効成分として含有する、ＨＥＲ３変異がんの治療剤。
［２］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］に記載の治療剤。
［３］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［１］に記載の治療剤。
［４］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［１］～［３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［５］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［１］～［３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１］～［５］のいずれか１項に記載の治療剤。
［７］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１］～［６］のいずれか１項に記載の治療剤。
［８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
［１］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを有効成分として含有する、ＨＥＲ３変異がんの治療剤。
［２］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］に記載の治療剤。
［３］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［１］に記載の治療剤。
［４］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［１］～［３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［５］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［１］～［３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１］～［５］のいずれか１項に記載の治療剤。
［７］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１］～［６］のいずれか１項に記載の治療剤。
［８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0015】
【化1】
【0016】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１］～［７］のいずれか１項に記載の治療剤。
［９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１］～［７］のいずれか１項に記載の治療剤。
［９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0017】
【化2】
【0018】
（式中、薬物リンカーは抗ＨＥＲ３抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１］～［７］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１０］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［１］～［９］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１１］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［１］～［９］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１２］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［１］～［９］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１３］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［１２］に記載の治療剤。
［１４］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［１］～［１３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［１］～［１３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１６］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］～［１５］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１７］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］～［１５］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３変異がんを有することが確認された患者に投与することを特徴とする、がんの治療方法。
［１９］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［１８］に記載の治療方法。
［２０］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［１８］に記載の治療方法。
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１］～［７］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１０］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［１］～［９］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１１］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［１］～［９］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１２］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［１］～［９］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１３］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［１２］に記載の治療剤。
［１４］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［１］～［１３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［１］～［１３］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１６］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］～［１５］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１７］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［１］～［１５］のいずれか１項に記載の治療剤。
［１８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３変異がんを有することが確認された患者に投与することを特徴とする、がんの治療方法。
［１９］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［１８］に記載の治療方法。
［２０］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［１８］に記載の治療方法。
【0019】
［２１］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［１８］～［２０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２２］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［１８］～［２０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２３］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１８］～［２２］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２４］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１８］～［２３］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［１８］～［２０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２２］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［１８］～［２０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２３］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１８］～［２２］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２４］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［１８］～［２３］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0020】
【化3】
【0021】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１８］～［２４］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１８］～［２４］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0022】
【化4】
【0023】
（式中、薬物リンカーは抗ＨＥＲ３抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１８］～［２４］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２７］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［１８］～［２６］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２８］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［１８］～［２６］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２９］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［１８］～［２６］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３０］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［２９］に記載の治療方法。
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［１８］～［２４］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２７］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［１８］～［２６］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２８］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［１８］～［２６］のいずれか１項に記載の治療方法。
［２９］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［１８］～［２６］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３０］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［２９］に記載の治療方法。
【0024】
［３１］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［１８］～［３０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３２］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［１８］～［３０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３３］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［１８］～［３２］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３４］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［１８］～［３２］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３５］
ＨＥＲ３変異がんの治療のための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３６］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［３５］に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３７］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［３５］に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３８］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［３５］～［３７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３９］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［３５］～［３７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４０］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［３５］～［３９］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４１］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［３５］～［４０］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４２］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［１８］～［３０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３２］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［１８］～［３０］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３３］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［１８］～［３２］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３４］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［１８］～［３２］のいずれか１項に記載の治療方法。
［３５］
ＨＥＲ３変異がんの治療のための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３６］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［３５］に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３７］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［３５］に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３８］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［３５］～［３７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［３９］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［３５］～［３７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４０］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［３５］～［３９］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４１］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［３５］～［４０］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４２］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0025】
【化5】
【0026】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［３５］～［４１］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４３］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［３５］～［４１］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４３］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0027】
【化6】
【0028】
（式中、薬物リンカーは抗ＨＥＲ３抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［３５］～［４１］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４４］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［３５］～［４３］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４５］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［３５］～［４３］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４６］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［３５］～［４３］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４７］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［４６］に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［３５］～［４７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［３５］～［４７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［５０］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［３５］～［４９］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［３５］～［４１］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４４］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［３５］～［４３］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４５］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［３５］～［４３］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４６］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［３５］～［４３］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４７］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［４６］に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［３５］～［４７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［４９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［３５］～［４７］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［５０］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［３５］～［４９］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
【0029】
［５１］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［３５］～［４９］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［５２］
ＨＥＲ３変異がんの治療用の医薬を製造するための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの使用。
［５３］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［５２］に記載の使用。
［５４］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［５２］に記載の使用。
［５５］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［５２］～［５４］のいずれか１項に記載の使用。
［５６］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［５２］～［５４］のいずれか１項に記載の使用。
［５７］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［５２］～［５６］のいずれか１項に記載の使用。
［５８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［５２］～［５７］のいずれか１項に記載の使用。
［５９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［３５］～［４９］のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
［５２］
ＨＥＲ３変異がんの治療用の医薬を製造するための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの使用。
［５３］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［５２］に記載の使用。
［５４］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［５２］に記載の使用。
［５５］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［５２］～［５４］のいずれか１項に記載の使用。
［５６］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［５２］～［５４］のいずれか１項に記載の使用。
［５７］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［５２］～［５６］のいずれか１項に記載の使用。
［５８］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［５２］～［５７］のいずれか１項に記載の使用。
［５９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0030】
【化7】
【0031】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［５２］～［５８］のいずれか１項に記載の使用。
［６０］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［５２］～［５８］のいずれか１項に記載の使用。
［６０］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0032】
【化8】
【0033】
（式中、薬物リンカーは抗ＨＥＲ３抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［５２］～［５８］のいずれか１項に記載の使用。
［６１］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［５２］～［６０］のいずれか１項に記載の使用。
［６２］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［５２］～［６０］のいずれか１項に記載の使用。
［６３］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［５２］～［６０］のいずれか１項に記載の使用。
［６４］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［６３］に記載の使用。
［６５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［５２］～［６４］のいずれか１項に記載の使用。
［６６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［５２］～［６４］のいずれか１項に記載の使用。
［６７］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［５２］～［６６］のいずれか１項に記載の使用。
［６８］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［５２］～［６６］のいずれか１項に記載の使用。
［６９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３変異がんの治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、ＨＥＲ３変異がんの治療方法。
［７０］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［６９］に記載の治療方法。
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［５２］～［５８］のいずれか１項に記載の使用。
［６１］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［５２］～［６０］のいずれか１項に記載の使用。
［６２］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［５２］～［６０］のいずれか１項に記載の使用。
［６３］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［５２］～［６０］のいずれか１項に記載の使用。
［６４］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［６３］に記載の使用。
［６５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［５２］～［６４］のいずれか１項に記載の使用。
［６６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［５２］～［６４］のいずれか１項に記載の使用。
［６７］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［５２］～［６６］のいずれか１項に記載の使用。
［６８］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［５２］～［６６］のいずれか１項に記載の使用。
［６９］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３変異がんの治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、ＨＥＲ３変異がんの治療方法。
［７０］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つである、［６９］に記載の治療方法。
【0034】
［７１］
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［６９］に記載の治療方法。
［７２］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［６９］～［７１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７３］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［６９］～［７１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７４］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［６９］～［７３］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［６９］～［７４］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
ＨＥＲ３変異がんにおけるＨＥＲ３変異が、Ｑ８０９Ｒである、［６９］に記載の治療方法。
［７２］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、［６９］～［７１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７３］
ＨＥＲ３変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、［６９］～［７１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７４］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［６９］～［７３］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７５］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリソソーム移行性が、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならない、［６９］～［７４］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７６］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0035】
【化9】
【0036】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［６９］～［７５］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７７］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［６９］～［７５］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７７］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0037】
【化10】
【0038】
（式中、薬物リンカーは抗ＨＥＲ３抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［６９］～［７５］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７８］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［６９］～［７７］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７９］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［６９］～［７７］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８０］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［６９］～［７７］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８１］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［８０］に記載の治療方法。
［８２］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［６９］～［８１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８３］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［６９］～［８１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８４］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［６９］～［８３］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８５］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［６９］～［８３］のいずれか１項に記載の治療方法。
で示される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、［６９］～［７５］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７８］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、［６９］～［７７］のいずれか１項に記載の治療方法。
［７９］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、［６９］～［７７］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８０］
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、［６９］～［７７］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８１］
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、［８０］に記載の治療方法。
［８２］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、［６９］～［８１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８３］
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、［６９］～［８１］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８４］
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、［６９］～［８３］のいずれか１項に記載の治療方法。
［８５］
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、［６９］～［８３］のいずれか１項に記載の治療方法。
【0039】
また、本発明は、以下の（１）～（４８）の通り表すこともできる。
（１）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを有効成分として含有する、ＨＥＲ３遺伝子変異がんの治療剤。
（２）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（１）に記載の治療剤。
（３）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（１）に記載の治療剤。
（４）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
（１）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを有効成分として含有する、ＨＥＲ３遺伝子変異がんの治療剤。
（２）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（１）に記載の治療剤。
（３）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（１）に記載の治療剤。
（４）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0040】
【化11】
【0041】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（１）～（３）のいずれか１項に記載の治療剤。
（５）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（１）～（４）のいずれか１項に記載の治療剤。
（６）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（１）～（５）のいずれか１項に記載の治療剤。
（７）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（１）～（６）のいずれか１項に記載の治療剤。
（８）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（７）に記載の治療剤。
（９）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（１）～（８）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１０）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（１）～（８）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１１）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（１）～（１０）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１２）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（１）～（１０）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１３）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３遺伝子変異がんを有することが確認された患者に投与することを特徴とする、がんの治療方法。
（１４）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（１３）に記載の治療方法。
（１５）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（１３）に記載の治療方法。
（１６）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（１）～（３）のいずれか１項に記載の治療剤。
（５）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（１）～（４）のいずれか１項に記載の治療剤。
（６）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（１）～（５）のいずれか１項に記載の治療剤。
（７）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（１）～（６）のいずれか１項に記載の治療剤。
（８）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（７）に記載の治療剤。
（９）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（１）～（８）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１０）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（１）～（８）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１１）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（１）～（１０）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１２）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（１）～（１０）のいずれか１項に記載の治療剤。
（１３）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３遺伝子変異がんを有することが確認された患者に投与することを特徴とする、がんの治療方法。
（１４）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（１３）に記載の治療方法。
（１５）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（１３）に記載の治療方法。
（１６）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0042】
【化12】
【0043】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（１３）～（１５）のいずれか１項に記載の治療方法。
（１７）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（１３）～（１６）のいずれか１項に記載の治療方法。
（１８）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（１３）～（１７）のいずれか１項に記載の治療方法。
（１９）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（１３）～（１８）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２０）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（１９）に記載の治療方法。
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（１３）～（１５）のいずれか１項に記載の治療方法。
（１７）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（１３）～（１６）のいずれか１項に記載の治療方法。
（１８）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（１３）～（１７）のいずれか１項に記載の治療方法。
（１９）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（１３）～（１８）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２０）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（１９）に記載の治療方法。
【0044】
（２１）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（１３）～（２０）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２２）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（１３）～（２０）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２３）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（１３）～（２２）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２４）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（１３）～（２２）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２５）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんの治療のための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２６）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（２５）に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２７）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（２５）に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２８）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（１３）～（２０）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２２）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（１３）～（２０）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２３）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（１３）～（２２）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２４）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（１３）～（２２）のいずれか１項に記載の治療方法。
（２５）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんの治療のための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２６）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（２５）に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２７）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（２５）に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２８）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0045】
【化13】
【0046】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（２５）～（２７）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２９）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（２５）～（２８）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３０）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（２５）～（２９）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３１）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（２５）～（３０）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３２）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（３１）に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３３）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（２５）～（３２）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３４）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（２５）～（３３）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３５）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（２５）～（３４）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３６）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（２５）～（３４）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３７）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんの治療用の医薬を製造するための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの使用。
（３８）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（３７）に記載の使用。
（３９）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（３７）に記載の使用。
（４０）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（２５）～（２７）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（２９）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（２５）～（２８）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３０）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（２５）～（２９）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３１）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（２５）～（３０）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３２）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（３１）に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３３）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（２５）～（３２）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３４）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（２５）～（３３）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３５）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（２５）～（３４）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３６）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（２５）～（３４）のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート。
（３７）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんの治療用の医薬を製造するための、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの使用。
（３８）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現している、（３７）に記載の使用。
（３９）
ＨＥＲ３遺伝子変異がんが、ＨＥＲ２を過剰発現していない、（３７）に記載の使用。
（４０）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートが、式
【0047】
【化14】
【0048】
（式中、Ａは抗ＨＥＲ３抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（３７）～（３９）のいずれか１項に記載の使用。
（４１）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（３７）～（４０）のいずれか１項に記載の使用。
（４２）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（３７）～（４１）のいずれか１項に記載の使用。
（４３）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（３７）～（４２）のいずれか１項に記載の使用。
（４４）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（４３）に記載の使用。
（４５）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（３７）～（４４）のいずれか１項に記載の使用。
（４６）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（３７）～（４４）のいずれか１項に記載の使用。
（４７）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（３７）～（４６）のいずれか１項に記載の使用。
（４８）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（３７）～（４６）のいずれか１項に記載の使用。
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである、（３７）～（３９）のいずれか１項に記載の使用。
（４１）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体である、（３７）～（４０）のいずれか１項に記載の使用。
（４２）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体である、（３７）～（４１）のいずれか１項に記載の使用。
（４３）
抗ＨＥＲ３抗体が、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、を含む抗体である、（３７）～（４２）のいずれか１項に記載の使用。
（４４）
抗ＨＥＲ３抗体の、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している、（４３）に記載の使用。
（４５）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７から８個の範囲である、（３７）～（４４）のいずれか１項に記載の使用。
（４６）
抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が７．５から８個の範囲である、（３７）～（４４）のいずれか１項に記載の使用。
（４７）
がんが、乳がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つである、（３７）～（４６）のいずれか１項に記載の使用。
（４８）
がんが、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである、（３７）～（４６）のいずれか１項に記載の使用。
【発明の効果】
【0049】
本発明により、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを含有する、ＨＥＲ３変異がんの治療剤、及び／又は、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを、ＨＥＲ３変異がんを有することが確認された患者に投与することを特徴とする、がんの治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】抗ＨＥＲ３抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図2】抗ＨＥＲ３抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図3】各種ＨＥＲ３安定発現細胞のＲＴ－ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動の結果（ＨＥＲ３の発現）を示す。
【図4】各種ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞のＲＴ－ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動の結果（ＨＥＲ３の発現）を示す。
【図5】各種ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞のＲＴ－ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動の結果（ＨＥＲ２の発現）を示す。
【図6】ＨＥＲ３安定発現細胞におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合性を示す。
【図7】ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合性を示す。
【図8】空ベクター導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図9】野生型ＨＥＲ３導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図10】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【0051】
【図11】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図12】変異型ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図13】変異型ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図14】変異型ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図15】変異型ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図16】変異型ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図17】変異型ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図18】変異型ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図19】変異型ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図20】空ベクター導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【0052】
【図21】野生型ＨＥＲ３導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図22】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図23】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図24】変異型ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図25】変異型ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図26】変異型ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図27】変異型ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図28】変異型ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図29】変異型ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図30】変異型ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【0053】
【図31】変異型ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図32】空ベクター導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図33】野生型ＨＥＲ３導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図34】変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）のＲＴ－ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動の結果（ＨＥＲ３の発現）を示す。
【図35】変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）のＲＴ－ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動の結果（ＨＥＲ２の発現）を示す。
【図36】変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合性を示す。
【図37】変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性を示す。
【図38】空ベクター導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図39】野生型ＨＥＲ３導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図40】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【0054】
【図41】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図42】変異型ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図43】変異型ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図44】変異型ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図45】変異型ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図46】変異型ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図47】変異型ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図48】変異型ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図49】変異型ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図50】空ベクター導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【0055】
【図51】野生型ＨＥＲ３導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図52】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図53】変異型ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図54】変異型ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図55】変異型ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図56】変異型ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図57】変異型ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図58】変異型ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図59】変異型ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図60】変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【0056】
【図61】変異型ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図62】変異型ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図63】空ベクター導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図64】野生型ＨＥＲ３導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現無し）に対する、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を示す。
【図65】ＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列（配列番号６９）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0057】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これによって本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0058】
［定義］
本発明において、「ＨＥＲ３」とは、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３；ＥｒｂＢ３としても知られる）と同義であり、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）とともに受容体蛋白質チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体サブファミリーに属する膜貫通受容体である。ＨＥＲ３は、乳がん、肺がん、大腸がん等、様々な種類の癌において発現しており、ＨＥＲ２やＥＧＦＲ等のチロシンキナーゼ受容体等とヘテロ二量体を形成することによって、リン酸化を受け、がん細胞の増殖やアポトーシス抑制シグナルを誘導することが知られている（Alimandi et al., Oncogene (1995) 10, 1813-1821、deFazio et al., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498、Naidu et al., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390）。
本発明において、「ＨＥＲ３」とは、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３；ＥｒｂＢ３としても知られる）と同義であり、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）とともに受容体蛋白質チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体サブファミリーに属する膜貫通受容体である。ＨＥＲ３は、乳がん、肺がん、大腸がん等、様々な種類の癌において発現しており、ＨＥＲ２やＥＧＦＲ等のチロシンキナーゼ受容体等とヘテロ二量体を形成することによって、リン酸化を受け、がん細胞の増殖やアポトーシス抑制シグナルを誘導することが知られている（Alimandi et al., Oncogene (1995) 10, 1813-1821、deFazio et al., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498、Naidu et al., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390）。
【0059】
本発明において、「ＨＥＲ３蛋白」という語は、ＨＥＲ３と同じ意味で用いている。ＨＥＲ３蛋白の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）法等、当業者に周知の方法を用いて検出することができる。また、ＨＥＲ３蛋白にＦｌａｇペプチドを導入し、抗Ｆｌａｇペプチド抗体を用いることにより、ＨＥＲ３蛋白の発現を検出することもできる。
【0060】
ＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列を配列番号６９（図６５）に示す。
【0061】
本発明において、「ＨＥＲ３遺伝子」とは、ＨＥＲ３蛋白をコードする遺伝子を意味する。ＨＥＲ３蛋白は、ＨＥＲ３遺伝子の遺伝子産物である。
【0062】
本発明において、「ＨＥＲ３変異」とは、ＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列に変異を有することを意味する。
【0063】
本発明において、「ＨＥＲ３変異がん」とは、ＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列に変異を有するがんを意味する。また、腫瘍組織全体にＨＥＲ３変異を有さなくてもＨＥＲ３変異を有するがん細胞を含むがんであれば、ＨＥＲ３変異がんに含まれる。
【0064】
本発明において、「ＨＥＲ３遺伝子変異」とは、ＨＥＲ３遺伝子に変異を有することを意味する。
【0065】
本発明において、「ＨＥＲ３遺伝子変異がん」とは、ＨＥＲ３遺伝子に変異を有するがんを意味する。また、腫瘍組織全体にＨＥＲ３遺伝子変異を有さなくてもＨＥＲ３遺伝子変異を有するがん細胞を含むがんであれば、ＨＥＲ３遺伝子変異がんに含まれる。ＨＥＲ３遺伝子変異は、遺伝子産物であるＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列に変異を及ぼし、ＨＥＲ３変異を生じさせる。
【0066】
ＨＥＲ３変異の具体例としては、例えば、ＨＥＲ３蛋白の１０４番目のアミノ酸であるＶ（バリン）がＬ（ロイシン）に置き換わっている変異（「Ｖ１０４Ｌ」とも言う）（Cancer Cell. 2013 May 13;23(5):603-17、Nat Genet. 2014 Aug;46(8):872-6、Cancer Res. 2014 Nov 1;74(21):6071-81、Cancer. 2016 Sep 1;122(17):2654-62、Nat Med. 2017 Jun;23(6):703-713、及びNature. 2018 Feb 8;554(7691):189-194等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の１０４番目のアミノ酸であるＶ（バリン）がＭ（メチオニン）に置き換わっている変異（「Ｖ１０４Ｍ」とも言う）（Hum Mutat. 2008 Mar;29(3):441-50、Cancer Cell. 2013 May 13;23(5):603-17、Genome Biol. 2014 Apr 1;15(4):R55、Cancer Res. 2014 Jun 15;74(12):3238-47、Nat Genet. 2014 Aug;46(8):872-6、及びAnn Oncol. 2016 Jan;27(1):127-33等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の２３２番目のアミノ酸であるＡ（アラニン）がＶ（バリン）に置き換わっている変異（「Ａ２３２Ｖ」とも言う）（Nat Genet. 2013 May;45(5):478-86、Cancer Cell. 2013 May 13;23(5):603-17、Cancer Cell. 2016 Feb 8;29(2):229-40、Cell Rep. 2016 Apr 26;15(4):857-865等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の２６２番目のアミノ酸であるＰ（プロリン）がＨ（ヒスチジン）に置き換わっている変異（「Ｐ２６２Ｈ」とも言う）（Cancer Cell. 2013 May 13;23(5):603-17、Gastroenterology. 2014 Feb;146(2):530-38.e5、及びNat Med. 2017 Jun;23(6):703-713等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の２８４番目のアミノ酸であるＧ（グリシン）がＲ（アルギニン）に置き換わっている変異（「Ｇ２８４Ｒ」とも言う）（Nature. 2008 Oct 23;455(7216):1069-75、Cancer Cell. 2013 May 13;23(5):603-17、Nat Genet. 2014 Jun;46(6):573-82、及びAnn Oncol. 2015 Aug;26(8):1704-9等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の２９７番目のアミノ酸であるＤ（アスパラギン酸）がＹ（チロシン）に置き換わっている変異（「Ｄ２９７Ｙ」とも言う）（PLoS One. 2014 Mar 5;9(3):e90459、Nat Genet. 2014 Jun;46(6):573-82、Nat Genet. 2014 Oct;46(10):1097-102、Ann Oncol. 2016 Jan;27(1):127-33、及びCancer. 2016 Sep 1;122(17):2654-62等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の３２５番目のアミノ酸であるＧ（グリシン）がＲ（アルギニン）に置き換わっている変異（「Ｇ３２５Ｒ」とも言う）（Nat Med. 2017 Jun;23(6):703-713等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の３５５番目のアミノ酸であるＴ（トレオニン）がＩ（イソロイシン）に置き換わっている変異（「Ｔ３５５Ｉ」とも言う）（Nat Med. 2017 Jun;23(6):703-713、及びNature. 2018 Feb 8;554(7691):189-194等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の８０９番目のアミノ酸であるＱ（グルタミン）がＲ（アルギニン）に置き換わっている変異（「Ｑ８０９Ｒ」とも言う）（Cancer Cell. 2013 May 13;23(5):603-17、Cell Rep. 2016 Apr 26;15(4):857-865、及びNat Med. 2017 Jun;23(6):703-713等を参照）、ＨＥＲ３蛋白の８４６番目のアミノ酸であるＳ（セリン）がＩ（イソロイシン）に置き換わっている変異（「Ｓ８４６Ｉ」とも言う）（Int J Cancer. 2006 Dec 15;119(12):2986-7、Nat Genet. 2014 Dec;46(12):1264-6、及びCell Rep. 2016 Apr 26;15(4):857-865等を参照）、及びＨＥＲ３蛋白の９２８番目のアミノ酸であるＥ（グルタミン酸）がＧ（グリシン）に置き換わっている変異（「Ｅ９２８Ｇ」とも言う）（Nat Genet. 2011 Oct 30;43(12):1219-23、Clin Cancer Res. 2016 Apr 1;22(7):1583-91、Cancer. 2016 Sep 1;122(17):2654-62、Clin Cancer Res. 2016 Dec 15;22(24):6061-6068、Cancer Res. 2016 Oct 15;76(20):5954-5961、及びPLoS Med. 2016 Dec 27;13(12):e1002201等を参照）を挙げることができる。
【0067】
なお、上記のＨＥＲ３変異のうち、特にＱ８０９Ｒを有するがんは、既存の抗ＨＥＲ２薬や抗ＨＥＲ３抗体に対し、強い抵抗性を示すことが示唆されている（Jaiswal et al., Cancer cell (2013) 23, 603-17）。
【0068】
本発明におけるＨＥＲ３変異は、ＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列に変異を有するものであれば特に限定はされないが、好適には、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｍ、Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ、Ｔ３５５Ｉ、Ｑ８０９Ｒ、Ｓ８４６Ｉ、及びＥ９２８Ｇからなる群より選択される少なくとも一つを挙げることができ、より好適にはＱ８０９Ｒを挙げることができる。
【0069】
ＨＥＲ３変異の有無は、例えば、がん患者から腫瘍組織を採取し、ホルマリン固定パラフィン包埋された検体（ＦＦＰＥ）をリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）又はマイクロアレイ解析等の方法を行うことにより確認することができる。
【0070】
また、ＨＥＲ３変異の有無は、がん患者から無細胞血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を採取し、次世代シークエンス（ＮＧＳ）等の方法を行うことにより確認することもできる（Sergina et al., Nature (2007) 445, 437-41、Jeong et al., Int. J. Cancer (2006) 119, 2986-7、Ding et al., Nature (2008) 455, 1069-75、Kan et al., Nature (2010) 466, 869-73、Wang et al., Nat. Genet. (2011) 43, 1219-23、Greenman et al., Nature (2007) 446, 153-8、Stransky et al., Science (2011) 333, 1157-60、Jaiswal et al., Cancer cell (2013) 23, 603-17、Hyman et al., Cancer Res. (2017) Abstract CT001、Mishra et al., Oncotarget (2017) 69, 114371-114392、Mishra et al., Oncotarget (2018) 45, 27773-27788等を参照）。
【0071】
本発明において、「ＨＥＲ３変異」という語は、ＨＥＲ３遺伝子変異と同じ意味で用いている。
【0072】
本発明において、「野生型ＨＥＲ３」とは、ＨＥＲ３変異がないＨＥＲ３蛋白を意味する。本発明において、野生型を「ＷＴ」と表すこともある。
【0073】
本発明において、「変異型ＨＥＲ３」とは、ＨＥＲ３変異があるＨＥＲ３蛋白を意味する。
【0074】
ＨＥＲ３安定発現細胞は、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム等を利用したトランスフェクションによる化学的遺伝子導入法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ソノポレーション、レーザー照射等による物理的遺伝子導入法、ウイルスベクターを利用した生物学的遺伝子導入法等により作製することができる。例えば、生物学的遺伝子導入法のうち、レンチウイルスを利用した場合では、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞等のパッケージング細胞にレンチウイルスタンパク質とエンベロープタンパク質の発現プラスミド及びＨＥＲ３発現プラスミドを共に導入後、培養上清よりレンチウイルス溶液を調整し、これを用いて腫瘍細胞を培養することにより、作製することができる。ここで、用いるＨＥＲ３発現プラスミドの種類により、野生型又は変異型ＨＥＲ３発現細胞を作り分けることができる。変異型ＨＥＲ３発現プラスミドは、ＨＥＲ３変異導入プライマーを用いて作製することができる。
【0075】
本発明において、「抗ＨＥＲ３抗体」とは、ＨＥＲ３に特異的に結合し、好ましくは、ＨＥＲ３と結合することによってＨＥＲ３発現細胞に内在化する活性を有する抗体、言い換えれば、ＨＥＲ３と結合した後、ＨＥＲ３発現細胞内に移動する活性を有する抗体を示す。
【0076】
本発明において、「ＨＥＲ２」とは、ヒト上皮増殖因子受容体２（ｎｅｕ、ＥｒｂＢ－２と呼ばれることもある）と同義であり、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４とともに受容体蛋白質チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体サブファミリーに属する膜貫通受容体である。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４とのヘテロ二量体形成により細胞内チロシン残基が自己リン酸化されて活性化することにより、正常細胞及び腫瘍細胞において細胞の増殖・分化・生存に重要な役割を果たすことが知られている。
【0077】
本発明において、「ＨＥＲ２蛋白」という語は、ＨＥＲ２と同じ意味で用いている。
【0078】
本発明において、ＨＥＲ２の「過剰発現」とは、ＨＥＲ２の発現が陽性と判定されることを示し、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）法によりＨＥＲ２の発現が３＋と判定されること、又は、免疫組織化学法によりＨＥＲ２の発現が２＋と判定され且つｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法によりＨＥＲ２の発現が陽性と判定されることを示す。免疫組織化学法や、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、ＨＥＲ２検査ガイド 乳癌編 第四版（乳癌ＨＥＲ２検査病理部会作成）等を参考に行うことができる。
【0079】
ＨＥＲ２過剰発現細胞は、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム等を利用したトランスフェクションによる化学的遺伝子導入法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ソノポレーション、レーザー照射等による物理的遺伝子導入法、ウイルスベクターを利用した生物学的遺伝子導入法等により作製することができる。例えば、生物学的遺伝子導入法のうち、レンチウイルスを利用した場合では、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞等のパッケージング細胞にレンチウイルスタンパク質とエンベロープタンパク質の発現プラスミド及びＨＥＲ２発現プラスミドを共に導入後、培養上清よりレンチウイルス溶液を調整し、これを用いて腫瘍細胞を培養することにより、作製することができる。さらに、先のＨＥＲ３発現プラスミド導入により得たレンチウイルス溶液を用いて、このＨＥＲ２過剰発現細胞を培養することにより、ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞を作製することができる。
【0080】
［抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート］
本発明において、「抗体－薬物コンジュゲート」とは、抗体に、細胞毒性を有する薬物を、リンカーを介して結合させた複合体のことを示す。抗体－薬物コンジュゲートとしては、例えば、米国特許第６２１４３４５号、国際公開第２００２／０８３０６７号、国際公開第２００３／０２６５７７号、国際公開第２００４／０５４６２２号、国際公開第２００５／１１２９１９号、国際公開第２００６／１３５３７１号、国際公開第２００７１１２１９３号、国際公開第２００８／０３３８９１号、国際公開第２００９／１００１９４号、国際公開第２００９／１３４９７６号、国際公開第２００９／１３４９７７号、国際公開第２０１０／０９３３９５号、国際公開第２０１１／１３０６１３号、国際公開第２０１１／１３０６１６号、国際公開第２０１３／０５５９９３号、国際公開第２０１４／０５７６８７号、国際公開第２０１４／０６１２７７号、国際公開第２０１４／１０７０２４号、国際公開第２０１４／１３４４５７号、及び国際公開第２０１４／１４５０９０号に記載のものを挙げることができ、好適には、国際公開第２０１４／０５７６８７号、及び国際公開第２０１４／０６１２７７号に記載のものであり、より好適には、国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載のものである。これらの抗体－薬物コンジュゲートは上記文献に記載の方法により製造することができる。
本発明において、「抗体－薬物コンジュゲート」とは、抗体に、細胞毒性を有する薬物を、リンカーを介して結合させた複合体のことを示す。抗体－薬物コンジュゲートとしては、例えば、米国特許第６２１４３４５号、国際公開第２００２／０８３０６７号、国際公開第２００３／０２６５７７号、国際公開第２００４／０５４６２２号、国際公開第２００５／１１２９１９号、国際公開第２００６／１３５３７１号、国際公開第２００７１１２１９３号、国際公開第２００８／０３３８９１号、国際公開第２００９／１００１９４号、国際公開第２００９／１３４９７６号、国際公開第２００９／１３４９７７号、国際公開第２０１０／０９３３９５号、国際公開第２０１１／１３０６１３号、国際公開第２０１１／１３０６１６号、国際公開第２０１３／０５５９９３号、国際公開第２０１４／０５７６８７号、国際公開第２０１４／０６１２７７号、国際公開第２０１４／１０７０２４号、国際公開第２０１４／１３４４５７号、及び国際公開第２０１４／１４５０９０号に記載のものを挙げることができ、好適には、国際公開第２０１４／０５７６８７号、及び国際公開第２０１４／０６１２７７号に記載のものであり、より好適には、国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載のものである。これらの抗体－薬物コンジュゲートは上記文献に記載の方法により製造することができる。
【0081】
細胞毒性を有する薬物としては、抗腫瘍効果を有し、リンカーに結合できる置換基や部分構造を有するものであれば特に制限はないが、例えば、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、カリチアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、シクロシチジン（Ｃｙｃｌｏｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、アウリスタチンＥ（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、メイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ピロロベンゾジアゼピン（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、及びこれらの誘導体を挙げることができ、好適には、カンプトテシン誘導体を挙げることができ、より好適には、エキサテカン（Ｅｘａｔｅｃａｎ）誘導体を挙げることができる。
【0082】
トポイソメラーゼＩ阻害剤であるエキサテカン（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン、（化学名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－２，３－ジヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）－ジオンとして表すこともできる））は、式
【0083】
【化15】
【0084】
で表される化合物である。
【0085】
本発明において、「薬物リンカー」とは、抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物とリンカー部分、言い換えれば、抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体以外の部分構造を示す。
【0086】
本発明において、「抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート」とは、抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＨＥＲ３抗体である抗体－薬物コンジュゲートを示す。抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートとしては、例えば、国際公開第２０１２／０１９０２４号、国際公開第２０１２／０６４７３３号、及び国際公開第２０１５／１５５９９８号に記載のものを挙げることができ、好適には、国際公開第２０１５／１５５９９８号に記載のものを挙げることができる。これらの抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、上記文献に記載の方法により製造することができる。
【0087】
本発明において好適に使用される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、式
【0088】
【化16】
【0089】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである。この薬物リンカーは、抗体の鎖間のジスルフィド結合部位（２箇所の重鎖－重鎖間、及び２箇所の重鎖－軽鎖間）において生じたチオール基（言い換えれば、システイン残基の硫黄原子）に結合している。
で示される薬物リンカーと、抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートである。この薬物リンカーは、抗体の鎖間のジスルフィド結合部位（２箇所の重鎖－重鎖間、及び２箇所の重鎖－軽鎖間）において生じたチオール基（言い換えれば、システイン残基の硫黄原子）に結合している。
【0090】
本発明において好適に使用される、上記の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、次式で示すこともできる。
【0091】
【化17】
【0092】
ここで、薬物リンカーは抗ＨＥＲ３抗体とチオエーテル結合によって結合している。また、ｎはいわゆる平均薬物結合数（ＤＡＲ； Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ）と同義であり、１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す。
【0093】
本発明において好適に使用される、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であり、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。
【0094】
本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの抗ＨＥＲ３抗体部分は、好適には、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体、又は、前記抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体である。
より好適には、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体、又は、前記抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体である。
【0095】
本発明において好適に使用される、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、がん細胞内に移行した後に、式
【0096】
【化18】
【0097】
で表される化合物を遊離することにより、抗腫瘍効果を発揮する。
【0098】
上記化合物は、本発明において好適に使用される、上記の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性の本体であると考えられ、トポイソメラーゼＩ阻害作用を有することが確認されている（Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research, 2016, Oct 15;22(20):5097-5108, Epub 2016 Mar 29）。
【0099】
上記化合物は、上記の抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートのリンカー部分が切断されることにより生じると考えられる、式
【0100】
【化19】
【0101】
で表される化合物のアミナール構造が分解することにより生じると考えられる。
【0102】
［抗ＨＥＲ３抗体の製造］
本発明で用いるＨＥＲ３蛋白は、ヒトのＨＥＲ３発現細胞から直接精製して使用するか、或は、抗原として使用する際には、当該細胞の細胞膜画分をＨＥＲ３蛋白として使用することができ、また、ＨＥＲ３をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、又は遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＨＥＲ３ ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、当該ベクターを転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中でインキュベートすることにより、ＨＥＲ３を合成することができる。或は他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を当該ベクターにて形質転換させ、ＨＥＲ３を発現させることによって、該蛋白質を得ることができる。また、前記の遺伝子操作によるＨＥＲ３発現細胞、又はＨＥＲ３を発現している細胞株をＨＥＲ３蛋白抗原として使用することも可能である。
ＨＥＲ３のＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は公的データベース上に公開されており、例えばＡＡＡ３５９７９（アミノ末端１９アミノ酸残基からなるシグナル配列を含む前駆体）、Ｍ３４３０９（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
本発明で用いるＨＥＲ３蛋白は、ヒトのＨＥＲ３発現細胞から直接精製して使用するか、或は、抗原として使用する際には、当該細胞の細胞膜画分をＨＥＲ３蛋白として使用することができ、また、ＨＥＲ３をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、又は遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＨＥＲ３ ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、当該ベクターを転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中でインキュベートすることにより、ＨＥＲ３を合成することができる。或は他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を当該ベクターにて形質転換させ、ＨＥＲ３を発現させることによって、該蛋白質を得ることができる。また、前記の遺伝子操作によるＨＥＲ３発現細胞、又はＨＥＲ３を発現している細胞株をＨＥＲ３蛋白抗原として使用することも可能である。
ＨＥＲ３のＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は公的データベース上に公開されており、例えばＡＡＡ３５９７９（アミノ末端１９アミノ酸残基からなるシグナル配列を含む前駆体）、Ｍ３４３０９（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号により参照可能である。
【0103】
また、上記ＨＥＲ３のアミノ酸配列において、１乃至１０個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、当該蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質もＨＥＲ３に含まれる。
【0104】
本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体は、公知の手段によって取得することができる。例えば、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるＨＥＲ３又はＨＥＲ３のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗ＨＥＲ３抗体を選別できる。
【0105】
また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497;Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y.(1980)）に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【0106】
なお、抗原は抗原蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現した抗原を精製すればよい。上記の遺伝子操作による抗原発現細胞、又は抗原を発現している細胞株、を動物に免疫する方法を用いることによっても抗体を取得できる。
【0107】
本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体であることが好ましく、又はヒト由来の抗体の遺伝子配列のみを有する抗体、すなわちヒト抗体であることが好ましい。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【0108】
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855,(1984)）。
【0109】
ヒト化抗体としては、異種抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Nature(1986) 321, p.522-525）、ＣＤＲ移植法によって、異種抗体のＣＤＲの配列に加えて、異種抗体の一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第９０／０７８６１号）、遺伝子変換突然変異誘発（ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ストラテジーを用いてヒト化した抗体（米国特許第５８２１３３７号）を挙げることができる。
【0110】
ヒト抗体としては、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いて作成した抗体（Tomizuka, K. et al., Nature Genetics(1997) 16, p.133-143;Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res.(1998) 26, p.3447-3448;Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73(Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999;Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97, p.722-727等を参照。）を挙げることができる。或いは、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイにより取得した抗体（Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002)43 (7), p.2301-2308;Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1(2), p.189-203;Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology(2002) 109(3), p.427-431等参照。）も挙げることができる。
【0111】
本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体には、抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明に係る抗体に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合又はＯ－結合炭水化物鎖への化学部分の結合を有する化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合又はＯ－結合型糖鎖の付加、Ｎ末端又はＣ末端のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化等）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってＮ末端にメチオニン残基が付加されたもの等が含まれる。また、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾体の意味に含まれる。この様な本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体の修飾体は、抗体の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
【0112】
また、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第００／６１７３９号、国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第２００７／１３３８５５号、及び国際公開第２０１３／１２００６６号等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体には当該糖鎖修飾が調節された抗体も含まれる。
【0113】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体では、その重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Journal of Chromatography A, 705: 129-134(1995)）、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Analytical Biochemistry, 360: 75-83(2007)）。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用等）には影響を及ぼさない。したがって、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体には、当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２のアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等も包含される。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか二種を組み合わせたものであってもよい。各欠失体の量比は本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体は、好ましくは、２本の重鎖の双方でカルボキシル末端のひとつのアミノ酸残基が欠失しているものを挙げることができる。
【0114】
本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体のアイソタイプとしては、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げることができる。また、これらの改変体も本発明にかかる抗ＨＥＲ３抗体として利用することができる。
【0115】
本発明において使用できる抗ＨＥＲ３抗体としては、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ， Ｕ３－１２８７）、Ｕ１－５９（国際公開第２００７／０７７０２８号）、ＡＶ－２０３（国際公開第２０１１／１３６９１１号）、ＬＪＭ－７１６（国際公開第２０１２／０２２８１４号）、Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ（ＭＥＨＤ－７９４５Ａ）（国際公開第２０１０／１０８１２７号）、Ｉｓｔｉｒａｔｕｍａｂ（ＭＭ－１４１）（国際公開第２０１１／０４７１８０号）、Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ（ＲＧ－７１１６）（国際公開第２０１４／１０８４８４号）、Ｓｅｔｉｂａｎｔｕｍａｂ（ＭＭ－１２１）（国際公開第２００８／１００６２４号）、ＲＥＧＮ－１４００（国際公開第２０１３／０４８８８３号）、ＺＷ－９（国際公開第２０１３／０６３７０２）、及びそれらの改変体、活性断片、修飾体等を挙げることができ、好適には、パトリツマブ、及びＵ１－５９を挙げることができる。これらの抗ＨＥＲ３抗体は、上記文献に記載の方法により製造することができる。
【0116】
［抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの製造］
本発明に係る抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの製造に使用される薬物リンカー中間体は、次式で示される。
本発明に係る抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの製造に使用される薬物リンカー中間体は、次式で示される。
【0117】
【化20】
【0118】
上記の薬物リンカー中間体は、Ｎ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド、という化学名で表すことができ、国際公開第２０１４／０５７６８７号、国際公開第２０１５／１５５９９８号、及び国際公開第２０１９／０４４９４７号等の記載を参考に製造することができる。
【0119】
本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、前述の薬物リンカー中間体と、チオール基（又はスルフヒドリル基とも言う）を有する抗ＨＥＲ３抗体を反応させることによって製造することができる。
【0120】
スルフヒドリル基を有する抗ＨＥＲ３抗体は、当業者周知の方法で得ることができる（Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, pp.56-136, pp.456-493, Academic Press(1996)）。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）等の還元剤を、抗体内鎖間ジスルフィド１個当たりに対して０．３乃至３モル当量用い、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤を含む緩衝液中で、抗ＨＥＲ３抗体と反応させることで、抗体内鎖間ジスルフィドが部分的若しくは完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗ＨＥＲ３抗体を得ることができる。
【0121】
さらに、スルフヒドリル基を有する抗ＨＥＲ３抗体１個あたり、２乃至２０モル当量の薬物リンカー中間体を使用して、抗体１個当たり２個乃至８個の薬物が結合した抗ＨＥＲ３抗体―薬物コンジュゲートを製造することができる。
【0122】
製造した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの抗体一分子あたりの平均薬物結合数の算出は、例えば、２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長における抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートとそのコンジュゲーション前駆体のＵＶ吸光度を測定することにより算出する方法（ＵＶ法）や、抗体－薬物コンジュゲートを還元剤で処理し得られた各フラグメントをＨＰＬＣ測定により定量し算出する方法（ＨＰＬＣ法）により行うことができる。
【0123】
抗ＨＥＲ３抗体と薬物リンカー中間体のコンジュゲーション、及び抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの抗体一分子あたりの平均薬物結合数の算出は、国際公開第２０１５／１５５９９８号等の記載を参考に実施することができる。
【0124】
［治療剤及び／又は治療方法］
本発明の治療剤及び／又は治療方法は、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを投与することを特徴とし、ＨＥＲ３変異がんの治療のために使用することができる。
本発明の治療剤及び／又は治療方法は、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートを投与することを特徴とし、ＨＥＲ３変異がんの治療のために使用することができる。
【0125】
本発明の治療剤及び／又は治療方法を使用することができるＨＥＲ３変異がんにおけるがんは、好適には、乳がん、肺がん（小細胞肺がん及び非小細胞肺がんを含む）、大腸がん（結腸直腸がんと呼ぶこともあり、結腸がん及び直腸がんを含む）、胃がん（胃腺がんと呼ぶこともある）、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、尿路上皮がん、前立腺がん、膵がん、膀胱がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、多形グリア芽細胞腫、肝臓がん、肝細胞がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、及び陰茎がんからなる群より選択される少なくとも一つであり、より好適には、乳がん、非小細胞肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、頭頸部がん、多形神経膠芽腫、及びメラノーマからなる群より選択される少なくとも一つである。
【0126】
本発明の治療剤及び治療方法は、哺乳動物に対して好適に使用することができるが、より好適にはヒトに対して使用することができる。
【0127】
本発明の治療剤及び治療方法の抗腫瘍効果は、例えば、腫瘍細胞に変異型ＨＥＲ３を発現させ、ＨＥＲ２過剰発現無し、及び／又は、ＨＥＲ２過剰発現有り、の状況下において、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの細胞増殖抑制活性を測定することにより確認することができる。また、変異型ＨＥＲ３を発現した腫瘍を被検動物に移植したモデルを作成し、本発明の治療剤又は治療方法を施すことによっても確認することができる。
【0128】
さらに、本発明の治療剤及び治療方法の抗腫瘍効果は、臨床試験においても確認することができる。すなわち、ＨＥＲ３変異が確認されたがん患者に、本発明の治療剤又は治療方法を施し、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）評価法、ＷＨＯ評価法、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ評価法、体重測定、及びその他の手法により確認することができ、完全奏効（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＣＲ）、部分奏効（Ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＰＲ）、進行（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）、客観的奏効率（Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒａｔｅ；ＯＲＲ）、奏効期間（Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＤｏＲ）、無憎悪生存期間（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－Ｆｒｅｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＰＦＳ）、全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＯＳ）等の指標により判定することができる。
【0129】
上述の方法により、本発明の治療剤及び治療方法のＨＥＲ３変異がんに対する抗腫瘍効果について、既存の抗がん剤に対する優位性を確認することができる。
【0130】
本発明の治療剤及び治療方法は、がん細胞の成長を遅らせ、増殖を抑え、さらにはがん細胞を破壊することができる。これらの作用によって、がん患者において、がんによる症状からの解放や、ＱＯＬの改善を達成でき、がん患者の生命を保って治療効果が達成される。がん細胞の破壊には至らない場合であっても、がん細胞の増殖の抑制やコントロールによってがん患者においてより高いＱＯＬを達成しつつより長期の生存を達成させることができる。
【0131】
本発明の治療剤は、患者に対しては全身療法として適用する他、がん組織に局所的に適用して治療効果を期待することができる。
【0132】
本発明の治療剤は、１種以上の薬学的に適合性の成分を含む医薬組成物として投与され得る。薬学的に適合性の成分は、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの投与量や投与濃度等に応じて、この分野において通常使用される製剤添加物その他から適宜選択して適用することができる。例えば、本発明の治療剤は、ヒスチジン緩衝剤等の緩衝剤、スクロース又はトレハロース等の賦形剤、並びにポリソルベート８０又は２０等の界面活性剤を含む医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」という。）として投与され得る。本発明の医薬組成物は、好適には、注射剤として使用することができ、より好適には、水性注射剤又は凍結乾燥注射剤として使用することができ、更により好適には、凍結乾燥注射剤として使用することができる。
【0133】
本発明の医薬組成物が水性注射剤である場合、好適には、適切な希釈液で希釈した後、静脈内に点滴投与することができる。希釈液としては、ブドウ糖溶液や、生理食塩液、等を挙げることができる。
【0134】
本発明の医薬組成物が凍結乾燥注射剤である場合、好適には、注射用水により溶解した後、必要量を適切な希釈液で希釈した後、静脈内に点滴投与することができる。希釈液としては、ブドウ糖溶液や、生理食塩液、等を挙げることができる。
【0135】
本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る導入経路としては、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、及び腹腔内の経路を挙げることができ、好適には、静脈内の経路を挙げることができる。
【0136】
本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、ヒトに対して、好適には、１週、２週、３週、又は４週に１回の間隔で投与することができ、さらにより好適には、３週に１回の間隔で投与することができる。
【0137】
また、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、ヒトに対して、好適には、１回あたり１．６ｍｇ／ｋｇ～１２．８ｍｇ／ｋｇの投与量で投与することができ、より好適には、１回あたり１．６ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、又は１２．８ｍｇ／ｋｇの投与量で投与することができ、更により好適には、１回あたり４．８ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、又は６．４ｍｇ／ｋｇの投与量で投与することができる。
【0138】
本発明の治療剤は、本発明で使用される抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート以外のがん治療剤と併用して投与することもでき、これによって抗腫瘍効果を増強させることができる。この様な目的で使用される他のがん治療剤は、本発明の治療剤と同時に、別々に、或は連続して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与されてもよい。この様ながん治療剤としては、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはないが、例えば、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ＣＰＴ－１１）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５－ＦＵ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カペシタビン（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、シクロフォスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）・ギメラシル（Ｇｉｍｅｒａｃｉｌ）・オテラシル（Ｏｔｅｒａｃｉｌ）配合剤、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、レゴラフェニブ（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、トリフルリジン（Ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）・チピラシル（Ｔｉｐｉｒａｃｉｌ）配合剤、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、アファチニブ（Ａｆａｔｉｎｉｂ）、オシメルチニブ（Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（Ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、フルベストラント（Ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ）、リュープロレリン（Ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ）、ゴセレリン（Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、レトロゾール（Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、アナストロゾール（Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、プロゲステロン製剤（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、及びトレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）からなる群より選択される少なくとも一つを挙げることができる。
【0139】
本発明の治療剤は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。例えば、がん患者は、本発明の治療剤による治療を受ける前及び／又は後、あるいは同時に放射線療法を受ける。
【0140】
本発明の治療剤は、外科手術と組み合わせた補助化学療法として使用することもできる。外科手術は、例えば、脳腫瘍の全部又は一部を物理的に取り除くことにより行われる。本発明の治療剤は外科手術の前に脳腫瘍の大きさを減じさせる目的で投与されてもよい（術前補助化学療法、又はネオアジュバント療法という）し、外科手術後に、脳腫瘍の再発を防ぐ目的で投与されてもよい（術後補助化学療法、又はアジュバント療法という）。
【実施例0141】
以下に示す例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるものではない。
【0142】
［実施例１］抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの製造
国際公開第２０１５／１５５９９８号に記載の製造方法に従って、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗ＨＥＲ３抗体（本発明において「ＨＥＲ３－Ａｂ（１）」と称する）を用いて、式
国際公開第２０１５／１５５９９８号に記載の製造方法に従って、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗ＨＥＲ３抗体（本発明において「ＨＥＲ３－Ａｂ（１）」と称する）を用いて、式
【0143】
【化21】
【0144】
で示される薬物リンカー中間体（以下「薬物リンカー中間体（１）」と称する）とのコンジュゲーション反応を行い、式
【0145】
【化22】
【0146】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）」と称する）を製造した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）における１抗体あたりの平均薬物結合数は７～８の範囲である。
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）」と称する）を製造した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）における１抗体あたりの平均薬物結合数は７～８の範囲である。
【0147】
［実施例２］ＨＥＲ３安定発現細胞の作製
実施例２－１：ＨＥＲ３変異発現レンチウイルス用ベクターの作製
１．ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒの作製
ＨＥＲ３ ｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１で示されるＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号１２で示されるＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）にて増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によりｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｐｕｒ（Ｔａｋａｒａ社製，＃６１８６）のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒ）。挿入配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。
実施例２－１：ＨＥＲ３変異発現レンチウイルス用ベクターの作製
１．ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒの作製
ＨＥＲ３ ｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１で示されるＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号１２で示されるＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）にて増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によりｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｐｕｒ（Ｔａｋａｒａ社製，＃６１８６）のＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒ）。挿入配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【0148】
２．ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒの作製
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒを鋳型とし、配列番号１３で示されるＦｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号１４で示されるＦｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎによりｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒを取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）のアミノ酸配列を配列番号１６に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒを鋳型とし、配列番号１３で示されるＦｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号１４で示されるＦｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎによりｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒを取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）のアミノ酸配列を配列番号１６に示した。
【0149】
３．各種ＨＥＲ３変異体発現プラスミドの作製
ｉ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号１７で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号１８で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）のアミノ酸配列を配列番号２０に示した。
ｉ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号１７で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号１８で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）のアミノ酸配列を配列番号２０に示した。
【0150】
ｉｉ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号２１で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号２２で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２３に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）のアミノ酸配列を配列番号２４に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号２１で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号２２で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２３に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）のアミノ酸配列を配列番号２４に示した。
【0151】
ｉｉｉ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号２５で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号２６で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２７に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）のアミノ酸配列を配列番号２８に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号２５で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号２６で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２７に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）のアミノ酸配列を配列番号２８に示した。
【0152】
ｉｖ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号２９で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号３０で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３１に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）のアミノ酸配列を配列番号３２に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号２９で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号３０で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３１に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）のアミノ酸配列を配列番号３２に示した。
【0153】
ｖ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号３３で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号３４で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３５に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）のアミノ酸配列を配列番号３６に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号３３で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号３４で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３５に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）のアミノ酸配列を配列番号３６に示した。
【0154】
ｖｉ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号３７で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号３８で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３９に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）のアミノ酸配列を配列番号４０に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号３７で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号３８で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３９に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）のアミノ酸配列を配列番号４０に示した。
【0155】
ｖｉｉ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号４１で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号４２で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４３に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）のアミノ酸配列を配列番号４４に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号４１で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号４２で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４３に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）のアミノ酸配列を配列番号４４に示した。
【0156】
ｖｉｉｉ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号４５で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号４６で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４７に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）のアミノ酸配列を配列番号４８に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号４５で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号４６で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４７に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）のアミノ酸配列を配列番号４８に示した。
【0157】
ｉｘ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号４９で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号５０で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５１に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）のアミノ酸配列を配列番号５２に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号４９で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号５０で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５１に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）のアミノ酸配列を配列番号５２に示した。
【0158】
ｘ）ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）Ｐｕｒ
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号５３で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号５４で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５５に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）のアミノ酸配列を配列番号５６に示した。
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号５３で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号５４で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５５に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）のアミノ酸配列を配列番号５６に示した。
【0159】
実施例２－２：ＨＥＲ２発現レンチウイルス用ベクターの作製
１．ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ２ Ｎｅｏの作製
ＨＥＲ２ ｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７で示されるＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号５８で示されるＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）にて増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によりｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｎｅｏ（Ｔａｋａｒａ社製，＃６１８４）のＮｏｔＩサイトに挿入した（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ２ Ｎｅｏ）。挿入配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。ＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５９に、ＨＥＲ２のアミノ酸配列を配列番号６０に示した。
１．ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ２ Ｎｅｏの作製
ＨＥＲ２ ｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７で示されるＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号５８で示されるＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）にて増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によりｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｎｅｏ（Ｔａｋａｒａ社製，＃６１８４）のＮｏｔＩサイトに挿入した（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ２ Ｎｅｏ）。挿入配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。ＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５９に、ＨＥＲ２のアミノ酸配列を配列番号６０に示した。
【0160】
実施例２－３：ＨＥＲ３安定発現細胞の作製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一夜培養を行った。ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）と、実施例２－１にて作製した各種ＨＥＲ３発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）Ｐｕｒ、及びｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）Ｐｕｒ）それぞれをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。また、空ベクター導入細胞を作製する目的で、上記と同様な方法により、プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｐｕｒ）をＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。導入２日後に培養上清を回収し、ＭＩＬＬＥＸ－ＨＰ ０．４５ ＵＭフィルター（メルク社製）に通し、レンチウイルス溶液を調製した。調製したレンチウイルス溶液の１／２量をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ Ｃｏａｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ（１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）へ移し、３７℃で一夜静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３日間培養した。培養終了後、細胞を剥がして全量を６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、０．５ μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）存在下での薬剤耐性を指標に安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）を取得した。取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、６００ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。次に、逆転写反応産物の１／２０容量を鋳型とし、配列番号６１で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６２で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｒｅｖ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃で２分加熱後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分を２５サイクルの条件で行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ３遺伝子発現を確認した。
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一夜培養を行った。ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）と、実施例２－１にて作製した各種ＨＥＲ３発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）Ｐｕｒ、及びｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）Ｐｕｒ）それぞれをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。また、空ベクター導入細胞を作製する目的で、上記と同様な方法により、プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｐｕｒ）をＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。導入２日後に培養上清を回収し、ＭＩＬＬＥＸ－ＨＰ ０．４５ ＵＭフィルター（メルク社製）に通し、レンチウイルス溶液を調製した。調製したレンチウイルス溶液の１／２量をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ Ｃｏａｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ（１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）へ移し、３７℃で一夜静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３日間培養した。培養終了後、細胞を剥がして全量を６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、０．５ μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）存在下での薬剤耐性を指標に安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）を取得した。取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、６００ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。次に、逆転写反応産物の１／２０容量を鋳型とし、配列番号６１で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６２で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｒｅｖ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃で２分加熱後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分を２５サイクルの条件で行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ３遺伝子発現を確認した。
【0161】
実施例２－４：ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現株の作製
１．ＨＥＲ２過剰発現細胞の作製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一夜培養を行った。ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）と実施例２－２にて作製したＨＥＲ２発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ２ Ｎｅｏ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。導入２日後に培養上清を回収し、ＭＩＬＬＥＸ－ＨＰ ０．４５ ＵＭフィルター（メルク社製）に通し、レンチウイルス溶液を調製した。調製したレンチウイルス溶液をＲｅｔｒｏＮｅｘｔｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）でコーティングしたプレート（６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）へ移し、３７℃で一夜静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３日間培養した。培養終了後、細胞を剥がして全量をＴ２５フラスコに播種し、８００μｇ／ｍＬ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）存在下での薬剤耐性を指標にＨＥＲ２安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）を取得した。取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、６００ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。次に、逆転写反応産物の１／２０容量を鋳型とし、配列番号６３で示されるＨＥＲ２ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６４で示されるＨＥＲ２ プライマー（Ｒｅｖ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃で２分加熱後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分を２３サイクルの条件で行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ２遺伝子発現を確認した。
１．ＨＥＲ２過剰発現細胞の作製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一夜培養を行った。ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）と実施例２－２にて作製したＨＥＲ２発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ＨＥＲ２ Ｎｅｏ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。導入２日後に培養上清を回収し、ＭＩＬＬＥＸ－ＨＰ ０．４５ ＵＭフィルター（メルク社製）に通し、レンチウイルス溶液を調製した。調製したレンチウイルス溶液をＲｅｔｒｏＮｅｘｔｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）でコーティングしたプレート（６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）へ移し、３７℃で一夜静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３日間培養した。培養終了後、細胞を剥がして全量をＴ２５フラスコに播種し、８００μｇ／ｍＬ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）存在下での薬剤耐性を指標にＨＥＲ２安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）を取得した。取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、６００ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。次に、逆転写反応産物の１／２０容量を鋳型とし、配列番号６３で示されるＨＥＲ２ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６４で示されるＨＥＲ２ プライマー（Ｒｅｖ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃で２分加熱後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分を２３サイクルの条件で行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ２遺伝子発現を確認した。
【0162】
２．ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞の作製
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一夜培養を行った。ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）と、実施例２－１にて作製した各種ＨＥＲ３発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）Ｐｕｒ、及びｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）Ｐｕｒ）それぞれをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。また、空ベクター導入細胞を作製する目的で、上記と同様な方法により、プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｐｕｒ）をＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。導入２日後に培養上清を回収し、ＭＩＬＬＥＸ－ＨＰ ０．４５ ＵＭフィルター（メルク社製）に通し、レンチウイルス溶液を調製した。調製したレンチウイルス溶液の１／２ 量をＲｅｔｒｏＮｅｘｔｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）でコーティングしたプレート（１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）へ移し、３７℃で一夜静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＨＥＲ２を過剰発現させたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３日間培養した。培養終了後、細胞を剥がして全量を６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、０．５μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）存在下での薬剤耐性を指標に安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）を取得した。取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、６００ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。次に、逆転写反応産物の１／２０容量を鋳型とし、配列番号６１で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６２で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｒｅｖ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃で２分加熱後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分を２５サイクルの条件で行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ３遺伝子発現を確認した。また、上記記載の方法によりＨＥＲ２遺伝子発現も確認した。
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一夜培養を行った。ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）と、実施例２－１にて作製した各種ＨＥＲ３発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）Ｐｕｒ、ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）Ｐｕｒ、及びｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）Ｐｕｒ）それぞれをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。また、空ベクター導入細胞を作製する目的で、上記と同様な方法により、プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α Ｐｕｒ）をＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞に導入した。導入２日後に培養上清を回収し、ＭＩＬＬＥＸ－ＨＰ ０．４５ ＵＭフィルター（メルク社製）に通し、レンチウイルス溶液を調製した。調製したレンチウイルス溶液の１／２ 量をＲｅｔｒｏＮｅｘｔｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）でコーティングしたプレート（１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）へ移し、３７℃で一夜静置した。ＰＢＳで洗浄後、ＨＥＲ２を過剰発現させたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３日間培養した。培養終了後、細胞を剥がして全量を６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、０．５μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）存在下での薬剤耐性を指標に安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）を取得した。取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、６００ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。次に、逆転写反応産物の１／２０容量を鋳型とし、配列番号６１で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６２で示されるＨＥＲ３ プライマー（Ｒｅｖ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃で２分加熱後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分を２５サイクルの条件で行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ３遺伝子発現を確認した。また、上記記載の方法によりＨＥＲ２遺伝子発現も確認した。
【0163】
結果を図３～図５に示す。図３は各種ＨＥＲ３安定発現細胞のＲＴ－ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動、図４及び図５は各種ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞のＲＴ－ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【0164】
ＨＥＲ３安定発現細胞では、ＨＥＲ３野生型及び変異型のいずれにおいても、ＨＥＲ３遺伝子発現を認めた。ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞では、ＨＥＲ２の過剰発現を認めるとともに、ＨＥＲ３野生型及び変異型のいずれにおいても、ＨＥＲ３遺伝子発現を認めた。
【0165】
実施例２－５：細胞表面ＨＥＲ３発現陽性率の確認
ＨＥＲ３安定発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標登録）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養プレートから剥離し、トリパンブルー処理により生細胞数を測定した。同数の生細胞を９６穴Ｕ底プレートに添加し、遠心分離により細胞を沈殿させ、メディウムをＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ製）に置換した。再度、遠心分離により細胞を沈殿させ、１μｇ／ｍＬに希釈調製したＰＥ ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃６３７３１０）を１００μＬ添加して細胞を懸濁した。ＰＥ ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙを添加しないＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて処理した細胞をコントロール群とした。各細胞を暗闇氷上にて６０分間反応させた後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。再度、１００μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁したのち、等量の４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（和光純薬製）を添加し、暗闇氷上で２０分間反応させた。Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄したのち、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）を用いて蛍光シグナルを測定し、測定結果はＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．０）を用いて解析した。表１は、ＰＥ ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙで処理した各種変異型ＨＥＲ３導入細胞株のＨＥＲ３発現陽性率を示す。
ＨＥＲ３安定発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標登録）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養プレートから剥離し、トリパンブルー処理により生細胞数を測定した。同数の生細胞を９６穴Ｕ底プレートに添加し、遠心分離により細胞を沈殿させ、メディウムをＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ製）に置換した。再度、遠心分離により細胞を沈殿させ、１μｇ／ｍＬに希釈調製したＰＥ ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃６３７３１０）を１００μＬ添加して細胞を懸濁した。ＰＥ ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙを添加しないＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて処理した細胞をコントロール群とした。各細胞を暗闇氷上にて６０分間反応させた後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。再度、１００μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁したのち、等量の４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（和光純薬製）を添加し、暗闇氷上で２０分間反応させた。Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄したのち、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）を用いて蛍光シグナルを測定し、測定結果はＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．０）を用いて解析した。表１は、ＰＥ ａｎｔｉ－ＤＹＫＤＤＤＤＫ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙで処理した各種変異型ＨＥＲ３導入細胞株のＨＥＲ３発現陽性率を示す。
【0166】
【表1】
【0167】
細胞表面のＨＥＲ３発現率は６５．０％～８３．９％であり、これらの細胞間で抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの特性を比較する分には支障ない範囲であると判断した。
【0168】
［実施例３］ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞株に対する結合性の確認
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標登録）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養プレートから剥離し、トリパンブルー処理により生細胞数を測定した。同数の生細胞を９６穴Ｕ底プレートに添加し、遠心分離により細胞を沈殿させ、メディウムをＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ製）に置換した。再度、遠心分離により細胞を沈殿させ、１００μＬの氷冷したＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）希釈液（Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを用いた１／１０の段階希釈により１００ｎＭ～０．１ｎＭに調製）に懸濁した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）を添加しないＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて処理した細胞をコントロール群とした。各細胞氷上にて６０分間反応させた後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。さらにＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ、又は１０μｇ／ｍＬに希釈調製した二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ－２１４４５）を１００μＬ添加して細胞を懸濁した。暗闇氷上で６０分間反応させた後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。１００μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁したのち、等量の４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（和光純薬製）を添加し、暗闇氷上で２０分間反応させた。Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄したのち、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）を用いて蛍光シグナルを測定し、測定結果はＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．０）を用いて解析した。なお、細胞でのＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）由来の蛍光シグナルを定量するため、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて処理したコントロール群とのシグナルを差し引いた値を使用した。
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標登録）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）にて培養プレートから剥離し、トリパンブルー処理により生細胞数を測定した。同数の生細胞を９６穴Ｕ底プレートに添加し、遠心分離により細胞を沈殿させ、メディウムをＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ製）に置換した。再度、遠心分離により細胞を沈殿させ、１００μＬの氷冷したＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）希釈液（Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒを用いた１／１０の段階希釈により１００ｎＭ～０．１ｎＭに調製）に懸濁した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）を添加しないＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて処理した細胞をコントロール群とした。各細胞氷上にて６０分間反応させた後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。さらにＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ、又は１０μｇ／ｍＬに希釈調製した二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ－２１４４５）を１００μＬ添加して細胞を懸濁した。暗闇氷上で６０分間反応させた後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。１００μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁したのち、等量の４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（和光純薬製）を添加し、暗闇氷上で２０分間反応させた。Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄したのち、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）を用いて蛍光シグナルを測定し、測定結果はＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．０）を用いて解析した。なお、細胞でのＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）由来の蛍光シグナルを定量するため、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒにて処理したコントロール群とのシグナルを差し引いた値を使用した。
【0169】
【0170】
各種変異型ＨＥＲ３安定発現細胞に対するＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合は濃度依存的に増加し、野生型ＨＥＲ３と同様の結合性を示した（図６）。ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合も濃度依存的に増加し、野生型ＨＥＲ３と同様の結合性を示した（図７）。また、この時に比較対象として、再度、ＨＥＲ２過剰発現無しの細胞を用いて結合性を測定し、ＨＥＲ２発現レベルによりＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合性に差異が認められないことを確認した（図７）。
【0171】
［実施例４］ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）による野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の増殖阻害活性は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）存在下で測定した。細胞の増殖は、非処理、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、及びＨＥＲ３－Ａｂ（１）処理群のａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）活性を測定することで評価した。陰性対照として、ＩｇＧ抗体と薬物リンカー中間体（１）とのコンジュゲーション反応により製造したＩｇＧ抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＩｇＧ－ＡＤＣ（１）」と称する）を用いた。
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の増殖阻害活性は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）存在下で測定した。細胞の増殖は、非処理、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、及びＨＥＲ３－Ａｂ（１）処理群のａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）活性を測定することで評価した。陰性対照として、ＩｇＧ抗体と薬物リンカー中間体（１）とのコンジュゲーション反応により製造したＩｇＧ抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＩｇＧ－ＡＤＣ（１）」と称する）を用いた。
【0172】
実施例４－１：細胞の処理
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は、５００ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの細胞懸濁液として、９６マイクロウェルプレート（コーニング，＃３９０４、黒壁透明ボトム）に播種した。翌日、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及び陰性対照としてＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の１０倍濃縮液を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０メディウムにて調製し、その１０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で６日間培養を行った。コントロールのウェルには１０μＬのメディウムのみを添加した。測定は、１条件あたり３ウェルないしは５ウェルで実施した。
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は、５００ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの細胞懸濁液として、９６マイクロウェルプレート（コーニング，＃３９０４、黒壁透明ボトム）に播種した。翌日、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及び陰性対照としてＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の１０倍濃縮液を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０メディウムにて調製し、その１０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で６日間培養を行った。コントロールのウェルには１０μＬのメディウムのみを添加した。測定は、１条件あたり３ウェルないしは５ウェルで実施した。
【0173】
実施例４－２：細胞増殖抑制効果の判定
６日間培養時における各種薬剤の細胞増殖抑制活性は、代謝活性のある生細胞を、ＡＴＰ活性を基準に評価した。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ７５７３）あるいは１００μＬのＡＴＰｌｉｔｅ １ｓｔｅｐ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃６０１６７３９）を９６マイクロウェルプレートの各ウェルに加え、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｈ＝０．９）で測定した。ＡＴＰ活性の低下を測定するため、各条件３ウェルないしは５ウェルずつの平均発光値を算出した。発光残存率（％）は無処理群の細胞と比較することで算出し、この値を細胞生存率（％）として解釈した。
６日間培養時における各種薬剤の細胞増殖抑制活性は、代謝活性のある生細胞を、ＡＴＰ活性を基準に評価した。１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ７５７３）あるいは１００μＬのＡＴＰｌｉｔｅ １ｓｔｅｐ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，＃６０１６７３９）を９６マイクロウェルプレートの各ウェルに加え、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｈ＝０．９）で測定した。ＡＴＰ活性の低下を測定するため、各条件３ウェルないしは５ウェルずつの平均発光値を算出した。発光残存率（％）は無処理群の細胞と比較することで算出し、この値を細胞生存率（％）として解釈した。
【0174】
結果を図８～図３３に示す。図８～図１９はＨＥＲ２過剰発現無しの野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞における各種薬剤の細胞増殖抑制活性を示した図である。図２０～図３１はＨＥＲ２過剰発現有りの野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞における各種薬剤の細胞増殖抑制活性を示した図である。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、野生型ＨＥＲ３導入細胞と同様に各種変異型ＨＥＲ３導入細胞に対しても細胞増殖抑制活性を示すことが判明した（図８～図１９）。ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞においても、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、野生型ＨＥＲ３導入細胞と同様に各種変異型ＨＥＲ３導入細胞に対しても細胞増殖抑制活性を示すことが判明した（図２０～図３１）。また、この時に比較対象として、再度、ＨＥＲ２過剰発現無しの細胞における各種薬剤の細胞増殖抑制活性を測定し（図３２、３３）、ＨＥＲ２発現レベルにより、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の細胞増殖抑制活性に差異は認められないことを確認した。
【0175】
［実施例５］変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞の作製と薬理評価
実施例５－１：ＨＥＲ３変異体発現プラスミドの作製
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号６５で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６６で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号６７に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）のアミノ酸配列を配列番号６８に示した。
実施例５－１：ＨＥＲ３変異体発現プラスミドの作製
ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）を鋳型とし、配列番号６５で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）、及び配列番号６６で示されるＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）にてプラスミド全長を増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）によるｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎにより、ＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）Ｐｕｒ）を取得した。配列はＤＮＡシーケンシングにより確認した。Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号６７に、Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）のアミノ酸配列を配列番号６８に示した。
【0176】
実施例５－２：変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）の作製
実施例５－１にて作製したＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）Ｐｕｒ）を用いて、実施例２－４と同様の方法により、ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）として、変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞を取得した。実施例２－４と同様の方法により、取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ３遺伝子発現（図３４）及びＨＥＲ２遺伝子発現（図３５）を確認した。
実施例５－１にて作製したＨＥＲ３変異体発現プラスミド（ｐＬＶＳＩＮ ＥＦ１α ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）Ｐｕｒ）を用いて、実施例２－４と同様の方法により、ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞（ｐｏｌｙｃｌｏｎｅ）として、変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞を取得した。実施例２－４と同様の方法により、取得した細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、ＨＥＲ３遺伝子発現（図３４）及びＨＥＲ２遺伝子発現（図３５）を確認した。
【0177】
実施例５－３：細胞表面ＨＥＲ３発現陽性率の確認
実施例５－２で作製された変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）について、実施例２－５と同様の方法により、細胞表面ＨＥＲ３発現陽性率を確認した。細胞表面のＨＥＲ３発現率は５８．８％であり、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの特性を比較する分には支障ない値であると判断した。
実施例５－２で作製された変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）について、実施例２－５と同様の方法により、細胞表面ＨＥＲ３発現陽性率を確認した。細胞表面のＨＥＲ３発現率は５８．８％であり、抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの特性を比較する分には支障ない値であると判断した。
【0178】
実施例５－４：変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）に対する結合性の確認
実施例５－２で作製された変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）について、実施例３と同様の方法により、各濃度におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の野生型および変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞株に対する結合性評価を行った。変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞株に対するＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合は濃度依存的に増加し、野生型ＨＥＲ３と同様の結合性を示した（図３６）。
実施例５－２で作製された変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）について、実施例３と同様の方法により、各濃度におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の野生型および変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞株に対する結合性評価を行った。変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞株に対するＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の結合は濃度依存的に増加し、野生型ＨＥＲ３と同様の結合性を示した（図３６）。
【0179】
実施例５－５：変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制
実施例５－２で作製された変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）について、実施例４と同様の方法により、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の野生型および変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制評価を行った。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、野生型ＨＥＲ３導入細胞と同様に変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞に対しても細胞増殖抑制活性を示すことが判明した（図３７）。
実施例５－２で作製された変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞（ＨＥＲ２過剰発現有り）について、実施例４と同様の方法により、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）、ＨＥＲ３－Ａｂ（１）、及びＩｇＧ－ＡＤＣ（１）の野生型および変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制評価を行った。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、野生型ＨＥＲ３導入細胞と同様に変異型ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）導入細胞に対しても細胞増殖抑制活性を示すことが判明した（図３７）。
【0180】
［実施例６］野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性の確認
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）存在下で測定した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、ｐＨ感受性を有する蛍光色素ｐＨｒｏｄｏにて標識し、リソソーム移行により発する蛍光シグナルを測定することで評価した。
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０メディウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）存在下で測定した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、ｐＨ感受性を有する蛍光色素ｐＨｒｏｄｏにて標識し、リソソーム移行により発する蛍光シグナルを測定することで評価した。
【0181】
実施例６－１：ｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の調製
ｐＨｒｏｄｏ標識には、ｐＨｒｏｄｏ（商標登録）ｉＦＬ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）を１０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ／５％ ｓｏｒｂｉｔｏｌ（ｐＨ５．５，ナカライテスク製）にて１ｍｇ／ｍＬに調製した。その１００μＬ（１００μｇ相当）を反応チューブに添加した。ｐＨｒｏｄｏ（商標登録）ｉＦＬ Ｒｅｄ ＳＴＰ ｅｓｔｅｒをＤＭＳＯに溶解し、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のタンパク質モル数に対して１０倍量に相当する量を反応チューブに加えて混和したのち、室温で６０分間反応させた。反応液をＺｅｂａ－ｓｐｉｎ（商標登録）脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）及びＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（Ｍｅｒｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて遠心することにより、ｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）を精製した。２８０ｎｍ及び５６６ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標登録）８０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定し、標識効率を算出した。
ｐＨｒｏｄｏ標識には、ｐＨｒｏｄｏ（商標登録）ｉＦＬ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用した。ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）を１０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ／５％ ｓｏｒｂｉｔｏｌ（ｐＨ５．５，ナカライテスク製）にて１ｍｇ／ｍＬに調製した。その１００μＬ（１００μｇ相当）を反応チューブに添加した。ｐＨｒｏｄｏ（商標登録）ｉＦＬ Ｒｅｄ ＳＴＰ ｅｓｔｅｒをＤＭＳＯに溶解し、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のタンパク質モル数に対して１０倍量に相当する量を反応チューブに加えて混和したのち、室温で６０分間反応させた。反応液をＺｅｂａ－ｓｐｉｎ（商標登録）脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）及びＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（Ｍｅｒｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて遠心することにより、ｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）を精製した。２８０ｎｍ及び５６６ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標登録）８０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定し、標識効率を算出した。
【0182】
実施例６－２：培養細胞におけるリソソーム移行
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞は、５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの細胞懸濁液として、９６マイクロウェルプレート（Ｃｅｌｌｃａｒｒｉｅｒ－９６ Ｕｌｔｒａ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）に播種した。翌日、メディウムを吸引したのち、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０メディウムにて１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ添加した。３０分後に、１００ｎｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を含有する１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０メディウムにて調製したｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の２倍濃縮液を５０μＬ、陰性対照にはｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の代わりにメディウムを添加した。蛍光シグナルをＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（商標登録）ハイスループット・ハイコンテンツイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、１０時間に亘って３０分毎にライブセルイメージング画像を取得した。測定は、１条件あたり３スポット／ウェルで実施した。取得した画像は、イメージ解析ソフトウェアＨａｒｍｏｎｙ（商標登録）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用いて定量解析した。なお、定量値は１細胞当たりの蛍光ドット数に対して１ドット当たりの蛍光強度を乗じた値（Ｔｒａｆｆｉｋｉｎｇ ｉｎｄｅｘ）として示した。
野生型および各種変異型ＨＥＲ３導入細胞は、５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの細胞懸濁液として、９６マイクロウェルプレート（Ｃｅｌｌｃａｒｒｉｅｒ－９６ Ｕｌｔｒａ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）に播種した。翌日、メディウムを吸引したのち、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０メディウムにて１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を５０μＬ添加した。３０分後に、１００ｎｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を含有する１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０メディウムにて調製したｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の２倍濃縮液を５０μＬ、陰性対照にはｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の代わりにメディウムを添加した。蛍光シグナルをＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（商標登録）ハイスループット・ハイコンテンツイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、１０時間に亘って３０分毎にライブセルイメージング画像を取得した。測定は、１条件あたり３スポット／ウェルで実施した。取得した画像は、イメージ解析ソフトウェアＨａｒｍｏｎｙ（商標登録）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用いて定量解析した。なお、定量値は１細胞当たりの蛍光ドット数に対して１ドット当たりの蛍光強度を乗じた値（Ｔｒａｆｆｉｋｉｎｇ ｉｎｄｅｘ）として示した。
【0183】
【0184】
ｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、野生型ＨＥＲ３導入細胞と同様に各種変異型ＨＥＲ３導入細胞に対しても濃度依存的なリソソーム移行性を示した（図３８～図４９）。これにより、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性は、野生型ＨＥＲ３発現細胞と、変異型ＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならないことが判明した。
【0185】
また、ｐＨｒｏｄｏ標識化ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、ＨＥＲ２過剰発現ＨＥＲ３安定発現細胞においても、濃度依存的なリソソーム移行性を示すことが判明した（図５０～図６２）。また、この時に比較対象として、再度、ＨＥＲ２過剰発現無しの細胞におけるＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性を確認した（図６３、６４）。これにより、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）のリソソーム移行性は、ＨＥＲ２を過剰発現しているＨＥＲ３発現細胞と、ＨＥＲ２を過剰発現していないＨＥＲ３発現細胞との間で実質的に異ならないことが判明した。
【0186】
以上の結果より、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）は、ＨＥＲ２の過剰発現の有無にかかわらず各種変異型ＨＥＲ３導入細胞に対し細胞増殖抑制活性を示すことが確認された。
【0187】
現在、ＨＥＲ３－ＡＤＣ（１）の臨床試験が進行中であるが、野生型ＨＥＲ３の症例と同様に、変異型ＨＥＲ３の症例に対しても臨床有効性が期待できることが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【0188】
配列番号１：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号２：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号３：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号４：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号５：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号６：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号７：抗ＨＥＲ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８：抗ＨＥＲ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：抗ＨＥＲ３抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号１０：抗ＨＥＲ３抗体の軽鎖のアミノ酸配列列
配列番号１１：ＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号１２：ＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号１３：Ｆｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号１４：Ｆｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号１５：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号１６：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）のアミノ酸配列
配列番号１７：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号１８：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号１９：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２０：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）のアミノ酸配列
配列番号２１：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号２２：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号２３：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２４：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）のアミノ酸配列
配列番号２５：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号２６：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号２７：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２８：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）のアミノ酸配列
配列番号２９：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号３０：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号２：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号３：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号４：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号５：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号６：抗ＨＥＲ３抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号７：抗ＨＥＲ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８：抗ＨＥＲ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：抗ＨＥＲ３抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号１０：抗ＨＥＲ３抗体の軽鎖のアミノ酸配列列
配列番号１１：ＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号１２：ＨＥＲ３ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号１３：Ｆｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号１４：Ｆｌａｇ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号１５：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号１６：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（ＷＴ）のアミノ酸配列
配列番号１７：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号１８：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号１９：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２０：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｌ）のアミノ酸配列
配列番号２１：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号２２：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号２３：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２４：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｖ１０４Ｍ）のアミノ酸配列
配列番号２５：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号２６：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号２７：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２８：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ａ２３２Ｖ）のアミノ酸配列
配列番号２９：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号３０：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
【0189】
配列番号３１：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号３２：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）のアミノ酸配列
配列番号３３：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号３４：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号３５：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号３６：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）のアミノ酸配列
配列番号３７：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号３８：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号３９：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４０：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）のアミノ酸配列
配列番号４１：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号４２：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号４３：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４４：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）のアミノ酸配列
配列番号４５：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号４６：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号４７：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４８：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）のアミノ酸配列
配列番号４９：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号５０：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号３２：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｐ２６２Ｈ）のアミノ酸配列
配列番号３３：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号３４：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号３５：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号３６：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ２８４Ｒ）のアミノ酸配列
配列番号３７：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号３８：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号３９：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４０：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｄ２９７Ｙ）のアミノ酸配列
配列番号４１：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号４２：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号４３：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４４：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｇ３２５Ｒ）のアミノ酸配列
配列番号４５：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号４６：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号４７：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４８：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｔ３５５Ｉ）のアミノ酸配列
配列番号４９：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号５０：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
【0190】
配列番号５１：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５２：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）のアミノ酸配列
配列番号５３：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号５４：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号５５：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５６：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）のアミノ酸配列
配列番号５７：ＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号５８：ＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号５９：ＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号６０：ＨＥＲ２のアミノ酸配列
配列番号６１：ＨＥＲ３ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号６２：ＨＥＲ３ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号６３：ＨＥＲ２ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号６４：ＨＥＲ２ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号６５：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号６６：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号６７：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号６８：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）のアミノ酸配列
配列番号６９：ＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列
配列番号５２：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｓ８４６Ｉ）のアミノ酸配列
配列番号５３：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号５４：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号５５：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５６：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｅ９２８Ｇ）のアミノ酸配列
配列番号５７：ＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号５８：ＨＥＲ２ ＩＦ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号５９：ＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号６０：ＨＥＲ２のアミノ酸配列
配列番号６１：ＨＥＲ３ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号６２：ＨＥＲ３ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号６３：ＨＥＲ２ プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号６４：ＨＥＲ２ プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号６５：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｆｗ）のヌクレオチド配列
配列番号６６：ＨＥＲ３変異導入プライマー（Ｒｅｖ）のヌクレオチド配列
配列番号６７：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号６８：Ｆｌａｇ－ＨＥＲ３（Ｑ８０９Ｒ）のアミノ酸配列
配列番号６９：ＨＥＲ３蛋白のアミノ酸配列
【図1】
【図2】
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【図4】
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【図10】
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【配列表】