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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024112568
(43)【公開日】2024-08-21
(54)【発明の名称】細胞凍結保存剤及び細胞凍結保存方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240814BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240814BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240814BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20240814BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C07K7/06
C07K7/08
C12N1/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023017699
(22)【出願日】2023-02-08
(71)【出願人】
【識別番号】000002288
【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】599029420
【氏名又は名称】田畑 泰彦
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】大田 英和
(72)【発明者】
【氏名】田畑 泰彦
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA87X
4B065BD27
4B065BD39
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045BA20
4H045BA21
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA23
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞を保存する際に、凍結時の細胞死及び細胞の機能低下を抑制し、かつ、溶解時に細胞の生存率低下及び細胞の機能低下を引き起こさない細胞凍結保存剤を提供する。
【解決手段】細胞凍結保存剤は、タンパク質（Ａ）、水及びアルコール（Ｂ）を含有し、前記アルコール（Ｂ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であり、前記タンパク質（Ａ）の重量割合が、氷晶からの保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％である。また、アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合は、氷晶からの保護の観点から、アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％である。
【選択図】なし
【解決手段】細胞凍結保存剤は、タンパク質（Ａ）、水及びアルコール（Ｂ）を含有し、前記アルコール（Ｂ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であり、前記タンパク質（Ａ）の重量割合が、氷晶からの保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％である。また、アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合は、氷晶からの保護の観点から、アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質（Ａ）、水及びアルコール（Ｂ）を含有する細胞凍結保存剤であって、
前記アルコール（Ｂ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であり、
前記タンパク質（Ａ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％であり、
前記タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（ｙ）とポリペプチド鎖（ｙ’）との合計個数が１～１００個であり、
前記ポリペプチド鎖（ｙ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２～２００個連続したポリペプチド鎖であり、
前記ポリペプチド鎖（ｙ’）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の６０％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換された前記アミノ酸配列（Ｘ’）を含み、かつ、前記ポリペプチド鎖（ｙ）を構成するアミノ酸数の５％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、１つの前記ポリペプチド鎖（ｙ’）において置換された前記リシン及び前記アルギニンの合計個数は１～１００個であり、
前記アミノ酸配列（Ｘ）の疎水性度が１．１～１．３であり、
前記アミノ酸配列（Ｘ’）の疎水性度が－３～－０．４であり、
前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、４０～６８％であり、
前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、２～１０％であり、
前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］が０．０９～０．２であり、
前記タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２～１．２であり、
前記アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合が、前記アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％である細胞凍結保存剤。
前記アルコール（Ｂ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であり、
前記タンパク質（Ａ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％であり、
前記タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（ｙ）とポリペプチド鎖（ｙ’）との合計個数が１～１００個であり、
前記ポリペプチド鎖（ｙ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２～２００個連続したポリペプチド鎖であり、
前記ポリペプチド鎖（ｙ’）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の６０％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換された前記アミノ酸配列（Ｘ’）を含み、かつ、前記ポリペプチド鎖（ｙ）を構成するアミノ酸数の５％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、１つの前記ポリペプチド鎖（ｙ’）において置換された前記リシン及び前記アルギニンの合計個数は１～１００個であり、
前記アミノ酸配列（Ｘ）の疎水性度が１．１～１．３であり、
前記アミノ酸配列（Ｘ’）の疎水性度が－３～－０．４であり、
前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、４０～６８％であり、
前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、２～１０％であり、
前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］が０．０９～０．２であり、
前記タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２～１．２であり、
前記アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合が、前記アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％である細胞凍結保存剤。
【請求項2】
前記タンパク質（Ａ）が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列であるＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）をさらに有する請求項１に記載の細胞凍結保存剤。
【請求項3】
前記タンパク質（Ａ）１分子中の、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）の個数と、前記アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝が、１：１～１：２０である請求項２に記載の細胞凍結保存剤。
【請求項4】
タンパク質（Ａ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５～２００ｋＤａである請求項１又は２に記載の細胞凍結保存剤。
【請求項5】
タンパク質（Ａ）が、前記ＧＶＧＶＰ配列（１）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（ｙ１）中の１個のアミノ酸がリシンで置換されたポリペプチド鎖（ｙ’１）を有するタンパク質（Ａ１１）である請求項１又は２に記載の細胞凍結保存剤。
【請求項6】
タンパク質（Ａ）が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列である（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１－１）及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列である（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）であるポリペプチド鎖（ｙ’１１）を有する人工タンパク質（Ａ１１１－１－１）である請求項１又は２に記載の細胞凍結保存剤。
【請求項7】
前記タンパク質（Ａ）は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の細胞凍結保存剤。
【請求項8】
請求項１又は２に記載の細胞凍結保存剤を用いて細胞（Ｃ）を凍結保存する方法である細胞凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞凍結保存剤及び細胞凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞の保存には、従来、凍結保存方法等が用いられている。
凍結保存法としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と血清とを含む培地に細胞を入れて凍結保存する方法（非特許文献１）が一般的に用いられている。細胞は使用時には、凍結状態から溶解し使用される。しかしながら、溶解状態ではＤＭＳＯの細胞毒性により細胞の機能が低下（例えば、接着率が低下）してしまう問題がある。
凍結保存法としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と血清とを含む培地に細胞を入れて凍結保存する方法（非特許文献１）が一般的に用いられている。細胞は使用時には、凍結状態から溶解し使用される。しかしながら、溶解状態ではＤＭＳＯの細胞毒性により細胞の機能が低下（例えば、接着率が低下）してしまう問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】村上浩紀、菅原卓也、細胞工学概論、コロナ社、１９９４年１２月、ｐ９９－１０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は細胞を保存する際に、凍結時の細胞死及び細胞の機能低下を抑制し、かつ、溶解時に細胞の生存率低下及び細胞の機能低下を引き起こさない細胞凍結保存剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の細胞凍結保存剤は、タンパク質（Ａ）、水及びアルコール（Ｂ）を含有する細胞凍結保存剤であって、前記アルコール（Ｂ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であり、前記タンパク質（Ａ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％であり、前記タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（ｙ）とポリペプチド鎖（ｙ’）との合計個数が１～１００個であり、前記ポリペプチド鎖（ｙ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２～２００個連続したポリペプチド鎖であり、前記ポリペプチド鎖（ｙ’）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の６０％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換された前記アミノ酸配列（Ｘ’）を含み、かつ、前記ポリペプチド鎖（ｙ）を構成するアミノ酸数の５％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、１つの前記ポリペプチド鎖（ｙ’）において置換された前記リシン及び前記アルギニンの合計個数は１～１００個であり、前記アミノ酸配列（Ｘ）の疎水性度が１．１～１．３であり、前記アミノ酸配列（Ｘ’）の疎水性度が－３～－０．４であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、４０～６８％であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、２～１０％であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］が０．０９～０．２であり、前記タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２～１．２であり、前記アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合が、前記アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％である。
本発明の細胞凍結保存方法は、前記本発明の細胞凍結保存剤を用いて細胞（Ｃ）を凍結保存する方法である。
すなわち、本発明の細胞凍結保存剤は、タンパク質（Ａ）、水及びアルコール（Ｂ）を含有する細胞凍結保存剤であって、前記アルコール（Ｂ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であり、前記タンパク質（Ａ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％であり、前記タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（ｙ）とポリペプチド鎖（ｙ’）との合計個数が１～１００個であり、前記ポリペプチド鎖（ｙ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２～２００個連続したポリペプチド鎖であり、前記ポリペプチド鎖（ｙ’）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の６０％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換された前記アミノ酸配列（Ｘ’）を含み、かつ、前記ポリペプチド鎖（ｙ）を構成するアミノ酸数の５％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、１つの前記ポリペプチド鎖（ｙ’）において置換された前記リシン及び前記アルギニンの合計個数は１～１００個であり、前記アミノ酸配列（Ｘ）の疎水性度が１．１～１．３であり、前記アミノ酸配列（Ｘ’）の疎水性度が－３～－０．４であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、４０～６８％であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、２～１０％であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］が０．０９～０．２であり、前記タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２～１．２であり、前記アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合が、前記アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％である。
本発明の細胞凍結保存方法は、前記本発明の細胞凍結保存剤を用いて細胞（Ｃ）を凍結保存する方法である。
【発明の効果】
【0006】
また、本発明の細胞凍結保存剤を用いて細胞を凍結保存すると、溶解時に細胞の生存率及び細胞の機能が低下しにくいという効果を奏する。
本発明の細胞凍結保存剤による上記の効果は、細胞死及び細胞の機能低下の原因となる、凍結時の氷晶の成長抑制、及び、氷晶の細胞内への侵入防止により、効果を奏しているものと推測される。
本発明の細胞凍結保存剤による上記の効果は、細胞死及び細胞の機能低下の原因となる、凍結時の氷晶の成長抑制、及び、氷晶の細胞内への侵入防止により、効果を奏しているものと推測される。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明の細胞凍結保存剤は、タンパク質（Ａ）を含有し、タンパク質（Ａ）の重量割合が、氷晶からの保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％である。
タンパク質（Ａ）の重量割合が、０．５重量％未満であると、タンパク質（Ａ）による細胞外部の保護効果（特に、細胞死及び細胞の機能低下の原因となる、凍結時の氷晶からの保護）が不十分であり、細胞死及び細胞の機能低下につながる。
タンパク質（Ａ）による氷晶からの保護効果の観点からは、タンパク質（Ａ）の重量割合は、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であることが好ましい。
タンパク質（Ａ）の重量割合が、０．５重量％未満であると、タンパク質（Ａ）による細胞外部の保護効果（特に、細胞死及び細胞の機能低下の原因となる、凍結時の氷晶からの保護）が不十分であり、細胞死及び細胞の機能低下につながる。
タンパク質（Ａ）による氷晶からの保護効果の観点からは、タンパク質（Ａ）の重量割合は、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であることが好ましい。
【0008】
タンパク質（Ａ）は、疎水性度の調整や動物由来物質の排除のために、下記の人工タンパク質であることが好ましい。
人工タンパク質は、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質を作製できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
人工タンパク質は、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質を作製できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【0009】
タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（ｙ）及びポリペプチド鎖（ｙ’）を有する。なお、以下、「ポリペプチド鎖（ｙ）」及び「ポリペプチド鎖（ｙ’）」の両者を区別する必要がない場合には、両者をまとめて、「ポリペプチド鎖（Ｙ）」とも記載する。
【0010】
本発明において、ポリペプチド鎖（ｙ）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列であるＧＶＧＶＰ配列（１）、配列番号２に示されるアミノ酸配列であるＶＧＶＰＧ配列（２）、配列番号３に示されるアミノ酸配列であるＧＶＰＧＶ配列（３）、配列番号４に示されるアミノ酸配列であるＶＰＧＶＧ配列（４）、配列番号５に示されるアミノ酸配列であるＰＧＶＧＶ配列（５）、配列番号６に示されるアミノ酸配列であるＧＶＧＶＡＰ配列（６）、配列番号７に示されるアミノ酸配列であるＶＧＶＡＰＧ配列（７）、配列番号８に示されるアミノ酸配列であるＧＶＡＰＧＶ配列（８）、配列番号９に示されるアミノ酸配列であるＶＡＰＧＶＧ配列（９）、配列番号１０に示されるアミノ酸配列であるＡＰＧＶＧＶ配列（１０）、配列番号１１に示されるアミノ酸配列であるＰＧＶＧＶＡ配列（１１）、配列番号１２に示されるアミノ酸配列であるＡＧＶＰＧＦＧＶＧ配列（１２）及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列であるＡＧＶＰＧＬＧＶＧ配列（１３）からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２～２００個連結したポリペプチド鎖である。
【0011】
本発明においてポリペプチド鎖（ｙ）は、具体的には、（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列、（ＶＧＶＰＧ）ｃ配列、（ＧＶＰＧＶ）ｄ配列、（ＶＰＧＶＧ）ｅ配列、（ＰＧＶＧＶ）ｆ配列、（ＧＶＧＶＡＰ）ｇ配列、（ＶＧＶＡＰＧ）ｈ配列、（ＧＶＡＰＧＶ）ｉ配列、（ＶＡＰＧＶＧ）ｊ配列、（ＡＰＧＶＧＶ）ｋ配列、（ＰＧＶＧＶＡ）ｌ配列、（ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ）ｍ配列及び（ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ）ｎ配列で表されるポリペプチド鎖等が挙げられる。（なお、ｂ～ｎはそれぞれアミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２～２００の整数である。）
タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（ｙ）を複数有する場合は、上記ポリペプチド鎖（ｙ）は同一でも異なっていてもよい。
また、タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数上記ｂ～ｎが同じポリペプチド鎖（ｙ）を複数有してもよく、ｂ～ｎが異なるポリペプチド鎖（ｙ）を複数有してもいい。
タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（ｙ）を複数有する場合は、上記ポリペプチド鎖（ｙ）は同一でも異なっていてもよい。
また、タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数上記ｂ～ｎが同じポリペプチド鎖（ｙ）を複数有してもよく、ｂ～ｎが異なるポリペプチド鎖（ｙ）を複数有してもいい。
【0012】
ポリペプチド鎖（ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）としては、氷晶からの保護の観点から、ＧＶＧＶＰ配列（１）が好ましい。つまり、ポリペプチド鎖（ｙ）として（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列が好ましい。
【0013】
ポリペプチド鎖（ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２～２００個連続した（上記ｂ～ｎが２～２００）ポリペプチド鎖であるが、氷晶からの保護の観点から、連続する個数は２～２０個（上記ｂ～ｎが２～２０）が好ましく、さらに好ましくは８～１６個（上記ｂ～ｎが８～１６）である。
【0014】
ポリペプチド鎖（ｙ’）は、アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の６０％以下のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’）を含み、かつ、ポリペプチド鎖（ｙ）を構成するアミノ酸数の５％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、１つのポリペプチド鎖（ｙ’）において置換されたリシン及びアルギニンの合計個数が１～１００個である。
【0015】
ポリペプチド鎖（ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中のリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を、他のアミノ酸［グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）等］に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（ｙ）となるかによって判断する。
ポリペプチド鎖（ｙ’）において、置換されたリシン及び／又はアルギニンの合計個数は１～１００個であるが、氷晶からの保護の観点から、５～５０個が好ましく、さらに好ましくは１３～２６個である。
また、ポリペプチド鎖（ｙ’）において、置換されたリシン及び／又はアルギニンの割合は、１つのポリペプチド鎖（ｙ’）を構成するアミノ酸数に対し、５％以下であるが、氷晶からの保護の観点から、０．０６％～５％であることが好ましく、０．５～５％がさらに好ましく、特に好ましくは１～５％である。
ポリペプチド鎖（ｙ’）において、置換されたリシン及び／又はアルギニンの合計個数は１～１００個であるが、氷晶からの保護の観点から、５～５０個が好ましく、さらに好ましくは１３～２６個である。
また、ポリペプチド鎖（ｙ’）において、置換されたリシン及び／又はアルギニンの割合は、１つのポリペプチド鎖（ｙ’）を構成するアミノ酸数に対し、５％以下であるが、氷晶からの保護の観点から、０．０６％～５％であることが好ましく、０．５～５％がさらに好ましく、特に好ましくは１～５％である。
【0016】
アミノ酸配列（Ｘ’）として、具体的には、配列番号１７に示されるアミノ酸配列であるＧＫＧＶＰ配列（１７）、配列番号１８に示されるアミノ酸配列であるＧＫＧＫＰ配列（１８）、配列番号１９に示されるアミノ酸配列であるＧＫＧＲＰ配列（１９）及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列であるＧＲＧＲＰ配列（２０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の置換の数［リシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換された数］は、水への溶解性の観点から、１～５個が好ましく、さらに好ましくは１～３個である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）は、溶解性の観点から、アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の１０～６０％が置換されたアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは２０～６０％が置換されたアミノ酸配列である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、水への溶解性の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（１７）、ＧＫＧＫＰ配列（１８）及びＧＲＧＲＰ配列（２０）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（１７）及びＧＫＧＫＰ配列（１８）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の置換の数［リシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換された数］は、水への溶解性の観点から、１～５個が好ましく、さらに好ましくは１～３個である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）は、溶解性の観点から、アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の１０～６０％が置換されたアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは２０～６０％が置換されたアミノ酸配列である。
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、水への溶解性の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（１７）、ＧＫＧＫＰ配列（１８）及びＧＲＧＲＰ配列（２０）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（１７）及びＧＫＧＫＰ配列（１８）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【0017】
タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（ｙ）とポリペプチド鎖（ｙ’）の合計個数は、氷晶からの保護の観点から、１～１００個である。また、これらの合計個数は、氷晶からの保護の観点から、４～８０個が好ましく、さらに好ましくは４～６０個である。
【0018】
なお、タンパク質（Ａ）中に、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なるポリペプチド鎖（ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（ｙ’）についても同様である。
【0019】
本発明の細胞凍結保存剤では、タンパク質（Ａ）に含まれるアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、氷晶からの保護の観点から、タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数を基準として５０～７０％であることが好ましい。
上記の割合は、氷晶からの保護作用をさらに向上させる観点から、５２．５～６７．５％が好ましく、さらに好ましくは５５～６５％である。
上記の割合は、氷晶からの保護作用をさらに向上させる観点から、５２．５～６７．５％が好ましく、さらに好ましくは５５～６５％である。
【0020】
また、本発明の細胞凍結保存剤では、タンパク質（Ａ）に含まれるアミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、氷晶からの保護の観点から、タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数を基準として４０～６８％である。
上記の割合は、氷晶からの保護作用をさらに向上させる観点から、４５～６０％であることが好ましい。
上記の割合は、氷晶からの保護作用をさらに向上させる観点から、４５～６０％であることが好ましい。
【0021】
また、本発明の細胞凍結保存剤では、タンパク質（Ａ）に含まれるアミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、氷晶からの保護の観点から、タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数を基準として２～１０％である。
上記の割合は、氷晶からの保護作用をさらに向上させる観点から、５～９％であることが好ましい。
上記の割合は、氷晶からの保護作用をさらに向上させる観点から、５～９％であることが好ましい。
【0022】
タンパク質（Ａ）に含まれるアミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］は、氷晶からの保護の観点から、０．０９～０．２である。
【0023】
上記のタンパク質（Ａ）に含まれるアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合等は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
【0024】
＜タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断できる切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合を算出する。
特定のアミノ酸残基で切断できる切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合を算出する。
【0025】
本発明において、タンパク質（Ａ）は、氷晶からの保護及び水への溶解性の観点から、配列番号１４に示されるアミノ酸配列であるＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～５０個個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が連続する個数は、氷晶からの保護及び水への溶解性の観点から、２～５０個が好ましく、さらに好ましくは２～４０個であり、次にさらに好ましくは２～３０個であり、特に好ましくは２～１０個である。
タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｓ）が１個以上含まれていればよいが、氷晶からの保護及び水への溶解性の観点から、４～１００個含まれることが好ましく、さらに好ましくは４～６０個含まれることである。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が連続する個数は、氷晶からの保護及び水への溶解性の観点から、２～５０個が好ましく、さらに好ましくは２～４０個であり、次にさらに好ましくは２～３０個であり、特に好ましくは２～１０個である。
タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｓ）が１個以上含まれていればよいが、氷晶からの保護及び水への溶解性の観点から、４～１００個含まれることが好ましく、さらに好ましくは４～６０個含まれることである。
【0026】
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合［｛タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１４）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、氷晶からの保護の観点から、５～５０％が好ましく、さらに好ましくは１０～４７．５％であり、特に好ましくは２０～４５％である。
タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
【0027】
＜タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合＞
特定のアミノ酸残基で切断できる切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝］×１００
特定のアミノ酸残基で切断できる切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１４）を構成するアミノ酸数の割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝］×１００
【0028】
タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する場合、タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｓ）が、交互にそれぞれ４個以上化学結合したポリペプチド鎖（ＹＳ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（ＹＳ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｓ）が、交互にそれぞれ４個以上、直接（後述の介在アミノ酸配列（Ｚ）を介さず）、化学結合した構造であることが好ましい。
上記の通り、ポリペプチド鎖（ＹＳ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｓ）が、交互にそれぞれ４個以上、直接、化学結合した構造をとることで、タンパク質（Ａ）の分子は、分子内のポリペプチド鎖（Ｓ）部位同士の距離が近づくように、折りたたんだ高次構造をとりやすくなる。この高次構造が細胞周辺を保護することで、細胞死及び細胞の機能低下の原因となる、凍結時の氷晶の侵入を防いでいるものと推測される。
ポリペプチド鎖（ＹＳ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｓ）が、交互にそれぞれ４個以上、直接（後述の介在アミノ酸配列（Ｚ）を介さず）、化学結合した構造であることが好ましい。
上記の通り、ポリペプチド鎖（ＹＳ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｓ）が、交互にそれぞれ４個以上、直接、化学結合した構造をとることで、タンパク質（Ａ）の分子は、分子内のポリペプチド鎖（Ｓ）部位同士の距離が近づくように、折りたたんだ高次構造をとりやすくなる。この高次構造が細胞周辺を保護することで、細胞死及び細胞の機能低下の原因となる、凍結時の氷晶の侵入を防いでいるものと推測される。
【0029】
ポリペプチド鎖（ＹＳ）には、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、介在アミノ酸配列（Ｚ）、又は末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合してもよい。
【0030】
タンパク質（Ａ）では、ポリペプチド鎖（ｙ）、ポリペプチド鎖（ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、タンパク質（Ａ）は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していても良い。
介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を含まないペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、水への溶解性の観点から、１～３０個が好ましく、さらに好ましくは１～１５個、特に好ましくは１～１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、配列番号２１に示されるアミノ酸配列であるＶＡＡＧＹ配列（２１）、配列番号２２に示されるアミノ酸配列であるＧＡＡＧＹ配列（２２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸数の割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸の数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、氷晶からの保護の観点から、０～２５％が好ましく、さらに好ましくは０～２２．５％であり、特に好ましくは０．０１～１５％である。
介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を含まないペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、水への溶解性の観点から、１～３０個が好ましく、さらに好ましくは１～１５個、特に好ましくは１～１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、配列番号２１に示されるアミノ酸配列であるＶＡＡＧＹ配列（２１）、配列番号２２に示されるアミノ酸配列であるＧＡＡＧＹ配列（２２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸数の割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸の数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、氷晶からの保護の観点から、０～２５％が好ましく、さらに好ましくは０～２２．５％であり、特に好ましくは０．０１～１５％である。
【0031】
タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（ｙ）、ポリペプチド鎖（ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していても良い。
末端アミノ酸配列（Ｔ）を有する場合、タンパク質（Ａ）の末端の構造としては、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）に、末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造等が挙げられる。
なお、末端アミノ酸配列（Ｔ）に結合するＧＡＧＡＧＳ配列（１４）は、ポリペプチド鎖（Ｓ）を構成していなくてもよい。
末端アミノ酸配列（Ｔ）に結合するアミノ酸配列（Ｘ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成していなくてもよい。
末端アミノ酸配列（Ｔ）に結合するアミノ酸配列（Ｘ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成していなくてもよい。
末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を含まないペプチド配列である。
末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、水への溶解性の観点から、１～１００個が好ましく、さらに好ましくは１～５０個、特に好ましくは１～４０個である。（Ｔ）として、具体的には、配列番号２３に示されるアミノ酸配列であるＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（２３）、配列番号２４に示されるアミノ酸配列であるＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭＧＡＧＳ配列（２４）、配列番号２５に示されるアミノ酸配列であるＧＡＧＡＭＤＰＧＲＹＱＤＬＲＳ配列（２５）等が挙げられる。
末端アミノ酸配列（Ｔ）を有する場合、タンパク質（Ａ）の末端の構造としては、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）に、末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造等が挙げられる。
なお、末端アミノ酸配列（Ｔ）に結合するＧＡＧＡＧＳ配列（１４）は、ポリペプチド鎖（Ｓ）を構成していなくてもよい。
末端アミノ酸配列（Ｔ）に結合するアミノ酸配列（Ｘ）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成していなくてもよい。
末端アミノ酸配列（Ｔ）に結合するアミノ酸配列（Ｘ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成していなくてもよい。
末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を含まないペプチド配列である。
末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、水への溶解性の観点から、１～１００個が好ましく、さらに好ましくは１～５０個、特に好ましくは１～４０個である。（Ｔ）として、具体的には、配列番号２３に示されるアミノ酸配列であるＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（２３）、配列番号２４に示されるアミノ酸配列であるＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭＧＡＧＳ配列（２４）、配列番号２５に示されるアミノ酸配列であるＧＡＧＡＭＤＰＧＲＹＱＤＬＲＳ配列（２５）等が挙げられる。
【0032】
タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数に対する末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸数の割合は、氷晶からの保護の観点から、２５％以下が好ましく、さらに好ましくは２２．５％以下であり、特に好ましくは０．０１～１５％である。
【0033】
タンパク質（Ａ）は、前述の通り、生物工学的手法により細菌を用いて製造することがある。このような場合、発現させたタンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、タンパク質（Ａ）は末端アミノ酸配列（Ｔ）の内の末端側に、Ｎ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有しても良い。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｅ２タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ－１）グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ－１）グルタチオン
（ｉ－２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ－２）アミロース
（ｉ－３）ＨＱタグ （ｉｉ－３）ニッケル
（ｉ－４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ－４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ－５）ＨＡタグ （ｉｉ－５）抗ＨＡ抗体
（ｉ－６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ－６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ－７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ－７）ニッケル又はコバルト
精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ－１）グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ－１）グルタチオン
（ｉ－２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ－２）アミロース
（ｉ－３）ＨＱタグ （ｉｉ－３）ニッケル
（ｉ－４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ－４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ－５）ＨＡタグ （ｉｉ－５）抗ＨＡ抗体
（ｉ－６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ－６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ－７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ－７）ニッケル又はコバルト
精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【0034】
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）を構成する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸数、タンパク質（Ａ）を構成する全ての末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸数及び精製タグを構成するアミノ酸数の合計数の割合は、氷晶からの保護の観点から、タンパク質（Ａ）を構成する全アミノ酸数を基準として、０～２５％が好ましく、さらに好ましくは０～２２．５％であり、特に好ましくは０．０１～１５％である。
【0035】
タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）の個数と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率（ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）の個数：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数）は、氷晶からの保護及び水への溶解性の観点から、１：１～１：２０が好ましく、１：１～１：６がさらに好ましく、１：１～１：５が特に好ましく、１：１～１：４がとりわけ好ましく、１：１．５～１：４が最も好ましい。
【0036】
好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（Ａ１）：アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（１）であるタンパク質
（Ａ１１）：ＧＶＧＶＰ配列（１）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（ｙ１）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（ｙ’１）を有するタンパク質
（Ａ１１１）ポリペプチド鎖（ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１１１－１）：ＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続した配列番号２６に示されるアミノ酸配列である（ＧＶＧＶＰ）８配列（２６）のポリペプチド鎖（ｙ１１）の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された配列番号１６に示されるアミノ酸配列である（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）であるペプチド鎖（ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１１－１－１）：ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が４個連続した配列番号１５に示されるアミノ酸配列である（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１－１）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、配列番号２７に示されるアミノ酸配列である（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）が化学結合したタンパク質［分子質量が約８０ｋＤａの配列番号２８に示されるアミノ酸配列である配列（２８）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）］
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）をそれぞれ４個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約３０ｋＤａの配列番号２９に示されるアミノ酸配列である配列（２９）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ４）
（Ａ１１１－１－２）：（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）であるポリペプチド鎖（Ｓ１－２）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列番号３０に示されるアミノ酸配列である配列（３０）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
（Ａ１）：アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（１）であるタンパク質
（Ａ１１）：ＧＶＧＶＰ配列（１）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（ｙ１）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（ｙ’１）を有するタンパク質
（Ａ１１１）ポリペプチド鎖（ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１１１－１）：ＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続した配列番号２６に示されるアミノ酸配列である（ＧＶＧＶＰ）８配列（２６）のポリペプチド鎖（ｙ１１）の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された配列番号１６に示されるアミノ酸配列である（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）であるペプチド鎖（ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１１－１－１）：ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が４個連続した配列番号１５に示されるアミノ酸配列である（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１－１）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、配列番号２７に示されるアミノ酸配列である（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）が化学結合したタンパク質［分子質量が約８０ｋＤａの配列番号２８に示されるアミノ酸配列である配列（２８）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）］
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）をそれぞれ４個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約３０ｋＤａの配列番号２９に示されるアミノ酸配列である配列（２９）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ４）
（Ａ１１１－１－２）：（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）であるポリペプチド鎖（Ｓ１－２）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列番号３０に示されるアミノ酸配列である配列（３０）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
【0037】
（Ａ１１１－２）：ＧＶＧＶＰ配列（１）が１２個連続したポリペプチド鎖の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された配列番号３１に示されるアミノ酸配列である（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（３１）（ｙ’１２）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１１－２－１）：（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）と（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（３１）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（３１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）が化学結合した分子質量が約１０５ｋＤａの配列番号３２に示されるアミノ酸配列である配列（３２）のタンパク質
（Ａ１１１－２－１）：（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）と（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（３１）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（３１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）が化学結合した分子質量が約１０５ｋＤａの配列番号３２に示されるアミノ酸配列である配列（３２）のタンパク質
【0038】
これらの中では、配列（２８）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）であることが好ましい。
また、タンパク質（Ａ）は、配列（２８）のタンパク質のアミノ酸配列と相同性が７０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。
また、この相同性は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。
また、タンパク質（Ａ）は、配列（２８）のタンパク質のアミノ酸配列と相同性が７０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。
また、この相同性は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。
【0039】
本発明におけるタンパク質（Ａ）は、円二色性スペクトル法により求められるタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が６０～８５％であることが好ましい。タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等により、タンパク質中のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は異なる。
βターン構造とランダムコイル構造との合計割合が上記の範囲であると、氷晶からの保護効果が向上する。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、氷晶からの保護の観点から、さらに好ましくは６５～８０％であり、特に好ましくは７０～８０％である。
上記割合を制御する方法としては特に限定されないが、以下の方法により増加又は低下させることができる。
上記割合を増加させる場合には、例えば、タンパク質（Ａ）を例えば、単独のタンパク質（Ａ）を過剰量の緩衝液で希釈してからリフォールディングさせる希釈リフォールディング法（大希釈法）が挙げられる。
また、上記割合を低下させる場合には、例えば、タンパク質（Ａ）を変性剤や熱等により変性させる方法が挙げられる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、下記測定法によって求める。
βターン構造とランダムコイル構造との合計割合が上記の範囲であると、氷晶からの保護効果が向上する。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、氷晶からの保護の観点から、さらに好ましくは６５～８０％であり、特に好ましくは７０～８０％である。
上記割合を制御する方法としては特に限定されないが、以下の方法により増加又は低下させることができる。
上記割合を増加させる場合には、例えば、タンパク質（Ａ）を例えば、単独のタンパク質（Ａ）を過剰量の緩衝液で希釈してからリフォールディングさせる希釈リフォールディング法（大希釈法）が挙げられる。
また、上記割合を低下させる場合には、例えば、タンパク質（Ａ）を変性剤や熱等により変性させる方法が挙げられる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、下記測定法によって求める。
【0040】
＜タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ－８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）にてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらの合計をβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合とする。
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ－８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）にてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらの合計をβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合とする。
【0041】
タンパク質（Ａ）の分子質量は、氷晶からの保護の及び水への溶解性の観点から、１５～２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは３０～１５０ｋＤａであり、特に好ましくは７０～１２０ｋＤａである。
なお、タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、タンパク質（Ａ）を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
なお、タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、タンパク質（Ａ）を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
【0042】
本発明において、タンパク質（Ａ）の疎水性度は、氷晶からの保護及び水への溶解性の観点から、０．２～１．２であり、好ましくは０．５～１．２が好ましく、さらに好ましくは０．５～０．８であり、特に好ましくは０．５５～０．７５であり、最も好ましくは０．６０～０．７２である。
（Ａ）の疎水性度は、（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数（ＭＴ）を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（アルバート・Ｌ．レーニンジャー、デビット・Ｌ．ネルソン、レーニンジャーの新生化学上、廣川書店、２０１０年９月、ｐ．３４６－３４７）に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭＴ）
Ｍα：（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭＴ：（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：－４．５
Ｎ（アスパラギン）：－３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：－３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：－３．５
Ｅ（グルタミン酸）：－３．５
Ｇ（グリシン）：－０．４
Ｈ（ヒスチジン）：－３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：－３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：－１．６
Ｓ（セリン）：－０．８
Ｔ（トレオニン）：－０．７
Ｗ（トリプトファン）：－０．９
Ｙ（チロシン）：－１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１７）である場合、（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（－０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（－１．６）＋１（Ｋの数）×（－３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．００である。
（Ａ）の疎水性度は、（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数（ＭＴ）を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（アルバート・Ｌ．レーニンジャー、デビット・Ｌ．ネルソン、レーニンジャーの新生化学上、廣川書店、２０１０年９月、ｐ．３４６－３４７）に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭＴ）
Ｍα：（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭＴ：（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：－４．５
Ｎ（アスパラギン）：－３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：－３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：－３．５
Ｅ（グルタミン酸）：－３．５
Ｇ（グリシン）：－０．４
Ｈ（ヒスチジン）：－３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：－３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：－１．６
Ｓ（セリン）：－０．８
Ｔ（トレオニン）：－０．７
Ｗ（トリプトファン）：－０．９
Ｙ（チロシン）：－１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１７）である場合、（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（－０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（－１．６）＋１（Ｋの数）×（－３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．００である。
【0043】
アミノ酸配列（Ｘ）の疎水性度は、１．１～１．３である。
アミノ酸配列（Ｘ’）の疎水性度は、－３～－０．４である。
タンパク質（Ａ）は、上記の疎水性度のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を有することで、細胞と適度に相互作用し、細胞死及び細胞機能低下の原因となる氷晶の細胞内部への侵入を防止し、氷晶からの保護作用を発揮しているものと推測される。
アミノ酸配列（Ｘ’）の疎水性度は、－３～－０．４である。
タンパク質（Ａ）は、上記の疎水性度のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を有することで、細胞と適度に相互作用し、細胞死及び細胞機能低下の原因となる氷晶の細胞内部への侵入を防止し、氷晶からの保護作用を発揮しているものと推測される。
【0044】
本発明の細胞凍結保存剤は水を含む。
細胞凍結保存剤中の水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
細胞凍結保存剤中の水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
【0045】
細胞凍結保存剤に含まれる水の含有量は、タンパク質（Ａ）の溶解性の観点から５０重量％以上であることが好ましく、６０重量％以上であることがさらに好ましい。
また、細胞凍結保存剤に含まれる水の含有量の上限は、特に限定されないが、９７重量％以下、９４重量％以下、８４重量％以下等が挙げられる。
また、細胞凍結保存剤に含まれる水の含有量の上限は、特に限定されないが、９７重量％以下、９４重量％以下、８４重量％以下等が挙げられる。
【0046】
本発明の細胞凍結保存剤は、上記タンパク質（Ａ）以外に、アルコール（Ｂ）を含有する。
【0047】
アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合は、氷晶からの保護の観点から、アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％であり、５０～６０重量％であることが好ましく、５５～６０重量％であることがさらに好ましい。
アルコール（Ｂ）としては、炭素数２～５のアルコール（エチレングルコール、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオール、グリセロール等）等が挙げられる。
アルコール（Ｂ）としては、炭素数２～５のアルコール（エチレングルコール、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオール、グリセロール等）等が挙げられる。
【0048】
本発明の細胞凍結保存剤が含有するアルコール（Ｂ）の重量割合は、氷晶からの保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として、２～１０重量％である。
【0049】
本発明の細胞凍結保存剤が含有するアルコール（Ｂ）の重量と、タンパク質（Ａ）の重量との比率［アルコール（Ｂ）の重量／タンパク質（Ａ）の重量］は、氷晶からの保護の観点から、０．１～１０であることが好ましい。
【0050】
本発明の細胞凍結保存剤が含有するタンパク質（Ａ）及びアルコール（Ｂ）の合計重量の割合は、氷晶からの保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として、６重量％以上であることが好ましく、７重量％以上であることがさらに好ましい。
【0051】
アルコール（Ｂ）は、適度な親水性と疎水性のバランスを有することで、細胞内に含まれやすくなり、細胞死等の原因となる氷晶の発生源である水が、細胞内に存在する量を低減させているものと推測される。
さらに、適度な親水性と疎水性のバランスを有するタンパク質（Ａ）が、細胞及びアルコール（Ｂ）と相互作用することで、タンパク質（Ａ）と細胞との親和性が向上し、タンパク質（Ａ）による保護効果が向上するという効果、及び、細胞周辺のタンパク質（Ａ）の存在により、水の細胞膜透過による水の流入を抑制し、するという効果が好適に発揮され、溶解時に細胞の生存率及び細胞の機能が低下しにくいという効果が好適に発揮されると考えられる。
さらに、適度な親水性と疎水性のバランスを有するタンパク質（Ａ）が、細胞及びアルコール（Ｂ）と相互作用することで、タンパク質（Ａ）と細胞との親和性が向上し、タンパク質（Ａ）による保護効果が向上するという効果、及び、細胞周辺のタンパク質（Ａ）の存在により、水の細胞膜透過による水の流入を抑制し、するという効果が好適に発揮され、溶解時に細胞の生存率及び細胞の機能が低下しにくいという効果が好適に発揮されると考えられる。
【0052】
本発明の細胞凍結保存剤は、上記タンパク質（Ａ）、水及びアルコール（Ｂ）以外に、発明の効果を妨げない範囲で、ＤＭＳＯ、培地成分（血清、成長因子、糖、ビタミン、アミノ酸、ピルビン酸、フェノール指示薬等）、無機塩及びリン酸（塩）を含んでも良い。
【0053】
血清としては、ウシ血清（ＦＢＳ等）、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等などが挙げられる。
細胞凍結保存剤中の血清の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として１０～２５％が好ましい。
細胞凍結保存剤中の血清の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として１０～２５％が好ましい。
【0054】
本発明の細胞凍結保存剤が含有するＤＭＳＯの重量割合の上限は、細胞機能保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として、１０重量％以下であることが好ましく、７重量％以下であることがさらに好ましく、５重量％以下であることが特に好ましく、３重量％以下であることが最も好ましい。
本発明の細胞凍結保存剤がＤＭＳＯを含有する場合、ＤＭＳＯの重量割合の下限は、細胞機能保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として、１重量％以上が好ましく、２重量％以上であることがさらに好ましい。
また、本発明の細胞凍結保存剤がＤＭＳＯを含有する場合、タンパク質（Ａ）の重量と、ＤＭＳＯの重量との比率［タンパク質（Ａ）の重量／ＤＭＳＯの重量］は、細胞機能保護の観点から、０．１～１０が好ましく、０．５～６がさらに好ましい。
本発明の細胞凍結保存剤がＤＭＳＯを含有する場合、ＤＭＳＯの重量割合の下限は、細胞機能保護の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として、１重量％以上が好ましく、２重量％以上であることがさらに好ましい。
また、本発明の細胞凍結保存剤がＤＭＳＯを含有する場合、タンパク質（Ａ）の重量と、ＤＭＳＯの重量との比率［タンパク質（Ａ）の重量／ＤＭＳＯの重量］は、細胞機能保護の観点から、０．１～１０が好ましく、０．５～６がさらに好ましい。
【0055】
成長因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。
細胞凍結保存剤中の成長因子の含有量（重量ｐｐｍ）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～１０００が好ましく、さらに好ましくは０～１００であり、次にさらに好ましくは０～５０である。
細胞凍結保存剤中の成長因子の含有量（重量ｐｐｍ）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～１０００が好ましく、さらに好ましくは０～１００であり、次にさらに好ましくは０～５０である。
【0056】
糖としては、従来知られている糖が含まれ、具体的には、単糖（グルコース等）、オリゴ糖（ショ糖、ラクトース及びマンノース等）、多糖（ヒアルロン酸等）及びこれらが化学修飾されたもの等が挙げられる。
細胞凍結保存剤中の糖の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～１重量％が好ましく、０．１～０．５重量％が好ましい。
細胞凍結保存剤中の糖の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～１重量％が好ましく、０．１～０．５重量％が好ましい。
【0057】
ビタミンとしては、従来知られているビタミンが含まれ、具体的には、ミオイノシトール、ニコチン酸、塩酸ピリドキシン及び塩酸チアミン等が挙げられる。
細胞凍結保存剤中のビタミンの含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細細凍結胞保存剤の重量を基準として０～０．０１重量％が好ましい。
細胞凍結保存剤中のビタミンの含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細細凍結胞保存剤の重量を基準として０～０．０１重量％が好ましい。
【0058】
アミノ酸としては、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。
細胞凍結保存剤中のアミノ酸の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～０．２重量％が好ましい。
細胞凍結保存剤中のアミノ酸の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～０．２重量％が好ましい。
【0059】
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
細胞凍結保存剤中の塩の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５～１．３重量％であり、特に好ましくは０．７～１．１重量％であり、最も好ましくは０．８５～０．９５重量％である。
細胞凍結保存剤中の塩の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５～１．３重量％であり、特に好ましくは０．７～１．１重量％であり、最も好ましくは０．８５～０．９５重量％である。
【0060】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
細胞凍結保存剤中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
細胞凍結保存剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１０～０．３０重量％であり、特に好ましくは０．１２～０．２８重量％であり、最も好ましくは０．１４～０．２６重量％である。
細胞凍結保存剤中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
細胞凍結保存剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の重量を基準として０～０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１０～０．３０重量％であり、特に好ましくは０．１２～０．２８重量％であり、最も好ましくは０．１４～０．２６重量％である。
【0061】
細胞凍結保存剤のｐＨは、細胞保存性の観点から、６～８が好ましく、さらに好ましく
は６．８～７．２である。
は６．８～７．２である。
【0062】
また、水及びその他の成分（培地成分等）を含む下記培地を用いて細胞凍結保存剤を作成してもよい。培地を用いて細胞凍結保存剤を作成した場合の、細胞凍結保存剤中の各成分の好ましい含有量、好ましいｐＨは、上述と同じである。
培地としては、無血清培地及び血清培地が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ－４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ－ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ－ＣＨＯ ＡＧＴＴＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ－１００培地、Ｓｆ－９００ＩＩ培地、Ｅｘ－ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
これらのうち、細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ－ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ－ＣＨＯ ＡＧＴＴＭ培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ－ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
血清培地としては、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ－１００培地、Ｓｆ－９００ＩＩ培地、Ｅｘ－ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
培地としては、無血清培地及び血清培地が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ－４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ－ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ－ＣＨＯ ＡＧＴＴＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ－１００培地、Ｓｆ－９００ＩＩ培地、Ｅｘ－ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
これらのうち、細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ－ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ－ＣＨＯ ＡＧＴＴＭ培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ－ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
血清培地としては、一般の培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ－１００培地、Ｓｆ－９００ＩＩ培地、Ｅｘ－ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
【0063】
本発明の細胞凍結保存剤の製造方法としては、特に限定ないが、一例を下記に示す。
水を含む２０～４０℃の溶液（前記の培地等）に、所定量のタンパク質（Ａ）を添加し、均一になるまで室温（例えば２５℃）で振とう混和する。
混和の方法としては、遠心分離（３，０００ｇ，３分間等）及びピペッティング等の操作を数回繰り返す方法等が挙げられる。
水を含む２０～４０℃の溶液（前記の培地等）に、所定量のタンパク質（Ａ）を添加し、均一になるまで室温（例えば２５℃）で振とう混和する。
混和の方法としては、遠心分離（３，０００ｇ，３分間等）及びピペッティング等の操作を数回繰り返す方法等が挙げられる。
【0064】
本発明の細胞（Ｃ）の細胞凍結保存方法は、本発明の細胞凍結保存剤を用いて、細胞（Ｃ）を凍結保存する方法である。
【0065】
また、本発明の細胞凍結保存剤の使用方法としては、特に限定ないが、一例を下記に示す。
（Ｉ）細胞凍結保存剤を２０～４０℃に温調する。
（ＩＩ）（Ｉ）の細胞凍結保存剤中に細胞を添加し、ピペット等を用いて懸濁させる。
（ＩＩＩ）細胞を懸濁させた（ＩＩ）の溶液を、２０～４０℃に温調する。
上記（ＩＩ）において、細胞数は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の体積を基準として、１０３～１０７個／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは１０５～１０６個／ｍＬである。
（ＩＶ）（ＩＩＩ）で得た液を、凍結保存容器（コスモ・バイオ（株）製ミスターフロスティー等）に入れ、例えば－８０℃のディープフリーザー庫内で、例えば１℃／ｍｉｎの凍結速度で凍結する。また、－８０℃での凍結保存後（１８～３０時間後等）、に凍結したサンプルを液体窒素中（－１９６℃）に移し保存する。（凍結保存の期間は、１～４０日間であることが好ましい。）
（Ｉ）細胞凍結保存剤を２０～４０℃に温調する。
（ＩＩ）（Ｉ）の細胞凍結保存剤中に細胞を添加し、ピペット等を用いて懸濁させる。
（ＩＩＩ）細胞を懸濁させた（ＩＩ）の溶液を、２０～４０℃に温調する。
上記（ＩＩ）において、細胞数は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の体積を基準として、１０３～１０７個／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは１０５～１０６個／ｍＬである。
（ＩＶ）（ＩＩＩ）で得た液を、凍結保存容器（コスモ・バイオ（株）製ミスターフロスティー等）に入れ、例えば－８０℃のディープフリーザー庫内で、例えば１℃／ｍｉｎの凍結速度で凍結する。また、－８０℃での凍結保存後（１８～３０時間後等）、に凍結したサンプルを液体窒素中（－１９６℃）に移し保存する。（凍結保存の期間は、１～４０日間であることが好ましい。）
【0066】
本発明の細胞凍結保存剤を用いて保存できる細胞（Ｃ）としては、特に限定はなく、接着性細胞（Ｃ１）及び浮遊性細胞（Ｃ２）が含まれる。
接着性細胞（Ｃ１）は、幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、中皮細胞、内皮細胞及びがん細胞等であり、具体的には、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳ細胞、線維芽細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞、骨前駆細胞、表皮細胞、腺房細胞、腺細胞、腹膜由来細胞、血管内皮細胞、肝がん細胞、腸がん細胞、肺がん細胞等が挙げられる。
接着性細胞（Ｃ１）としては、具体的には、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞及びｈＡＤＳＣ細胞等が挙げられる。
浮遊性細胞（Ｃ２）は、血球系細胞であり、具体的には、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等が挙げられる。
浮遊性細胞（Ｃ２）としては、具体的には、ＴＨＰ－１細胞等が挙げられる。
接着性細胞（Ｃ１）は、幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、中皮細胞、内皮細胞及びがん細胞等であり、具体的には、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳ細胞、線維芽細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞、骨前駆細胞、表皮細胞、腺房細胞、腺細胞、腹膜由来細胞、血管内皮細胞、肝がん細胞、腸がん細胞、肺がん細胞等が挙げられる。
接着性細胞（Ｃ１）としては、具体的には、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞及びｈＡＤＳＣ細胞等が挙げられる。
浮遊性細胞（Ｃ２）は、血球系細胞であり、具体的には、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球等が挙げられる。
浮遊性細胞（Ｃ２）としては、具体的には、ＴＨＰ－１細胞等が挙げられる。
【0067】
本発明の細胞凍結保存剤の使用方法としては、細胞の凍結保存剤として使用できる。
本発明の細胞凍結保存剤は、細胞凍結保存剤に細胞を懸濁して細胞を保存しても良く、細胞懸濁液中に添加しても良い。
細胞を懸濁させた溶液中に添加する場合、細胞懸濁液中のタンパク質（Ａ）の濃度は、細胞保存性の観点から、細胞懸濁液の重量を基準として、０．５～１５重量％が好ましく、さらに好ましくは２～１０重量％である。
細胞（Ｃ）の濃度は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の体積を基準として、１０３～１０７個／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは１０５～１０６個／ｍＬである。
本発明の細胞凍結保存剤は、細胞凍結保存剤に細胞を懸濁して細胞を保存しても良く、細胞懸濁液中に添加しても良い。
細胞を懸濁させた溶液中に添加する場合、細胞懸濁液中のタンパク質（Ａ）の濃度は、細胞保存性の観点から、細胞懸濁液の重量を基準として、０．５～１５重量％が好ましく、さらに好ましくは２～１０重量％である。
細胞（Ｃ）の濃度は、細胞保存性の観点から、細胞凍結保存剤の体積を基準として、１０３～１０７個／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは１０５～１０６個／ｍＬである。
【0068】
本明細書には、以下の事項が開示されている。
【0069】
本開示（１）は、タンパク質（Ａ）、水及びアルコール（Ｂ）を含有する細胞凍結保存剤であって、前記アルコール（Ｂ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として２～１０重量％であり、前記タンパク質（Ａ）の重量割合が、細胞凍結保存剤の重量を基準として０．５～１５重量％であり、前記タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（ｙ）とポリペプチド鎖（ｙ’）との合計個数が１～１００個であり、前記ポリペプチド鎖（ｙ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２～２００個連続したポリペプチド鎖であり、前記ポリペプチド鎖（ｙ’）は、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸数の６０％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換された前記アミノ酸配列（Ｘ’）を含み、かつ、前記ポリペプチド鎖（ｙ）を構成するアミノ酸数の５％以下のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、１つの前記ポリペプチド鎖（ｙ’）において置換された前記リシン及び前記アルギニンの合計個数は１～１００個であり、前記アミノ酸配列（Ｘ）の疎水性度が１．１～１．３であり、前記アミノ酸配列（Ｘ’）の疎水性度が－３～－０．４であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、４０～６８％であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合が、タンパク質（Ａ）を構成するアミノ酸数を基準として、２～１０％であり、前記タンパク質（Ａ）に含まれる前記アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、前記アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］が０．０９～０．２であり、前記タンパク質（Ａ）の疎水性度が０．２～１．２であり、前記アルコール（Ｂ）が有する水酸基の重量割合が、前記アルコール（Ｂ）の重量を基準として、４０～６０重量％である細胞凍結保存剤である。
【0070】
本開示（２）は、前記タンパク質（Ａ）が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列であるＧＡＧＡＧＳ配列（１４）が２～５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）をさらに有する本開示（１）に記載の細胞凍結保存剤である。
【0071】
本開示（３）は、前記タンパク質（Ａ）１分子中の、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）の個数と、前記アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１４）：アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝が、１：１～１：２０である本開示（２）に記載の細胞凍結保存剤である。
【0072】
本開示（４）は、タンパク質（Ａ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５～２００ｋＤａである本開示（１）～（３）のいずれかに記載の細胞凍結保存剤である。
【0073】
本開示（５）は、タンパク質（Ａ）が、前記ＧＶＧＶＰ配列（１）が２～２００個連続したポリペプチド鎖（ｙ１）中の１個のアミノ酸がリシンで置換されたポリペプチド鎖（ｙ’１）を有するタンパク質（Ａ１１）である本開示（１）～（４）のいずれかに記載の細胞凍結保存剤である。
【0074】
本開示（６）は、タンパク質（Ａ）が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列である（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）であるポリペプチド鎖（Ｓ１－１）及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列である（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）であるポリペプチド鎖（ｙ’１１）を有する人工タンパク質（Ａ１１１－１－１）である本開示（１）～（５）のいずれかに記載の細胞凍結保存剤である。
【0075】
本開示（７）は、前記タンパク質（Ａ）は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列を有する本開示（１）に記載の細胞凍結保存剤である。
【0076】
本開示（８）は、本開示（１）～（７）のいずれかに記載の凍結保存剤を用いて細胞（Ｃ）を凍結保存する方法である細胞凍結保存方法である。
【実施例0077】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、部は重量部を示す。
【0078】
＜製造例１＞
（１）タンパク質（Ａ－１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）の作製
○ＳＥＬＰ８Ｋの生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、配列（２８）を有するタンパク質（Ａ－１）を生産する方法を示す。
（１）タンパク質（Ａ－１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）の作製
○ＳＥＬＰ８Ｋの生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、配列（２８）を有するタンパク質（Ａ－１）を生産する方法を示す。
【0079】
○ＳＥＬＰ８Ｋ生産株の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍＬフラスコ中のＬＢ培地５０ｍＬに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）培養した。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：（株）島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍＬを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍＬフラスコ中のＬＢ培地５０ｍＬに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）培養した。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：（株）島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍＬを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
【0080】
○ＳＥＬＰ８Ｋの精製
集菌した大腸菌を用い、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陽イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２８）を有するタンパク質の精製物である製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）を得た。
集菌した大腸菌を用い、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陽イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２８）を有するタンパク質の精製物である製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）を得た。
【0081】
１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
【0082】
２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
【0083】
３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８～１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８～１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８～１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８～１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
【0084】
４：限外濾過
「３：硫安沈殿」で得た溶液を分子質量３０，０００Ｄａカットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア社製）に供した。「３：硫安沈殿」で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
「３：硫安沈殿」で得た溶液を分子質量３０，０００Ｄａカットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア社製）に供した。「３：硫安沈殿」で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【0085】
５：陽イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陽イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｉｌｏｔ（ＧＥヘルスケア社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陽イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｉｌｏｔ（ＧＥヘルスケア社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
【0086】
６：限外濾過
「５：陽イオン交換クロマトグラフィー」で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
「５：陽イオン交換クロマトグラフィー」で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【0087】
７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して５ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス（株）製）に入れて、－４０℃、１６時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、－２０℃で、９０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させた。このようにして、製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）を得た。
タンパク質を脱イオン水に溶解して５ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス（株）製）に入れて、－４０℃、１６時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、－２０℃で、９０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させた。このようにして、製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）（ＳＥＬＰ８Ｋ）を得た。
【0088】
○ＳＥＬＰ８Ｋの同定
製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量８０ｋＤａの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。
また、アミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所製）を用いたアミノ酸組成分析より得られた製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）のアミノ酸の組成物率（実測値）と、合成遺伝子配列から推測されるＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の組成物率（理論値）を表１に示す。
これらから、製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）は、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）が化学結合してなる配列（２８）を有するタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）であることを確認した。
即ち、タンパク質（Ａ－１）において、
アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合は、タンパク質（Ａ－１）の全アミノ酸数を基準として５１％であり、
アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合は、タンパク質（Ａ－１）の全アミノ酸数を基準として７％であり、
アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］は、０．１４である。
また、タンパク質（Ａ－１）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）［ＧＶＧＶＰ（１）］の疎水性度は、１．２であり、
タンパク質（Ａ－１）を構成するアミノ酸配列（Ｘ’）［ＧＫＧＶＰ（１７）］の疎水性度は、－０．４２であり、
タンパク質（Ａ－１）疎水性度は、０．６２である。
製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量８０ｋＤａの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。
また、アミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所製）を用いたアミノ酸組成分析より得られた製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）のアミノ酸の組成物率（実測値）と、合成遺伝子配列から推測されるＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の組成物率（理論値）を表１に示す。
これらから、製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）は、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２７）が化学結合してなる配列（２８）を有するタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）であることを確認した。
即ち、タンパク質（Ａ－１）において、
アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数の割合は、タンパク質（Ａ－１）の全アミノ酸数を基準として５１％であり、
アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数の割合は、タンパク質（Ａ－１）の全アミノ酸数を基準として７％であり、
アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数と、アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数との比率［アミノ酸配列（Ｘ’）を構成するアミノ酸の合計個数／アミノ酸配列（Ｘ）を構成するアミノ酸の合計個数］は、０．１４である。
また、タンパク質（Ａ－１）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）［ＧＶＧＶＰ（１）］の疎水性度は、１．２であり、
タンパク質（Ａ－１）を構成するアミノ酸配列（Ｘ’）［ＧＫＧＶＰ（１７）］の疎水性度は、－０．４２であり、
タンパク質（Ａ－１）疎水性度は、０．６２である。
【0089】
【表1】
【0090】
＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ［１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６重量％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３重量％ ブロモフェノールブルー、及び３０重量％ グリセロールを含む］１０μＬを添加して９５℃で５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレンにトランスファー（以下、「メンブレン」と略記）し、これをブロッキングバッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５重量％ スキムミルクを含む］に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む］で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及び抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ－Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社製）をＴＢＳ－Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ－Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ［１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６重量％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３重量％ ブロモフェノールブルー、及び３０重量％ グリセロールを含む］１０μＬを添加して９５℃で５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレンにトランスファー（以下、「メンブレン」と略記）し、これをブロッキングバッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５重量％ スキムミルクを含む］に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む］で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及び抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ－Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社製）をＴＢＳ－Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ－Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。
【0091】
○βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定
製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。
＜βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定＞
製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）水溶液を作製した。作製した製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ－８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を算出した。結果は、７０．９％であった。
製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。
＜βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定＞
製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）水溶液を作製した。作製した製造例１に係るタンパク質（Ａ－１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ－８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を算出した。結果は、７０．９％であった。
【0092】
＜実施例１～１９及び比較例１～５＞
本発明の細胞凍結保存剤は、以下の方法で製造した。
（１）タンパク質（Ａ－１）に、血清を含まない培地を、表２に記載の重量比率となるように添加し、均一になるまで２５℃で混和した。
培地はＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞又はｈＡＤＳＣ細胞を培養する場合はαＭＥＭ培地（１重量％ＰＳ含有）を、ＴＨＰ－１細胞を培養する場合はＲＰＭＩ１６４０培地（１重量％ＰＳ含有）を用いた。
（２）（１）で調製した溶液に、表２に記載のアルコールを、表２に記載の重量比率となるように添加し以降の実験に用いた。
本発明の細胞凍結保存剤は、以下の方法で製造した。
（１）タンパク質（Ａ－１）に、血清を含まない培地を、表２に記載の重量比率となるように添加し、均一になるまで２５℃で混和した。
培地はＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞又はｈＡＤＳＣ細胞を培養する場合はαＭＥＭ培地（１重量％ＰＳ含有）を、ＴＨＰ－１細胞を培養する場合はＲＰＭＩ１６４０培地（１重量％ＰＳ含有）を用いた。
（２）（１）で調製した溶液に、表２に記載のアルコールを、表２に記載の重量比率となるように添加し以降の実験に用いた。
【0093】
【表2】
【0094】
＜細胞の培養＞
マウス頭蓋冠細胞として、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞としてｈＡＤＳＣを使用した。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞及びｈＡＤＳＣ細胞は、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２条件下で十分量が得られるまで培養した。
ヒト血球系細胞として、ＴＨＰ－１細胞を使用した。ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２条件下で充分量が得られるまで培養した。
マウス頭蓋冠細胞として、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞としてｈＡＤＳＣを使用した。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞及びｈＡＤＳＣ細胞は、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２条件下で十分量が得られるまで培養した。
ヒト血球系細胞として、ＴＨＰ－１細胞を使用した。ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２条件下で充分量が得られるまで培養した。
【0095】
＜凍結保存サンプルの調製方法＞
上記の＜細胞の培養＞にて培地をアスピレーターで除去した後、少量のＰＢＳ（－）（１００ｍｍ培養皿に対して５ｍＬ）で洗浄し、その後トリプシン水溶液（２．５ｇ／Ｌ－トリプシン、１ｍＭ－ＥＤＴＡを含有、ナカライテスク株式会社製）（１００ｍｍ培養皿に対して２ｍＬ）を加え３７℃，５体積％ＣＯ２下で５分間インキュベーションした。その後、トリプシンと当量の培地を加え遠心分離（２００ｇ，３分間）して細胞を回収した。
なお、ＴＨＰ－１細胞（浮遊細胞）を培養した場合は、上記のトリプシン処理をせず、遠心分離して回収した。
各凍結保存条件に対し１５ｍＬｔｕｂｅに細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓになるように分取し、遠心分離後（２００ｇ，３分間）にアスピレーターにより上清を取り除きＰＢＳ（－）を３ｍＬ加えて懸濁し洗浄した。その後、遠心分離し再度上清を取り除いた。上記のＰＢＳ（－）による洗浄操作は２回繰り返した。
その後、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように実施例１～１９及び比較例１～５で調製した細胞凍結保存剤を３ｍＬ加えて懸濁し各クライオチューブに１ｍＬずつ分注した。
上記の＜細胞の培養＞にて培地をアスピレーターで除去した後、少量のＰＢＳ（－）（１００ｍｍ培養皿に対して５ｍＬ）で洗浄し、その後トリプシン水溶液（２．５ｇ／Ｌ－トリプシン、１ｍＭ－ＥＤＴＡを含有、ナカライテスク株式会社製）（１００ｍｍ培養皿に対して２ｍＬ）を加え３７℃，５体積％ＣＯ２下で５分間インキュベーションした。その後、トリプシンと当量の培地を加え遠心分離（２００ｇ，３分間）して細胞を回収した。
なお、ＴＨＰ－１細胞（浮遊細胞）を培養した場合は、上記のトリプシン処理をせず、遠心分離して回収した。
各凍結保存条件に対し１５ｍＬｔｕｂｅに細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓになるように分取し、遠心分離後（２００ｇ，３分間）にアスピレーターにより上清を取り除きＰＢＳ（－）を３ｍＬ加えて懸濁し洗浄した。その後、遠心分離し再度上清を取り除いた。上記のＰＢＳ（－）による洗浄操作は２回繰り返した。
その後、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように実施例１～１９及び比較例１～５で調製した細胞凍結保存剤を３ｍＬ加えて懸濁し各クライオチューブに１ｍＬずつ分注した。
【0096】
＜凍結保存方法＞
上記の＜凍結保存サンプルの調製方法＞で得た細胞凍結保存サンプルを含有するクライオチューブを、標線まで、２－プロパノールを注いだ凍結保存容器（ミスターフロスティー、コスモ・バイオ（株）製）に入れ、－８０℃のディープフリーザー庫内で、１℃／ｍｉｎの凍結速度で凍結した。２４時間後に、凍結したサンプルを液体窒素中（－１９６℃）に移し、３日間保存した。
上記の＜凍結保存サンプルの調製方法＞で得た細胞凍結保存サンプルを含有するクライオチューブを、標線まで、２－プロパノールを注いだ凍結保存容器（ミスターフロスティー、コスモ・バイオ（株）製）に入れ、－８０℃のディープフリーザー庫内で、１℃／ｍｉｎの凍結速度で凍結した。２４時間後に、凍結したサンプルを液体窒素中（－１９６℃）に移し、３日間保存した。
【0097】
細胞の凍結保存後に、以下の方法で、細胞生存率、細胞初期接着率及び細胞増殖率を測定した。
【0098】
（１）細胞生存率の測定
表２に示す実施例及び比較例に関して、細胞生存率の評価を、トリパンブルー（０．０５％ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル含有生理食塩水含有，ナカライテスク株式会社製）染色法にて行った。
まず、液体窒素中に保存していたサンプルを３７℃で３分間温浴させ急速溶解させた。次に、１５ｍＬチューブ中に溶解したサンプル１ｍＬをＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ）３ｍＬで希釈し、遠心分離（２００ｇ，３分間）し上清を取り除いた。ＭＥＭα培地１ｍＬ／ｔｕｂｅで細胞を再懸濁した。その後細胞懸濁液１０μＬ、トリパンブルー溶液１０μＬ混ぜて１０μＬの混合液を細胞計測盤（ワケンカウンター，ワケンビューテック株式会社製）に入れて生細胞数、死細胞数を各区画（５区画／枚）カウントした。
細胞生存率は以下の式に従い各区画（生細胞数最大と最小の区画は除外）にて算出した。
各区画の細胞生存率（％）＝生細胞数／（生細胞数＋死細胞数）×１００
上記の各サンプルの細胞生存率は３回で実施し、その平均値を細胞生存率とした。
また、細胞としてＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を用いる場合、上記の＜凍結保存方法＞において、液体窒素中での保存期間を３日間から７日間に変更した条件での試験も実施した。
表２に示す実施例及び比較例に関して、細胞生存率の評価を、トリパンブルー（０．０５％ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル含有生理食塩水含有，ナカライテスク株式会社製）染色法にて行った。
まず、液体窒素中に保存していたサンプルを３７℃で３分間温浴させ急速溶解させた。次に、１５ｍＬチューブ中に溶解したサンプル１ｍＬをＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ）３ｍＬで希釈し、遠心分離（２００ｇ，３分間）し上清を取り除いた。ＭＥＭα培地１ｍＬ／ｔｕｂｅで細胞を再懸濁した。その後細胞懸濁液１０μＬ、トリパンブルー溶液１０μＬ混ぜて１０μＬの混合液を細胞計測盤（ワケンカウンター，ワケンビューテック株式会社製）に入れて生細胞数、死細胞数を各区画（５区画／枚）カウントした。
細胞生存率は以下の式に従い各区画（生細胞数最大と最小の区画は除外）にて算出した。
各区画の細胞生存率（％）＝生細胞数／（生細胞数＋死細胞数）×１００
上記の各サンプルの細胞生存率は３回で実施し、その平均値を細胞生存率とした。
また、細胞としてＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を用いる場合、上記の＜凍結保存方法＞において、液体窒素中での保存期間を３日間から７日間に変更した条件での試験も実施した。
【0099】
（２）凍結保存後の細胞初期接着率の測定
表２に示す実施例及び比較例に関して、保存期間が３日間のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞及びｈＡＤＳＣについて（１）で得た再懸濁後の液を、６ｗｅｌｌプレートに添加した。その際、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ）を用いて１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの生細胞密度となるように、２ｍＬ／穴の量となるように、６ｗｅｌｌプレート添加した。その後、３７℃インキュベーター内に３時間培養した。
３時間後（培養終了後）、アスピレーターを用いて培地を除去し、ＰＢＳ（－）を細胞に直接当たらないように注意しながら１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、アスピレーターを用いてＰＢＳ（－）を除去した。
次に、トリプシン水溶液（２．５ｇ／Ｌ－トリプシン，１ｍＭ－ＥＤＴＡを含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に５分間放置した。
５分後に、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（２００ｇ，３ｍｉｎ）の後、上清を取り除いた。
ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を用いて、１００μＬ／ｔｕｂｅとなるように再懸濁し、トリパンブルー（ナカライテスク製）染色にて生細胞数をカウントした。得られた生細胞数から以下の式を用い細胞接着率を算出した。なお、試験は３回実施し、その平均値を各細胞凍結保存剤の細胞初期接着率とした。
結果を表２に示す。
なお、細胞増殖率が高いほど、凍結保存により、細胞の機能が損なわれていないことを示す。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
Ｘ：３時間後トリプシン処理にて回収した生細胞数
Ｘ０：１．０×１０５（播種した生細胞数）
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロットし、近似直線を描き、コーティング量が２．５のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とする。
表２に示す実施例及び比較例に関して、保存期間が３日間のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞及びｈＡＤＳＣについて（１）で得た再懸濁後の液を、６ｗｅｌｌプレートに添加した。その際、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ）を用いて１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの生細胞密度となるように、２ｍＬ／穴の量となるように、６ｗｅｌｌプレート添加した。その後、３７℃インキュベーター内に３時間培養した。
３時間後（培養終了後）、アスピレーターを用いて培地を除去し、ＰＢＳ（－）を細胞に直接当たらないように注意しながら１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、アスピレーターを用いてＰＢＳ（－）を除去した。
次に、トリプシン水溶液（２．５ｇ／Ｌ－トリプシン，１ｍＭ－ＥＤＴＡを含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に５分間放置した。
５分後に、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（２００ｇ，３ｍｉｎ）の後、上清を取り除いた。
ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を用いて、１００μＬ／ｔｕｂｅとなるように再懸濁し、トリパンブルー（ナカライテスク製）染色にて生細胞数をカウントした。得られた生細胞数から以下の式を用い細胞接着率を算出した。なお、試験は３回実施し、その平均値を各細胞凍結保存剤の細胞初期接着率とした。
結果を表２に示す。
なお、細胞増殖率が高いほど、凍結保存により、細胞の機能が損なわれていないことを示す。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
Ｘ：３時間後トリプシン処理にて回収した生細胞数
Ｘ０：１．０×１０５（播種した生細胞数）
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロットし、近似直線を描き、コーティング量が２．５のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とする。
【0100】
（３）細胞増殖率の測定
表２に示す実施例及び比較例に関して、保存期間が３日間のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞、ｈＡＤＳＣ及びＴＨＰ－１細胞について（１）で得た再懸濁後の液を、６ｗｅｌｌプレートに添加した。その際、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ）を用いて１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの生細胞密度となるように、２ｍＬ／穴の量となるように、６ｗｅｌｌプレートに添加した。その後、３７℃インキュベーター内に１，３又は４日間培養した。
各培養期間終了後（１、３又は４日後）、アスピレーターを用いて培地を除去し、ＰＢＳ（－）を細胞に直接当たらないように注意しながら１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、アスピレーターを用いてＰＢＳ（－）を除去した。
次に、トリプシン水溶液（２．５ｇ／Ｌ－トリプシン，１ｍＭ－ＥＤＴＡを含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に５分間放置した。
５分後に、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し遠心分離（２００ｇ，３ｍｉｎ）の後上清を取り除いた。
ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を用いて、１日間培養した時は１００μＬ／ｔｕｂｅとなるように、３日間及び４日間培養した時は５００～６００μＬ／ｔｕｂｅとなるように再懸濁し、トリパンブルー（ナカライテスク製）染色にて生細胞数をカウントした。得られた生細胞数から以下の式を用い細胞増殖率を算出した。なお、試験は３回実施し、その平均値を各細胞凍結保存剤の細胞増殖率とした。結果を表２に示す。
細胞増殖率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
Ｘ：培養期間終了後（１、３又は４日後）トリプシン処理にて回収した生細胞数
Ｘ０：１．０×１０５ （播種した生細胞数）
表２に示す実施例及び比較例に関して、保存期間が３日間のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞、ｈＡＤＳＣ及びＴＨＰ－１細胞について（１）で得た再懸濁後の液を、６ｗｅｌｌプレートに添加した。その際、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ）を用いて１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの生細胞密度となるように、２ｍＬ／穴の量となるように、６ｗｅｌｌプレートに添加した。その後、３７℃インキュベーター内に１，３又は４日間培養した。
各培養期間終了後（１、３又は４日後）、アスピレーターを用いて培地を除去し、ＰＢＳ（－）を細胞に直接当たらないように注意しながら１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、アスピレーターを用いてＰＢＳ（－）を除去した。
次に、トリプシン水溶液（２．５ｇ／Ｌ－トリプシン，１ｍＭ－ＥＤＴＡを含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に５分間放置した。
５分後に、ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し遠心分離（２００ｇ，３ｍｉｎ）の後上清を取り除いた。
ＭＥＭα培地（１０重量％ＦＢＳ，１重量％ＰＳ含有）を用いて、１日間培養した時は１００μＬ／ｔｕｂｅとなるように、３日間及び４日間培養した時は５００～６００μＬ／ｔｕｂｅとなるように再懸濁し、トリパンブルー（ナカライテスク製）染色にて生細胞数をカウントした。得られた生細胞数から以下の式を用い細胞増殖率を算出した。なお、試験は３回実施し、その平均値を各細胞凍結保存剤の細胞増殖率とした。結果を表２に示す。
細胞増殖率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
Ｘ：培養期間終了後（１、３又は４日後）トリプシン処理にて回収した生細胞数
Ｘ０：１．０×１０５ （播種した生細胞数）
【0101】
表２に示すように、各実施例に係る細胞凍結保存剤を用いて細胞を凍結保存した場合、溶解後の細胞生存率、細胞初期接着率及び細胞増殖率が高いことが判明した。
従って、各実施例に係る細胞凍結保存剤を用いて細胞を凍結保存すると、溶解時に細胞の生存率及び細胞の機能が低下しにくいという効果を奏することが判明した。
従って、各実施例に係る細胞凍結保存剤を用いて細胞を凍結保存すると、溶解時に細胞の生存率及び細胞の機能が低下しにくいという効果を奏することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【0102】
本発明の細胞凍結保存剤は、細胞を凍結保存する際の細胞凍結保存剤として使用できる。
【配列表】