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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024110248
(43)【公開日】2024-08-15
(54)【発明の名称】抗ウイルス剤及び医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/496 20060101AFI20240807BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240807BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240807BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240807BHJP
【ＦＩ】
A61K31/496
A61P31/14
A61P1/16
C12N15/11 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023014730
(22)【出願日】2023-02-02
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 「肝炎等克服実用化研究事業 肝炎等克服緊急対策研究事業 経口感染によるウイルス性肝炎（Ａ型及びＥ型）の感染防止、病態解明、治療等に関する研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】神田 達郎
(72)【発明者】
【氏名】田中 玲奈
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC82
4C086GA08
4C086GA10
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA75
4C086ZB33
(57)【要約】
【課題】副作用が少なく、Ａ型肝炎ウイルス等のＲＮＡウイルスの増殖抑制に有効な抗ウイルス剤、及び、抗ウイルス剤を含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤を採用する。抗ウイルス剤は、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。
【選択図】なし
【解決手段】ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤を採用する。抗ウイルス剤は、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤であって、
マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤。
マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤。
【請求項2】
前記ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡゲノム中にＩＲＥＳを有する、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項3】
前記ＲＮＡウイルスは、Ａ型肝炎ウイルスである、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項4】
ＲＮＡウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物であって、
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ウイルス剤及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
Ａ型肝炎は、ＲＮＡウイルスであるＡ型肝炎ウイルスにより引き起こされる疾患であり、その患者数は世界で年間１億７０００万人である。患者の０．５～２％は重症化し、肝移植をしなかった場合には死に至る場合がある（例えば、特許文献１）。近年でも、韓国、米国で、数万人規模の大流行が起きた。
【0003】
Ａ型肝炎治療薬として、インターフェロン等が提案されているが、副作用が多い。Ａ型肝炎の重症化例に対しては、血漿交換、血液持続濾過透析、肝移植等の治療法が採用されるが、これらの治療法は患者の負担が大きい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２０２２－５４４６１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
副作用が少なく、Ａ型肝炎ウイルス等のＲＮＡウイルスに対して抗ウイルス活性を示す有効な治療薬は報告されていない。そこで、本発明は、副作用が少なく、Ａ型肝炎ウイルス等のＲＮＡウイルスの増殖抑制に有効な抗ウイルス剤、及び、前記抗ウイルス剤を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤であって、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤。
［２］前記ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡゲノム中にＩＲＥＳを有する、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［３］前記ＲＮＡウイルスは、Ａ型肝炎ウイルスである、［２］に記載の抗ウイルス剤。
［４］ＲＮＡウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物であって、
［１］～［３］のいずれかに記載の抗ウイルス剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［１］ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤であって、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤。
［２］前記ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡゲノム中にＩＲＥＳを有する、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［３］前記ＲＮＡウイルスは、Ａ型肝炎ウイルスである、［２］に記載の抗ウイルス剤。
［４］ＲＮＡウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物であって、
［１］～［３］のいずれかに記載の抗ウイルス剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、副作用が少なく、Ａ型肝炎ウイルス等のＲＮＡウイルスの増殖抑制に有効な抗ウイルス剤、及び、前記抗ウイルス剤を含む医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞に導入したコンストラクトのエレメントを模式的に示す図である。
【図1B】ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞に対して、ＩＦＮ－α－２ａを投与した後、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図2】薬剤ライブラリについて、ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞を用いて、ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率を指標としてスクリーニングを行った結果を示す図である。
【図3】ＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡ株を用いて、スクリーニングにより選択された薬剤について、ＨＡＶ感染の抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図4】ＨＭ１７５－１８ｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢ株を感染させたＨｕｈ７細胞株に対して、マシニチブを投与した後、ＨＡＶ ＶＰ１タンパク質の発現を観察した結果を示す図である。
【図5】ＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡ株を用いて、マシニチブによるＨＡＶ感染の抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図6A】ＣＯＳ７－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株を用いて、マシニチブによる、ＩＲＥＳを介した翻訳の抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図6B】ｐＳＶ４０－ＨＡＶ－ＩＲＥＳベクターを一過性にＨｕｈ７細胞へ遺伝子導入することで、マシニチブによる、ＩＲＥＳを介した翻訳の抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図6C】ＣＯＳ７－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株を用いて、マシニチブ存在下の細胞生存率を測定した結果を示す図である。
【図6D】Ｈｕｈ７細胞株を用いて、マシニチブ存在下の細胞生存率を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
［抗ウイルス剤］
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤であって、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤であって、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、抗ウイルス剤を提供する。
【0010】
＜対象となるウイルス＞
本実施形態に係る抗ウイルス剤の対象となるウイルスは、ＲＮＡ感染症の原因となるＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルス感染症としては、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば、Ａ型肝炎及、Ｃ型肝炎、ポリオウイルス感染症等のピコルナウイルス感染症が挙げられる。
本実施形態に係る抗ウイルス剤の対象となるウイルスは、ＲＮＡ感染症の原因となるＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルス感染症としては、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、例えば、Ａ型肝炎及、Ｃ型肝炎、ポリオウイルス感染症等のピコルナウイルス感染症が挙げられる。
【0011】
対象となる前記ＲＮＡウイルスは、二本鎖ＲＮＡウイルスであってもよいし、一本鎖ＲＮＡウイルスであってもよい。一本鎖ＲＮＡウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであってもよいし、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスであってもよい。
【0012】
抗ウイルス剤の対象となるＲＮＡウイルスとしては、そのゲノム中に、ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）を有するＲＮＡウイルスであることが好ましい。
ゲノム中にＩＲＥＳを有するＲＮＡウイルスとしては、例えば、ピコルナウイルスが挙げられる。ピコルナウイルスとしては、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス等が挙げられる。これらの中でも、抗ウイルス剤の対象となるウイルスとしては、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びポリオウイルスからなる群より選択される一種以上が好ましく、Ａ型肝炎ウイルスがより好ましい。
ゲノム中にＩＲＥＳを有するＲＮＡウイルスとしては、例えば、ピコルナウイルスが挙げられる。ピコルナウイルスとしては、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス等が挙げられる。これらの中でも、抗ウイルス剤の対象となるウイルスとしては、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びポリオウイルスからなる群より選択される一種以上が好ましく、Ａ型肝炎ウイルスがより好ましい。
【0013】
＜マシニチブ＞
本実施形態に係る抗ウイルス剤は、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。
マシニチブのＣＡＳ番号は、７９０２９９－７９－５である。マシニチブのＩＵＰＡＣ名は、４－［（４－Ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－Ｎ－（４－ｍｅｔｈｙｌ－３－｛［４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ｝ｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅである。
本実施形態に係る抗ウイルス剤は、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。
マシニチブのＣＡＳ番号は、７９０２９９－７９－５である。マシニチブのＩＵＰＡＣ名は、４－［（４－Ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－Ｎ－（４－ｍｅｔｈｙｌ－３－｛［４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ｝ｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅである。
【0014】
本実施形態に係る抗ウイルス剤が含み得るマシニチブの塩としては、抗ウイルス剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、燐酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。
これらの中でも、マシニチブの塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。
これらの中でも、マシニチブの塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【0015】
本実施形態に係る抗ウイルス剤が含み得るマシニチブ又はその塩の溶媒和物としては、抗ウイルス剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
マシニチブ又はその塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であることが好ましい。
マシニチブ又はその塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であることが好ましい。
【0016】
＜その他の成分＞
本実施形態に係る抗ウイルス剤は、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、抗ウイルス剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、角質軟化剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、油性基剤、乳化剤、乳化安定剤、粉末成分、高分子成分、粘着性改良剤、被膜形成剤、保型剤、潤沢剤等が挙げられる。
本実施形態に係る抗ウイルス剤は、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物のみからなるものであってもよいし、その他の成分を含んでもよい。
その他の成分としては、抗ウイルス剤が効果を発揮する限り特に制限されず、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、角質軟化剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、油性基剤、乳化剤、乳化安定剤、粉末成分、高分子成分、粘着性改良剤、被膜形成剤、保型剤、潤沢剤等が挙げられる。
【0017】
＜用途＞
本実施形態に係る抗ウイルス剤の用途は、上述のＲＮＡウイルスに対する増殖抑制を目的としている限り特に限定されず、例えば、治療用医薬組成物、予防用医薬組成物等の医薬組成物；身体洗浄用組成物、食物洗浄用組成物等の洗浄用組成物；医療用洗浄用組成物、食器洗浄用組成物等の器具洗浄用組成物等に配合して使用してもよい。
これらの中でも、医薬組成物に配合して用いることが好ましく、治療用医薬組成物に配合して用いることがより好ましい。
本実施形態に係る抗ウイルス剤の用途は、上述のＲＮＡウイルスに対する増殖抑制を目的としている限り特に限定されず、例えば、治療用医薬組成物、予防用医薬組成物等の医薬組成物；身体洗浄用組成物、食物洗浄用組成物等の洗浄用組成物；医療用洗浄用組成物、食器洗浄用組成物等の器具洗浄用組成物等に配合して使用してもよい。
これらの中でも、医薬組成物に配合して用いることが好ましく、治療用医薬組成物に配合して用いることがより好ましい。
【0018】
＜使用方法及び使用量＞
本実施形態に係る抗ウイルス剤の使用方法及び使用量は、抗ウイルス剤が対象のＲＮＡウイルスに対して効果を発揮する限り特に制限されず、当業者であれば、適宜設定可能である。
本実施形態に係る抗ウイルス剤の使用方法及び使用量は、抗ウイルス剤が対象のＲＮＡウイルスに対して効果を発揮する限り特に制限されず、当業者であれば、適宜設定可能である。
【0019】
本実施形態に係る抗ウイルス剤によれば、対象となるＲＮＡウイルスの増殖を抑制することが可能である。本実施形態に係る抗ウイルス剤は、宿主であるヒト細胞に対する毒性が低いため、副作用が少ない。
【0020】
［医薬組成物］
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、前記実施形態に係る抗ウイルス剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む。
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、前記実施形態に係る抗ウイルス剤の有効量、及び薬学的に許容される担体を含む。
【0021】
＜薬学的に許容される担体＞
本実施形態に係る医薬組成物は、前記実施形態に係る抗ウイルス剤の有効量に加えて、薬学的に許容される担体を含んでもよい。「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本実施形態に係る医薬組成物において、薬学的に許容される担体は、前記実施形態に係る抗ウイルス剤の抗ウイルス活性を阻害せず、且つ投与対象に対して実質的な毒性を示さない成分であり得る。
本実施形態に係る医薬組成物は、前記実施形態に係る抗ウイルス剤の有効量に加えて、薬学的に許容される担体を含んでもよい。「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本実施形態に係る医薬組成物において、薬学的に許容される担体は、前記実施形態に係る抗ウイルス剤の抗ウイルス活性を阻害せず、且つ投与対象に対して実質的な毒性を示さない成分であり得る。
【0022】
薬学的に許容される担体は、剤型に応じて、任意のものを用いることができる。
薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム－ グリコール－ スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤；クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、緩衝液、生理食塩水等の希釈剤；カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられる。
薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム－ グリコール－ スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤；クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、緩衝液、生理食塩水等の希釈剤；カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられる。
【0023】
本実施形態に係る医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、医薬組成物の製剤は経口剤のために通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等の添加剤を用いて、常法により製造することができる。
使用可能な添加剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、クエン酸、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等が挙げられる。
本実施形態に係る医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、その医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤等の経口投与に適した剤形に調製されたものであってもよい。
使用可能な添加剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、クエン酸、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等が挙げられる。
本実施形態に係る医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、その医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤等の経口投与に適した剤形に調製されたものであってもよい。
【0024】
＜対象の疾患＞
本実施形態に係る医薬組成物の適用対象の疾患は、ＲＮＡウイルス感染症である。前記ＲＮＡウイルス感染症としては、ピコルナウイルス感染症が好ましく、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎及びポリオウイルス感染症からなる群より選択される一種以上がより好ましく、Ａ型肝炎が更に好ましい。
本実施形態に係る医薬組成物は、前記ＲＮＡウイルス感染症を治療するためのものであってもよく、前記ＲＮＡウイルス感染症を予防するためのものであってもよい。
本実施形態に係る医薬組成物の適用対象の疾患は、ＲＮＡウイルス感染症である。前記ＲＮＡウイルス感染症としては、ピコルナウイルス感染症が好ましく、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎及びポリオウイルス感染症からなる群より選択される一種以上がより好ましく、Ａ型肝炎が更に好ましい。
本実施形態に係る医薬組成物は、前記ＲＮＡウイルス感染症を治療するためのものであってもよく、前記ＲＮＡウイルス感染症を予防するためのものであってもよい。
【0025】
＜投与対象＞
本実施形態に係る医薬組成物の投与対象は、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、ペット、家畜等が挙げられる。哺乳動物としては、ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等が挙げられる。これらの中でも、投与対象としては、ヒトが好ましい。
本実施形態に係る医薬組成物の投与対象は、本発明の効果が奏される限り特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、ペット、家畜等が挙げられる。哺乳動物としては、ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等が挙げられる。これらの中でも、投与対象としては、ヒトが好ましい。
【0026】
＜投与方法＞
本実施形態に係る医薬組成物の投与方法としては、投与対象において、医薬組成物が治療効果を発揮する限り特に限定されず、経口投与でもよく、非経口投与でもよいが、経口投与が好ましい。
非経口投与としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与等の全身投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔投与、脳室内投与、髄腔内投与、経皮投与、眼内投与、鼻腔内投与等の局所投与等が挙げられる。
本実施形態に係る医薬組成物の投与方法としては、投与対象において、医薬組成物が治療効果を発揮する限り特に限定されず、経口投与でもよく、非経口投与でもよいが、経口投与が好ましい。
非経口投与としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与等の全身投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔投与、脳室内投与、髄腔内投与、経皮投与、眼内投与、鼻腔内投与等の局所投与等が挙げられる。
【0027】
本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態に係る治療用医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、投与量は適宜決定されるが、例えば、治療対象の患者当たり、約０．１～２０００ｍｇであってもよく、これを１日あたり１回又は数回に分けて投与してもよいし、数日置きに投与してもよい。
本実施形態に係る治療用医薬組成物が経口的に投与されるものである場合、投与量は適宜決定されるが、例えば、治療対象の患者当たり、約０．１～２０００ｍｇであってもよく、これを１日あたり１回又は数回に分けて投与してもよいし、数日置きに投与してもよい。
【0028】
＜有効量＞
本実施形態に係る医薬組成物に含まれる抗ウイルス剤の有効量は、医薬組成物が投与対象に対して効果を発揮する限り特に制限されず、当業者が、適宜設定することができる。
本実施形態に係る医薬組成物に含まれる抗ウイルス剤の有効量は、医薬組成物が投与対象に対して効果を発揮する限り特に制限されず、当業者が、適宜設定することができる。
【0029】
本実施形態に係る医薬組成物は、上述の抗ウイルス剤を含むため、投与対象において対象となるＲＮＡウイルスの増殖を抑制することが可能である。そのため、本実施形態に係る医薬を投与することにより、投与対象におけるＲＮＡウイルス感染症を治療することが可能である。本実施形態に係る医薬組成物に含まれるマシチニブは、抗悪性腫瘍薬として用いられており、安全性が確認されている。
【0030】
その他の実施形態としては、例えば、ＲＮＡウイルス感染症の治療方法であって、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含むものが挙げられる。
【0031】
また、その他の実施形態としては、例えば、ＲＮＡウイルス感染症の治療のための、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の使用が挙げられる。
【0032】
また、その他の実施形態としては、例えば、ＲＮＡウイルス感染症の治療剤を製造するための、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の使用が挙げられる。
【0033】
上記の各実施形態において、ＲＮＡウイルスとしては、上述したものであってもよい。
上記の各実施形態において、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物としては、上述したものであってもよい。
上記の各実施形態において、マシチニブ若しくはその塩又はそれらの溶媒和物としては、上述したものであってもよい。
【実施例0034】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0035】
［材料及び方法］
（細胞株）
ヒト肝臓がん細胞として、Ｈｕｈ７細胞及びＨｕｈＴ７細胞を用いた。ＨｕｈＴ７細胞は、細胞質でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定的に発現する、Ｈｕｈ７細胞の形質転換体である。これらの細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地を用いて、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で培養した。
（細胞株）
ヒト肝臓がん細胞として、Ｈｕｈ７細胞及びＨｕｈＴ７細胞を用いた。ＨｕｈＴ７細胞は、細胞質でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを安定的に発現する、Ｈｕｈ７細胞の形質転換体である。これらの細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地を用いて、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で培養した。
【0036】
ＣＯＳ７－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株は、ＨＡＶ ＩＲＥＳの下流に、ホタルルシフェラーゼを連結したレポーター遺伝子を、ＣＯＳ７細胞に導入した細胞である（Kanda T et al., The sirtuin inhibitor sirtinol inhibits hepatitis A virus (HAV) replication by inhibiting HAV internal ribosomal entry site activity. Biochem Biophys. Res. Commun. 2015, 466, 567-571. DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.09.083. PMID: 26388050）。ＣＯＳ７－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株において、ＨＡＶ－ＩＲＥＳは恒常的に発現する。
【0037】
ｐＳＶ４０－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株は、Ｈｕｈ７細胞に、ｐＳＶ４０－ＨＡＶ－ＩＲＥＳを一過性に遺伝子導入した細胞である（Kanda T et al. Amantadine inhibits hepatitis A virus internal ribosomal entry site-mediated translation in human hepatoma cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 331, 621-629. DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.03.212. PMID: 15850805）。ｐＳＶ４０－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株において、ＨＡＶ－ＩＲＥＳは一過性に発現する。
【0038】
ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞株は、ＨＡＶ ＨＭ１７５ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｐｌｉｃｏｎ（すなわち、ｐＴ７－１８ｆ－ＬＵＣ）を恒常的に発現する、ＨｕｈＴ７細胞株である。ｐＴ７－１８ｆ－ＬＵＣは、ＨＡＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎのはじめの４アミノ酸残基、及び、ＨＡＶ ＨＭ１７５ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢのＶＰ１のＣ末端の１２アミノ酸残基で挟まれた、ホタルルシフェラーゼのＯＲＦを含む（Gauss-Muller, V. and Kusov, Y.Y. Replication of a hepatitis A virus replicon detected by genetic recombination in vivo. J. Gen. Virol. 2002, 83, 2183-2192. DOI: 10.1099/0022-1317-83-9-2183. PMID: 12185272）。ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞株の作製方法は後述する。
【0039】
（薬剤ライブラリ）
１１３４種の薬剤を含む、ＦＤＡにより承認された薬剤ライブラリは、大阪大学薬学研究科 創薬サイエンス研究支援拠点より提供された。Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ（マシニチブ），ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ及びｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｋ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。Ｔｈｏｎｚｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅは、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）より購入した。
１１３４種の薬剤を含む、ＦＤＡにより承認された薬剤ライブラリは、大阪大学薬学研究科 創薬サイエンス研究支援拠点より提供された。Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ（マシニチブ），ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ及びｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｋ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。Ｔｈｏｎｚｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅは、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）より購入した。
【0040】
（ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞の作製）
ｐＴ７－１８ｆ－ＬＵＣを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）、及び、配列番号１及び配列番号２で表されるプライマーを用いて、ＰＣＲにより、ＨＡＶ／Ｌｕｃを増幅させた。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用い、９４℃ ２分、次いで、９８℃ １０分、５５℃ ５秒、及び６８℃ ４分を４０サイクル、次いで、６８℃ ３分の条件で行った。
ｐＴ７－１８ｆ－ＬＵＣを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）、及び、配列番号１及び配列番号２で表されるプライマーを用いて、ＰＣＲにより、ＨＡＶ／Ｌｕｃを増幅させた。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用い、９４℃ ２分、次いで、９８℃ １０分、５５℃ ５秒、及び６８℃ ４分を４０サイクル、次いで、６８℃ ３分の条件で行った。
【0041】
次いで、得られたＰＣＲ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ｎｏｎｖｉｒａｌ ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒ（ＰＢ５０１Ｂ－１；Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
【0042】
次いで、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＨＡＶ／Ｌｕｃが挿入されたｎｏｎｖｉｒａｌ ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒ、及び、ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ｖｅｃｔｏｒ（ＰＢ２１０ＰＡ－１；Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＨｕｈＴ７にトランスフェクションし、ＨＡＶ／Ｌｕｃを恒常的に発現する細胞株を作製した。
【0043】
トランスフェクションを行ってから９６時間後に、トランスフェクション後の細胞を５ μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で処理し、ＨＡＶ／Ｌｕｃを恒常的に発現するＨｕｈＴ７を得た。
【0044】
（薬剤スクリーニング）
９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｆｏｒｍａｔ ＭＳ－８０９６Ｗ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に、ウェル当たり、２×１０４～２．５×１０４個のＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞を播種した。
９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｆｏｒｍａｔ ＭＳ－８０９６Ｗ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に、ウェル当たり、２×１０４～２．５×１０４個のＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞を播種した。
【0045】
細胞を播種して２４時間後に、１０μＭの１１３４種類の各薬剤、又はＤＭＳＯ（コントロール）で細胞を処理した。次いで、２４時間後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイによりルシフェラーゼの活性を測定した。また、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＳ）アッセイにより、細胞生存率を測定した。
【0046】
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
細胞は、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏ Ｉｎｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて播種した。ルシフェラーゼ活性は、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＡＢ－２２００－Ｒ，ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。
細胞は、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏ Ｉｎｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて播種した。ルシフェラーゼ活性は、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＡＢ－２２００－Ｒ，ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。
【0047】
（細胞生存率の測定）
細胞生存率は、Ｏｎｅ－Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＭＴＳアッセイにより測定した。酵素活性は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｉＭａｒｋ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、波長４９０ｎｍで測定した。
細胞生存率は、Ｏｎｅ－Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＭＴＳアッセイにより測定した。酵素活性は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｉＭａｒｋ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、波長４９０ｎｍで測定した。
【0048】
（ＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡの感染）
ウイルスを感染させる２４時間前に、６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、１ウェル当たり、３×１０５個のＨｕｈ７細胞を播種した。次いで、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞を２回洗浄した。次いで、Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）を０．１に設定した無血清ＲＰＭＩ培地で、細胞に対してＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡを感染させた。
ウイルスを感染させる２４時間前に、６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、１ウェル当たり、３×１０５個のＨｕｈ７細胞を播種した。次いで、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞を２回洗浄した。次いで、Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）を０．１に設定した無血清ＲＰＭＩ培地で、細胞に対してＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡを感染させた。
【0049】
次いで、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞に対して、１μＭ ｔｈｏｎｚｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，５μＭ ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，５μＭ ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ、５μＭ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ、又は１０μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂを添加した。コントロールでは、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞に対して、無血清ＲＰＭＩを添加した。
【0050】
次いで、２４時間静置した後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いで、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞に対して、１μＭ ｔｈｏｎｚｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，５μＭ ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，５μＭ ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ，５μＭ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ、又は１０μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂを含む、５％ＦＢＳ－血清ＲＰＭＩ １ｍＬを添加した。コントロールでは、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞に対して、５％ＦＢＳ－血清ＲＰＭＩを添加した。
【0051】
次いで、７２時間の感染後、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞における、ＨＡＶ ＲＮＡレベルを、以下に示す方法で、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）により測定した。
【0052】
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、トータルＲＮＡを分離した。次いで、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ；Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応は、３７℃で１５分、８５℃で５秒の条件で行った。
【0053】
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分、次いで、９５℃で１５秒及び６０℃ １分を４０サイクルで行った。ＨＡＶ ＲＮＡ及びａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの定量は、それぞれ、配列番号３及び配列番号４で表されるプライマー、配列番号５及び配列番号６で表されるプライマーを用いて行った。標準化には、ハウスキーピング遺伝子であるａｃｔｉｎを用い、データはＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ Ｍｅｔｈｏｄにより解析した。遺伝子発現量の相対値は、ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅにより得られた遺伝子発現量の絶対値と相関していた。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲは、それぞれ２回行った。
【0054】
（ＩＣ５０の測定）
ＨＡＶの最大感染抑制の５０％となるｍａｓｉｔｉｎｉｂの濃度は、ＩＣ５０＝１０＾［ＬＯＧ（Ａ／Ｂ）×（５０－Ｃ）／（Ｄ－Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ）］により算出した（Sasaki-Tanaka, R. et al. Favipiravir Inhibits Hepatitis A Virus Infection in Human Hepatocytes. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 2631. DOI: 10.3390/ijms23052631. PMID: 35269774）。Ａ及びＢは薬剤の濃度を示す。Ｃは、薬剤の濃度がＢであるときのＨＡＶ ＲＮＡレベルを意味する。Ｄは、薬剤の濃度がＡであるときのＨＡＶ ＲＮＡレベルを意味する。ＡはＩＣ５０よりも高い濃度であり、ＢはＩＣ５０よりも低い濃度である。
ＨＡＶの最大感染抑制の５０％となるｍａｓｉｔｉｎｉｂの濃度は、ＩＣ５０＝１０＾［ＬＯＧ（Ａ／Ｂ）×（５０－Ｃ）／（Ｄ－Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ）］により算出した（Sasaki-Tanaka, R. et al. Favipiravir Inhibits Hepatitis A Virus Infection in Human Hepatocytes. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 2631. DOI: 10.3390/ijms23052631. PMID: 35269774）。Ａ及びＢは薬剤の濃度を示す。Ｃは、薬剤の濃度がＢであるときのＨＡＶ ＲＮＡレベルを意味する。Ｄは、薬剤の濃度がＡであるときのＨＡＶ ＲＮＡレベルを意味する。ＡはＩＣ５０よりも高い濃度であり、ＢはＩＣ５０よりも低い濃度である。
【0055】
（免疫染色）
感染の２４時間前に、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ）のカバーグラスに、１ウェル当たり５×１０４個の細胞を播種した。次いで、ＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞を２回洗浄した。次いで、Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）を０．１に設定した無血清ＲＰＭＩ培地で、細胞に対してＨＡＶ ＨＭ１７５－１８ｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢを感染させた。
感染の２４時間前に、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ）のカバーグラスに、１ウェル当たり５×１０４個の細胞を播種した。次いで、ＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞を２回洗浄した。次いで、Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）を０．１に設定した無血清ＲＰＭＩ培地で、細胞に対してＨＡＶ ＨＭ１７５－１８ｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢを感染させた。
【0056】
次いで、１０μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂ又は０．１μｇ／ｍＬ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α－２ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞に添加した。次いで、２４時間静置後、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、ＨＡＶ感染Ｈｕｈ７細胞に対して、１０μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂ又は０．１μｇ／ｍＬ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α－２ａを含む、５％ＦＢＳ－血清ＲＰＭＩ ５００μＬを添加した。
【0057】
ウイルス感染から７２時間後に、氷冷したメタノールを用いて、－２０℃で５分間、細胞を固定した。メタノールの除去後、細胞を３分間乾燥させた。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、３％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて、室温で３０分間、ブロッキングを行った。次いで、一次抗体として抗ＨＡＶ ＶＰ１抗体（ａａ７－１４３，１：５０，ＬＳ－Ｃ１３７６７４，ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＷＡ，ＵＳＡ）、次いで、二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：５００，Ａ－１１０１７，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
【0058】
次いで、核を、５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）－ＰＢＳで、１０分間、染色した。スライドグラスを、ａｎｔｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕｅｎｃｈｅｒ （ＳｌｏｗＦａｄ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマウントした。
【0059】
蛍光免疫染色の画像は、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７１０ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＫＥＹＥＮＣＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、４０倍の対物レンズで、取得した。
【0060】
［実験例１］
（ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞のレポーター活性の確認）
ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞に導入したＨＡＶ／Ｌｕｃコンストラクトを図１Ａに示す（Gauss-Muller, V. and Kusov, Y.Y. Replication of a hepatitis A virus replicon detected by genetic recombination in vivo. J. Gen. Virol. 2002, 83, 2183-2192. DOI: 10.1099/0022-1317-83-9-2183. PMID: 12185272）。
（ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞のレポーター活性の確認）
ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞に導入したＨＡＶ／Ｌｕｃコンストラクトを図１Ａに示す（Gauss-Muller, V. and Kusov, Y.Y. Replication of a hepatitis A virus replicon detected by genetic recombination in vivo. J. Gen. Virol. 2002, 83, 2183-2192. DOI: 10.1099/0022-1317-83-9-2183. PMID: 12185272）。
【0061】
図１Ａ中、Ｔ７は、Ｔ７プロモーターである。５’－ＵＴＲは、５’非翻訳領域であり、ＨＡＶのＩＲＥＳを含む。ＩＲＥＳは、ピリミジン塩基を多く含む領域を有し、これにより、キャップ構造非依存的に翻訳が進行する。ＦｌｕｃはホタルルシフェラーゼのＯＲＦであり、ＨＡＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎのはじめの４アミノ酸残基、及び、ＨＡＶ ＨＭ１７５ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢのＶＰ１のＣ末端の１２アミノ酸残基で挟まれている。Ｐ２及びＰ３は、ＨＡＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎのＰ２及びＰ３をコードする配列である。３’－ＵＴＲは、３’非翻訳領域である。ＰｏｌｙＡは、ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌである。
【0062】
ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞に対して、０．１μｇ／ｍＬのＩＦＮ－α－２ａを添加した。４８時間静置後、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１Ｂに示す。ＩＦＮ－α－２ａで処理していないＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性は約６０００ＲＬＵ／１．５×１０５ｃｅｌｌｓであり、０．１μｇ／ｍＬのＩＦＮ－α－２ａで処理したＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性は約１０００ＲＬＵ／１．５×１０５ｃｅｌｌｓであった。ＨＡＶ／Ｌｕｃが導入されていないＨｕｈＴ７細胞のルシフェラーゼ活性は、無視できるほど低い値であった。
【0063】
ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞、ＨＡＶ／Ｌｕｃが導入されていないＨｕｈＴ７細胞について、ＨＡＶ ＲＮＡをＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより測定した結果、Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅはそれぞれ、２３．９、４０であった。
【0064】
以上の結果から、ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞が安定してＨＡＶ／Ｌｕｃを発現することが確認された。これにより、ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞は、ルシフェラーゼ活性を指標とした薬剤スクリーニングに用いることができることが確認された。
【0065】
［実験例２］
（薬剤スクリーニング）
ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞を用いて、ＦＤＡ承認薬剤ライブラリから得られた１１３４種類の薬剤について、スクリーニングを行った。
（薬剤スクリーニング）
ＨｕｈＴ７－ＨＡＶ／Ｌｕｃ細胞を用いて、ＦＤＡ承認薬剤ライブラリから得られた１１３４種類の薬剤について、スクリーニングを行った。
【0066】
スクリーニングは、ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率を指標として行った。結果を図２に示す。図２中、横軸は、ルシフェラーゼの比活性を示し、縦軸は、細胞生存率を示す。ルシフェラーゼの比活性は、薬剤を投与していない細胞のルシフェラーゼ活性に対する、薬剤投与した細胞のルシフェラーゼ活性の比である。
【0067】
スクリーニングの結果を参照し、ルシフェラーゼの比活性が０．３３未満であり、かつ、薬剤投与後の細胞生存率が９０％超であった、５種類の薬剤を選択した。５種類の薬剤は、ｍａｓｉｔｉｎｉｂ（マシニチブ），ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ，ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅａｎｄｔｈｏｎｚｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅであった。
【0068】
［実験例３］
（５種類の薬剤の活性）
スクリーニングにより選択した５種類の薬剤について、ＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡ株を用いて、ＨＡＶ ＲＮＡの発現抑制効果、細胞生存率を測定した。
（５種類の薬剤の活性）
スクリーニングにより選択した５種類の薬剤について、ＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡ株を用いて、ＨＡＶ ＲＮＡの発現抑制効果、細胞生存率を測定した。
【0069】
５種類の薬剤を用いた場合の、ＨＡＶ ＲＮＡの発現量をＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより測定した。結果を図３に示す。図３中、縦軸は、ａｃｔｉｎで標準化したＨＡＶの発現量（ＨＡＶ／ａｃｔｉｎ）の比を示す。この比は、薬剤非投与後のＨＡＶ／ａｃｔｉｎに対する、各薬剤投与後のＨＡＶ／ａｃｔｉｎの比を示す。＊＊は、ｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を意味する。
１０μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂの投与により、ウイルスの複製が７１％減少することが確認された。
１０μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂの投与により、ウイルスの複製が７１％減少することが確認された。
【0070】
細胞生存率の測定の結果から、ｍａｓｉｔｉｎｉｂは１０μＭ以下で細胞毒性を有さず、ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｎｅｂｉｖｏｌｏｌ及びｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅは５μＭ以下で細胞毒性を有さず，ｔｈｏｎｚｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅは１μＭ以下で細胞毒性を有さないことが確認された（図示せず）。
【0071】
［実験例４］
（ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるＨＡＶタンパク質の発現抑制）
Ｈｕｈ７細胞に対してＨＡＶ ＨＭ１７５－１８ｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢ株を感染させ、ＨＡＶ ＶＰ１タンパク質の発現量を観察することにより、ｍａｓｉｔｉｎｉｂのウイルス増殖抑制効果を評価した。ＨＡＶ ＶＰ１タンパク質は、抗ＶＰ１抗体を用いて染色した。結果を図４に示す。図４中、スケールバーは２５μｍを示す。
（ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるＨＡＶタンパク質の発現抑制）
Ｈｕｈ７細胞に対してＨＡＶ ＨＭ１７５－１８ｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＢ株を感染させ、ＨＡＶ ＶＰ１タンパク質の発現量を観察することにより、ｍａｓｉｔｉｎｉｂのウイルス増殖抑制効果を評価した。ＨＡＶ ＶＰ１タンパク質は、抗ＶＰ１抗体を用いて染色した。結果を図４に示す。図４中、スケールバーは２５μｍを示す。
【0072】
ＨＡＶを感染させていない細胞では、ＶＰ１のシグナルが確認されなかった（Ｍｏｃｋ）。ＨＡＶを感染させた細胞では、ＶＰ１のシグナルが確認された（ＨＡＶ）。ＩＦＮ－α－２ａ又はｍａｓｉｔｉｎｉｂ存在下では、非存在下に比べて、ＶＰ１のシグナルが減弱していた。
【0073】
以上の結果から、ｍａｓｉｔｉｎｉｂにより、ＶＰ１タンパク質の発現量が低下すること、すなわち、ウイルス増殖が抑制されることが確認された。
【0074】
［実験例５］
（ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるＨＡＶ ＲＮＡの発現抑制）
Ｈｕｈ７細胞に対して、ＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡ株を感染させ、ＨＡＶ ＲＮＡ量をＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより定量することにより、ｍａｓｉｔｉｎｉｂのウイルス増殖抑制効果を評価した。結果を図５に示す。
（ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるＨＡＶ ＲＮＡの発現抑制）
Ｈｕｈ７細胞に対して、ＨＡＶ ＨＡ１１－１２９９ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩＩＡ株を感染させ、ＨＡＶ ＲＮＡ量をＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより定量することにより、ｍａｓｉｔｉｎｉｂのウイルス増殖抑制効果を評価した。結果を図５に示す。
【0075】
図５中、縦軸は、ａｃｔｉｎで標準化したＨＡＶの発現量（ＨＡＶ／ａｃｔｉｎ）の比を示す。この比は、薬剤を投与しなかった場合のＨＡＶ／ａｃｔｉｎに対する、各薬剤投与後のＨＡＶ／ａｃｔｉｎの比を示す。横軸は、ｍａｓｉｔｉｎｉｂの濃度を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を意味する。
【0076】
５μＭ又は１０μＭのｍａｓｉｔｉｎｉｂの存在下では、ｍａｓｉｔｉｎｉｂの非存在下に比べて、ＨＡＶ ＲＮＡ量の発現量が、それぞれ、３２％、６０％低下した。ＨＡＶの感染最大抑制の５０％となるｍａｓｉｔｉｎｉｂの濃度（ＩＣ５０）は、７．８１μＭであった。
【0077】
［実験例６］
（ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるＨＡＶの増殖抑制）
ＣＯＳ７－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株、及び、ｐＳＶ４０－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞を用いて、ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるルシフェラーゼ活性の抑制効果を評価した。結果を図６Ａ～図６Ｄに示す。
（ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるＨＡＶの増殖抑制）
ＣＯＳ７－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞株、及び、ｐＳＶ４０－ＨＡＶ－ＩＲＥＳ細胞を用いて、ｍａｓｉｔｉｎｉｂによるルシフェラーゼ活性の抑制効果を評価した。結果を図６Ａ～図６Ｄに示す。
【0078】
図６Ａ及び図６Ｂ中、縦軸は、ルシフェラーゼの比活性を示す。図６Ｃ及び図６Ｄ中、縦軸は、細胞生存率を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を意味する。
【0079】
５μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂ存在下では、ＣＯＳ７細胞におけるＨＡＶ－ＩＲＥＳの活性、Ｈｕｈ７細胞におけるＨＡＶ－ＩＲＥＳの活性が、それぞれ、６６％、３３％低下した。１０μＭ ｍａｓｉｔｉｎｉｂ存在下では、Ｈｕｈ７細胞におけるＨＡＶ－ＩＲＥＳの活性が、８８％低下した。
【0080】
ｍａｓｉｔｉｎｉｂの濃度が１０μＭ以下の条件では、細胞生存率に大きな影響は確認されなかった。
【産業上の利用可能性】
【0081】
Ａ型肝炎ウイルス等のＲＮＡウイルスに対しする抗ウイルス剤、抗ウイルス剤を含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【配列表】