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特開2024-111993乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＥＫ－０１株、およびこれを含む組成物、飲食品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024111993
(43)【公開日】2024-08-20
(54)【発明の名称】乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＥＫ－０１株、およびこれを含む組成物、飲食品
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240813BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20240813BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
A23L33/135
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023016790
(22)【出願日】2023-02-07
(71)【出願人】
【識別番号】503172770
【氏名又は名称】株式会社えがお
(74)【代理人】
【識別番号】100197642
【弁理士】
【氏名又は名称】南瀬 透
(74)【代理人】
【識別番号】100099508
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 久
(74)【代理人】
【識別番号】100182567
【弁理士】
【氏名又は名称】遠坂 啓太
(74)【代理人】
【識別番号】100219483
【弁理士】
【氏名又は名称】宇野 智也
(72)【発明者】
【氏名】北野 忠男
(72)【発明者】
【氏名】松本 ▲祥▼幸
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B018LB03
4B018LB07
4B018MD86
4B018ME11
4B018MF13
4B065AA30X
4B065BC02
4B065BC03
4B065CA41
(57)【要約】
【課題】酸性や、アルカリ性の環境に接しても生存し、増殖可能な乳酸菌等を提供する。
【解決手段】耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、又は前記ＥＫ－０１株の変異株。耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、及び／又は前記ＥＫ－０１株の変異株を含有する、整腸作用を有する組成物、またこの組成物を含有する飲食品。
【選択図】図１
【解決手段】耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、又は前記ＥＫ－０１株の変異株。耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、及び／又は前記ＥＫ－０１株の変異株を含有する、整腸作用を有する組成物、またこの組成物を含有する飲食品。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、又は前記ＥＫ－０１株の変異株。
【請求項2】
耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、及び／又は前記ＥＫ－０１株の変異株を含有する、整腸作用を有する組成物。
【請求項3】
請求項２に記載の組成物を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、耐酸性および耐アルカリ性を有するLactobacillus buchneriに属する乳酸菌等に関する。また、その乳酸菌を含む組成物や、飲食品に関する。
【背景技術】
【0002】
乳酸菌は、経口的に摂取されることで、整腸作用を初めとして健康に利する多彩な生理的機能性を示す事が報告されている。また、こうした機能性の多くは生菌のみならず死菌であっても得られる事から、乳酸菌の生理活性は菌体そのものに起因している場合も少なくないと考えられており、こうした菌体成分そのものが生理活性を示す事は「バイオジェニクス」と呼ばれる（非特許文献１）。なお、非特許文献２は、乳酸菌の一種であるLactobacillus plantarumの増殖に関する文献であり、一般的に乳酸菌は弱酸性程度から中性付近が至適ｐＨである。
【0003】
乳酸菌は、株ごとに異なる物性を有することが多く、由来などによっても異なる特性を有している。例えば、特許文献１は、無塩発酵漬物すんきから分離されたｐＨ２．５で生存する高い耐酸性を有しアンジオテンシン変換酵素阻害活性を示す物質産生能を有するラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＮＩＴＥ Ｐ－０１９８９菌株からなり乳製品乳酸菌飲料の製造に使用される乳酸菌を開示している。
【0004】
また、特許文献２は、あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブチネリ（Lactobacillus buchneri）及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のうちの少なくとも一方の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有し、前記ラクトバチルス・ブチネリ（Lactobacillus buchneri）が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－１１２３で寄託されたラクトバチルス・ブチネリ（Lactobacillus buchneri）ＡＮ１－１であり、前記ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－１２２４で寄託されたラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＡＮＰ７－１であることを特徴とするウイルス感染予防用乳酸菌組成物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第６５１８９０９号公報
【特許文献2】特許第６０２８９６２号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】日本調理科学会誌 Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．２，１２９～１３３（２０１３）
【非特許文献2】Influence of pH and initial lactate concentration on the growth of Lactobacillus plantarum(Appl Microbiol Biotechnol (1991) 36:96-99)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
乳酸菌は各種の食品の製造や食品の成分として利用される場合がある。しかし、実際に製造等される食品等は千差万別であり、特にｐＨがアルカリ域の食品素材に対して耐性が低い乳酸菌を利用しようとする場合など、利用可能な菌株の選択に制限があるという課題があった。また、整腸作用等を期待するにあたっても、胃は強酸性で、腸は弱アルカリ性になる場合もあるため、いずれでも死滅せず生育できる菌でないと経口摂取で得られる効果が限られたものとなる。
【0008】
かかる状況下、本発明は、酸性・アルカリ性の環境でも増殖可能な乳酸菌等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
【0010】
＜１＞ 耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、又は前記ＥＫ－０１株の変異株。
＜２＞ 耐酸性、および耐アルカリ性を有する 乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、及び／又は前記ＥＫ－０１株の変異株を含有する、整腸作用を有する組成物。
＜３＞ 請求項２に記載の組成物を含有する飲食品。
＜２＞ 耐酸性、および耐アルカリ性を有する 乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、及び／又は前記ＥＫ－０１株の変異株を含有する、整腸作用を有する組成物。
＜３＞ 請求項２に記載の組成物を含有する飲食品。
【発明の効果】
【0011】
本発明にかかる乳酸菌は酸性・アルカリ性の環境でも増殖可能である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明の乳酸菌の耐酸性に関する試験結果に関するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「～」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いる。
【0014】
［本発明の乳酸菌］
本発明の乳酸菌は、耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）に関する。また、本発明の乳酸菌等は、前記ＥＫ－０１株、前記ＥＫ－０１株の変異株に関する。
本発明の乳酸菌は、耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）に関する。また、本発明の乳酸菌等は、前記ＥＫ－０１株、前記ＥＫ－０１株の変異株に関する。
【0015】
［本発明の組成物］
本発明の組成物は、耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、及び／又は前記ＥＫ－０１株の変異株を含有する、整腸作用を有する組成物。
本発明の組成物は、耐酸性、および耐アルカリ性を有する乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）、及び／又は前記ＥＫ－０１株の変異株を含有する、整腸作用を有する組成物。
【0016】
なお、本願において本発明の乳酸菌は本発明の組成物に利用することができ、本願においてそれぞれに対応する構成は相互に利用することができる。
【0017】
［乳酸菌］
本発明の乳酸菌は、Lactobacillus buchneriに属するＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）の乳酸菌に関する。この乳酸菌は、優れた耐酸性と耐アルカリ性を有し、これらの環境でも増殖することを特徴とする。これにより、食品の製造等に利用したり、食品として摂取したとき、胃や腸で生存しやすく、整腸作用等を奏する。
本発明の乳酸菌は、Lactobacillus buchneriに属するＥＫ－０１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２）の乳酸菌に関する。この乳酸菌は、優れた耐酸性と耐アルカリ性を有し、これらの環境でも増殖することを特徴とする。これにより、食品の製造等に利用したり、食品として摂取したとき、胃や腸で生存しやすく、整腸作用等を奏する。
【0018】
本発明の乳酸菌は、ｐＨ９．５～ｐＨ１０．０で処理しても生存・増殖可能な乳酸菌である。また、本発明の乳酸菌は、ｐＨ１～１．５で処理しても生存・増殖可能な乳酸菌である。これらの処理時間は、３７℃で約１時間程度を目安とすることができる。
【0019】
本発明のLactobacillus buchneriに属する乳酸菌の具体例は、本発明者らが壺作り黒酢の製造工程から単離・同定したLactobacillus buchneri ＥＫ－０１株（以下、「ＥＫ－０１株」と記す場合がある）である。当該乳酸菌株は、２０１７年１１月９日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８－１２２)に受領され、「受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２５６２」として寄託されている。
【0020】
Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株の菌学的性質及び遺伝学的性質は以下の通りである。
【0021】
＜菌学的性質＞
Ａ．形態的性状
細胞形態 ：桿状
コロニー ：クリーム色
特徴 ：ｐＨ１．２の環境に１～２時間曝露された環境でも増殖する。
Ａ．形態的性状
細胞形態 ：桿状
コロニー ：クリーム色
特徴 ：ｐＨ１．２の環境に１～２時間曝露された環境でも増殖する。
【0022】
＜遺伝学的性質＞
ＥＫ－０１株の細菌５００ｂｐ（１６Ｓ ｒＤＮＡ配列）は、データベース（ＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標） ＩＤ ＡＢ＿Ｂａｃｔｅｒｉａｌ５００Ｌｉｂ＿２０１３）を用いて、対応する塩基配列と比較する解析により、Lactobacillus buchneriと最も高い相同性（約９９．４％）を示した。また、その糖資化性の評価結果から、ＥＫ－０１株はLactobacillus buchneriに属する乳酸菌であると判断された。
ＥＫ－０１株の細菌５００ｂｐ（１６Ｓ ｒＤＮＡ配列）は、データベース（ＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標） ＩＤ ＡＢ＿Ｂａｃｔｅｒｉａｌ５００Ｌｉｂ＿２０１３）を用いて、対応する塩基配列と比較する解析により、Lactobacillus buchneriと最も高い相同性（約９９．４％）を示した。また、その糖資化性の評価結果から、ＥＫ－０１株はLactobacillus buchneriに属する乳酸菌であると判断された。
【0023】
食用にも利用できるLactobacillus buchneriの例は少なく、さらに酸やアルカリに十分な耐性があることが知られたものはない。また、他の乳酸菌についても強酸性や、アルカリ性でも増殖できるものは限られている。本発明のＥＫ－０１株は、ｐＨ１～２程度やｐＨ９．５程度でも良好に増殖する事から、既知のLactobacillus buchneriとは性質の異なる新規の菌株であると判断される。
【0024】
ＥＫ－０１株の培養は従来からある常法に従って行うことができる。培地は、ＥＫ－０１株が増殖できるものであれば特に制限はなく、天然培地、合成培地、半合成培地などの培地を使用することができる。また牛乳やローヤルゼリー、果実などを培地として使用することもできる。また培地には、窒素源及び炭素源を含有するものも使用することができ、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、グルテン、大豆粉、大豆加水分解物、アミノ酸等が挙げられ、炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトース、イノシトール、ソルビトール、水飴、澱粉、麹汁、フスマ、バカス、糖蜜等が挙げられる。その他、無機質（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、食塩、炭酸カルシウム、鉄、マンガン、モリブデン）、各種ビタミン類などを添加してもよい。
【0025】
ＥＫ－０１株の培養温度は４～４５℃、好ましくは３０～３７℃であり、培養時間は通常１２～４８時間程度である。また乳酸菌は通性嫌気性なので通気振盪又は通気撹拌してもよいが、好ましくは嫌気環境で培養する。培地のｐＨは、例えば１～１１や、２～９．５のような広範なｐＨ域でも増殖可能である。
【0026】
代表的な培養方法としては、例えばＭＲＳ培地に１％の菌体を植菌し、３７℃で２４時間培養すること等が考えられる。
【0027】
また、本発明の乳酸菌は、このＥＫ－０１株から生じた派生株であり、耐酸性と耐アルカリ性を有する変異株とすることもできる。
【0028】
［菌体処理物］
本発明では、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株、および／または、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株の変異株の菌体処理物を、本発明の乳酸菌の菌体処理物として利用してもよい。すなわち、本発明の乳酸菌の菌体を構成する成分に各種有効成分が含まれ、これらを利用することができる。
本発明では、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株、および／または、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株の変異株の菌体処理物を、本発明の乳酸菌の菌体処理物として利用してもよい。すなわち、本発明の乳酸菌の菌体を構成する成分に各種有効成分が含まれ、これらを利用することができる。
【0029】
本発明の乳酸菌は、生菌として乳酸発酵等に利用することができる。このとき、乳酸発酵の過程で発酵対象を適宜アルカリ性のものとしても、それらの対象を用いて乳酸発酵するための増殖を維持することができる。また、整腸作用を奏する。特にアルカリ性よりの腸内でも増殖することができることから、優れた整腸作用を奏することが期待できる。
【0030】
これらの利用にあたって、適宜その使用目的に応じた剤形等で利用することができる。乳酸菌はそのまま粉末製剤等として用いることもできるし、各種成分と組み合わせた組成物として用いてもよい。乳酸発酵等に用いる場合、工業用製剤として用いてよいし、整腸作用を奏する飲食用組成物や医薬用組成物のような態様として用いてもよい。
【0031】
［耐酸性］
耐酸性は、酸性の条件でも菌が増殖できることをいう。耐酸性の評価は、例えば、ｐＨ１．２の環境に１時間曝露された後に、乳酸菌培養用の調製を行ったＭＲＳ培地に１％の菌体を植菌し、３７℃で２４時間培養したとき増殖してコロニー形成することをもって評価することができる。さらには、耐酸性を評価するための暴露時間が１時間のとき、植菌した菌が１０％以上コロニー形成するものとしてもよい。
耐酸性は、酸性の条件でも菌が増殖できることをいう。耐酸性の評価は、例えば、ｐＨ１．２の環境に１時間曝露された後に、乳酸菌培養用の調製を行ったＭＲＳ培地に１％の菌体を植菌し、３７℃で２４時間培養したとき増殖してコロニー形成することをもって評価することができる。さらには、耐酸性を評価するための暴露時間が１時間のとき、植菌した菌が１０％以上コロニー形成するものとしてもよい。
【0032】
［耐アルカリ性］
耐アルカリ性は、アルカリ性の条件でも増殖できることをいう。耐アルカリ性の評価は、例えば、ｐＨ９．５の環境に１時間曝露された後に、乳酸菌培養用の調製を行ったＭＲＳ培地に１％の菌体を植菌し、３７℃で２４時間培養したとき増殖してコロニー形成することをもって評価することができる。さらには、耐アルカリ性を評価するための暴露時間が１時間のとき、植菌した菌が１０％以上コロニー形成するものとしてもよい。
耐アルカリ性は、アルカリ性の条件でも増殖できることをいう。耐アルカリ性の評価は、例えば、ｐＨ９．５の環境に１時間曝露された後に、乳酸菌培養用の調製を行ったＭＲＳ培地に１％の菌体を植菌し、３７℃で２４時間培養したとき増殖してコロニー形成することをもって評価することができる。さらには、耐アルカリ性を評価するための暴露時間が１時間のとき、植菌した菌が１０％以上コロニー形成するものとしてもよい。
【0033】
［組成物］
本発明の組成物は、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株の変異株、およびこれらの乳酸菌の菌体処理物からなる群から選択される１以上を含有する。この組成物は、乳酸菌やその菌体処理物を含み、その使用目的に応じて適宜調製される組成物である。これらの組成物は、食品組成物や医薬組成物、化粧料組成物、発酵用組成物等として用いることができる。これらの組成物の用途は例示であり、以下、種々の態様を例示するが適宜相互に利用できる形態を参照して調製することもできる。
本発明の組成物は、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株、乳酸菌Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株の変異株、およびこれらの乳酸菌の菌体処理物からなる群から選択される１以上を含有する。この組成物は、乳酸菌やその菌体処理物を含み、その使用目的に応じて適宜調製される組成物である。これらの組成物は、食品組成物や医薬組成物、化粧料組成物、発酵用組成物等として用いることができる。これらの組成物の用途は例示であり、以下、種々の態様を例示するが適宜相互に利用できる形態を参照して調製することもできる。
【0034】
［食品組成物］
本発明の組成物は、食品組成物とすることができる。本発明の食品組成物は、本発明の乳酸菌又は菌体処理物を含有する。当該食品組成物には、ヒトを含む動物が摂取できるあらゆる食品組成物を含む。
本発明の組成物は、食品組成物とすることができる。本発明の食品組成物は、本発明の乳酸菌又は菌体処理物を含有する。当該食品組成物には、ヒトを含む動物が摂取できるあらゆる食品組成物を含む。
【0035】
本発明の食品組成物において乳酸菌は、生菌体又は死菌体の状態を問わない。また、単離した菌体、菌体の培養物及び発酵物の何れを用いてもよい。
【0036】
乳酸菌の菌体処理物としては、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥（凍結乾燥、噴霧乾燥など）、凍結、溶菌、破砕、抽出等されたものが挙げられる。更に、菌体処理物としては、超音波破砕などの処理を行った菌体破砕物に除タンパクを行った後の上清、菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。
【0037】
上記乳酸菌は菌として単体の菌を使用することもできるが、他の微生物と混合して使用しても差し支えない。
【0038】
本発明の食品組成物には、上記乳酸菌又は菌体処理物をそのまま使用することもできるほか、必要に応じて、それぞれの食品組成物を構成するものに加えて、例えば、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等を配合することができる。
【0039】
本発明の食品組成物の種類は、食品として食用や飲用できるものであれば特に限定されない。例えば、乳製品；発酵食品(ヨーグルト、ローヤルゼリー等)；飲料類(コーヒー、ジュース、茶飲料のような清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、乳酸菌入り飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、日本酒、洋酒、果実酒のような酒等)；スプレッド類(カスタードクリーム等)；ペースト類(フルーツペースト等)；洋菓子類(チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ、プリン等)；和菓子類(大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ、羊羹等)；氷菓類(アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベット等)；食品類(カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム、ローヤルゼリー等)；調味料類(ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料、スープの素等)などが含まれる。
【0040】
本発明の食品組成物の製法も特に限定されず、適宜任意の方法で製造することができる。例えば、前記のような食品組成物の製造工程における中間製品、又は最終製品に、上記乳酸菌又は菌体処理物を混合又は噴霧等することにより食品組成物を得ることができる。また、上記乳酸菌を用いて牛乳などの獣乳や乳原料等の発酵を行うことにより発酵製品、乳酸菌飲料、及び乳酸菌入り飲料を製造することができる。また、上記乳酸菌によりローヤルゼリーの発酵を行うことで、ローヤルゼリーの発酵食品も製造することができる。また上記乳酸菌により果実や野菜等の発酵を行うことで、果実や野菜等の発酵食品も製造することができる。
【0041】
また、本発明の食品組成物は、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品又はプロバイオティック製品としても使用できる。サプリメントとして使用する際の投与単位形態については特に限定されず適宜選択できるが、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、散剤等が挙げられる。
【0042】
本発明の食品組成物における上記乳酸菌の含有量は、食品組成物全量中１×１０-6～１００質量％の範囲から自由に適宜選択することが可能である。この含有量の下限は、食品組成物の態様に応じて、１×１０-4質量％以上や、１×１０-2質量％以上、１質量％以上、５質量％以上のように設定してもよい。この含有量の上限は、食品組成物の態様に応じて、９９．９質量％以下や、９９質量％以下、９０質量％以下、８０質量％以下、５０質量％以下のように設定してもよい。
【0043】
本発明の食品組成物の摂取量は、摂取者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜設定することができるが、例えば乳酸菌の菌体数で表すと、乳等省令で規定された発酵乳（ヨーグルト）の菌体数と同等以上（１ｍＬあたり１０００万個以上）が望ましい。
【0044】
本発明の組成物は、医薬組成物とすることができる。医薬組成物は、症状等に応じて、それらに対する予防や治療効果を奏する任意の態様とすることができ、経口投与や非経口投与で用いることができる。本発明の医薬組成物は、本発明の乳酸菌又は菌体処理物を有効成分として含有する。本発明の医薬組成物は、乳酸菌製剤と称することができる。
【0045】
本発明の医薬組成物において乳酸菌は、生菌体を用いることが好ましい。また、単離した菌体、菌体の培養物及び発酵物の何れを用いてもよい。
【0046】
乳酸菌の菌体処理物を利用する場合、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥（凍結乾燥、噴霧乾燥など）、凍結、溶菌、破砕、抽出等されたものが挙げられる。更に、菌体処理物としては、超音波破砕などの処理を行った菌体破砕物に除タンパクを行った後の上清、菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。
【0047】
また、上記乳酸菌は菌として単体の菌を使用することもできるが、他の微生物と混合して使用してもよい。
【0048】
医薬組成物として調製する場合、本発明の乳酸菌又は菌体処理物を培養したり回収したものをそのまま使用することができる。また、医薬品として許容される任意の形態（錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射用剤等）で製剤化することもできる。
【0049】
本発明の医薬組成物における上記乳酸菌又は菌体処理物の含有量は、医薬組成物全量中１×１０-6～１００重量％の範囲から自由に選択することが可能である。この含有量の下限は、食品組成物の態様に応じて、１×１０-4質量％以上や、１×１０-2質量％以上、１質量％以上、５質量％以上のように設定してもよい。この含有量の上限は、食品組成物の態様に応じて、９９．９質量％以下や、９９質量％以下、９０質量％以下、８０質量％以下、５０質量％以下のように設定してもよい。
【0050】
［発酵用組成物］
また、本発明の乳酸菌を利用した組成物は、発酵助成剤のような発酵用組成物として用いてもよい。発酵用組成物としては、乳酸菌の生菌や、死菌、菌体処理物等を用いることができる。特に、発酵に伴い増殖しながら発酵するように生菌を含む状態とすることが好ましい。この発酵用組成物は、乳酸菌を用いた各種発酵に用いることができる。例えば、ヨーグルト、乳酸菌飲料、漬け物など食品の発酵などに用いることができる。この発酵用組成物としては、いわゆるスターターと呼ばれるような純粋培養した本発明の乳酸菌を用いることが好ましい。発酵用組成物として使用する使用量は、組成物中の乳酸菌の量や発酵対象等を鑑み、乳酸菌の常用の使用法で設定して用いることができる。特に、本発明の乳酸菌は通常の酸性や中性相当に加えて、強酸性やアルカリ性の条件でも増殖するため、強酸性のものやアルカリ性のものを発酵対象として発酵することができる。このことから本発明の乳酸菌は、自身が産生した乳酸によるｐＨの低下に起因する発酵効率の低下や菌の死滅を緩和する目的で予め発酵対象のｐＨを下げたり、ｐＨを高めておくことができ、これにより発酵過程で乳酸菌が乳酸を産生しても発酵対象のｐＨ変化を抑制させて発酵を進めることができる。
また、本発明の乳酸菌を利用した組成物は、発酵助成剤のような発酵用組成物として用いてもよい。発酵用組成物としては、乳酸菌の生菌や、死菌、菌体処理物等を用いることができる。特に、発酵に伴い増殖しながら発酵するように生菌を含む状態とすることが好ましい。この発酵用組成物は、乳酸菌を用いた各種発酵に用いることができる。例えば、ヨーグルト、乳酸菌飲料、漬け物など食品の発酵などに用いることができる。この発酵用組成物としては、いわゆるスターターと呼ばれるような純粋培養した本発明の乳酸菌を用いることが好ましい。発酵用組成物として使用する使用量は、組成物中の乳酸菌の量や発酵対象等を鑑み、乳酸菌の常用の使用法で設定して用いることができる。特に、本発明の乳酸菌は通常の酸性や中性相当に加えて、強酸性やアルカリ性の条件でも増殖するため、強酸性のものやアルカリ性のものを発酵対象として発酵することができる。このことから本発明の乳酸菌は、自身が産生した乳酸によるｐＨの低下に起因する発酵効率の低下や菌の死滅を緩和する目的で予め発酵対象のｐＨを下げたり、ｐＨを高めておくことができ、これにより発酵過程で乳酸菌が乳酸を産生しても発酵対象のｐＨ変化を抑制させて発酵を進めることができる。
【0051】
本発明の組成物は、食品組成物や医薬組成物として使用することができる。主に、食品組成物や医薬組成物として、経口投与する態様で摂取することが好ましい。本発明の組成物を、整腸用などとしてヒトが用いるとき、その摂取量は、具体的な症状の程度や時期、環境、体調、年齢等を鑑みて適宜設定することができる。この摂取量を例示すると、具体的には、成人の１日当たり摂取量として、１０ｍｇ以上とすることができる。
この摂取量は成人について６０ｋｇ程度の体重相当として、体重１ｋｇあたりに換算して前記摂取量を設定してもよい。前記摂取量は、本発明の乳酸菌および本発明の乳酸菌の菌体処理物の総量であり、その量は、乾燥重量基準として設定する。
成人の１日当たり摂取量は、過剰に摂取しても菌や菌体処理物による弊害は少ないため特に上限を定めなくてもよい。過剰に摂取しても効果が飽和すると考えられることから、２０ｇ以上程度や１０ｇ以上程度、５ｇ以上程度を上限としてもよい。成人の１日当たり摂取量の下限は、より安定した効果を得るために、１５ｍｇ以上や、２０ｍｇ以上、２５ｍｇ以上としてもよい。
この摂取量は成人について６０ｋｇ程度の体重相当として、体重１ｋｇあたりに換算して前記摂取量を設定してもよい。前記摂取量は、本発明の乳酸菌および本発明の乳酸菌の菌体処理物の総量であり、その量は、乾燥重量基準として設定する。
成人の１日当たり摂取量は、過剰に摂取しても菌や菌体処理物による弊害は少ないため特に上限を定めなくてもよい。過剰に摂取しても効果が飽和すると考えられることから、２０ｇ以上程度や１０ｇ以上程度、５ｇ以上程度を上限としてもよい。成人の１日当たり摂取量の下限は、より安定した効果を得るために、１５ｍｇ以上や、２０ｍｇ以上、２５ｍｇ以上としてもよい。
【実施例0052】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【0053】
［実施例１］［Lactobacillus buchneri ＥＫ－０１株等の単離］
菌の分離に用いた培地は炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地で、適宜ＮａＣｌで塩濃度を調整した上で水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１０．０に調整した。この培地に福山町で製造途中の壷酢を希釈、添加し、嫌気環境のインキュベータ内にて、３７℃で４８時間培養を行った。クリアゾーンを形成した複数のシングルコロニーをニードルで採取し、同じ組成の培地に穿刺して培養後、１次サンプルとして保存した。
１次サンプルを用いて諸種の試験により性状を検討した上で、有用性が望めると判定したサンプルについてＭＲＳ液体培地で培養後、終濃度１５％のグリセロールストックを作製、－８０℃にて凍結保存した。
以上の手順により、ＮａＯＨによるｐＨ１０．０の環境下の培地で生残できる耐アルカリ性を有する乳酸菌の約３０株を得た。
菌の分離に用いた培地は炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地で、適宜ＮａＣｌで塩濃度を調整した上で水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１０．０に調整した。この培地に福山町で製造途中の壷酢を希釈、添加し、嫌気環境のインキュベータ内にて、３７℃で４８時間培養を行った。クリアゾーンを形成した複数のシングルコロニーをニードルで採取し、同じ組成の培地に穿刺して培養後、１次サンプルとして保存した。
１次サンプルを用いて諸種の試験により性状を検討した上で、有用性が望めると判定したサンプルについてＭＲＳ液体培地で培養後、終濃度１５％のグリセロールストックを作製、－８０℃にて凍結保存した。
以上の手順により、ＮａＯＨによるｐＨ１０．０の環境下の培地で生残できる耐アルカリ性を有する乳酸菌の約３０株を得た。
【0054】
［実施例２］［ＥＫ－０１株の評価］
実施例１でスクリーニングした約３０株について、以下の評価を行った。
実施例１でスクリーニングした約３０株について、以下の評価を行った。
【0055】
［実施例２－１］酸処理による生存率確認実験
・乳酸菌サンプル調製
福山町で製造途中の壷酢から入手される過程に準じて取得したコロニーの株について、強酸に対する耐酸性の評価を行った。それぞれの株の試験名称は、評価結果と合わせて後述する。なお、ＥＫ－０１株は、この試験における「Ａ－８」株である。それぞれのコロニーの株は、３７℃液体培養を７日行ったものである。これらの培養を行った液は、１５ｍＬ遠心チューブに深さ７ｍｍ程度の沈殿（乳酸菌）がみられた。
・乳酸菌サンプル調製
福山町で製造途中の壷酢から入手される過程に準じて取得したコロニーの株について、強酸に対する耐酸性の評価を行った。それぞれの株の試験名称は、評価結果と合わせて後述する。なお、ＥＫ－０１株は、この試験における「Ａ－８」株である。それぞれのコロニーの株は、３７℃液体培養を７日行ったものである。これらの培養を行った液は、１５ｍＬ遠心チューブに深さ７ｍｍ程度の沈殿（乳酸菌）がみられた。
【0056】
・液体培地
前述の培養に用いた液体培地は、次の組成で作製した乳酸菌評価用の培地を用いた。ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ＋Ａｇａｒ（ＢＤ－Ｇｉｆｃｏ）１０５ｇ、炭酸カルシウム７．５ｇ、ＤＷ（蒸留水（Distilled Water））１．５Ｌを混合した。オートクレーブで滅菌処理した。
前述の培養に用いた液体培地は、次の組成で作製した乳酸菌評価用の培地を用いた。ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ＋Ａｇａｒ（ＢＤ－Ｇｉｆｃｏ）１０５ｇ、炭酸カルシウム７．５ｇ、ＤＷ（蒸留水（Distilled Water））１．５Ｌを混合した。オートクレーブで滅菌処理した。
【0057】
［酸処理による生存率確認実験］（局方第１液（２ｈ））
・１０ｍＬの滅菌水に各乳酸菌サンプルを２０μＬ加えて、５０００分の１倍の希釈液を作成した。
・前記希釈液を、「日本薬局方一般試験法 試薬・試液 崩壊試験第１液／溶出試験第１液（ｐＨ１．２）」（以下、「局方第１液」）にそれぞれ２０μＬ加え、静置した。
・２時間経過後に１００μＬもしくは５００μＬを寒天培地（１００ｍｍφ）に稙菌し、３７℃で培養した（非嫌気条件）。
・１０ｍＬの滅菌水に各乳酸菌サンプルを２０μＬ加えて、５０００分の１倍の希釈液を作成した。
・前記希釈液を、「日本薬局方一般試験法 試薬・試液 崩壊試験第１液／溶出試験第１液（ｐＨ１．２）」（以下、「局方第１液」）にそれぞれ２０μＬ加え、静置した。
・２時間経過後に１００μＬもしくは５００μＬを寒天培地（１００ｍｍφ）に稙菌し、３７℃で培養した（非嫌気条件）。
【0058】
・酸処理による生存率確認実験結果：
局方第１液（２ｈ）で処理したそれぞれの株の培養液の、生存確認試験結果における「コロニー数／コントロール処理（ＤＷ）コロニー数」は以下のものであった。なお、基本的に得られた株は連番で番号を付しているが試験途中の生育状態が悪いものなど問題があるものは、生存確率確認前に排除した。
「Ａ－３」 ０／２４０、「Ａ－５」 ０／２６２、「Ａ－６」 ３／２９３、
「Ａ－７」 ０／４３８、「Ａ－８」 ３／３２３、「Ａ－９」 ０／２１５、
「Ａ－１０」 ０／２９１、「Ａ－１１」 ０／２００、「Ａ－１３」 ３／４３２、
「Ａ－１４」 ０／３２０、「Ａ－１５」 ４／２３０、「Ａ－１６」 ０／２５６、
「Ａ－１７」 ０／４５７、「Ａ－１８」 ０／４２５、「Ａ－２１」 ０／２４０、
「Ａ－２５」 ０／３５６、「Ａ－２６」 ０／１７、「Ａ－２７」 ０／２７２、
「Ａ－２８」 ０／３７７、「Ａ－３１」 ０／３６５、「Ａ－３２」 ０／２０６、
「Ａ－３３」 ０／４５１。
局方第１液（２ｈ）で処理したそれぞれの株の培養液の、生存確認試験結果における「コロニー数／コントロール処理（ＤＷ）コロニー数」は以下のものであった。なお、基本的に得られた株は連番で番号を付しているが試験途中の生育状態が悪いものなど問題があるものは、生存確率確認前に排除した。
「Ａ－３」 ０／２４０、「Ａ－５」 ０／２６２、「Ａ－６」 ３／２９３、
「Ａ－７」 ０／４３８、「Ａ－８」 ３／３２３、「Ａ－９」 ０／２１５、
「Ａ－１０」 ０／２９１、「Ａ－１１」 ０／２００、「Ａ－１３」 ３／４３２、
「Ａ－１４」 ０／３２０、「Ａ－１５」 ４／２３０、「Ａ－１６」 ０／２５６、
「Ａ－１７」 ０／４５７、「Ａ－１８」 ０／４２５、「Ａ－２１」 ０／２４０、
「Ａ－２５」 ０／３５６、「Ａ－２６」 ０／１７、「Ａ－２７」 ０／２７２、
「Ａ－２８」 ０／３７７、「Ａ－３１」 ０／３６５、「Ａ－３２」 ０／２０６、
「Ａ－３３」 ０／４５１。
【0059】
この結果から、乳酸菌は、局方第１液のような強酸で長時間処理することで、生存率は大きく下がることが多いことが確認された。しかし、本発明にかかる「ＥＫ－０１株」にかかる「Ａ－８株」のように一部の株は、生存することが確認された。
【0060】
［実施例２－２］
実施例２－１のなかで、一定の生存率が確認された「Ａ－１５」株、「Ａ－８」株について、さらに、局方第１液０．５時間処理、１時間処理による生存率を確認した。
実施例２－１のなかで、一定の生存率が確認された「Ａ－１５」株、「Ａ－８」株について、さらに、局方第１液０．５時間処理、１時間処理による生存率を確認した。
【0061】
・乳酸菌サンプル調製
「Ａ－１５」、「Ａ－８」、「Ａ－１７（ネガティブコントロール）」の株について、実施例２－１に準じて、試験用のサンプルを調製した。
「Ａ－１５」、「Ａ－８」、「Ａ－１７（ネガティブコントロール）」の株について、実施例２－１に準じて、試験用のサンプルを調製した。
【0062】
［酸処理］
・５ｍＬの局方第１液に各サンプルを３μＬ加え懸濁
・所定の時間毎に３μＬを寒天培地（１００ｍｍφ）に稙菌し、３７℃で培養した（非嫌気条件）。
・５ｍＬの局方第１液に各サンプルを３μＬ加え懸濁
・所定の時間毎に３μＬを寒天培地（１００ｍｍφ）に稙菌し、３７℃で培養した（非嫌気条件）。
【0063】
評価結果を、表１、図１に示す。Ａ－８株は、他の株よりも局方第１液で処理したときの耐酸性が安定して高いことが確認された。他の株は、耐酸性が不安定であり、一部生残したように見える場合もあったが、生存比率はＡ－８株よりも低かった。
【0064】
【表1】
【0065】
Ａ－８株は、選抜過程で、耐アルカリ性を有するものとして抽出している。また、前述の評価のように、局方第１液への暴露試験の結果、耐酸性を有することが確認されている。特に、１時間程度の暴露まで安定して一定の生存率を維持できることが確認できた。このことから、Ａ－８株は、耐酸性や耐アルカリ性を有し、かつ、増殖性にも優れている株である。
【0066】
［実施例３］［ヒトの摂取試験］
研究開始前に参加の同意が得られた２０歳以上６４歳以下の健常成人男女１１名（男性５名、女性６名）を対象に、黒酢由来乳酸菌含有食品（以下「研究食品」と表記）を１日摂取目安量（１粒に乳酸菌５００億菌）の５倍量（乳酸菌２，５００億菌）を４週間連続摂取させる研究を実施し、安全性を検討した。
研究開始前に参加の同意が得られた２０歳以上６４歳以下の健常成人男女１１名（男性５名、女性６名）を対象に、黒酢由来乳酸菌含有食品（以下「研究食品」と表記）を１日摂取目安量（１粒に乳酸菌５００億菌）の５倍量（乳酸菌２，５００億菌）を４週間連続摂取させる研究を実施し、安全性を検討した。
【0067】
試験に用いた食品の組成は、下表に示す構成のカプセル剤である。
【0068】
【表2】
【0069】
本研究食品を１日１粒、４週間連続摂取させ、有害事象の発現について調べるとともに、摂取２週目、摂取４週目、摂取終了２週目の各時点で、体重、収縮期血圧、拡張期血圧、脈拍数および臨床検査値（血液学的検査、血液生化学検査、尿検査）の測定を実施した。研究食品摂取開始後に発現した有害事象、測定値、検査値を評価項目として、安全性を評価した。
【0070】
有害事象は、１１名中３名（２７．３％）に５件発現し、頭痛１件、酩酊１件、膨満感１件、軟便１件、感冒症状（鼻汁・噴嚏）１件であった。いずれの有害事象も実施医師責任者は研究食
品との関連性はなく、臨床上問題となるものではないと判断した。また、本試験条件下において、黒酢由来乳酸菌含有食品を１日摂取目安量の５倍量を４週間連続摂取した場合、安全性に問題はないと実施医師責任者により判断された。
品との関連性はなく、臨床上問題となるものではないと判断した。また、本試験条件下において、黒酢由来乳酸菌含有食品を１日摂取目安量の５倍量を４週間連続摂取した場合、安全性に問題はないと実施医師責任者により判断された。
【0071】
試験の結果、体重に有意な変動が認められた。体重は、１１名の平均で、体重は、事前：５５．５６±７．０６ｋｇであり、摂取２週間で５５．２７±７．２６ｋｇであり、摂取４週間で５４．９４±７．４１ｋｇであった。また、摂取終了後２週目で５５．３９±７．０８ｋｇであった。
【0072】
考察：
今回の試験により、有意な体重の変動が見られたことについては、摂取したＥＫ－０１株によるプレバイオティクス作用が考えられる。腸に到達したＥＫ－０１株は、被験者の腸内細菌の餌となることにより、常在菌が活発化する。その結果、蠕動運動が促進され、腸内に蓄積した便が排出されやすくなり、宿便量の減少により体重が減少した可能性がある。また、腸内細菌には体重減少に作用する菌種が報告されている。例えば、肥満の人の腸内細菌はFirmicutes（ファーミキューテス）門に属する菌が多く、Bacteroidetes（バクテロイデーテス）門が多いことが報告されている。ＥＫ－０１株の摂取が、Firmicutes門に属する菌とBacteroidetes門に属する菌のバランスに影響を与えたことが考えられる。
今回の試験により、有意な体重の変動が見られたことについては、摂取したＥＫ－０１株によるプレバイオティクス作用が考えられる。腸に到達したＥＫ－０１株は、被験者の腸内細菌の餌となることにより、常在菌が活発化する。その結果、蠕動運動が促進され、腸内に蓄積した便が排出されやすくなり、宿便量の減少により体重が減少した可能性がある。また、腸内細菌には体重減少に作用する菌種が報告されている。例えば、肥満の人の腸内細菌はFirmicutes（ファーミキューテス）門に属する菌が多く、Bacteroidetes（バクテロイデーテス）門が多いことが報告されている。ＥＫ－０１株の摂取が、Firmicutes門に属する菌とBacteroidetes門に属する菌のバランスに影響を与えたことが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0073】
本発明は、食品や食品の製造等に利用することができ、産業上有用である。
【図1】
