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特開2024-112032合成培地の製造方法、大腸菌の培養方法、及びタンパク質、核酸、又は代謝物の合成方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024112032
(43)【公開日】2024-08-20
(54)【発明の名称】合成培地の製造方法、大腸菌の培養方法、及びタンパク質、核酸、又は代謝物の合成方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240813BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240813BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023016849
(22)【出願日】2023-02-07
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）２０２０年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、カーボンリサイクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504300088
【氏名又は名称】国立大学法人北海道国立大学機構
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100222922
【弁理士】
【氏名又は名称】和田 朋子
(74)【代理人】
【識別番号】100202913
【弁理士】
【氏名又は名称】武山 敦史
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(72)【発明者】
【氏名】小西 正朗
(72)【発明者】
【氏名】中島 拓都
(72)【発明者】
【氏名】渡辺 一樹
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064CD01
4B064CD04
4B065AA26X
4B065BB01
4B065CA24
(57)【要約】
【課題】未知の成分を含む従来の培地と同等以上の組換えタンパク質合成能を有する合成培地の製造方法、大腸菌の培養方法、及びタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法を提供する。
【解決手段】合成培地の製造方法は、少なくとも１つの成分が未知である微生物培養用の培地又は培地に含まれる少なくとも１つの成分が未知である組成物における測定対象成分の濃度を測定する測定ステップと、測定ステップで測定した濃度に基づいて、少なくとも測定対象成分を混合して調製物を得る混合ステップと、を含む。
【選択図】図１
【解決手段】合成培地の製造方法は、少なくとも１つの成分が未知である微生物培養用の培地又は培地に含まれる少なくとも１つの成分が未知である組成物における測定対象成分の濃度を測定する測定ステップと、測定ステップで測定した濃度に基づいて、少なくとも測定対象成分を混合して調製物を得る混合ステップと、を含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの成分が未知である微生物培養用の培地又は前記培地に含まれる少なくとも１つの成分が未知である組成物における測定対象成分の濃度を測定する測定ステップと、
前記測定ステップで測定した濃度に基づいて、少なくとも前記測定対象成分を混合して調製物を得る混合ステップと、
を含み、
前記測定対象成分は、
アデニン、アデノシン、クエン酸、シトルリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、フマル酸、ガンマアミノ酪酸、グルコース、グリセロール、イソクエン酸、乳酸、オルニチン、リンゴ酸、マルトース、ｍｙｏ－イノシトール、リン酸、ソルビトール、コハク酸、スクロース、トレハロース、トリプトファン、ウラシル、尿素、キサンチン、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン、リボフラビン、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、システイン、アルミニウム、ホウ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル及び鉛である、
合成培地の製造方法。
前記測定ステップで測定した濃度に基づいて、少なくとも前記測定対象成分を混合して調製物を得る混合ステップと、
を含み、
前記測定対象成分は、
アデニン、アデノシン、クエン酸、シトルリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、フマル酸、ガンマアミノ酪酸、グルコース、グリセロール、イソクエン酸、乳酸、オルニチン、リンゴ酸、マルトース、ｍｙｏ－イノシトール、リン酸、ソルビトール、コハク酸、スクロース、トレハロース、トリプトファン、ウラシル、尿素、キサンチン、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン、リボフラビン、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、システイン、アルミニウム、ホウ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル及び鉛である、
合成培地の製造方法。
【請求項2】
前記調製物と緩衝成分を混合するステップをさらに含む、
請求項１に記載の合成培地の製造方法。
請求項１に記載の合成培地の製造方法。
【請求項3】
前記微生物培養用の培地は、大腸菌培養用の培地である、
請求項１又は２に記載の合成培地の製造方法。
請求項１又は２に記載の合成培地の製造方法。
【請求項4】
請求項３に記載の合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む、
大腸菌の培養方法。
大腸菌の培養方法。
【請求項5】
請求項３に記載の合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む、
タンパク質、核酸又は代謝物の合成方法。
タンパク質、核酸又は代謝物の合成方法。
【請求項6】
前記大腸菌からタンパク質、核酸又は代謝物を得る取得ステップをさらに含む、
請求項５に記載のタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法。
請求項５に記載のタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、合成培地の製造方法、大腸菌の培養方法、及びタンパク質、核酸、又は代謝物の合成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物を培養する際に使用される培地には、一般的に、糖類及び塩類の他に、トリプトン及びペプトン等のタンパク質分解物、及び酵母又は獣肉等の生物由来の抽出物等含まれる。例えば、大腸菌の培養に使用されるＬＢ培地及びＳＯＣ培地等には、トリプトン及び酵母抽出物が含まれる。これらのタンパク質分解物及び抽出物等は、すべての成分が明らかなわけではなく、未知の成分を含む組成物である。また、これらは天然物であることからロット又は製造元による成分の差が大きい。
【0003】
一般的に、培地に含まれるそれらの組成物は、培地に含まれる量においては細菌の増殖にそれほど悪影響を及ぼさないと考えられている。しかし、遺伝子治療用の核酸又は組換えタンパク質ワクチン等の生産等の医薬の分野においては、未知成分によるリスクが指摘されている。また、非特許文献１には、培地に含まれる天然物の種類又は量により、細菌の増殖、タンパク質の糖化及び突然変異頻度等が異なることが記載されている。さらに、ロット間又はブランド間での成分の差による増殖能及びタンパク質産生能等の変動が大きいことが指摘されている。
【0004】
未知の成分を含まない合成培地であれば、含まれる全ての成分の種類及び量が一定であるため、これらの問題を解決することができる。特許文献１では、特定のアミノ酸を含む合成培地が提案されている。特許文献２では、リン酸の濃度を限定した合成培地が提案されている。また、組成は明らかにされていないが、高性能とされる合成培地が市販されている（Ｂａｃｔｏ ＣＤ Ｓｕｐｒｅｍｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＰＭ）（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開平１－５１０７８号公報
【特許文献2】特開昭６３－１５７９７４号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Karin E. Kram and Steven E. Finkel (2015) Rich Medium Composition Affects Escherichia coli Survival, Glycation, and Mutation Frequency during Long-Term Batch Culture, Applied Environmental Microbiology, 81, 4442-4450.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記特許文献１及び２に記載の合成培地、又は市販の上記合成培地を使用することにより、増殖能及びタンパク質産生能等のばらつきを小さくすることができる。しかし、これらの合成培地は、いずれも従来の天然成分を含む培地に比べて組換えタンパク質等の産生能が劣るため、組換えタンパク質等の産生におけるコストが増大するという問題があった。
【0008】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、未知の成分を含む従来の培地と同等以上の組換えタンパク質合成能を有する合成培地の製造方法、大腸菌の培養方法、及びタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の第１の観点に係る合成培地の製造方法は、
少なくとも１つの成分が未知である微生物培養用の培地又は前記培地に含まれる少なくとも１つの成分が未知である組成物における測定対象成分の濃度を測定する測定ステップと、
前記測定ステップで測定した濃度に基づいて、少なくとも前記測定対象成分を混合して調製物を得る混合ステップと、
を含み、
前記測定対象成分は、
アデニン、アデノシン、クエン酸、シトルリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、フマル酸、ガンマアミノ酪酸、グルコース、グリセロール、イソクエン酸、乳酸、オルニチン、リンゴ酸、マルトース、ｍｙｏ－イノシトール、リン酸、ソルビトール、コハク酸、スクロース、トレハロース、トリプトファン、ウラシル、尿素、キサンチン、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン、リボフラビン、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、システイン、アルミニウム、ホウ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル及び鉛である。
少なくとも１つの成分が未知である微生物培養用の培地又は前記培地に含まれる少なくとも１つの成分が未知である組成物における測定対象成分の濃度を測定する測定ステップと、
前記測定ステップで測定した濃度に基づいて、少なくとも前記測定対象成分を混合して調製物を得る混合ステップと、
を含み、
前記測定対象成分は、
アデニン、アデノシン、クエン酸、シトルリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、フマル酸、ガンマアミノ酪酸、グルコース、グリセロール、イソクエン酸、乳酸、オルニチン、リンゴ酸、マルトース、ｍｙｏ－イノシトール、リン酸、ソルビトール、コハク酸、スクロース、トレハロース、トリプトファン、ウラシル、尿素、キサンチン、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン、リボフラビン、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、システイン、アルミニウム、ホウ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル及び鉛である。
【0010】
この場合、上記本発明の第１の観点に係る合成培地の製造方法は、
前記調製物と緩衝成分を混合するステップをさらに含む、
こととしてもよい。
前記調製物と緩衝成分を混合するステップをさらに含む、
こととしてもよい。
【0011】
また、前記微生物培養用の培地は、大腸菌培養用の培地である、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
【0012】
本発明の第２の観点に係る大腸菌の培養方法は、
上記本発明の第１の観点に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。
上記本発明の第１の観点に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。
【0013】
本発明の第３の観点に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法は、
上記本発明の第１の観点に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。
上記本発明の第１の観点に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。
【0014】
この場合、上記本発明の第３の観点に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法は、
前記大腸菌からタンパク質、核酸又は代謝物を得る取得ステップをさらに含む、
こととしてもよい。
前記大腸菌からタンパク質、核酸又は代謝物を得る取得ステップをさらに含む、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、未知の成分を含む従来の培地と同等以上の組換えタンパク質合成能を有する合成培地を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】実施例３におけるＧＦＰ由来蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
【0018】
（実施の形態１）
本実施の形態に係る合成培地の製造方法は、測定ステップ及び混合ステップを含む。測定ステップでは、少なくとも１つの成分が未知である微生物培養用の培地又は当該培地に含まれる少なくとも１つの成分が未知である組成物における測定対象成分の濃度を測定する。
本実施の形態に係る合成培地の製造方法は、測定ステップ及び混合ステップを含む。測定ステップでは、少なくとも１つの成分が未知である微生物培養用の培地又は当該培地に含まれる少なくとも１つの成分が未知である組成物における測定対象成分の濃度を測定する。
【0019】
「微生物培養用の培地」とは一般的に微生物の培養に用いられている培地を指し、例として、ＬＢ培地、ＴＢ培地、ＳＯＢ培地及びＳＯＣ培地等の大腸菌培養用の培地、ＹＰＤ培地及びＹＥＰ培地等の酵母培養用の培地、並びにＭＲＳ培地及びＭ１７等の乳酸菌培養用の培地等が挙げられる。これらの培地には成分が未知である組成物が含まれるため、培地全体としても成分が明らかでない。
【0020】
「組成物」は、例えば、酵母抽出物、獣肉抽出物及び麦芽抽出物等の生物由来の抽出物、ペプトン、トリプトン、カゼイン及びカザミノ酸等のタンパク質の加水分解物、及びコーンスティープリカー等が挙げられる。組成物は、少なくとも１つの成分が未知である。
【0021】
測定ステップでは、上記の培地又は組成物の成分のうち、以下に列挙する測定対象成分の濃度を測定する。測定ステップでは、培地自体を分析して測定対象成分を測定してもよいし、組成物を分析して測定対象成分を測定してもよい。測定対象成分は、アデニン、アデノシン、クエン酸、シトルリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、フマル酸、ガンマアミノ酪酸、グルコース、グリセロール、イソクエン酸、乳酸、オルニチン、リンゴ酸、マルトース、ｍｙｏ－イノシトール、リン酸、ソルビトール、コハク酸、スクロース、トレハロース、トリプトファン、ウラシル、尿素、キサンチン、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン、リボフラビン、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、システイン、アルミニウム、ホウ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル及び鉛である。
【0022】
測定対象成分の分析には、分析化学の分野で知られる任意の分析方法を用いてもよい。分析方法としては、糖、糖アルコール、有機酸、アミノ酸、無機イオン及び重金属類等を網羅的かつ定量的に分析できるのが好ましく、例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析、イオンクロマトグラフィー分析、アミノ酸分析、誘導結合プラズマ発光分析等が挙げられる。これらの分析方法を組み合わせて使用するため、同等品質以上の定量分析データを得られる分析装置を組み合わせて使用するのが好ましい。
【0023】
測定ステップでは、測定対象成分に含まれない任意の成分の濃度をさらに測定してもよい。
【0024】
混合ステップでは、測定ステップで測定した濃度に基づいて、少なくとも測定対象成分を混合して調製物を得る。測定ステップで培地自体を分析して測定対象成分の濃度を測定した場合は、各測定対象成分が測定した濃度の±１０％以内、好ましくは±５％以内になるように、各測定対象成分を混合する。
【0025】
測定ステップで成分が未知の組成物を分析して測定対象成分の濃度を測定した場合は、測定値と培地における組成物の含有量から培地における測定対象成分の濃度を算出し、各測定対象成分が算出した濃度の±１０％以内、好ましくは±５％以内になるように各測定対象成分を混合する。
【0026】
混合ステップで混合する成分のうち、イオン性物質については、対となる陽イオンおよび陰イオンの組合せを任意に変更し、測定ステップにおける測定値により近い濃度となるように組成を設計することが望ましい。イオン性無機塩の場合、陽イオン濃度を一致させることを基本とし、塩化物、もしくは硫酸塩を使用することが望ましい。硫化物イオンは硫黄源として重要であり、測定ステップにおける硫化物イオンの測定値と対応するように添加量を決定するのが好ましい。
【0027】
混合ステップで混合する成分の最適化には、市販のリレーショナルデータベースソフトを用いてもよい。
【0028】
混合ステップでは、微生物の増殖を有意に阻害しない限り、測定対象成分の他に任意の成分をさらに混合してもよい。混合ステップで混合し得る測定対象成分以外の成分としては、例えば、グルコン酸等の測定対象成分以外の炭素源、グルタミン及びアスパラギン等の測定対象成分以外のアミノ酸、塩化物イオン等の測定対象成分以外のイオン等が挙げられる。塩化物イオン及びナトリウムイオン等の測定対象成分に含まれない成分は、測定ステップにおいて濃度を測定した場合であっても、測定値と異なる濃度になってもよい。測定対象成分以外の成分を混合する場合は、他の文献等を参照してそれらの成分の濃度を決定してもよい。
【0029】
混合ステップでは、９５％以上、好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の純度の化合物のみを用いる。化合物は、他の物質から調製して精製してもよいし、試薬として販売されているものを使用してもよい。化合物は、無水物、水和物及び塩形態等のいずれを使用してもよい。
【0030】
混合ステップの後に、混合ステップで得られた調製物と緩衝成分を混合するステップをさらに含んでもよい。緩衝成分は、培地のｐＨを一定に保つ役割を果たす。目的の微生物の増殖に最適なｐＨに保つことにより、増殖能及びタンパク質等の産生能の向上が期待できる。緩衝成分は、生化学の分野で知られる任意の緩衝成分を使用してもよく、例えば、リン酸バッファー、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等が挙げられる。緩衝成分は、固体で混合して培地に溶解させてもよいし、液体で添加してもよい。混合する緩衝成分の濃度は特に限定されないが、例えば、終濃度が１０～５０ｍＭとなるように混合する。
【0031】
本実施の形態に係る合成培地の製造方法により製造される合成培地の水素イオン濃度は、培養する微生物に応じて最適な範囲にしてもよい。例えば大腸菌を培養する場合、ｐＨ６．０～７．５、好ましくはｐＨ６．５～７，０に調整してもよい。水素イオン濃度の調整には、水酸化ナトリウム及び塩酸等の任意の酸及び塩基を用いてもよい。
【0032】
本実施の形態に係る合成培地の製造方法により製造される合成培地は、オートクレーブ滅菌及びフィルター滅菌等の任意の方法で滅菌することができる。フィルター滅菌の場合は、有効径２２μｍ以下のフィルターで滅菌処理するのが好ましい。また、合成培地は、液体培地として使用してもよいし、寒天を加えて固体の寒天培地としてもよい。
【0033】
本実施の形態に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて、測定ステップで測定した培地が対象とする微生物を培養することができる。例えば、測定ステップにおいて大腸菌培養用のＳＯＣ培地を用いた場合には、製造された合成培地を用いて大腸菌を培養することができる。
【0034】
（実施の形態２）
本実施の形態に係る大腸菌の培養方法は、実施の形態１に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。
本実施の形態に係る大腸菌の培養方法は、実施の形態１に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。
【0035】
培養ステップでは、実施の形態１に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養すること以外に、当分野で知られる任意の培養条件を使用することができる。大腸菌の培養温度は通常３０～３７℃とされるが、必要に応じて大腸菌が生育し得る限り任意の温度とすることができる。大腸菌の培養温度は、例えば、３４～３７℃としてもよい。
【0036】
合成培地に寒天を添加した寒天培地を用いる場合は、静置培養によりコロニーを形成させる。合成培地を液体で用いる場合は、静置培養及び振とう培養のいずれの培養方法を用いてもよい。１～１０ｍＬ程度の小容量の合成培地で大腸菌を前培養した後、５０～１０００ｍＬ程度の大容量の合成培地で本培養してもよい。大腸菌の培養時間は、通常、６～２４時間程度であるが、培養の目的及び他の条件を考慮して適宜設定してもよい。例えば、大腸菌の培養時間は、１４～２０時間としてもよい。
【0037】
培養する大腸菌は、ＤＨ５α及びＢＬ２１等の任意の大腸菌株を用いることができる。また、大腸菌は、塩化カルシウム法及びエレクトロポレーション法等の任意の方法により任意のプラスミド等を導入した形質転換体であってもよい。大腸菌が形質転換体である場合、導入したプラスミド等が有する耐性遺伝子の種類に応じて、アンピシリン、カナマイシン又はハイグロマイシン等の任意の抗生物質を合成培地に添加してもよい。タンパク質発現のために、任意の遺伝子発現誘導物質を加えてもよい。遺伝子発現誘導物質の例としてイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等が挙げられる。
【0038】
（実施の形態３）
本実施の形態に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法は、実施の形態１に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。培養ステップでは、実施の形態２に係る培養方法と同様の培養方法により大腸菌が培養される。
本実施の形態に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法は、実施の形態１に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地を用いて大腸菌を培養する培養ステップを含む。培養ステップでは、実施の形態２に係る培養方法と同様の培養方法により大腸菌が培養される。
【0039】
目的のタンパク質、核酸又は代謝物は、大腸菌由来のものであってもよいし、大腸菌に導入したプラスミド等に由来するものであってもよい。目的のタンパク質、核酸又は代謝物がプラスミド等に由来するものである場合、培養ステップで培養される大腸菌は、目的物を産生するためのＤＮＡ配列を有するプラスミド等を導入した形質転換体である。
【0040】
例えば目的物が組換えタンパク質である場合、培養ステップで培養する形質転換大腸菌は以下のように作製される。まず、公知の方法により、プラスミド又はファージ等のベクターに目的のタンパク質をコードする遺伝子を連結して発現ベクターを作製する。発現ベクター上には、転写プロモーター及びターミネーター等、目的タンパク質遺伝子が適切に転写及び翻訳されるために必要な配列を適宜配置することが望ましい。このようにして作製した発現ベクターを大腸菌に導入するが、導入方法は特に限定されず、例えば、塩化カルシウム法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【0041】
本実施の形態に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法によれば、市販の合成培地で培養した場合と比較して、より多くのタンパク質、核酸又は代謝物を大腸菌内で合成することができる。また、実施の形態１の測定ステップにおいて測定した培地で大腸菌を培養した場合と比較して、同等以上の目的タンパク質、核酸又は代謝物を大腸菌内で合成することができる。産生された目的のタンパク質、核酸又は代謝物は、その目的物の特性に応じて、ウェスタンブロッティング、発光・蛍光測定、制限酵素処理又はＰＣＲ等の生化学的な手法、及び分析化学的な手法を用いて、定性的又は定量的に確認することができる。
【0042】
本実施の形態に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法は、培養ステップで培養した大腸菌からタンパク質、核酸又は代謝物を得る取得ステップをさらに含んでもよい。取得ステップでは、当分野で知られる任意の方法を用いて、当該大腸菌の菌体から目的のタンパク質、核酸又は代謝物を取得することができる。目的物がタンパク質である場合、加熱処理、超音波破砕、凍結融解による破砕、リソソームなどの酵素による溶解等により菌体を処理し、大腸菌由来の不純物を除去することで目的のタンパク質を得ることができる。さらに、例えばクロマトグラフィーを用いて精製工程を行ってもよい。例えば、最初の精製では、粗原料又は精澄化溶液から目的タンパク質の１回目の精製を行う。次の中間精製では、ＤＮＡ、ウイルス及びエンドトキシン等の主要な不純物の殆どを除去する。最後の最終精製では、微量の不純物を除去する工程を行う。その後、公知の方法を使用して目的タンパク質の濃縮を行ってもよい。
【0043】
目的物が核酸である場合、核酸の種類応じてアルカリ法及びフェノール／クロロホルム法等の既知の方法、又は市販のキット等を使用して、プラスミドＤＮＡ、大腸菌ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ等の目的の核酸を得ることができる。目的に応じて、得られた核酸をエタノール沈殿、ＰＥＧ沈殿、又は塩化セシウム密度勾配超遠心法等により、さらに精製及び濃縮を行ってもよい。
【0044】
別の実施の形態では、実施の形態１に係る合成培地の製造方法により製造された合成培地が提供される。
【0045】
別の実施の形態では、実施の形態３に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法により合成されたタンパク質、核酸又は代謝物が提供される。
【0046】
別の実施の形態では、実施の形態３に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法により合成されたタンパク質、核酸又は代謝物を含む医療用組成物又は医薬が提供される。
【0047】
別の実施の形態では、実施の形態３に係るタンパク質、核酸又は代謝物の合成方法により合成されたタンパク質、核酸又は代謝物の使用が提供される。
【実施例0048】
（実施例１．ＳＯＣ培地の分析）
大腸菌での組換えタンパク質産生に多用されるＳＯＣ培地の組成のうち、酵母抽出物及びトリプトンは成分が未知の組成物である。以下のように、酵母抽出物（ＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＴｈｉｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））及びトリプトン（ＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ（ＴｈｉｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））に含まれる成分の濃度を測定した。
大腸菌での組換えタンパク質産生に多用されるＳＯＣ培地の組成のうち、酵母抽出物及びトリプトンは成分が未知の組成物である。以下のように、酵母抽出物（ＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＴｈｉｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））及びトリプトン（ＢＤ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ（ＴｈｉｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））に含まれる成分の濃度を測定した。
【0049】
［ガスクロマトグラフィー質量分析］
分析する組成物を、１０ｇ／Ｌになるように水に溶解し、分析用サンプルを調製した。さらに１ｇ／Ｌに希釈した分析用サンプル１００μＬに、２０ｍｇ／ｍＬリビトール６０μＬ及び抽出溶媒（メタノール：クロロホルム：水＝５：２：２）９００μＬを加えて抽出した。抽出サンプルは、文献（Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ．，Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｍ．，Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１２８（４），４６８－４７４，２０１９．）に記載の方法でトリメチルシリル化したものを用いた。分析にはＧＣ４５０－３００ＭＳシステム（Ｖａｒｉａｎ社製）を使用した。キャリアガスにはヘリウムを使用し、流速は２．２５ｍＬ／分とした。試料の注入量は１μＬ、スプリット比は２５：１とした。オーブン温度は、初期温度６０℃で１分間保持したのち、１０℃／分で２１０℃まで上昇させた。２１０℃から５℃／分で２３０℃まで上昇させたのち、１５℃／分で３２５℃まで上昇させ、１０分間保持し、分析時間は３６．３分間とした。注入口、イオン源、ＭＳトランスファーラインの温度はそれぞれ、２５０℃、２８０℃、２８０℃とした。多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）には、公開されているデータ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ－ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｐｈｐ？ｉｄ＝１００４６９６＃ＴＱよりダウンロード）を使用した。本分析により定量分析される成分は、アデニン、アデノシン、クエン酸、シトルリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、フマル酸、ガンマアミノ酪酸、グルコース、グリセロール、イソクエン酸、乳酸、オルニチン、リンゴ酸、マルトース、ｍｙｏ－イノシトール、リン酸、ソルビトール、コハク酸、スクロース、トレハロース、トリプトファン、ウラシル、尿素及びキサンチンである。
分析する組成物を、１０ｇ／Ｌになるように水に溶解し、分析用サンプルを調製した。さらに１ｇ／Ｌに希釈した分析用サンプル１００μＬに、２０ｍｇ／ｍＬリビトール６０μＬ及び抽出溶媒（メタノール：クロロホルム：水＝５：２：２）９００μＬを加えて抽出した。抽出サンプルは、文献（Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｓ．，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ．，Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｍ．，Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１２８（４），４６８－４７４，２０１９．）に記載の方法でトリメチルシリル化したものを用いた。分析にはＧＣ４５０－３００ＭＳシステム（Ｖａｒｉａｎ社製）を使用した。キャリアガスにはヘリウムを使用し、流速は２．２５ｍＬ／分とした。試料の注入量は１μＬ、スプリット比は２５：１とした。オーブン温度は、初期温度６０℃で１分間保持したのち、１０℃／分で２１０℃まで上昇させた。２１０℃から５℃／分で２３０℃まで上昇させたのち、１５℃／分で３２５℃まで上昇させ、１０分間保持し、分析時間は３６．３分間とした。注入口、イオン源、ＭＳトランスファーラインの温度はそれぞれ、２５０℃、２８０℃、２８０℃とした。多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）には、公開されているデータ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ－ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｐｈｐ？ｉｄ＝１００４６９６＃ＴＱよりダウンロード）を使用した。本分析により定量分析される成分は、アデニン、アデノシン、クエン酸、シトルリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、フマル酸、ガンマアミノ酪酸、グルコース、グリセロール、イソクエン酸、乳酸、オルニチン、リンゴ酸、マルトース、ｍｙｏ－イノシトール、リン酸、ソルビトール、コハク酸、スクロース、トレハロース、トリプトファン、ウラシル、尿素及びキサンチンである。
【0050】
［液体クロマトグラフィー質量分析］
液体クロマトグラフィー質量分析では、前述のガスクロマトグラフィー質量分析で抽出されたものと同様のサンプルを用いた。標準物質には２０μｇ／ｍＬピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）一ナトリウム塩を使用した。Ｗａｔｅｒｓ（商標）ｅ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（日本ウォーターズ社製）及びＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＱＤａ検出機（日本ウォーターズ社製）を使用し、カラムにはＳｈｏｄｅｘ（登録商標）ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ－５０ ２Ｄ（２．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）（昭和電工社製）を使用した。試料の注入量は５μＬとした。溶離液Ａには０．５％アンモニア水溶液を使用し、溶離液Ｂにはアセトニトリルを使用し、流速は０．２ｍＬ／分でグラジエントモードにて分析した。グラジエントは、溶離液Ｂの初期割合を８０％として２分間保持し、１０分間かけて１０％まで下降させた。１０％で３分間保持し、５分間かけて８０％まで上昇させ、分析時間は２０分間とした。試料のイオン化にはエレクトロイオンスプレー化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を使用し、プローブ温度は３００℃とした。本分析により定量分析される成分は、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン及びリボフラビンである。
液体クロマトグラフィー質量分析では、前述のガスクロマトグラフィー質量分析で抽出されたものと同様のサンプルを用いた。標準物質には２０μｇ／ｍＬピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）一ナトリウム塩を使用した。Ｗａｔｅｒｓ（商標）ｅ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（日本ウォーターズ社製）及びＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＱＤａ検出機（日本ウォーターズ社製）を使用し、カラムにはＳｈｏｄｅｘ（登録商標）ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ－５０ ２Ｄ（２．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ）（昭和電工社製）を使用した。試料の注入量は５μＬとした。溶離液Ａには０．５％アンモニア水溶液を使用し、溶離液Ｂにはアセトニトリルを使用し、流速は０．２ｍＬ／分でグラジエントモードにて分析した。グラジエントは、溶離液Ｂの初期割合を８０％として２分間保持し、１０分間かけて１０％まで下降させた。１０％で３分間保持し、５分間かけて８０％まで上昇させ、分析時間は２０分間とした。試料のイオン化にはエレクトロイオンスプレー化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を使用し、プローブ温度は３００℃とした。本分析により定量分析される成分は、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン及びリボフラビンである。
【0051】
［イオンクロマトグラフィー分析］
１０ｇ／Ｌに調製した前述の分析用サンプルを０．２２μｍのフィルターでろ過後、１００倍から１０００倍希釈したサンプルを分析した。イオンクロマトグラフィー・システム ＩＣ－２０１０（東ソー社製）を使用し、カラムは、カチオン分析にはＴＳＫｇｅｌ ＩＣ－Ｃａｔｉｏｎ Ｉ／ＩＩ ＨＲ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１０ｃｍ）、アニオン分析にはＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＩＣ－ＡＺ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５ｃｍ）を使用した。両分析において、注入量は３０μＬ、カラム温度は４０℃、流量は０．８ｍＬ／分とした。使用した溶離液について、カチオン分析では０．２Ｍ硝酸を使用し、アニオン分析では１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウムと３．２ｍＭ炭酸ナトリウムを使用した。またアニオン分析ではサプレッサーを用いた。本分析により定量分析される成分は、塩化物イオン、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンである。
１０ｇ／Ｌに調製した前述の分析用サンプルを０．２２μｍのフィルターでろ過後、１００倍から１０００倍希釈したサンプルを分析した。イオンクロマトグラフィー・システム ＩＣ－２０１０（東ソー社製）を使用し、カラムは、カチオン分析にはＴＳＫｇｅｌ ＩＣ－Ｃａｔｉｏｎ Ｉ／ＩＩ ＨＲ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１０ｃｍ）、アニオン分析にはＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＩＣ－ＡＺ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５ｃｍ）を使用した。両分析において、注入量は３０μＬ、カラム温度は４０℃、流量は０．８ｍＬ／分とした。使用した溶離液について、カチオン分析では０．２Ｍ硝酸を使用し、アニオン分析では１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウムと３．２ｍＭ炭酸ナトリウムを使用した。またアニオン分析ではサプレッサーを用いた。本分析により定量分析される成分は、塩化物イオン、亜硝酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンである。
【0052】
［アミノ酸分析］
１０ｇ／Ｌに調製した前述の分析用サンプル１０μＬをガラス試料管Ｓに入れ、デシケーターで乾固した。乾固したサンプルに低沸点塩酸（２０％ｗ／ｖ ＨＣｌ）２００μＬ加え、減圧封菅した。サンプルを乾熱機で１１０℃、２０時間反応させたのち、遠心エバポレーターで乾固した。乾固したサンプルに超純水２００μＬ加えて溶解し、分析に供した。Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）及びＲＦ－１０ＡＸＬ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を使用してポストカラム法にて分析した。カラムはＳｈｉｍ－ｐａｃｋ Ａｍｉｎｏ－Ｎａ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ）を使用し、アンモニアトラップカラムにはＳｈｉｍ－ｐａｃｋ ＩＳＣ－３０／Ｓ０５０４ Ｎｓ（４．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ）を使用した。注入量は１０μＬとし、カラム温度および試料の反応温度は６０℃とした。移動相にはＡｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ Ｋｉｔ（Ｎａ Ｔｙｐｅ）（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を使用し、流速は０．５ｍＬ／分とした。反応液としてＡｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ａ及びＢ）（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を使用し、流速は０．２ｍＬ／分で使用した。蛍光検出機の励起光は３５０ｎｍ、蛍光は４５０ｎｍとした。本分析により定量分析される成分は、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン及びシステインである。
１０ｇ／Ｌに調製した前述の分析用サンプル１０μＬをガラス試料管Ｓに入れ、デシケーターで乾固した。乾固したサンプルに低沸点塩酸（２０％ｗ／ｖ ＨＣｌ）２００μＬ加え、減圧封菅した。サンプルを乾熱機で１１０℃、２０時間反応させたのち、遠心エバポレーターで乾固した。乾固したサンプルに超純水２００μＬ加えて溶解し、分析に供した。Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）及びＲＦ－１０ＡＸＬ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を使用してポストカラム法にて分析した。カラムはＳｈｉｍ－ｐａｃｋ Ａｍｉｎｏ－Ｎａ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１００ｍｍ）を使用し、アンモニアトラップカラムにはＳｈｉｍ－ｐａｃｋ ＩＳＣ－３０／Ｓ０５０４ Ｎｓ（４．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ）を使用した。注入量は１０μＬとし、カラム温度および試料の反応温度は６０℃とした。移動相にはＡｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｏｂｉｌｅ Ｐｈａｓｅ Ｋｉｔ（Ｎａ Ｔｙｐｅ）（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を使用し、流速は０．５ｍＬ／分とした。反応液としてＡｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ａ及びＢ）（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を使用し、流速は０．２ｍＬ／分で使用した。蛍光検出機の励起光は３５０ｎｍ、蛍光は４５０ｎｍとした。本分析により定量分析される成分は、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン及びシステインである。
【0053】
［誘導結合プラズマ発光分析］
１０ｇ／Ｌに調製した前述の分析用サンプルを０．１Ｍ ＨＮＯ３で１ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌに希釈し、分析に供した。シーケンシャル型ＩＣＰ発光分光分析装置ＳＰＳ３１００ＨＶ ＵＶ（エスアイアイ・ナノテクノロジー社製）にて分析した。本分析により定量分析される成分は、アルミニウム（３９６．１５２）、ホウ素（２４９．７７３）、カルシウム（３９３．３６６）、カドミウム（２１４．５０６）、クロム（２０５．６１８）、銅（３２４．７５４）、鉄（２３８．２７７）、マンガン（２５７．６１０）、亜鉛（２１３．９２４）、コバルト（２２８．６８７）、ニッケル（２２１．７１６）及び鉛（２２０．４２２）である。括弧内は分光器の検出波長を示す。
１０ｇ／Ｌに調製した前述の分析用サンプルを０．１Ｍ ＨＮＯ３で１ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌに希釈し、分析に供した。シーケンシャル型ＩＣＰ発光分光分析装置ＳＰＳ３１００ＨＶ ＵＶ（エスアイアイ・ナノテクノロジー社製）にて分析した。本分析により定量分析される成分は、アルミニウム（３９６．１５２）、ホウ素（２４９．７７３）、カルシウム（３９３．３６６）、カドミウム（２１４．５０６）、クロム（２０５．６１８）、銅（３２４．７５４）、鉄（２３８．２７７）、マンガン（２５７．６１０）、亜鉛（２１３．９２４）、コバルト（２２８．６８７）、ニッケル（２２１．７１６）及び鉛（２２０．４２２）である。括弧内は分光器の検出波長を示す。
【0054】
以上の各分析で定量された組成を表１に示す。
【0055】
【表1-1】
【表1-2】
【0056】
（実施例２．合成ＳＯＣ培地の調製）
基準となるＳＯＣ培地の組成は、Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭである。このうち、Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅとＢａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔを、実施例１で測定した組成に置き換え、合成ＳＯＣ培地を調製した。
基準となるＳＯＣ培地の組成は、Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭである。このうち、Ｂａｃｔｏ ｔｒｙｐｔｏｎｅとＢａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔを、実施例１で測定した組成に置き換え、合成ＳＯＣ培地を調製した。
【0057】
そのまま置き換えることのできないイオンについては、測定ステップでの定量値から各イオンのモル濃度を算出し、各イオンの濃度が合致するように添加物量を決定した。まず、ＮＯ３
－の定量値とＫＮＯ３の分子量から、ＮＯ３
－のモル濃度に対応するＫＮＯ３の添加量を決定した。Ｋ＋の定量値からＫＮＯ３で添加したモル濃度分を差し引いた残りはＫＣｌを添加した。ＳＯ４
２＋の定量値とＭｇＳＯ４の分子量から、ＳＯ４
２＋のモル濃度に対応するＫＮＯ３の添加量を決定した。Ｍｇ２＋の定量値からＭｇＳＯ４で添加したモル濃度分を差し引いた残りはＭｇＣｌを添加した。Ｎａ＋、ＮＨ４
－、Ｋ＋及びＣａ２＋イオンは塩化物として添加し、モル濃度を合わせた。リン酸イオンはＰＯ４の定量値とＨ３ＰＯ４の定量値があるため，ＰＯ４モル濃度の合算値を算出し、Ｈ３ＰＯ４の添加量を合わせた。
【0058】
定量できなかったグルタミン及びアスパラギンは、ＢＤ Ｂｉｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓ テクニカルマニュアル第３版（日本ベクトン・ディッキンソン社、平成１９年）に記載の濃度を参考に添加量を決定した。また、定量できなかったミネラル成分は、文献（Ｂaｃｋｌｕｎｄ Ｅ．，Ｒｅｅｋｓ Ｄ．，Ｍａｒｋｌａｎｄ Ｋ．，Ｗｅｉｒ Ｎ．， Ｂｏｗｅｒｉｎｇ Ｌ．Ｌａｒｓｓｏｎ Ｇ（２００８）Ｆｅｄｂａｔｃｈ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３５（４）：３５８－３６５．）を参考に添加量を決定した。調合した培地はＮａＯＨを用いてｐＨが７．０になるように調整された後、０．２２μｍの有効径を持つフィルターでろ過滅菌された。
【0059】
本実施例で調製した合成ＳＯＣ培地の組成を表２に示す。
【0060】
【表2-1】
【表2-2】
【0061】
（実施例３．合成ＳＯＣ培地の有効性の検証）
大腸菌でのタンパク質産生における、実施例２で調製した合成ＳＯＣ培地の有効性を評価した。供試大腸菌は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）にｐＲＳＥＴｅｍＧＦＰを導入したものを用いた。培地は、通常のＳＯＣ培地、市販の大腸菌用完全合成培地（Ｂａｃｔｏ ＣＤ Ｓｕｐｒｅｍｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＰＭ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製（以下、「ＣＤ」ともいう））、実施例２で調製した合成ＳＯＣ培地、及び緩衝成分である３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を添加した合成ＳＯＣ培地を用いた。各培地で培養した大腸菌におけるタンパク質産生を、ディープウェル培養法で評価した。２ｍｌ容量の９６穴ディープウェルプレートにクロラムフェニコール３５μｇ／ｍＬ及びアンピシリン５０μ／ｍＬとなるように加えた培地を１ｍｌ添加し、ディープウェルマキシマイザーを用いて、１，２００ｒｐｍ、３７℃の条件で培養した。培養開始２時間後１ｍＭのＩＰＴＧを添加しＧＦＰ発現を誘導した。培養８時間後のＧＦＰ由来の蛍光を、蛍光プレートリーダーを用いて評価した。蛍光検出の際の励起波長は４８７ｎｍ、蛍光検出波長は５０９ｎｍとした。
大腸菌でのタンパク質産生における、実施例２で調製した合成ＳＯＣ培地の有効性を評価した。供試大腸菌は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）にｐＲＳＥＴｅｍＧＦＰを導入したものを用いた。培地は、通常のＳＯＣ培地、市販の大腸菌用完全合成培地（Ｂａｃｔｏ ＣＤ Ｓｕｐｒｅｍｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＰＭ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製（以下、「ＣＤ」ともいう））、実施例２で調製した合成ＳＯＣ培地、及び緩衝成分である３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を添加した合成ＳＯＣ培地を用いた。各培地で培養した大腸菌におけるタンパク質産生を、ディープウェル培養法で評価した。２ｍｌ容量の９６穴ディープウェルプレートにクロラムフェニコール３５μｇ／ｍＬ及びアンピシリン５０μ／ｍＬとなるように加えた培地を１ｍｌ添加し、ディープウェルマキシマイザーを用いて、１，２００ｒｐｍ、３７℃の条件で培養した。培養開始２時間後１ｍＭのＩＰＴＧを添加しＧＦＰ発現を誘導した。培養８時間後のＧＦＰ由来の蛍光を、蛍光プレートリーダーを用いて評価した。蛍光検出の際の励起波長は４８７ｎｍ、蛍光検出波長は５０９ｎｍとした。
【0062】
（結果）
図１に示すように、ＳＯＣ培地と合成ＳＯＣ培地のＧＦＰ由来蛍光はそれぞれ平均値で５１６４及び５９５１であり、５％有意水準で合成ＳＯＣ培地が優れていた。さらに終濃度４０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）添加した培地（合成ＳＯＣ＋ＭＯＰＳ）では、ＧＦＰ由来蛍光強度は平均値で１０２７０を示した。この結果は、各種機器分析で算出した培養基材組成のデータを用いて合成培地を設計することで、従来の培地を上回る性能を持つ培地を設計できることを示している。一方、ＣＤ培地で培養した大腸菌のＧＦＰ蛍光強度は平均値で３８８１であった。大腸菌によるＧＦＰ生産において、本発明で設計した合成ＳＯＣ培地および合成ＳＯＣ＋ＭＯＰＳは市販の大腸菌用完全合成培地よりも優れていることが示された。
図１に示すように、ＳＯＣ培地と合成ＳＯＣ培地のＧＦＰ由来蛍光はそれぞれ平均値で５１６４及び５９５１であり、５％有意水準で合成ＳＯＣ培地が優れていた。さらに終濃度４０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）添加した培地（合成ＳＯＣ＋ＭＯＰＳ）では、ＧＦＰ由来蛍光強度は平均値で１０２７０を示した。この結果は、各種機器分析で算出した培養基材組成のデータを用いて合成培地を設計することで、従来の培地を上回る性能を持つ培地を設計できることを示している。一方、ＣＤ培地で培養した大腸菌のＧＦＰ蛍光強度は平均値で３８８１であった。大腸菌によるＧＦＰ生産において、本発明で設計した合成ＳＯＣ培地および合成ＳＯＣ＋ＭＯＰＳは市販の大腸菌用完全合成培地よりも優れていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0063】
本発明は、製薬、医療及び研究分野における微生物培養に有用である。
【図1】
