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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024110569
(43)【公開日】2024-08-16
(54)【発明の名称】子宮間葉性腫瘍に対する予後予測法の開発
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240808BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240808BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/574 A
【審査請求】有
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023015220
(22)【出願日】2023-02-03
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2024-08-01
(71)【出願人】
【識別番号】504136993
【氏名又は名称】独立行政法人国立病院機構
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】林 琢磨
(72)【発明者】
【氏名】天野 泰彰
(72)【発明者】
【氏名】安彦 郁
(72)【発明者】
【氏名】小西 郁生
(72)【発明者】
【氏名】佐野 健司
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB02
2G045DA36
2G045FB03
(57)【要約】
【課題】子宮間葉性腫瘍の患者の生命予後の予測を精度よく行う。
【解決手段】子宮間葉性腫瘍に罹患した対象から採取した子宮平滑筋組織検体について、サイクリンＥ及びＫｉ－６７を検出して、その結果で子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する。
【選択図】なし
【解決手段】子宮間葉性腫瘍に罹患した対象から採取した子宮平滑筋組織検体について、サイクリンＥ及びＫｉ－６７を検出して、その結果で子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
術前で、子宮間葉性腫瘍に罹患した対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出する工程を含む、子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する方法。
【請求項2】
前記子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記検出が、免疫組織化学染色による検出である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記生検が、ＣＴガイド下で採取されたバイオプシー生検である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫組織化学バイオマーカーによる子宮間葉性腫瘍の予後予測法に関する。
【背景技術】
【0002】
子宮の平滑筋層で発症する腫瘍は間葉性腫瘍であり、良性の子宮間葉性腫瘍が子宮平滑筋腫であり、悪性の子宮間葉性腫瘍が子宮平滑筋肉腫である。これまでの臨床研究の結果、子宮平滑筋肉腫は、再発・転移を繰り返し、子宮平滑筋肉腫の５年生存率は、２０％未満とされている難治性悪性腫瘍である。子宮平滑筋腫は、３０歳以上の女性の２０～３０％、顕微鏡的なものを含めると約７０％に認められるといわれる罹患率の高い良性腫瘍である。一方で、子宮平滑筋肉腫は発症頻度が低く、子宮体部の悪性腫瘍の約１～２％である。子宮平滑筋肉腫は、子宮頸部よりの平滑筋層よりも、子宮体部の筋肉層で多く発生する。多くの症例で、子宮平滑筋肉腫は、子宮平滑筋腫と併発しており、子宮平滑筋肉腫と子宮平滑筋腫は混在している。子宮間葉性腫瘍は、多彩な細胞形態を有するため、子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫とを鑑別することが非常に難しい症例が少なくない。多くの症例では、外科病理診断は、子宮摘出又は腫瘍核出術により採取された組織に対する検鏡下において、行われる。子宮平滑筋肉腫の症例の多くでは、細胞異型性と核異型性が強く増殖能が高い。その腫瘍学的性質ため、中には腫瘍が巨大化する例もみられる。しかし、一方で、検鏡下ではほとんど細胞異型性や核異型性が認められない子宮平滑筋肉腫の場合もあり、細胞異型性や核異型性の有無は、決定的な鑑別基準とまではいえなかった。
【0003】
子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫との鑑別診断は、凝固壊死があるかどうか、及び細胞分裂像が増加しているかどうかが１つの判断基準とされている。さらに、これまでの子宮間葉性腫瘍に対する病理診断での基準として、細胞密度が高い場合には１０倍高視野で１０個以上、腫瘍細胞に異型性が認められる場合には１０倍高視野で５個以上の細胞分裂がある場合に、子宮平滑筋肉腫と診断される症例が多い。つまり、実臨床では、検鏡下で、腫瘍細胞の細胞異型度、細胞密度、細胞分裂の数、細胞形態の有無についての組織学的所見が確認され、肉眼で、腫瘍内の壊死、出血の有無についての検体の所見が確認される。組織学的所見と検体の所見を併せて、病理学的診断が行われる。しかしながら、組織学的所見の確認は、診断病理医の主観によることが多く、客観性に欠けている。そのため、実臨床において、子宮間葉性腫瘍に対する客観的な指標を用いた病理学的診断法の確立が求められている。
【0004】
子宮間葉性腫瘍に対する病理学的診断において、悪性とも良性とも判断ができない子宮間葉性腫瘍、つまり、悪性度不明な平滑筋腫瘍（Smooth muscle tumors of uncertain malignant potential: ＳＴＵＭＰ）と診断される症例が存在する。ＳＴＵＭＰの症例において、予後不良(手術後５年以内に)となる症例が散見される。
【0005】
非特許文献１には、インターフェロンγ誘導型の蛋白質分解酵素複合体であるイムノプロテアーゼの構成因子であるＬＭＰ２（large multifunctional protease 2）を欠損したマウスのメスにおいて、生後６ヶ月以降に子宮平滑筋肉腫（uterine leiomyosarcoma）の自然発症が認められ、生後１２ヶ月までの発症率が全ＬＭＰ２欠損マウスのメスの約３５％にまで及ぶことが報告されている。ＬＭＰ２の生理学的機能は、基質または組織特異的であり、cytotoxic T cells (ＣＴＬｓ)によるMajor Histocompatibility Complex (ＭＨＣ)クラスＩが仲介する抗腫瘍免疫活性に重要な生物学的役割を持っている（非特許文献２参照）。特許文献１には、子宮平滑筋組織のＬＭＰ２の転写又は発現の程度を指標に、子宮平滑筋肉腫の存在を評価する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２００７／０６４０３８号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Hayashi T. et al., Cancer Res., 62, 22-27 (2002)
【非特許文献2】Van Kaer L. et al., Immunity, 1, 533-541 (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上記の通り、子宮平滑筋肉腫を評価する基準は知られているが、実臨床では、子宮間葉性腫瘍は、多彩な細胞形態を有するため、上記の基準では判断出来ない腫瘍の症例は少なくない。つまり、従来の評価基準によってＳＴＵＭＰと診断された症例では、生命予後が予測出来ないため、外科的治療後のフォローアップに苦慮する症例が認められる。したがって、従来の評価基準は、必ずしも患者の予後予測に寄与するものではなかった。
【0009】
本発明は、子宮間葉性腫瘍の患者に対して予後予測を行うにあたり、これまでの子宮間葉性腫瘍に対する病理診断の精度を高めることが可能な生命予後の予測法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、以下を提供する。
［１］術前で、子宮間葉性腫瘍に罹患した対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出する工程を含む、子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を行う方法。
［２］前記子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍である、［１］に記載の方法。
［３］前記検出が、免疫組織化学染色法による検出である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を使用する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記生検が、Computed Tomography（コンピュータ断層撮影）(ＣＴ)ガイド下で採取されたバイオプシー生検である、［１］に記載の方法。
［６］サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
［１］術前で、子宮間葉性腫瘍に罹患した対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出する工程を含む、子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を行う方法。
［２］前記子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍である、［１］に記載の方法。
［３］前記検出が、免疫組織化学染色法による検出である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を使用する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記生検が、Computed Tomography（コンピュータ断層撮影）(ＣＴ)ガイド下で採取されたバイオプシー生検である、［１］に記載の方法。
［６］サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、子宮間葉性腫瘍を罹患した患者の予後予測を行うにあたり、これまでの子宮間葉性腫瘍に対する病理診断の基準の精度を高めることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】悪性の子宮間葉性腫瘍の発症が疑われた患者より、外科的治療により摘出された組織を用いて行われた病理診断の結果、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）及びＳＴＵＭＰと診断された患者を選択した。外科的治療で摘出された腫瘍組織に対して抗サイクリンＥモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学染色法(ＩＨＣ)により染色を行った。図１は、染色結果を撮像した写真である。図１Ａは、ＬＭＳ患者で術後５年以内に死亡した症例(LMS D)、図１Ｂは、ＬＭＳ患者で術後５年以上生存している症例(LMS L)、図１Ｃは、ＳＴＵＭＰ患者で術後５年以内に死亡した症例(STUMP D)、図１Ｄは、ＳＴＵＭＰ患者で術後５年以上生存している症例(STUMP L)のＩＨＣ染色結果の写真である。
【図2】悪性の子宮間葉性腫瘍の発症が疑われた患者より、外科的治療により摘出された組織を用いて行われた病理診断の結果、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）及びＳＴＵＭＰと診断された患者を選択した。外科的治療で摘出された腫瘍組織に対して抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体を用いてＩＨＣにより染色を行った。染色結果を撮像した写真である。図２Ａは、ＬＭＳ患者で術後５年以内に死亡した症例(LMS D)、図２Ｂは、ＬＭＳ患者で術後５年以上生存している症例(LMS L)、図２Ｃは、ＳＴＵＭＰ患者で術後５年以内に死亡した症例(STUMP D)、図２Ｄは、ＳＴＵＭＰ患者で術後５年以上生存している症例(STUMP L)のＩＨＣ染色結果を撮像した写真である。
【図3】子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）患者の予後不良（Ｄ）群(術後５年以内に死亡した症例)、予後良好（Ｌ）群(術後５年以上生存している症例)、及びＳＴＵＭＰ患者の予後不良（Ｄ）群(術後５年以内に死亡した症例)、予後良好（Ｌ）群(術後５年以上生存している症例)で、抗サイクリンＥモノクローナル抗体及び抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体を用いたＩＨＣ染色法を行った。染色結果より、サイクリンＥまたはＫｉ－６７の発現レベルを染色強度として数値化して、各症例でのサイクリンＥまたはＫｉ－６７の発現レベルの分布を示す散布図である。図３Ａは、ＬＭＳのＤ群及びＬ群におけるサイクリンＥ（ＣＣＮＥ）、Ｋｉ－６７の染色強度の分布を示す。図３Ｂは、ＳＴＵＭＰのＤ群及びＬ群における抗サイクリンＥモノクローナル抗体、抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体による染色強度の分布を示す。
【図4】子宮平滑筋肉腫患者を、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現が低かった群（ａ群）と高かった群（ｂ群）に分け、各群の生存率の推移を示した生存曲線である。図中、「*」は、カプラン－マイヤー法でｐ＜０．０１であったことを示す。
【図5】実施例２の症例１の子宮体部内の原発腫瘍及び肺臓器への転移腫瘍の組織染色写真を示す。上段が原発腫瘍、下段が肺臓器への転移腫瘍の写真である。また、左がＨＥ染色、中央が抗サイクリンＥモノクローナル抗体による染色、右が抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体による染色した結果を撮影した写真である。各写真の下段は上段の破線枠内の拡大図を示す。
【図6】実施例２の症例２の子宮体部内の原発腫瘍及び肺臓器への転移腫瘍の組織染色写真を示す。上段が原発腫瘍、下段が肺臓器への転移腫瘍の写真である。また、左がＨＥ染色、中央が抗サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）抗体染色、右が抗Ｋｉ－６７抗体染色した各標本の写真である。各写真の下段は上段の破線枠内の拡大図を示す。
【図7】ＬＭＳ患者及びＳＴＵＭＰ患者より術前でのバイオプシー生検、並びに外科的治療法により摘出した腫瘍組織について、一次抗体として抗サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)モノクローナル抗体を用いてＩＨＣ染色した結果を撮像した写真である。
【図8】ＬＭＳ患者及びＳＴＵＭＰ患者より術前でのバイオプシー生検、並びに外科的治療法により摘出した腫瘍組織について、一次抗体として抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体（クローンＭＩＢ－１）を用いてＩＨＣ染色した結果を撮像した写真である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１．子宮間葉性腫瘍の診断を補助する方法
本発明の第１の実施形態は、子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測する方法で、これまでの病理診断法を補助する方法であって、術前で、画像診断等で悪性が疑われる子宮間葉性腫瘍に罹患した対象からＣＴガイド下で採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検について、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出する工程を含むことを特徴とする。本実施形態の方法は、上記特徴を有することで、対象の生命予後を予測することが可能となり、これまでの病理診断法を補助し、これにより、対象への治療強度の決定を補助することが可能である。例えば、予後が良好である子宮間葉性腫瘍と判断される場合は、患者に対する外来での定期診察の継続を行い、予後が不良である子宮間葉性腫瘍と判断される場合は、患者の生存を最優先とする治療を選択することができる。
本発明の第１の実施形態は、子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測する方法で、これまでの病理診断法を補助する方法であって、術前で、画像診断等で悪性が疑われる子宮間葉性腫瘍に罹患した対象からＣＴガイド下で採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検について、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出する工程を含むことを特徴とする。本実施形態の方法は、上記特徴を有することで、対象の生命予後を予測することが可能となり、これまでの病理診断法を補助し、これにより、対象への治療強度の決定を補助することが可能である。例えば、予後が良好である子宮間葉性腫瘍と判断される場合は、患者に対する外来での定期診察の継続を行い、予後が不良である子宮間葉性腫瘍と判断される場合は、患者の生存を最優先とする治療を選択することができる。
【0014】
教科書的には、子宮肉腫は、癌肉腫、子宮平滑筋肉腫、子宮内膜間質肉腫、腺癌肉腫、脂肪性平滑筋肉腫に分類される。しかし、2020年のWHO分類では、癌肉腫、子宮内膜間質肉腫、腺癌肉腫、は、癌に分類された。本明細書において、子宮間葉性腫瘍とは、子宮の平滑筋組織から発症する子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、脂肪性平滑筋肉腫、脂肪性子宮平滑筋腫、静脈内平滑筋腫症、良性転移性平滑筋腫、核異型を伴う子宮平滑筋腫（子宮平滑筋腫 with Bizarre Nuclei）、ＳＴＵＭＰなどを示す。子宮体部で発症が認められる横紋筋肉腫は、子宮内膜組織の細胞が分化し、肉腫成分が発現している悪性腫瘍であり、子宮平滑筋細胞をオリジンとする子宮間葉性腫瘍とは異なっている。子宮間葉性腫瘍の細胞・核形態は非常に多彩であるため、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）は、高頻度にみられる良性腫瘍である子宮平滑筋腫との鑑別がしばしば困難となる疾患であり、子宮平滑筋肉腫を含む子宮間葉性腫瘍に対するより適切な診断法が求められている。ＬＭＳは、基本的には生命予後が不良な疾患として知られるが、同じＬＭＳの症例であっても、比較的予後が良好な症例も存在する。一方、子宮間葉性腫瘍には、良性／悪性の判断がつかない、悪性度不明の平滑筋腫瘍（ＳＴＵＭＰ）が存在する。従来の外科的病理組織診断では、多くの症例において、ＳＴＵＭＰは、ＬＭＳほどの悪性度が認められない腫瘍であるが、中にはＬＭＳと同様に生命予後が不良な症例も存在する。また、本発明者らは、希少例ではあるが、良性の子宮平滑筋腫と診断された症例において、手術後５年以内に肺転移を発症した症例を経験している。本発明者らは、子宮間葉性腫瘍、特にＬＭＳだけでなく、ＳＴＵＭＰ等のＬＭＳ以外の子宮間葉性腫瘍について、その生命予後が、従来の悪性度診断よりも組織の２つのマーカーの発現量に相関することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0015】
本実施形態の方法において、予後予測の対象となる子宮間葉性腫瘍は、ＬＭＳ以外の子宮間葉性腫瘍であってもよい。実臨床においては、特に、ＳＴＵＭＰを対象とすることが好ましい。本実施形態の方法は、ＬＭＳに限らず、従来の診断では悪性と診断されない子宮間葉性腫瘍についても、精度の高い予後予測を可能とする。
【0016】
本明細書において、「予後予測」とは、生命予後、特に５年生存の可能性予測、又は、再発・転移、特に５年以内の再発・転移の可能性予測を指す。
【0017】
本明細書において、「対象」とは、子宮間葉性腫瘍に罹患したヒトを指す。本明細書において、「対象」を「患者」とも称する。
【0018】
本明細書において、「組織検体」は、対象から取り出した組織検体を指し、より具体的には、開腹を伴う外科的治療法(手術)で摘出された子宮平滑筋腫瘍組織検体、内視鏡で切除された子宮平滑筋腫瘍組織検体及び生検を指す。また、生検は、具体的には、経腟的針生検で採取された子宮平滑筋腫瘍組織検体である。経腟的針生検は、一般的には、超音波ガイド下で取得されるが、より確実に腫瘍組織検体を取得するため、ＣＴガイド下で採取されることが好ましい。
【0019】
本発明の方法によれば、術前のバイオプシー生検を用いてサイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出した場合でも、外科的治療法による摘出組織を用いてサイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出した場合と同様の結果を得ることができる。従って、術前のバイオプシー生検を用いた場合でも、子宮間葉性腫瘍が悪性か良性かを判断することができ、生命予後を予測することができる。本発明の方法により、これまでの子宮間葉性腫瘍に対する病理診断の基準を補助することができる。
【0020】
組織切片の調製手法としては、パラフィン包埋法を用いることができる。具体的には、バイオプシー生検または摘出組織を10％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、これをミクロトーム等の薄切装置で１～５μｍ程度の厚さに切り出す手法で、外科病理診断用の未染薄切スライドを得ることができる。標的因子(サイクリンＥ及びＫｉ－６７)を選択的に結合するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色あるいはHE染色後の標本を顕微鏡で観察を行うためには、外科的治療法による摘出組織またはバイオプシー生検は、組織切片の形状であることが好ましい。
【0021】
本明細書において「抗体」は、モノクローナル抗体であり得、抗体のイムノグロブリンクラスは、ＩｇＧであり、いずれのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であってもよい。本明細書における「抗体」の用語は、必ずしもインタクトな抗体である必要はなく、抗原結合性断片も包含するものとする。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくは（ｓｃＦｖ－ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体を挙げることができる。
【0022】
本実施形態の方法は、対象から外科的治療法による摘出組織またはバイオプシー生検について、２つのマーカー、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現を検出する工程を含む。サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼの活性を調節する、細胞周期で重要な役割を果たすタンパク質であり、サイクリンＥは、哺乳類細胞の細胞増殖周期のＧ１期において作用するＧ１サイクリンの一つである。サイクリンＥは、子宮平滑筋肉腫組織において、正常組織と比較して著しく上昇するが、子宮平滑筋腫組織においては著しく上昇しないことが知られる。
【0023】
本明細書において、サイクリンＥは、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１（UniProt Accession No. P24864-1）に示すアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指すものとする。本明細書において、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）等のタンパク質検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる値をいう。
【0024】
Ｋｉ－６７は核小体にも分布しリボゾームＲＮＡ合成に関与するとされる。本明細書において、Ｋｉ－６７は、配列番号２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２（NCBI Reference Sequence NP_002408.3）に示すアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指すものとする。配列番号１及び２のアミノ酸配列を表１に示す。
【0025】
【表1】
【0026】
本実施形態の方法において、サイクリンＥの発現の検出は、サイクリンＥタンパク質を免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法により直接検出してもよく、また、サイクリンＥをコードするｍＲＮＡをｍＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法にて検出してもよい。同様に、Ｋｉ－６７の発現の検出は、Ｋｉ－６７タンパク質を直接検出してもよく、また、Ｋｉ－６７をコードするｍＲＮＡをｍＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法にて検出してもよい。検体として組織切片を使用する場合、タンパク質の検出は免疫組織化学（ＩＨＣ）染色、ｍＲＮＡの検出はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで実施することができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、例えば分子生物学実験プロトコールIII 丸善株式会社 平成９年８月30日の記載に従って行うことができる。この際、サイクリンＥおよび／またはＫｉ－６７をコードするｍＲＮＡを特異的に測定するために、サイクリンＥおよび／またはＫｉ－６７をコードするｍＲＮＡの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブまたはプライマーを用いればよい。検体が腹水や胸水から採取された細胞の場合は、例えば、免疫細胞化学染色の手法を用いることができる。すなわち、腹水又は胸水を採取し、その体液内に存在する細胞を集め、メタノール等により固定し固定標本を作製し、該固定標本を免疫細胞化学染色により染色すればよい。本実施形態の方法において、検出は、ＩＨＣ染色で行われることが好ましい。
【0027】
ＩＨＣ染色を行う場合、一次抗体としては、サイクリンＥに特異的に結合する抗体、又はＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用することができる。ＩＨＣ染色には、パラフィン包埋法等で調製された未染薄切スライドを使用することができる。パラフィン組織切片を使用する場合のＩＨＣの手法は、特に限定されないが、例えば以下の手法をとることができる。測定時にキシレン処理、エタノール処理等によりパラフィンを除去し、生理食塩水又は緩衝液に浸して親水化する。染色は、無標識抗サイクリンＥモノクローナル抗体若しくは抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体を結合させた後に、該抗体（例えばマウスＩｇＧ）を抗原とする3,3'Diaminobenzidine (DAB)酵素又は蛍光物質で標識された抗体を二次抗体として結合させる。標識に用いる酵素として、ＩＨＣ染色の手法は、当業者にとって公知であり、当業者は、公知の手法から、適したものを適宜選択することができる。
【0028】
ＩＨＣ染色による結果は、顕微鏡下で判断することもできる。しかし、ＩＨＣ染色による結果を客観的な数値で示すことが重要である。既存の画像解析装置及び画像解析ソフトを用いて標的因子(サイクリンＥとＫｉ－６７)の発現量を数値化する。例えば、数値化するソフトを使用して、１倍高視野（ＨＰＦ）当たりの特定の波長のＤＡＢの染色強度を測定することが必要である。このような画像解析装置及び画像解析ソフトとして、例えば、デジタル顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（キーエンス社（大阪））及びＭａｎｔｒａ ２（Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のＯｐａｌ解析ソフトを使用することができる。後ろ向き臨床研究で、生命予後が明らかにされている摘出組織あるいはバイオプシー生検について、同様のＩＨＣ染色及び染色の数値を行い、Receiver-operating characteristic(ＲＯＣ)曲線等を作成して染色強度のカットオフ値を設定することができる。
【0029】
子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測判定には、ＩＨＣ染色の結果より、以下を補助情報として参照することができる。
サイクリンＥ及びＫｉ－６７がカットオフ超：予後不良
サイクリンＥ又はＫｉ－６７がカットオフ以下：予後良好
サイクリンＥ及びＫｉ－６７がカットオフ超：予後不良
サイクリンＥ又はＫｉ－６７がカットオフ以下：予後良好
【0030】
図１Ａ及び図１Ｃは、それぞれ子宮平滑筋肉腫(ＬＭＳ)及び悪性度不明な平滑筋腫瘍(ＳＴＵＭＰ)で５年以内に死亡した症例、すなわち生命予後が不良であった症例由来の摘出組織を、抗サイクリンＥモノクローナル抗体を用いてＩＨＣ染色を行った結果を示す写真である。図中、茶色で着色された部分が抗サイクリンＥモノクローナル抗体でサイクリンＥの発現が認められた領域である。摘出組織全体の細胞の核は、ヘマトキシリン染色（Ｈ染色）法で青く着色されており、摘出組織のクオリティーに問題は無いことが明らかにされている。生命予後が不良であった症例から選ばれたこの２症例において、標的因子(サイクリンＥとＫｉ－６７）発現が強く認められる染色像が見られた。一方、図１Ｂ及び図１Ｄは、それぞれＬＭＳ及びＳＴＵＭＰで術後５年以上生存している症例、すなわち、生命予後が良好であった症例由来の摘出組織を、抗サイクリンＥモノクローナル抗体を用いてＩＨＣ染色が行われた結果を示す写真である。予後が良好な症例では、標的因子(サイクリンＥとＫｉ－６７）の発現が強く認められる染色像は見られなかった。このように、従来の悪性度判定基準では診断結果が得られなか症例において、ＬＭＳ及びＳＴＵＭＰの生命予後の不良例は、図１Ａ及び図１Ｃのように、特徴的な標的因子(サイクリンＥとＫｉ－６７）の発現が強い染色像が確認された。抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体を用いたＩＨＣ染色法でも同様の結果が得られることが確認された（図２Ａ及び図２Ｃ）。本実施形態の方法において、画像解析装置及び画像解析ソフトを使用する場合、例えば、人工知能（ＡＩ）を用いて上記の特徴的な染色像を判定する機構を装置に組み込んでもよい。ＡＩを用いる場合、ロゼット様の染色像、それ以外の染色像のデータベースを教師データとして、既知のニューラルネットワークを用いた機械学習を経て学習済みモデルを構築することができ、解析手段は、これを用いて、目的の画像から、ロゼット様の染色像を示すか否かの判定を行い、出力することができる。
【0031】
サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量の測定値は、例えば、予め設定したカットオフ値を用いて判定することができる。カットオフ値は、予後既知の検体を用いて作成したＲＯＣ曲線等より設定することができる。子宮間葉性腫瘍の予測判定には、発現量測定値より、以下を補助情報として参照することができる。
サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量がカットオフ超：予後不良
サイクリンＥ又はＫｉ－６７の発現量がカットオフ以下：予後良好
サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量がカットオフ超：予後不良
サイクリンＥ又はＫｉ－６７の発現量がカットオフ以下：予後良好
【0032】
本実施形態の方法は、サイクリンＥ及びＫｉ－６７に加えて、さらに他のマーカーの発現の検出を含んでいてもよい。他のマーカーとしては、キャベオリン、ＬＭＰ２等が挙げられる。子宮間葉性腫瘍では、悪性、良性腫瘍に関係なく、キャベオリンの強い発現が認められる。つまり、キャベオリンは、子宮間葉性腫瘍のバイオマーカーである。ＬＭＰ２はプロテアソームのサブユニットである。正常な子宮平滑筋層と子宮平滑筋腫では、ＬＭＰ２の発現が陽性であるが、子宮平滑筋肉腫では、ＬＭＰ２の発現が陰性となることが知られている。ＬＭＰ２の発現レベルは、子宮平滑筋腫瘍の悪性度判定に有用であることが報告されている（国際公開第２００７／３２４４０３）。これらの他のマーカーの発現は、サイクリンＥ及びＫｉ－６７と同様にＩＨＣ染色等で検出されてもよく、また、別の方法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫測定等で検出されてもよい。
【0033】
２．子宮間葉性腫瘍の予後予測補助用キット
本発明の第２の実施形態は、子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測補助用キットであり、サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、ことを特徴とする。本実施形態のキットは、より具体的には、「１．子宮間葉性腫瘍の診断を補助する方法」の項に記載の方法に使用するためのキットである。本実施形態のキットの測定原理は、特に矛盾のない限り、「１．子宮間葉性腫瘍の診断を補助する方法」の項に記載の通りである。
本発明の第２の実施形態は、子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測補助用キットであり、サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、ことを特徴とする。本実施形態のキットは、より具体的には、「１．子宮間葉性腫瘍の診断を補助する方法」の項に記載の方法に使用するためのキットである。本実施形態のキットの測定原理は、特に矛盾のない限り、「１．子宮間葉性腫瘍の診断を補助する方法」の項に記載の通りである。
【0034】
本実施形態のキットの測定対象となる検体は、子宮間葉性腫瘍に罹患した対象から取得した組織検体とすることが好ましい。子宮間葉性腫瘍は、例えばＳＴＵＭＰ等の、ＬＭＳ以外の子宮間葉性腫瘍であってもよい。
【0035】
本実施形態のキットは、サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含み、検体中のサイクリンＥ及びＫｉ－６７を、ＩＨＣ染色法、免疫細胞化学染色を介して検出することが可能であり、該検出結果により、対象の子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助することが可能である。本実施形態のキットは、好ましくは、ＩＨＣ染色用キットである。
【0036】
本実施形態のキットは、抗体に加えて、サイクリンＥ及びＫｉ－６７を検出するための他の試薬等を備えていてもよい。例えばＩＨＣ染色用キットであれば、組織固定用の10％中性緩衝ホルマリン、包埋用パラフィン、スライドガラス、カバーガラス、切片洗浄用のアルコール（キシレン、エタノール等）、標識二次抗体、ＨＥ染色色素等を備えていてもよい。また、本実施形態のキットは、使用説明書、染色像判定用のインジケータ等を備えていてもよい。
【0037】
さらに、本実施形態のキットは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりサイクリンＥおよび／またはＫｉ－６７をコードするｍＲＮＡを測定する場合、少なくともサイクリンＥおよび／またはＫｉ－６７をコードするｍＲＮＡの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブまたはプライマーを含む。
【実施例0038】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0039】
［実施例１］組織検体のサイクリンＥ及びＫｉ－６７をマーカーとする免疫組織化学染色試験
（１）組織検体採取と病理学的診断
子宮平滑筋腫瘍の発症と診断された３２～８３歳の１０１人の患者から採取された、病理学検査用の組織検体を使用した。各患者由来の２ブロックの組織検体から、連続切片を切り出し、ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）、各標的因子に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。信州大学倫理委員会および国立病院機構中央倫理審査委員会で、臨床研究の研究計画書が承認された後に、全ての組織は、各患者から書面による臨床研究への参加の同意を得た後に使用された。
（１）組織検体採取と病理学的診断
子宮平滑筋腫瘍の発症と診断された３２～８３歳の１０１人の患者から採取された、病理学検査用の組織検体を使用した。各患者由来の２ブロックの組織検体から、連続切片を切り出し、ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）、各標的因子に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。信州大学倫理委員会および国立病院機構中央倫理審査委員会で、臨床研究の研究計画書が承認された後に、全ての組織は、各患者から書面による臨床研究への参加の同意を得た後に使用された。
【0040】
子宮平滑筋腫瘍の病理学的診断は、確立された判定基準(Uterine leiomyoma. Female Genital Tumours WHO Classification of Tumours, 5th ed., Vol.4. WHO Classification of Tumours Editorial Board. WORLD HEALTH ORGANIZATION. 2020; pp283-285., Uterine leiomyosarcoma. Female Genital Tumours WHO Classification of Tumours, 5th ed., Vol.4. WHO Classification of Tumours Editorial Board. WORLD HEALTH ORGANIZATION. 2020; pp272-276.）に従って、診断病理医によって行われた。
【0041】
子宮平滑筋腫瘍(良性腫瘍、悪性腫瘍を含む)の発症が疑われた患者１０１人から得られた、各種腫瘍組織の種類及び例数は、表２に示す通りであった。表２の例数には、単独の患者から取得された複数種の腫瘍(子宮平滑筋腫瘍に対する対象例として、子宮横紋筋肉腫や子宮頸がんも含まれる)も含まれる。
【0042】
子宮頸部上皮および癌組織を組織アレイ（AccuMax Array（韓国、ソウル）)に供して、タンパク質発現を観察した。組織アレイは、製造業者（AccuMax Array)の説明書に従って実施した。
【0043】
（２）免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
子宮間葉性腫瘍を有する患者から摘出した子宮間葉性腫瘍の連続切片について、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、キャベオリン１（ＣＡＶ１）、サイクリンＢ（ＣＣＮＢ）、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ）、大型多機能ペプチダーゼ２／β１ｉ（ＬＭＰ２／β１ｉ）、及びＫｉ－６７に対する抗体を用いたＩＨＣ染色を実施した。ＩＨＣ染色は、ＤＡＢ標識抗体を用いた発色法を用いて実施した。
子宮間葉性腫瘍を有する患者から摘出した子宮間葉性腫瘍の連続切片について、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、キャベオリン１（ＣＡＶ１）、サイクリンＢ（ＣＣＮＢ）、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ）、大型多機能ペプチダーゼ２／β１ｉ（ＬＭＰ２／β１ｉ）、及びＫｉ－６７に対する抗体を用いたＩＨＣ染色を実施した。ＩＨＣ染色は、ＤＡＢ標識抗体を用いた発色法を用いて実施した。
【0044】
悪性の子宮間葉性腫瘍が疑われた患者由来の子宮組織標本のパラフィン包埋試料から、５ｍｍ組織切片を切り出し、一次抗体として各マーカーに対するモノクローナル抗体を反応させた。一次抗体は以下の物を使用した。
抗ＣＣＮＥモノクローナル抗体（ＣＣＮＥ１／２４６０）：Ａｂｃａｍ社(英国、ケンブリッジ)から購入。
抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体（ＭＩＢ－１）：Ｄａｋｏ社（デンマーク）から購入。
抗αＳＭＡモノクローナル抗体 Covance Research Products, Inc. (Princeton, New Jersey)から購入。
抗ＣＡＶ１モノクローナル抗体：Santa Cruz Biotechnology Inc.(米国、カリフォルニア州)から購入。
抗ＣＣＮＢモノクローナル抗体：Santa Cruz Biotechnology Inc.(米国、カリフォルニア州)から購入。
抗ＬＭＰ２／β１ｉモノクローナル抗体：Santa Cruz Biotechnology Inc.(米国、カリフォルニア州)から購入。
抗ＣＣＮＥモノクローナル抗体（ＣＣＮＥ１／２４６０）：Ａｂｃａｍ社(英国、ケンブリッジ)から購入。
抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体（ＭＩＢ－１）：Ｄａｋｏ社（デンマーク）から購入。
抗αＳＭＡモノクローナル抗体 Covance Research Products, Inc. (Princeton, New Jersey)から購入。
抗ＣＡＶ１モノクローナル抗体：Santa Cruz Biotechnology Inc.(米国、カリフォルニア州)から購入。
抗ＣＣＮＢモノクローナル抗体：Santa Cruz Biotechnology Inc.(米国、カリフォルニア州)から購入。
抗ＬＭＰ２／β１ｉモノクローナル抗体：Santa Cruz Biotechnology Inc.(米国、カリフォルニア州)から購入。
【0045】
リン酸緩衝液 (phosphate-buffered saline: PBS)により洗浄された組織切片を、二次抗体としてのビオチン化抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＤＫ－２６００Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）（Ｄａｋｏ社、デンマーク）と反応させた。洗浄後、次いで、発色酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジン複合体（Ｄａｋｏ社）と反応させた。反応物に発色基質として３、３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と対比染色であるヘマトキシリン（青）を反応させた。対比用に、同じ組織から取得した他の切片について、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色を実施した。
【0046】
検体中の正常子宮筋層部分を陽性対照とし、一次抗体に代えてウサギＩｇＧを使用した組織切片を陰性対象とした。各マーカーが検出された部分は茶色に着色され、各細胞の核は、ヘマトキシリン染色（Ｈ染色）で青色に染色された。
【0047】
染色後の組織は、デジタル顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（キーエンス社（大阪））でスキャンし、染色の強度を数値化した。
【0048】
（３）結果
表２に、組織の病理学的診断結果と、各マーカータンパク質の発現量の関係を示す。表中、「－」、「局所＋」、「－／＋」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」及び「ＮＡ」は、以下を意味する。なお、表中のこれらの表記は、対象となる組織全数の平均的な結果を示す。
－：陰性
局所＋：局所的に陽性、５％未満の細胞を染色
－／＋：部分的に陽性、５－１０％の細胞を染色
＋：５％以上、１０％未満の細胞を染色
＋＋：１０％以上、９０％未満の細胞を染色
＋＋＋：９０％以上の細胞を染色
ＮＡ：データなし
表２に、組織の病理学的診断結果と、各マーカータンパク質の発現量の関係を示す。表中、「－」、「局所＋」、「－／＋」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」及び「ＮＡ」は、以下を意味する。なお、表中のこれらの表記は、対象となる組織全数の平均的な結果を示す。
－：陰性
局所＋：局所的に陽性、５％未満の細胞を染色
－／＋：部分的に陽性、５－１０％の細胞を染色
＋：５％以上、１０％未満の細胞を染色
＋＋：１０％以上、９０％未満の細胞を染色
＋＋＋：９０％以上の細胞を染色
ＮＡ：データなし
【0049】
【表2】
【0050】
表２中、ＳＭＡ(smooth muscle actin）は、平滑筋細胞に対する特異的マーカーであり、子宮間葉性腫瘍の診断に重要である。しかし、ＳＭＡは正常子宮平滑筋細胞でも強く発現している。すなわち、子宮平滑筋細胞又は子宮平滑筋細胞由来の細胞を特定するために必須のマーカーである。
また表２の「子宮頸がん」の結果が示すように、高悪性度の子宮頸がんの摘出組織を用いたＩＨＣ染色の結果、Ｋｉ－６７の強発現が認められたが、サイクリンＥの発現は認められなかった。この結果は、サイクリンＥの強発現とＫｉ－６７の強発現は、子宮間葉性腫瘍の生命予後の不良を特異的に表現することを示している。
また表２の「子宮頸がん」の結果が示すように、高悪性度の子宮頸がんの摘出組織を用いたＩＨＣ染色の結果、Ｋｉ－６７の強発現が認められたが、サイクリンＥの発現は認められなかった。この結果は、サイクリンＥの強発現とＫｉ－６７の強発現は、子宮間葉性腫瘍の生命予後の不良を特異的に表現することを示している。
【0051】
図１は、ＬＭＳ患者（Ａ、Ｂ）、及びＳＴＵＭＰ患者（Ｃ、Ｄ）から、摘出した組織を、抗サイクリンＥモノクローナル抗体を用いたＩＨＣ染色法によって染色した結果を撮像した写真である。患者Ａ及びＣ由来の摘出組織では、サイクリンＥの発現を示す茶色の染色が強い染色像が示された。これらの患者は、組織採取後５年以内に死亡した。一方、患者Ｂ及びＤ由来の組織では、弱い茶色の染色像が示された。これらの患者は術後５年以上生存している。術後５年以内に死亡したＬＭＳの症例、又は術後５年以内に死亡したＳＴＵＭＰの症例、すなわち予後不良の症例では、腫瘍組織でサイクリンＥ発現量が高くなることが見いだされた。
【0052】
図２は、ＬＭＳ患者（Ａ、Ｂ）、及びＳＴＵＭＰ患者（Ｃ、Ｄ）から、摘出した組織を、抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体を用いてＩＨＣ染色法によって染色した結果を撮像した写真である。患者Ａ及びＣ由来の摘出組織では、Ｋｉ－６７の発現を示す茶色の染色が強い染色像が示された。これらの患者は、組織採取後５年以内に死亡した。一方、患者Ｂ及びＤ由来の組織では、弱い茶色の染色像が示された。これらの患者は術後５年以上生存している。術後５年以内に死亡したＬＭＳの症例、又は術後５年以内に死亡したＳＴＵＭＰの症例、すなわち予後不良の症例では、腫瘍組織でＫｉ－６７発現量が高くなることが見いだされた。
【0053】
図３は、後ろ向き研究で、予後観察が可能であったＬＭＳ ２６症例、ＳＴＵＭＰ １１症例を、それぞれ術後５年以内に死亡した群（Ｄ）、術後５年以上生存している群（Ｌ）に分けて、各症例由来の摘出組織を抗サイクリンＥ抗体、又は抗Ｋｉ－６７抗体を用いたＩＨＣ染色法した結果を、Ｍａｎｔｒａ ２（Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のＯｐａｌ解析ソフトを用いて数値化し、プロットしたグラフである。
【0054】
図３には、ＬＭＳのＤ群、Ｌ群、及びＳＴＵＭＰのＤ群、Ｌ群の染色強度の分布が示されている。ＬＭＳの症例においても、ＳＴＵＭＰの症例においても、生命予後の不良（術後５年以内亡くなられた）の患者で、摘出組織のサイクリンＥ（ＣＣＮＥ）発現量が有意に高いことが認められた（図３Ａ）。さらに、ＬＭＳの症例またはＳＴＵＭＰの症例からの摘出組織で、抗Ｋｉ－６７抗体を用いたＩＨＣ染色法が行われた結果についても同様の検討を行った。抗サイクリンＥ（ＣＣＮＥ)抗体を用いた染色像と同様に、ＬＭＳ症例及びＳＴＵＭＰ症例で、生命予後の不良の患者で、摘出組織のＫｉ－６７発現量が有意に高いことが認められた（図３Ｂ）。
【0055】
ＬＭＳを罹患した５４症例からの摘出組織におけるＫｉ－６７と抗サイクリンＥ（ＣＣＮＥ)の発現状況で、ＬＭＳの患者を２つの群（ａ群とｂ群）に組み入れた。
ａ群：Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況のいずれかが「＋」又は「＋＋」である群
ｂ群：Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況がいずれも「＋＋＋」である群
ａ群：Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況のいずれかが「＋」又は「＋＋」である群
ｂ群：Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況がいずれも「＋＋＋」である群
【0056】
図４に、各群についての生存曲線を示す。ａ群では、約半数の患者が術後１００ヶ月以上生存していることが認められた。一方、ｂ群では、全ての患者が術後２０ヶ月以内に悪性腫瘍の原因で死亡し、生命予後が著しく不良であった。ｂ群に該当する患者、すなわち、子宮平滑筋肉腫瘍(LMS)の患者からの摘出組織においてＫｉ－６７、ＣＣＮＥ発現量の高い患者は、著しく不良であることが判断できる。
【0057】
［実施例２］子宮平滑筋肉腫の患者から切除された肺臓器での転移巣と子宮体部内の原発腫瘍に対して行われた免疫組織化学染色法の結果
子宮平滑筋肉腫と診断されて、外科的治療法により腫瘍組織を摘出された後５年以内に、肺臓器に転移巣が認められた２症例（症例１、症例２）について、摘出された原発腫瘍及び肺臓器での転移巣を実施例１と同様の手法で組織染色した。
子宮平滑筋肉腫と診断されて、外科的治療法により腫瘍組織を摘出された後５年以内に、肺臓器に転移巣が認められた２症例（症例１、症例２）について、摘出された原発腫瘍及び肺臓器での転移巣を実施例１と同様の手法で組織染色した。
【0058】
図５に症例１の原発腫瘍及び肺臓器での転移巣の免疫組織化学染色法による結果の写真を示す。上段が原発腫瘍、下段が肺臓器での転移巣の写真である。また、左がＨＥ染色の結果、中央が抗サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)モノクローナル抗体による染色結果、右が抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体による染色結果を示した写真である。各写真の下段は上段の破線枠内の拡大図を示す。子宮平滑筋肉腫の患者から切除された肺臓器での転移巣と原発腫瘍に対して行われた免疫組織化学染色法の結果より、原発腫瘍において、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)、Ｋｉ－６７の高い発現が認められた。肺臓器での転移巣では、原発腫瘍と同様な免疫組織化学染色の結果を示すことが確認された。ことから、したがって、当該肺臓器での転移巣の免疫組織化学染色法の結果より、原発腫瘍の有する悪性度は、転移巣での腫瘍細胞においても認められた。
【0059】
図６に、症例２の原発腫瘍及び肺臓器での転移巣を用いて行われた免疫組織化学染色法の結果の写真が示されている。上段が原発腫瘍、下段が肺臓器での転移巣の写真である。また、左がＨＥ染色の結果、中央が抗サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)抗体による染色結果、右が抗Ｋｉ－６７抗体による染色結果を示した写真である。各写真の下段は上段の破線枠内の拡大図を示す。症例１と同様に、肺臓器での転移巣において、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)、Ｋｉ－６７の高い発現が認められた。肺臓器での転移巣において、原発腫瘍と同様な免疫組織化学染色の結果を示すことが確認された。したがって、当該肺臓器での転移巣の免疫組織化学染色法の結果より、原発腫瘍の有する悪性度は、転移巣での腫瘍細胞においても認められた。
【0060】
上記２症例の結果より、肺臓器での転移巣の免疫組織化学染色法の結果より、原発腫瘍の有する悪性度は、転移巣での腫瘍細胞においても認められた。腫瘍組織でのサイクリンＥ(ＣＣＮＥ)、Ｋｉ－６７の高い場合、発現他臓器転移を生じるなど、予後不良となるリスクが高いことが示唆された。
【0061】
［実施例３］組織検体とＣＴガイド下生検検体との結果比較
子宮平滑筋肉腫(ＬＭＳ)が疑われる子宮間葉性腫瘍の患者２０例について、術前にＣＴガイド下で採取したバイオプシー生検と、外科的治療法により摘出した組織について、それぞれ実施例１と同様に免疫組織化学(ＩＨＣ)染色法によりサイクリンＥ(ＣＣＮＥ)及びＫｉ－６７の発現レベルを検討した。外科的治療法により摘出された組織あるいはバイオプシー生検を用いて行われた免疫組織化学(ＩＨＣ)染色法の結果より、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)及びＫｉ－６７の発現が、数的高値を示した場合、生命予後が不良と判断する。臨床研究の後ろ向き研究で、既に、外科的治療法により摘出された組織を用いた外科病理診断とカルテのデータベースで生命予後が明らかとされている子宮平滑筋肉腫２０例について、各症例から得られたバイオプシー生検を用いた免疫組織化（ＩＨＣ）学染色法によって、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)、及びＫｉ－６７の発現による生命予後について検証を行った。その検討結果が、表３に示されている。表３に示す通り、２０例中１９例の予後予測結果が一致（正診率９５％）した。これにより、ＣＴガイド下で採取されたバイオプシー生検を用いた免疫組織化（ＩＨＣ）学染色法によって、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)、及びＫｉ－６７の発現状況による生命予後の予測の可能性が示された。
子宮平滑筋肉腫(ＬＭＳ)が疑われる子宮間葉性腫瘍の患者２０例について、術前にＣＴガイド下で採取したバイオプシー生検と、外科的治療法により摘出した組織について、それぞれ実施例１と同様に免疫組織化学(ＩＨＣ)染色法によりサイクリンＥ(ＣＣＮＥ)及びＫｉ－６７の発現レベルを検討した。外科的治療法により摘出された組織あるいはバイオプシー生検を用いて行われた免疫組織化学(ＩＨＣ)染色法の結果より、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)及びＫｉ－６７の発現が、数的高値を示した場合、生命予後が不良と判断する。臨床研究の後ろ向き研究で、既に、外科的治療法により摘出された組織を用いた外科病理診断とカルテのデータベースで生命予後が明らかとされている子宮平滑筋肉腫２０例について、各症例から得られたバイオプシー生検を用いた免疫組織化（ＩＨＣ）学染色法によって、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)、及びＫｉ－６７の発現による生命予後について検証を行った。その検討結果が、表３に示されている。表３に示す通り、２０例中１９例の予後予測結果が一致（正診率９５％）した。これにより、ＣＴガイド下で採取されたバイオプシー生検を用いた免疫組織化（ＩＨＣ）学染色法によって、サイクリンＥ(ＣＣＮＥ)、及びＫｉ－６７の発現状況による生命予後の予測の可能性が示された。
【0062】
【表3】
【0063】
[実施例４]術前のバイオプシー生検及び外科的治療法摘出組織のＩＨＣ染色
悪性の子宮間葉性腫瘍の発症が疑われるＬＭＳ患者、及びＳＴＵＭＰ患者より、術前で、ＣＴガイド下により採取したバイオプシー生検(腫瘍組織)、並びに外科的治療法により摘出した腫瘍組織を用いて、免疫組織化学(ＩＨＣ)染色法を行った。免疫組織化学(ＩＨＣ)染色は、実施例１に記載の方法により行った。
悪性の子宮間葉性腫瘍の発症が疑われるＬＭＳ患者、及びＳＴＵＭＰ患者より、術前で、ＣＴガイド下により採取したバイオプシー生検(腫瘍組織)、並びに外科的治療法により摘出した腫瘍組織を用いて、免疫組織化学(ＩＨＣ)染色法を行った。免疫組織化学(ＩＨＣ)染色は、実施例１に記載の方法により行った。
【0064】
図７に、一次抗体として抗サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）モノクローナル抗体を用いてＩＨＣ染色を行って、その結果を撮像した写真が示されている。図８に、一次抗体としてＫｉ－６７モノクローナル抗体（クローン名：ＭＩＢ－１）を用いてＩＨＣ染色を行って、その結果を撮像した写真が示されている。
図７及び８には、対物レンズの倍率として×１０、×４０及び×１００で撮像された写真を示す。
図７及び８には、対物レンズの倍率として×１０、×４０及び×１００で撮像された写真を示す。
【0065】
図７及び図８に示すように、一次抗体として、抗サイクリンＥ（ＣＣＮＥ）モノクローナル抗体又は抗Ｋｉ－６７モノクローナル抗体（クローン名：ＭＩＢ－１）を用いた場合のバイオプシー生検と摘出組織のＩＨＣ染色像を比較すると、摘出組織のＩＨＣ染色像だけではなく、バイオプシー生検のＩＨＣ染色像も、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の強い発現、つまり、茶色の染色が強く、ロゼット様の染色像を示すという同じ結果が得られた。図７及び図８において、×１００で撮像された写真中の実線の枠で囲んだ部分がロゼット様の染色像である。摘出組織のＩＨＣ染色像がロゼット様の染色像を示すことは、腫瘍が悪性腫瘍であることを示す。
【0066】
術前でのバイオプシー生検のＩＨＣ染色像もロゼット様の染色像を示したことは、術前でのバイオプシー生検により子宮間葉性腫瘍の悪性、良性の診断が可能になり、さらに生命予後を予測し得ることを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値に基づいて子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良か良好かを判定する、子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する方法。
【請求項2】
術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値を予め設定したカットオフ値と比較し、サイクリンＥ又はＫｉ－６７がカットオフ以下の場合に、生命予後良好と判定し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の両方の発現量がカットオフ値を超える場合に、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定する、請求項１に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する方法。
【請求項3】
術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値に基づいて発現状況を下の表に示す「－」、「局所＋」、「－／＋」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」又は「ＮＡ」と分け、Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況がいずれも「＋＋＋」である場合に、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定する、請求項１に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する方法。
【請求項4】
前記子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、脂肪性平滑筋肉腫、脂肪性子宮平滑筋腫、静脈内平滑筋腫症、良性転移性平滑筋腫、核異型を伴う子宮平滑筋腫（子宮平滑筋腫 with Bizarre Nuclei）及びＳＴＵＭＰからなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項6】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、ＳＴＵＭＰである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
生命予後の予測が、５年生存の可能性予測、又は、５年以内の再発・転移の可能性予測を指す、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記生検が、ＣＴガイド下で採取されたバイオプシー生検である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値に基づいて子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定するための、子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【請求項10】
サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値を予め設定したカットオフ値と比較し、サイクリンＥ又はＫｉ－６７がカットオフ以下の場合に、生命予後良好と判定し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の両方の発現量がカットオフ値を超える場合に、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定するための、請求項９に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【請求項11】
サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値に基づいて発現状況を下の表に示す「－」、「局所＋」、「－／＋」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」又は「ＮＡ」と分け、Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況がいずれも「＋＋＋」である場合に、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定するための、請求項９に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【請求項12】
前記子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍である、請求項９～１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項13】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、脂肪性平滑筋肉腫、脂肪性子宮平滑筋腫、静脈内平滑筋腫症、良性転移性平滑筋腫、核異型を伴う子宮平滑筋腫（子宮平滑筋腫 with Bizarre Nuclei）及びＳＴＵＭＰからなる群から選択される請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、ＳＴＵＭＰである、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
生命予後の予測が、５年生存の可能性予測、又は、５年以内の再発・転移の可能性予測を指す、請求項９～１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項16】
前記生検が、ＣＴガイド下で採取されたバイオプシー生検である、請求項９～１１のいずれか１項に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】2024-06-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、当該数値に基づいて子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する方法であって、前記数値は子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良か良好かを示す、方法。
【請求項2】
術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値を予め設定したカットオフ値と比較し、サイクリンＥ又はＫｉ－６７がカットオフ以下であることは、生命予後良好であることを示し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の両方の発現量がカットオフ値を超えることは、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であることを示す、請求項１に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する方法。
【請求項3】
術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値に基づいて発現状況を下の表に示す「－」、「局所＋」、「－／＋」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」又は「ＮＡ」と分け、Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況がいずれも「＋＋＋」であることは、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であることを示す、請求項１に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後の予測を補助する方法。
【請求項4】
前記子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、脂肪性平滑筋肉腫、脂肪性子宮平滑筋腫、静脈内平滑筋腫症、良性転移性平滑筋腫、核異型を伴う子宮平滑筋腫（子宮平滑筋腫 with Bizarre Nuclei）及びＳＴＵＭＰからなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項6】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、ＳＴＵＭＰである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
生命予後の予測が、５年生存の可能性予測、又は、５年以内の再発・転移の可能性予測を指す、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記生検が、ＣＴガイド下で採取されたバイオプシー生検である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値に基づいて子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定するための、子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【請求項10】
サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値を予め設定したカットオフ値と比較し、サイクリンＥ又はＫｉ－６７がカットオフ以下の場合に、生命予後良好と判定し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の両方の発現量がカットオフ値を超える場合に、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定するための、請求項９に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【請求項11】
サイクリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合するモノクローナル抗体を少なくとも含む、術前で、病理学的診断により子宮間葉性腫瘍に罹患したと診断された対象から採取した子宮平滑筋組織のバイオプシー生検又は細胞について、サイクリンＥに特異的に結合する抗体及びＫｉ－６７に特異的に結合する抗体を使用する免疫組織化学染色により染色し、サイクリンＥ及びＫｉ－６７の発現量を数値化し、数値に基づいて発現状況を下の表に示す「－」、「局所＋」、「－／＋」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」又は「ＮＡ」と分け、Ｋｉ－６７とＣＣＮＥの発現状況がいずれも「＋＋＋」である場合に、子宮間葉性腫瘍の生命予後が不良であると判定するための、請求項９に記載の子宮間葉性腫瘍の生命予後を予測するためのキット。
【請求項12】
前記子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍である、請求項９～１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項13】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、脂肪性平滑筋肉腫、脂肪性子宮平滑筋腫、静脈内平滑筋腫症、良性転移性平滑筋腫、核異型を伴う子宮平滑筋腫（子宮平滑筋腫 with Bizarre Nuclei）及びＳＴＵＭＰからなる群から選択される請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
子宮平滑筋肉腫以外の子宮間葉性腫瘍が、ＳＴＵＭＰである、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
生命予後の予測が、５年生存の可能性予測、又は、５年以内の再発・転移の可能性予測を指す、請求項９～１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項16】
前記生検が、ＣＴガイド下で採取されたバイオプシー生検である、請求項９～１１のいずれか１項に記載のキット。