(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024110983
(43)【公開日】2024-08-16
(54)【発明の名称】細胞外小胞の回収方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240808BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240808BHJP
G01N 1/10 20060101ALI20240808BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20240808BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240808BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240808BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240808BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240808BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20240808BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071 ZNA
C12Q1/686 Z
G01N1/10 F
G01N1/10 H
G01N33/48 A
G01N33/50 Z
G01N33/53 S
G01N33/68
G01N33/50 P
C12N5/071
C12N15/09 Z
C07K16/28
C12Q1/6851 Z
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024090514
(22)【出願日】2024-06-04
(62)【分割の表示】P 2020553220の分割
【原出願日】2019-10-16
(31)【優先権主張番号】P 2018195926
(32)【優先日】2018-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2019015177
(32)【優先日】2019-01-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】517448489
【氏名又は名称】合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】川▲崎▼ 佑季
(72)【発明者】
【氏名】栗本 綾子
(72)【発明者】
【氏名】犬塚 達俊
(57)【要約】
【課題】細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を回収する新規方法。
【解決手段】ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
【選択図】なし
【解決手段】ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
【請求項2】
ポリマーが、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ポリマーが、セルロース誘導体またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ポリマーが、少なくとも１つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体、または少なくとも１つの水素原子がラクタムで置換されたポリビニル誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ポリマーが、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する際のポリマーの濃度が、０．０１～１０．００重量％である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
細胞外小胞が、エクソソームである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
細胞外小胞膜結合物質がＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７に対する抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または唾液である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
【請求項15】
キレート剤の細胞外小胞含有試料への添加をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
分離された細胞外小胞中のタンパク質または核酸が分析される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
ポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
【請求項18】
キレート剤をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞外小胞の回収方法などに関する。
【背景技術】
【0002】
細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶ）は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中あるいは細胞培養液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｌｅｂ）が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含む多様な集団であることから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の回収方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、キレート剤を用いた細胞外小胞の回収方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０１８／０７０４７９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
細胞外小胞含有試料から高効率で細胞外小胞を回収することができれば、診断、創薬等の応用に有望である。細胞外小胞は主に、細胞外小胞マーカーに対する抗体を用いる免疫沈降法、または超遠心法により回収されている。しかし、このような方法では、細胞外小胞は必ずしも高効率で回収されず、また、回収された細胞外小胞は非特異的に濃縮されるため品質にばらつきを有する。
【0005】
したがって、本発明の目的は、細胞外小胞を回収できる新規方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、鋭意検討した結果、所定のポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することにより、細胞外小胞を高効率で回収できること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
〔２〕ポリマーが、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有する、〔１〕の方法。
〔３〕ポリマーが、セルロース誘導体またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕ポリマーが、少なくとも１つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体、または少なくとも１つの水素原子がラクタムで置換されたポリビニル誘導体である、〔３〕の方法。
〔５〕ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンである、〔４〕の方法。
〔６〕ポリマーが、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する際のポリマーの濃度が、０．０１～１０．００重量％である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕細胞外小胞が、エクソソームである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕前記分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、〔１０〕の方法。
〔１２〕細胞外小胞膜結合物質がＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７に対する抗体である、〔１１〕の方法。
〔１３〕細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または唾液である、〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
〔１５〕キレート剤の細胞外小胞含有試料への添加をさらに含む、〔１４〕の方法。
〔１６〕分離された細胞外小胞中のタンパク質または核酸が分析される、〔１４〕または〔１５〕の方法。
〔１７〕ポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
〔１８〕キレート剤をさらに含む、〔１７〕のキット。
〔１〕ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することを含む、細胞外小胞の回収方法。
〔２〕ポリマーが、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有する、〔１〕の方法。
〔３〕ポリマーが、セルロース誘導体またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕ポリマーが、少なくとも１つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体、または少なくとも１つの水素原子がラクタムで置換されたポリビニル誘導体である、〔３〕の方法。
〔５〕ポリマーが、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンである、〔４〕の方法。
〔６〕ポリマーが、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する際のポリマーの濃度が、０．０１～１０．００重量％である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕細胞外小胞が、エクソソームである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕前記分離が、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または細胞外小胞含有試料の超遠心法により行われる、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕細胞外小胞膜結合物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、〔１０〕の方法。
〔１２〕細胞外小胞膜結合物質がＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７に対する抗体である、〔１１〕の方法。
〔１３〕細胞外小胞含有試料が血液試料、尿、または唾液である、〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕以下を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
〔１５〕キレート剤の細胞外小胞含有試料への添加をさらに含む、〔１４〕の方法。
〔１６〕分離された細胞外小胞中のタンパク質または核酸が分析される、〔１４〕または〔１５〕の方法。
〔１７〕ポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含む、キット。
〔１８〕キレート剤をさらに含む、〔１７〕のキット。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、所定のポリマーを用いることにより、より高効率かつより高純度で、細胞外小胞の回収が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、実施例１における、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、または各濃度の各種ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図2】図２は、実施例２における、ＰＢＳ、または各濃度のＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を４℃で一晩もしくは３７℃で１時間抗ＣＤ９抗体と免疫沈降させて得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図3】図３は、実施例３における、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのナノ粒子トラッキング解析による粒子数測定結果を示す図である。
【図4】図４は、実施例４における、血清、および５種類の抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、ＡＣＤ（酸－クエン酸－デキストロース、ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース、ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿を、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図5A】図５Ａは、実施例５における、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した血清検体の抗テトラスパニン膜タンパク質抗体（抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体）による免疫沈降法で得られたサンプルの抗テトラスパニン膜タンパク質抗体（抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体）によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図5B】図５Ｂは、実施例５における、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した血清検体の抗ＣＤ１４７抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図6】図６は、実施例６における、体液（尿および唾液、それぞれ、２個のサンプル。「＃１」および「＃２」として表わす。）を、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図7A】図７Ａは、実施例７における、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＥＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図7B】図７Ｂは、実施例７における、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＰＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図7C】図７Ｃは、実施例７における、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＰＭＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図8】図８は、実施例８における、ＰＢＳ、または各濃度の各種ＰＶＰ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図9A】図９Ａは、実施例９における、ＰＢＳまたはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ９抗体と免疫沈降させて得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図9B】図９Ｂは、実施例９における、ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ６３抗体と免疫沈降させて得られたサンプルの抗ＣＤ６３抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、細胞外小胞の回収方法を提供する。
【0011】
細胞外小胞は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～３００ｎｍ、より好ましくは８０～２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。
【0012】
本発明の回収方法は、以下の工程を含む：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること。
【0013】
細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞を含有する任意の試料である。好ましくは、細胞外小胞含有試料は、生物学的な液体試料である。細胞外小胞含有試料は、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
【0014】
一実施形態では、細胞外小胞含有試料は、培養上清である。培養上清は、細胞培養上清であっても組織培養上清であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ等の家畜；およびウマ、ヒツジ等の使役動物）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物（例、細菌類）、植物、および魚類が挙げられる。好ましくは、生物は、ヒト等の哺乳動物である。
【0015】
別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、体液である。体液は、上述したような生物に由来する体液である。体液としては、例えば、血液試料（例、全血、血清および血漿）、尿、唾液、リンパ液、組織液、脳脊髄液、腹水、汗、精液、涙液、粘液、乳汁、胸腔液、気管支肺胞洗浄液および羊水が挙げられる。好ましくは、体液は、血液試料、尿、または唾液である。血漿としては、例えば、ヘパリン血漿、クエン酸血漿、フッ化ナトリウム血漿、ＡＣＤ（ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）またはＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿が挙げられる。一般に、細胞外小胞の回収は、培養上清に比し、培養上清よりも多量のタンパク質（例、アルブミン、リゾチーム、ラクトフェリン、ヒスタチン、ペルオキシダーゼ、アグルチニン、ディフェンシン、免疫グロブリン）が混在している体液（例、血液、尿、唾液）において困難である。一方、本発明の方法によれば、細胞外小胞含有試料からの細胞外小胞の回収量が増加し、このような体液からであっても細胞外小胞を高効率かつ高純度で回収することができる。
【0016】
本発明で用いられるポリマーは、水溶性ポリマーであることが好ましい。「水溶性ポリマー」とは、４～８０℃（好ましくは、４～３７℃）での水に対する溶解度が０．０１重量％以上のポリマーをいう。水溶性ポリマーの４～８０℃（好ましくは、４～３７℃）での水に対する溶解度は、好ましくは０．０５重量％以上、より好ましくは０．１重量％以上であってもよい。
【0017】
ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有していてもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、さらにより好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以上、なおさらにより好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以上、特に好ましくは３５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは３００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下、なおさらにより好ましくは５０００ｍＰａ・ｓ以下、特に好ましくは１０００ｍＰａ・ｓ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５～３００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは１０～２００００ｍＰａ・ｓ、さらにより好ましくは２０～１００００ｍＰａ・ｓ、なおさらにより好ましくは３０～５０００ｍＰａ・ｓ、特に好ましくは３５～１０００ｍＰａ・ｓであってもよい。
【0018】
ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にポリマーを２重量％になるように溶解したＰＢＳ溶液中の３０℃における粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有していてもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、さらにより好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以上、なおさらにより好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以上、特に好ましくは３５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは３００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下、なおさらにより好ましくは５０００ｍＰａ・ｓ以下、特に好ましくは１０００ｍＰａ・ｓ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５～３００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは１０～２００００ｍＰａ・ｓ、さらにより好ましくは２０～１００００ｍＰａ・ｓ、なおさらにより好ましくは３０～５０００ｍＰａ・ｓ、特に好ましくは３５～１０００ｍＰａ・ｓであってもよい。
【0019】
ポリマーの粘度は、例えば、液体試料を回転体によって回転させた際にロータの外周に発生した液の粘度摩擦トルクを検出する方法（回転粘度計を用いる方法）、または試料が満たされた測定管内を、落下錘を自由落下させ、その落下時間を計測する方法（落球粘度計を用いる方法）により測定することができる。また、ポリマーの粘度は、例えば、液体試料中に振動体（粘度センサ）を入れて振動させると、センサの振動振幅は、液体粘度が大きくなるにしたがってその粘性抵抗により抑制され、低下するが、この抑制される力に打ち勝ち、定振幅を維持するように振動子駆動電流を増加させ、この時の入力電流量を測定する方法（振動粘度計を用いる方法）により測定することができる。
ポリマーの粘度は、例えば、粘性解析装置（例、レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００、ヤマト科学社）を用いて測定することができる。
ポリマーの粘度は、例えば、粘性解析装置（例、レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００、ヤマト科学社）を用いて測定することができる。
【0020】
ポリマーは、例えば、セルロース誘導体、親水性基を有するポリビニル誘導体、ポリエーテル化合物であってもよい。
【0021】
セルロース誘導体とは、セルロースの少なくとも１つの水酸基の水素原子が親水性基で置換されたセルロース誘導体である。セルロース誘導体における親水性基としては、例えば、カルボキシアルキル（例、カルボキシＣ１～６アルキル）、ヒドロキシアルキル（例、ヒドロキシＣ１～６アルキル）が挙げられる。セルロース誘導体における親水性基は、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルが好ましい。
カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル（１－カルボキシエチル、２－カルボキシエチル）、カルボキシプロピル（１－カルボキシプロピル、２－カルボキシプロピル、３－カルボキシプロピル）、カルボキシイソプロピル（１－カルボキシ－２－メチルエチル、２－カルボキシ－２－メチルエチル）、カルボキシブチル（１－カルボキシブチル、２－カルボキシブチル、３－カルボキシブチル、４－カルボキシブチル）、カルボキシｔ－ブチル、カルボキシペンチル（１－カルボキシペンチル、２－カルボキシペンチル、３－カルボキシペンチル、４－カルボキシペンチル、５－カルボキシペンチル）、カルボキシヘキシル（１－カルボキシヘキシル、２－カルボキシヘキシル、３－カルボキシヘキシル、４－カルボキシヘキシル、５－カルボキシヘキシル、６－カルボキシヘキシル）が挙げられる。
ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル（１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル）、ヒドロキシプロピル（１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル）、ヒドロキシイソプロピル（１－ヒドロキシ－２－メチルエチル、２－ヒドロキシ－２－メチルエチル）、ヒドロキシブチル（１－ヒドロキシブチル、２－ヒドロキシブチル、３－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル）、ヒドロキシｔ－ブチル、ヒドロキシペンチル（１－ヒドロキシペンチル、２－ヒドロキシペンチル、３－ヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル）、ヒドロキシヘキシル（１－ヒドロキシヘキシル、２－ヒドロキシヘキシル、３－ヒドロキシヘキシル、４－ヒドロキシヘキシル、５－ヒドロキシヘキシル、６－ヒドロキシヘキシル）が挙げられる。
セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が挙げられる。
セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル（１－カルボキシエチル、２－カルボキシエチル）、カルボキシプロピル（１－カルボキシプロピル、２－カルボキシプロピル、３－カルボキシプロピル）、カルボキシイソプロピル（１－カルボキシ－２－メチルエチル、２－カルボキシ－２－メチルエチル）、カルボキシブチル（１－カルボキシブチル、２－カルボキシブチル、３－カルボキシブチル、４－カルボキシブチル）、カルボキシｔ－ブチル、カルボキシペンチル（１－カルボキシペンチル、２－カルボキシペンチル、３－カルボキシペンチル、４－カルボキシペンチル、５－カルボキシペンチル）、カルボキシヘキシル（１－カルボキシヘキシル、２－カルボキシヘキシル、３－カルボキシヘキシル、４－カルボキシヘキシル、５－カルボキシヘキシル、６－カルボキシヘキシル）が挙げられる。
ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル（１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル）、ヒドロキシプロピル（１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル）、ヒドロキシイソプロピル（１－ヒドロキシ－２－メチルエチル、２－ヒドロキシ－２－メチルエチル）、ヒドロキシブチル（１－ヒドロキシブチル、２－ヒドロキシブチル、３－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル）、ヒドロキシｔ－ブチル、ヒドロキシペンチル（１－ヒドロキシペンチル、２－ヒドロキシペンチル、３－ヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル）、ヒドロキシヘキシル（１－ヒドロキシヘキシル、２－ヒドロキシヘキシル、３－ヒドロキシヘキシル、４－ヒドロキシヘキシル、５－ヒドロキシヘキシル、６－ヒドロキシヘキシル）が挙げられる。
セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が挙げられる。
セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
【0022】
親水性基を有するポリビニル誘導体とは、少なくとも１つの水素原子が親水性基で置換されたポリビニル誘導体であり、メチレン単位中の１個の水素原子が親水性基で置換されたポリビニル誘導体が好ましい。ポリビニル誘導体の親水性基としては、例えば、カルボニル含有親水性基、カルボキシ含有親水性基、含窒素親水性基、環（炭素環または複素環）含有親水性基が挙げられる。ポリビニル誘導体の親水性基は、カルボニル含有親水性基、含窒素親水性基、または複素環含有親水性基が好ましく、ラクタム（例、α－ラクタム、β－ラクタム、γ－ラクタム、δ－ラクタム、ε－ラクタム）がより好ましい。親水性基を有するポリビニル誘導体の具体例としては、ポリビニルピロリドンが挙げられる。
【0023】
ポリエーテル化合物とは、反復単位の主鎖にエーテル構造を含むポリマーである。ポリエーテル化合物としては、例えば、ポリアルキレンオキシ化合物（例、ポリＣ１～６アルキレンオキシ化合物）が挙げられる。ポリアルキレンオキシ化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールが挙げられる。ポリアルキレンオキシ化合物は、ポリエチレングリコールが好ましい。
【0024】
ナノセルロースとは、ナノメートルオーダーの繊維幅を有する繊維状セルロースである。ナノセルロースの繊維幅は、例えば５００ｎｍ以下であり、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下、なおさらにより好ましくは１０ｎｍ以下、特により好ましくは５ｎｍ以下であってもよい。
【0025】
セルロース誘導体、親水性基を有するポリビニル誘導体、およびポリエーテル化合物には、それらの塩も含まれる。塩としては、例えば、金属（例、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、およびセシウム等の一価の金属、ならびにカルシウム、マグネシウム、および亜鉛等の二価の金属）の塩、ならびに無機塩基（例、アンモニア）の塩が挙げられる。
【0026】
ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有してもよい。ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは１２ｋＤａ以上、より好ましくは１４ｋＤａ以上、さらにより好ましくは１６ｋＤａ以上、なおさらにより好ましくは１８ｋＤａ以上、特に好ましくは２０ｋＤａ以上であってもよい。ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは５０００ｋＤａ以下、より好ましくは３０００ｋＤａ以下、さらにより好ましくは２０００ｋＤａ以下、なおさらにより好ましくは１０００ｋＤａ以下、特に好ましくは５００ｋＤａ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは１２～５０００ｋＤａ、より好ましくは１４～３０００ｋＤａ、さらにより好ましくは１６～２０００ｋＤａ、なおさらにより好ましくは１８～１０００ｋＤａ、特に好ましくは２０～５００ｋＤａであってもよい。
【0027】
細胞外小胞の分離工程におけるポリマーの濃度は、ポリマーを含まない場合に比べて細胞外小胞を高効率で回収でき、かつ分離工程で用いられる溶液中にポリマーが溶解できる濃度である限り特に限定されない。このような濃度は、ポリマーの種類によっても異なるが、例えば０．０１～１０．００重量％、好ましくは０．０５～７．５０重量％、より好ましくは０．１０～５．００重量％であってもよい。
【0028】
細胞外小胞の分離工程において、細胞外小胞は、細胞外小胞含有試料から液相中で分離される。すなわち、細胞外小胞は、ポリマーと共沈しない状態で、後述する分離手法により、細胞外小胞含有試料から分離される。したがって、本発明における分離工程は、共沈性ポリマーを用いた共沈法による分離（例、ポリエチレングリコール沈殿）とは異なる。したがって、本発明で用いるポリマーは、非共沈性ポリマーであることが好ましい。
【0029】
本発明の回収方法において、ポリマーは、分離工程に存在すればよいので、本発明の回収方法は、細胞外小胞含有試料とポリマーを合わせることを含んでもよい。例えば、細胞外小胞含有試料とポリマーを合わせた後に、当該細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離してもよい。また、例えば、後述する細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法を用いる場合、細胞外小胞膜結合物質を含む溶液に予めポリマーを添加しておき、これに細胞外小胞含有試料を添加してもよい。
【0030】
本発明の回収方法は、細胞外小胞含有試料とキレート剤を合わせることをさらに含んでもよい。この場合、本発明の回収方法において、ポリマーおよびキレート剤の存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すればよいので、例えば、細胞外小胞含有試料にポリマーおよびキレート剤を同時に添加してもよいし、細胞外小胞含有試料にポリマーを添加した後にキレート剤を添加してもよいし、細胞外小胞含有試料にキレート剤を添加した後にポリマーを添加してもよい。また、例えば、後述する細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法を用いる場合、細胞外小胞膜結合物質を含む溶液に予めポリマーおよびキレート剤を添加しておき、これに細胞外小胞含有試料を添加してもよい。
【0031】
キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上（例、３個または６個）である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子又はリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
【0032】
キレート剤としては、例えば、シュウ酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、並びにそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。本発明では、２種以上（例、２種、３種、４種、５種）のキレート剤の混合物を細胞外小胞含有試料の分離に用いてもよい。
【0033】
キレート剤は、恐らくは細胞外小胞への夾雑物の吸着を抑制することにより、細胞外小胞の高純度での回収に効果を示す（国際公開第２０１８／０７０４７９号）。したがって、ポリマーおよびキレート剤の存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することにより、細胞外小胞の回収効率向上に相乗効果を与える。上述のキレート剤はいずれも細胞外小胞の高純度での回収に効果を示すので、ポリマーとの併用により同質の相乗効果を与える。
【0034】
細胞外小胞の分離工程におけるキレート剤の濃度は、細胞外小胞への夾雑物の吸着を抑制でき、かつ分離工程で用いられる溶液中にキレート剤が溶解できる濃度である限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類によっても異なるが、例えば、１ｍＭ～２００ｍＭである。好ましくは、キレート剤の濃度は、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類によっても異なるが、２００ｍＭ以下、１８０ｍＭ以下、１６０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。
【0035】
ポリマーの存在下での、細胞外小胞含有試料からの細胞外小胞の分離（工程（１））は、例えば、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法、または超遠心法により行うことができる。細胞外小胞膜結合物質を用いた分離は、分析方法（例、後述するイムノアッセイ）の過程において行われてもよい。細胞外小胞膜結合物質を用いて細胞外小胞を分離する場合、細胞外小胞膜結合物質を細胞外小胞含有試料と混合することで、細胞外小胞膜結合物質を細胞外小胞に結合させ、次いで細胞外小胞膜結合物質が結合した細胞外小胞を、試料から分離することにより、細胞外小胞を回収することができる。また、細胞外小胞の分離を超遠心法により行う場合、超遠心法により細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を沈殿させ、次いで、上清を廃棄することにより、細胞外小胞を回収することができる。さらに、細胞外小胞の分離を分析方法の過程において行う場合、分析方法（例、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイ）における溶液の除去または固相の洗浄に伴い、細胞外小胞を分離することができる。具体的には、イムノアッセイにおいて、細胞外小胞の抗体との結合および細胞外小胞含有試料を含む溶液の除去および／または固相の洗浄に伴い、細胞外小胞を分離することができる。分離は、好ましくは、単離または精製である。したがって、本発明の回収方法はまた、単離または精製方法として利用することができる。
【0036】
本発明の回収方法において用いられる細胞外小胞膜結合物質は、細胞外小胞マーカーに親和性を有する物質である。細胞外小胞マーカーとしては、例えば、テトラスパニン膜タンパク質（細胞外小胞膜特異的４回貫通膜タンパク質、例、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ＡＬＩＸ、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－Ｉ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｒａｂタンパク質、ＥｐＣＡＭなどが挙げられる。細胞外小胞マーカーは、好ましくはテトラスパニン膜タンパク質、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質である。また細胞外小胞マーカーは、好ましくはＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７である。細胞外小胞膜結合物質としては、例えば、抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその抗原結合性断片、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。抗原結合性断片は、対象とする細胞外小胞マーカーに対する結合性を維持している抗体断片であればよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。細胞外小胞膜結合物質は、好ましくは抗体またはその抗原結合性断片であり、より好ましくはモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。また、細胞外小胞を回収する際に用いられる細胞外小胞膜結合物質は、一つでも複数を組み合わせてもよい。
【0037】
細胞外小胞膜結合物質は、細胞外小胞の分離を容易にするための固相と結合していてもよい。固相としては、例えば、セファロースビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、またはプラスチックプレートを用いることができる。固相への細胞外小胞膜結合物質の固定化は当業者に周知の常法によって行うことができる。
【0038】
本発明の回収方法において、細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法により細胞外小胞を回収する場合、ポリマーは、少なくとも細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料とを混合する際に、存在していればよい。例えば、磁性ビーズを用いる場合、ポリマーの存在下で、磁性ビーズに結合した細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料を混合することにより、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞とを結合させ、磁性ビーズを永久磁石または電磁石などを用いて集磁し、次いで、磁性ビーズに結合しなかった成分を含む上清を廃棄することにより、磁性ビーズに結合した細胞外小胞を細胞外小胞含有試料から分離することができる。磁性ビーズを集磁する方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。また、例えば、セファロースビーズまたはアガロースビーズを用いる場合、ポリマーの存在下で、これらビーズに結合した細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料を混合することにより、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞とを結合させ、遠心分離により、ビーズを沈殿させ、ビーズに結合しなかった成分を含む上清を廃棄することにより、ビーズに結合した細胞外小胞を細胞外小胞含有試料から分離することができる。ビーズを遠心分離により沈殿させる方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。
【0039】
細胞外小胞膜結合物質を用いた分離法により、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離する場合、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料を混合する温度は、細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞含有試料との混合物が液体で存在する温度であればいかなる温度であってもよく、０～１００℃であってもよい。このような温度は、例えば４℃以上であり、好ましくは１５℃以上、より好ましくは３５℃以上、さらに好ましくは４０℃以上であってもよい。このような温度はまた、例えば８０℃以下であり、好ましくは７０℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下であってもよい。より具体的には、このような温度は、例えば４～８０℃であり、好ましくは１５～７０℃、より好ましくは３５～６０℃、さらに好ましくは４０～５０℃であってもよい。細胞外小胞膜結合物質と細胞外小胞を結合させる時間は、細胞外小胞膜結合物質が細胞外小胞に結合するために十分な時間である限り特に限定されず、例えば、１分以上、５分以上、１０分以上、または２０分以上であってもよい。このような時間はまた、２４時間以下、１８時間以下、８時間以下、４時間以下、２時間以下、または１時間以下であってもよい。
【0040】
本発明の回収方法において、超遠心法により細胞外小胞を回収する場合、ポリマーは、細胞外小胞含有試料が超遠心分離に供される際に存在すればよく、例えば、超遠心分離を複数回行う場合は、少なくとも１回の超遠心分離をポリマーの存在下で行えばよい。超遠心分離は、超遠心機を使用して行うことができる。超遠心分離で印加される重力は、例えば、１０，０００×ｇ～２００，０００×ｇであり、好ましくは、７０，０００×ｇ～１５０，０００×ｇであってもよい。超遠心分離の時間は、例えば、０．５～２４時間であり、好ましくは１～５時間である。超遠心分離での温度は、例えば、４～３０℃である。超遠心分離は、１回または複数回（例、２回、３回）行ってもよい。
【0041】
本発明はまた、細胞外小胞の分析方法を提供する。
【0042】
本発明の分析方法は、以下を含む：
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
（１）ポリマーの存在下で、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
【0043】
本発明の分析方法における工程（１）は、本発明の回収方法における工程（１）と同様にして行うことができる。
【0044】
工程（２）では、分離された細胞外小胞が分析される。分析される対象としては、例えば、細胞外小胞中に含まれる成分（例、細胞外小胞の内部に含まれる成分、細胞外小胞の膜成分、細胞外小胞の膜表面に存在している成分）、および細胞外小胞自体（粒子）が挙げられる。
【0045】
細胞外小胞中に含まれる成分が分析される場合、分析は、成分の検出または定量である。このような分析はまた、一成分または複数成分の分析である。分析される成分としては、例えば、タンパク質、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖、脂質、アミノ酸、ビタミン類、ポリアミン、およびペプチドが挙げられる。ポリマーの存在下で細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離することにより、細胞外小胞の回収量を増加させることができる。したがって、本発明の分析方法によれば、細胞外小胞中のタンパク質、核酸等の成分を高精度で分析することができる。
【0046】
成分の分析は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、逆転写酵素を用いる逆転写（ＲＴ）反応、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法（例、定量ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ等のＰＣＲ法）、シークエンシング、質量分析法が挙げられる。
分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、逆転写酵素を用いる逆転写（ＲＴ）反応、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法（例、定量ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ等のＰＣＲ法）、シークエンシング、質量分析法が挙げられる。
分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
【0047】
本発明の分析方法は、細胞外小胞に含まれるマーカーの検出に用いることができる。細胞外小胞に含まれるマーカーとしては、例えば、細胞外小胞の存在の指標となるマーカー、癌等の疾患の指標となるマーカー（例、診断マーカー、疾患のリスク評価マーカー）が挙げられる。細胞外小胞の存在の指標となるマーカーとしては、例えば、テトラスパニン膜タンパク質（細胞外小胞膜特異的４回貫通膜タンパク質、例、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ＡＬＩＸ、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－Ｉ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｒａｂタンパク質、ＥｐＣＡＭ、およびこれらのタンパク質をコードする核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）が挙げられる。疾患の指標となるマーカーとしては、例えば、癌等の疾患に罹患した生物に由来する細胞外小胞または癌細胞等の異常細胞から分泌される細胞外小胞に特異的に存在するタンパク質（以下、「異常タンパク質」と呼ぶ。例、変異タンパク質、外来タンパク質）が挙げられる。変異タンパク質としては、例えば、ＥＭＬ４－ＡＬＫ等の融合タンパク質が挙げられる。ＥＭＬ４－ＡＬＫには、バリアント１、２、３ａ、３ｂ、４，５ａ、５ｂ、６等のバリアントが存在する。外来タンパク質としては、例えば、ウイルス由来タンパク質が挙げられる。疾患の指標となるマーカーとしてはまた、これらのタンパク質をコードする核酸の発現の有無またはその量の変化、ならびに、ＳＮＰ等の変異、ハプロタイプ、転座、核酸のメチル化の存在もしくは非存在、およびバリアントの種類が挙げられる。
【0048】
細胞外小胞自体（粒子）の分析は、例えば、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。この場合、細胞外小胞の粒子数、粒子の大きさおよび形状、並びにそれらの分布を分析することができる。
【0049】
細胞外小胞は、癌等の種々の疾患に関与し得ることが報告されている（国際公開第２０１４／００３０５３号；国際公開第２０１４／１５２６２２号；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌ，１００（２００８） ｐｐ１３－２１）。したがって、本発明の回収方法および分析方法は、例えば、細胞外小胞に基づく診断および創薬に有用である。例えば、肺癌等の癌マーカーであるＥＭＬ４－ＡＬＫを本発明の分析方法により検出することは、肺癌等の癌患者に対するクリゾニチブ、アレクチニブ等のＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤の投与決定の指標として有用となり得る。
【0050】
別の実施形態では、本発明は、以下を含む、細胞外小胞の分析方法を提供する：
（１）細胞外小胞膜結合物質を用いて細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞内に含まれる、癌等の疾患の指標となるマーカーを分析すること。
（１）細胞外小胞膜結合物質を用いて細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞内に含まれる、癌等の疾患の指標となるマーカーを分析すること。
【0051】
本実施形態における細胞外小胞膜結合物質としては、上述の細胞外小胞マーカーに親和性を有する物質が挙げられる。細胞外小胞マーカーは、好ましくはテトラスパニン膜タンパク質、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質である。また細胞外小胞マーカーは、好ましくはＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７、より好ましくはＣＤ９、またはＣＤ６３である。細胞外小胞膜結合物質としては、例えば、上述の抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその抗原結合性断片、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。
【0052】
癌等の疾患の指標となるマーカーして、上述した異常タンパク質の発現の有無またはその量の変化が挙げられる。異常タンパク質としては、例えば、ＥＭＬ４－ＡＬＫ等の融合タンパク質が挙げられる。疾患の指標となるマーカーとしてはまた、これらのタンパク質をコードする核酸の発現の有無またはその量の変化、ならびに、ＳＮＰ等の変異、ハプロタイプ、転座、核酸のメチル化の存在もしくは非存在、およびバリアントの種類が挙げられる。
【0053】
本発明はまた、上述したようなポリマーおよび細胞外小胞膜結合物質を含むキットを提供する。本発明のキットは、キレート剤をさらに含んでもよい。本発明のキットは、例えば、本発明の回収方法、および分析方法の簡便な実施に有用である。
【実施例0054】
以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0055】
（実施例１）
市販の３種類のＣＭＣナトリウム塩（以下、単に「ＣＭＣ」と呼ぶ。ＣＡＳ Ｎｏ．９００４－３２－４、ナカライテスク社＃０７３２６－９５（平均分子量不明）、シグマアルドリッチ社＃Ｃ５６７８（平均分子量９０ｋＤａ）、＃Ｃ４８８８（平均分子量２５０ｋＤａ））の、ＥＶ回収への効果を検討した。ＥＶ回収は、抗ＣＤ９抗体を用いて行った。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ（２．９ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、９．０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、または終濃度０．２～２．５重量％のＣＭＣ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の終濃度が０．２～２．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ウエスタンブロッティング用サンプルでは、エクソソームを含むサンプルがＳＤＳで処理されることにより、エクソソームが破壊され、エクソソームのマーカータンパク質（例、ＣＤ９）がサンプル溶液中に放出されている。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図１）。４種類のＣＭＣ全てにおいて、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
実施例で用いたＣＭＣの各物性値を以下の表１にまとめた。
市販の３種類のＣＭＣナトリウム塩（以下、単に「ＣＭＣ」と呼ぶ。ＣＡＳ Ｎｏ．９００４－３２－４、ナカライテスク社＃０７３２６－９５（平均分子量不明）、シグマアルドリッチ社＃Ｃ５６７８（平均分子量９０ｋＤａ）、＃Ｃ４８８８（平均分子量２５０ｋＤａ））の、ＥＶ回収への効果を検討した。ＥＶ回収は、抗ＣＤ９抗体を用いて行った。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ（２．９ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、９．０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、または終濃度０．２～２．５重量％のＣＭＣ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の終濃度が０．２～２．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ウエスタンブロッティング用サンプルでは、エクソソームを含むサンプルがＳＤＳで処理されることにより、エクソソームが破壊され、エクソソームのマーカータンパク質（例、ＣＤ９）がサンプル溶液中に放出されている。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図１）。４種類のＣＭＣ全てにおいて、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
実施例で用いたＣＭＣの各物性値を以下の表１にまとめた。
【0056】
【表1】
【0057】
（実施例２）
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）の濃度（０．０６重量％～１．０重量％の終濃度）および反応温度（４℃、３７℃）がＥＶ回収に与える効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳもしくはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．０６～１．０重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩もしくは３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図２）。反応温度４℃および３７℃において、ＣＭＣの終濃度０．２５重量％～１重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）の濃度（０．０６重量％～１．０重量％の終濃度）および反応温度（４℃、３７℃）がＥＶ回収に与える効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳもしくはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．０６～１．０重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩もしくは３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図２）。反応温度４℃および３７℃において、ＣＭＣの終濃度０．２５重量％～１重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
【0058】
（実施例３）
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果をナノ粒子トラッキング解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０、カンタムデザイン社）により検討した。
２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で３０分間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、４０μＬ ＢＲＵＢ（Ｂｒｉｔｔｏｎ ＆ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ２．６）で５分間反応させた後、２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和することで細胞外小胞を抗体磁性ビーズ粒子から遊離させた。Ｑｕｂｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（ライフテクノロジーズ社）で総タンパク質濃度を定量した後、ＰＢＳ ４５０μＬを添加してＮａｎｏＳｉｇｈｔにより粒子数を解析した（図３）。ＣＭＣで希釈した条件においてＥＶの総回収粒子数と総タンパク質あたりの粒子数の増加が認められ、高純度で細胞外小胞が回収されたことが示された。
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果をナノ粒子トラッキング解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０、カンタムデザイン社）により検討した。
２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で３０分間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、４０μＬ ＢＲＵＢ（Ｂｒｉｔｔｏｎ ＆ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ２．６）で５分間反応させた後、２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和することで細胞外小胞を抗体磁性ビーズ粒子から遊離させた。Ｑｕｂｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（ライフテクノロジーズ社）で総タンパク質濃度を定量した後、ＰＢＳ ４５０μＬを添加してＮａｎｏＳｉｇｈｔにより粒子数を解析した（図３）。ＣＭＣで希釈した条件においてＥＶの総回収粒子数と総タンパク質あたりの粒子数の増加が認められ、高純度で細胞外小胞が回収されたことが示された。
【0059】
（実施例４）
血清、および５種類の抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、ＡＣＤ（酸－クエン酸－デキストロース；ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース；ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
２００μＬの健常人血清、および抗凝固剤含有健常人血漿を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後のそれぞれの終濃度が３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％になるようにＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＣＭＣを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図４）。抗凝固剤の種類を問わず、血漿検体においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
血清、および５種類の抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、ＡＣＤ（酸－クエン酸－デキストロース；ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース；ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
２００μＬの健常人血清、および抗凝固剤含有健常人血漿を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後のそれぞれの終濃度が３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％になるようにＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＣＭＣを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図４）。抗凝固剤の種類を問わず、血漿検体においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
【0060】
（実施例５）
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）が、ＣＤ９以外の２種類のテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ６３およびＣＤ８１）、および細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）に対する抗体を用いたＥＶ回収に与える効果を検討した。
２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）、抗ＣＤ８１抗体（Ｍ３８：アブカム社）および抗ＣＤ１４７抗体（ＭＥＭ－Ｍ６／１：アブカム社）の各抗体を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。抗ＣＤ６３抗体（自社製）、抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）およびビオチン化抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法でＥＶ回収効率を解析した（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１４７に対する抗体を用いた場合でもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）が、ＣＤ９以外の２種類のテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ６３およびＣＤ８１）、および細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）に対する抗体を用いたＥＶ回収に与える効果を検討した。
２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）、抗ＣＤ８１抗体（Ｍ３８：アブカム社）および抗ＣＤ１４７抗体（ＭＥＭ－Ｍ６／１：アブカム社）の各抗体を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。抗ＣＤ６３抗体（自社製）、抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）およびビオチン化抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法でＥＶ回収効率を解析した（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１４７に対する抗体を用いた場合でもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
【0061】
（実施例６）
２種類の体液（尿および唾液）において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
２００μＬの健常人尿および唾液（それぞれ、２個のサンプル。「＃１」および「＃２」として表わす。）を１５，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、０．２２μｍフィルターにより濾過を行った後、２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図６）。血清、血漿のみならず、尿および唾液においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
２種類の体液（尿および唾液）において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
２００μＬの健常人尿および唾液（それぞれ、２個のサンプル。「＃１」および「＃２」として表わす。）を１５，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、０．２２μｍフィルターにより濾過を行った後、２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図６）。血清、血漿のみならず、尿および唾液においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
【0062】
（実施例７）
下記表２に示すセルロース誘導体（０．１３重量％～４．０重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＰＢＳに溶解したセルロース誘導体（血清希釈後の各終濃度０．１３～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図７Ａ～Ｃ）。ＣＭＣ以外の３種類のセルロース誘導体においてもＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた（ＨＥＣは０．１３重量％～２．０重量％の範囲、ＨＰＣは０．２５重量％～４．０重量％の範囲、ＨＰＭＣは０．２５重量％～２．０重量％の範囲において）。
下記表２に示すセルロース誘導体（０．１３重量％～４．０重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＰＢＳに溶解したセルロース誘導体（血清希釈後の各終濃度０．１３～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図７Ａ～Ｃ）。ＣＭＣ以外の３種類のセルロース誘導体においてもＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた（ＨＥＣは０．１３重量％～２．０重量％の範囲、ＨＰＣは０．２５重量％～４．０重量％の範囲、ＨＰＭＣは０．２５重量％～２．０重量％の範囲において）。
【0063】
【表2】
【0064】
（実施例８）
下記表３に示すポリビニルピロリドン（１重量％、２重量％、４重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳに溶解したポリビニルピロリドン（血清希釈後の各終濃度１．０～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図８）。ポリビニルピロリドンは１．０重量％～４．０重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較して、ＥＶ回収効率向上の効果が認められた。
下記表３に示すポリビニルピロリドン（１重量％、２重量％、４重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳに溶解したポリビニルピロリドン（血清希釈後の各終濃度１．０～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図８）。ポリビニルピロリドンは１．０重量％～４．０重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較して、ＥＶ回収効率向上の効果が認められた。
【0065】
【表3】
【0066】
（実施例９）
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）について、３５℃から６０℃の各反応温度におけるＥＶ回収への効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、１００μＬの血清を１００μＬのＰＢＳまたはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）または抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。各反応温度で５分間反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）および抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図９Ａ～図９Ｃ）。ＣＭＣ添加により３５℃から６０℃の各反応温度においてＥＶ回収効率向上の効果を認めた。さらに４０℃以上の高温条件においてＣＭＣ添加によりＥＶ回収効率向上の、より高い効果を認めた。また、ＣＭＣによるＥＶ回収効率向上効果は短時間の反応においても効果を認めた。
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）について、３５℃から６０℃の各反応温度におけるＥＶ回収への効果を検討した。
健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、１００μＬの血清を１００μＬのＰＢＳまたはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）または抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）を固定した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。各反応温度で５分間反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）および抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図９Ａ～図９Ｃ）。ＣＭＣ添加により３５℃から６０℃の各反応温度においてＥＶ回収効率向上の効果を認めた。さらに４０℃以上の高温条件においてＣＭＣ添加によりＥＶ回収効率向上の、より高い効果を認めた。また、ＣＭＣによるＥＶ回収効率向上効果は短時間の反応においても効果を認めた。
【0067】
（実施例１０）
実施例７で用いたセルロース誘導体および実施例８で用いたポリビニルピロリドンのＰＢＳ溶液中の粘度を測定した。具体的には、２重量％になるように各セルロース誘導体又はポリビニルピロリドンをＰＢＳに溶解して調製した各ＰＢＳ溶液を粘性解析装置レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００（ヤマト科学社）を用いて、３０℃、測定時間６０秒にて、２００ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、８００ｒｐｍの各回転速度で測定した結果の平均として求めた（表４）。
実施例７で用いたセルロース誘導体および実施例８で用いたポリビニルピロリドンのＰＢＳ溶液中の粘度を測定した。具体的には、２重量％になるように各セルロース誘導体又はポリビニルピロリドンをＰＢＳに溶解して調製した各ＰＢＳ溶液を粘性解析装置レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００（ヤマト科学社）を用いて、３０℃、測定時間６０秒にて、２００ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、８００ｒｐｍの各回転速度で測定した結果の平均として求めた（表４）。
【0068】
【表4】
【0069】
（実施例１１）
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）およびテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ９およびＣＤ６３）に対する抗体を用いた免疫沈降法によるＥＶ回収およびＥＶからのマーカー（ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子）ＲＮＡの検出への効果を検討した。
３日間無血清培地で培養したヒト肺癌細胞Ｈ２２２８の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて１００倍に濃縮した。
濃縮物を等量のＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）の各抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社）をそれぞれ０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩、回転反応させた後に、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを精製した。精製したトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｃＤＮＡを作成し、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてＥＭＬ４－ＡＬＫ ｍＲＮＡを定量した（図１０）。
ＥＭＬ４－ＡＬＫ ｍＲＮＡの検出には以下の表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いた。蛍光プローブとして、５’末端に蛍光物質ＨＥＸと、プローブの内部にＺＥＮクエンチャーと、３’末端にＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（ＩＡＢｋＦＱ）とを有するダブルクエンチャープローブを用いた。表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いることにより、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａおよび３ｂを検出することができる。
ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）およびテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ９およびＣＤ６３）に対する抗体を用いた免疫沈降法によるＥＶ回収およびＥＶからのマーカー（ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子）ＲＮＡの検出への効果を検討した。
３日間無血清培地で培養したヒト肺癌細胞Ｈ２２２８の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて１００倍に濃縮した。
濃縮物を等量のＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）の各抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社）をそれぞれ０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩、回転反応させた後に、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを精製した。精製したトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｃＤＮＡを作成し、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてＥＭＬ４－ＡＬＫ ｍＲＮＡを定量した（図１０）。
ＥＭＬ４－ＡＬＫ ｍＲＮＡの検出には以下の表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いた。蛍光プローブとして、５’末端に蛍光物質ＨＥＸと、プローブの内部にＺＥＮクエンチャーと、３’末端にＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（ＩＡＢｋＦＱ）とを有するダブルクエンチャープローブを用いた。表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いることにより、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａおよび３ｂを検出することができる。
【0070】
【表5】
【0071】
免疫沈降法により回収したＥＶに含まれるＥＭＬ４－ＡＬＫを検出した。ＣＭＣを用いることで、ＥＭＬ４－ＡＬＫ ｍＲＮＡ検出量が増大し、ＥＶ回収効率の向上効果を認めた。さらに、キレート剤を添加することで、ＥＭＬ４－ＡＬＫ ｍＲＮＡ検出量がより増大し、ＥＶ回収効率のより向上した効果を認めた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【配列表】