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特開2024-112453アミロイドを生産可能な形質転換細胞およびアミロイドを生産する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024112453
(43)【公開日】2024-08-21
(54)【発明の名称】アミロイドを生産可能な形質転換細胞およびアミロイドを生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240814BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240814BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240814BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240814BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240814BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P21/02 C
C12N15/11 Z
C12N15/54
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023017462
(22)【出願日】2023-02-08
(71)【出願人】
【識別番号】504180239
【氏名又は名称】国立大学法人信州大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】小笠原 寛
(72)【発明者】
【氏名】松吉 志
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】安定的にアミロイドを大量生産するための形質転換細胞およびその方法を提供する。
【解決手段】本発明の一態様は、アミロイドを生産可能な形質転換細胞である。上記形質転換細胞は、エンテロバクター目に属する。さらに、上記形質転換細胞の染色体において、ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに上記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている上記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の一態様は、アミロイドを生産可能な形質転換細胞である。上記形質転換細胞は、エンテロバクター目に属する。さらに、上記形質転換細胞の染色体において、ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに上記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている上記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミロイドを生産可能な形質転換細胞であって、
エンテロバクター目に属し、
前記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに前記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている前記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、形質転換細胞。
エンテロバクター目に属し、
前記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに前記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている前記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、形質転換細胞。
【請求項2】
前記組み換えプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＡｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１に記載の形質転換細胞。
【請求項3】
前記組み換えプロモーターが、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり、
前記染色体において、さらに、
ｃ）前記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、請求項１に記載の形質転換細胞。
前記染色体において、さらに、
ｃ）前記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、請求項１に記載の形質転換細胞。
【請求項4】
前記ｂ）において、少なくともｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されている、請求項１または２に記載の形質転換細胞。
【請求項5】
前記アミロイドが、ＣｓｇＡタンパク質を含む、請求項１または２に記載の形質転換細胞。
【請求項6】
前記形質転換細胞が、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属またはエルシニア属に属する、請求項１または２に記載の形質転換細胞。
【請求項7】
アミロイドを生産する方法であって、
形質転換細胞を準備する準備工程と、
前記形質転換細胞を培養してアミロイドを生産させる生産工程と、
を含み、
前記形質転換細胞が、エンテロバクター目に属し、
前記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに前記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている前記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、方法。
形質転換細胞を準備する準備工程と、
前記形質転換細胞を培養してアミロイドを生産させる生産工程と、
を含み、
前記形質転換細胞が、エンテロバクター目に属し、
前記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに前記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている前記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、方法。
【請求項8】
前記組み換えプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＡｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記組み換えプロモーターが、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり、
前記染色体において、さらに、
ｃ）前記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、請求項７に記載の方法。
前記染色体において、さらに、
ｃ）前記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記ｂ）において、少なくともｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されている、請求項７または８に記載の方法。
【請求項11】
前記アミロイドが、ＣｓｇＡタンパク質を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項12】
前記形質転換細胞が、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属またはエルシニア属に属する、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミロイドを生産可能な形質転換細胞に関する。また、本発明は、アミロイドを生産する方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
多くのバイオフィルム形成細菌は、繊維状タンパク質であるアミロイドを生産して細胞外に放出する。細菌が生産するアミロイドは、物理的ストレス環境下で高い安定性を有することから、新たな繊維素材として注目されている。
【0003】
近年、細菌が生産するアミロイドに様々な機能を持たせる研究が盛んに行われている。特許文献１には、大腸菌が生産するアミロイドであるＣｓｇＡタンパク質に機能性ペプチドドメインを遺伝的に付加することにより、バイオフィルムに特定の能力を持たせる技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１９－２２４９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記のような機能性付加アミロイドを工業的に利用するためには、生産性を向上する技術が必要となる。現在は、多コピープラスミドを宿主細胞に導入する手法が汎用されているが、長期培養によってプラスミドが脱落してしまうという課題があった。
【0006】
本発明は、安定的にアミロイドを大量生産するための形質転換細胞およびその方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らが、鋭意検討した結果、特定の遺伝子がアミロイド生産を阻害していることを見出した。さらに、本発明者らは、アミロイド生産に関わる因子の転写機構を改善することにより、本発明を完成させた。
【0008】
本発明によれば、以下が提供される。
［１］アミロイドを生産可能な形質転換細胞であって、
エンテロバクター目に属し、
上記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに上記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている上記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、形質転換細胞。
［２］上記組み換えプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＡｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、［１］に記載の形質転換細胞。
［３］上記組み換えプロモーターが、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり、
上記染色体において、さらに、
ｃ）上記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、［１］に記載の形質転換細胞。
［４］上記ｂ）において、少なくともｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されている、［１］または［２］に記載の形質転換細胞。
［５］上記アミロイドが、ＣｓｇＡタンパク質を含む、［１］または［２］に記載の形質転換細胞。
［６］上記形質転換細胞が、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属またはエルシニア属に属する、請求項１または２に記載の形質転換細胞。
［７］アミロイドを生産する方法であって、
形質転換細胞を準備する準備工程と、
上記形質転換細胞を培養してアミロイドを生産させる生産工程と、
を含み、
上記形質転換細胞が、エンテロバクター目に属し、
上記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに上記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている上記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、方法。
［８］上記組み換えプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＡｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、［７］に記載の方法。
［９］上記組み換えプロモーターが、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり、
上記染色体において、さらに、
ｃ）上記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、［７］に記載の方法。
［１０］上記ｂ）において、少なくともｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されている、［７］または［８］に記載の方法。
［１１］上記アミロイドが、ＣｓｇＡタンパク質を含む、［７］または［８］に記載の方法。
［１２］上記形質転換細胞が、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属またはエルシニア属に属する、［７］または［８］に記載の方法。
［１］アミロイドを生産可能な形質転換細胞であって、
エンテロバクター目に属し、
上記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに上記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている上記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、形質転換細胞。
［２］上記組み換えプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＡｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、［１］に記載の形質転換細胞。
［３］上記組み換えプロモーターが、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり、
上記染色体において、さらに、
ｃ）上記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、［１］に記載の形質転換細胞。
［４］上記ｂ）において、少なくともｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されている、［１］または［２］に記載の形質転換細胞。
［５］上記アミロイドが、ＣｓｇＡタンパク質を含む、［１］または［２］に記載の形質転換細胞。
［６］上記形質転換細胞が、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属またはエルシニア属に属する、請求項１または２に記載の形質転換細胞。
［７］アミロイドを生産する方法であって、
形質転換細胞を準備する準備工程と、
上記形質転換細胞を培養してアミロイドを生産させる生産工程と、
を含み、
上記形質転換細胞が、エンテロバクター目に属し、
上記形質転換細胞の染色体において、
ａ）ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置され、かつ
ｂ）ｙｃｃＴ遺伝子、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに上記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている上記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化されている、方法。
［８］上記組み換えプロモーターが、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＡｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、［７］に記載の方法。
［９］上記組み換えプロモーターが、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり、
上記染色体において、さらに、
ｃ）上記組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する、［７］に記載の方法。
［１０］上記ｂ）において、少なくともｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されている、［７］または［８］に記載の方法。
［１１］上記アミロイドが、ＣｓｇＡタンパク質を含む、［７］または［８］に記載の方法。
［１２］上記形質転換細胞が、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属またはエルシニア属に属する、［７］または［８］に記載の方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、安定的にアミロイドを大量生産するための形質転換細胞およびその方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明について詳述する。なお、本明細書において、「～」はその前後の数値を含む範囲を意味する。
【0012】
本明細書において、「形質転換細胞」とは、プラスミドを導入された細胞およびゲノムに外来遺伝子が組み込まれた細胞などの、外部からＤＮＡが導入されかつ野生型とは異なる形質（表現型など）を有する細胞を表す。本明細書において、形質転換前の細胞および形質転換された細胞と形質転換されていない細胞とが混合されている状態の細胞を、単に「細胞」と言う場合がある。
【0013】
以下、本実施形態に係る形質転換細胞およびその作製方法について説明し、ついで、本実施形態に係るアミロイドを生産する方法について説明する。
【0014】
（形質転換細胞）
本実施形態に係る形質転換細胞は、エンテロバクター目に属する細菌であることが好ましい。エンテロバクター目に属する細菌としては、例えば、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属およびエルシニア属に属する細菌が挙げられる。このような細菌であれば、本実施形態に係るアミロイドを生産することができる。また、本実施形態に係る形質転換細胞は、大腸菌、サルモネラ、セラチア菌および赤痢菌からなる群から選択されることがさらに好ましい。本実施形態に係る形質転換細胞が、これらの菌であると、遺伝子操作が容易となる。また、本実施形態に係る形質転換細胞は、大腸菌が特に好ましい。大腸菌には、病原性がないものが含まれ、安価に大量培養することができる。
本実施形態に係る形質転換細胞は、エンテロバクター目に属する細菌であることが好ましい。エンテロバクター目に属する細菌としては、例えば、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パントエア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属およびエルシニア属に属する細菌が挙げられる。このような細菌であれば、本実施形態に係るアミロイドを生産することができる。また、本実施形態に係る形質転換細胞は、大腸菌、サルモネラ、セラチア菌および赤痢菌からなる群から選択されることがさらに好ましい。本実施形態に係る形質転換細胞が、これらの菌であると、遺伝子操作が容易となる。また、本実施形態に係る形質転換細胞は、大腸菌が特に好ましい。大腸菌には、病原性がないものが含まれ、安価に大量培養することができる。
【0015】
本実施形態に係る形質転換細胞の染色体上において、ｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置されていることが好ましい。組み換えプロモーターが配置されている位置は、当該プロモーターがｃｓｇＤ遺伝子の発現を制御することが可能であれば特に限定されない。また、本実施形態に係る形質転換細胞の染色体上において、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンの上流にシャイン・ダルガノ配列（ＳＤ配列ともいう）が配置されていることが好ましい。このような位置にＳＤ配列が配置されていると、ＳＤ配列の下流にあるｃｓｇＤ遺伝子の翻訳が高効率になる。なお、ＳＤ配列は、野生型のＳＤ配列であっても、遺伝子組み換えにより導入されたＳＤ配列であってもよい。本実施形態に係る形質転換細胞の染色体上において、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンの上流にＳＤ配列が配置されている場合は、組み換えプロモーターはＳＤ配列の２０ｂｐ以上上流に配置されていることが好ましい。
【0016】
本実施形態に係る形質転換細胞の染色体上において、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンの上流２００ｂｐ以内が削除されていることが好ましく、上流１２０ｂｐ以内が削除されていることがさらに好ましい。このような形質転換細胞は、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンの上流にある5'非翻訳領域が削除されているため、ｓＲＮＡによるｃｓｇＤ遺伝子の翻訳制御の影響を抑えることができる。
【0017】
本実施形態に係る形質転換細胞の染色体上において、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンの上流３００ｂｐ～５００ｂｐが削除されていることが好ましく、４００ｂｐ～５００ｂｐが削除されていることがさらに好ましい。このような形質転換細胞は、ｃｓｇＤ遺伝子の転写を制御しうる転写因子の影響を抑えられるため、効率的にｃｓｇＤ遺伝子を転写することができる。
【0018】
本明細書における「組み換えプロモーター」とは、野生型のプロモーター以外の遺伝子組み換えにより導入されたプロモーターを指す。本実施形態に係る組み換えプロモーターとして、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＡｒａＢＡＤプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであることが好ましい。また、本実施形態に係る組み換えプロモーターは、異種由来のプロモーターであることが好ましい。例えば、本実施形態に係る形質転換細胞が大腸菌の場合、組み換えプロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーターおよびＳｐ６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであることが好ましい。このような組み換えプロモーターを選択することで、組み換えプロモーター下流の目的遺伝子（本実施形態においてはｃｓｇＤ遺伝子）の発現制御が簡便になる。なお、本実施形態に係る組み換えプロモーターは、１つでもよく、複数でもよい。本実施形態に係る形質転換細胞を用いることにより、アミロイドを大量生産することができる。
【0019】
また、本実施形態に係る形質転換細胞が大腸菌の場合、組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在することが好ましい。これにより、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を形質転換細胞の培地中に添加するか否かによって遺伝子発現を制御することが可能となる。
【0020】
本実施形態に係る一態様は、形質転換細胞の染色体上において、ｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されていることが好ましい。なお、本明細書において「遺伝子が不活性化されている」とは、当該遺伝子の機能が低下している状態または失われている状態を指す。具体的には、「遺伝子が不活性化されている」とは、当該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡおよび翻訳産物であるポリペプチドの発現量が低下している状態および当該ｍＲＮＡおよび当該ポリペプチドが正常に機能しない状態を含む。本実施形態に係る形質転換細胞を用いることにより、アミロイドを大量生産することができる。
【0021】
本実施形態に係る別の態様は、形質転換細胞の染色体上において、ｙｃｃＴ遺伝子の下流に配置されているｙｃｃＴ遺伝子と同一オペロン内の遺伝子から選択される１以上の遺伝子（以下、第１オペロン遺伝子）が不活性化されていることが好ましい。また、本実施形態に係る別の態様は、形質転換細胞の染色体上において、ｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群ならびに上記群に含まれる遺伝子の下流に配置されている上記遺伝子と同一オペロン内の遺伝子（以下、第２オペロン遺伝子）から選択される１以上の遺伝子が不活性化されていることが好ましい。本実施形態に係る形質転換細胞を用いることにより、アミロイドを大量生産することができる。
【0022】
本明細書において、「（ｍＲＮＡまたはポリペプチドの）発現量が低下している」とは、不活性化後の発現量が不活性化前（野生型）の発現量よりも低下している状態を表す。本実施形態に係るｙｃｃＴ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現量は、不活性化前（野生型）の発現量を基準として、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または１００％低下していることが好ましい。
【0023】
本明細書において、「（ｍＲＮＡまたはポリペプチドが）正常に機能しない」とは、不活性化前（野生型）における機能（例えば、転写活性、酵素活性）が低下している状態を表す。本実施形態に係るｙｃｃＴ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡまたはポリペプチドの機能は、不活性化前（野生型）の機能を基準として、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または１００％低下していることが好ましい。
【0024】
本実施形態に係る形質転換細胞の染色体上に、アミロイドの生産に悪い影響を与えない範囲で、さらに任意の遺伝子ならびに転写および翻訳を制御する因子導入されていてもよい。導入され得る遺伝子ならびに転写および翻訳を制御する因子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など）および栄養要求性マーカー遺伝子、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、リプレッサーならびにターミネーターが挙げられる。
【0025】
本実施形態に係る形質転換細胞は、アミロイドを生産可能であることが好ましい。本実施形態に係る形質転換細胞が生産するアミロイドは、典型的には、バクテリアアミロイドである。また、本実施形態に係る形質転換細胞が生産するアミロイドは、ＣｓｇＡタンパク質を含むことが好ましい。本実施形態に係るＣｓｇＡタンパク質には、機能性を有するオリゴペプチドおよびポリペプチドが付加されていてもよい。本実施形態に係るＣｓｇＡタンパク質に付加されるオリゴペプチドおよびポリペプチドのアミノ酸配列は、用途によって任意に設計される。付加されるポリペプチド、タンパク質として、例えば、タグペプチドおよびタグタンパク質（Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｐｙタグ、Ｓｐｙ Ｃａｔｃｈｅｒ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙなど）が挙げられる。付加されるポリペプチドの長さは、例えば、５残基以上、１０残基以上、２０残基以上、３０残基以上、５０残基以上、１００残基以上である。さらに、ＣｓｇＡタンパク質と付加されるポリペプチドなどとの間に、リンカーが設けられていてもよい。
【0026】
（形質転換細胞の作製方法）
本実施形態に係る形質転換細胞の作製方法は、細胞を提供する提供工程と、細胞を形質転換する形質転換工程と、を含んでもよい。本実施形態に係る形質転換工程は、細胞の染色体上のｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターを配置する配置工程と、染色体上のｙｃｃＴ遺伝子を不活性化する不活性化工程を含んでもよい。別の実施形態において、細胞の染色体上のｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターを配置し、かつ染色体上のｙｃｃＴ遺伝子を不活性化する工程であってもよい。
本実施形態に係る形質転換細胞の作製方法は、細胞を提供する提供工程と、細胞を形質転換する形質転換工程と、を含んでもよい。本実施形態に係る形質転換工程は、細胞の染色体上のｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターを配置する配置工程と、染色体上のｙｃｃＴ遺伝子を不活性化する不活性化工程を含んでもよい。別の実施形態において、細胞の染色体上のｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターを配置し、かつ染色体上のｙｃｃＴ遺伝子を不活性化する工程であってもよい。
【0027】
本実施形態における配置工程は、染色体上のｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターを配置できれば、特に限定されない。本実施形態に係る配置工程は、組み換えプロモーターの塩基配列をコードする核酸分子を細胞の染色体に導入する核酸導入工程を含んでもよい。本実施形態に係る核酸分子は、例えば、ベクターの一部分をＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片であってもよい。また、別の実施形態において、本実施形態に係る配置工程は、組み換えプロモーター配列を含むベクターを細胞に導入するベクター導入工程を含んでもよい。本実施形態に係るベクターの種類は特に限定されない。本実施形態に係るベクターとして、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターおよび人工染色体ベクターが挙げられる。本実施形態において、核酸分子を細胞の染色体に導入する方法として、例えば、Ｔ５－エキソヌクレアーゼ－ＤＮＡ－アセンブリメソッド（以下、ＴＥＤＡ法ともいう；Nucleic Acids Res. 2019 Feb 20; 47(3): e15）が挙げられる。本実施形態において、ベクターを細胞に導入する方法は、ベクターおよび細胞の種類に応じて適宜選択できる。ベクターを細胞に導入する方法として、例えば、トランスフェクション法、コンピテントセル法およびエレクトロポレーションが挙げられる。
【0028】
本実施形態の一態様における不活性化工程は、染色体上のｙｃｃＴ遺伝子を不活性化できれば、特に限定されない。本実施形態に係る不活性化工程は、染色体上のｙｃｃＴ遺伝子を別の遺伝子に置換する置換工程を含んでもよい。別の実施形態において、本実施形態に係る不活性化工程は、染色体上のｙｃｃＴ遺伝子を欠失する欠失工程または染色体上のｙｃｃＴ遺伝子に任意の核酸分子を挿入する挿入工程を含んでもよい。さらに、別の実施形態において、本実施形態に係る不活性化工程は、ｙｃｃＴ遺伝子遺伝子の発現を制御する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、サイレンサー領域、リプレッサー領域、ターミネーター領域など）を改変する改変工程を含んでもよい。なお、改変を行う部位は、遺伝子を不活性化することができれば特に限定されない。遺伝子を不活性化する方法として、具体的には、薬剤および紫外線によるＤＮＡ変異処理、ＰＣＲを用いた変異導入、ＲＮＡ干渉ならびに相同組み換えが挙げられる。
【0029】
本実施形態の別態様における不活性化工程は、染色体上のｆｅｐＤ遺伝子、ｅｎｔＳ遺伝子、ｙｃｃＵ遺伝子、ｗｒｂＡ遺伝子、ｙｍｄＦ遺伝子、ｆｌｉＥ遺伝子、ｆｌｉＦ遺伝子、ｙｈｂＴ遺伝子、ｙｈｂＵ遺伝子、ｍｄｈ遺伝子、ａｒｇＲ遺伝子、ｎｌｐＡ遺伝子およびｙｉｃＳ遺伝子からなる群、第１オペロン遺伝子、ならびに第２オペロン遺伝子の遺伝子のうち、１以上の遺伝子が不活性化できれば、特に限定されない。不活性化工程の方法は、上述のｙｃｃＴ遺伝子の不活性化と同様である。
【0030】
本実施形態に係る形質転換工程は、さらに、染色体上のｃｓｇＡ遺伝子を改変するｃｓｇＡ遺伝子改変工程を含んでもよい。本実施形態に係るｃｓｇＡ遺伝子改変工程は、ｃｓｇＡ遺伝子にタグペプチドをコードする核酸分子を付加するタグペプチド付加工程を含んでもよい。
【0031】
本実施形態に係る形質転換工程は、アミロイドの生産に悪い影響を与えない範囲で、さらに、細胞の染色体上の塩基配列を改変する追加改変工程を含んでもよい。細胞の染色体上の塩基配列を改変する方法は、特に限定されない。任意の塩基配列の導入は、上述の組み換えプロモーターの配置および遺伝子の不活性化と同時に行ってもよく、単独で行ってもよい。
【0032】
本実施形態に係る形質転換細胞の作製方法は、さらに、形質転換細胞を選抜する選抜工程を含んでもよい。形質転換細胞を選抜する方法は、特に限定されない。形質転換細胞の選抜マーカーとして、薬剤耐性遺伝子を使用してもよい。具体的には、本実施形態に係る選抜工程は、導入した薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質などの薬剤を細胞の培地中に添加する薬剤添加工程を含んでもよい。また、形質転換細胞の選抜マーカーとして、栄養要求性マーカー遺伝子を使用してもよい。この場合、本実施形態に係る選抜工程は、薬剤添加をせず、形質転換後の細胞を生育する生育工程を含んでもよい。
【0033】
本実施形態に係る形質転換細胞の作製方法は、さらに、形質転換されていることを確認する確認工程を含んでもよい。染色体上のｃｓｇＤ遺伝子の上流に組み換えプロモーターが配置されていることは、例えば、ＤＮＡシーケンスにより確認することができる。また、遺伝子が不活性化されていることは、例えば、当該遺伝子に係るｍＲＮＡおよびポリペプチドの発現量により確認することができる。ｍＲＮＡの発現量は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＮＡ－Ｓｅｑ法などにより測定することができる。ポリペプチドの発現量は、例えば、細胞懸濁液を電気泳動などで分離して、当該ポリペプチドの分子量付近のバンドを検出する方法および当該ポリペプチドを認識する標識抗体を検出する方法により測定することができる。
【0034】
（アミロイドを生産する方法）
本実施形態に係るアミロイドを生産する方法は、形質転換細胞を準備する準備工程を含んでもよい。本実施形態に係る準備工程は、予め形質転換された形質転換細胞を準備してもよく、細胞に形質転換を施して形質転換細胞を準備してもよい。すなわち、本実施形態に係る準備工程は、形質転換細胞を作製する作製工程を含んでもよい。なお、作製工程の詳細は、上述の形質転換細胞の作成方法に記載されている。形質転換細胞は、自然界に存在する細胞を採取して用意しても、市販されているコンピテントセルなどの細胞を購入して用意してもよい。
本実施形態に係るアミロイドを生産する方法は、形質転換細胞を準備する準備工程を含んでもよい。本実施形態に係る準備工程は、予め形質転換された形質転換細胞を準備してもよく、細胞に形質転換を施して形質転換細胞を準備してもよい。すなわち、本実施形態に係る準備工程は、形質転換細胞を作製する作製工程を含んでもよい。なお、作製工程の詳細は、上述の形質転換細胞の作成方法に記載されている。形質転換細胞は、自然界に存在する細胞を採取して用意しても、市販されているコンピテントセルなどの細胞を購入して用意してもよい。
【0035】
本実施形態に係るアミロイドを生産する方法は、形質転換細胞を培養してアミロイドを生産させる生産工程を含んでもよい。形質転換細胞の培養条件は、使用する細胞に応じて任意に設定できる。また、形質転換細胞の組み換えプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼがラクトースオペロン制御下に存在する場合、本実施形態に係る生産工程は、さらに、ＩＰＴＧを添加するＩＰＴＧ添加工程を含んでもよい。
【0036】
本実施形態に係る形質転換細胞の培養に使用する培地は、形質転換細胞が生育可能かつアミロイドを生産可能であれば、特に限定されない。培地成分としては、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、抗生物質などが挙げられる。また、培地は、寒天培地のような固形培地でも、液体培地でもよい。培地のｐＨは、形質転換細胞が大腸菌の場合、ｐＨ６．０～８．０に調整することが好ましい。培地の塩化ナトリウム濃度は、特に限定されない。培地の塩化ナトリウム濃度は、形質転換細胞が大腸菌の場合、０．５～１．０質量％であってもよい。大腸菌のアミロイド生産に係る野生型のプロモーターは、培地の塩化ナトリウム濃度がこのような範囲であると、機能が抑制され得る。しかし、本実施形態に係るアミロイド生産は組み換えプロモーターを用いるため、培地の塩化ナトリウム濃度がこのような範囲であっても、アミロイド生産が可能である。培養温度は、形質転換細胞が大腸菌の場合、例えば、１５～５０℃、好ましくは２０～４２℃、さらに好ましくは２８～３７℃である。培養時間は、例えば、１時間以上、２時間以上、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上および４８時間以上である。
【0037】
本実施形態に係るアミロイドを生産する方法は、さらに、アミロイドを回収する回収工程を含んでもよい。本実施形態に係る回収工程は、生産工程後の細胞および培養液を回収しても、生産工程において培養中の細胞および培養液の一部を回収してもよい。本実施形態に係る形質転換細胞は、染色体上にアミロイド生産に係る遺伝子が存在するため、安定的にアミロイドを生産できる。したがって、本実施形態に係る形質転換細胞は、長期培養および連続培養が可能である。また、本実施形態に係る形質転換細胞のアミロイドに、タグペプチドまたはタグタンパク質が付加されている場合、タグペプチドまたはタグタンパク質を指標にアミロイドを回収してもよい。
【0038】
本実施形態に係るアミロイドを生産する方法は、さらに、アミロイドを検出する検出工程を含んでもよい。アミロイドは細胞外（細胞表面または培養液中）および細胞内に存在し得る。細胞外のアミロイドの検出方法としては、例えば、コンゴーレッド染色により検出することができる。また、細胞内のアミロイドの検出方法としては、例えば、細胞を界面活性剤で懸濁した後、アミロイド（または、タグペプチド若しくはタグタンパク質）を認識する標識抗体を検出する方法が挙げられる。
【0039】
本実施形態に係るアミロイドの用途は、特に限定されない。本実施形態に係るアミロイドは、生体親和性に優れるため、例えば、医療用材料として利用できる。
【実施例0040】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0041】
（菌株の構築）
プラスミドベクターｐＥＴ－２１ａ（＋）（Novagen社製）のマルチクローニングサイトにｃｓｇＤ遺伝子のＯＲＦ（ｃｓｇＤ ＯＲＦ；配列番号１）を含む遺伝子断片（大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（Promega社製）の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（配列番号７）およびプライマー２（配列番号８）を用いて作製）が導入されたｐＥＴｃｓｇＤを用意した。ｐＥＴｃｓｇＤは、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンの上流にｐＥＴ－２１ａ（＋）由来のＳＤ配列が配置され、ＳＤ配列のさらに２０ｂｐ以上上流にＴ７プロモーター（配列番号２）が配置されていた。導入には、ＴＥＤＡ法を用いた。ＴＥＤＡ法は、末端配列約１５ｂｐの相同な配列をもたせた線上化ベクターとインサートとを、Ｔ５－エキソヌクレアーゼで処理し（３０℃、４０分間）、１０℃で１０分間インキュベートすることによって行った。なお、インサートの増幅時に、プライマーの一部をベクターの末端の配列と相補的な配列とすることで、インサートの末端配列をベクターの末端と相同な配列とした（以下同じ）。
プラスミドベクターｐＥＴ－２１ａ（＋）（Novagen社製）のマルチクローニングサイトにｃｓｇＤ遺伝子のＯＲＦ（ｃｓｇＤ ＯＲＦ；配列番号１）を含む遺伝子断片（大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（Promega社製）の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（配列番号７）およびプライマー２（配列番号８）を用いて作製）が導入されたｐＥＴｃｓｇＤを用意した。ｐＥＴｃｓｇＤは、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンの上流にｐＥＴ－２１ａ（＋）由来のＳＤ配列が配置され、ＳＤ配列のさらに２０ｂｐ以上上流にＴ７プロモーター（配列番号２）が配置されていた。導入には、ＴＥＤＡ法を用いた。ＴＥＤＡ法は、末端配列約１５ｂｐの相同な配列をもたせた線上化ベクターとインサートとを、Ｔ５－エキソヌクレアーゼで処理し（３０℃、４０分間）、１０℃で１０分間インキュベートすることによって行った。なお、インサートの増幅時に、プライマーの一部をベクターの末端の配列と相補的な配列とすることで、インサートの末端配列をベクターの末端と相同な配列とした（以下同じ）。
【0042】
ｐＥＴｃｓｇＤのＴ７プロモーター領域上流に、ＴＥＤＡ法を用いて、カナマイシン耐性遺伝子（Quick & Easy Conditional Knockout Kit (FRT/FLPe)（Gene Bridges社製）で作製されたものを使用した）を導入した。さらにその上流に、ＴＥＤＡ法を用いて、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡにおけるｃｓｇＤ遺伝子の開始コドンより５００～７００ｂｐ上流の２００ｂｐのＤＮＡ（ｃｓｇＤ ＵＰ；配列番号３）を含む遺伝子断片（大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー３（配列番号９）およびプライマー４（配列番号１０）を用いて作製）を導入した。
【0043】
上述のプラスミドを鋳型に、ｃｓｇＤ ＵＰ－カナマイシン耐性遺伝子－Ｔ７プロモーター－ｃｓｇＤ ＯＲＦが融合されたＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。このとき、プライマーにはプライマー４（配列番号１０）およびプライマー５（配列番号１１）を使用した。当該ＤＮＡ断片を、λ-red recombinationシステムによるOne step相同組み換えを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡにおけるｃｓｇＤ ＯＲＦ領域上流に導入した。これにより、ｃｓｇＤ遺伝子の開始コドン上流から５００ｂｐが削除された。ＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞をカナマイシンにより選抜し、Ｔ７プロモーター－ｃｓｇＤ融合ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を得た。
【0044】
次に、Ｔ７プロモーター－ｃｓｇＤ融合ＪＭ１０９（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡからカナマイシン耐性遺伝子を除去した。さらに、λ-red recombinationシステムによるOne step相同組み換えを用いて、カナマイシン耐性遺伝子と置換することにより、Ｔ７プロモーター－ｙｃｃＴ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、Ｔ７プロモーター－ｃｓｇＡ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株およびＴ７プロモーター－ｃｓｇＢＡ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株をそれぞれ作製した。また、同様に、ＪＭ１０９（ＤＥ３）株について、λ-red recombinationシステムによるOne step相同組み換えを用いて、カナマイシン耐性遺伝子と置換することにより、ｙｃｃＴ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を作製した。
【0045】
（Ｈｉｓタグ融合ＣｓｇＡタンパク質発現株の構築）
大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｃｓｇＢ－ｙｍｄＡ領域を含む遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。このとき、プライマーにはプライマー６（配列番号１２）およびプライマー７（配列番号１３）を使用した。なお、ｙｍｄＡ遺伝子は、ｃｓｇＢＡＣオペロンの下流に位置する遺伝子であり、ｃｓｇＢ－ｙｍｄＡ領域は、ｃｓｇＢ遺伝子の開始コドンからｙｍｄＡ遺伝子の開始コドンの下流１５０ｂｐまでの領域である。次に、ＴＥＤＡ法を用いて、ｐＥＴ－２１ａ（＋）にｃｓｇＢ－ｙｍｄＡ領域を含む遺伝子断片を導入して、ｐＥＴｃｓｇＢ－ｙｍｄＡを作製した。
大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｃｓｇＢ－ｙｍｄＡ領域を含む遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。このとき、プライマーにはプライマー６（配列番号１２）およびプライマー７（配列番号１３）を使用した。なお、ｙｍｄＡ遺伝子は、ｃｓｇＢＡＣオペロンの下流に位置する遺伝子であり、ｃｓｇＢ－ｙｍｄＡ領域は、ｃｓｇＢ遺伝子の開始コドンからｙｍｄＡ遺伝子の開始コドンの下流１５０ｂｐまでの領域である。次に、ＴＥＤＡ法を用いて、ｐＥＴ－２１ａ（＋）にｃｓｇＢ－ｙｍｄＡ領域を含む遺伝子断片を導入して、ｐＥＴｃｓｇＢ－ｙｍｄＡを作製した。
【0046】
続いて、ＴＥＤＡ法を用いて、ｐＥＴｃｓｇＢ－ｙｍｄＡにおけるＣｓｇＡタンパク質（ｃｓｇＡ ＯＲＦ；配列番号４）のＣ末端側に、アミノ酸６残基のリンカーをコードするＤＮＡ断片（配列番号５）およびＨｉｓタグをコードするＤＮＡ断片（配列番号６）を導入した。さらに、ＴＥＤＡ法を用いて、ｙｍｄＡ遺伝子の６０ｂｐ上流にカナマイシン耐性遺伝子を融合させた。
【0047】
上述のプラスミドを鋳型に、ｃｓｇＡ ＯＲＦ－リンカー－Ｈｉｓタグ－ｃｓｇＣ ＯＲＦ－カナマイシン耐性遺伝子－ｙｍｄＡが融合されたＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、精製した。このとき、プライマーにはプライマー８（配列番号１４）およびプライマー７（配列番号１３）を使用した。
【0048】
λ-red recombinationシステムによるOne step相同組み換えを用いて、各大腸菌の染色体ＤＮＡに、ｃｓｇＡ ＯＲＦ－リンカー－Ｈｉｓタグ－ｃｓｇＣ ＯＲＦ－カナマイシン耐性遺伝子－ｙｍｄＡが融合されたＤＮＡ断片を導入した。ＤＮＡ断片を導入した大腸菌株は、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、ｙｃｃＴ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、Ｔ７プロモーター－ｃｓｇＤ融合ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、Ｔ７プロモーター－ｙｃｃＴ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、Ｔ７プロモーター－ｃｓｇＡ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株およびＴ７プロモーター－ｃｓｇＢＡ欠損ＪＭ１０９（ＤＥ３）株であり、導入後の各大腸菌株を、それぞれ、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ＷＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｃｓｇＡ株およびＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｃｓｇＢＡ株とした。各大腸菌株は、－８０℃フリーズストックとして保存した。
【0049】
（細胞内アミロイドの検出）
液体ＬＢ培地（組成は表１を参照）に各大腸菌株（ＪＭ１０９（ＤＥ３）ＷＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｃｓｇＡ株およびＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｃｓｇＢＡ株）を播種して３７℃で８時間以上培養した。培養終了後の培養液１００μＬを、それぞれ、液体ＬＢ培地１０ｍＬに植菌して、３７℃で３時間振とう培養した。次に、培養液１５０μＬを、それぞれ、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート（ＬＢ寒天プレートの組成は表２を参照；ＬＢ寒天プレート（１０ｍＬ）作製時に１００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液を１００μＬ添加した）上に、塗布して、２８℃で２４時間、４８時間または１６８時間培養した。
液体ＬＢ培地（組成は表１を参照）に各大腸菌株（ＪＭ１０９（ＤＥ３）ＷＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｃｓｇＡ株およびＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｃｓｇＢＡ株）を播種して３７℃で８時間以上培養した。培養終了後の培養液１００μＬを、それぞれ、液体ＬＢ培地１０ｍＬに植菌して、３７℃で３時間振とう培養した。次に、培養液１５０μＬを、それぞれ、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート（ＬＢ寒天プレートの組成は表２を参照；ＬＢ寒天プレート（１０ｍＬ）作製時に１００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液を１００μＬ添加した）上に、塗布して、２８℃で２４時間、４８時間または１６８時間培養した。
【0050】
【表1】
【0051】
【表2】
【0052】
培養終了後、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上のコロニーを掻き取り、リン酸カリウムバッファー（２８．９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２１．１ｍＭ Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）１ｍＬに懸濁した。分光光度計を用いて、懸濁液の濁度（ＯＤ６００）を測定し、適宜希釈してサンプル間の濁度を揃えた。
【0053】
調製した各サンプルのうち、３００μＬを遠心分離処理（１６，０００×ｇ、３分間）して、上清を除去した。取得したペレットをヘキサフルオロイソプロパノール７０μＬに懸濁した後、濃縮遠心機にてサンプルを乾燥（４５℃、３０分間）させた。
【0054】
乾燥させた各サンプルを、２×ＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％（ｖ／ｖ）２－メルカプトエタノール、０．０１％（ｍ／ｖ）ブロモフェノールブルー、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、３％（ｍ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）に懸濁し、ヒートブロックでインキュベート（９５℃で１０分間）した。このようにして調製した各サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、ＣＢＢ染色および脱色を行った。
【0055】
ＣＢＢ染色の結果を、図１および図２に示す（図２は、図１に示される写真を解析したときの拡大写真である）。図１および図２に示されるように、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ＷＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐ株およびＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｙｃｃＴ株において、Ｈｉｓタグ融合ＣｓｇＡタンパク質の分子量１７．５ｋＤａ付近にバンドが検出された。さらに、画像処理ソフトウェアImage Jを用いて、各バンドの濃度を定量した。ＪＷ１０９（ＤＥ３）ＷＴ株を基準としたときの各バンド濃度の結果を、図３に示す（Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分子量４０ｋＤａ付近に共通に検出されたタンパク質のバンド）。その結果、ｃｓｇＤ遺伝子の上流にＴ７プロモーターが配置され、かつｙｃｃＴ遺伝子が不活性化されているＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｙｃｃＴ株の場合、ＣｓｇＡタンパク質が顕著に発現上昇していることが分かった。
【0056】
（細胞外アミロイドの検出）
液体ＬＢ培地に各大腸菌株（ＪＭ１０９（ＤＥ３）ＷＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐ株およびＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｙｃｃＴ株）を播種して３７℃で８時間以上培養した。培養終了後の培養液１００μＬを、それぞれ、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上に塗布して、３７℃で２４時間培養した。
液体ＬＢ培地に各大腸菌株（ＪＭ１０９（ＤＥ３）ＷＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔｙｃｃＴ株、ＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐ株およびＪＭ１０９（ＤＥ３）Ｔ７ｐΔｙｃｃＴ株）を播種して３７℃で８時間以上培養した。培養終了後の培養液１００μＬを、それぞれ、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上に塗布して、３７℃で２４時間培養した。
【0057】
培養終了後、ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上のコロニーを掻き取り、リン酸カリウムバッファー１ｍＬに懸濁した。分光光度計を用いて、懸濁液の濁度（ＯＤ６００）を測定した。
【0058】
続いて、懸濁した各サンプル８００μＬに、５×コンゴーレッド溶液（コンゴーレッド１ｍｇを１０ｍＬの超純水に溶解させ、ろ過滅菌した）２００μＬを加えて混合し、１０分間室温で静置した。静置後の各サンプルについて、遠心分離処理（１５，０００×ｇ、５分間）して、上清を回収した。回収した各上清について、分光光度計を用いて、ＯＤ４８０を５回測定した（ｎ＝５）。対象として、リン酸カリウムバッファー８００μＬに、５×コンゴーレッド溶液２００μＬを加えて混合し、上記と同様に静置および遠心分離処理した上清についてもＯＤ４８０を測定した。各大腸菌の細胞外アミロイド量は、以下の式により算出した。
【0059】
【数1】
【0060】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】