特開 2024-109943 ブルトン型チロシンキナーゼに対するＴＡＬＥＮベースのおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳベースのゲノム編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024109943

(43)【公開日】2024-08-14

(54)【発明の名称】ブルトン型チロシンキナーゼに対するＴＡＬＥＮベースのおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳベースのゲノム編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240806BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240806BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240806BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240806BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240806BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240806BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240806BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240806BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N5/10 ZNA

C12N5/078

C12N15/867 Z

A61K35/28

A61P37/04

C12N15/54

C12N15/864 100Z

C12N5/10

【審査請求】有

【請求項の数】41

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024088147

(22)【出願日】2024-05-30

(62)【分割の表示】P 2020560207の分割

【原出願日】2019-04-26

(31)【優先権主張番号】62/664,035

(32)【優先日】2018-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】515045617

【氏名又は名称】シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート）

【住所又は居所原語表記】１９００ Ｎｉｎｔｈ Ａｖｅ． Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ ９８１０１ Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ジェイ． ローリングス

(72)【発明者】

【氏名】コートニー クラフ

(72)【発明者】

【氏名】イラム エフ． カーン

(57)【要約】

【課題】ブルトン型チロシンキナーゼに対するＴＡＬＥＮベースのおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳベースのゲノム編集の提供。
【解決手段】本開示は、ヒトＢＴＫ遺伝子を編集するための改善されたゲノム編集組成物および方法を提供する。本開示は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）の少なくとも１つの症候の予防、処置または軽減のためのゲノム編集された細胞をさらに提供する。本開示は、改善されたゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子を編集するための、ＴＡＬＥＮベースのおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのゲノム編集組成物および該ゲノム編集組成物を使用する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、配列番号９～１７に記載されているヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ；および
ｃ）機能的なＢＴＫ遺伝子またはその断片を含む修復テンプレート
を含むゲノム編集組成物であって、前記ゲノム編集組成物は、Ｂ細胞における内在性ＢＴＫ遺伝子を修復することができる、または、Ｂ細胞のゲノムに機能的なＢＴＫ遺伝子を挿入することができる、ゲノム編集組成物。

【請求項2】

請求項１に記載のゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項１に記載のゲノム編集組成物をコードするｍＲＮＡ。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物をコードするｃＤＮＡ。

【請求項5】

請求項１に記載のゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項6】

請求項１に記載のゲノム編集組成物を含む細胞。

【請求項7】

請求項１に記載のゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチドを含む細胞。

【請求項8】

請求項５に記載のベクターを含む細胞。

【請求項9】

請求項１に記載のゲノム編集組成物によって導入された１またはそれを超えるゲノム修飾を含む細胞。

【請求項10】

前記細胞が造血細胞である、請求項６～９のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項11】

前記細胞が造血幹または前駆細胞である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項12】

前記細胞がＣＤ３４^＋細胞である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項13】

前記細胞がＣＤ１３３^＋細胞である、請求項６～１２のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項14】

請求項６～１３のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。

【請求項15】

請求項６～１３のいずれか一項に記載の細胞と生理的に許容され得る担体とを含む組成物。

【請求項16】

細胞中のＢＴＫ遺伝子を編集するエクスビボの方法であって、請求項１に記載のゲノム編集組成物、請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５に記載のベクターと、ドナー修復テンプレートとを前記細胞中に導入することを含み、前記ゲノム編集組成物の発現がＢＴＫ遺伝子中の標的部位に二本鎖切断を作製し、前記ドナー修復テンプレートが、前記二本鎖切断（ＤＳＢ）の前記部位において、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記ＢＴＫ遺伝子中に取り込まれる、方法。

【請求項17】

前記ＢＴＫ遺伝子が、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）をもたらす１またはそれを超えるアミノ酸変異または欠失を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記細胞が造血細胞である、請求項１６または請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記細胞が造血幹または前駆細胞である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記細胞がＣＤ３４^＋細胞である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記細胞がＣＤ１３３^＋細胞である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

５’－３’エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが前記細胞中に導入される、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

Ｔｒｅｘ２または生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドが前記細胞中に導入される、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ドナー修復テンプレートが、ＤＳＢの５’のＢＴＫ遺伝子配列に相同な５’相同性アームと、ドナーポリヌクレオチドと、ＤＳＢの３’のＢＴＫ遺伝子配列に相同な３’相同性アームとを含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ドナーポリヌクレオチドが、ＢＴＫ遺伝子中の１またはそれを超えるアミノ酸変異または欠失を修復するように設計されている、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ドナーポリヌクレオチドが、ＢＴＫポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記ドナーポリヌクレオチドが、ＢＴＫポリペプチドをコードするｃＤＮＡに動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記５’および３’相同性アームの長さが、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐから独立に選択される、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記５’および３’相同性アームの長さが、約６００ｂｐ～約１５００ｂｐから独立に選択される、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記５’相同性アームが約１５００ｂｐであり、３’相同性アームが約１０００ｂｐである、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記５’相同性アームが約６００ｂｐであり、３’相同性アームが約６００ｂｐである、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ドナー修復テンプレートを細胞中に導入するためにウイルスベクターが使用される、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ウイルスベクターが組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ｒＡＡＶがＡＡＶ２由来の１またはそれを超えるＩＴＲを有する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項３４または請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ｒＡＡＶがＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項３４に記載の方法。

【請求項39】

前記レンチウイルスがインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

被験体におけるＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）の少なくとも１つの症候またはＸＬＡと関連する症状を処置、予防、または軽減する方法において使用するための組成物であって、前記被験体から採集され、かつ請求項１６～３９のいずれか一項に記載の方法に従って編集された細胞の集団を含む、組成物。

【請求項41】

被験体におけるＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）の少なくとも１つの症候またはＸＬＡと関連する症状を処置、予防、または軽減するための医薬の製造における、前記被験体から採集され、かつ請求項１６～３９のいずれか一項に記載の方法に従って編集された細胞の集団の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１８年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／６６４，０３５号の優先権を主張し、その全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出されたテキストファイルの記述
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読み取り可能なフォーマットの写し（ファイル名：ＳＥＣＨ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録された日：２０１９年４月２６日、ファイルサイズ７５キロバイト）。

【背景技術】

【0003】

背景
技術分野
本開示は、改善されたゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子を編集するための、ＴＡＬＥＮベースのおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのゲノム編集組成物および該ゲノム編集組成物を使用する方法に関する。

【0004】

関連技術の説明
Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子中の変異によって引き起こされる稀な免疫不全である。ＢＴＫ遺伝子中の６００を超える異なる変異が、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症と関連付けられている。これらの変異の多くは、ＢＴＫタンパク質の不存在をもたらす。他の変異は単一のタンパク質構成要素（アミノ酸）を変化させ、これは、細胞中で急速に分解される異常なＢＴＫタンパク質の産生を引き起こし得る。ＢＴＫは、正常なＢ成熟および活性化のために、ＢＣＲを介したシグナル伝達のために、および骨髄系細胞中のいくつかのシグナル伝達経路のために必要とされる。機能的なＢＴＫを欠如する被験体は、主に未成熟なＢ細胞、最小の抗体産生を有し、反復する生命を脅かす感染症に罹りやすい。

【0005】

既存の処置には、これらの感染症の重度を低下させる生涯にわたって行われる静脈内免疫グロブリン治療および抗生物質治療の慎重な使用が含まれる。造血細胞移植（ＨＣＴ）は、ＸＬＡの治癒をもたらす可能性を有する唯一の利用可能なアプローチである。しかしながら、ＨＬＡが合致するドナーを見出すことの困難さおよびＧｖＨＤに伴う潜在的な毒性のために、多くのＸＬＡ患者はこのアプローチで処置されていない。移植片生存の顕著な改善に関わらず、処置に関連する死亡のリスクがＸＬＡに対する同種ＨＣＴの障害となってきた。天然の近位ＢＴＫ遺伝子プロモーターの調節下にあるＢＴＫ ｃＤＮＡをコードする自己不活化レンチウイルスベクター（ＬＶ）を組み込むことが開発され、ヒトＸＬＡのマウスモデル中で評価されてきた。しかしながら、レトロウイルスおよびＬＶベースの遺伝子治療に伴う挿入突然変異誘発および遺伝子発現調節不全の著しいリスクが存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

簡単な要旨
一般的には、本開示は、１つには、ヒトＢＴＫ遺伝子のゲノム編集を媒介するＴＡＬＥＮベースのまたはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集システムおよびこれを使用する方法に関する。

【0007】

様々な実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヒトブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子中の標的部位を切断するＴＡＬＥＮを含む。

【0008】

ある実施形態において、ＴＡＬＥＮは、
ａ）Ｔ１－Ｆ ＲＶＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ；
ｂ）Ｔ１－Ｒ ＲＶＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ；
ｃ）Ｔ２－Ｆ ＲＶＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ；
ｄ）Ｔ２－Ｒ ＲＶＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ；
ｅ）Ｔ３－Ｆ ＲＶＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ；
ｆ）Ｔ３－Ｒ ＲＶＤ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＧ；
ｇ）Ｔ４－Ｆ ＲＶＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＧ；および
ｈ）Ｔ４－Ｒ ＲＶＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ；
を含む群から選択されるＲＶＤを有するＴＡＬエフェクタードメインを含み、ＴＡＬエフェクタードメインは標的部位Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３またはＴ４を結合することができる。

【0009】

様々な実施形態において、ゲノム編集組成物は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と；機能的ＢＴＫ遺伝子またはその断片を含む修復テンプレートと；を含み、ゲノム編集システムは、Ｂ細胞中の内在性ＢＴＫ遺伝子を修復するか、またはＢ細胞のゲノム中に機能的ＢＴＫ遺伝子を挿入することができる。

【0010】

ある実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号９～１７に記載されているヌクレオチド配列を含む。

【0011】

様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは本明細書において想定されるゲノム編集組成物をコードする。

【0012】

様々な実施形態において、ｍＲＮＡは本明細書において想定されるゲノム編集組成物をコードする。

【0013】

様々な実施形態において、ｃＤＮＡは本明細書において想定されるゲノム編集組成物をコードする。

【0014】

様々な実施形態において、ベクターは、本明細書において想定されるゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0015】

様々な実施形態において、細胞は、本明細書において想定されるゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0016】

様々な実施形態において、細胞は、本明細書において想定されるゲノム編集組成物をコードするｍＲＮＡを含む。

【0017】

様々な実施形態において、細胞は、本明細書において想定されるゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。

【0018】

様々な実施形態において、細胞は、本明細書において想定される１またはそれを超えるゲノム修飾を含む。

【0019】

ある実施形態において、上記細胞は造血細胞である。

【0020】

ある実施形態において、上記細胞は造血幹または前駆細胞である。

【0021】

ある実施形態において、上記細胞はＣＤ３４^＋細胞である。

【0022】

ある実施形態において、上記細胞はＣＤ１３３^＋細胞である。

【0023】

さらなる実施形態において、組成物は、本明細書において想定される細胞を含む。

【0024】

特定の実施形態において、上記組成物は、生理学的に許容され得る担体をさらに含む。

【0025】

様々な実施形態において、細胞中のＢＴＫ遺伝子を編集する方法は、本明細書において想定されるゲノム編集組成物、ポリヌクレオチドおよびベクターの１またはそれより多くとドナー修復テンプレートとを上記細胞中に導入することを含み、上記ゲノム編集組成物の発現はＢＴＫ遺伝子中の標的部位に二本鎖切断を作製し、上記ドナー修復テンプレートは、上記二本鎖切断（ＤＳＢ）の前記部位において、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記ＢＴＫ遺伝子中に取り込まれる。

【0026】

ある実施形態において、ＢＴＫ遺伝子は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）をもたらす１またはそれを超えるアミノ酸変異または欠失を含む。

【0027】

特定の実施形態において、上記細胞は造血細胞である。

【0028】

特定の実施形態において、上記細胞は造血幹または前駆細胞である。

【0029】

特定の実施形態において、上記細胞はＣＤ３４^＋細胞である。

【0030】

特定の実施形態において、上記細胞はＣＤ１３３^＋細胞である。

【0031】

特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。

【0032】

特定の実施形態において、５’－３’エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが上記細胞中に導入される。

【0033】

さらなる実施形態において、Ｔｒｅｘ２または生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドが上記細胞中に導入される。

【0034】

いくつかの実施形態において、上記ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢの５’のＢＴＫ遺伝子配列に相同な５’相同性アームと、ドナーポリヌクレオチドと、ＤＳＢの３’のＢＴＫ遺伝子配列に相同な３’相同性アームとを含む。

【0035】

様々な実施形態において、上記ドナーポリヌクレオチドは、ＢＴＫ遺伝子中の１またはそれを超えるアミノ酸変異または欠失を修復するように設計されている。

【0036】

特定の実施形態において、上記ドナーポリヌクレオチドは、ＢＴＫポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。

【0037】

さらなる実施形態において、上記ドナーポリヌクレオチドは、ＢＴＫポリペプチドをコードするｃＤＮＡに動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

【0038】

特定の実施形態において、上記５’および３’相同性アームの長さは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐから独立に選択される。

【0039】

様々な実施形態において、上記５’および３’相同性アームの長さは、約６００ｂｐ～約１５００ｂｐから独立に選択される。

【0040】

いくつかの実施形態において、上記５’相同性アームは約１５００ｂｐであり、３’相同性アームは約１０００ｂｐである。

【0041】

ある実施形態において、上記５’相同性アームは約６００ｂｐであり、上記３’相同性アームは約６００ｂｐである。

【0042】

さらなる実施形態において、上記ドナー修復テンプレートを細胞中に導入するためにウイルスベクターが使用される。

【0043】

ある実施形態において、上記ウイルスベクターは組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。

【0044】

様々な実施形態において、上記ｒＡＡＶはＡＡＶ２由来の１またはそれを超えるＩＴＲを有する。

【0045】

さらなる実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。

【0046】

特定の実施形態において、上記ｒＡＡＶはＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する。

【0047】

いくつかの実施形態において、上記レトロウイルスはレンチウイルスである。

【0048】

ある実施形態において、上記レンチウイルスはインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である。

【0049】

特定の実施形態において、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）の少なくとも１つの症候またはＸＬＡと関連する症状を処置し、予防し、または軽減する方法は、被験体から細胞の集団を採集すること、本明細書において想定されるＢＴＫ遺伝子を編集する方法に従って前記細胞の集団を編集すること、および編集された細胞の集団を前記被験体に投与すること、を含む。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ヒトブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子中の標的部位を切断するＴＡＬＥＮを含むゲノム編集組成物。
（項目２）
ＴＡＬＥＮが、
ｉ）Ｔ１－Ｆ ＲＶＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ；
ｊ）Ｔ１－Ｒ ＲＶＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ；
ｋ）Ｔ２－Ｆ ＲＶＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ；
ｌ）Ｔ２－Ｒ ＲＶＤ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ；
ｍ）Ｔ３－Ｆ ＲＶＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＧ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ；
ｎ）Ｔ３－Ｒ ＲＶＤ ＮＮ ＮＮ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＩ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＧ；
ｏ）Ｔ４－Ｆ ＲＶＤ ＨＤ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＩ ＮＩ ＮＩ ＨＤ ＮＧ ＮＩ ＮＮ ＮＮ ＮＧ；および
ｐ）Ｔ４－Ｒ ＲＶＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＩ ＮＧ ＨＤ ＨＤ ＨＤ ＮＧ ＨＤ ＮＧ ＮＧ ＮＮ ＮＮ ＮＧ ＮＧ；
を含む群から選択されるＲＶＤを有するＴＡＬエフェクタードメインを含み、
前記ＴＡＬエフェクタードメインが、標的部位Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３またはＴ４を結合することができる、
項目１に記載のゲノム編集組成物。
（項目３）
ゲノム編集組成物であって、
ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
ｃ）機能的ＢＴＫ遺伝子またはその断片を含む修復テンプレート；
を含み、
ゲノム編集システムが、Ｂ細胞中の内在性ＢＴＫ遺伝子を修復することができるか、またはＢ細胞のゲノム中への機能的ＢＴＫ遺伝子を挿入することができる、ゲノム編集組成物。
（項目４）
ｇＲＮＡが配列番号９～１７に記載されているヌクレオチド配列を含む、項目３に記載のゲノム編集組成物。
（項目５）
項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチド。
（項目６）
項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物をコードするｍＲＮＡ。
（項目７）
項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物をコードするｃＤＮＡ。
（項目８）
項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目９）
項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物を含む細胞。
（項目１０）
項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物をコードするポリヌクレオチドを含む細胞。
（項目１１）
項目８に記載のベクターを含む細胞。
（項目１２）
項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物によって導入された１またはそれを超えるゲノム修飾を含む細胞。
（項目１３）
前記細胞が造血細胞である、項目９～１２のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１４）
前記細胞が造血幹または前駆細胞である、項目９～１３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１５）
前記細胞がＣＤ３４^＋細胞である、項目９～１４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１６）
前記細胞がＣＤ１３３^＋細胞である、項目９～１５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目１７）
項目９～１６のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
（項目１８）
項目９～１６のいずれか一項に記載の細胞と生理的に許容され得る担体とを含む組成物。
（項目１９）
細胞中のＢＴＫ遺伝子を編集する方法であって、項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集組成物、項目５に記載のポリヌクレオチドまたは項目８に記載のベクターと、ドナー修復テンプレートとを前記細胞中に導入することを含み、前記ゲノム編集組成物の発現がＢＴＫ遺伝子中の標的部位に二本鎖切断を作製し、前記ドナー修復テンプレートが、前記二本鎖切断（ＤＳＢ）の前記部位において、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記ＢＴＫ遺伝子中に取り込まれる、方法。
（項目２０）
前記ＢＴＫ遺伝子が、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）をもたらす１またはそれを超えるアミノ酸変異または欠失を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞が造血細胞である、項目１９または項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が造血幹または前駆細胞である、項目１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記細胞がＣＤ３４^＋細胞である、項目１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞がＣＤ１３３^＋細胞である、項目１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、項目１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
５’－３’エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが前記細胞中に導入される、項目１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
Ｔｒｅｘ２または生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドが前記細胞中に導入される、項目１９～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ドナー修復テンプレートが、ＤＳＢの５’のＢＴＫ遺伝子配列に相同な５’相同性アームと、ドナーポリヌクレオチドと、ＤＳＢの３’のＢＴＫ遺伝子配列に相同な３’相同性アームとを含む、項目１９～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ドナーポリヌクレオチドが、ＢＴＫ遺伝子中の１またはそれを超えるアミノ酸変異または欠失を修復するように設計されている、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ドナーポリヌクレオチドが、ＢＴＫポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記ドナーポリヌクレオチドが、ＢＴＫポリペプチドをコードするｃＤＮＡに動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記５’および３’相同性アームの長さが、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐから独立に選択される、項目２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記５’および３’相同性アームの長さが、約６００ｂｐ～約１５００ｂｐから独立に選択される、項目２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記５’相同性アームが約１５００ｂｐであり、３’相同性アームが約１０００ｂｐである、項目２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記５’相同性アームが約６００ｂｐであり、３’相同性アームが約６００ｂｐである、項目２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記ドナー修復テンプレートを細胞中に導入するためにウイルスベクターが使用される、項目２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記ウイルスベクターが組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ｒＡＡＶがＡＡＶ２由来の１またはそれを超えるＩＴＲを有する、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、項目３７または項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ｒＡＡＶがＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する、項目３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記レトロウイルスがレンチウイルスである、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記レンチウイルスがインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）の少なくとも１つの症候またはＸＬＡと関連する症状を処置、予防、または軽減する方法であって、被験体から細胞の集団を採集すること、項目１９～４２のいずれか一項に記載の方法に従って前記細胞の集団を編集すること、および編集された細胞の集団を前記被験体に投与すること、を含む方法。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1A】図１Ａは、ヒトＢＴＫ遺伝子内のＴＡＬＥＮ（Ｔ１～Ｔ４）切断部位の位置について注釈が付されたＢＴＫ遺伝子座の模式図を示す。図解は、原寸通りに描かれていない。

【0051】

【図1B】図１Ｂは、初代Ｔ細胞中で各ＴＡＬＥＮを用いて達成されたパーセント破壊を示す。ＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）を補充されたＴ細胞増殖培地中で初代ヒトＴ細胞を培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて４８時間刺激した。ビーズを除去し、細胞を一晩静置させた後、いずれかのＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ（１μｇの各ＲＮＡ単量体）とともにＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステムを使用して電気穿孔を行った。細胞をさらに５日間培養し、ゲノムＤＮＡを抽出した。切断部位周囲の領域を増幅し、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ７エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）とともに２００ｎｇの精製されたＰＣＲ産物をインキュベートし、ゲル上で分析し、Ｌｉｃｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅソフトウェアを用いてパーセント破壊を定量した。その後の図面中の実験では、ＴＡＬＥＮ Ｔ３を使用した。

【0052】

【図1C】図１Ｃは、ＴＡＬＥＮを用いてＢＴＫ遺伝子を編集するためのＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。ＤＴ ＡＡＶベクターは、ＭＮＤプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）カセットに隣接する１ｋｂの相同性アームを有する。ＤＴ－Ｄｅｌ ＡＡＶドナーは、ＴＡＬスペーサードメイン（配列番号７２）まで５’相同性アームの末端にまたがるゲノム領域の欠失を有し、第二のエクソンとイントロンの部分的欠失をもたらして、ＴＡＬＥＮによる切断を消失させる。

【0053】

【図1D】図１Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶドナーテンプレートを使用する初代Ｔ細胞中での編集を示す。棒グラフは、ＧＦＰ発現の時間経過を図示する。パーセント相同組換え（ＨＲ）は、１５日におけるパーセント（％）ＧＦＰとして報告されている。

【0054】

【図1E】図１Ｅは、ＴＡＬＥＮとＡＡＶドナーの同時送達を用いた初代Ｔ細胞の編集の２日後および１５日後におけるＧＦＰ発現を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。

【0055】

【図2A】図２Ａは、ＣＲＩＳＰＲガイドの注釈が付されたＢＴＫ遺伝子座の模式図を示す。ヒトＢＴＫ遺伝子内のガイドＲＮＡ（Ｇ１～Ｇ９）の位置が示されている。図解は、原寸通りに描かれていない。

【0056】

【図2B】図２Ｂは、Ｔ７エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって決定された、ガイドＧ１からＧ９によるＢＴＫ遺伝子座でのパーセント（％）破壊を示す。パーセント破壊は、Ｌｉｃｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅソフトウェアを用いて定量した。その後の図面中の実験では、ガイドＧ３を使用した。

【0057】

【図2C】図２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを用いてＢＴＫ遺伝子を編集するための３つの例示的なＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。ＤＴ ＡＡＶベクターは、ＭＮＤプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に隣接する１ｋｂの相同性アームを有する。ＤＴ－ＰＡＭ ＡＡＶドナーは、ガイドＧ３による切断を消失させるために、ＰＡＭ配列中に変異（配列番号７３）を有する。ＤＴ－Ｄｅｌベクターは、ガイドＧ３による切断を消失させるために、欠失（配列番号７４）を有する。

【0058】

【図2D】図２Ｄは、Ｃａｓ９に加えてガイドおよびＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を使用する初代Ｔ細胞中での編集を示す。初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を培養し、ビーズ刺激した。次いで、Ｃａｓ９タンパク質と単一のガイドＲＮＡのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）で細胞を形質移入し、２時間後に、培養体積の２０％でＡＡＶドナーを添加した。２、８および１５日目にＧＦＰ発現に関して細胞を分析した。１５日目のＧＦＰ発現は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を示している。

【0059】

【図2E】図２Ｅは、ＲＮＰに加えてＡＡＶドナーを用いた初代Ｔ細胞の編集の２および１５日後におけるＧＦＰ発現を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。

【0060】

【図3A】図３Ａは、ヒトＣＤ３４^＋細胞編集プロトコールの模式図を示す。ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ３（６０ｎｇ／ｍＬ）が補充されたＳＣＧＭ培地中で４８時間、成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を培養した後、１：１．２の比率で混合された、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓ９タンパク質のリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）のいずれかおよび単一のガイドＲＮＡとともにＮｅｏｎ電気穿孔システムを用いて電気穿孔を行った。ｓｇＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入され、５’および３’末端の３つの末端位置に化学的に修飾されたヌクレオチドを有する。２および５日目に、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。

【0061】

【図3B】図３Ｂは、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡとＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を使用する、ＣＤ３４^＋ＨＳＣ中のＢＴＫ遺伝子座の編集を示す。成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を以前に記載されたとおりにＳＣＧＭ培地中で培養した後、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡとともにＮｅｏｎ電気穿孔システムを使用して電気穿孔を行った。電気穿孔の直後に、ドナーテンプレートを担持するＡＡＶベクターを添加した。対照は、操作されていない細胞およびヌクレアーゼの形質移入なしにＡＡＶのみで形質導入された細胞（ＡＡＶ）を含んだ。棒グラフは、５日での％ＧＦＰを図示し、ＨＤＲを示す。

【0062】

【図3C】図３Ｃは、編集の２および５日後における、モック、ＡＡＶまたはＡＡＶプラスＴＡＬＥＮ処理されたＣＤ３４^＋細胞からのＧＦＰ発現を図示するＦＡＣＳプロットを示す。

【0063】

【図3D】図３Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶドナーでの編集後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。棒グラフは、編集の２および５日後における、モックおよびＡＡＶのみおよびＡＡＶプラスＴＡＬＥＮ処理された細胞の生存率を表す。

【0064】

【図3E】図３Ｅは、ＴＡＬＥＮ編集されたＣＤ３４^＋細胞に対するＣＦＵアッセイを示す。ＴＡＬＥＮ編集された、ＴＡＬＥＮのみ、ＡＡＶのみおよびモック細胞を、編集の１日後に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのためにＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地上に播種した。簡潔に述べると、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、５００個の細胞を２つ組で播種し、１２～１４日間３７℃でインキュベートし、その形態およびＧＦＰ発現に基づいてコロニーを数えた。ＣＦＵ－Ｅ：コロニー形成単位赤血球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球、マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位赤血球。ｎ＝３の独立のドナー。データは、平均±平均値の標準誤差として表されている。

【0065】

【図4A】図４Ａは、ＲＮＰとＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を使用する、ＣＤ３４^＋ＨＳＣ中のＢＴＫ遺伝子座の編集を示す。成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を以前に記載されたとおりにＳＣＧＭ培地中で培養した後、ＲＮＰ複合体とともにＮｅｏｎ電気穿孔システムを使用して電気穿孔を行った。電気穿孔の直後に、ドナーテンプレートを担持するＡＡＶベクターを添加した。対照は、操作されていない細胞およびヌクレアーゼの形質移入なしにＡＡＶのみで形質導入された細胞（ＡＡＶ）を含んだ。棒グラフは、５日での％ＧＦＰを図示し、ＨＤＲを示す。

【0066】

【図4B】図４Ｂは、図４Ａと同じ実験を示し、２および５日における、ＧＦＰ発現を示す代表的ＦＡＣｓプロットを図示する。

【0067】

【図4C】図４Ｃは、ＲＮＰおよびＡＡＶドナーでの編集後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。棒グラフは、編集の２および５日後における、モックおよびＡＡＶのみおよび（様々なＲＮＰとＡＡＶ用量での）ＡＡＶプラスＲＮＰ処理された細胞の生存率を表す。

【0068】

【図4D】図４Ｄは、ＲＮＰ編集されたＣＤ３４^＋細胞に対するＣＦＵアッセイを示す。ＲＮＰ編集された、ＡＡＶのみ、およびモック細胞を、編集の１日後に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのためにＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地上に播種した。簡潔に述べると、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、５００個の細胞を２つ組で播種し、１２～１４日間３７℃でインキュベートし、その形態およびＧＦＰ発現に基づいてコロニーを数えた。ＣＦＵ－Ｅ：コロニー形成単位赤血球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球、マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位赤血球。ｎ＝３の独立のドナー。データは、平均±平均値の標準誤差として表されている。

【0069】

【図5A】図５Ａは、ＧＦＰを発現する無プロモーターＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。このベクターは、ＧＦＰ、末端切断されたウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ３）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。この挿入物は、いずれかの側において、ＢＴＫ遺伝子座への０．５ｋｂ相同性アームによって隣接されている。

【0070】

【図5B】図５Ｂは、ＲＮＰとＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を用いる、ＣＤ３４^＋ＨＳＣ中での無プロモーターＧＦＰベクターを使用するＢＴＫ遺伝子座の編集を示す。棒グラフは、１、２および５日での％ＧＦＰを図示し、５日での％ＧＦＰはＨＤＲを示す。

【0071】

【図5C】図５Ｃは、図４Ａと同じ実験を示し、２および５日における、ＧＦＰ発現を示す代表的ＦＡＣｓプロットを図示する。

【0072】

【図5D】図５Ｄは、ＲＮＰおよび無プロモーターＡＡＶドナーでの編集後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。棒グラフは、編集の１、２および５日後における、モックおよびＡＡＶのみおよび（様々なＲＮＰとＡＡＶ用量での）ＡＡＶプラスＲＮＰ処理された細胞の生存率を表す。５日での％ＧＦＰは、％ＨＤＲを示す。

【0073】

【図5E】図５Ｅは、ＨＤＲを決定するためのデジタルドロップレットＰＣＲアッセイを示す。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）からゲノムＤＮＡを単離した。編集率を評価するために、ＡＡＶ挿入物内に結合するフォワードプライマーおよび相同性の領域外のＢＴＫ遺伝子座を結合するリバースプライマーを用いて、「インアウト」ドロップレットデジタルＰＣＲを行った。対照としての役割を果たすために、ＡｃｔＢ遺伝子に対して類似の大きさの対照アンプリコンを作製した。全ての反応は、２つ組みで行った。ＰＣＲ反応液は、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、液滴に分割した。ＵＴＰなしのｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、９００ｎＭのプライマー、２５０ｎＭのプローブ、５０ｎｇのゲノムＤＮＡおよび１％ＤＭＳＯを用いて、増幅を行った。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で液滴を分析した。

【0074】

【図6】図６は、コドン最適化されたＢＴＫを発現するＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。

【0075】

【図7】図７は、ＴＡＬＥＮプラスＡＡＶまたはＲＮＰプラスＡＡＶで編集された細胞中でのＨＤＲ（相同組換え修復）対ＮＨＥＪ（非相同末端結合）の比の比較を示す。

【0076】

【図8A】図８Ａは、内在性プロモーターからコドン最適化されたＢＴＫ ｃＤＮＡを発現するｒＡＡＶ６ドナーベクターの模式図である。

【0077】

【図8B】図８Ｂは、ＸＬＡ中で臨床的な恩恵を容易に与えると予測されるレベルで、内在性ＢＴＫ遺伝子座中にＢＴＫ ｃＤＮＡを導入する能力を実証する、単一のＣＤ３４^＋ドナーから得られたデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0078】

配列識別子の簡単な説明
配列番号１～８は、ヒトＢＴＫ遺伝子の第一および第二のイントロン中のＴＡＬＥＮ標的部位である。

【0079】

配列番号９～１７は、ｇＲＮＡ配列Ｇ１～Ｇ９である。

【0080】

配列番号１８は、ヒトＢＴＫポリペプチドのアミノ酸配列である。

【0081】

配列番号１９～２４は、ＢＴＫ遺伝子座に対するＡＡＶターゲティングベクターの配列である。

【0082】

配列番号２５～３５は、ＲＮＰもしくはＴＡＬＥＮに加えてＡＡＶ．ＭＮＤ．ＧＦＰベクターを用いてまたはＲＮＰおよびＡＴＧ．ｃｏＢＴＫ発現ＡＡＶベクターを用いて、ＣＤ３４＋細胞中でのＨＤＲを決定するために使用されたオリゴおよびプローブである。

【0083】

詳細な説明
Ａ．概要
一般的には、本開示は、１つには、改善されたゲノム編集組成物およびその使用の方法に関する。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、本明細書中で想定されるゲノム編集組成物は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）と関連する症候を処置、予防または軽減するために、細胞中のブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の量を増加させるために使用される。従って、本明細書において想定される組成物は、ＸＬＡを有する被験体に、根治的となり得る解決手段を与える。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、ＸＬＡをもたらす１またはそれを超える変異および／または欠失を有するＢＴＫ遺伝子中に機能的なＢＴＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入するゲノム編集アプローチがＸＬＡによって引き起こされる免疫的および機能的欠損を救出し、根治的となり得る治療を与えると想定される。

【0084】

様々な実施形態において、ＢＴＫ機能を増加または回復させるための、ゲノム編集戦略、組成物、遺伝的に改変された細胞およびこれらの使用方法が想定される。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、ＢＴＫタンパク質の機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを導入するためのＢＴＫ遺伝子のゲノム編集が想定される。一実施形態において、ＢＴＫ遺伝子の編集は、造血幹細胞（ＨＳＣ）中で内在性プロモーターおよびエンハンサーの調節下にあるように、ＢＴＫタンパク質の機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。免疫細胞中での機能的ＢＴＫの回復は、ＸＬＡを有する被験体と関連する１またはそれを超える症候を効果的に処置し、予防し、および／または軽減するであろう。

【0085】

様々な実施形態において想定されるゲノム編集方法は、ＢＴＫ遺伝子中の標的結合部位を結合し、切断するように設計されたＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）変異形を含む。特定の実施形態において想定されるＴＡＬＥＮ変異形は、標的ポリヌクレオチド配列中に二本鎖切断を導入し、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち、ＢＴＫ遺伝子中へのドナー修復テンプレートの相同組換えをもたらすために使用することができる。ある種の実施形態において想定されるＴＡＬＥＮ変異形は、細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構またはドナー修復テンプレートの存在下での相同組換えを用いて修復することができる一本鎖ＤＮＡ切断を生成するニッカーゼとして設計することも可能である。相同組換えは、二本鎖ＤＮＡ切断を修復するためのテンプレートとして相同なＤＮＡを必要とし、標的部位における治療遺伝子（例えば、ＢＴＫ）をコードする発現カセットまたはポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡの導入によって特定され、標的部位に隣接する領域と相同性を有する配列によっていずれかの側で隣接された無限の様々な修飾を作出するために活用することができる。

【0086】

様々な他の実施形態において想定されるゲノム編集方法は、ＢＴＫ遺伝子中の標的結合部位を結合し、切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。特定の実施形態において想定されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列中に二本鎖切断を導入し、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち、ＢＴＫ遺伝子中へのドナー修復テンプレートの相同組換えをもたらすために使用することができる。ある種の実施形態において想定されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、１またはそれを超えるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって、１またはそれを超える切断部位へガイドされることもできる。ある種の実施形態において想定されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構またはドナー修復テンプレートの存在下での相同組換えを用いて修復することができる一本鎖ＤＮＡ切断を生成するニッカーゼとして設計することも可能である。相同組換えは、二本鎖ＤＮＡ切断を修復するためのテンプレートとして相同なＤＮＡを必要とし、標的部位における治療遺伝子（例えば、ＢＴＫ）をコードする発現カセットまたはポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡの導入によって特定され、標的部位に隣接する領域と相同性を有する配列によっていずれかの側で隣接された無限の様々な修飾を作出するために活用することができる。

【0087】

１つの好ましい実施形態において、本明細書において想定されるゲノム編集組成物は、ヒトＢＴＫ遺伝子を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。

【0088】

１つの好ましい実施形態において、本明細書において想定されるゲノム編集組成物は、ヒトＢＴＫ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系を含む。このような実施形態において、部位特異的なヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（「Ｃａｓ「エンドヌクレアーゼ」）であり、核酸ガイド分子はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。

【0089】

様々な実施形態において、ＤＮＡ切断がＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中に生成され、機能的なＢＴＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレート、すなわち、ドナー修復テンプレートが提供される場合、ＤＳＢは、ＤＮＡ切断部位における相同組換えによって、テンプレートの配列を用いて修復される。好ましい実施形態において、修復テンプレートは、当該ポリヌクレオチドおよびＢＴＫポリペプチドの発現が内在性ＢＴＫプロモーターおよび／またはエンハンサーの調節下にある部位において挿入されるように設計された機能的ＢＴＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0090】

１つの好ましい実施形態において、本明細書において想定されるゲノム編集組成物は、ＴＡＬＥＮ変異形とＨＤＲ効率を増加させるための１またはそれを超える末端プロセシング酵素とを含む。

【0091】

１つの好ましい実施形態において、本明細書において想定されるゲノム編集組成物は、ヒトＢＴＫ遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系と、機能的ＢＴＫタンパク質をコードするドナー修復テンプレートと、および末端プロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２とを含む。

【0092】

様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞が想定される。ゲノム編集された細胞は、機能的なＢＴＫポリペプチドを含み、Ｂ細胞の発達を救出し、ＸＬＡを防止する。

【0093】

従って、本明細書において想定される方法および組成物は、ＸＬＡの処置のための既存のゲノム編集戦略と比べて、飛躍的な改善を示す。

【0094】

組換え（すなわち、改変操作された）ＤＮＡ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成、イムノアッセイ、組織培養、形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）、酵素反応、精製のための技術ならびに関連する技術および手順は、一般に、本明細書を通じて引用および論述されている微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学における様々な一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されているとおりに実施され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００８年７月改訂）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ
Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ
２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）；Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ
Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌の研究書を参照。
Ｂ．定義

【0095】

本開示をより詳しく記載する前に、本明細書において使用されるある種の用語の定義を与えることが、本明細書の理解にとって有益であろう。

【0096】

別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。特定の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載されているものと同様のまたは等価なあらゆる方法および材料を使用することができるが、本明細書には、組成物、方法および材料の好ましい実施形態が記載されている。本開示において、以下の用語が以下で定義されている。さらなる定義は、本開示を通じて記載されている。

【0097】

冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法的目的語の１つまたは１より多く（すなわち、少なくとも１つの、または１もしくはそれを超える）を表すために、本明細書において使用される。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素（ｏｎｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）または１もしくはそれを超える要素（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を意味する。

【0098】

選択肢（例えば、「または」）の使用は、当該選択肢の一方、両方またはその任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。

【0099】

用語「および／または」は、当該選択肢の一方または両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。

【0100】

本明細書において使用される、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対して最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％変動する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さを表す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さの範囲を表す。

【0101】

一実施形態において、範囲、例えば、１～５、約１～５または約１～約５は、この範囲によって包含される各数値を表す。例えば、１つの非限定的な単なる例示的な実施形態において、範囲「１～５」は、表現１、２、３、４、５；または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５もしくは５．０；または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９もしくは５．０に等しい。

【0102】

本明細書において使用される、「実質的に」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さと比べて８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さを表す。一実施形態において、「実質的に同じ」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さとおよそ同じである効果、例えば、生理的効果を生じる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、大きさ、サイズ、量、重量または長さを表す。

【0103】

本明細書全体を通じて、文脈が別段の要求をしていなければ、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、表記された工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の包含を含意するが、任意のその他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の除外を含意しないことが理解されるであろう。「からなる」という用語に続くものが何であれ、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」によって、含み、それに限定されることが意味される。従って、「からなる」という用語は、列記された要素が必要とされるまたは必須であること、他の要素は存在し得ないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」によって、その用語の後に列記された全ての要素を含み、列記された要素に対して本開示中で指定された活性または作用を妨害せずまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、「から本質的になる」という用語は、列記された要素が必要とされるまたは必須であること、ただし、列記された要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が存在しないことを示す。

【0104】

本明細書を通じて、「一実施形態」、「１つの実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加の実施形態」または「さらなる実施形態」またはこれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書を通じた様々な場所での先述の用語の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を参照するわけではない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１またはそれを超える実施形態において、任意の適切な様式で組み合わされ得る。一実施形態における特徴の積極的列挙は、特定の実施形態においてその特徴を除外するための基礎としての役割を果たすことも理解される。

【0105】

「エクスビボ」という用語は、好ましくは天然の条件を最小限に改変した生物の外側の人工的環境において生きた組織中または生きた組織上で行われる実験または測定など、生物の外側で行われる活動を一般的に表す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、通常は無菌条件下で、状況に応じて、典型的には数時間または最大約２４時間（但し、最大４８時間または７２時間を含む）、実験装置中で培養または調節された生きた細胞または組織を伴う。ある実施形態において、このような組織または細胞は、収集及び凍結され、エクスビボ処理のためにその後融解することができる。生きた細胞または組織を使用して数日より長く続く組織培養実験または手順は典型的には「インビトロ」であると考えられるが、ある実施形態では、この用語はエクスビボと互換的に使用することができる。

【0106】

「インビボ」という用語は、生物の内側で行われる活動を一般的に表す。一実施形態において、細胞のゲノムは、インビボで改変操作され、編集され、または修飾される。

【0107】

「増強する」または「促進する」または「増加する」または「拡大する」または「強化する」によって、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比べて、より大きな応答（すなわち、生理的応答）を生成し、惹起し、または引き起こす、本明細書において想定されるＴＡＬＥＮ変異形、ゲノム編集組成物またはゲノム編集された細胞の能力を一般的に表す。測定可能な応答は、本分野での理解および本明細書中の記載から特に自明である、ＨＤＲおよび／またはＢＴＫ発現の増加を含み得る。「増加された」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって生成される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０またはそれを超える倍数（例えば、５００、１０００倍）（その間のおよび１より大きい全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含み得る。

【0108】

「減少する」または「低下する」または「減らす」または「低減する」または「和らげる」または「除去する」または「抑制する」または「減衰させる」によって、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比べて、より小さな応答（すなわち、生理的応答）を生成し、惹起し、または引き起こす、本明細書において想定されるＴＡＬＥＮ変異形、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ゲノム編集組成物またはゲノム編集された細胞の能力を一般的に表す。測定可能な応答は、ＸＬＡに関連する１またはそれを超える症候の減少を含み得る。「減少された」または「低減された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって生成される応答（基準応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０またはそれを超える倍数（例えば、５００、１０００倍）（その間のおよび１より大きい全ての整数および小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含み得る。

【0109】

「維持する」または「保持する」または「維持」または「変化なし」または「実質的な変化なし」または「実質的な減少なし」によって、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比べて、実質的に類似のまたは同等な生理的応答（すなわち、下流の効果）を生成し、惹起し、または引き起こす、本明細書において想定されるＴＡＬＥＮ変異形、ゲノム編集組成物またはゲノム編集された細胞の能力を一般的に表す。同等の応答とは、基準応答と著しく異ならないまたは測定可能に異ならない応答である。

【0110】

本明細書において使用される「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合された」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合より大きな結合親和性でのある分子の別の分子への結合、例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡへの結合を記載する。例えば、約１０^５Ｍ^－１より大きいまたは約１０^５Ｍ^－１と等しい親和性またはＫ_ａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する、特定の結合相互作用の平衡会合定数）で、標的部位に結合しまたは標的部位と会合すれば、結合ドメインは、標的部位に「特異的に結合する」。ある実施形態において、結合ドメインは、約１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１、１０^１２Ｍ^－１または１０^１３Ｍ^－１より大きいまたは等しいＫ_ａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、少なくとも１０^１３Ｍ^－１またはそれを超えるＫ_ａで結合ドメインを表す。

【0111】

または、親和性は、Ｍの単位を有する、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍまたはそれ未満）として定義され得る。特定の実施形態において想定されるＤＮＡ標的部位に対する１またはそれを超えるＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ変異形の親和性は、慣用の技術、例えば、酵母細胞表面ディスプレイを用いて、または結合会合によって、または標識されたリガンドを使用する置換アッセイによって容易に決定することができる。

【0112】

一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグランド結合より約２倍大きい、バックグランド結合より約５倍大きい、バックグランド結合より約１０倍大きい、バックグランド結合より約２０倍大きい、バックグランド結合より約５０倍大きい、バックグランド結合より約１００倍大きいもしくはバックグランド結合より約１０００倍大きい、またはさらに大きい。

【0113】

「選択的に結合する」または「選択的に結合された」または「選択的に結合している」または「選択的に標的とする」という用語は、複数のオフターゲット分子の存在下での、標的分子へのある分子の優先的な結合（オンターゲット結合）を記載する。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮがオフターゲットＤＮＡ標的結合部位を結合するより、約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００または１０００倍頻繁に、オンターゲットＤＮＡ結合部位を選択的に結合する。

【0114】

「オンターゲット」は、標的部位配列を表す。

【0115】

「オフターゲット」は、標的部位配列と類似するが、同一ではない配列を表す。

【0116】

「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断が存在するのに十分な条件が与えられれば、結合分子が結合および／または切断する核酸の部分を規定する染色体または染色体外核酸配列である。標的部位または標的配列の１つの鎖のみを参照するポリヌクレオチド配列または配列番号を参照する場合、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって結合および／または切断される標的部位または標的配列は二本鎖であり、参照配列およびその相補鎖を含むことが理解されるであろう。好ましい実施形態において、標的部位はヒトＢＴＫ遺伝子中の配列である。

【0117】

「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むがこれに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換の過程を表す。本開示において、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機序を介した細胞中での二本鎖切断の修復の間に起こるこのような交換の特殊化された形態を表す。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）を修復するためのテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の導入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」と様々に称されている。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、このような導入は、切断された標的とドナー間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正および／または標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」および／または関連する過程を伴うことができる。このような特殊化されたＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、しばしば、標的分子の配列の変化をもたらす。

【0118】

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を表す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むがこれらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能である。二本鎖切断は２つの別個の一本鎖切断現象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または粘着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。ある実施形態において、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために、本明細書において想定されるポリペプチドおよびＴＡＬＥＮ変異形、例えば、ＴＡＬＥＮなどが使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれかのＤＮＡ鎖または両方のＤＮＡ鎖上に存在し得る。

【0119】

「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１またはそれを超える遺伝学的、生化学的またはその他の方法によって細胞中に導入される分子である。例示的な外因性分子としては、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体または上記分子の１もしくはそれより多くを含む任意の複合体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞中に外因性分子を導入する方法は当業者に公知であり、脂質によって媒介される導入（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストランによって媒介される導入およびウイルスベクターによって媒介される導入が含まれるが、これらに限定されない。

【0120】

「内在性」分子は、特定の環境条件下において、特定の発達段階で特定の細胞中に通常存在する分子である。さらなる内在性分子としては、タンパク質を挙げることができる。

【0121】

「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域の他、そのような制御配列がコード配列および／または転写される配列に隣接しているかどうかを問わず、遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域を表す。遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳制御配列、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域が含まれるが、これらに限定されない。

【0122】

「遺伝子発現」は、遺伝子中に含有されている情報の、遺伝子産物への変換を表す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。

【0123】

本明細書において使用される「遺伝的に改変操作された」または「遺伝的に改変された」という用語は、細胞中の全遺伝物質への、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の外部遺伝物質の染色体または染色体外添加を表す。遺伝子改変は、細胞のゲノム中の特定の部位に標的化または非標的化され得る。一実施形態において、遺伝子改変は部位特異的である。一実施形態において、遺伝子改変は部位特異的でない。

【0124】

本明細書において使用される「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復し、修正し、破壊し、および／または改変する、細胞のゲノム中の標的部位における遺伝物質の置換、欠失および／または導入を表す。特定の実施形態において想定されるゲノム編集は、必要に応じてドナー修復テンプレートの存在下で、細胞のゲノム中の標的部位にまたはその近傍にＤＮＡ損傷を生成するために、１またはそれを超えるＴＡＬＥＮ変異形を細胞中に導入することを含む。

【0125】

本明細書において使用される「遺伝子治療」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復し、修正し、もしくは改変するまたは治療用ポリペプチドを発現することを目的とする細胞中の全遺伝物質中への外部遺伝物質の導入を表す。特定の実施形態において、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復し、修正し、破壊し、もしくは改変するまたは治療用ポリペプチドを発現することを目的とするゲノム編集による細胞のゲノム中への遺伝物質の導入は、遺伝子治療と考えられる。
Ｃ．ＴＡＬＥＮベースの系

【0126】

ＢＴＫ遺伝子中の標的部位をゲノム編集するのに適している本明細書中の特定の実施形態において想定されるＴＡＬＥＮ変異形は、１またはそれを超えるＤＮＡ結合ドメインと１またはそれを超えるＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１またはそれを超えるエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼドメイン）とを含み、本明細書において想定される１またはそれを超えるリンカーを必要に応じて含む。「再プログラムされたヌクレアーゼ」、「改変操作されたヌクレアーゼ」、「ヌクレアーゼ変異形」または「ＴＡＬＥＮ変異形」という用語は互換的に使用され、１またはそれを超えるＤＮＡ結合ドメインと１またはそれを超えるＤＮＡ切断ドメインとを含むＴＡＬＥＮであって、ＢＴＫ遺伝子中の二本鎖ＤＮＡ標的配列、好ましくはヒトＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中の標的配列、より好ましくは配列番号１～８に記載されているヒトＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中の標的配列を結合および切断するように、親または天然に存在するＴＡＬＥＮから設計および／または改変されているＴＡＬＥＮを表す。ＴＡＬＥＮ変異形は、天然に存在するエフェクタードメインからまたは以前のＴＡＬＥＮ変異形から設計および／または改変され得る。特定の実施形態において想定されるＴＡＬＥＮ変異形は、１またはそれを超えるさらなる機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。

【0127】

様々な実施形態において、ＴＡＬＥＮは、ＢＴＫ遺伝子、好ましくはヒトＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中の標的配列、より好ましくは配列番号１～８に記載されているヒトＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中の標的配列中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するために再プログラムされる。「ＴＡＬＥＮ」は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインと酵素ドメインを含むタンパク質を表す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。上記ＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子制御系において使用するのに適した例示的酵素ドメインである。

【0128】

ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌が植物に感染するときに、そのＩＩＩ型分泌系を介してＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、多様な１２番目および１３番目のアミノ酸を有する反復され、高度に保存された３３～３４アミノ酸の配列を含有する。反復可変性二残基（ＲＶＤ（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ））と称されるこれらの２つの位置は高度に可変的であり、特異的なヌクレオチド認識と強く相関する。従って、ＴＡＬエフェクタードメインは、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することによって、特異的な標的ＤＮＡ配列を結合するように改変操作することができる。ＲＶＤの組み合わせに対する核酸の特異性は、以下の通りである：ＨＤはシトシンを標的とし、ＮＩはアデニン（ａｄｅｎｅｎｉｎｅ）を標的とし、ＮＧはチミンを標的とし、ＮＮはグアニンを標的とする（但し、いくつかの実施形態において、ＮＮは、より低い特異性でアデニンも結合することができる）。

【0129】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0130】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0131】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１～８の１つと少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１～８の１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１～８の１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0132】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
表１：標的部位

【表1A】

【0133】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0134】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１～８の１つと少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１～８の１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１～８の１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0135】

いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0136】

いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、配列番号１～８の１つと少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、配列番号１～８の１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２またはそれを超えるＴＡＬエフェクター－融合タンパク質を含み、ここで、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、配列番号１～８の１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0137】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクタードメインは、表２に示されているＲＶＤ配列を含む。
表２：ＴＡＬエフェクタードメインＲＶＤ

【表2A】

【0138】

ＴＡＬエフェクターリピートを組み立てるための方法および組成物は、本分野において公知である。例えば、Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照。ＴＡＬエフェクターリピートの構築のためのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている。
Ｄ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの系

【0139】

組み合わせ遺伝子制御系は、部位特異的改変ポリペプチドおよび核酸ガイド分子を含む。本明細書において、「部位特異的改変ポリペプチド」は、核酸ガイド分子に結合するポリペプチドであって、これが結合する核酸ガイド分子によって、例えば、ＤＮＡ配列などの標的核酸配列へ標的化され、標的ＤＮＡ配列を改変する（例えば、標的ＤＮＡの切断、変異またはメチル化）ポリペプチドを表す。部位特異的改変ポリペプチドは、２つの部分、核酸ガイドを結合する部分と活性部分を含む。いくつかの実施形態において、部位特異的改変ポリペプチドは、部位特異的酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ切断、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化など）を示す活性部分を含み、ここで、酵素活性の部位はガイド核酸によって決定される。いくつかの事例では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡを改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチル転移活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性）を有する。他の事例では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡと会合するポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチル転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、アセチル転移酵素活性、脱アセチル化酵素、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する。いくつかの実施形態において、活性部分は、（例えば、転写を増加または減少するために）標的ＤＮＡ配列の転写を調節する。

【0140】

核酸ガイドは、２つの部分；内在標的ＤＮＡ配列と相補的であり、内在標的ＤＮＡ配列と結合することができる第一の部分（本明細書において、「ＤＮＡ結合セグメント」と称される。）と、部位特異的改変ポリペプチドと相互作用することができる第二の部分（本明細書において、「タンパク質結合セグメント」と称される。）とを含む。いくつかの実施形態において、核酸ガイドのＤＮＡ結合セグメントとタンパク質結合セグメントは、単一のポリヌクレオチド分子内に含まれる。いくつかの実施形態において、核酸ガイドのＤＮＡ結合セグメントとタンパク質結合セグメントは、核酸ガイドが互いに会合して機能的ガイドを形成する２つのポリヌクレオチド分子を含むように、それぞれが別個のポリヌクレオチド分子内に含まれる。

【0141】

核酸ガイドは、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれる標的ＤＮＡ配列と特異的にハイブリッドを形成することによって、複合タンパク質／核酸遺伝子制御系の標的特異性を媒介する。本明細書における標的遺伝子への言及は、その遺伝子に対する完全長ＤＮＡ配列を包含し、当該標的遺伝子に対する完全長ＤＮＡ配列は、当該標的遺伝子配列（例えば、エクソンまたはイントロン）の一部を表す標的遺伝子座を複数含むであろう。各標的遺伝子座内には、本明細書に記載されている遺伝子制御系によって改変することができる、本明細書において「標的ＤＮＡ配列」または「標的配列」と称されるＤＮＡ配列のより短い広がりがある。さらに、各標的遺伝子座は、遺伝子制御系によって誘導される改変の正確な位置（例えば、挿入、欠失もしくは変異の位置、ＤＮＡ切断の位置または後成的修飾の位置）を表す「標的改変部位」を含む。本明細書に記載されている遺伝子制御系は単一の核酸ガイドを含み得、または複数の核酸ガイド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える核酸ガイド）を含み得る。

【0142】

以下に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、複合タンパク質／核酸系の例示的な実施形態である。

【0143】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系であるこのような実施形態において、部位特異的改変ポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ）であり、核酸ガイド分子はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。

【0144】

Ｃａｓポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用することができるポリペプチドを表し、ｇＲＮＡ分子と協力して、標的ＤＮＡ配列に向かいまたは局在化し、天然に存在するＣａｓタンパク質および天然に存在するＣａｓ配列と１またはそれを超えるアミノ酸残基が異なる改変操作された、変化されたまたはその他改変されたＣａｓタンパク質を含む。

【0145】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためのＨＮＨヌクレアーゼドメインと非標的鎖を切断するためのＲｕｖＣ様ドメインとを使用するマルチドメイン酵素である。いくつかの実施形態において、ＷＴ Ｃａｓ９を、ＤＮＡを切断することができない酵素的に不活性な変異体（例えば、ｄＣａｓ９）または標的もしくは非標的鎖の一方もしくは他方を切断することによって一本鎖ＤＮＡ切断を生成することができるニッカーゼ変異体へと変換することができる選択的なドメイン不活化によって、Ｃａｓ９の変異体を生成することができる。

【0146】

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、２つのセグメント、ＤＮＡ結合セグメントおよびタンパク質結合セグメントを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは１つのＲＮＡ分子中に含まれ、ＤＮＡ結合セグメントは別の別個のＲＮＡ分子中に含まれる。このような実施形態は、本明細書において、「二重分子ｇＲＮＡ」または「二分子ｇＲＮＡ」または「二重ＲＮＡ」と称される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは単一のＲＮＡ分子であり、本明細書において「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は包括的であり、２分子ガイドＲＮＡとｓｇＲＮＡの両方を表す。

【0147】

ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つには、互いにハイブリッドを形成して二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補的な広がりを含み、これは、Ｃａｓタンパク質への結合を容易にする。

【0148】

ｇＲＮＡのＤＮＡ結合セグメント（または「ＤＮＡ結合配列」）は、特異的配列標的ＤＮＡ配列に相補的であり、これに結合することができるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的改変ポリペプチドの相互作用は内在性ＤＮＡへのＣａｓ結合をもたらし、標的ＤＮＡ配列内または周囲に１またはそれを超える改変を生成する。標的改変部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ配列との間での塩基対形成相補性および（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの位置の両方によって決定される。ＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列へのＣａｓ結合のために必要とされる。様々なＰＡＭ配列が本分野において公知であり、本分野において公知である特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）とともに使用するのに適している（例えば、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６－１１２１およびＳｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５参照）。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、標的改変部位の５０塩基対内に位置する。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、標的改変部位の１０塩基対内に位置する。本方法によって標的とされ得るＤＮＡ配列は、標的改変部位へのＰＡＭ配列の相対的な距離と配列特異的な、ｇＲＮＡによって媒介されるＣａｓ結合を媒介するための特有の２０塩基対配列の存在とによってのみ限定される。いくつかの実施形態において、標的改変部位は、標的遺伝子座の５’終端に位置する。いくつかの実施形態において、標的改変部位は、標的遺伝子座の３’末端に位置する。いくつかの実施形態において、標的改変部位は、標的遺伝子座のイントロンまたはエクソン内に位置する。

【0149】

いくつかの実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、本開示は部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクター中に含まれる。
Ｃａｓタンパク質

【0150】

いくつかの実施形態において、部位特異的改変ポリペプチドはＣａｓタンパク質である。本明細書に記載されている方法および組成物においては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ
ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ
ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ種、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ種、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ種、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ種、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ種またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ由来のＣａｓ分子を含む様々な種のＣａｓ分子を使用することができる。

【0151】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９相同分子種であり、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９およびＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも称される）、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４からなる群から選択される。さらなるＣａｓ９相同分子種は、ＰＣＴ国際公開第２０１５／０７１４７４号に記載されている。

【0152】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、天然に存在するＣａｓ９タンパク質である。例示的な天然に存在するＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３：１０：５、７２７－７３７に記載されている。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラスター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラスター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、クラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１５細菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスター１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラスター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラスター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、クラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスター５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラスター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７７細菌科またはクラスター７８細菌科のＣａｓ９の分子が挙げられる。

【0153】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５、７２７－７３７；Ｈｏｕら、ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３、１－６に記載されているＣａｓ９アミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0154】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓポリペプチドは、以下の活性の１またはそれより多くを含む。
ａ）ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を切断する能力；
ｂ）一実施形態において、２つのニッカーゼ活性の存在である二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を作出する能力；
ｃ）エンドヌクレアーゼ活性；
ｄ）エキソヌクレアーゼ活性；および／または
ｅ）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。

【0155】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は野生型（ＷＴ）Ｃａｓ９タンパク質または相同分子種である。ＷＴ Ｃａｓ９は、２つの触媒的に活性なドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を含む。ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡへのＷＴ Ｃａｓ９の結合は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、いずれかの修復機構による標的配列の修復の可能性または割合をさらに増加させるために、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼまたはホスファターゼを補充する異種のタンパク質に融合される。いくつかの実施形態において、ＷＴ Ｃａｓ９は、相同組換え修復による外因性核酸配列の取り込みを促進するために、核酸修復テンプレートとともに同時発現される。

【0156】

いくつかの実施形態において、異なるＣａｓ９タンパク質の様々な酵素的特徴を十分に活用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列選好性のため；増加または減少した酵素活性のため；細胞毒性の増加または減少したレベルのため；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断などの間でのバランスを変化させるため）、様々な提供される方法において異なるＣａｓ９タンパク質（すなわち、様々な種由来のＣａｓ９タンパク質）を使用することが有利であり得る。

【0157】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡを認識する（Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３；３３９（６１２１）：８２３－８２６）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧＮＧおよび／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７－１７０，及びＤｅｖｅａｕら、Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００参照）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕら、Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００参照）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＡＴＴまたはＮ ＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）を認識する（例えば、Ｈｏｕら、ＰＮＡＳ
２０１３，１－６参照）。先述の実施形態において、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれでもあり得る。

【0158】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＰＣＴ国際公開第２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５、７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＰＣＴ国際公開第２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５、７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＰＣＴ国際公開第２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３
１０：５、７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。
Ｃａｓ変異体

【0159】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓポリペプチドの１またはそれを超える特性を変化させるために、Ｃａｓポリペプチドは改変操作される。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃａｓポリペプチドは、変化した酵素特性、例えば、（天然に存在するまたは他の参照Ｃａｓ分子と比較して）変化したヌクレアーゼ活性または変化したヘリカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態において、改変操作されたＣａｓポリペプチドは、そのサイズを変化させる変化、例えば、Ｃａｓポリペプチドの別の特性に対する顕著な効果なしにそのサイズを低下させるアミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態において、改変操作されたＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を与える変化を含む。例えば、改変操作されたＣａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように変化させることができる。

【0160】

所望の特性を有するＣａｓポリペプチドは、所望の特性を有する変異体または変化したＣａｓポリペプチドを提供するための、天然に存在するＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドの変化を含む多数の方法で作製することができる。例えば、親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然に存在するまたは改変操作されたＣａｓポリペプチド）の配列中に、１またはそれを超える変異を導入することができる。このような変異および差は、置換（例えば、保存的置換または非必須なアミノ酸の置換）、挿入または欠失を含み得る。いくつかの実施形態において、変異体Ｃａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドと比較して１またはそれを超える変異（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の変異）を含む。

【0161】

一実施形態において、変異体Ｃａｓポリペプチドは、天然に存在するＣａｓポリペプチドと異なる切断特性を備える。いくつかの実施形態において、ＣａｓはＣａｓニッカーゼ変異体である。Ｃａｓニッカーゼ変異体は、ただ１つの触媒的に活性なドメイン（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）を含む。Ｃａｓニッカーゼ変異体はｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡ結合を保持するが、ＤＮＡのただ１つの鎖を切断することができ、一本鎖切断（例えば、「ニック」）をもたらす。いくつかの実施形態において、２つの相補的Ｃａｓニッカーゼ変異体（例えば、不活化されたＲｕｖＣドメインを有する１つのＣａｓニッカーゼ変異体および不活化されたＨＮＨドメインを有する１つのＣａｓニッカーゼ変異体）が、２つのそれぞれの標的配列；センスＤＮＡ鎖上の１つの標的配列およびアンチセンスＤＮＡ鎖上の１つの標的配列に対応する２つのｇＲＮＡを用いて、同じ細胞中で発現される。２つの標的外ニックが二本鎖切断を生成するのに十分に近く生成される可能性は低いので、この二重ニッカーゼ系は付着二本鎖切断をもたらし、標的特異性を増加させることができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼ変異体は、相同組換え修復による外因性核酸配列の取り込みを促進するために、核酸修復テンプレートとともに同時発現される。

【0162】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓは非活性化されたＣａｓ（ｄＣａｓ）変異体である。このような実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、内因性酵素活性を全く含まず、ＤＮＡ切断を媒介することができない。このような実施形態において、ｄＣａｓは、非切断ベースの様式でＤＮＡを改変することができる異種のタンパク質と融合され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ｄＣａｓタンパク質は転写活性化因子または転写リプレッサードメイン（例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）；ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）；など）に融合される。いくつかのこのような事例では、ｄＣａｓ融合タンパク質は、標的ＤＮＡ中の特異的な位置（すなわち、配列）へガイドＲＮＡによって標的化され、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ結合の遮断（転写活性化因子機能を選択的に阻害する）および／または局所クロマチン状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変するまたは標的ＤＮＡと会合したポリペプチドを改変する融合配列が使用される場合）など遺伝子座特異的制御を及ぼす。いくつかの事例では、変化は一過性である（例えば、転写抑制または活性化）。いくつかの事例において、変化は遺伝性である（例えば、標的ＤＮＡにまたは標的ＤＮＡと会合されたタンパク質、例えば、ヌクレオソームのヒストンに後成的修飾が施された場合）

【0163】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＣａｓポリペプチドは、ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ特異性を変化させるために改変操作することができる。いくつかの実施形態において、変異体Ｃａｓポリペプチドは、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有する。例えば、オフターゲット部位を減少させ、特異性を改善させまたはＰＡＭ認識要求を除去するために変異体Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ配列を変化させるために、天然に存在するＣａｓタンパク質を改変することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＰＡＭ認識配列の長さを増加させるために改変することができる。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。指向性進化を用いて、異なるＰＡＭ配列を認識するおよび／または低下したオフターゲット活性を有するＣａｓポリペプチドを生成することができる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化のために使用することができる例示的な方法および系は、例えば、Ｅｓｖｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１、４７２（７３４４）：４９９－５０３に記載されている。

【0164】

例示的なＣａｓ変異体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１６１２７６号に記載されている。
ｇＲＮＡ

【0165】

本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを特異的な標的ＤＮＡ配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよびタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ配列中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。従って、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して、配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用し、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列はｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ配列内の任意の所望の配列にハイブリッド形成するために、（例えば、遺伝子改変操作によって）修飾することができる。

【0166】

ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的改変ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）と相互作用して、複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、上記ＤＮＡ標的化セグメントを介して、結合されたポリペプチドを、標的ＤＮＡ内の特異的なヌクレオチド配列へガイドする。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であり、二本鎖のＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドの２つの広がりを含む。

【0167】

いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは２つの別個のＲＮＡ分子を含む。このような実施形態において、２つのＲＮＡ分子のそれぞれは、２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリッド形成して、タンパク質結合セグメントの二本鎖のＲＮＡ二重鎖を形成するように互いに相補的であるヌクレオチドの広がりを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を含む。

【0168】

標的遺伝子座に対するｇＲＮＡの特異性は、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列に相補的である約２０ヌクレオチドを含むＤＮＡ結合セグメントの配列によって媒介される。いくつかの実施形態において、対応する標的ＤＮＡ配列はおよそ２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、本発明のｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列に少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態において、本発明のｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。いくつかの実施形態において、本発明のｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列に１００％相補的である。

【0169】

いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、ＢＴＫ遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0170】

いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表３中の配列の１つと少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
表３：例示的なガイド配列

【表3-1】

【表3-2】

【0171】

いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表３中の配列の１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表３中の配列の１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0172】

いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、表１に列記されているものから選択される標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、ＢＴＫ遺伝子のエクソン内またはイントロン内、好ましくはＢＴＫ遺伝子の第二または第三のエクソン内の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0173】

いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、配列番号１～８の１つと少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、配列番号１～８の１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集組成物は、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２またはそれを超えるｇＲＮＡ分子を含み、ここで、ＤＮＡ結合セグメントの少なくとも１つは、配列番号１～８の１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。

【0174】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、特定の標的遺伝子座または標的遺伝子に特有である標的配列を特定するための本分野において公知のアルゴリズム（例えば、Ｃａｓ－ＯＦＦ ｆｉｎｄｅｒ）を用いて、オフターゲット結合を最小限に抑えるように設計される。

【0175】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する１またはそれを超える修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。このような実施形態において、これらの修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、低下した自然免疫を誘発し得る。「自然免疫応答」という用語には、サイトカイン発現および放出、特にインターフェロン、および細胞死の誘導を伴う、一般的にはウイルスまたは細菌起源の、一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答が含まれる。

【0176】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、５’末端でまたはその付近で（例えば、ｇＲＮＡの５’末端の１～１０、１～５または１～２ヌクレオチド内）修飾される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの５’末端は、真核生物のｍＲＮＡキャップ構造またはキャップ類縁体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇｃａｐ類縁体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇｃａｐ類縁体または３’－０－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗リバースキャップ類縁体（ＡＲＣＡ））の包含によって修飾される。いくつかの実施形態において、インビトロ転写されたｇＲＮＡは、５’トリホスフェート基を除去するためのホスファターゼ（例えば、ウシ腸アルカリホスファターゼ）での処理によって修飾される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、その３’末端にまたはその付近に（例えば、ｇＲＮＡの３’末端の１～１０、１～５または１～２ヌクレオチド内）修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの３’末端は、１またはそれを超える（例えば、２５～２００）アデニン（Ａ）残基の付加によって修飾される。

【0177】

いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはｇＲＮＡ中に存在することができるが、他の遺伝子制御系、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡベースの系中にも存在し得る。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１またはそれより多くを含むことができる。
ａ）非連結ホスフェート酸素および／またはホスホジエステル骨格結合中の連結ホスフェート酸素の１もしくはそれより多くの一方または両方の改変、例えば、置換；
ｂ）リボース糖の、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの構成要素の改変、例えば、置換；
ｃ）「デホスホ」リンカーによるホスフェート部分の大規模な置換；
ｄ）天然に存在する核酸塩基の修飾または置換
ｅ）リボース－ホスフェート骨格の置換または修飾；
ｆ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端ホスフェート基の除去、修飾もしくは置換または部分の抱合；および
ｇ）糖の修飾。

【0178】

いくつかの実施形態において、２、３、４またはそれを超える修飾を有することができる修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを与えるために、上に列記されている修飾は組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾された糖および修飾された核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの全ての塩基が修飾される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ分子のホスフェート基のそれぞれが、ホスホロチオエート基で置換される。

【0179】

いくつかの実施形態において、使用者の標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適化するために、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性を最小化するために、ソフトウェアツールを使用することができる。オフターゲット活性は、切断以外であり得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を使用するそれぞれの可能なｇＲＮＡ選択に対して、ソフトウェアツールは、ある数まで（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）のミスマッチされた塩基対を含有する、（ＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭのいずれかに先行する）ゲノム全体にわたる全ての潜在的オフターゲット配列を同定することができる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に得られた重み付けスキームを用いて予想することができる。次いで、各可能なｇＲＮＡは、その予想される全てのオフターゲット切断に従って順位付けすることができ、最上位に順位付けされたｇＲＮＡが最大のオンターゲットおよび最小のオフターゲット切断を有する可能性があるｇＲＮＡに相当する。他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクター構築のための自動化された試薬設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイのためのプライマー設計次世代配列決定を介したオフターゲット切断の高処理量検出および定量のためのプライマー設計も、ツール中に含めることができる。
末端プロセシング酵素

【0180】

特定の実施形態において想定されるゲノム編集組成物および方法は、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣａｓタンパク質および末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断ペプチド配列、例えば、２Ａ配列によって、またはＩＲＥＳ配列によって隔てられた、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓタンパク質および末端プロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと末端プロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。

【0181】

「末端プロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の露出した末端を修飾する酵素を表す。ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖ハイブリッドおよび合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ以外の塩基を含有する）であり得る。末端プロセシング酵素は、１もしくはそれを超えるヌクレオチドを付加し、１もしくはそれを超えるヌクレオチドを除去し、ホスフェート基を除去もしくは修飾し、および／またはヒドロキシル基を除去もしくは修飾することによって、露出したポリヌクレオチド鎖末端を修飾し得る。末端プロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位においてまたは他の化学的もしくは機械的手段、例えば、剪断（例えば、細いゲージの針を通過させることによる、加熱、超音波処理、ミニビーズ転動および噴霧）、電離放射線、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解および化学療法剤によって生成された末端において、末端を修飾し得る。

【0182】

特定の実施形態において、特定の実施形態において想定されるゲノム編集組成物および方法は、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＤＮＡ末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。

【0183】

「ＤＮＡ末端プロセシング酵素」という用語は、ＤＮＡの露出した末端を修飾する酵素を表す。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、平滑末端または付着末端（５’または３’突出を有する末端）を修飾し得る。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを修飾し得る。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位においてまたは他の化学的もしくは機械的手段、例えば、剪断（例えば、細いゲージの針を通過させることによる、加熱、超音波処理、ミニビーズ転動および噴霧）、電離放射線、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解および化学療法剤によって生成された末端において、末端を修飾し得る。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、１もしくはそれを超えるヌクレオチドを付加し、１もしくはそれを超えるヌクレオチドを除去し、ホスフェート基を除去もしくは修飾し、および／またはヒドロキシル基を除去もしくは修飾することによって、露出したＤＮＡ末端を修飾し得る。

【0184】

本明細書において想定される特定の実施形態で使用するのに適したＤＮＡ末端プロセシング酵素の実例としては、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼおよび鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【0185】

本明細書において想定される特定の実施形態における使用に適したＤＮＡ末端プロセシング酵素のさらなる実例としては、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通ドメインのないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２，Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エキソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、Ａｎｔａｒｔｉｃ Ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌ ｍｕ、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４およびＵＬ－１２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0186】

特定の実施形態において、本明細書において想定される細胞のゲノムを編集するためのゲノム編集組成物および方法は、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓタンパク質およびエキソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。「エキソヌクレアーゼ」という用語は、３’または５’末端のいずれかにおけるホスホジエステル結合を切断する加水分解反応を介してポリヌクレオチド鎖の末端のホスホジエステル結合を切断する酵素を表す。

【0187】

本明細書において想定される特定の実施形態における使用に適したエキソヌクレアーゼの実例としては、ｈＥｘｏＩ、酵母ＥｘｏＩ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｘｏＩ、ｈＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ２、ラットＴＲＥＸ２、ｈＴＲＥＸ１、マウスＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１およびラットＴＲＥＸ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0188】

特定の実施形態において、ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、３’または５’エキソヌクレアーゼ、好ましくは、Ｔｒｅｘ１またはＴｒｅｘ２、より好ましくは、Ｔｒｅｘ２、さらに好ましくは、ヒトまたはマウスＴｒｅｘ２である。
Ｅ．標的部位

【0189】

特定の実施形態において想定されるヌクレアーゼ変異形は、ＢＴＫ遺伝子中の任意の適切な標的配列に結合するように設計することができ、天然に存在するエフェクタードメインと比較して、新規結合特異性を有することができる。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー要素などを含むがこれらに限定されない遺伝子の制御領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびドナー修復テンプレートは、治療用ポリヌクレオチドを挿入するように設計することができる。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびドナー修復テンプレートは、内在性ＢＴＫ遺伝子制御要素または発現調節配列の調節下で治療用ポリヌクレオチドを挿入するように設計することができる。

【0190】

様々な実施形態において、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｘ染色体上に位置するブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）遺伝子中の標的配列に結合し、切断する。ＢＴＫ遺伝子は、Ｂ細胞の発達および成熟にとって不可欠であるチロシンキナーゼをコードする。ＢＴＫは、とりわけ、ブルトン無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ、Ｂ細胞前駆細胞キナーゼ（ＢＰＫ）、チロシンタンパク質キナーゼＢＴＫアイソフォーム（エクソン１３～１７を欠如する）、ドミナントネガティブキナーゼ欠損ブルトン型チロシンキナーゼ、チロシン－タンパク質キナーゼＢＴＫアイソフォーム（エクソン１４を欠如する）、末端切断されたブルトン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ、ＰＳＣＴＫ１、ＡＧＭＸ１、無ガンマグロブリン血症（Ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎａｅｍｉａ）チロシンキナーゼ（ＡＴＫ）、無ガンマグロブリン血症（Ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）チロシンキナーゼ、チロシン－タンパク質キナーゼＢＴＫおよびＩＭＤ１とも称される。特定の実施形態において使用される例示的なＢＴＫ参照配列番号としては、ＮＭ＿００００６１．２、ＮＰ＿００００５２．１、ＡＫ０５７１０５、ＢＣ１０９０７９、ＤＡ６１９５４２、ＤＢ６３６７３７、ＣＣＤＳ１４４８２．１、Ｑ０６１８７、Ｑ５ＪＹ９０、ＥＮＳＰ０００００３０８１７６．７、ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２３６７６、ＥＮＳＴ０００００３０８７３１．７、ＯＴＴＨＵＭＴ００００００５７５３２、ＮＭ＿００１２８７３４４．１、ＮＰ＿００１２７４２７３．１、ＮＭ＿００１２８７３４５．１およびＮＰ＿００１２７４２７４．１．が挙げられるが、これらに限定されない。

【0191】

特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＢＴＫ遺伝子、好ましくはヒトＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中の標的配列、より好ましくは配列番号１～８に記載されているヒトＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中の標的配列中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列「ＡＣＴＴ」を切断することによって、配列番号１～８に記載されているＢＴＫ遺伝子の第一または第二のイントロン中の標的部位に二本鎖切断を導入するヌクレアーゼを含む。

【0192】

好ましい実施形態において、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は二本鎖ＤＮＡを切断し、配列番号１～８に記載されているポリヌクレオチド配列中にＤＳＢを導入する。

【0193】

好ましい実施形態において、ＢＴＫ遺伝子はヒトＢＴＫ遺伝子である。
Ｆ．ドナー修復テンプレート

【0194】

標的配列中にＤＳＢを導入するために、ヌクレアーゼ変異形が使用され得、ＤＳＢは、１またはそれを超えるドナー修復テンプレートの存在下で、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を通じて修復され得る。特定の実施形態において、ゲノム中に配列を挿入するために、ドナー修復テンプレートが使用される。特定の好ましい実施形態において、治療用ＢＴＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号１８を挿入するために、ドナー修復テンプレートが使用される。

【化1】

（配列番号１８）

【0195】

特定の好ましい実施形態において、ＢＴＫポリペプチドの発現が内在性ＢＴＫプロモーターおよび／またはエンハンサーの調節下にあるように、ドナー修復テンプレートが、治療用ＢＴＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入するために使用される。

【0196】

様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスベクターで細胞を形質導入することによって、ドナー修復テンプレートが造血細胞、例えば、造血幹もしくは前駆細胞、またはＣＤ３４^＋細胞中に導入される。

【0197】

特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位に隣接する１またはそれを超える相同性アームを含む。

【0198】

本明細書において使用される「相同性アーム」という用語は、ヌクレアーゼによって標的部位に導入されたＤＮＡ切断に隣接するＤＮＡ配列と同一またはほぼ同一である、ドナー修復テンプレート中の核酸配列を表す。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ切断部位の５’のＤＮＡ配列と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む５’相同性アームを含む。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ切断部位の３’のＤＮＡ配列と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む３’相同性アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５’相同性アームおよび３’相同性アームを含む。ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位に直接隣接したゲノム配列に対する相同性またはＤＳＢ部位から任意の数の塩基対内にあるゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐまたはそれを超える、ゲノム配列に対して相同である核酸配列を含み、相同な配列の任意の中間の長さを含む。

【0199】

特定の実施形態において想定される相同性アームの適切な長さの実例は、独立に選択され得、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐまたは約３０００ｂｐまたはこれより長い相同性アームを含むがこれらに限定されず、相同性アームの全ての中間の長さを含む。

【0200】

適切な相同性アームの長さのさらなる実例としては、約１００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約１５００ｂｐまたは約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐが挙げられるが、これらに限定されず、相同性アームの全ての中間の長さを含む。

【0201】

特定の実施形態において、５’および３’相同性アームの長さは、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐから独立に選択される。一実施形態において、５’相同性アームは約１５００ｂｐであり、３’相同性アームは約１０００ｂｐである。一実施形態において、５’相同性アームは約２００ｂｐ～約６００ｂｐであり、３’相同性アームは約２００ｂｐ～約６００ｂｐである。一実施形態において、５’相同性アームは約２００ｂｐであり、３’相同性アームは約２００ｂｐである。一実施形態において、５’相同性アームは約３００ｂｐであり、３’相同性アームは約３００ｂｐである。一実施形態において、５’相同性アームは約４００ｂｐであり、３’相同性アームは約４００ｂｐである。一実施形態において、５’相同性アームは約５００ｂｐであり、３’相同性アームは約５００ｂｐである。一実施形態において、５’相同性アームは約６００ｂｐであり、３’相同性アームは約６００ｂｐである。
Ｇ．ポリペプチド

【0202】

ＴＡＬＥＮおよびＣａｓタンパク質を含むがこれらに限定されない様々なポリペプチドが本明細書において想定される。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、表２に記載されているＲＶＤの１またはそれより多くをコードするアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、反対の指定がなければ、互換的に、慣用の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及びその他の変異形を含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび／または合成技術のいずれをも使用して調製することができる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、ポリペプチドは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの他、本分野において公知の他の修飾、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方を含み得る。

【0203】

本明細書において使用される「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、インビトロ合成、細胞環境からのおよび細胞の他の成分との会合からの単離および／または精製を表す、すなわち、インビボの物質を著しく伴っていない。

【0204】

特定の実施形態において想定されるポリペプチドの実例としては、ＴＡＬＥＮ、Ｃａｓタンパク質、末端プロセシングヌクレアーゼ、これらの融合ポリペプチドおよび変異形が含まれるが、これらに限定されない。

【0205】

ポリペプチドには、「ポリペプチド変異形」が含まれる。ポリペプチド変異形は、１またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失、付加および／または挿入において、天然に存在するポリペプチドと異なり得る。このような変異形は、天然に存在し得、または、例えば、上記ポリペプチド配列の１もしくはそれを超えるアミノ酸を修飾することによって合成的に生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチド中に１またはそれを超える置換、欠失、付加および／または挿入を導入することによって、ヒトＢＴＫ遺伝子中の標的部位を結合および切断するＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどの生物学的特性を改善することが望ましいことがあり得る。特定の実施形態において、ポリペプチドには、本明細書において想定される参照配列のいずれかと少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸同一性を有するポリペプチドが含まれ、典型的には、変異形は参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

【0206】

ポリペプチド変異形には、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」が含まれる。生物学的に活性なポリペプチド断片の実例としては、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが挙げられる。本明細書において使用される「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％または少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を表す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および／または切断活性である。ある実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含むことができる。ある実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００またはそれを超えるアミノ酸長であることが理解されるであろう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＴＡＬＥＮ変異形の生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されているポリペプチドは、「Ｘ」と表記される１またはそれを超えるアミノ酸を含み得る。アミノ酸配列番号中に存在する場合、「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す。１またはそれを超える「Ｘ」残基は、本明細書において想定される特定の配列番号中に記載されているアミノ酸配列のＮおよびＣ末端に存在し得る。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に記載されている残りのアミノ酸配列が生物学的に活性な断片と考えられ得る。

【0207】

生物学的に活性な断片は、Ｎ末端の末端切断および／またはＣ末端の末端切断を含み得る。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメイン配列と比較して、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインの１、２、３、４、５、６、７または８つのＮ末端のアミノ酸の欠失を欠如しまたは含み、より好ましくは、対応する野生型ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメイン配列と比較して、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインの４つのＮ末端のアミノ酸の欠失を欠如しまたは含む。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインと比較して、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインの１、２、３、４または５つのＣ末端のアミノ酸の欠失を欠如しまたは含み、より好ましくは、対応する野生型ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインと比較して、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインの２つのＣ末端のアミノ酸の欠失を欠如しまたは含む。特定の好ましい実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインと比較して、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬエフェクタードメインの４つのＮ末端のアミノ酸および２つのＣ末端のアミノ酸の欠失を欠如し、または含む。

【0208】

上述のとおり、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、末端切断および挿入を含む様々な方法で変化され得る。このような操作方法は、本分野において一般に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異形は、ＤＮＡ中の変異によって調製することができる。突然変異導入およびヌクレオチド配列改変のための方法は、本分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）およびこれらの中に引用されている参考文献を参照。関心対象のタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換についての指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデル中に見出され得る。

【0209】

ある実施形態において、変異形は１またはそれを超える保存的置換を含有するであろう。「保存的置換」とは、ペプチド化学の分野において通常の技術を有する者が、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標の性質が実質的に変更されないと予想するように、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されている置換である。修飾は、特定の実施形態において想定されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造中に施され得、ポリペプチドは、少なくともおよそを有するポリペプチドを含み、所望の特徴を有する変異形または誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子をなお取得する。等価なまたは改善された変異形ポリペプチドを作製するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることが望まれる場合、当業者は、例えば表１に従って、例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンの１またはそれより多くを変化させることができる。
表１－アミノ酸コドン

【表1B-1】

【表1B-2】

【0210】

生物学的活性を消失させずに何れのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失させることができるかを決定する上での指針は、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ ＶｅｃｔｏｒまたはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアなどの本分野において周知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。好ましくは、本明細書中に開示されているタンパク質変異形中のアミノ酸変化は保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に帯電したまたは帯電していないアミノ酸の置換である。保存的なアミノ酸変化は、その側鎖中に関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分類される：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および帯電していない極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に、合わせて芳香族アミノ酸として分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般的に、得られる分子の生物学的活性を変化させることなく施すことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４参照）。

【0211】

一実施形態において、２またはそれを超えるポリペプチドの発現が所望される場合には、２またはそれを超えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中の他の箇所に開示されているＩＲＥＳ配列によって隔てられることができる。

【0212】

特定の実施形態において想定されるポリペプチドには、融合ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを表す。

【0213】

別の実施形態において、２またはそれを超えるポリヌペプチドは、本明細書中の他の箇所に開示されている１またはそれを超える自己切断ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現されることができる。

【0214】

一実施形態において、本明細書において想定される融合タンパク質は、１またはそれを超えるＴＡＬエフェクタードメインおよび１またはそれを超えるヌクレアーゼ、ならびに１またはそれを超えるリンカーおよび／または自己切断ポリペプチドを含む。

【0215】

一実施形態において、本明細書において想定される融合タンパク質は、ＴＡＬＥＮ変異形と、リンカーまたは自己切断ペプチドと、ならびに５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼおよび３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むがこれらに限定されない末端プロセシング酵素とを含む。

【0216】

融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ－ＧおよびＨＡ）、ポリペプチドリンカーおよびポリペプチド切断シグナルを含むがこれらに限定されない１またはそれを超えるポリペプチドドメインまたはセグメントを含むことができる。融合ポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端がＮ末端に連結されているが、Ｃ末端がＣ末端に、Ｎ末端がＮ末端にまたはＮ末端がＣ末端にも連結され得る。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であり得る。融合ポリペプチドの所望される活性が保存される限り、融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、保存的に修飾された変異形、多型変異形、対立遺伝子、変異体、サブ配列および種間相同体も含むことができる。融合ポリペプチドは、化学的合成法によってもしくは２つの部分間での化学的連結によって作製され得、または他の標準的な技術を用いて、一般的に調製され得る。融合ポリペプチドを含む連結されたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所に開示されている適切な転写または翻訳調節要素に動作可能に連結される。

【0217】

融合ポリペプチドは、１もしくはそれを超えるポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結するために使用することができるリンカーを必要に応じて含み得る。ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその適切な二次構造および三次構造に折り畳まれて、ポリペプチドドメインにその所望の機能を確実に発揮させるのに十分な距離によって、任意の２またはそれを超えるポリペプチド成分を隔てるために利用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、本分野における標準的な技術を用いて融合ポリペプチド中に取り込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）柔軟な伸長した立体構造を採る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用することができる二次構造を採る能力の欠如；ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または帯電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどのその他の近い中性アミノ酸も、リンカー配列中に使用され得る。リンカーとして有用に利用され得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが挙げられる。当該融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体障害を抑制するために使用することができる非必須のＮ末端アミノ酸領域を含有する場合には、リンカー配列は必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される柔軟なアミノ酸サブ配列である。リンカーポリペプチドは、１～２００アミノ酸の長さ、１～１００アミノ酸の長さまたは１～５０アミノ酸の長さであり得、これらの間の全ての整数値を含む。

【0218】

例示的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列：グリシンポリマー（Ｇ）_ｎ；グリシン－セリンポリマー（Ｇ_１－５Ｓ_１－５）_ｎ、式中、ｎは少なくとも１、２、３、４または５の整数である；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号３６）；ＴＧＥＫＰ（配列番号３７）（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ ５５２５－５５３０（１９９７））；ＧＧＲＲ（配列番号３８）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、１９９５、上記）；（ＧＧＧＧＳ）_ｎ 式中、ｎ＝１、２、３、４または５（配列番号３９）（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ ９３，１１５６－１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号４０）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４１）（Ｂｉｒｄら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号４２）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号４３）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号４４）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）_２ＥＲＰ（配列番号４５）が挙げられるが、これらに限定されない。または、柔軟なリンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを用いて（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４）またはファージディスプレイ法によって合理的に設計することができる。

【0219】

融合ポリペプチドは、本明細書に記載されているポリペプチドドメインのそれぞれの間にまたは内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチド間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。さらに、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列中に配置することができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、ポリペプチド切断認識部位、例えば、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）および自己切断ウイルスオリゴペプチドが含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４，Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６参照）。

【0220】

適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎら、１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋら、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８５－５９４参照）。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、バイモウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、バイモウイルスＲＮＡ－２によってコードされるプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球形ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断厳格性のために、一実施形態において、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号４６）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４７）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４８）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧまたはＱとＳの間で起こる）を表す）が好ましい。

【0221】

ある種の実施形態において、自己切断ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。特定の実施形態において、ウイルスの２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチドまたはカルジオウイルス２Ａペプチドである。

【0222】

一実施形態において、ウイルスの２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａ型ウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチドおよび脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。

【0223】

２Ａ部位の実例は、表２に提供されている。
表２：例示的な２Ａ部位としては、以下の配列が挙げられる：

【表2B-1】

【表2B-2】

Ｈ．ポリヌクレオチド

【0224】

特定の実施形態において、本明細書において想定される１またはそれを超えるＴＡＬＥＮ、ＴＡＬエフェクタードメイン、Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、末端プロセシング酵素および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを表す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得、組換え、合成または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡおよび組換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００または少なくとも１５０００またはそれを超えるヌクレオチド長のヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれかの種類の修飾された形態のいずれか、ならびに全ての中間の長さを表す。「中間の長さ」は、この文脈において、引用された値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など；１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することが容易に理解されるであろう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは変異形は、参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0225】

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはコドン最適化され得る。本明細書において使用される「コドン最適化された」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性および／または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換することを表す。コドン最適化に影響を与える要因としては、（ｉ）２もしくはそれを超える生物もしくは遺伝子間でのコドンバイアスもしくは合成的に構築されたバイアス表の変動、（ｉｉ）生物、遺伝子もしくは遺伝子の組内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテクストを含むコドンの系統的変動、（ｉｖ）コドンのデコードするｔＲＮＡに従うコドンの変動、（ｖ）トリプレットの全体的なまたは１つの位置におけるＧＣ％に従うコドンの変動、（ｖｉ）参照配列、例えば、天然に存在する配列との類似性の程度の変動、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的特性、（ｉｘ）コドン置換の組の設計が基礎とすべきるＤＮＡ配列の機能についての従前の知識、および／または（ｘ）各アミノ酸に対するコドンの組の系統的変動、および／または（ｘｉ）偽の翻訳開始部位の単離された除去の１またはそれより多くが挙げられるが、これらに限定されない。

【0226】

本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、リン酸化された糖とＮ－グリコシド結合した複素環式窒素塩基を表す。ヌクレオチドは、天然塩基および本分野で認知されている多様な修飾された塩基を含むことが理解される。このような塩基は、一般的には、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、一般的には、塩基、糖およびホスフェート基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）では、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）では、糖はデオキシリボース、すなわち、リボース中に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。例示的な天然の窒素塩基には、プリンであるアデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジンであるシチジン（Ｃ）およびチミジン（Ｔ）（または、ＲＮＡの場合にはウラシル（Ｕ））が含まれる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合される。ヌクレオチドは、通常、モノ、ジまたはトリホスフェートである。ヌクレオチドは、糖、ホスフェートおよび／または塩基部分において修飾されないまたは修飾されることが可能である（ヌクレオチド類縁体、ヌクレオチド誘導体、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチドおよび非標準的なヌクレオチドとも互換的に称され、例えば、国際公開第９２／０７０６５号および国際公開第９３／１５１８７号参照）。修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈら、（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）によって要約されている。

【0227】

ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルとみなすこともでき、エステル化は糖のＣ－５に付着されたヒドロキシル基上で起こる。本明細書において使用される「ヌクレオシド」という用語は、糖とＮ－グリコシド結合した複素環式窒素塩基を表す。本分野において、ヌクレオシドは、天然塩基を含むこと、および周知の修飾された塩基も含むことが認識されている。このような塩基は、一般的には、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオシドは、一般的には、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖および／または塩基部分において修飾されないまたは修飾されることが可能である（ヌクレオシド類縁体、ヌクレオシド誘導体、修飾されたヌクレオシド、非天然ヌクレオシドおよび非標準的なヌクレオシドとも互換的に称される）。同じく上述されているように、修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈら、（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）によって要約されている。

【0228】

様々な例示的実施形態において、本明細書において想定されるポリヌクレオチドとしては、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ガイドＲＮＡ、末端プロセシング酵素、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに発現ベクター、ウイルスベクターおよび本明細書において想定されるポリヌクレオチドを含む導入プラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0229】

本明細書において使用される「ポリヌクレオチド変異形」および「変異形」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列または以下で定義されている厳格な条件下で参照配列とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを表す。これらの用語は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって参照ポリヌクレオチドから区別されるポリヌクレオチドも包含する。従って、「ポリヌクレオチド変異形」および「変異形」という用語には、１またはそれを超えるヌクレオチドが付加されまたは欠失され、または修飾され、または異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失および置換を含むある種の変化を参照ポリヌクレオチドに施すことができ、それにより、改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが本分野において十分に理解されている。

【0230】

一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳格な条件下で標的核酸配列にハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む。「厳格な条件」下でハイブリッド形成することは、互いに少なくとも６０％同一のヌクレオチド配列がハイブリッド形成された状態を保つハイブリダイゼーションプロトコールを記載する。一般的には、厳格な条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリッド形成する（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般的に過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される。

【0231】

本明細書において使用される「配列同一性」または、例えば、「５０％同一な配列」を含むという表記は、比較のウィンドウにわたる、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸ベースで配列が同一である程度を表す。従って、「配列同一性の百分率」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適に並列された配列を比較すること、合致した位置の数を得るために、両配列中で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が生じる位置の数を決定すること、合致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって除すること、および配列同一性の百分率を得るために結果に１００を乗じることによって計算され得る。本明細書に記載されている参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチド変異形は参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。

【0232】

２またはそれを超えるポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係性を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、長さが少なくとも１２単量体単位であるが、しばしば１５～１８単量体単位、多くの場合少なくとも２５単量体単位であり、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を包含する。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）（すなわち、２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るので、２（またはそれを超える）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適に並列された後に、配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較される少なくとも６つの連続する部分、通常は、約５０～約１００、より通常は、約１００～約１５０の連続する部分の概念的セグメントを表す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適な並列のために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、間隙）を含み得る。比較ウィンドウを並列させるための配列の最適な並列は、アルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良の並列（すなわち、比較ウィンドウにわたって最高の百分率相同性をもたらす）によって実施され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照され得る。配列分析の詳細な論述は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙのユニット１９．３、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９４－１９９８，１５章に見出すことができる。

【0233】

本明細書において使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態で当該ポリペプチドに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常当該断片に隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を表す。特定の実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドまたは自然に存在せず、人の手によって作られたその他のポリヌクレオチドを表す。

【0234】

いくつかの実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、本開示は部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクター中に含まれる。

【0235】

様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬエフェクタードメイン、Ｃａｓタンパク質および末端プロセシング酵素を含むがこれらに限定されない本明細書において想定されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ、１またはそれを超えるヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチドならびにポリ（Ａ）テールを含む。

【0236】

特定の実施形態において、本明細書において想定されるｍＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護し、ｍＲＮＡを安定化し、および翻訳を促進することを補助するために、ポリ（Ａ）テールを含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。

【0237】

特定の実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または少なくとも約５００またはそれを超えるアデニンヌクレオチドまたは任意の中間の数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４または２７５またはそれを超えるアデニンヌクレオチドである。

【0238】

特定の実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さは、約１０～約５００アデニンヌクレオチド、約５０～約５００アデニンヌクレオチド、約１００～約５００アデニンヌクレオチド、約１５０～約５００アデニンヌクレオチド、約２００～約５００アデニンヌクレオチド、約２５０～約５００アデニンヌクレオチド、約３００～約５００アデニンヌクレオチド、約５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約５０～約４００アデニンヌクレオチド、約５０～約３５０アデニンヌクレオチド、約１００～約５００アデニンヌクレオチド、約１００～約４５０アデニンヌクレオチド、約１００～約４００アデニンヌクレオチド、約１００～約３５０アデニンヌクレオチド、約１００～約３００アデニンヌクレオチド、約１５０～約５００アデニンヌクレオチド、約１５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約４００アデニンヌクレオチド、約１５０～約３５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約３００アデニンヌクレオチド、約１５０～約２５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約２００アデニンヌクレオチド、約２００～約５００アデニンヌクレオチド、約２００～約４５０アデニンヌクレオチド、約２００～約４００アデニンヌクレオチド、約２００～約３５０アデニンヌクレオチド、約２００～約３００アデニンヌクレオチド、約２５０～約５００アデニンヌクレオチド、約２５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約２５０～約４００アデニンヌクレオチド、約２５０～約３５０アデニンヌクレオチドまたは約２５０～約３００アデニンヌクレオチドまたは任意の中間の範囲のアデニンヌクレオチドである。

【0239】

ポリヌクレオチドの方向性を記載する用語には、５’（通常、遊離のホスフェート基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離のヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向性でまたは３’から５’の方向性で注釈を付けることができる。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、５’から３’への鎖は、その配列がプレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるので［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）に代えて、ＲＮＡ中ではウラシル（Ｕ）であることを除く］、「センス」、「プラス」または「コード」鎖と表記される。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’への鎖は、「テンプレート」、「アンチセンス」、「マイナス」または「非コード」鎖と表記される。本明細書において使用される「逆方向性」という用語は、３’から５’への方向性で書かれた５’から３’への配列または５’から３’への方向性で書かれた３’から５’への配列を表す。

【0240】

「相補的な」および「相補性」という用語は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を表す。例えば、ＤＮＡ配列の相補鎖５’ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’は、３’ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、しばしば、左側に５’末端および右側に３’末端を有する逆相補鎖、５’ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’として書かれる。その逆相補鎖と等しい配列は、回文配列であると言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対形成規則に従って合致される「部分的」であり得る。または、核酸間で「完全な」または「全部の」相補性が存在し得る。

【0241】

本明細書において使用される「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡ、その後にポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を表す。一実施形態において、核酸カセットは、関心対象の遺伝子、例えば、関心対象のポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１またはそれを超える発現調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列および関心対象の遺伝子、例えば、関心対象のポリヌクレオチドを含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれを超える核酸カセットを含み得る。カセット中の核酸がＲＮＡに転写されることができ、必要な場合には、タンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞中での活性のために必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適切な区画へ移動されることができるように、核酸カセットは、位置的におよび順序的に正しくベクター内に配置される。好ましくは、カセットは、ベクター中への容易な挿入のために適合されたその３’および５’末端を有する、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を処置し、予防し、または軽減するために使用される治療用遺伝子の配列を含有する。カセットは、単一のユニットとして、取り出され、プラスミドまたはウイルスベクター中に挿入することができる。

【0242】

ポリヌクレオチドには、関心対象のポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において使用される「関心対象のポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本明細書において想定される阻害的ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとしての役割を果たすポリヌクレオチドを表す。

【0243】

さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書において想定される、ポリペプチドまたはその変異形の断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにも関わらず、コドン使用の差のために変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択に対して最適化されたポリヌクレオチドが、特定の実施形態において具体的に想定される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１またはそれを超える変異の結果として変化された内在性ポリヌクレオチド配列である。

【0244】

ある実施形態において、関心対象のポリヌクレオチドはドナー修復テンプレートを含む。

【0245】

コード配列自体の長さに関わらず、特定の実施形態において想定されたポリヌクレオチドは、それらの全体的な長さが大幅に変動し得るように、本明細書の他の箇所に開示されているまたは本分野において公知である、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴおよびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、転写後応答要素および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグと組み合わされ得る。従って、特定の実施形態において、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチド断片が利用され得ることが想定され、その全長は、好ましくは、調製の容易さおよび所期の組換えＤＮＡプロトコールにおける使用によって制約される。

【0246】

ポリヌクレオチドは、本分野において公知の利用可能な様々な十分に確立された技術のいずれをも用いて調製され、操作され、発現され、および／または送達されることができる。所望のポリペプチドを発現するために、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は適切なベクター中に挿入することができる。所望のポリペプチドは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞中に送達することによっても発現することができる。

【0247】

ベクターの実例としては、プラスミド、自己複製配列および転位因子、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。

【0248】

ベクターのさらなる実例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージおよび動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0249】

ベクターとして有用なウイルスの実例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0250】

発現ベクターの実例としては、哺乳動物細胞中での発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；レンチウイルスによって媒介される遺伝子導入および哺乳動物細胞中での発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されているポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞中でのポリペプチドの発現のために、このような発現ベクター中に連結させることができる。

【0251】

特定の実施形態において、ベクターは、エピソームのベクターまたは染色体外に維持されたベクターである。本明細書において使用される「エピソームの」という用語は、宿主の染色体のＤＮＡ中への組み込みなしに、および分裂する宿主細胞から徐々に失われることなしに複製することができるベクターを表す、すなわち、前記ベクターは染色体外でまたはエピソームで複製することも意味する。

【0252】

発現ベクター中に存在する「発現調節配列」、「調節要素」または「制御配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域－複製の起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、転写後制御要素、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域－である。このような要素は、その強度および特異性において変動し得る。使用されるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写および翻訳要素が使用され得る。

【0253】

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定されないベクターを含む。ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの１またはそれを超える外因性、内在性または異種の調節配列を含み得る。「内在性調節配列」は、ゲノム中の所定の遺伝子と天然に連結されている調節配列である。「外因性調節配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって誘導されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）を用いて遺伝子に並置されている調節配列である。「異種の調節配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種由来の外因性配列である。「合成」調節配列は、１もしくはそれを超える（ｏｎｅ ｍｏｒｅ）内在性および／もしくは外因性配列の要素、ならびに／または特定の治療に対して最適なプロモーターおよび／もしくはエンハンサー活性を提供するインビトロまたはインシリコで決定された配列を含み得る。

【0254】

本明細書において使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を表す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドを惹起し、転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞中で動作するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴが豊富な領域および／または転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）を含む。

【0255】

「エンハンサー」という用語は、強化された転写を与えることができる配列を含有し、いくつかの事例では、別の調節配列に対するその配向性と独立して機能することができるＤＮＡのセグメントを表す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協同的にまたは付加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを表す。

【0256】

「動作可能に連結された」という用語は、記載された成分が、その意図された様式で機能することができる関係性にある並置を表す。一実施形態において、本用語は、核酸発現調節配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第二のポリヌクレオチド配列、例えば、関心対象のポリヌクレオチドとの間の機能的な連結であって、発現調節配列が第二の配列に対応する核酸の転写を誘導する機能的な連結を表す。

【0257】

本明細書において使用される「恒常的発現調節配列」という用語は、動作可能に連結された配列の転写を持続的にまたは連続的に許容するプロモーター、エンハンサーまたはプロモーター／エンハンサーを表す。恒常的発現調節配列は、それぞれ、幅広い様々な細胞および組織種中での発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサーもしくはプロモーター／エンハンサーであり得、または限定された様々な細胞および組織種中での発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞種特異的」、「細胞系列特異的」または「組織特異的」プロモーター、エンハンサーもしくはプロモーター／エンハンサーであり得る。

【0258】

特定の実施形態における使用に適した例示的な遍在性発現調節配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５およびＰ１１プロモーター、短い伸長因子１－α（ＥＦ１ａ－短）プロモーター、長い伸長因子１－α（ＥＦ１ａ－長）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａβ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６領域（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、欠失された負の制御領域（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｄｅｌｅｔｅｄ）、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換された（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８－５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0259】

特定の実施形態において、（例えば、細胞種、細胞系列もしくは組織の一部の中のみでまたは発達の特異的段階の間に、ポリペプチドをコードする特定の核酸を発現するために）所望のポリヌクレオチド配列の細胞種特異的、系列特異的または組織特異的発現を達成するために、細胞、細胞種、細胞系列または組織特異的発現調節配列を使用することが望ましいことがあり得る。

【0260】

本明細書において使用される「条件的発現」は、誘導性発現；抑制可能な発現；特定の生理学的、生物学的または疾患状態などを有する細胞または組織中での発現を含むが、これらに限定されない任意の種類の条件的発現を表し得る。この定義は、細胞種または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある実施形態は、関心対象のポリヌクレオチドの条件的発現を提供し、例えば、ポリヌクレオチドを発現させるまたは関心対象のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増加もしくは減少を引き起こす処置または条件に、例えば、細胞、組織、生物などを供することによって、発現が調節される。

【0261】

誘導性プロモーター／系の実例としては、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子に対するプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処置によって誘導可能）、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（様々な重金属での処理によって誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御可能な系（Ｓｉｒｉｎら、２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート誘導性遺伝子スイッチ（国際公開第２００２／０８８３４６号）、テトラサイクリン依存性制御系などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0262】

条件的発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成することができる。ある実施形態によると、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的には２つの）部位を含む。本明細書において使用される「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語には、１またはそれを超える組換え部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える）を伴う組換え反応に関与する除去（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）または組込みタンパク質、酵素、補因子または関連するタンパク質が含まれ、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）参照）または変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片およびこれらの変異形であり得る。特定の実施形態において使用するのに適したリコンビナーゼの実例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１およびＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0263】

ポリヌクレオチドは、幅広い多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対する１またはそれを超える組換え部位を含み得る。ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みのために必要とされるいずれかの部位に加えて、部位特異的リコンビナーゼに対する標的部位が必要とされることが理解されるべきである。本明細書において使用される「組換え配列」、「組換え部位」または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を表す。

【0264】

特定の実施形態において、本明細書において想定されるポリヌクレオチドには、１またはそれを超えるポリペプチドをコードする１またはそれを超える関心対象のポリヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態において、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１もしくはそれを超えるＩＲＥＳ配列または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離されることができる。

【0265】

本明細書において使用される「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン、例えば、ＡＴＧへ直接の配列内リボソーム侵入を促進し、これにより、遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳を導く要素を表す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３）およびＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ
１（１０）：９８５－１０００を参照。当業者によって一般的に利用されるＩＲＥＳの例としては、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されているものが挙げられる。本分野において公知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから取得可能なＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０）およびウイルスまたは細胞のｍＲＮＡ源から取得可能なＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚら、１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８－６１９０）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、およびインシュリン様増殖因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇおよび酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅら、１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６（３）：１６０２－９）およびＶＥＧＦ ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚら、１９９８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８（１１）：６１７８－９０）などが挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳは、ピコルナウイルス科、ジシストロウイルス科およびフラビウイルス科種のウイルスゲノム中に、ならびにＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）中にも報告されている。

【0266】

特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスコザック配列を有するおよび所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書において使用される「コザック配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットへのｍＲＮＡの最初の結合を大幅に促進し、翻訳を増加する短いヌクレオチド配列を表す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号７１）であり、ここで、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。

【0267】

異種の核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を誘導する要素は、異種の遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般的には、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’にポリアデニル化配列を含む。本明細書において使用される「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を表す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加によってｍＲＮＡ安定性を促進し、その結果、増加された翻訳効率に寄与することができる。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列によって誘導される。哺乳動物のプレｍＲＮＡに対するコアポリ（Ａ）配列は、切断－ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識要素を有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、ＵまたはＧＵ残基に富んだより可変な要素の２０～５０ヌクレオチド上流に位置する。新生転写物の切断はこれらの２つの要素間で起こり、５’切断生成物への最大２５０のアデノシンの付加に連結される。特定の実施形態において、コアポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβグロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、これらの変異形または本分野において公知の別の適切な異種のもしくは内在するポリＡ配列である。

【0268】

特定の実施形態において、１またはそれを超えるＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、末端プロセシング酵素または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスおよびウイルス法の両方によって、造血細胞、例えば、ＣＤ３４^＋細胞中に導入され得る。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮもしくはＣａｓヌクレアーゼをコードする１もしくはそれを超えるポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートの送達は、同一の方法によってもしくは異なる方法によっておよび／または同一のベクターによってもしくは異なるベクターによって提供され得る。

【0269】

「ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を導入しまたは輸送することができる核酸分子を表すために使用される。導入される核酸は、一般的には、ベクター核酸分子に連結される、例えば、ベクター核酸分子中に挿入される。ベクターは、細胞中での自律的複製を誘導する配列を含み得る、または宿主細胞ＤＮＡ中への組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態において、本明細書において想定される１またはそれを超えるポリヌクレオチドをＣＤ３４^＋細胞に送達するために、非ウイルスベクターが使用される。

【0270】

非ウイルスベクターの実例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミドおよび細菌の人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0271】

特定の実施形態において想定されるポリヌクレオチドの非ウイルス性送達の例示的な方法としては、電気穿孔、超音波穿孔、リポフェクション、微量注入、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸抱合体、裸のＤＮＡ、人工のビリオン、ＤＥＡＥ－デキストランによって媒介される導入、遺伝子銃および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。

【0272】

特定の実施形態において測定される特定の実施形態での使用に適したポリヌクレオチド送達系の実例としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＳｙｓｔｅｍｓおよびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７；およびＢａｌａｚｓら、（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照。抗体を標的とする、細菌由来の、非生物ナノセルベースの送達も、特定の実施形態において想定される。

【0273】

特定の実施形態において想定されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、個々の患者への投与によって、典型的には、以下に記載されているような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達することができる。または、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検など）または万能ドナー造血幹細胞など、エクスビボで細胞に送達することができ、患者中への細胞の再移植がこれに続く。

【0274】

一実施形態において、ＴＡＬＥＮ変異形もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与される。または、裸のＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路により、注射、注入、局所適用および電気穿孔を含むがこれらに限定されない。このような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、当業者に周知であって、特定の組成物を投与するために１を超える経路を使用することができるが、多くの場合、別の経路より、特定の経路がより直ちにより効果的な反応を与えることができる。

【0275】

本明細書において想定される特定の実施形態における使用に適したウイルスベクター系の実例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｉ．ゲノム編集された細胞

【0276】

特定の実施形態において想定される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）の処置のための改善された細胞ベースの治療薬を提供する。いずれかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、本明細書において想定される組成物および方法は、内在性ＢＴＫ発現をほとんどまたは全くもたらさず、ＸＬＡをもたらす１またはそれを超える変異および／または欠失を含むＢＴＫ遺伝子中に、機能的なＢＴＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入するために使用することができ、その結果、ＸＬＡを処置するために、いくつかの実施形態においては、ＸＬＡを潜在的に治癒させるために使用され得るより強固なゲノム編集された細胞組成物を提供すると考えられる。

【0277】

特定の実施形態において想定されるゲノム編集された細胞は、自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）／自家性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（「自己」）または非自家（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であり得る。本明細書において使用される「自家」は、同じ被験体から得た細胞を表す。本明細書において使用される「同種異系」とは、比較する細胞に対して遺伝的に異なる、同じ種の細胞を表す。本明細書において使用される「同系」とは、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる被験体の細胞を表す。本明細書において使用される「異種」とは、比較する細胞と異なる種の細胞を表す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物の被験体から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類被験体、必要に応じて非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト被験体から得られる。

【0278】

「単離された細胞」は、天然に存在しない細胞、例えば、インビボ組織または器官から得られ、細胞外マトリックスを実質的に含まない天然に存在しない細胞、改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）細胞、改変操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）細胞などを表す。

【0279】

本明細書において想定される組成物および方法を用いてそのゲノムを編集することができる細胞種の実例としては、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞および分化した細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0280】

「幹細胞」という用語は、（１）長期自己再生（すなわち、元の細胞の少なくとも１つの同じコピーを生成する能力）、（２）単一細胞レベルでの、複数の、いくつかの事例ではただ１つの特殊化された細胞種への分化、および（３）組織のインビボ機能的再生をすることができる未分化細胞である細胞を表す。幹細胞は、その発達の能力に従って、全能性、多能性、複能性および寡／単能性として細分類される。「自己複製能」とは、変化していない娘細胞を産生し、特殊化された細胞種を生成する特有の能力（分化能（ｐｏｔｅｎｃｙ））を有する細胞を表す。自己複製能は、２通りに達成することができる。非対称細胞分裂は、親細胞と同一である１つの娘細胞と親細胞と異なる１つの娘細胞とを産生し、前駆細胞または分化した細胞である。対称細胞分裂は、２つの同一の娘細胞を産生する。細胞の「増殖」または「拡大」は、対称的に分裂する細胞を表す。

【0281】

本明細書において使用される「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」または「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）」は、自己複製し、より成熟した細胞へ分化する能力を有する細胞を表す。多くの前駆細胞は、単一の系列に沿って分化するが、極めて大規模な増殖能を有し得る。

【0282】

特定の実施形態において、細胞は初代細胞である。本明細書において使用される「初代細胞」という用語は、組織から単離され、インビトロまたはエクスビボで増殖のために確立された細胞を表すために本分野において公知である。対応する細胞は、たとえ経ている場合でも集団倍加をほとんど経ておらず、したがって、継代細胞株と比べて、細胞が由来する組織の主要な機能的成分をより代表しており、そのため、インビボ状態をより忠実に表すモデルとなる。様々な組織から試料を得る方法および初代細胞株を確立する方法は、本分野において周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７参照）。本明細書において想定される方法において使用するための初代細胞は、臍帯血、胎盤血、動員末梢血および骨髄に由来する。一実施形態において、初代細胞は造血幹または前駆細胞である。

【0283】

一実施形態において、ゲノム編集された細胞は胚性幹細胞である。

【0284】

一実施形態において、ゲノム編集された細胞は成体幹または前駆細胞である。

【0285】

一実施形態において、ゲノム編集された細胞は初代細胞である。

【0286】

好ましい実施形態において、ゲノム編集された細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、例えば、Ｂ細胞前駆細胞、または造血細胞を含む細胞集団である。

【0287】

本明細書において使用される「細胞の集団」という用語は、本明細書の他の箇所において記載されているように、均一なまたは不均一な細胞種のあらゆる数および／または組み合わせから構成され得る複数の細胞を表す。例えば、造血幹または前駆細胞の形質導入のために、細胞の集団は、臍帯血、胎盤血、骨髄または動員末梢血から単離または取得され得る。細胞の集団は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％の編集されるべき標的細胞種を含み得る。ある実施形態において、造血幹または前駆細胞は、本分野において公知の方法を用いて、不均一な細胞の集団から単離または精製され得る。

【0288】

造血細胞の例示的な取得源としては、臍帯血、骨髄または動員末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。

【0289】

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物の生存期間にわたって、成熟した血液細胞のレパートリー全体を生成することができる単分化能性造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じる。「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄細胞系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ球系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および本分野において公知の他の血液細胞種（Ｆｅｉ，Ｒ．ら、米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅら、米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．ら、米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏら、米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７１６，８２７号参照）を含む、生物の全ての血液細胞種を生じる多能性幹細胞を表す。致死的に照射された動物またはヒト中に移植された場合、造血幹および前駆細胞は、赤血球、好中球－マクロファージ、巨核球およびリンパ系造血細胞プールを再定着させることができる。

【0290】

本明細書において想定される方法および組成物とともに使用するのに適した造血幹または前駆細胞のさらなる実例としては、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ＬｏＣＤ９０^＋ＣＤ４５^ＲＡ－である造血細胞、ＣＤ３４^＋、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^Ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７^＋およびＬｉｎ^（－）である造血細胞ならびにＣＤ１３３^＋である造血細胞が挙げられる。

【0291】

好ましい実施形態において、ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋である造血細胞。

【0292】

好ましい実施形態において、ＣＤ１３３^＋ＣＤ３４^＋である造血細胞。

【0293】

好ましい実施形態において、ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋である造血細胞。

【0294】

造血階層を性質決定するための様々な方法が存在する。性質決定の一方法は、ＳＬＡＭコードである。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、その遺伝子が１番染色体（マウス）上の単一の遺伝子座中に多くは直列に位置しており、全てが免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの部分集団に属し、元々はＴ細胞刺激に関与すると考えられた１０を超える分子の群である。このファミリーには、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４などが含まれ、ＣＤ１５０は創設メンバーであり、このため、ｓｌａｍＦ１、すなわち、ＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血階層に対するシグネチャＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）－ＣＤ１５０^＋ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^－；多能性前駆細胞（ＭＰＰ）－ＣＤ１５０^－ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^＋；系統拘束前駆細胞（ＬＲＰ）－ＣＤ１５０^－ＣＤ４８^＋ＣＤ２４４^＋；骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）－ｌｉｎ－ＳＣＡ－１－ｃ－ｋｉｔ^＋ＣＤ３４^＋ＣＤ１６／３２^ｍｉｄ．；顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）－ｌｉｎ^－ＳＣＡ－１－ｃ－ｋｉｔ^＋ＣＤ３４^＋ＣＤ１６／３２^ｈｉ．；および巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）－ｌｉｎ^－ＳＣＡ－１－ｃ－ｋｉｔ^＋ＣＤ３４^－ＣＤ１６／３２^ｌｏｗである。

【0295】

本明細書において想定される組成物および方法によって編集される好ましい標的細胞種としては、造血細胞、好ましくはヒト造血細胞、より好ましくはヒト造血幹および前駆細胞、さらに好ましくはＣＤ３４^＋ヒト造血幹細胞が挙げられる。本明細書において使用される「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を表す。本明細書において使用される「ＣＤ３４」は、細胞－細胞接着因子としてしばしば働く細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を表す。ＣＤ３４＋は、造血幹および前駆細胞の両方の細胞表面マーカーである。

【0296】

一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１５０^＋ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^－細胞である。

【0297】

一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ１３３^＋細胞である。

【0298】

一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１３３^＋細胞である。

【0299】

一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４^＋細胞である。

【0300】

特定の実施形態において、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞の集団は、機能的ＢＴＫポリペプチドを発現させるように編集された欠陥ＢＴＫ遺伝子を含み、編集はＨＤＲによって修復されたＤＳＢである。

【0301】

特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞はＢ細胞前駆細胞を含む。

【0302】

特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ほとんどまたは全く内在性ＢＴＫ発現をもたらさないＢＴＫ遺伝子中に１またはそれを超える変異および／または欠失を含む。
Ｊ．組成物および製剤

【0303】

特定の実施形態において想定される組成物は、本明細書において想定されるとおりの、１またはそれを超えるポリペプチド、ポリヌクレオチド、これらを含むベクター、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において想定されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団中のヒトＢＴＫ遺伝子中の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物は、造血細胞、例えば、造血幹もしくは前駆細胞、またはＣＤ３４^＋細胞中でＨＤＲによってＢＴＫ遺伝子を編集するために使用される。

【0304】

様々な実施形態において、本明細書において想定される組成物は、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および必要に応じて末端プロセシング酵素、例えば、３’－５’エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）を含む。ＴＡＬＥＮ変異形またはＣａｓタンパク質は、上に開示されたポリヌクレオチド送達方法、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子などを介して細胞中に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質が使用される場合にはガイドＲＮＡとともに、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと必要に応じて３’－５’エキソヌクレアーゼとを含む組成物は、上に開示されているポリヌクレオチド送達方法を介して細胞中に導入される。

【0305】

特定の実施形態において、本明細書において想定される組成物は、細胞の集団、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および必要に応じてドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書において想定される組成物は、細胞の集団、ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、末端プロセシング酵素および必要に応じてドナー修復テンプレートを含む。ＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／または末端プロセシング酵素は、上に開示されたポリヌクレオチド送達方法を介して細胞中に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。ドナー修復テンプレートは、別個の組成物を用いて細胞中に導入することもできる。

【0306】

特定の実施形態において、本明細書において想定される組成物は、細胞の集団、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびｇＲＮＡならびに必要に応じてドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書において想定される組成物は、細胞の集団、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびｇＲＮＡ、３’－５’エキソヌクレアーゼならびに必要に応じてドナー修復テンプレートを含む。ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびｇＲＮＡおよび／または３’－５’エキソヌクレアーゼは、上に開示されたポリヌクレオチド送達方法を介して細胞中に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。ドナー修復テンプレートは、別個の組成物を用いて細胞中に導入することもできる。ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、一緒にまたは別個の組成物によって細胞中に導入することもできる。Ｃａｓタンパク質は、タンパク質としてまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして供給することができる。

【0307】

特定の実施形態において、細胞の集団は、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ１３３^＋細胞およびＣＤ３４^＋細胞を含むがこれらに限定されない遺伝的に改変された造血細胞を含む。

【0308】

組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは１もしくはそれを超える他の治療の様式と組み合わせて、細胞又は動物に投与するための薬学的に許容され得るまたは生理的に許容され得る溶液中に調合された組成物を表す。所望であれば、組成物は、他の因子、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体または他の様々な薬学的に活性な因子などと組み合わせても投与され得ることも理解されるであろう。追加の因子が組成物に悪影響を与えない限り、同じく組成物中に含まれ得る他の成分には実質的に制限は存在しない。

【0309】

「薬学的に許容され得る」という用語は、合理的な便益／リスク比に相応して過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答またはその他の問題もしくは併発症なしに、健全な医学的判断の範疇内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適している、化合物、物質、組成物および／または剤形を表すために本明細書において使用される。

【0310】

「薬学的に許容され得る担体」という用語は、それらとともに治療用細胞が投与される希釈剤、佐剤、賦形剤またはビヒクルを表す。薬学的担体の実例は、無菌の液体、例えば、細胞培地、水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などであり得る。生理食塩水溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、液体担体、特に注射可能溶液用液体担体として利用することもできる。特定の実施形態における適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜（ｃｈａｌｋ）、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。慣用の媒体または因子が活性成分と不適合である場合を除き、治療組成物中でのその使用が想定される。補充的活性成分も、組成物中に取り込ませることもできる。

【0311】

一実施形態において、薬学的に許容され得る担体を含む組成物は被験体への投与に適している。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与に適している。特定の実施形態において、薬学的に許容され得る担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内またはくも膜下腔内投与に適している。薬学的に許容され得る担体には、無菌の、水溶液、細胞培地または分散液が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および因子の使用は、本分野において周知である。慣用の媒体または因子が形質導入された細胞と不適合である場合を除き、薬学的組成物中でのそれらの使用が想定される。

【0312】

特定の実施形態において、本明細書において想定される組成物は、機能的ＢＴＫポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む遺伝的に改変された造血幹および／または前駆細胞と薬学的に許容され得る担体とを含む。

【0313】

特定の実施形態において、本明細書において想定される組成物は、１もしくはそれを超える変異および／もしくは欠失を含むＢＴＫ遺伝子ならびに機能的ＢＴＫポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む遺伝的に改変された造血幹および／または前駆細胞と薬学的に許容され得る担体とを含む。本明細書に想定される細胞ベースの組成物を含む組成物は、非経口投与方法によって投与することができる。

【0314】

薬学的に許容され得る担体は、担体を処置されているヒト被験体への投与に適するようにするために十分に高い純度および十分に低い毒性でなければならない。薬学的に許容され得る担体は、さらに、組成物の安定性を維持しまたは増加させるべきである。薬学的に許容され得る担体は液体または固体とすることができ、投与の計画された様式を念頭に置いて、組成物の他の成分と組み合わされたときに所望の容積（ｂｕｌｋ）、粘度を与えるように選択される。例えば、薬学的に許容され得る担体は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩（ｍｅｔａｌｌｉｃ ｓｔｅａｒａｔｅ）、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であり得るが、これらに限定されない。本明細書において想定される組成物のための他の適切な薬学的に許容され得る担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0315】

このような担体溶液は、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加物も含有することができる。本明細書において使用される「緩衝液」という用語は、その化学的構成がｐＨの著しい変化なしに酸または塩基を中和する溶液または液体を表す。本明細書において想定される緩衝液の例としては、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液、５％水中デキストロース（Ｄ５Ｗ）、正常な／生理的な食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0316】

薬学的に許容され得る担体は、約７の組成物のｐＨを維持するのに十分な量で存在し得る。または、組成物は、約６．８～約７．４の範囲、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３および７．４のｐＨを有する。さらに別の実施形態において、組成物は約７．４のｐＨを有する。

【0317】

本明細書において想定される組成物は、無毒な薬学的に許容され得る媒質を含み得る。組成物は、懸濁液であり得る。本明細書において使用される「懸濁液」という用語は、その中で細胞が固体支持体に付着されていない非接着条件を表す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌または揺動され得、培養皿などの支持体に付着されない。

【0318】

特定の実施形態において、本明細書において想定される組成物は懸濁液中に調合され、ここで、ゲノム編集された造血幹および／または前駆細胞は、静脈内（ＩＶ）袋などの中の許容され得る液体媒質または溶液、例えば、生理食塩水または無血清媒質内に分散される。許容され得る希釈剤としては、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、無血清細胞培地および低温貯蔵に適した媒質、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）媒質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0319】

ある実施形態において、薬学的に許容され得る担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集された細胞、例えば、造血幹および前駆細胞の集団を含む組成物を保存するのに適している。治療用組成物は、ヒト患者中に投与されることが予定されており、このため、ウシ血清アルブミン、ウマ血清およびウシ胎仔血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。

【0320】

いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容され得る細胞培地中に調合される。このような組成物は、ヒト被験体に投与するのに適している。特定の実施形態において、薬学的に許容され得る細胞培地は無血清培地である。

【0321】

無血清培地は、簡略化され、より明確に確定された組成、混入物の低下した程度、潜在的な感染性因子源の除去およびより低い費用を含む、血清含有培地に比べていくつかの利点を有する。様々な実施形態において、無血清培地は無動物であり、必要に応じて無タンパク質であり得る。必要に応じて、培地は、生物薬剤学的に許容され得る組換えタンパク質を含有し得る。「無動物」培地は、成分が非動物源に由来する培地を表す。組換えタンパク質は、無動物培地中の天然の動物タンパク質を置き換え、栄養素は、合成、植物または微生物源から取得される。これに対して、「無タンパク質」培地は、タンパク質を実質的に含まないとして定義される。

【0322】

特定の組成物中で使用される無血清培地の実例としては、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられるが、これらに限定されない。

【0323】

好ましい実施形態において、ゲノム編集された造血幹および／または前駆細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ中に調合される。

【0324】

様々な実施形態において、造血幹および／または前駆細胞を含む組成物は、凍結保護培地中に調合される。例えば、凍結保護剤を有する凍結保護培地が、融解後に高い細胞生存率結果を維持するために使用され得る。特定の組成物中で使用される凍結保護培地の実例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0325】

一実施形態において、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む溶液中に調合される。

【0326】

特定の実施形態において、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシンおよび微生物の混入を実質的に含まない。エンドトキシンに関する「実質的に含まない」によって、生物学的医薬品（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）に対してＦＤＡが許容するより少ない細胞の用量当たりのエンドトキシン、すなわち、１日当たり５ＥＵ／ｋｇ体重の総エンドトキシン、すなわち、平均７０ｋｇの人に対して細胞の総用量当たり３５０ＥＵが存在することを意味する。特定の実施形態において、本明細書において想定されるレトロウイルスベクターで形質導入された造血幹または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ～約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬまたは５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。

【0327】

ある実施形態において、１またはそれを超えるＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および必要に応じて末端プロセシング酵素をコードする１またはそれを超えるｍＲＮＡを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドの送達に適した組成物および製剤が想定される。

【0328】

エクスビボ送達のための例示的な製剤は、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショックおよび様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質によって媒介される形質移入）など、本分野において公知の様々な形質移入剤の使用も含み得る。以下により詳しく記載されているように、リポソームは、わずかな水性液体を取り込む脂質二重層である。ＤＮＡは、（その電荷によって）陽イオン性リポソームの外側表面に自発的に会合し、これらのリポソームは細胞膜と相互作用するであろう。

【0329】

特定の実施形態において、薬学的に許容され得る担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、例えば、経腸および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、くも膜下腔内および髄内投与および製剤を含む、様々な処置レジメンにおいて本明細書に記載されている特定の組成物を使用するための適切な投薬および処置レジメンの開発も同様に周知である。本明細書において想定される特定の実施形態は、薬学の分野において周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌｏｙｄ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載されているものなどの他の製剤を含み得ることが当業者によって理解されるであろう。
Ｋ．ゲノム編集された細胞治療

【0330】

特定の実施形態において想定される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）の予防、処置および軽減において使用するためのまたはＸＬＡと関連する少なくとも１つの症候もしくはＢＴＫ遺伝子中に変異を引き起こすＸＬＡを有する被験体を予防し、処置し、または軽減するための改善された薬物製品を提供する。本明細書において使用される「薬物製品」という用語は、本明細書において想定される組成物および方法を用いて産生される遺伝的に改変された細胞を表す。特定の実施形態において、薬物製品は遺伝的に改変された造血幹細胞または前駆細胞、例えばＣＤ３４^＋細胞を含む。遺伝的に改変された造血幹または前駆細胞はＢ細胞系列全体を生じさせるのに対して、ＢＴＫ遺伝子中にＸＬＡを引き起こす１またはそれを超える変異および／または欠失を含む非改変細胞はＢ細胞の発達に欠陥がある。

【0331】

特定の実施形態において、編集され得る造血幹または前駆細胞は、非機能的なまたは破壊された、除去されたまたは部分的に欠失されたＢＴＫ遺伝子を含み、これにより、ＢＴＫ発現を低減または除去し、正常なＢ細胞の発達を抑止する。

【0332】

特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹または前駆細胞は、非機能的なまたは破壊された、除去されたまたは部分的に欠失されたＢＴＫ遺伝子を含み、これにより、内在性ＢＴＫ発現を低減または除去し、正常なＢ細胞の発達を回復する機能的なＢＴＫポリペプチドをコードする、ＢＴＫ遺伝子中に挿入されたポリヌクレオチドをさらに含む。

【0333】

特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹または前駆細胞は、ＸＬＡと診断されたまたはＸＬＡを有すると疑われる被験体に根治的、予防的または改善的治療を提供する。

【0334】

様々な実施形態において、ゲノム編集組成物は、遺伝子治療を必要とする被験体の細胞、組織または器官への直接的な注射によって、インビボで、例えば、骨髄へ投与される。様々な他の実施形態において、細胞は、本明細書において想定されるＴＡＬＥＮ変異形またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によってインビトロまたはエクスビボで編集され、必要に応じて、エクスビボで増やされる。次いで、ゲノム編集された細胞は、治療を必要とする被験体に投与される。

【0335】

本明細書において想定されるゲノム編集方法において使用するための好ましい細胞としては、自家／自家性（「自己」）細胞、好ましくは造血細胞、より好ましくは造血幹または前駆細胞、さらにより好ましくはＣＤ３４^＋細胞が挙げられる。

【0336】

本明細書において使用される「個体」および「被験体」という用語は、しばしば互換的に使用され、本明細書の他の箇所において想定される、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ゲノム編集組成物、遺伝子治療ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞および方法によって処置することができるＸＬＡの症候を呈する任意の動物を表す。適切な被験体（例えば、患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、畜産動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）および家庭用動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくは、ヒト被験体が挙げられる。典型的な被験体としては、ＸＬＡを有する、ＸＬＡと診断されたまたはＸＬＡを有するリスクがあるヒト患者が挙げられる。

【0337】

本明細書において使用される「患者」という用語は、本明細書の他の箇所において想定される、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ゲノム編集組成物、遺伝子治療ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞および方法によって処置することができるＸＬＡと診断された被験体を表す。

【0338】

本明細書において使用される「処置」または「処置する」には、ＸＬＡの症候または病状に対して任意の有益なまたは望ましい効果が含まれ、ＸＬＡの１またはそれを超える測定可能なマーカーの最小限の低下さえ含まれ得る。処置は、ＸＬＡの進行の遅延を必要に応じて伴うことができる。「処置」は、ＸＬＡまたはその関連する症候の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。

【0339】

本明細書において使用される「予防する」および「予防」、「予防された」、「予防している」などの類似の用語は、ＸＬＡの発生または再発の可能性を抑制し、阻止し、または低減するためのアプローチを示す。本用語は、ＸＬＡの発症もしくは再発を遅延させること、またはＸＬＡの発生もしくは再発を遅延させることも表す。本明細書において使用される「予防」および類似の用語は、その発症または再発前に、ＸＬＡの強さ、作用、症候および／または負荷を低減することも含む。

【0340】

本明細書において使用される「の少なくとも１つの症候を軽減する」という用語は、ＸＬＡの１またはそれを超える症候を減少させることを表す。特定の実施形態において、軽減されるＸＬＡの１またはそれを超える症候としては、気管支炎（気道感染）、慢性の下痢、結膜炎（目の感染）、中耳炎（中耳の感染）、肺炎（肺の感染）、副鼻腔炎（副鼻腔の炎症）、皮膚感染症、上気道感染症；細菌、ウイルスおよびその他の微生物による感染症；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびブドウ球菌感染症を含むがこれらに限定されない細菌感染を含むがこれらに限定されない一般的な感染症が挙げられるが、これらに限定されない。

【0341】

本明細書において使用される「量」という用語は、臨床的結果を含む有益なまたは所望の予防的または治療的結果を達成するのに十分な、ＴＡＬＥＮ変異形もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ゲノム編集組成物またはゲノム編集された細胞の「有効量」または「有効な量」を表す。

【0342】

「予防的に有効な量」は、所望の予防的結果を達成するのに十分な、ＴＡＬＥＮ変異形もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ゲノム編集組成物またはゲノム編集された細胞の量を表す。典型的には、但し、必ずというわけではないが、予防的用量は、疾患の前にまたは疾患の初期段階で被験体において使用されるので、予防的に有効な量は治療的に有効な量より少ない。

【0343】

ＴＡＬＥＮ変異形もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ゲノム編集組成物またはゲノム編集された細胞の「治療的に有効な量」は、疾患状態、個体の年齢、性別および体重ならびに個体中に所望の応答を惹起する能力などの要因に従って変動し得る。治療的に有効な量は、治療的に有益な効果が任意の毒性または有害な効果を上回る量でもある。「治療的に有効な量」という用語は、被験体（例えば、患者）を「処置する」のに有効である量を含む。治療的な量が示されている場合、投与されるべき特定の実施形態において想定される組成物の正確な量は、仕様に照らしてならびに年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者（被験体）の症状における個々の差を考慮して、医師によって決定することができる。

【0344】

ゲノム編集された細胞は、骨髄切除治療を受けたまたは受けていない個体中に、骨髄または臍帯血移植片の一部として投与され得る。一実施形態において、本明細書において想定されるゲノム編集された細胞は、化学的切除または放射線切除骨髄療法を受けた個体に、骨髄移植片の中で投与される。

【0345】

一実施形態において、ゲノム編集された細胞の用量が被験体に静脈内送達される。好ましい実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞は、被験体に静脈内投与される。

【0346】

例示的な一実施形態において、被験体に与えられるゲノム編集された細胞の有効量は、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０^６細胞／ｋｇまたは少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇまたはそれを超える細胞／ｋｇであり、全ての中間の細胞の用量を含む。

【0347】

別の例示的な実施形態において、被験体に与えられるゲノム編集された細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ、約６×１０^６細胞／ｋｇ、約７×１０^６細胞／ｋｇ、約８×１０^６細胞／ｋｇ、約９×１０^６細胞／ｋｇまたは約１０×１０^６細胞／ｋｇまたはそれを超える細胞／ｋｇであり、全ての中間の細胞の用量を含む。

【0348】

別の例示的な実施形態において、被験体に与えられるゲノム編集された細胞の有効量は、約２×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇまたは６×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇであり、全ての中間の細胞の用量を含む。

【0349】

投薬量のいくらかの変動が、処置されている被験体の症状に応じて必ず起こるであろう。投与に責任を有する者が、いずれにしても、個別の被験体に対して適切な決定をするであろう。

【0350】

特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞治療は、ＸＬＡまたはＸＬＡと関連する症状を処置し、予防し、または軽減するために使用され、内在性ＢＴＫ発現をほとんどまたは全くもたらさないＢＴＫ遺伝子中に１またはそれを超える変異および／または欠失を有する被験体に、治療的に有効量の本明細書に想定されるゲノム編集された細胞を投与することを含む。一実施形態において、ゲノム編集された細胞治療は機能的な内在性ＢＴＫ発現を欠くが、機能的なＢＴＫポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0351】

様々な実施形態において、被験体は、被験体中でのＢＴＫ発現を増加させるのに有効な、機能的ＢＴＫポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム編集された細胞の量を投与される。特定の実施形態において、ＢＴＫ遺伝子中に１またはそれを超える有害な変異または欠失を含むゲノム編集された細胞中の外因性ポリヌクレオチドからのＢＴＫ発現の量は、内在性ＢＴＫ発現と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２倍、少なくとも５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１０００倍またはそれを超えて増加される。

【0352】

適切な投与の経路および本明細書において想定されるゲノム編集された細胞を含む有効量の組成物の妥当な投薬量を決定するために、当業者は、日常的な方法を使用することができるであろう。ある種の治療においては、本明細書に想定される薬学的組成物の複数回投与が治療を実施するために必要とされ得ることを認識することも当業者に公知であろう。

【0353】

ゲノム編集された造血幹および前駆細胞治療による処置に適した被験体を処置するために使用される主要な方法の１つは輸血である。このため、本明細書において想定される組成物および方法の主な最終目標の１つは、輸血の回数を減らすことまたは輸血の必要性を失くすことである。

【0354】

特定の実施形態において、薬物製品は１回投与される。

【0355】

ある実施形態において、薬物製品は、１年、２年、５年、１０年またはそれを超える長さにわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回またはそれを超える回数投与される。

【0356】

本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許出願および発行済み特許は、
それぞれの個別の刊行物、特許出願または発行済み特許が参照によって組み込まれることが具体的にかつ個別的に示されているごとく、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0357】

理解を明確にする目的で、例示および例によって、先述の実施形態を幾分詳しく記載してきたが、本明細書に想定される教示に照らして、添付の特許請求の精神または範囲から逸脱することなく、ある種の変更および改変が実施形態に施され得ることが当業者に自明であろう。以下の実施例は、例示のためにのみ提供されており、限定のために提供されているものではない。当業者は、本質的に類似の結果を与えるように変更または改変することができる様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。

【実施例0358】

［実施例１］
ヒトＢＴＫ遺伝子のイントロン２中の標的部位におけるＴＡＬＥＮベースのゲノム編集

【0359】

ヒトＢＴＫ遺伝子内の標的部位Ｔ１～Ｔ４に対してＴＡＬＥＮを生成した。（図１Ａ）ＴＡＬＥＮの配列は、以下のとおりであった。
表２：ＴＡＬエフェクタードメインＲＶＤ

【表2C】

【0360】

図１Ｂは、初代Ｔ細胞中で各ＴＡＬＥＮを用いて達成されたパーセント破壊を示す。ＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）を補充されたＴ細胞増殖培地中で初代ヒトＴ細胞を培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて４８時間刺激した。ビーズを除去し、細胞を一晩静置させた後、いずれかのＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ（１μｇの各ＲＮＡ単量体）とともにＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステムを使用して電気穿孔を行った。細胞をさらに５日間培養し、ゲノムＤＮＡを抽出した。切断部位周囲の領域を増幅し、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ７エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）とともに２００ｎｇの精製されたＰＣＲ産物をインキュベートし、ゲル上で分析し、Ｌｉｃｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅソフトウェアを用いてパーセント破壊を定量した。その後の図面中の実験では、ＴＡＬＥＮ Ｔ３を使用した。

【0361】

図１Ｃは、ＴＡＬＥＮを用いてＢＴＫ遺伝子を編集するためのＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。ＤＴ ＡＡＶベクターは、ＭＮＤプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）カセットに隣接する１ｋｂの相同性アームを有する。ＤＴ－Ｄｅｌ ＡＡＶドナーは、ＴＡＬスペーサードメインまで５’相同性アームの末端にまたがるゲノム領域の欠失を有し、第二のエクソンとイントロンの部分的欠失をもたらして、ＴＡＬＥＮによる切断を消失させる。

【0362】

図１Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶドナーテンプレートを使用する初代Ｔ細胞中での編集を示す。棒グラフは、ＧＦＰ発現の時間経過を図示する。パーセント相同組換え（ＨＲ）は、１５日におけるパーセント（％）ＧＦＰとして報告されている。

【0363】

図１Ｅは、ＴＡＬＥＮとＡＡＶドナーの同時送達を用いた初代Ｔ細胞の編集の２日後および１５日後におけるＧＦＰ発現を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。

【0364】

［実施例２］
ヒトＢＴＫ遺伝子のイントロン２中の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集

【0365】

ガイドＲＮＡ位置Ｇ１～Ｇ９に対応するヒトＢＴＫ遺伝子内の標的部位に対してＴＡＬＥＮを生成した。（図２Ａ）。ｇＲＮＡ配列は、以下のとおりであった。

【表4-1】

【表4-2】

【0366】

図２Ｂは、Ｔ７エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって決定された、ガイドＧ１からＧ９によるＢＴＫ遺伝子座でのパーセント（％）破壊を示す。パーセント破壊は、Ｌｉｃｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅソフトウェアを用いて定量した。その後の図面中の実験では、ガイドＧ３を使用した。

【0367】

図２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓを用いてＢＴＫ遺伝子を編集するための３つの例示的なＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。ＤＴ ＡＡＶベクターは、ＭＮＤプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に隣接する１ｋｂの相同性アームを有する。ＤＴ－ＰＡＭ ＡＡＶドナーは、ガイドＧ３による切断を消失させるために、ＰＡＭ配列中に変異を有する。ＤＴ－Ｄｅｌベクターは、ガイドＧ３による切断を消失させるために、欠失を有する。

【0368】

［実施例３］
Ｃａｓ９タンパク質と単一のガイドＲＮＡのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）およびＡＡＶドナーの同時送達による初代Ｔ細胞中でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集

【0369】

図２Ｄは、Ｃａｓ９に加えてガイドおよびＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を使用する初代Ｔ細胞中での編集を示す。初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を培養し、ビーズ刺激した。次いで、Ｃａｓ９タンパク質と単一のガイドＲＮＡのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）で細胞を形質移入し、２時間後に、培養体積の２０％でＡＡＶドナーを添加した。２、８および１５日目にＧＦＰ発現に関して細胞を分析した。１５日目のＧＦＰ発現は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を示している。

【0370】

図２Ｅは、ＲＮＰに加えてＡＡＶドナーを用いた初代Ｔ細胞の編集の２および１５日後におけるＧＦＰ発現を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。

【0371】

［実施例４］
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥＮベースの系によるＣＤ３４＋Ｔ細胞中でのゲノム編集

【0372】

図３Ａは、ヒトＣＤ３４^＋細胞編集プロトコールの模式図を示す。ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ３（６０ｎｇ／ｍＬ）が補充されたＳＣＧＭ培地中で４８時間、成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を培養した後、１：１．２の比率で混合された、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓ９タンパク質のリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）のいずれかおよび単一のガイドＲＮＡとともにＮｅｏｎ電気穿孔システムを用いて電気穿孔を行った。ｓｇＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入され、５’および３’末端の３つの末端位置に化学的に修飾されたヌクレオチドを有する。２および５日目に、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。

【0373】

図３Ｂは、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡとＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を使用する、ＣＤ３４^＋ＨＳＣ中のＢＴＫ遺伝子座の編集を示す。成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を以前に記載されたとおりにＳＣＧＭ培地中で培養した後、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡとともにＮｅｏｎ電気穿孔システムを使用して電気穿孔を行った。電気穿孔の直後に、ドナーテンプレートを担持するＡＡＶベクターを添加した。対照は、操作されていない細胞およびヌクレアーゼの形質移入なしにＡＡＶのみで形質導入された細胞（ＡＡＶ）を含んだ。棒グラフは、５日での％ＧＦＰを図示し、ＨＤＲを示す。

【0374】

図３Ｃは、編集の２および５日後における、モック、ＡＡＶまたはＡＡＶプラスＴＡＬＥＮ処理されたＣＤ３４^＋細胞からのＧＦＰ発現を図示するＦＡＣＳプロットを示す。

【0375】

図３Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＡＡＶドナーでの編集後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。棒グラフは、編集の２および５日後における、モックおよびＡＡＶのみおよびＡＡＶプラスＴＡＬＥＮ処理された細胞の生存率を表す。

【0376】

図３Ｅは、ＴＡＬＥＮ編集されたＣＤ３４^＋細胞に対するＣＦＵアッセイを示す。ＴＡＬＥＮ編集された、ＴＡＬＥＮのみ、ＡＡＶのみおよびモック細胞を、編集の１日後に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのためにＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地上に播種した。簡潔に述べると、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、５００個の細胞を２つ組で播種し、１２～１４日間３７℃でインキュベートし、その形態およびＧＦＰ発現に基づいてコロニーを数えた。ＣＦＵ－Ｅ：コロニー形成単位赤血球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球、マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位赤血球。ｎ＝３の独立のドナー。データは、平均±平均値の標準誤差として表されている。

【0377】

図４Ａは、ＲＮＰとＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を使用する、ＣＤ３４^＋ＨＳＣ中のＢＴＫ遺伝子座の編集を示す。成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を以前に記載されたとおりにＳＣＧＭ培地中で培養した後、ＲＮＰ複合体とともにＮｅｏｎ電気穿孔システムを使用して電気穿孔を行った。電気穿孔の直後に、ドナーテンプレートを担持するＡＡＶベクターを添加した。対照は、操作されていない細胞およびヌクレアーゼの形質移入なしにＡＡＶのみで形質導入された細胞（ＡＡＶ）を含んだ。棒グラフは、５日での％ＧＦＰを図示し、ＨＤＲを示す。

【0378】

図４Ｂは、図４Ａと同じ実験を示し、２および５日における、ＧＦＰ発現を示す代表的ＦＡＣｓプロットを図示する。

【0379】

図４Ｃは、ＲＮＰおよびＡＡＶドナーでの編集後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。棒グラフは、編集の２および５日後における、モックおよびＡＡＶのみおよび（様々なＲＮＰとＡＡＶ用量での）ＡＡＶプラスＲＮＰ処理された細胞の生存率を表す。

【0380】

図４Ｄは、ＲＮＰ編集されたＣＤ３４^＋細胞に対するＣＦＵアッセイを示す。ＲＮＰ編集された、ＡＡＶのみ、およびモック細胞を、編集の１日後に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのためにＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地上に播種した。簡潔に述べると、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、５００個の細胞を２つ組で播種し、１２～１４日間３７℃でインキュベートし、その形態およびＧＦＰ発現に基づいてコロニーを数えた。ＣＦＵ－Ｅ：コロニー形成単位赤血球、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球、マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位赤血球。ｎ＝３の独立のドナー。データは、平均±平均値の標準誤差として表されている。

【0381】

図５Ａは、ＧＦＰを発現する無プロモーターＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。このベクターは、ＧＦＰ、末端切断されたウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ３）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。この挿入物は、いずれかの側において、ＢＴＫ遺伝子座への０．５ｋｂ相同性アームによって隣接されている。

【0382】

図５Ｂは、ＲＮＰとＡＡＶドナーテンプレートの同時送達を用いる、ＣＤ３４^＋ＨＳＣ中での無プロモーターＧＦＰベクターを使用するＢＴＫ遺伝子座の編集を示す。棒グラフは、１、２および５日での％ＧＦＰを図示し、５日での％ＧＦＰはＨＤＲを示す。

【0383】

図５Ｃは、図４Ａと同じ実験を示し、２および５日における、ＧＦＰ発現を示す代表的ＦＡＣｓプロットを図示する。

【0384】

図５Ｄは、ＲＮＰおよび無プロモーターＡＡＶドナーでの編集後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。棒グラフは、編集の１、２および５日後における、モックおよびＡＡＶのみおよび（様々なＲＮＰとＡＡＶ用量での）ＡＡＶプラスＲＮＰ処理された細胞の生存率を表す。５日での％ＧＦＰは、％ＨＤＲを示す。

【0385】

図５Ｅは、ＨＤＲを決定するためのデジタルドロップレットＰＣＲアッセイを示す。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）からゲノムＤＮＡを単離した。編集率を評価するために、ＡＡＶ挿入物内に結合するフォワードプライマーおよび相同性の領域外のＢＴＫ遺伝子座を結合するリバースプライマーを用いて、「インアウト」ドロップレットデジタルＰＣＲを行った。対照としての役割を果たすために、ＡｃｔＢ遺伝子に対して類似の大きさの対照アンプリコンを作製した。全ての反応は、２つ組みで行った。ＰＣＲ反応液は、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、液滴に分割した。ＵＴＰなしのｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、９００ｎＭのプライマー、２５０ｎＭのプローブ、５０ｎｇのゲノムＤＮＡおよび１％ＤＭＳＯを用いて、増幅を行った。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で液滴を分析した。

【0386】

図６は、コドン最適化されたＢＴＫを発現するＡＡＶドナーテンプレートの模式図を示す。

【0387】

［実施例５］
ＡＡＶ標的化ベクター配列
＃ＤＴ（＃１１７７）（配列番号１９）

【0388】

ＢＴＫ遺伝子座に対するＡＡＶ標的化ベクター。このベクターは、ＭＮＤプロモーター、ｅＧＦＰ（強化された緑色蛍光タンパク質）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有し、約１ｋｂの相同性アームが隣接している。
ＤＴ－Ｄｅｌ（＃１２３３）（配列番号２０）

【0389】

このベクターは、ＭＮＤプロモーター、ｅＧＦＰおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。この挿入物は、いずれかの側に、ＢＴＫ遺伝子座へのおよそ１ｋｂの相同性アームが隣接している。このベクターは、ＢＴＫ ＴＡＬＥＮ Ｔ３とともに使用するために特異的に設計されている。ＴＡＬＥＮ結合部位は、ＴＡＬＥＮによる切断を消失させるために欠失されている。
ＤＴ－ＰＡＭ １２５４（配列番号２１）

【0390】

このベクターは、ＭＮＤプロモーター、ｅＧＦＰおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。この挿入物は、いずれかの側に、ＢＴＫ遺伝子座へのおよそ１ｋｂの相同性アームが隣接している。ガイドによる修復テンプレートの切断を消失させるためにＰＡＭ部位が欠失されているので、このベクターは、ＢＴＫガイドＧ３とともに働くように設計されている。
ＤＴ－ＰＡＭ ｍｕｔ（＃１２５１）（配列番号２２）

【0391】

このベクターは、ＭＮＤプロモーター、ｅＧＦＰおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。この挿入物は、いずれかの側に、ＢＴＫ遺伝子座へのおよそ１ｋｂの相同性アームが隣接している。ガイドＧ３による切断を消失させるために、ＰＡＭ部位は変異されている。
ＡＴＧ－ＤＴ－Ｄｅｌ（＃１３７５）（配列番号２３）

【0392】

このベクターは、ｅＧＦＰ、末端切断されたウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ３）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有し、ＢＴＫ遺伝子座への０．５ｋｂの相同性アーム（ｒａｍｓ）が隣接している。このベクターは、ＢＴＫガイドＧ３とともに働くように設計されている。
ＡＴＧ－ＢＴＫ ＤＴ－ＤＥＬ（＃１３７９）（配列番号２４）

【0393】

このベクターは、コドン最適化されたＢＴＫ ｃＤＮＡ、末端切断されたウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ３）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。この挿入物は、いずれかの側において、ＢＴＫ遺伝子座への０．５ｋｂ相同性アームが隣接しており、ＢＴＫガイドＧ３とともに働くように特別に設計されている。

【0394】

［実施例６］
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥＮベースを有するＣＤ３４＋Ｔ細胞中のＨＤＲ：ＮＨＥＪ比
要約

【0395】

図７は、（ｒＡＡＶ６標的化ベクターとともに同時送達された場合の）ＲＮＰによる相同組換え修復：非相同末端結合の比とＴＡＬＥＮプラットフォームによる相同組換え修復：非相同末端結合の比の比較を図示する変異原性ＮＨＥＪの代わりにＨＤＲを用いて切断を修復するように細胞が準備されていることを意味するので、より高いＨＤＲ：ＮＨＥＪ比が好ましい。

【0396】

両ヌクレアーゼプラットフォームによって高レベルのＨＤＲが達成されるが、ＲＮＰ＋ＡＡＶ送達と比べて、ＴＡＬＥＮ＋ＡＡＶに対して、ＨＤＲ：ＮＨＥＪ比がより高い。

【0397】

図８Ａ～８Ｂは、ＲＮＰおよびＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）において臨床的な恩恵を直ちに与えると予測されるレベルで、内在性ＢＴＫ遺伝子座中にコドン最適化されたＢＴＫ ｃＤＮＡを発現するように設計されたｒＡＡＶ６ ＢＴＫ ｃＤＮＡ標的化ベクターで処理されたＣＤ３４^＋細胞中でのＨＤＲ編集を例示する。
結果

【0398】

図７は、ＴＡＬＥＮプラスＡＡＶまたはＲＮＰプラスＡＡＶで編集された細胞中でのＨＤＲ（相同組換え修復）対ＮＨＥＪ（非相同末端結合）の比の比較を示す。ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ６（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充されたＳＣＧＭ培地中で、成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を４８時間培養した後に、Ｎｅｏｎを用いて電気穿孔を行った。０．５μｇの各ＴＡＬＥＮ単量体または２μｇのＲＮＰ（１：１．２のＣａｓ９：ガイド比）のいずれかで細胞を形質移入した後、３％の培養体積でＡＡＶを形質導入した。５日目に、培養された細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＤＲ割合を決定するためにｄｄＰＣＲを行った。

【0399】

編集率を評価するために、ＡＡＶ挿入物内に結合するフォワードプライマーおよび相同性の領域外のＢＴＫ遺伝子座を結合するリバースプライマーを用いて、「インアウト」ドロップレットデジタルＰＣＲを行った。対照としての役割を果たすために、ＣＣＲ５遺伝子に対して類似の大きさの対照アンプリコンを作製した。全ての反応は、２つ組みで行った。ＰＣＲ反応液は、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、液滴に分割した。ＵＴＰなしのｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、９００ｎＭのプライマー、２５０ｎＭのプローブおよび５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、増幅を行った。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で液滴を分析した。さらに、切断部位周囲の領域を増幅し、ゲルを抽出し、ＮＨＥＪ割合を決定するために、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推測）分析に供した。ＨＤＲ対ＮＨＥＪの比をグラフ上にプロットした。色は、独立したＣＤ３４^＋ドナーを表す。データは、平均±平均値の標準誤差として表されている。

【0400】

変異原性ＮＨＥＪの代わりにＨＤＲを用いて切断を修復するように細胞が準備されていることを意味するので、より高いＨＤＲ：ＮＨＥＪ比が好ましい。ＲＮＰプラットフォームによってより高レベルのＨＤＲが達成されるが、ＲＮＰ＋ＡＡＶ送達と比べて、ＴＡＬＥＮ＋ＡＡＶに対して、ＨＤＲ：ＮＨＥＪ比が相対的により高い。

【0401】

図８Ａ～８Ｂは、ＲＮＰおよび首尾よく編集されたＨＳＣ中でコドン最適化されたＢＴＫ ｃＤＮＡを発現するように設計されたｒＡＡＶ６ ＢＴＫ ｃＤＮＡ標的化ベクターで処理されたＣＤ３４^＋細胞中でのＨＤＲ編集を示す。図８Ａは、内在性プロモーターからコドン最適化されたＢＴＫ ｃＤＮＡを発現するｒＡＡＶ６ドナーベクターの模式図である。前述されているとおりに、成人の誘導されたＣＤ３４^＋細胞を培養した後に、Ｎｅｏｎ機器を用いて電気穿孔を行った。５μｇのＲＮＰ（１：１．２のＣａｓ９：ガイド比）でＨＳＣ細胞を形質移入した後、６００および１２００のＭＯＩでＡＡＶを形質導入した。５日目に、培養された細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＤＲ割合を決定するためにドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイを行った。

【0402】

編集率を評価するために、ＡＡＶ挿入物内に結合するフォワードプライマーおよび相同性の領域外のＢＴＫ遺伝子座を結合するリバースプライマーを用いて、「インアウト」ドロップレットデジタルＰＣＲを行った。対照としての役割を果たすために、ＣＣＲ５遺伝子に対して類似の大きさの対照アンプリコンを作製した。全ての反応は、２つ組みで行った。ＰＣＲ反応液は、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、液滴に分割した。ＵＴＰなしのｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、９００ｎＭのプライマー、２５０ｎＭのプローブおよび５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、増幅を行った。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で液滴を分析した。

【0403】

図８Ｂでは、ＸＬＡ中で臨床的な恩恵を容易に与えると予測されるレベルで、内在性ＢＴＫ遺伝子座中にＢＴＫ ｃＤＮＡを導入する能力を実証する、単一のＣＤ３４^＋ドナーから得られたデータが明確に示されている。

【0404】

表５は、ＲＮＰまたはＴＡＬＥＮに加えてＡＡＶ．ＭＮＤ．ＧＦＰベクターを用いて標的化されたＣＤ３４＋細胞中のＨＤＲを決定するためのオリゴおよびプローブのリストを与える。
表５

【表5】

【0405】

表６は、ＲＮＰおよびＡＴＧ．ｃｏＢＴＫ発現ＡＡＶベクターを用いて標的化されたＣＤ３４＋細胞中のＨＤＲを決定するためのオリゴおよびプローブのリストを与える。対照ＣＣＲ５オリゴ／プローブは、ＧＦＰベクターに対するものと同じである。
表６

【表6-1】

【表6-2】

【0406】

一般に、以下の特許請求の範囲では、使用されている用語は、本明細書および特許請求の範囲中に開示されている具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、かかる特許請求の範囲の権利が及ぶ均等物の全範囲とともに全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【配列表】

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【外国語明細書】