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特開2024-112895変更されたＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024112895
(43)【公開日】2024-08-21
(54)【発明の名称】変更されたＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 9/16 20060101AFI20240814BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240814BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240814BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240814BHJP
【ＦＩ】
C12N9/16 Z ZNA
C07K19/00
C12N15/09 110
C12N9/16 Z
C12N15/55
【審査請求】有
【請求項の数】31
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024080681
(22)【出願日】2024-05-17
(62)【分割の表示】P 2020511253の分割
【原出願日】2018-08-22
(31)【優先権主張番号】62/549,303
(32)【優先日】2017-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/641,687
(32)【優先日】2018-03-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，キース，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】クラインスティーバー，ベンジャミン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】変更および改善されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有する、遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼを提供する。
【解決手段】一般に使用される化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択に基づく指向進化およびコンビナトリアル設計を使用して、新規なＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作した。これらの変更されたＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によって効率よく標的化することができないヒト細胞中のレポーター部位および内在性遺伝子部位の安定した編集を可能にする。
【選択図】図１
【解決手段】一般に使用される化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択に基づく指向進化およびコンビナトリアル設計を使用して、新規なＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作した。これらの変更されたＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によって効率よく標的化することができないヒト細胞中のレポーター部位および内在性遺伝子部位の安定した編集を可能にする。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／
もしくはＴ１３３７の３つ、４つ、５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化
膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質であって
、前記変異が、ＶＳＲＥＥＲまたはＶＳＲＥＱＲではない、タンパク質。
もしくはＴ１３３７の３つ、４つ、５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化
膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質であって
、前記変異が、ＶＳＲＥＥＲまたはＶＳＲＥＱＲではない、タンパク質。
【請求項2】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１に記載
の単離されたタンパク質。
の単離されたタンパク質。
【請求項3】
表Ａ、１、２または３に示される変異のセットを含む、請求項１に記載の単離されたタ
ンパク質。
ンパク質。
【請求項4】
以下の変異のセット：
ＬＲＳＶＱＬ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＫＩＱＫ、ＬＷＫＩＱ
Ｋ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＬＲＳ、ＧＲＫＩＱＫ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨ
ＦＫＶ、ＭＳＧＶＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、Ｋ
ＲＲＣＫＶ、ＶＲＡＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＷＫＬＬＲ
、ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬ
ＬＲ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ
ＰＡＭについて）；ＭＱＫＳＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、ＩＣＫＳＥＲ、ＬＲＳＶＥＲ、ＬＷ
ＬＥＴＲ、ＬＳＲＷＥＲ、ＭＱＳＶＱＬ、ＶＲＲＥＥＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＬＳＲＷＱＲ、
ＬＷＲＶＶＡ、ＷＭＱＡＹＧ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱ
Ｈ、ＭＣＳＦＥＲ、ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮ
ＹＱＳ、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＦＭＱＷＶＲ、またはＳＳＫＷＰ
Ａバリアント（例えば、ＮＧＣＮ ＰＡＭについて）；ＬＲＳＶＲＳ、ＳＲＱＭＲＧ、Ｍ
ＲＡＲＫＥ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＲＲＥＱＲ、ＶＲＧＥＱＲ、ＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴ
Ｒ、ＫＷＭＭＣＧ、ＶＲＧＡＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣ
ＱＣＶ、ＡＥＥＱＱＲ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、Ｖ
ＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ
、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶ
ＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、また
はＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＡＮ ＰＡＭについて）
を含む、請求項１～３に記載の単離されたタンパク質。
ＬＲＳＶＱＬ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＫＩＱＫ、ＬＷＫＩＱ
Ｋ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＬＲＳ、ＧＲＫＩＱＫ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨ
ＦＫＶ、ＭＳＧＶＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、Ｋ
ＲＲＣＫＶ、ＶＲＡＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＷＫＬＬＲ
、ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬ
ＬＲ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ
ＰＡＭについて）；ＭＱＫＳＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、ＩＣＫＳＥＲ、ＬＲＳＶＥＲ、ＬＷ
ＬＥＴＲ、ＬＳＲＷＥＲ、ＭＱＳＶＱＬ、ＶＲＲＥＥＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＬＳＲＷＱＲ、
ＬＷＲＶＶＡ、ＷＭＱＡＹＧ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱ
Ｈ、ＭＣＳＦＥＲ、ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮ
ＹＱＳ、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＦＭＱＷＶＲ、またはＳＳＫＷＰ
Ａバリアント（例えば、ＮＧＣＮ ＰＡＭについて）；ＬＲＳＶＲＳ、ＳＲＱＭＲＧ、Ｍ
ＲＡＲＫＥ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＲＲＥＱＲ、ＶＲＧＥＱＲ、ＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴ
Ｒ、ＫＷＭＭＣＧ、ＶＲＧＡＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣ
ＱＣＶ、ＡＥＥＱＱＲ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、Ｖ
ＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ
、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶ
ＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、また
はＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＡＮ ＰＡＭについて）
を含む、請求項１～３に記載の単離されたタンパク質。
【請求項5】
Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６
３での変異からなる群から選択されるヌクレアーゼ活性を減少させる１つまたは複数の変
異をさらに含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
３での変異からなる群から選択されるヌクレアーゼ活性を減少させる１つまたは複数の変
異をさらに含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項6】
前記変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙ
である、請求項５に記載の単離されたタンパク質。
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙ
である、請求項５に記載の単離されたタンパク質。
【請求項7】
Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８１０、Ｋ８４８
、Ｑ９２６、Ｋ１００３およびＲ０１６０での変異、ならびに任意選択でＫ５２６および
／またはＲ６９１での変異からなる群から選択される特異性を増加させる１つまたは複数
の変異をさらに含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
、Ｑ９２６、Ｋ１００３およびＲ０１６０での変異、ならびに任意選択でＫ５２６および
／またはＲ６９１での変異からなる群から選択される特異性を増加させる１つまたは複数
の変異をさらに含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項8】
Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｍ６９
４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ
、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９
２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５
Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６
６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／
Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９
２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ
／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２
６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／
Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ
；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ
６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ
；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ
５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ
；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５
８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ
／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ
８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０
Ａ、および任意選択でＫ５２６Ａおよび／またはＲ６９１Ａの変異を含む、請求項７に記
載の単離されたタンパク質。
４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ
、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９
２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５
Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６
６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／
Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９
２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ
／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２
６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／
Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ
；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ
６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ
；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ
５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ
；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５
８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ
／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ
８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０
Ａ、および任意選択でＫ５２６Ａおよび／またはＲ６９１Ａの変異を含む、請求項７に記
載の単離されたタンパク質。
【請求項9】
任意の介在リンカーで異種性機能ドメインと融合された請求項１～８に記載の単離され
たタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活
性を妨げない、融合タンパク質。
たタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活
性を妨げない、融合タンパク質。
【請求項10】
前記異種性機能ドメインが、転写活性化ドメインである、請求項９に記載の融合タンパ
ク質。
ク質。
【請求項11】
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｒＴＡ、ＮＦ－κＢ ｐ６５または
複合性ＶＰＲ（ＶＰ６４－ｐ６５－ｒＴＡ）からのものである、請求項９に記載の融合タ
ンパク質。
複合性ＶＰＲ（ＶＰ６４－ｐ６５－ｒＴＡ）からのものである、請求項９に記載の融合タ
ンパク質。
【請求項12】
前記異種性機能ドメインが、転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項
９に記載の融合タンパク質。
９に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプ
レッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請
求項１２に記載の融合タンパク質。
レッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請
求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記転写サイレンサーが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１
２に記載の融合タンパク質。
２に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記異種性機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１２
に記載の融合タンパク質。
に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮ
ＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
ＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記ＴＥＴタンパク質が、ＴＥＴ１である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
前記異種性機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項９に
記載の融合タンパク質。
記載の融合タンパク質。
【請求項19】
ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（
ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（
ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（
ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記異種性機能ドメインが、塩基エディターである、請求項９に記載の融合タンパク質
。
。
【請求項21】
前記塩基エディターが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、好ましくは、アポリポ
タンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）
ファミリー、任意選択で、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯ
ＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥ
Ｃ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨもしくはＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（
ＡＩＤ）、任意選択で、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデア
ミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナ
ーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼドメイン、あるいは（
ｉｉ）アデノシンデアミナーゼ、好ましくは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、
ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、Ａ
ＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、
ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデ
アミナーゼ（ＴａｄＡ）からなる群から選択されるアデノシンデアミナーゼである、請求
項２０に記載の融合タンパク質。
タンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）
ファミリー、任意選択で、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯ
ＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥ
Ｃ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨもしくはＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（
ＡＩＤ）、任意選択で、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデア
ミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナ
ーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼドメイン、あるいは（
ｉｉ）アデノシンデアミナーゼ、好ましくは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、
ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、Ａ
ＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、
ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデ
アミナーゼ（ＴａｄＡ）からなる群から選択されるアデノシンデアミナーゼである、請求
項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
前記異種性機能ドメインが、生物学的テザーである、請求項９に記載の融合タンパク質
。
。
【請求項23】
前記生物学的テザーが、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項２
２に記載の融合タンパク質。
２に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
前記異種性機能ドメインが、ＦｏｋＩである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
請求項１～２４に記載のタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項26】
請求項２５に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項27】
請求項２５に記載の単離された核酸が、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２
１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７の１つ、２つ、３つ、４つ、
５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyog
enes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメ
インに作動可能に連結された、請求項２４に記載のベクター。
１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７の１つ、２つ、３つ、４つ、
５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyog
enes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメ
インに作動可能に連結された、請求項２４に記載のベクター。
【請求項28】
請求項２５に記載の核酸を含み、および任意選択で、請求項１～２４に記載のタンパク
質を発現する宿主細胞、好ましくは、哺乳動物宿主細胞。
質を発現する宿主細胞、好ましくは、哺乳動物宿主細胞。
【請求項29】
細胞のゲノムを変更する方法であって、請求項１～２４に記載の単離されたタンパク質
もしくは融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択された部分に相補的な領域
を有するガイドＲＮＡを、前記細胞で発現させること、または前記細胞をこれらと接触さ
せることを含む方法。
もしくは融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択された部分に相補的な領域
を有するガイドＲＮＡを、前記細胞で発現させること、または前記細胞をこれらと接触さ
せることを含む方法。
【請求項30】
前記単離されたタンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞透過性ペプチ
ド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を含む、請求項２９に記載の
方法。
ド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を含む、請求項２９に記載の
方法。
【請求項31】
前記細胞が、幹細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞もしくは人工多能性幹細胞であるか、生きてい
る動物における細胞であるか、または胚における細胞である、請求項３１に記載の方法。
る動物における細胞であるか、または胚における細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請
求項１～２４に記載の単離されたタンパク質もしくは融合タンパク質、および前記ｄｓＤ
ＮＡ分子の選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む
方法。
求項１～２４に記載の単離されたタンパク質もしくは融合タンパク質、および前記ｄｓＤ
ＮＡ分子の選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む
方法。
【請求項34】
前記ｄｓＤＮＡ分子が、インビトロにある、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記融合タンパク質およびＲＮＡが、リボヌクレオタンパク質複合体にある、請求項３
３に記載の方法。
３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０１７年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／５４９，３０３
号、および２０１８年３月１２日に出願された同第６２／６４１，６８７号の利益を主張
する。前述の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／５４９，３０３
号、および２０１８年３月１２日に出願された同第６２／６４１，６８７号の利益を主張
する。前述の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による支援を受けた研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された、助成金番号ＧＭ１０５３７８、Ｇ
Ｍ１０７４２７、ＧＭ１１８１５８およびＧＭ０８８０４０の政府支援により行われた。
政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された、助成金番号ＧＭ１０５３７８、Ｇ
Ｍ１０７４２７、ＧＭ１１８１５８およびＧＭ０８８０４０の政府支援により行われた。
政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本発明は、少なくとも一部は、変更および改善されたプロトスペーサー隣接モチーフ（
ＰＡＭ）特異性を有する遺伝子操作されたクラスター化した規則的な配置の短い回文配列
リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、ならびにゲノ
ム工学、エピゲノム工学およびゲノム標的化におけるそれらの使用に関する。
本発明は、少なくとも一部は、変更および改善されたプロトスペーサー隣接モチーフ（
ＰＡＭ）特異性を有する遺伝子操作されたクラスター化した規則的な配置の短い回文配列
リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、ならびにゲノ
ム工学、エピゲノム工学およびゲノム標的化におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0004】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、多種多様な生物体および細胞の種類において
、効率が良く、カスタマイズ可能なゲノム編集を可能にする（Sander & Joung, Nat Biot
echnol 32, 347-355 (2014)；Hsuet al., Cell 157, 1262-1278 (2014); Doudna & Charp
entier, Science 346, 1258096 (2014)；Barrangou & May, Expert Opin Biol Ther 15,
311-314 (2015)）。Ｃａｓ９による標的部位認識は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ
として公知の２つの短いＲＮＡによって導かれ（Deltcheva et al., Nature 471, 602-60
7 (2011)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）、これらは融合してキメラ単
一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とすることができる（Jinek et al., Science 337, 816-8
21 (2012)；Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Mali et al., Science 339, 823-8
26 (2013)；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)）。ｓｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡに
由来する）の５’末端は、標的ＤＮＡ部位と塩基対形成することができ、それによって、
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による部位特異的切断の直接リプログラミングを可能にする
（Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。しかしながら、Ｃａｓ９は、ｓｇＲ
ＮＡと塩基対形成するＤＮＡの近位にある特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ
）も認識しなければならず（Mojica et al., Microbiology 155, 733-740 (2009)；Shah
et al., RNA Biol 10, 891-899 (2013)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)；
Sapranauskas et al, Nucleic Acids Res 39, 9275-9282 (2011)；Horvath et al., J Ba
cteriol 190, 1401-1412 (2008)）、この要件は、配列特異的な認識を開始するために必
要であるが（Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014)）、これはまた、ゲノム編集
のためにこれらのヌクレアーゼの標的化範囲を制限し得る。幅広く使用される化膿性連鎖
球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、短いＮＧＧ ＰＡＭを認
識し（Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012); Jiang et al., Nat Biotechnol 31
, 233-239 (2013)）、これは、ランダムなＤＮＡ配列の８ｂｐごとに１回生じる。一方、
これまでに特徴付けられた他のＣａｓ９オルソログは、より長いＰＡＭを認識することが
できる（Horvath et al., J Bacteriol 190, 1401-1412 (2008)；Fonfara et al., Nucle
ic Acids Res 42, 2577-2590 (2014)；Esvelt et al., Nat Methods 10, 1116-1121 (201
3)；Ran et al., Nature 520, 186-191 (2015)；Zhang et al., Mol Cell 50, 488-503 (
2013)）。例えば、ウイルス送達のためにより適切ないくつかのより小さなＣａｓ９オル
ソログの１つである黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９
）は（Horvath et al., J Bacteriol 190, 1401-1412 (2008)；Ran et al., Nature 520,
186-191 (2015)；Zhang et al., Mol Cell 50, 488-503 (2013)）、ランダムなＤＮＡの
３２ｂｐごとに１回生じると予想されるより長いＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭを認識する。Ｃａ
ｓ９オルソログの標的化範囲の広幅化は、小さな遺伝要素（例えば、転写因子結合部位（
Canver et al. Nature. 527(7577):192-7 (2015)；Vierstra et al., Nat Methods. 12(1
0):927-30 (2015)）の改変、またはＰＡＭ内に配列の相違を位置させることによるアレル
特異的変更を行うこと（Courtney, D.G. et al. Gene Ther. 23(1):108-12 (2015)）を含
むさまざまな適用のために重要である。本発明者らは、以前に、ＮＧＡおよびＮＧＣＧ
ＰＡＭ配列により部位を認識することができるＳｐＣａｓ９のバリアントを遺伝子操作に
より作製したが（Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４
号パンフレット）、それにもかかわらず多くの代替のＰＡＭ配列は標的化できないままで
ある。
、効率が良く、カスタマイズ可能なゲノム編集を可能にする（Sander & Joung, Nat Biot
echnol 32, 347-355 (2014)；Hsuet al., Cell 157, 1262-1278 (2014); Doudna & Charp
entier, Science 346, 1258096 (2014)；Barrangou & May, Expert Opin Biol Ther 15,
311-314 (2015)）。Ｃａｓ９による標的部位認識は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ
として公知の２つの短いＲＮＡによって導かれ（Deltcheva et al., Nature 471, 602-60
7 (2011)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）、これらは融合してキメラ単
一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とすることができる（Jinek et al., Science 337, 816-8
21 (2012)；Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Mali et al., Science 339, 823-8
26 (2013)；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)）。ｓｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡに
由来する）の５’末端は、標的ＤＮＡ部位と塩基対形成することができ、それによって、
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による部位特異的切断の直接リプログラミングを可能にする
（Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。しかしながら、Ｃａｓ９は、ｓｇＲ
ＮＡと塩基対形成するＤＮＡの近位にある特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ
）も認識しなければならず（Mojica et al., Microbiology 155, 733-740 (2009)；Shah
et al., RNA Biol 10, 891-899 (2013)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)；
Sapranauskas et al, Nucleic Acids Res 39, 9275-9282 (2011)；Horvath et al., J Ba
cteriol 190, 1401-1412 (2008)）、この要件は、配列特異的な認識を開始するために必
要であるが（Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014)）、これはまた、ゲノム編集
のためにこれらのヌクレアーゼの標的化範囲を制限し得る。幅広く使用される化膿性連鎖
球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、短いＮＧＧ ＰＡＭを認
識し（Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012); Jiang et al., Nat Biotechnol 31
, 233-239 (2013)）、これは、ランダムなＤＮＡ配列の８ｂｐごとに１回生じる。一方、
これまでに特徴付けられた他のＣａｓ９オルソログは、より長いＰＡＭを認識することが
できる（Horvath et al., J Bacteriol 190, 1401-1412 (2008)；Fonfara et al., Nucle
ic Acids Res 42, 2577-2590 (2014)；Esvelt et al., Nat Methods 10, 1116-1121 (201
3)；Ran et al., Nature 520, 186-191 (2015)；Zhang et al., Mol Cell 50, 488-503 (
2013)）。例えば、ウイルス送達のためにより適切ないくつかのより小さなＣａｓ９オル
ソログの１つである黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９
）は（Horvath et al., J Bacteriol 190, 1401-1412 (2008)；Ran et al., Nature 520,
186-191 (2015)；Zhang et al., Mol Cell 50, 488-503 (2013)）、ランダムなＤＮＡの
３２ｂｐごとに１回生じると予想されるより長いＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭを認識する。Ｃａ
ｓ９オルソログの標的化範囲の広幅化は、小さな遺伝要素（例えば、転写因子結合部位（
Canver et al. Nature. 527(7577):192-7 (2015)；Vierstra et al., Nat Methods. 12(1
0):927-30 (2015)）の改変、またはＰＡＭ内に配列の相違を位置させることによるアレル
特異的変更を行うこと（Courtney, D.G. et al. Gene Ther. 23(1):108-12 (2015)）を含
むさまざまな適用のために重要である。本発明者らは、以前に、ＮＧＡおよびＮＧＣＧ
ＰＡＭ配列により部位を認識することができるＳｐＣａｓ９のバリアントを遺伝子操作に
より作製したが（Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４
号パンフレット）、それにもかかわらず多くの代替のＰＡＭ配列は標的化できないままで
ある。
【発明の概要】
【0005】
本明細書に記載されるように、一般に使用される化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyog
enes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択に基づく指向進化およびコンビ
ナトリアル設計を使用して、新規なＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作した。これら
の変更されたＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によって効率よく標的化す
ることができないヒト細胞中のレポーター部位および内在性遺伝子部位の安定した編集を
可能にする。本知見は、本明細書において「バリアント」または「本バリアント」と総称
される、幅広く有用なＳｐＣａｓ９バリアントを提供する。
enes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択に基づく指向進化およびコンビ
ナトリアル設計を使用して、新規なＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作した。これら
の変更されたＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によって効率よく標的化す
ることができないヒト細胞中のレポーター部位および内在性遺伝子部位の安定した編集を
可能にする。本知見は、本明細書において「バリアント」または「本バリアント」と総称
される、幅広く有用なＳｐＣａｓ９バリアントを提供する。
【0006】
第１の態様において、本発明は、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、
Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７の３つ、４つ、５つまたは６つすべ
てで、例えば、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／
もしくはＴ１３３７（Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１
３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の２つ、３つ、４つ、
５つまたはすべてで、変異を有し、例えば、示された変異を有する配列番号１のアミノ酸
配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一である配列を含む、単離された化膿性
連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、表Ａ、１、２また
は３に示される変異のセット、例えば、以下の変異のセットの１つ：ＬＲＳＶＱＬ、ＬＲ
ＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＫＩＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＩＲＡＶＱＬ、
ＶＲＫＬＲＳ、ＧＲＫＩＱＫ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨＦＫＶ、ＭＳＧＶＫ
Ｃ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＲＡ
ＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＷＫＬＬＲ、ＧＷＫＯＱＫ、Ｖ
ＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬＬＲ、ＩＲＡＶＱＬ
、ＶＲＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ ＰＡＭについて）
；ＭＱＫＳＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、ＩＣＫＳＥＲ、ＬＲＳＶＥＲ、ＬＷＬＥＴＲ、ＬＳＲＷ
ＥＲ、ＭＱＳＶＱＬ、ＶＲＲＥＥＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＬＳＲＷＱＲ、ＬＷＲＶＶＡ、ＷＭ
ＱＡＹＧ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、ＭＣＳＦＥＲ、
ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ、ＦＭＱＷＶ
Ｎ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＦＭＱＷＶＲ、またはＳＳＫＷＰＡバリアント（例え
ば、ＮＧＣＮ ＰＡＭについて）；ＬＲＳＶＲＳ、ＳＲＱＭＲＧ、ＭＲＡＲＫＥ、ＳＲＭ
ＨＣＫ、ＶＲＲＥＱＲ、ＶＲＧＥＱＲ、ＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴＲ、ＫＷＭＭＣＧ、
ＶＲＧＡＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣＱＣＶ、ＡＥＥＱＱ
Ｒ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲ
ＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、Ｑ
ＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ
、ＶＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリ
アント（例えば、ＮＧＡＮ ＰＡＭについて）を含む。いくつかの実施形態において、変
異は、ＶＳＲＥＥＲ（ＶＲＥＲとしても公知）またはＶＳＲＥＱＲ（ＶＲＱＲとしても公
知）ではない。
Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７の３つ、４つ、５つまたは６つすべ
てで、例えば、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／
もしくはＴ１３３７（Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１
３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の２つ、３つ、４つ、
５つまたはすべてで、変異を有し、例えば、示された変異を有する配列番号１のアミノ酸
配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一である配列を含む、単離された化膿性
連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、表Ａ、１、２また
は３に示される変異のセット、例えば、以下の変異のセットの１つ：ＬＲＳＶＱＬ、ＬＲ
ＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＫＩＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＩＲＡＶＱＬ、
ＶＲＫＬＲＳ、ＧＲＫＩＱＫ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨＦＫＶ、ＭＳＧＶＫ
Ｃ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＲＡ
ＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＷＫＬＬＲ、ＧＷＫＯＱＫ、Ｖ
ＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬＬＲ、ＩＲＡＶＱＬ
、ＶＲＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ ＰＡＭについて）
；ＭＱＫＳＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、ＩＣＫＳＥＲ、ＬＲＳＶＥＲ、ＬＷＬＥＴＲ、ＬＳＲＷ
ＥＲ、ＭＱＳＶＱＬ、ＶＲＲＥＥＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＬＳＲＷＱＲ、ＬＷＲＶＶＡ、ＷＭ
ＱＡＹＧ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、ＭＣＳＦＥＲ、
ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ、ＦＭＱＷＶ
Ｎ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＦＭＱＷＶＲ、またはＳＳＫＷＰＡバリアント（例え
ば、ＮＧＣＮ ＰＡＭについて）；ＬＲＳＶＲＳ、ＳＲＱＭＲＧ、ＭＲＡＲＫＥ、ＳＲＭ
ＨＣＫ、ＶＲＲＥＱＲ、ＶＲＧＥＱＲ、ＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴＲ、ＫＷＭＭＣＧ、
ＶＲＧＡＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣＱＣＶ、ＡＥＥＱＱ
Ｒ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲ
ＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、Ｑ
ＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ
、ＶＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリ
アント（例えば、ＮＧＡＮ ＰＡＭについて）を含む。いくつかの実施形態において、変
異は、ＶＳＲＥＥＲ（ＶＲＥＲとしても公知）またはＶＳＲＥＱＲ（ＶＲＱＲとしても公
知）ではない。
【0007】
いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ７６
２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３での変異からな
る群から選択されるヌクレアーゼ活性を減少させる１つまたは複数の変異を含む。いくつ
かの実施形態において、変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および（ｉｉ）Ｈ８４
０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙである。
２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３での変異からな
る群から選択されるヌクレアーゼ活性を減少させる１つまたは複数の変異を含む。いくつ
かの実施形態において、変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および（ｉｉ）Ｈ８４
０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙである。
【0008】
いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｎ４９７、Ｋ５
２６、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８１０、Ｋ８
４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３および／もしくはＲ０１６０での変異からなる群から選択さ
れる特異性を増加させる１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、変
異は、Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｋ５２６Ａ、Ｒ
６６１Ａ、Ｒ６９１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６
０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ
６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１
６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／
Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ
１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ
６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５
Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ
６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ
／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９
２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ
；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９
２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ
６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ
／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８
４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ
／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９
７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ
／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８
Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、
Ｋ５２６またはＲ６９１での変異を含まない。
２６、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８１０、Ｋ８
４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３および／もしくはＲ０１６０での変異からなる群から選択さ
れる特異性を増加させる１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、変
異は、Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｋ５２６Ａ、Ｒ
６６１Ａ、Ｒ６９１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６
０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ
６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１
６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／
Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ
１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ
６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５
Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ
６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ
／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９
２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ
；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９
２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ
６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ
／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８
４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ
／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９
７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ
／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８
Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、
Ｋ５２６またはＲ６９１での変異を含まない。
【0009】
本明細書において、任意の介在リンカーで異種性機能ドメインと融合された本明細書に
記載の単離されたバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質であって、リ
ンカーが、融合タンパク質の活性を妨げない、融合タンパク質も提供する。いくつかの実
施形態において、異種性機能ドメインは、転写活性化ドメインである。いくつかの実施形
態において、転写活性化ドメインは、ＶＰ６４またはＮＦ－κＢ ｐ６５からのものであ
る。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、転写サイレンサーまたは転写
抑制ドメインである。いくつかの実施形態において、転写抑制ドメインは、クルッペル関
連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉ
ｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である。いくつかの実施形態において、転写サイレン
サーは、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１βで
ある。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改
変する酵素である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素
は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である。いく
つかの実施形態において、ＴＥＴタンパク質は、ＴＥＴ１である。いくつかの実施形態に
おいて、異種性機能ドメインは、ヒストンサブユニットを改変する酵素である。いくつか
の実施形態において、ヒストンサブユニットを改変する酵素は、ヒストンアセチルトラン
スフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトラン
スフェラーゼ（ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである。
記載の単離されたバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質であって、リ
ンカーが、融合タンパク質の活性を妨げない、融合タンパク質も提供する。いくつかの実
施形態において、異種性機能ドメインは、転写活性化ドメインである。いくつかの実施形
態において、転写活性化ドメインは、ＶＰ６４またはＮＦ－κＢ ｐ６５からのものであ
る。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、転写サイレンサーまたは転写
抑制ドメインである。いくつかの実施形態において、転写抑制ドメインは、クルッペル関
連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉ
ｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である。いくつかの実施形態において、転写サイレン
サーは、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１βで
ある。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改
変する酵素である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素
は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である。いく
つかの実施形態において、ＴＥＴタンパク質は、ＴＥＴ１である。いくつかの実施形態に
おいて、異種性機能ドメインは、ヒストンサブユニットを改変する酵素である。いくつか
の実施形態において、ヒストンサブユニットを改変する酵素は、ヒストンアセチルトラン
スフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトラン
スフェラーゼ（ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである。
【0010】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、塩基エディター、例えば、シチ
ジンデアミナーゼドメイン、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３
Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨもしくはＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリポタンパク
質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリ
ー；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導シチジンデアミナ
ーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔ
ＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からのものである。いくつかの実施
形態において、異種性機能ドメインは、アデノシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼで
あり、例えば、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；Ｒ
ＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔ
ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；
および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（
ＴａｄＡ）である。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、生物学的テザ
ーである。いくつかの実施形態において、生物学的テザーは、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラ
ムダＮタンパク質である。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、Ｆｏｋ
Ｉである。
ジンデアミナーゼドメイン、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３
Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、
ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨもしくはＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリポタンパク
質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリ
ー；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導シチジンデアミナ
ーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔ
ＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からのものである。いくつかの実施
形態において、異種性機能ドメインは、アデノシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼで
あり、例えば、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；Ｒ
ＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔ
ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；
および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（
ＴａｄＡ）である。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、生物学的テザ
ーである。いくつかの実施形態において、生物学的テザーは、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラ
ムダＮタンパク質である。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、Ｆｏｋ
Ｉである。
【0011】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、内因性ＤＮＡ修復もしくは塩基
除去修復（ＢＥＲ）経路を阻害または増強する酵素、ドメインあるいはペプチド、例えば
、ＢＥＲを開始するウラシルの除去を媒介するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、
ウラシルＮ－グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても公知）を阻害するウラシルＤＮＡグリ
コシラーゼ阻害剤；あるいはバクテリオファージＭｕからのＧａｍなどのＤＮＡ末端結合
タンパク質である。
除去修復（ＢＥＲ）経路を阻害または増強する酵素、ドメインあるいはペプチド、例えば
、ＢＥＲを開始するウラシルの除去を媒介するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、
ウラシルＮ－グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても公知）を阻害するウラシルＤＮＡグリ
コシラーゼ阻害剤；あるいはバクテリオファージＭｕからのＧａｍなどのＤＮＡ末端結合
タンパク質である。
【0012】
本明細書において、本明細書に記載のバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質をコードする
単離された核酸、および任意選択で、本明細書に記載のバリアントＳｐＣａｓ９タンパク
質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインに作動可能に連結された、単離された
核酸を含むベクターも提供する。本明細書において、任意選択で、本明細書に記載のバリ
アントＳｐＣａｓ９タンパク質を発現する、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞、例え
ば、哺乳動物宿主細胞も提供する。本明細書において、本明細書に記載のバリアントＳｐ
Ｃａｓ９タンパク質、およびバリアントタンパク質によって標的化されるＰＡＭ配列を有
する配列を標的化するガイドＲＮＡを含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体も提
供する。
単離された核酸、および任意選択で、本明細書に記載のバリアントＳｐＣａｓ９タンパク
質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインに作動可能に連結された、単離された
核酸を含むベクターも提供する。本明細書において、任意選択で、本明細書に記載のバリ
アントＳｐＣａｓ９タンパク質を発現する、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞、例え
ば、哺乳動物宿主細胞も提供する。本明細書において、本明細書に記載のバリアントＳｐ
Ｃａｓ９タンパク質、およびバリアントタンパク質によって標的化されるＰＡＭ配列を有
する配列を標的化するガイドＲＮＡを含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体も提
供する。
【0013】
本明細書において、本明細書に記載の単離されたバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質、
および細胞のゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを、細胞で発
現させることによって、細胞のゲノムを変更する方法を提供する。
および細胞のゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを、細胞で発
現させることによって、細胞のゲノムを変更する方法を提供する。
【0014】
本明細書において、バリアントタンパク質、および細胞のゲノムの選択された部分に相
補的な領域を有するガイドＲＮＡを、細胞で発現させることによって、細胞のゲノムを変
更する、例えば、選択的に変更するための方法を提供する。
補的な領域を有するガイドＲＮＡを、細胞で発現させることによって、細胞のゲノムを変
更する、例えば、選択的に変更するための方法を提供する。
【0015】
細胞を、本明細書に記載のタンパク質バリアント、および細胞のゲノムの選択された部
分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることによって、細胞のゲノムを変更
する、例えば、選択的に変更するための方法も提供する。
分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることによって、細胞のゲノムを変更
する、例えば、選択的に変更するための方法も提供する。
【0016】
いくつかの実施形態において、単離されたタンパク質または融合タンパク質は、核局在
化配列、細胞透過性ペプチド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を
含む。
化配列、細胞透過性ペプチド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を
含む。
【0017】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞、例えば、胚性
幹細胞、間葉系幹細胞もしくは人工多能性幹細胞であるか、生きている動物における細胞
であるか、あるいは胚、例えば、哺乳動物、昆虫もしくは魚類（例えば、ゼブラフィッシ
ュ）の胚における細胞または胚細胞である。
幹細胞、間葉系幹細胞もしくは人工多能性幹細胞であるか、生きている動物における細胞
であるか、あるいは胚、例えば、哺乳動物、昆虫もしくは魚類（例えば、ゼブラフィッシ
ュ）の胚における細胞または胚細胞である。
【0018】
さらに、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更するための方法、
例えば、インビトロの方法を提供する。この方法は、ｄｓＤＮＡ分子を、１つまたは複数
の本明細書に記載のバリアントタンパク質、およびｄｓＤＮＡ分子の選択された部分に相
補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む。
例えば、インビトロの方法を提供する。この方法は、ｄｓＤＮＡ分子を、１つまたは複数
の本明細書に記載のバリアントタンパク質、およびｄｓＤＮＡ分子の選択された部分に相
補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む。
【0019】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、こ
の発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方
法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され、当技術分野において
公知の他の適切な方法および材料を使用することもできる。材料、方法および例は、説明
のみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書において列挙される、
すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データーベースのエントリーおよび他の参照は
、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書
が支配する。
の発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方
法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され、当技術分野において
公知の他の適切な方法および材料を使用することもできる。材料、方法および例は、説明
のみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書において列挙される、
すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データーベースのエントリーおよび他の参照は
、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書
が支配する。
【0020】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求
の範囲から明らかになろう。
の範囲から明らかになろう。
【0021】
本特許または本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カ
ラーの図面を伴う本特許または本出願公開の写しは、申請および必要な料金の支払により
、特許庁によって提供されるだろう。
ラーの図面を伴う本特許または本出願公開の写しは、申請および必要な料金の支払により
、特許庁によって提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】図１Ａ～１Ｂは、ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントライブラリーの生成およびスクリーニングに関する。（ａ）ＰＡＭ認識のために重要な６つの位置で多様なアミノ酸の組み合わせを有するＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを生成するために、変性オリゴライブラリーをＳｐＣａｓ９コード配列の３つの領域にクローニングして、赤で強調された６つのコドンをランダム化した。（ｂ）細菌選択アッセイの概略図、ここで、ＳｐＣａｓ９バリアントおよびｓｇＲＮＡは、１つのプラスミドから発現し、第２のプラスミドは、誘導毒性遺伝子およびカスタマイズ化標的部位をコードする。両方のプラスミドは、細菌に同時形質転換され、毒性プラスミドの標的部位でコードされるＰＡＭを認識することができるＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントを保有する細胞のみが、毒性遺伝子の発現を誘導する培地上で生存することができる（選択培地は１０ｍＭのアラビノースを含有する）。
【図2-1】図２Ａ～２Ｆは、ＮＧＴＮ ＰＡＭを有する部位を認識する細菌選択から得られたＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントに関する。（Ａ～Ｆ）ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣまたはＮＧＴＡ ＰＡＭ配列を運ぶ陽性選択プラスミドに対する初期スクリーニングからのＳｐＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドを、細菌スクリーニングアッセイで再スクリーニングして、ＮＧＴＮ ＰＡＭ配列を有する標的部位に対する活性を評価した。パネルＣ、ＥおよびＦについて、バリアントはまた、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣおよびＮＧＡＡ ＰＡＭを有する標的部位に対してスクリーニングした。示されたＰＡＭを有する部位におけるバリアントのおおよその活性を、非選択培地（クロラムフェニコールのみ）におけるコロニーの数を選択培地（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）のものと比較することによって計算し、生存％を計算した（表１）。数字にアスタリスクがあるバリアントは、以前のアッセイにおいて試験されたプラスミドを示し（この図の上側パネルに示される）、これらのバリアントのアミノ酸配列は表１に見ることができる。
【図3】図３Ａ～３Ｃは、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ ＮＧＴＮ ＰＡＭバリアントの活性に関する。（Ａ、Ｂ）ＮＧＴＡ、ＮＧＴＣ、ＮＧＴＴおよびＮＧＴＧ ＰＡＭを保有するＥＧＦＰにおける部位に対する、（選択によって得られたか、または合理的に設計された）さまざまなＳｐＣａｓ９バリアントの活性を評価するためのヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ。エラーバーは、ｎ＝２～７についてのｓ．ｅ．ｍを表す。（Ｃ）ＮＧＴＧ、ＮＧＴＡ、ＮＧＴＣまたはＮＧＴＴ ＰＡＭを保有する部位に対する、ＳｐＣａｓ９－ＮＧＴＮ ＰＡＭバリアント、ＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬバリアントを行うトップの１つの内在性遺伝子破壊活性。Ｔ７Ｅ１アッセイによって定量された遺伝子破壊。
【図4】図４Ａ～４Ｆは、ＮＧＣＮ ＰＡＭを有する部位を認識する細菌選択から得られたＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントに関する。（Ａ～Ｂ）ＮＧＣＧ、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣまたはＮＧＣＡ ＰＡＭ配列を運ぶ陽性選択プラスミドに対する初期スクリーニングからのＳｐＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドを、細菌スクリーニングアッセイで再スクリーニングして、ＮＧＣＮ ＰＡＭ配列を有する標的部位に対する活性を評価した。示されたＰＡＭを有する部位におけるバリアントのおおよその活性を、非選択培地（クロラムフェニコールのみ）におけるコロニーの数を選択培地（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）のものと比較することによって計算し、生存％を計算した（表２）。数字にアスタリスクがあるバリアントは、以前のアッセイにおいて試験されたプラスミドを示し（この図の上側パネルに示される）、これらのバリアントのアミノ酸配列は表２に見ることができる。
【図5-1】図５Ａ～５Ｅは、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ ＮＧＣＮ ＰＡＭバリアントの活性に関する。（Ａ～Ｅ）ＮＧＣＡ、ＮＧＣＣ、ＮＧＣＴおよびＮＧＣＧ ＰＡＭを保有するＥＧＦＰにおける部位に対する、（選択によって得られたか、または合理的に設計された）さまざまなＳｐＣａｓ９バリアントの活性を評価するためのヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ。（Ａ）ＮＧＣＡ ＰＡＭ部位、（Ｂ）ＮＧＣＣ ＰＡＭ部位、（Ｃ）ＮＧＣＴ ＰＡＭ部位、（Ｄ）ＮＧＣＣおよびＮＧＣＴ ＰＡＭ部位、ならびに（Ｅ）さまざまなＮＧＣＮ ＰＡＭ部位を有する部位に対する活性。
【図6】図６Ａ～６Ｂは、ＮＧＡＮ ＰＡＭを有する部位を認識する細菌選択から得られたＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントに関する。（Ａ～Ｂ）ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣまたはＮＧＡＡ ＰＡＭ配列を運ぶ陽性選択プラスミドに対する初期スクリーニングからのＳｐＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドを、細菌スクリーニングアッセイで再スクリーニングして、ＮＧＡＮ ＰＡＭ配列を有する標的部位に対する活性を評価した。示されたＰＡＭを有する部位におけるバリアントのおおよその活性を、非選択培地（クロラムフェニコールのみ）におけるコロニーの数を選択培地（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）のものと比較することによって計算し、生存％を計算した（表３）。これらのバリアントのアミノ酸配列は表３に見ることができる。
【図7】図７Ａ～７Ｂは、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ ＮＧＡＮ ＰＡＭバリアントの活性に関する。（Ａ～Ｂ）（Ａ）ＮＧＡＡ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＧ ＰＡＭ、または（Ｂ）さまざまなＮＧＡＣ ＰＡＭを保有するＥＧＦＰにおける部位に対する、（選択によって得られたか、または合理的に設計された）さまざまなＳｐＣａｓ９バリアントの活性を評価するためのヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ。
【図8】ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントとｘＣａｓ９のヌクレアーゼ活性の比較。内因性遺伝子破壊活性をＴ７Ｅ１アッセイによって評価した。
【図9-1】図９は、ヒト細胞の内因性部位おけるＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントとｘＣａｓ９の塩基編集活性の比較に関する。（Ａ）ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントのＢＥ３バージョン（Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4）を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏによって行った標的化ディープシークエンシングおよび解析によって評価される、ＣからＴへの塩基編集活性について試験した（Pinello et al., Nat Biotechnol. 2016 Jul 12; 34(7): 695-697；Nat Biotechnol. 2016 Jul 12; 34(7): 695-697）。ｘ軸に表示された編集されたシトシンヌクレオチドは、Ｃａｓ９標的配列の最もＰＡＭから遠位の位置として位置１から番号付けされる。（Ｂ）ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントのＡＢＥ７．１０バージョン（Gaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471）を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏによって行った標的化ディープシークエンシングおよび解析によって評価される、ＡからＧへの塩基編集活性について試験した。ｘ軸に表示された編集されたアデノシンヌクレオチドは、Ｃａｓ９標的配列の最もＰＡＭから遠位の位置として位置１から番号付けされる。
【発明を実施するための形態】
【0023】
表１：ＮＧＴＮ ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
表２：ＮＧＣＮ ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
表３：ＮＧＡＮ ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
表２：ＮＧＣＮ ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
表３：ＮＧＡＮ ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
【0024】
化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）によるプロトス
ペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識は、標的ＤＮＡ認識の重要な第１ステップであり
、ＳｐＣａｓ９が結合およびＤＮＡを加水分解することを可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ
ａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノム編集のために幅広く使用されているが１～４、Ｃａｓ９が
切断することができる配列の範囲は、標的部位における特異的ＰＡＭについての必要性に
よって制限される５、６。例えば、これまでに最も安定かつ幅広く使用されているＣａｓ
９であるＳｐＣａｓ９は、主に、ＮＧＧ ＰＡＭを認識する。結果として、多くの場合、
さまざまなゲノム編集の応用のために必要な正確さで二本鎖の破壊（ＤＳＢ）を標的化す
ることは困難であり得る。加えて、Ｃａｓ９による不完全なＰＡＭ認識は、望まない標的
外変異の生成をもたらし得る７、８。意図的に変更および／または改善されたＰＡＭ特異
性を有するＣａｓ９誘導体は、これらの限界に対処するだろう。
ペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識は、標的ＤＮＡ認識の重要な第１ステップであり
、ＳｐＣａｓ９が結合およびＤＮＡを加水分解することを可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ
ａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノム編集のために幅広く使用されているが１～４、Ｃａｓ９が
切断することができる配列の範囲は、標的部位における特異的ＰＡＭについての必要性に
よって制限される５、６。例えば、これまでに最も安定かつ幅広く使用されているＣａｓ
９であるＳｐＣａｓ９は、主に、ＮＧＧ ＰＡＭを認識する。結果として、多くの場合、
さまざまなゲノム編集の応用のために必要な正確さで二本鎖の破壊（ＤＳＢ）を標的化す
ることは困難であり得る。加えて、Ｃａｓ９による不完全なＰＡＭ認識は、望まない標的
外変異の生成をもたらし得る７、８。意図的に変更および／または改善されたＰＡＭ特異
性を有するＣａｓ９誘導体は、これらの限界に対処するだろう。
【0025】
結晶構造から、野生型ＳｐＣａｓ９が２つのアルギニンアミノ酸側鎖（Ｒ１３３３およ
びＲ１３３５）を利用して、塩基を、基準のＮＧＧ ＰＡＭ配列のグアニンに特異的に接
触させることが明らかである。しかしながら、ＰＡＭ認識を変更し、かつＳｐＣａｓ９の
標的範囲を改善するために、本発明者らおよび他者は、これらのアルギニンのいずれか１
つまたは両方の単純な変異は、ＰＡＭ選好性を転換しないことを示した（Anders et al,
Nature 2014; Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号
パンフレット）。本発明者らは、以前に、ＮＧＡおよびＮＧＣＧ ＰＡＭ配列を標的化す
ることができるＳｐＣａｓ９のバリアントを進化させるための選択アプローチに着手した
が（Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレッ
ト）、しかしながら、多くの代替のＰＡＭ配列は、標的化できないままである。
びＲ１３３５）を利用して、塩基を、基準のＮＧＧ ＰＡＭ配列のグアニンに特異的に接
触させることが明らかである。しかしながら、ＰＡＭ認識を変更し、かつＳｐＣａｓ９の
標的範囲を改善するために、本発明者らおよび他者は、これらのアルギニンのいずれか１
つまたは両方の単純な変異は、ＰＡＭ選好性を転換しないことを示した（Anders et al,
Nature 2014; Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号
パンフレット）。本発明者らは、以前に、ＮＧＡおよびＮＧＣＧ ＰＡＭ配列を標的化す
ることができるＳｐＣａｓ９のバリアントを進化させるための選択アプローチに着手した
が（Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレッ
ト）、しかしながら、多くの代替のＰＡＭ配列は、標的化できないままである。
【0026】
現在アクセスできないＰＡＭ配列の標的化を可能にすることによってＳｐＣａｓ９の有
用性をさらに拡大するために、本発明者らは、新規なＰＡＭ配列を認識する能力があるＳ
ｐＣａｓ９バリアントについて選択するための代替戦略を考えた。ＳｐＣａｓ９コード配
列内のある特定の位置がＰＡＭ認識のために重要であることが以前に確立されており（Kl
einstiver et al., Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット）
、本発明者らは、ＰＡＭ相互作用ドメインの３つの別々の領域内の６つのアミノ酸をラン
ダム化して、これらの位置：Ｄ１１３５／Ｓ１１３６、Ｇ１２１８／Ｅ１２１９およびＲ
１３３５／Ｔ１３３７で多様なコドン使用頻度を有するＳｐＣａｓ９バリアントのライブ
ラリーを生成させる集中飽和変異生成アプローチを実施した。そうするために、本発明者
らは、コードされたこれらの６つのアミノ酸を含有するＳｐＣａｓ９のコドンで、ＮＮＳ
ヌクレオチドトリプレット（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＳはＧまたはＣで
ある）をコードするランダム化オリゴヌクレオチドカセットを連続してクローニングした
（図１Ａ）。次いで、得られるＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを、以前に記載さ
れたようにして（Kleinstiver et al., Nature 2015）、本発明者らの細菌陽性選択アッ
セイを使用する選択に供して、さまざまなＮＧＮＮ ＰＡＭ配列を保有する標的部位を切
断することができるバリアントを特定した（図１Ｂ）。簡潔には、発現したＳｐＣａｓ９
バリアントが陽性選択プラスミドにおいてコードされる標的部位（ＰＡＭおよびスペーサ
ー配列）を認識することができる場合にのみ、細菌は、選択条件（１０ｍＭのアラビノー
ス上に蒔かれ、これは、ｃｃｄＢ毒性遺伝子の転写を誘導する）で生存することができる
。強いＰＡＭ認識は、選択プラスミドの加水分解をもたらし、ｃｃｄＢ発現の誘導を防ぎ
、それによって、細菌の増殖を可能にする。このように、ＳｐＣａｓ９ライブラリーのス
クリーニングの間に、１０ｍＭのアラビノースを含有する培地で増殖するコロニーは、目
的とする代替ＰＡＭを持つ部位を標的化することができるＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアン
トをコードすると予想される（図１Ｂ）。
用性をさらに拡大するために、本発明者らは、新規なＰＡＭ配列を認識する能力があるＳ
ｐＣａｓ９バリアントについて選択するための代替戦略を考えた。ＳｐＣａｓ９コード配
列内のある特定の位置がＰＡＭ認識のために重要であることが以前に確立されており（Kl
einstiver et al., Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット）
、本発明者らは、ＰＡＭ相互作用ドメインの３つの別々の領域内の６つのアミノ酸をラン
ダム化して、これらの位置：Ｄ１１３５／Ｓ１１３６、Ｇ１２１８／Ｅ１２１９およびＲ
１３３５／Ｔ１３３７で多様なコドン使用頻度を有するＳｐＣａｓ９バリアントのライブ
ラリーを生成させる集中飽和変異生成アプローチを実施した。そうするために、本発明者
らは、コードされたこれらの６つのアミノ酸を含有するＳｐＣａｓ９のコドンで、ＮＮＳ
ヌクレオチドトリプレット（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＳはＧまたはＣで
ある）をコードするランダム化オリゴヌクレオチドカセットを連続してクローニングした
（図１Ａ）。次いで、得られるＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを、以前に記載さ
れたようにして（Kleinstiver et al., Nature 2015）、本発明者らの細菌陽性選択アッ
セイを使用する選択に供して、さまざまなＮＧＮＮ ＰＡＭ配列を保有する標的部位を切
断することができるバリアントを特定した（図１Ｂ）。簡潔には、発現したＳｐＣａｓ９
バリアントが陽性選択プラスミドにおいてコードされる標的部位（ＰＡＭおよびスペーサ
ー配列）を認識することができる場合にのみ、細菌は、選択条件（１０ｍＭのアラビノー
ス上に蒔かれ、これは、ｃｃｄＢ毒性遺伝子の転写を誘導する）で生存することができる
。強いＰＡＭ認識は、選択プラスミドの加水分解をもたらし、ｃｃｄＢ発現の誘導を防ぎ
、それによって、細菌の増殖を可能にする。このように、ＳｐＣａｓ９ライブラリーのス
クリーニングの間に、１０ｍＭのアラビノースを含有する培地で増殖するコロニーは、目
的とする代替ＰＡＭを持つ部位を標的化することができるＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアン
トをコードすると予想される（図１Ｂ）。
【0027】
変更されたＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作されたＣａｓ９バリアント
この研究において遺伝子操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９に
よってアクセス可能な標的部位の範囲を大いに増加させ、効率がよいＨＤＲを実施するた
め、ＮＨＥＪ媒介インデルを小さな遺伝要素に標的化するため、およびＰＡＭについての
要件を利用して同じ細胞中の２つの異なるアレルの間を区別するために、ＣＲＩＳＰＲ－
Ｃａｓ９プラットフォームを使用する機会をさらに増強する。以前はアクセス可能ではな
かったＮＧＴＮおよびＮＧＣＨ（ここで、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴである）ＰＡＭ含有部位
を現在標的化することができるバリアント、ならびにＮＧＡＣに対する活性を改善するこ
とができるバリアントの選択および合理的設計は、正確かつ高分解能のゲノム編集のため
の見込みを改善する。変更されたＰＡＭ特異性ＳｐＣａｓ９バリアントは、細菌およびヒ
ト細胞の両方においてＳｐＣａｓ９によって現在標的化できない内在性遺伝子部位を効率
よく破壊することができ、これらが、いろいろな異なる細胞の種類および生物体において
働くことを示唆する。
この研究において遺伝子操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９に
よってアクセス可能な標的部位の範囲を大いに増加させ、効率がよいＨＤＲを実施するた
め、ＮＨＥＪ媒介インデルを小さな遺伝要素に標的化するため、およびＰＡＭについての
要件を利用して同じ細胞中の２つの異なるアレルの間を区別するために、ＣＲＩＳＰＲ－
Ｃａｓ９プラットフォームを使用する機会をさらに増強する。以前はアクセス可能ではな
かったＮＧＴＮおよびＮＧＣＨ（ここで、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴである）ＰＡＭ含有部位
を現在標的化することができるバリアント、ならびにＮＧＡＣに対する活性を改善するこ
とができるバリアントの選択および合理的設計は、正確かつ高分解能のゲノム編集のため
の見込みを改善する。変更されたＰＡＭ特異性ＳｐＣａｓ９バリアントは、細菌およびヒ
ト細胞の両方においてＳｐＣａｓ９によって現在標的化できない内在性遺伝子部位を効率
よく破壊することができ、これらが、いろいろな異なる細胞の種類および生物体において
働くことを示唆する。
【0028】
本明細書に記載のすべてのＳｐＣａｓ９バリアントは、例えば、単純な部位指定変異生
成によって、既存の広く使用されているベクターに迅速に組み込むことができ、それらは
、ＰＡＭ相互作用ドメイン内に含有される少数の変異のみを必要とするので、バリアント
はまた、ＳｐＣａｓ９プラットフォームに以前に記載された他の改善とともに働くはずで
ある（例えば、トランケートｓｇＲＮＡ（Tsai et al., Nat Biotechnol 33, 187-197 (2
015)；Fu et al., Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)）、ニッカーゼ変異（Mali et al
., Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)；Ran et al., Cell 154, 1380-1389 (2013)）、
二量体ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ融合体（Guilinger et al., Nat Biotechnol 32, 577-582 (20
14)；Tsai et al., Nat Biotechnol 32, 569-576 (2014)）；および高フィデリティーバ
リアント（Kleinstiver et al. Nature 2016））。
成によって、既存の広く使用されているベクターに迅速に組み込むことができ、それらは
、ＰＡＭ相互作用ドメイン内に含有される少数の変異のみを必要とするので、バリアント
はまた、ＳｐＣａｓ９プラットフォームに以前に記載された他の改善とともに働くはずで
ある（例えば、トランケートｓｇＲＮＡ（Tsai et al., Nat Biotechnol 33, 187-197 (2
015)；Fu et al., Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)）、ニッカーゼ変異（Mali et al
., Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)；Ran et al., Cell 154, 1380-1389 (2013)）、
二量体ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ融合体（Guilinger et al., Nat Biotechnol 32, 577-582 (20
14)；Tsai et al., Nat Biotechnol 32, 569-576 (2014)）；および高フィデリティーバ
リアント（Kleinstiver et al. Nature 2016））。
【0029】
変更されたＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアント
したがって、本明細書において、ＳｐＣａｓ９バリアントを提供する。ＳｐＣａｓ９野
生型配列は以下の通りである。
したがって、本明細書において、ＳｐＣａｓ９バリアントを提供する。ＳｐＣａｓ９野
生型配列は以下の通りである。
【0030】
【化1-1】
【0031】
【化1-2】
【0032】
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、
Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７、例えば、Ｄ１１３５
Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ（ここで
、Ｘは、任意のアミノ酸である）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてで（
またはこれらと類似の位置）、変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、
ＳｐＣａｓ９バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば、
少なくとも８５％、９０％または９５％同一であり、例えば、配列番号１の残基の最大で
５％、１０％、１５％または２０％まで、例えば、保存的変異で置き換えられた、相違を
有する。好ましい実施形態において、本バリアントは、所望の親の活性、例えば、ヌクレ
アーゼ活性（親が、ニッカーゼまたは死Ｃａｓ９である場合を除く）ならびに／またはガ
イドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持する。
Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７、例えば、Ｄ１１３５
Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ（ここで
、Ｘは、任意のアミノ酸である）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてで（
またはこれらと類似の位置）、変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、
ＳｐＣａｓ９バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば、
少なくとも８５％、９０％または９５％同一であり、例えば、配列番号１の残基の最大で
５％、１０％、１５％または２０％まで、例えば、保存的変異で置き換えられた、相違を
有する。好ましい実施形態において、本バリアントは、所望の親の活性、例えば、ヌクレ
アーゼ活性（親が、ニッカーゼまたは死Ｃａｓ９である場合を除く）ならびに／またはガ
イドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持する。
【0033】
２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のた
めに整列される（例えば、ギャップは、最適な整列のための第１および第２のアミノ酸も
しくは核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は、比較の目的のた
めに無視することができる）。比較の目的のために整列された参照配列の長さは、参照配
列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％ま
たは１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でのヌ
クレオチドが比較される。第１の配列中の位置は、第２の配列中の対応する位置と同じヌ
クレオチドによって占められ、その結果、分子は、その位置で同一である（本明細書で使
用される場合、核酸の「同一性」は核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列の間の
同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列化のために導入することが必要な、ギャッ
プの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置
の数の関数である。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の同一性パーセントは、当技
術分野における技能内であるさまざまな方法、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7
）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれた「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」（
Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、Schwarz a
nd Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 3
53-358；ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール；（Altschul
, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡ
ＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬ
ＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア
などの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、決定される。加えて、
当業者は、比較される配列の長さに対する最大の整列を達成するために必要な任意のアル
ゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一
般に、タンパク質または核酸のためには、比較の長さは、最大で、かつ全長を含む、任意
の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％または１００％）であり得る。本組成物および方法の目的のために
、配列の全長の少なくとも８０％が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよび初期設定パラメータ
ーを使用して整列される。
めに整列される（例えば、ギャップは、最適な整列のための第１および第２のアミノ酸も
しくは核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は、比較の目的のた
めに無視することができる）。比較の目的のために整列された参照配列の長さは、参照配
列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％ま
たは１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でのヌ
クレオチドが比較される。第１の配列中の位置は、第２の配列中の対応する位置と同じヌ
クレオチドによって占められ、その結果、分子は、その位置で同一である（本明細書で使
用される場合、核酸の「同一性」は核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列の間の
同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列化のために導入することが必要な、ギャッ
プの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置
の数の関数である。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の同一性パーセントは、当技
術分野における技能内であるさまざまな方法、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7
）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれた「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」（
Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、Schwarz a
nd Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 3
53-358；ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール；（Altschul
, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡ
ＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬ
ＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア
などの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、決定される。加えて、
当業者は、比較される配列の長さに対する最大の整列を達成するために必要な任意のアル
ゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一
般に、タンパク質または核酸のためには、比較の長さは、最大で、かつ全長を含む、任意
の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％または１００％）であり得る。本組成物および方法の目的のために
、配列の全長の少なくとも８０％が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよび初期設定パラメータ
ーを使用して整列される。
【0034】
本発明の目的のために、２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は
、ギャップペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４およびフレームシフトギャップペ
ナルティ５でＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリング行列を使用して達成することができる。
、ギャップペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４およびフレームシフトギャップペ
ナルティ５でＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリング行列を使用して達成することができる。
【0035】
保存的置換は、典型的には、以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン
、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン
；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン
；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【0036】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、表１、２または３に示され
る変異のセット、例えば、以下の変異のセットの１つ：Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ
１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ：ＳｐＣａｓ９－ＬＷＫＩＱＫ
、ＬＷＫＩＱＫ、ＩＲＡＶＱＬ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨＦＫＶ、ＭＳＧＶ
ＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＲ
ＡＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＲＫＩＱＫ、ＧＷＫＬＬＲ、
ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬＬ
Ｒ、ＬＲＳＶＱＬ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＩＱＫ、ＶＲＭＨＣＫ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳ
ＶＱＫ、またはＶＲＫＩＱＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ ＰＡＭについて）；ＷＭＱ
ＡＹＧ、ＭＱＫＳＥＲ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、Ｍ
ＣＳＦＥＲ、ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ
、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＬＷＬＥＴＲ、ＦＭＱＷＶＲ、ＳＳＫＷ
ＰＡ、ＬＳＲＷＱＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、またはＩＣＫＳＥＲバリアント（例
えば、ＮＧＣＮ ＰＡＭについて）；またはＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴＲ、ＫＷＭＭＣ
Ｇ、ＶＲＧＡＫＥ、ＭＲＡＲＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣ
ＱＣＶ、ＡＥＥＱＱＲ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＳＲＱＭＲＧ、ＬＲＳＹＬＨ、Ｖ
ＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ
、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨ
ＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＬＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲ
ＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＭＨＣＫ、またはＳＲＭＨＣＫ（例えば、ＮＧＡＮ ＰＡ
Ｍについて）を含む。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｄ１１
３５Ｌ／Ｓ１１３６Ｒ／Ｇ１２１８Ｓ／Ｅ１２１９Ｖ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ、例
えば、ＬＲＳＶＱＬまたはＬＲＳＶＲＳを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ１１３
５での残基は、Ｌ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＳである。いくつかの実施形態において、Ｓ１
１３６での残基は、Ｒ、Ｑ、Ｗ、ＳまたはＣである。いくつかの実施形態において、Ｇ１
２１８での残基は、Ｓ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｃ、Ｇ、ＡまたはＱである。いくつかの実施形
態において、Ｅ１２１９での残基は、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｅ、Ｗ、Ｃ、ＡまたはＲである。いく
つかの実施形態において、Ｒ１３３５での残基は、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｖ、ＴまたはＫである。
いくつかの実施形態において、Ｔ１３３７での残基は、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｔまた
はＧである。いくつかの実施形態において、バリアントは、表Ａにおける変異のセットの
１つを含む。
る変異のセット、例えば、以下の変異のセットの１つ：Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ
１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ：ＳｐＣａｓ９－ＬＷＫＩＱＫ
、ＬＷＫＩＱＫ、ＩＲＡＶＱＬ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨＦＫＶ、ＭＳＧＶ
ＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＲ
ＡＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＲＫＩＱＫ、ＧＷＫＬＬＲ、
ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬＬ
Ｒ、ＬＲＳＶＱＬ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＩＱＫ、ＶＲＭＨＣＫ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳ
ＶＱＫ、またはＶＲＫＩＱＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ ＰＡＭについて）；ＷＭＱ
ＡＹＧ、ＭＱＫＳＥＲ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、Ｍ
ＣＳＦＥＲ、ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ
、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＬＷＬＥＴＲ、ＦＭＱＷＶＲ、ＳＳＫＷ
ＰＡ、ＬＳＲＷＱＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、またはＩＣＫＳＥＲバリアント（例
えば、ＮＧＣＮ ＰＡＭについて）；またはＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴＲ、ＫＷＭＭＣ
Ｇ、ＶＲＧＡＫＥ、ＭＲＡＲＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣ
ＱＣＶ、ＡＥＥＱＱＲ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＳＲＱＭＲＧ、ＬＲＳＹＬＨ、Ｖ
ＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ
、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨ
ＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＬＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲ
ＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＭＨＣＫ、またはＳＲＭＨＣＫ（例えば、ＮＧＡＮ ＰＡ
Ｍについて）を含む。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｄ１１
３５Ｌ／Ｓ１１３６Ｒ／Ｇ１２１８Ｓ／Ｅ１２１９Ｖ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ、例
えば、ＬＲＳＶＱＬまたはＬＲＳＶＲＳを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ１１３
５での残基は、Ｌ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＳである。いくつかの実施形態において、Ｓ１
１３６での残基は、Ｒ、Ｑ、Ｗ、ＳまたはＣである。いくつかの実施形態において、Ｇ１
２１８での残基は、Ｓ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｃ、Ｇ、ＡまたはＱである。いくつかの実施形
態において、Ｅ１２１９での残基は、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｅ、Ｗ、Ｃ、ＡまたはＲである。いく
つかの実施形態において、Ｒ１３３５での残基は、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｖ、ＴまたはＫである。
いくつかの実施形態において、Ｔ１３３７での残基は、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｅ、Ｔまた
はＧである。いくつかの実施形態において、バリアントは、表Ａにおける変異のセットの
１つを含む。
【0037】
【表1】
【0038】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントはまた、タンパク質のヌクレア
ーゼ部分を触媒的に不活性にするために、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減もしくは破
壊する以下のアミノ酸の位置の１つ：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９
８６、およびＨ８４０またはＮ８６３、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／
Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙで変異を含み、これらの位置での置換は、アラニン（これらは、
Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)にある）、または他の残基、例えば、グルタ
ミン、アスパラギン、チロシン、セリンもしくはアスパラギン酸塩、例えば、Ｅ７６２Ｑ
、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳまたはＮ８６３Ｈであ
ろう（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレットを参照されたい）。いくつかの
実施形態において、バリアントは、Ｄ１０ＡもしくはＨ８４０Ａでの変異（一本鎖ニッカ
ーゼを生成する）、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａでの変異（ヌクレアーゼ活性を無効
にし、この変異は死Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９として公知である）を含む。
ーゼ部分を触媒的に不活性にするために、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減もしくは破
壊する以下のアミノ酸の位置の１つ：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９
８６、およびＨ８４０またはＮ８６３、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／
Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙで変異を含み、これらの位置での置換は、アラニン（これらは、
Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)にある）、または他の残基、例えば、グルタ
ミン、アスパラギン、チロシン、セリンもしくはアスパラギン酸塩、例えば、Ｅ７６２Ｑ
、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳまたはＮ８６３Ｈであ
ろう（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレットを参照されたい）。いくつかの
実施形態において、バリアントは、Ｄ１０ＡもしくはＨ８４０Ａでの変異（一本鎖ニッカ
ーゼを生成する）、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａでの変異（ヌクレアーゼ活性を無効
にし、この変異は死Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９として公知である）を含む。
【0039】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントはまた、タンパク質の特異性を
増加させる（すなわち、標的外の効果を低減する）１つまたは複数のアミノ酸の位置で変
異を含む。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の残基：Ｎ４
９７、Ｋ５２６、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８
１０、Ｋ８４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３および／もしくはＲ０１６０で、１つ、２つ、３
つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３すべての変異を
含む。いくつかの実施形態において、変異は、Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ
６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｋ５２６Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｒ６９１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ
、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ
６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３
５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／
Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１
１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３
５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ
６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ
／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１
１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ
６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９
４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ
６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９
２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ
６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２
６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ
６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ
／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９
１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ
９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１０
０３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。例えば
、米国特許第９５１２４４６号；Kleinstiver et al., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):
490-5；Slaymaker et al., Science. 2016 Jan 1;351(6268):84-8；Chen et al., Nature
. 2017 Oct 19;550(7676):407-410；Tsai and Joung, Nature Reviews Genetics 17:300-
312 (2016)；Vakulskas et al., Nature Medicine 24:1216-1224 (2018)；Casini et al.
, Nat Biotechnol. 2018 Mar;36(3):265-27を参照されたい。いくつかの実施形態におい
て、本バリアントは、Ｋ５２６またはＲ６９１での変異を含まない。
増加させる（すなわち、標的外の効果を低減する）１つまたは複数のアミノ酸の位置で変
異を含む。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の残基：Ｎ４
９７、Ｋ５２６、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８
１０、Ｋ８４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３および／もしくはＲ０１６０で、１つ、２つ、３
つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３すべての変異を
含む。いくつかの実施形態において、変異は、Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ
６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｋ５２６Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｒ６９１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ
、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ
６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３
５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／
Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５
Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１
１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３
５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ
６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ
／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１
１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ
６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９
４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ
６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９
２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ
６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２
６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ
６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ
／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９
１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ
９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１０
０３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。例えば
、米国特許第９５１２４４６号；Kleinstiver et al., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):
490-5；Slaymaker et al., Science. 2016 Jan 1;351(6268):84-8；Chen et al., Nature
. 2017 Oct 19;550(7676):407-410；Tsai and Joung, Nature Reviews Genetics 17:300-
312 (2016)；Vakulskas et al., Nature Medicine 24:1216-1224 (2018)；Casini et al.
, Nat Biotechnol. 2018 Mar;36(3):265-27を参照されたい。いくつかの実施形態におい
て、本バリアントは、Ｋ５２６またはＲ６９１での変異を含まない。
【0040】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｌ１６９Ａ、
Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６および／もしくはＤ１１３５Ｅの１
つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべてで変異を含み、例えば、いくつかの
実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｎ４９７、Ｒ６６１、
Ｑ６９５およびＱ９２６の１つ、２つ、３つまたは４つすべてで、例えば、以下の変異：
Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａの１つ、２つ、３つまたは４つす
べてで、変異を含む。いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質
は、Ｑ６９５および／またはＱ９２６で、ならびに任意選択で、例えば、限定されないが
、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９
５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９
Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６
９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／
Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１
３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ
／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６
１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、
Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／
Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅを含む、Ｌ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１およびＤ１
１３５Ｅの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてで変異を含む。例えば、Kleinstive
r et al., Nature 529:490-495 (2016)；国際公開第２０１７／０４０３４８号パンフレ
ット；米国特許第９，５１２，４４６号を参照されたい。
Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６および／もしくはＤ１１３５Ｅの１
つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべてで変異を含み、例えば、いくつかの
実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｎ４９７、Ｒ６６１、
Ｑ６９５およびＱ９２６の１つ、２つ、３つまたは４つすべてで、例えば、以下の変異：
Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａの１つ、２つ、３つまたは４つす
べてで、変異を含む。いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質
は、Ｑ６９５および／またはＱ９２６で、ならびに任意選択で、例えば、限定されないが
、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９
５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９
Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６
９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／
Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１
３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ
／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６
１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、
Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／
Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅを含む、Ｌ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１およびＤ１
１３５Ｅの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてで変異を含む。例えば、Kleinstive
r et al., Nature 529:490-495 (2016)；国際公開第２０１７／０４０３４８号パンフレ
ット；米国特許第９，５１２，４４６号を参照されたい。
【0041】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントはまた、以下の位置：Ｆ４９１
、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５８５、Ｎ５８８
、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８
、Ｋ９１８、Ｖ９２２、および／またはＲ９２５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ
、７つまたはそれ以上で、および任意選択でＱ９２６で変異を含み、好ましくは、以下の
位置：Ｆ４９１、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５
８５、Ｎ５８８、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６
９５、Ｈ６９８、Ｋ９１８、Ｖ９２２および／もしくはＲ９２５の１つ、２つ、３つ、４
つ、５つ、６つ、７つまたはそれ以上で、および任意選択でＱ９２６で変異を有する配列
番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列、ならびに任意選択で核局在化
配列、細胞透過性ペプチド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を含
む。
、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５８５、Ｎ５８８
、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８
、Ｋ９１８、Ｖ９２２、および／またはＲ９２５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ
、７つまたはそれ以上で、および任意選択でＱ９２６で変異を含み、好ましくは、以下の
位置：Ｆ４９１、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５
８５、Ｎ５８８、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６
９５、Ｈ６９８、Ｋ９１８、Ｖ９２２および／もしくはＲ９２５の１つ、２つ、３つ、４
つ、５つ、６つ、７つまたはそれ以上で、および任意選択でＱ９２６で変異を有する配列
番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列、ならびに任意選択で核局在化
配列、細胞透過性ペプチド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を含
む。
【0042】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、以下：Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、
およびＨ６９８；Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５８５、およびＮ５８８；Ｔ６５７
、Ｇ６５８、Ｗ６５９、およびＲ６６１；Ｆ４９１、Ｍ４９５、Ｔ４９６、およびＮ４９
７；またはＫ９１８、Ｖ９２２、Ｒ９２５、およびＱ９２６の１つ、２つ、３つまたは４
つすべてで変異を含む。
およびＨ６９８；Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５８５、およびＮ５８８；Ｔ６５７
、Ｇ６５８、Ｗ６５９、およびＲ６６１；Ｆ４９１、Ｍ４９５、Ｔ４９６、およびＮ４９
７；またはＫ９１８、Ｖ９２２、Ｒ９２５、およびＱ９２６の１つ、２つ、３つまたは４
つすべてで変異を含む。
【0043】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、以下の変異：Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、
Ｑ６９５Ａ、およびＨ６９８Ａ；Ｇ５８２Ａ、Ｖ５８３Ａ、Ｅ５８４Ａ、Ｄ５８５Ａ、お
よびＮ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ、Ｇ６５８Ａ、Ｗ６５９Ａ、およびＲ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ
、Ｍ４９５Ａ、Ｔ４９６Ａ、およびＮ４９７Ａ；またはＫ９１８Ａ、Ｖ９２２Ａ、Ｒ９２
５Ａ、およびＱ９２６Ａの１つ、２つ、３つ、４つまたはすべてを含む。
Ｑ６９５Ａ、およびＨ６９８Ａ；Ｇ５８２Ａ、Ｖ５８３Ａ、Ｅ５８４Ａ、Ｄ５８５Ａ、お
よびＮ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ、Ｇ６５８Ａ、Ｗ６５９Ａ、およびＲ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ
、Ｍ４９５Ａ、Ｔ４９６Ａ、およびＮ４９７Ａ；またはＫ９１８Ａ、Ｖ９２２Ａ、Ｒ９２
５Ａ、およびＱ９２６Ａの１つ、２つ、３つ、４つまたはすべてを含む。
【0044】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、変異：Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａを含む。
５Ａ／Ｈ６９８Ａを含む。
【0045】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、変異：Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ
６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ
；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ
５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ
；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５
８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ
／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａを含む。例えば、
Chen et al., “Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy,” b
ioRxiv, doi.org/10.1101/160036 (August 12, 2017)を参照されたい。
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ
６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ
／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ
；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９
５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ
５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ
；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５
８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ
９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ
／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａを含む。例えば、
Chen et al., “Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy,” b
ioRxiv, doi.org/10.1101/160036 (August 12, 2017)を参照されたい。
【0046】
いくつかの実施形態において、バリアントタンパク質は、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｒ８３
２、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ９６８、Ｒ９７６、Ｈ９８２、Ｋ１００３、Ｋ１０１４、Ｋ
１０４７および／もしくはＲ１０６０、例えば、Ｒ７８０Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｒ８３２Ａ、
Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｋ９６８Ａ、Ｒ９７６Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｋ１０
１４Ａ、Ｋ１０４７Ａおよび／もしくはＲ１０６０Ａ、例えば、Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ
／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；（ｅＳｐＣａｓ９ １．０とも称される）；またはＫ８
４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ（ｅＳｐＣａｓ９ １．１とも称される）の１つま
たは複数で変異を含む（Slaymaker et al., Science. 2016 Jan l;351(6268):84-8を参照
されたい）。
２、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ９６８、Ｒ９７６、Ｈ９８２、Ｋ１００３、Ｋ１０１４、Ｋ
１０４７および／もしくはＲ１０６０、例えば、Ｒ７８０Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｒ８３２Ａ、
Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｋ９６８Ａ、Ｒ９７６Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｋ１０
１４Ａ、Ｋ１０４７Ａおよび／もしくはＲ１０６０Ａ、例えば、Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ
／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；（ｅＳｐＣａｓ９ １．０とも称される）；またはＫ８
４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ（ｅＳｐＣａｓ９ １．１とも称される）の１つま
たは複数で変異を含む（Slaymaker et al., Science. 2016 Jan l;351(6268):84-8を参照
されたい）。
【0047】
本明細書において、ＳｐＣａｓ９バリアントをコードする単離された核酸、任意選択で
バリアントタンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインと作動可能に連結
された単離された核酸を含むベクター、ならびに、核酸を含み、および任意選択でバリア
ントタンパク質を発現する宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提供する。
バリアントタンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインと作動可能に連結
された単離された核酸を含むベクター、ならびに、核酸を含み、および任意選択でバリア
ントタンパク質を発現する宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提供する。
【0048】
本明細書に記載のバリアントは、細胞のゲノムを変更するために使用することができ、
この方法は、一般に、細胞中のバリアントタンパク質を、細胞のゲノムの選択された部分
に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと一緒に発現させることを含む。細胞のゲノムを選
択的に変更するための方法は、当技術分野において、公知であり、例えば、米国特許第８
，６９７，３５９号；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号；米国特許出願公
開第２０１１／０１８９７７６号；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号；米
国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号；国際公開第２００８／１０８９８９号パ
ンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／
１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際
公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５／００５０
６９９号；米国特許出願公開第２０１５／００４５５４６号；米国特許出願公開第２０１
５／００３１１３４号；米国特許出願公開第２０１５／００２４５００号；米国特許出願
公開第２０１４／０３７７８６８号；米国特許出願公開第２０１４／０３５７５３０号；
米国特許出願公開第２０１４／０３４９４００号；米国特許出願公開第２０１４／０３３
５６２０号；米国特許出願公開第２０１４／０３３５０６３号；米国特許出願公開第２０
１４／０３１５９８５号；米国特許出願公開第２０１４／０３１０８３０号；米国特許出
願公開第２０１４／０３１０８２８号；米国特許出願公開第２０１４／０３０９４８７号
；米国特許出願公開第２０１４／０３０４８５３号；米国特許出願公開第２０１４／０２
９８５４７号；米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５６号；米国特許出願公開第２
０１４／０２９４７７３号；米国特許出願公開第２０１４／０２８７９３８号；米国特許
出願公開第２０１４／０２７３２３４号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３２
号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３１号；米国特許出願公開第２０１４／０
２７３２３０号；米国特許出願公開第２０１４／０２７１９８７号；米国特許出願公開第
２０１４／０２５６０４６号；米国特許出願公開第２０１４／０２４８７０２号；米国特
許出願公開第２０１４／０２４２７０２号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２７０
０号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９９号；米国特許出願公開第２０１４／
０２４２６６４号；米国特許出願公開第２０１４／０２３４９７２号；米国特許出願公開
第２０１４／０２２７７８７号；米国特許出願公開第２０１４／０２１２８６９号；米国
特許出願公開第２０１４／０２０１８５７号；米国特許出願公開第２０１４／０１９９７
６７号；米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号；米国特許出願公開第２０１４
／０１８６９５８号；米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号；米国特許出願公
開第２０１４／０１８６８４３号；米国特許出願公開第２０１４／０１７９７７０号；米
国特許出願公開第２０１４／０１７９００６号；米国特許出願公開第２０１４／０１７０
７５３号；Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas syste
ms" 9(6) Nature Reviews Microbiology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et a
l., "RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea" 482 Nature 33
1-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiunas et al., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex me
diates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria" 109(39) Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et
al., "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Imm
unity" 337 Science 816-821 (Aug. 17, 2012)；Carroll, "A CRISPR Approach to Gene
Targeting" 20(9) Molecular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日に
出願された米国出願第６１／６５２，０８６号；Al-Attar et al., Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious A
ntiviral Defense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4,
pp. 277-289；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs
That Function With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (
2012) vol. 45, Issue 3, 292-302を参照されたい。
この方法は、一般に、細胞中のバリアントタンパク質を、細胞のゲノムの選択された部分
に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと一緒に発現させることを含む。細胞のゲノムを選
択的に変更するための方法は、当技術分野において、公知であり、例えば、米国特許第８
，６９７，３５９号；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号；米国特許出願公
開第２０１１／０１８９７７６号；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号；米
国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号；国際公開第２００８／１０８９８９号パ
ンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／
１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際
公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５／００５０
６９９号；米国特許出願公開第２０１５／００４５５４６号；米国特許出願公開第２０１
５／００３１１３４号；米国特許出願公開第２０１５／００２４５００号；米国特許出願
公開第２０１４／０３７７８６８号；米国特許出願公開第２０１４／０３５７５３０号；
米国特許出願公開第２０１４／０３４９４００号；米国特許出願公開第２０１４／０３３
５６２０号；米国特許出願公開第２０１４／０３３５０６３号；米国特許出願公開第２０
１４／０３１５９８５号；米国特許出願公開第２０１４／０３１０８３０号；米国特許出
願公開第２０１４／０３１０８２８号；米国特許出願公開第２０１４／０３０９４８７号
；米国特許出願公開第２０１４／０３０４８５３号；米国特許出願公開第２０１４／０２
９８５４７号；米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５６号；米国特許出願公開第２
０１４／０２９４７７３号；米国特許出願公開第２０１４／０２８７９３８号；米国特許
出願公開第２０１４／０２７３２３４号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３２
号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３１号；米国特許出願公開第２０１４／０
２７３２３０号；米国特許出願公開第２０１４／０２７１９８７号；米国特許出願公開第
２０１４／０２５６０４６号；米国特許出願公開第２０１４／０２４８７０２号；米国特
許出願公開第２０１４／０２４２７０２号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２７０
０号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９９号；米国特許出願公開第２０１４／
０２４２６６４号；米国特許出願公開第２０１４／０２３４９７２号；米国特許出願公開
第２０１４／０２２７７８７号；米国特許出願公開第２０１４／０２１２８６９号；米国
特許出願公開第２０１４／０２０１８５７号；米国特許出願公開第２０１４／０１９９７
６７号；米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号；米国特許出願公開第２０１４
／０１８６９５８号；米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号；米国特許出願公
開第２０１４／０１８６８４３号；米国特許出願公開第２０１４／０１７９７７０号；米
国特許出願公開第２０１４／０１７９００６号；米国特許出願公開第２０１４／０１７０
７５３号；Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas syste
ms" 9(6) Nature Reviews Microbiology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et a
l., "RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea" 482 Nature 33
1-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiunas et al., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex me
diates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria" 109(39) Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et
al., "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Imm
unity" 337 Science 816-821 (Aug. 17, 2012)；Carroll, "A CRISPR Approach to Gene
Targeting" 20(9) Molecular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日に
出願された米国出願第６１／６５２，０８６号；Al-Attar et al., Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious A
ntiviral Defense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4,
pp. 277-289；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs
That Function With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (
2012) vol. 45, Issue 3, 292-302を参照されたい。
【0049】
本明細書に記載のバリアントタンパク質は、前述の参照文献に記載のＳｐＣａｓ９タン
パク質の代わりに、表１、２または３によるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイド
ＲＮＡとともに使用することができる。
パク質の代わりに、表１、２または３によるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイド
ＲＮＡとともに使用することができる。
【0050】
加えて、本明細書に記載のバリアントは、当技術分野において公知の野生型Ｃａｓ９ま
たは他のＣａｓ９変異（上記に記載のｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼなど）の代わ
りに、融合タンパク質、例えば、国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに記
載の異種性機能ドメインを有する融合タンパク質において使用することができる。例えば
、好ましくは、１つもしくは複数のヌクレアーゼ低減変異または致死変異を含むバリアン
トは、Ｃａｓ９のＮまたはＣ末端において、転写活性化ドメインもしくは他の異種性機能
ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤなど、例えば
、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）のリプレッサードメイン（ＥＲＤ）の４７３～５
３０番目のアミノ酸、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインの１～９７番目のアミノ酸、もしくは
Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）の１～３６番目のアミノ酸；Beerli et
al., PNAS USA 95:14628-14633 (1998)を参照されたい）、またはヘテロクロマチンタン
パク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても公知）などのサイレンサー、例えば、ＨＰ１αもし
くはＨＰ１β；ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４もしくはラム
ダＮタンパク質に結合したものなどの固定ＲＮＡ結合配列に融合された長い非コードＲＮ
Ａ（ｌｎｃＲＮＡ）をリクルートすることができるタンパク質またはペプチド；ＤＮＡの
メチル化状態を改変する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）ま
たはＴＥＴタンパク質）；ヒストンサブユニットを改変する酵素（例えば、ヒストンアセ
チルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメ
チルトランスフェラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基のメチル化のため）もし
くはヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基の脱メチル化のため）
）に融合させることができる。
たは他のＣａｓ９変異（上記に記載のｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼなど）の代わ
りに、融合タンパク質、例えば、国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに記
載の異種性機能ドメインを有する融合タンパク質において使用することができる。例えば
、好ましくは、１つもしくは複数のヌクレアーゼ低減変異または致死変異を含むバリアン
トは、Ｃａｓ９のＮまたはＣ末端において、転写活性化ドメインもしくは他の異種性機能
ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤなど、例えば
、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）のリプレッサードメイン（ＥＲＤ）の４７３～５
３０番目のアミノ酸、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインの１～９７番目のアミノ酸、もしくは
Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）の１～３６番目のアミノ酸；Beerli et
al., PNAS USA 95:14628-14633 (1998)を参照されたい）、またはヘテロクロマチンタン
パク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても公知）などのサイレンサー、例えば、ＨＰ１αもし
くはＨＰ１β；ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４もしくはラム
ダＮタンパク質に結合したものなどの固定ＲＮＡ結合配列に融合された長い非コードＲＮ
Ａ（ｌｎｃＲＮＡ）をリクルートすることができるタンパク質またはペプチド；ＤＮＡの
メチル化状態を改変する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）ま
たはＴＥＴタンパク質）；ヒストンサブユニットを改変する酵素（例えば、ヒストンアセ
チルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメ
チルトランスフェラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基のメチル化のため）もし
くはヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基の脱メチル化のため）
）に融合させることができる。
【0051】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、塩基エディター、例えば、シト
シンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、Ａ
ＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯ
ＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリ
ポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ
）ファミリー（例えば、Yang et al., J Genet Genomics. 2017 Sep 20;44(9):423-437を
参照されたい）；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導シチ
ジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２
；ならびにｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からのシチジンデアミ
ナーゼである。以下の表に例示的な配列を提示し、他の配列を使用することもできる。
シンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、Ａ
ＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯ
ＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリ
ポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ
）ファミリー（例えば、Yang et al., J Genet Genomics. 2017 Sep 20;44(9):423-437を
参照されたい）；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導シチ
ジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２
；ならびにｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からのシチジンデアミ
ナーゼである。以下の表に例示的な配列を提示し、他の配列を使用することもできる。
【0052】
【表2】
【0053】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、アデノシンＤＮＡ塩基を改変す
るデアミナーゼであり、例えば、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１
）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２
、ＡＤＡＲ３（例えば、Savva et al., Genome Biol. 2012 Dec 28;13(12):252を参照さ
れたい）；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、
ＡＤＡＴ３（Keegan et al., RNA. 2017 Sep;23(9):1317-1328およびSchaub and Keller,
Biochimie. 2002 Aug;84(8):791-803を参照されたい）；および天然に存在するまたは遺
伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）（例えば、Gaudelli
et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471（ＮＰ＿４１７０５４．２（大腸菌（
Escherichia coli）株Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５）を参照されたい;例えば、Wolf et al.
, EMBO J. 2002 Jul 15;21(14):3841-51を参照されたい）である。以下の表に例示的な配
列を提示し、他の配列を使用することもできる。
るデアミナーゼであり、例えば、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１
）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２
、ＡＤＡＲ３（例えば、Savva et al., Genome Biol. 2012 Dec 28;13(12):252を参照さ
れたい）；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、
ＡＤＡＴ３（Keegan et al., RNA. 2017 Sep;23(9):1317-1328およびSchaub and Keller,
Biochimie. 2002 Aug;84(8):791-803を参照されたい）；および天然に存在するまたは遺
伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）（例えば、Gaudelli
et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471（ＮＰ＿４１７０５４．２（大腸菌（
Escherichia coli）株Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５）を参照されたい;例えば、Wolf et al.
, EMBO J. 2002 Jul 15;21(14):3841-51を参照されたい）である。以下の表に例示的な配
列を提示し、他の配列を使用することもできる。
【0054】
【表3】
【0055】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、内因性ＤＮＡ修復もしくは塩基
除去修復（ＢＥＲ）経路を阻害または増強する、酵素、ドメインあるいはペプチド、例え
ば、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２１１
．４（核酸）およびＮＰ＿００３２０２．３（タンパク質））、またはウラシルＤＮＡグ
リコシラーゼ（ＵＤＧ、ウラシルＮ－グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても公知；Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３６２．３（核酸）およびＮＰ＿００３３５３．１（タン
パク質））、またはＢＥＲを開始するウラシルの除去を媒介するＵＮＧを阻害するウラシ
ルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）（例えば、Mol et al., Cell 82, 701-708 (19
95)；Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603)を参照されたい）；あるいはＤＮＡ
修復酵素を阻害およびより正確な編集をもたらす（意図的ではない塩基編集がより少ない
）、遊離ＤＮＡ末端に結合するバクテリオファージＭｕからのタンパク質であるＧａｍな
どのＤＮＡ末端結合タンパク質である。例えば、Komor et al., Sci Adv. 2017 Aug 30;3
(8):eaao4774を参照されたい。
除去修復（ＢＥＲ）経路を阻害または増強する、酵素、ドメインあるいはペプチド、例え
ば、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２１１
．４（核酸）およびＮＰ＿００３２０２．３（タンパク質））、またはウラシルＤＮＡグ
リコシラーゼ（ＵＤＧ、ウラシルＮ－グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても公知；Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３６２．３（核酸）およびＮＰ＿００３３５３．１（タン
パク質））、またはＢＥＲを開始するウラシルの除去を媒介するＵＮＧを阻害するウラシ
ルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）（例えば、Mol et al., Cell 82, 701-708 (19
95)；Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603)を参照されたい）；あるいはＤＮＡ
修復酵素を阻害およびより正確な編集をもたらす（意図的ではない塩基編集がより少ない
）、遊離ＤＮＡ末端に結合するバクテリオファージＭｕからのタンパク質であるＧａｍな
どのＤＮＡ末端結合タンパク質である。例えば、Komor et al., Sci Adv. 2017 Aug 30;3
(8):eaao4774を参照されたい。
【0056】
例えば、使用することもできる当技術分野において公知の、Komor et al., Nature. 20
16 May 19;533(7603):420-4；Nishida et al., Science. 2016 Sep 16;353(6305). pii:
aaf8729；Rees et al., Nat Commun. 2017 Jun 6;8:15790；またはKim et al., Nat Biot
echnol. 2017 Apr;35(4):371-376)を参照されたい。
16 May 19;533(7603):420-4；Nishida et al., Science. 2016 Sep 16;353(6305). pii:
aaf8729；Rees et al., Nat Commun. 2017 Jun 6;8:15790；またはKim et al., Nat Biot
echnol. 2017 Apr;35(4):371-376)を参照されたい。
【0057】
多くのドメインについての配列は、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触
媒する。例示的なタンパク質としては、１０－１１転位（ＴＥＴ）１～３ファミリー、Ｄ
ＮＡ中で５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ
）に変換する酵素が挙げられる。
媒する。例示的なタンパク質としては、１０－１１転位（ＴＥＴ）１～３ファミリー、Ｄ
ＮＡ中で５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ
）に変換する酵素が挙げられる。
【0058】
ヒトＴＥＴ１～３についての配列は、当技術分野において公知であり、以下の表に示す
。
。
【0059】
【表4】
【0060】
いくつかの実施形態において、触媒ドメインの全長配列のすべてまたは一部は、例えば
、７つの高度に保存されたエクソンによってコードされる、システインリッチ拡張および
２ＯＧＦｅＤＯドメインを含む触媒モジュール、例えば、１５８０～２０５２番目のアミ
ノ酸を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、１２９０～１９０５番目のアミノ酸を含むＴｅｔ２、
および９６６～１６７８番目のアミノ酸を含むＴｅｔ３を含むことができる。３つすべて
のＴｅｔタンパク質中の重要な触媒残基および全長配列についてのこれらの補助物質を示
す配列について（例えば、配列２ｃを参照されたい）、Iyer et al., Cell Cycle. 2009
Jun 1;8(11):1698-710. Epub 2009 Jun 27の図１を参照されたい；いくつかの実施形態に
おいて、配列は、Ｔｅｔ１の１４１８～２１３６番目のアミノ酸またはＴｅｔ２／３の対
応する領域を含む。
、７つの高度に保存されたエクソンによってコードされる、システインリッチ拡張および
２ＯＧＦｅＤＯドメインを含む触媒モジュール、例えば、１５８０～２０５２番目のアミ
ノ酸を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、１２９０～１９０５番目のアミノ酸を含むＴｅｔ２、
および９６６～１６７８番目のアミノ酸を含むＴｅｔ３を含むことができる。３つすべて
のＴｅｔタンパク質中の重要な触媒残基および全長配列についてのこれらの補助物質を示
す配列について（例えば、配列２ｃを参照されたい）、Iyer et al., Cell Cycle. 2009
Jun 1;8(11):1698-710. Epub 2009 Jun 27の図１を参照されたい；いくつかの実施形態に
おいて、配列は、Ｔｅｔ１の１４１８～２１３６番目のアミノ酸またはＴｅｔ２／３の対
応する領域を含む。
【0061】
他の触媒モジュールは、Iyer et al., 2009において特定されたタンパク質からのもの
であり得る。
であり得る。
【0062】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、生物学的テザーであり、ＭＳ２
コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質のすべて
または一部（例えば、これらからのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質は
、ｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ標的化配列によって特異化された場所に特異的ステムループ構造
を含有するＲＮＡ分子をリクルートするために使用することができる。例えば、ＭＳ２コ
ートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮに融合されたｄＣａｓ
９バリアントは、ＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ
）をリクルートするために使用することができ、例えば、Ｃｙｓ４、ＭＳ２またはラムダ
Ｎ結合配列に連結された、Keryer-Bibens et al., Biol. Cell 100:125-138 (2008)を参
照されたい。あるいは、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮタンパク質結合配列は、例えば
、Keryer-Bibens et al.（上記）に記載の別のタンパク質と連結され得、このタンパク質
は、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ｄＣａｓ９バリアント結合部位に標
的化することができる。いくつかの実施形態において、Ｃｓｙ４は、触媒的に不活性であ
る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９バリアント、好ましくは、ｄＣａｓ９バリア
ントは、国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットに記載のＦｏｋＩと融合され
る。
コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質のすべて
または一部（例えば、これらからのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質は
、ｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ標的化配列によって特異化された場所に特異的ステムループ構造
を含有するＲＮＡ分子をリクルートするために使用することができる。例えば、ＭＳ２コ
ートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮに融合されたｄＣａｓ
９バリアントは、ＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ
）をリクルートするために使用することができ、例えば、Ｃｙｓ４、ＭＳ２またはラムダ
Ｎ結合配列に連結された、Keryer-Bibens et al., Biol. Cell 100:125-138 (2008)を参
照されたい。あるいは、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮタンパク質結合配列は、例えば
、Keryer-Bibens et al.（上記）に記載の別のタンパク質と連結され得、このタンパク質
は、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ｄＣａｓ９バリアント結合部位に標
的化することができる。いくつかの実施形態において、Ｃｓｙ４は、触媒的に不活性であ
る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９バリアント、好ましくは、ｄＣａｓ９バリア
ントは、国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットに記載のＦｏｋＩと融合され
る。
【0063】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９バリアントおよび異種性
機能ドメインの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質（または連結された構造中
の融合タンパク質の間）で使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨
げない任意の配列を含むことができる。好ましい実施形態において、リンカーは、短く、
例えば、２～２０アミノ酸であり、典型的には、フレキシブルである（すなわち、グリシ
ン、アラニンおよびセリンなどの高自由度のアミノ酸を含む）。いくつかの実施形態にお
いて、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）もしくはＧＧＧＧＳ（配列番号３）からなる
１つまたは複数のユニット、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号２）もしくはＧＧＧＧＳ（配列
番号３）ユニットの２つ、３つ、４つまたはそれ以上のリピートを含む。他のリンカー配
列を使用することもできる。
機能ドメインの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質（または連結された構造中
の融合タンパク質の間）で使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨
げない任意の配列を含むことができる。好ましい実施形態において、リンカーは、短く、
例えば、２～２０アミノ酸であり、典型的には、フレキシブルである（すなわち、グリシ
ン、アラニンおよびセリンなどの高自由度のアミノ酸を含む）。いくつかの実施形態にお
いて、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）もしくはＧＧＧＧＳ（配列番号３）からなる
１つまたは複数のユニット、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号２）もしくはＧＧＧＧＳ（配列
番号３）ユニットの２つ、３つ、４つまたはそれ以上のリピートを含む。他のリンカー配
列を使用することもできる。
【0064】
送達および発現系
本明細書に記載のＣａｓ９バリアントを使用するために、これらをコードする核酸から
これらを発現することが望ましくあり得る。これは、いろいろな方法で行うことができる
。例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸は、複製および／もしくは発現のために
、原核細胞または真核細胞に形質転換するための中間ベクターにクローニングすることが
できる。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ９バリアントの産生のためにＣａｓ９バリ
アントをコードする核酸の貯蔵または操作のための、原核ベクター、例えば、プラスミド
、またはシャトルベクターもしくは昆虫ベクターである。Ｃａｓ９バリアントをコードす
る核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞
、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングすること
もできる。
本明細書に記載のＣａｓ９バリアントを使用するために、これらをコードする核酸から
これらを発現することが望ましくあり得る。これは、いろいろな方法で行うことができる
。例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸は、複製および／もしくは発現のために
、原核細胞または真核細胞に形質転換するための中間ベクターにクローニングすることが
できる。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ９バリアントの産生のためにＣａｓ９バリ
アントをコードする核酸の貯蔵または操作のための、原核ベクター、例えば、プラスミド
、またはシャトルベクターもしくは昆虫ベクターである。Ｃａｓ９バリアントをコードす
る核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞
、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングすること
もできる。
【0065】
発現を得るために、Ｃａｓ９バリアントをコードする配列は、典型的には、直接転写の
ためのプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌およ
び真核プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Mol
ecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and E
xpression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biol
ogy (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。遺伝子操作されたタンパク質を発
現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.
）およびサルモネラ（Salmonella）で利用可能である（Palva et al., 1983, Gene 22:22
9-235）。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母およ
び昆虫細胞のための真核発現系は、当技術分野において周知であり、これも市販されてい
る。
ためのプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌およ
び真核プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Mol
ecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and E
xpression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biol
ogy (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。遺伝子操作されたタンパク質を発
現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.
）およびサルモネラ（Salmonella）で利用可能である（Palva et al., 1983, Gene 22:22
9-235）。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母およ
び昆虫細胞のための真核発現系は、当技術分野において周知であり、これも市販されてい
る。
【0066】
核酸の直接発現のために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、
強い構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製のために使用
される。対照的に、Ｃａｓ９バリアントが遺伝子制御のためにインビボで投与されるべき
である場合、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかを、Ｃａｓ９バリア
ントの特定の使用に応じて、使用することができる。加えて、Ｃａｓ９バリアントの投与
のための好ましいプロモーターは、ＨＳＶ ＴＫなどの弱いプロモーター、または同様の
活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に応答するエレ
メント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー
応答エレメント、ならびにテトラサイクリン調節系およびＲＵ－４８６系などの低分子調
節系（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547；Oligin
o et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441
；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998, Nat. Biot
echnol., 16:757-761を参照されたい）を含むこともできる。
強い構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製のために使用
される。対照的に、Ｃａｓ９バリアントが遺伝子制御のためにインビボで投与されるべき
である場合、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかを、Ｃａｓ９バリア
ントの特定の使用に応じて、使用することができる。加えて、Ｃａｓ９バリアントの投与
のための好ましいプロモーターは、ＨＳＶ ＴＫなどの弱いプロモーター、または同様の
活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に応答するエレ
メント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー
応答エレメント、ならびにテトラサイクリン調節系およびＲＵ－４８６系などの低分子調
節系（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547；Oligin
o et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441
；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998, Nat. Biot
echnol., 16:757-761を参照されたい）を含むこともできる。
【0067】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核または真核のいずれかの宿
主細胞での核酸の発現のために必要なすべての追加エレメントを含有する転写ユニットま
たは発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃａｓ９
バリアントをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、
転写物、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結の効率がよいポリアデニル化のた
めに必要な任意のシグナルを含有する。カセットの追加エレメントは、例えば、エンハン
サー、および異種スプライシングイントロンシグナルを含んでいてもよい。
主細胞での核酸の発現のために必要なすべての追加エレメントを含有する転写ユニットま
たは発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃａｓ９
バリアントをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、
転写物、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結の効率がよいポリアデニル化のた
めに必要な任意のシグナルを含有する。カセットの追加エレメントは、例えば、エンハン
サー、および異種スプライシングイントロンシグナルを含んでいてもよい。
【0068】
細胞に遺伝情報を運ぶために使用される特定の発現ベクターは、Ｃａｓ９バリアントの
意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原性動物などにおける発現に関して
選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ
、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合
発現系が挙げられる。
意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原性動物などにおける発現に関して
選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ
、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合
発現系が挙げられる。
【0069】
真核ウイルスからの制御エレメントを含有する発現ベクターは、多くの場合、真核発現
ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン
バーウイルスに由来するベクターにおいて使用される。他の例示的な真核ベクターとして
は、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュ
ロウイルスｐＤＳＶＥが挙げられ、任意の他のベクターは、ＳＶ４０早期プロモーター、
ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプ
ロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核
細胞における発現のために効果的であることが示されているその他のプロモーターの指示
の下でタンパク質の発現を可能にする。
ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン
バーウイルスに由来するベクターにおいて使用される。他の例示的な真核ベクターとして
は、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュ
ロウイルスｐＤＳＶＥが挙げられ、任意の他のベクターは、ＳＶ４０早期プロモーター、
ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプ
ロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核
細胞における発現のために効果的であることが示されているその他のプロモーターの指示
の下でタンパク質の発現を可能にする。
【0070】
Ｃａｓ９バリアントを発現するためのベクターとしては、ガイドＲＮＡの発現を推進す
る、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモータ
ーを挙げることができる。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクシ
ョン後、哺乳動物細胞中においてＣａｓ９バリアントの発現を可能にする。
る、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモータ
ーを挙げることができる。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクシ
ョン後、哺乳動物細胞中においてＣａｓ９バリアントの発現を可能にする。
【0071】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択
のためのマーカーを有する。例えば、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターをポリ
ヒドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示の下、配列を
コードするｇＲＮＡとともに使用する、高収率の発現系も適切である。
ゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択
のためのマーカーを有する。例えば、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターをポリ
ヒドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示の下、配列を
コードするｇＲＮＡとともに使用する、高収率の発現系も適切である。
【0072】
典型的に発現ベクターに含まれるエレメントは、大腸菌（E. coli）において機能する
レプリコン、組み換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコー
ドする遺伝子、および組み換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域のユニー
クな制限部位も含む。
レプリコン、組み換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコー
ドする遺伝子、および組み換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域のユニー
クな制限部位も含む。
【0073】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する、細菌、
哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株を生成し、次いで、これは、標準的な技術を使用して
精製される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to
Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)
を参照されたい）。真核細胞および真核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行われ
る（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss,
Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい）。
哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株を生成し、次いで、これは、標準的な技術を使用して
精製される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to
Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)
を参照されたい）。真核細胞および真核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行われ
る（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss,
Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい）。
【0074】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための任意の公知の手順を使用してもよい
。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合
、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクシ
ョン、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよびイ
ンテグレーションの両方、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成Ｄ
ＮＡ、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための任意の他の周知の方法を含む
（例えば、Sambrook et al.（上記）を参照されたい）。使用される特定の遺伝子操作手
順は、Ｃａｓ９バリアントを発現する能力がある宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を成
功裏に導入する能力があることのみが必要である。
。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合
、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクシ
ョン、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよびイ
ンテグレーションの両方、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成Ｄ
ＮＡ、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための任意の他の周知の方法を含む
（例えば、Sambrook et al.（上記）を参照されたい）。使用される特定の遺伝子操作手
順は、Ｃａｓ９バリアントを発現する能力がある宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を成
功裏に導入する能力があることのみが必要である。
【0075】
あるいは、本方法は、Ｃａｓ９バリアントタンパク質およびガイドＲＮＡを一緒に、例
えば、複合体として、送達することを含み得る。例えば、Ｃａｓ９バリアントおよびｇＲ
ＮＡは、宿主細胞中で過剰発現および精製され、次いで、ガイドＲＮＡ（例えば、試験管
中）と複合体化して、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成し、細胞に送達すること
ができる。いくつかの実施形態において、バリアントＣａｓ９は、細菌Ｃａｓ９発現プラ
スミドの使用によって、細菌から発現および精製することができる。例えば、Ｈｉｓタグ
化バリアントＣａｓ９タンパク質は、細菌細胞中で発現し、次いで、ニッケルアフィニテ
ィークロマトグラフィーを使用して精製することができる。ＲＮＰの使用は、ヌクレアー
ゼもしくはガイドをコードするか、またはｍＲＮＡとしてヌクレアーゼをコードするプラ
スミドＤＮＡを送達する必要性を回避する。ＲＮＰ送達はまた、おそらく、ＲＮＰの半減
期がより短く、ヌクレアーゼおよびガイドの持続的発現がないので（プラスミドから取得
する場合）、特異性を改善し得る。ＲＮＰは、例えば、脂質媒介トランスフェクションま
たはエレクトロポレーションを使用して、インビボまたはインビトロで細胞に送達するこ
とができる。例えば、Liang et al. "Rapid and highly efficient mammalian cell engi
neering via Cas9 protein transfection." Journal of biotechnology 208 (2015): 44-
53；Zuris, John A., et al. "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables
efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nature biotechnol
ogy 33.1 (2015): 73-80；Kim et al. "Highly efficient RNA-guided genome editing i
n human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins." Genome research
24.6 (2014): 1012-1019を参照されたい。
えば、複合体として、送達することを含み得る。例えば、Ｃａｓ９バリアントおよびｇＲ
ＮＡは、宿主細胞中で過剰発現および精製され、次いで、ガイドＲＮＡ（例えば、試験管
中）と複合体化して、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成し、細胞に送達すること
ができる。いくつかの実施形態において、バリアントＣａｓ９は、細菌Ｃａｓ９発現プラ
スミドの使用によって、細菌から発現および精製することができる。例えば、Ｈｉｓタグ
化バリアントＣａｓ９タンパク質は、細菌細胞中で発現し、次いで、ニッケルアフィニテ
ィークロマトグラフィーを使用して精製することができる。ＲＮＰの使用は、ヌクレアー
ゼもしくはガイドをコードするか、またはｍＲＮＡとしてヌクレアーゼをコードするプラ
スミドＤＮＡを送達する必要性を回避する。ＲＮＰ送達はまた、おそらく、ＲＮＰの半減
期がより短く、ヌクレアーゼおよびガイドの持続的発現がないので（プラスミドから取得
する場合）、特異性を改善し得る。ＲＮＰは、例えば、脂質媒介トランスフェクションま
たはエレクトロポレーションを使用して、インビボまたはインビトロで細胞に送達するこ
とができる。例えば、Liang et al. "Rapid and highly efficient mammalian cell engi
neering via Cas9 protein transfection." Journal of biotechnology 208 (2015): 44-
53；Zuris, John A., et al. "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables
efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nature biotechnol
ogy 33.1 (2015): 73-80；Kim et al. "Highly efficient RNA-guided genome editing i
n human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins." Genome research
24.6 (2014): 1012-1019を参照されたい。
【0076】
本発明は、ベクター、およびベクターを含む細胞を含む。
【実施例0077】
本発明を以下の実施例においてさらに記載し、これは、特許請求の範囲に記載の本発明
の範囲を限定するものではない。
の範囲を限定するものではない。
【0078】
方法
以下の材料および方法を実施例１において使用した。
以下の材料および方法を実施例１において使用した。
【0079】
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
Ｔ７Ｅ１アッセイのための内因性ヒト遺伝子標的部位を増幅するために使用されるオリ
ゴヌクレオチドの配列は表４に見られる。
Ｔ７Ｅ１アッセイのための内因性ヒト遺伝子標的部位を増幅するために使用されるオリ
ゴヌクレオチドの配列は表４に見られる。
【0080】
【表5】
【0081】
細菌Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを別々に発現
させるための２つのＴ７プロモーターを用いて、以前に記載されるようにして（Kleinsti
ver et al., Nature 2015）、構築した。Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２
１９、Ｒ１３３５およびＴ１３３７の位置で可変アミノ酸を含有する細菌発現プラスミド
を、これらの位置でランダム化コドンをコードするオリゴヌクレオチドを、親ＳｐＣａｓ
９細菌発現ベクターにクローニングすることによって生成した（図１）。
させるための２つのＴ７プロモーターを用いて、以前に記載されるようにして（Kleinsti
ver et al., Nature 2015）、構築した。Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２
１９、Ｒ１３３５およびＴ１３３７の位置で可変アミノ酸を含有する細菌発現プラスミド
を、これらの位置でランダム化コドンをコードするオリゴヌクレオチドを、親ＳｐＣａｓ
９細菌発現ベクターにクローニングすることによって生成した（図１）。
【0082】
ヒト細胞での発現のために、ＳｐＣａｓ９における点変異を、ｐＣＭＶ－Ｔ７－ｈＳｐ
Ｃａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＦＬＡＧベクター（ＪＤＳ２４６；配列は、ここで、ａｄｄｇｅ
ｎｅ．ｏｒｇ／４３８６１／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／に見られる）への等温アセンブリーに
よって生成した。
Ｃａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＦＬＡＧベクター（ＪＤＳ２４６；配列は、ここで、ａｄｄｇｅ
ｎｅ．ｏｒｇ／４３８６１／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／に見られる）への等温アセンブリーに
よって生成した。
【0083】
ｓｇＲＮＡのＵ６発現のためのプラスミド（所望のスペーサーオリゴをクローニングす
ることができる）を、ＢｓｍＢＩ消化ＢＰＫ１５２０に適切にアニーリングされたオリゴ
をクローニングすることによって生成した。
ることができる）を、ＢｓｍＢＩ消化ＢＰＫ１５２０に適切にアニーリングされたオリゴ
をクローニングすることによって生成した。
【0084】
ＳｐＣａｓ９バリアントを進化させるための細菌系陽性選択アッセイ
陽性選択プラスミド（埋め込まれた標的部位を有する）を含有する形質転換受容性のあ
る大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）２３をＣａｓ９／ｓｇＲＮＡをコードす
るプラスミドで形質転換した。ＳＯＢ培地中での回収の６０分後、形質転換体を、クロラ
ムフェニコール（非選択的）またはクロラムフェニコール＋１０ｍＭアラビノース（選択
的）のいずれかを含有するＬＢプレートに蒔いた。
陽性選択プラスミド（埋め込まれた標的部位を有する）を含有する形質転換受容性のあ
る大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）２３をＣａｓ９／ｓｇＲＮＡをコードす
るプラスミドで形質転換した。ＳＯＢ培地中での回収の６０分後、形質転換体を、クロラ
ムフェニコール（非選択的）またはクロラムフェニコール＋１０ｍＭアラビノース（選択
的）のいずれかを含有するＬＢプレートに蒔いた。
【0085】
新規ＰＡＭを切断することができるＳｐＣａｓ９バリアントについて選択するために、
ランダム化Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／
Ｔ１３３７Ｘ ＳｐＣａｓ９ライブラリーをコードするプラスミドを、目的とするＰＡＭ
を有する標的部位をコードする陽性選択プラスミドを既に保有している大腸菌（E.coli）
ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）細胞にエレクトロポレーションした。生存コロニーを、終夜
増殖させ、ミニプレップして、ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸ発現プラスミドを抽出し、個
々に、以前に記載のＰＡＭ配列を有する陽性選択を含有する大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１
４１（λＤＥ３）細胞に再形質転換して、生存表現型とそのプラスミドの連結を再試験し
、それによって、偽陽性クローンを排除した。一般に、約３００クローンを、追跡実験で
再スクリーニングした。二次スクリーニングにおける真正の生存コロニーのＳｐＣａｓ９
発現プラスミドを、シークエンシングして、特異性の変更をもたらすＤ１１３５、Ｓ１１
３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／またはＴ１３３７の位置でのアミノ
酸を特定した（表１～３を参照されたい）。シークエンシングされたクローンにおいて観
察された変異を、生存クローンにおけるそれらの頻度、および（いくつかの場合では）ヒ
ト細胞系ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける活性に基づいて、さらなる評価のために選択した
。
ランダム化Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／
Ｔ１３３７Ｘ ＳｐＣａｓ９ライブラリーをコードするプラスミドを、目的とするＰＡＭ
を有する標的部位をコードする陽性選択プラスミドを既に保有している大腸菌（E.coli）
ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）細胞にエレクトロポレーションした。生存コロニーを、終夜
増殖させ、ミニプレップして、ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸ発現プラスミドを抽出し、個
々に、以前に記載のＰＡＭ配列を有する陽性選択を含有する大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１
４１（λＤＥ３）細胞に再形質転換して、生存表現型とそのプラスミドの連結を再試験し
、それによって、偽陽性クローンを排除した。一般に、約３００クローンを、追跡実験で
再スクリーニングした。二次スクリーニングにおける真正の生存コロニーのＳｐＣａｓ９
発現プラスミドを、シークエンシングして、特異性の変更をもたらすＤ１１３５、Ｓ１１
３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／またはＴ１３３７の位置でのアミノ
酸を特定した（表１～３を参照されたい）。シークエンシングされたクローンにおいて観
察された変異を、生存クローンにおけるそれらの頻度、および（いくつかの場合では）ヒ
ト細胞系ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける活性に基づいて、さらなる評価のために選択した
。
【0086】
ヒト細胞培養およびトランスフェクション
ＥＧＦＰ－ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一の統合されたコピーを保有するＵ２ＯＳ細
胞およびＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞（Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for hi
gh-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)）を、１０％のＦ
ＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％Ｃ
Ｏ２で培養した。細胞株の特定を、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）およびディープ
シークエンシングによって検証し、細胞を、マイコプラズマ汚染について２週間に１回試
験した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ培養培地に、追加で、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充し
た。細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－ヌクレオフェクターのＤＮ－１００プログラムを使用し
て、製造者の指示書に従って、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇ
ＲＮＡプラスミドで同時トランスフェクトした。空のＵ６プロモータープラスミドで一緒
にトランスフェクトされたＣａｓ９プラスミドを、すべてのヒト細胞実験について、陰性
対照として使用した。
ＥＧＦＰ－ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一の統合されたコピーを保有するＵ２ＯＳ細
胞およびＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞（Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for hi
gh-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)）を、１０％のＦ
ＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％Ｃ
Ｏ２で培養した。細胞株の特定を、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）およびディープ
シークエンシングによって検証し、細胞を、マイコプラズマ汚染について２週間に１回試
験した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ培養培地に、追加で、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充し
た。細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－ヌクレオフェクターのＤＮ－１００プログラムを使用し
て、製造者の指示書に従って、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇ
ＲＮＡプラスミドで同時トランスフェクトした。空のＵ６プロモータープラスミドで一緒
にトランスフェクトされたＣａｓ９プラスミドを、すべてのヒト細胞実験について、陰性
対照として使用した。
【0087】
ヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ
ＥＧＦＰ破壊実験を、以前に記載されたようにして（Fu, Y. et al. High-frequency o
ff-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotec
hnol 31, 822-826 (2013); Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for high-thro
ughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)）、行った。トランスフェ
クションのおよそ５２時間後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、トランスフェクトされたＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞中のＥＧ
ＦＰ蛍光を測定した。Ｃａｓ９および空のＵ６プロモータープラスミドの陰性対照トラン
スフェクションを使用して、すべての実験について、約２．５％のバックグラウンドのＥ
ＧＦＰのロスを確立した。
ＥＧＦＰ破壊実験を、以前に記載されたようにして（Fu, Y. et al. High-frequency o
ff-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotec
hnol 31, 822-826 (2013); Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for high-thro
ughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)）、行った。トランスフェ
クションのおよそ５２時間後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、トランスフェクトされたＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞中のＥＧ
ＦＰ蛍光を測定した。Ｃａｓ９および空のＵ６プロモータープラスミドの陰性対照トラン
スフェクションを使用して、すべての実験について、約２．５％のバックグラウンドのＥ
ＧＦＰのロスを確立した。
【0088】
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイを、以前に記載されたようにして１５、行った。Ｕ２ＯＳヒト細胞の
ために、ゲノムＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、
トランスフェクションの約７２時間後に、トランスフェクトされた細胞から抽出した。ヒ
ト細胞のゲノムＤＮＡからの標的遺伝子座を、表４に列挙したプライマーを使用して増幅
した。概略で２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、変性させ、アニーリングし、およびＴ７Ｅ
１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。変異生成頻度を、以前に記
載されたようにして１５、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を
使用して定量化した。
Ｔ７Ｅ１アッセイを、以前に記載されたようにして１５、行った。Ｕ２ＯＳヒト細胞の
ために、ゲノムＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、
トランスフェクションの約７２時間後に、トランスフェクトされた細胞から抽出した。ヒ
ト細胞のゲノムＤＮＡからの標的遺伝子座を、表４に列挙したプライマーを使用して増幅
した。概略で２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、変性させ、アニーリングし、およびＴ７Ｅ
１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。変異生成頻度を、以前に記
載されたようにして１５、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を
使用して定量化した。
【0089】
[実施例１]
現在アクセスできないＰＡＭ配列の標的化を可能にすることによってＳｐＣａｓ９の有
用性をさらに拡大するために、本発明者らは、新規なＰＡＭ配列を認識する能力があるＳ
ｐＣａｓ９バリアントについて選択するための代替戦略を考えた。ＳｐＣａｓ９コード配
列内のある特定の位置がＰＡＭ認識のために重要であることが以前に確立されており（Kl
einstiver et al., Nature 2015）、本発明者らは、６つの位置でアミノ酸をランダム化
して、ＰＡＭ相互作用ドメイン：Ｄ１１３５／Ｓ１１３６、Ｇ１２１８／Ｅ１２１９およ
びＲ１３３５／Ｔ１３３７の３つの別々の領域内で多様なコドン使用頻度を有するＳｐＣ
ａｓ９バリアントのライブラリーを生成させる、集中変異生成アプローチを実施した。そ
うするために、本発明者らは、コードされたこれらの６つのアミノ酸を含有するＳｐＣａ
ｓ９のコドンで、ＮＮＳヌクレオチドトリプレット（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドで
あり、ＳはＧまたはＣである）をコードするランダム化オリゴヌクレオチドカセットを連
続してクローニングした（図１Ａ）。次いで、得られるＳｐＣａｓ９バリアントのライブ
ラリーを、以前に記載されたようにして（Kleinstiver et al., Nature 2015）、さまざ
まなＮＧＮＮ ＰＡＭ配列をコードする標的部位に対して、本発明者らの細菌陽性選択ア
ッセイでスクリーニングした（図１Ｂ）。簡潔には、ＳｐＣａｓ９が陽性選択プラスミド
においてコードされる標的部位（ＰＡＭおよびスペーサー配列）を認識することができる
場合にのみ、細菌は、選択条件（１０ｍＭのアラビノース上に蒔かれ、これは、ｃｃｄＢ
毒性遺伝子の転写を誘導する）で生存することができる。強いＰＡＭ認識は、選択プラス
ミドの加水分解をもたらし、ｃｃｄＢ発現の誘導を防ぎ、細菌の増殖を可能にする。この
ように、ＳｐＣａｓ９ライブラリーのスクリーニングの間に、１０ｍＭのアラビノースを
含有する培地で増殖したコロニーは、代替ＰＡＭを標的化することができるＳｐＣａｓ９
ＰＡＭバリアントをコードすると予想される（図１Ｂ）。
現在アクセスできないＰＡＭ配列の標的化を可能にすることによってＳｐＣａｓ９の有
用性をさらに拡大するために、本発明者らは、新規なＰＡＭ配列を認識する能力があるＳ
ｐＣａｓ９バリアントについて選択するための代替戦略を考えた。ＳｐＣａｓ９コード配
列内のある特定の位置がＰＡＭ認識のために重要であることが以前に確立されており（Kl
einstiver et al., Nature 2015）、本発明者らは、６つの位置でアミノ酸をランダム化
して、ＰＡＭ相互作用ドメイン：Ｄ１１３５／Ｓ１１３６、Ｇ１２１８／Ｅ１２１９およ
びＲ１３３５／Ｔ１３３７の３つの別々の領域内で多様なコドン使用頻度を有するＳｐＣ
ａｓ９バリアントのライブラリーを生成させる、集中変異生成アプローチを実施した。そ
うするために、本発明者らは、コードされたこれらの６つのアミノ酸を含有するＳｐＣａ
ｓ９のコドンで、ＮＮＳヌクレオチドトリプレット（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドで
あり、ＳはＧまたはＣである）をコードするランダム化オリゴヌクレオチドカセットを連
続してクローニングした（図１Ａ）。次いで、得られるＳｐＣａｓ９バリアントのライブ
ラリーを、以前に記載されたようにして（Kleinstiver et al., Nature 2015）、さまざ
まなＮＧＮＮ ＰＡＭ配列をコードする標的部位に対して、本発明者らの細菌陽性選択ア
ッセイでスクリーニングした（図１Ｂ）。簡潔には、ＳｐＣａｓ９が陽性選択プラスミド
においてコードされる標的部位（ＰＡＭおよびスペーサー配列）を認識することができる
場合にのみ、細菌は、選択条件（１０ｍＭのアラビノース上に蒔かれ、これは、ｃｃｄＢ
毒性遺伝子の転写を誘導する）で生存することができる。強いＰＡＭ認識は、選択プラス
ミドの加水分解をもたらし、ｃｃｄＢ発現の誘導を防ぎ、細菌の増殖を可能にする。この
ように、ＳｐＣａｓ９ライブラリーのスクリーニングの間に、１０ｍＭのアラビノースを
含有する培地で増殖したコロニーは、代替ＰＡＭを標的化することができるＳｐＣａｓ９
ＰＡＭバリアントをコードすると予想される（図１Ｂ）。
【0090】
本発明者らは、最初に、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡ ＰＡＭを有す
る標的部位をコードする陽性選択プラスミドにおいて、ランダム化されたＤ１１３５Ｘ／
Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ ＳｐＣａｓ
９ライブラリー（ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）
をスクリーニングした。それぞれの異なるＰＡＭ選択のために、アラビノース選択からの
４８の生存コロニーを集め、クロラムフェニコール含有培地中で終夜増殖させて、プラス
ミドをコードするヌクレアーゼを回収した。一次スクリーニングにおいて偽陽性の割合を
低減するために、すべての推定上のＰＡＭバリアントプラスミドを、その後、標的部位を
コードする陽性選択プラスミドに対して、およびそれらが最初にスクリーニングされたＰ
ＡＭに対して、再スクリーニングした（データは示さない）。この再スクリーニングアッ
セイにおいて少なくとも５０％生存の真正バリアントのサブセットをシークエンシングし
て、１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、１３３５、１３３７番目の残基でのアミ
ノ酸を特定し（表１）、次いで、これらのバリアントを、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣ
およびＮＧＴＡ ＰＡＭに対してより広範にスクリーニングして、ＮＧＴＮ部位に対する
活性を評価した（図２ａ～２ｂおよび表１）。注意：この記載以降、細菌アッセイにおい
て、ＳｐＣａｓ９バリアントは、それらのバリアント番号（ｖＮＧＴＮ－＃）によって記
載し、またはヒトアッセイにおいて「アミノ酸名称」によって記載し、ここで、アミノ酸
名称は、ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸの形式であり、ここで、６つのＸは、１１３５、１
１３６、１２１８、１２１９、１３３５および１３３７番目の位置でのアミノ酸識別を表
す（表１～３において見られる）。再スクリーニングはわずかな傾向を特定し、ここで、
いくつかの場合において、バリアントは、最初に選択されたもの（例、ｖＮＧＴＮ－１、
－３、－１２、－２７、－２８など）に対するＮＧＴＮ ＰＡＭに対して最も高い活性を
有し、いくつかのバリアントは、ＮＧＴＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－１５、－３１、－
３５など、これは、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡを標的化することができる）の組み合わせを
標的化することができ、いくつかのバリアントは、ＮＧＴＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－
９、－１０、－３０など）のすべてを標的化することができる（図２Ａ～２Ｂおよび表１
）。これらの結果に基づいて、新規なバリアントを、初期スクリーニングにおいて十分に
行われたクローン中の１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、１３３５および１３３
７番目の位置でアミノ酸を生じる頻度に基づいて、合理的に設計した。これらの合理的に
設計されたＮＧＴＮバリアントを、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡ ＰＡ
Ｍ（図２Ｃ～２Ｆ）に対する細菌スクリーニングにおいて評価し、いくつかの場合におい
て、ＮＧＡＮ ＰＡＭ（ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＡ；図２Ｃ、２Ｅ～２Ｆ
）に対してもスクリーニングした。再び、上記の選好性と一致した性質を有する多数の興
味深いバリアントを特定したが、とりわけ、ＰＡＭ（例、ＮＧＴＧもしくはＮＧＡＧ Ｐ
ＡＭを標的化することができるｖＮＧＴＧ－３７、またはＮＧＴＣおよびＮＧＡＣ ＰＡ
ＭにおけるｖＮＧＴＧ－１８ならびに－４１など）の４番目の位置での選好性を与え得る
いくつかの追加バリアント、ＮＧＴＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－４０、－４６、－４８
など）のすべてを標的化することができる追加バリアント、およびＮＧＴＮもしくはＮＧ
ＡＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－７、－４４、－５９など；図２Ｃ～２Ｆおよび表１）の
すべてまたはほぼすべてを標的化することができるバリアントを特定した。
る標的部位をコードする陽性選択プラスミドにおいて、ランダム化されたＤ１１３５Ｘ／
Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ ＳｐＣａｓ
９ライブラリー（ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）
をスクリーニングした。それぞれの異なるＰＡＭ選択のために、アラビノース選択からの
４８の生存コロニーを集め、クロラムフェニコール含有培地中で終夜増殖させて、プラス
ミドをコードするヌクレアーゼを回収した。一次スクリーニングにおいて偽陽性の割合を
低減するために、すべての推定上のＰＡＭバリアントプラスミドを、その後、標的部位を
コードする陽性選択プラスミドに対して、およびそれらが最初にスクリーニングされたＰ
ＡＭに対して、再スクリーニングした（データは示さない）。この再スクリーニングアッ
セイにおいて少なくとも５０％生存の真正バリアントのサブセットをシークエンシングし
て、１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、１３３５、１３３７番目の残基でのアミ
ノ酸を特定し（表１）、次いで、これらのバリアントを、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣ
およびＮＧＴＡ ＰＡＭに対してより広範にスクリーニングして、ＮＧＴＮ部位に対する
活性を評価した（図２ａ～２ｂおよび表１）。注意：この記載以降、細菌アッセイにおい
て、ＳｐＣａｓ９バリアントは、それらのバリアント番号（ｖＮＧＴＮ－＃）によって記
載し、またはヒトアッセイにおいて「アミノ酸名称」によって記載し、ここで、アミノ酸
名称は、ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸの形式であり、ここで、６つのＸは、１１３５、１
１３６、１２１８、１２１９、１３３５および１３３７番目の位置でのアミノ酸識別を表
す（表１～３において見られる）。再スクリーニングはわずかな傾向を特定し、ここで、
いくつかの場合において、バリアントは、最初に選択されたもの（例、ｖＮＧＴＮ－１、
－３、－１２、－２７、－２８など）に対するＮＧＴＮ ＰＡＭに対して最も高い活性を
有し、いくつかのバリアントは、ＮＧＴＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－１５、－３１、－
３５など、これは、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡを標的化することができる）の組み合わせを
標的化することができ、いくつかのバリアントは、ＮＧＴＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－
９、－１０、－３０など）のすべてを標的化することができる（図２Ａ～２Ｂおよび表１
）。これらの結果に基づいて、新規なバリアントを、初期スクリーニングにおいて十分に
行われたクローン中の１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、１３３５および１３３
７番目の位置でアミノ酸を生じる頻度に基づいて、合理的に設計した。これらの合理的に
設計されたＮＧＴＮバリアントを、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡ ＰＡ
Ｍ（図２Ｃ～２Ｆ）に対する細菌スクリーニングにおいて評価し、いくつかの場合におい
て、ＮＧＡＮ ＰＡＭ（ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＡ；図２Ｃ、２Ｅ～２Ｆ
）に対してもスクリーニングした。再び、上記の選好性と一致した性質を有する多数の興
味深いバリアントを特定したが、とりわけ、ＰＡＭ（例、ＮＧＴＧもしくはＮＧＡＧ Ｐ
ＡＭを標的化することができるｖＮＧＴＧ－３７、またはＮＧＴＣおよびＮＧＡＣ ＰＡ
ＭにおけるｖＮＧＴＧ－１８ならびに－４１など）の４番目の位置での選好性を与え得る
いくつかの追加バリアント、ＮＧＴＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－４０、－４６、－４８
など）のすべてを標的化することができる追加バリアント、およびＮＧＴＮもしくはＮＧ
ＡＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ－７、－４４、－５９など；図２Ｃ～２Ｆおよび表１）の
すべてまたはほぼすべてを標的化することができるバリアントを特定した。
【0091】
細菌中のＮＧＴＮ ＰＡＭ部位を標的化することができるいくつかのバリアントを特定
し、本発明者らは、これらの選好性がヒト細胞における真正な活動に翻訳されるか否かを
決定することを試みた。本発明者らのヒトＵ２ＯＳ ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける１２
の異なるＮＧＴＮ ＰＡＭバリアントの初期スクリーニングにおいて、本発明者らは、Ｎ
ＧＴＴおよびＮＧＴＧ ＰＡＭ（例、ＳｐＣａｓ９－ＧＲＫＩＱＫ、－ＶＡＫＬＬＲ、－
ＶＲＫＬＬＲなど）を安定して標的化し得るバリアント、およびすべてのＮＧＴＮ ＰＡ
Ｍ部位（例、ＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬ、－ＩＲＡＶＱＬなど）を改変し得るいくつか
のバリアントを特定した（図３Ａ）。ヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイにおいてこれらのバ
リアントおよび追加の合理的に設計されたバリアントのサブセットのさらなるスクリーニ
ングは、ＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬ、－ＬＲＫＩＱＫ、－ＬＲＳＶＱＫなどを、ＮＧＴ
Ｎ ＰＡＭ配列を標的化することができる有望なバリアントとして特定した（図３Ｂ）。
ヒト細胞でのＮＧＴＮ ＰＡＭ配列におけるＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬの活性をより厳
しく特徴付けるために、本発明者らは、ヒトＵ２ＯＳ細胞において、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣ
ＦおよびＲＵＮＸ１遺伝子にわたる３２の異なる内因性部位にわたって、このヌクレアー
ゼバリアントの活性を調べた。この解析は、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＡ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴ
Ｔ ＰＡＭを持つさまざまな内因性部位におけるＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬの安定した
活性を明らかにした（図３Ｃ、本発明者らの選択および合理的に設計したＰＡＭバリアン
トが公表されたＳｐＣａｓ９バリアントで以前に標的化できなかった多数の遺伝子座にわ
たって効率よく機能することができることを実証する）。
し、本発明者らは、これらの選好性がヒト細胞における真正な活動に翻訳されるか否かを
決定することを試みた。本発明者らのヒトＵ２ＯＳ ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける１２
の異なるＮＧＴＮ ＰＡＭバリアントの初期スクリーニングにおいて、本発明者らは、Ｎ
ＧＴＴおよびＮＧＴＧ ＰＡＭ（例、ＳｐＣａｓ９－ＧＲＫＩＱＫ、－ＶＡＫＬＬＲ、－
ＶＲＫＬＬＲなど）を安定して標的化し得るバリアント、およびすべてのＮＧＴＮ ＰＡ
Ｍ部位（例、ＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬ、－ＩＲＡＶＱＬなど）を改変し得るいくつか
のバリアントを特定した（図３Ａ）。ヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイにおいてこれらのバ
リアントおよび追加の合理的に設計されたバリアントのサブセットのさらなるスクリーニ
ングは、ＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬ、－ＬＲＫＩＱＫ、－ＬＲＳＶＱＫなどを、ＮＧＴ
Ｎ ＰＡＭ配列を標的化することができる有望なバリアントとして特定した（図３Ｂ）。
ヒト細胞でのＮＧＴＮ ＰＡＭ配列におけるＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬの活性をより厳
しく特徴付けるために、本発明者らは、ヒトＵ２ＯＳ細胞において、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣ
ＦおよびＲＵＮＸ１遺伝子にわたる３２の異なる内因性部位にわたって、このヌクレアー
ゼバリアントの活性を調べた。この解析は、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＡ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴ
Ｔ ＰＡＭを持つさまざまな内因性部位におけるＳｐＣａｓ９－ＬＲＳＶＱＬの安定した
活性を明らかにした（図３Ｃ、本発明者らの選択および合理的に設計したＰＡＭバリアン
トが公表されたＳｐＣａｓ９バリアントで以前に標的化できなかった多数の遺伝子座にわ
たって効率よく機能することができることを実証する）。
【0092】
本発明者らは、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ（Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ
／Ｔ１３３７Ｒ置換をコードする）と呼ばれるＮＧＣＧ ＰＡＭ部位（Kleinstiver et a
l., Nature, 2015）を効率的に標的化することができるＳｐＣａｓ９バリアントを以前に
記載した。このバリアントは、以前にアクセス可能ではなかった部位の標的化を可能にす
るが、これは、拡張されたＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位における活性を制限する。現在
ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよびＮＧＣＡを含むＮＧＣＮ ＰＡＭをすべて潜在的に標的化する
ことによってＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントの有用性を拡大するために、本発明者らは
、上記に記載のものに対する同様の選択を行ったが、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣまた
はＮＧＣＡ ＰＡＭのいずれかを有する標的部位を保有する陽性選択プラスミドに対する
ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸライブラリーをスクリーニングした（図４Ａ～４Ｂおよび表
２）。本発明者らがＮＧＴＮ選択で観察したものと酷似して、ＮＧＣＮバリアントの再ス
クリーニングは、バリアントが、最初に選択されたＮＧＣＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ－
３、－８、－９、－１７など）に対して最も高い活性を有する場合、いくつかのバリアン
トが、ＮＧＣＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ－１０など、これは、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよ
びＮＧＣＡを標的化することができる）の組み合わせを標的化することができること、な
らびにいくつかのバリアントがＮＧＣＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ－１、－２、－５、－
１８、－２６など）のすべてを標的化することができることを特定した（図４Ａ～４Ｂお
よび表２）。さまざまな合理的に生成されたＮＧＣＮバリアントを、ＳｐＣａｓ９－ＸＸ
ＸＸＸＸ選択クローンにおけるアミノ酸富化の観察に基づいてクローニングし、ＮＧＣＮ
ＰＡＭに対する活性について細菌中で試験した（図４Ａ～４Ｂ、表２、データは示さな
い）。
／Ｔ１３３７Ｒ置換をコードする）と呼ばれるＮＧＣＧ ＰＡＭ部位（Kleinstiver et a
l., Nature, 2015）を効率的に標的化することができるＳｐＣａｓ９バリアントを以前に
記載した。このバリアントは、以前にアクセス可能ではなかった部位の標的化を可能にす
るが、これは、拡張されたＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位における活性を制限する。現在
ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよびＮＧＣＡを含むＮＧＣＮ ＰＡＭをすべて潜在的に標的化する
ことによってＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントの有用性を拡大するために、本発明者らは
、上記に記載のものに対する同様の選択を行ったが、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣまた
はＮＧＣＡ ＰＡＭのいずれかを有する標的部位を保有する陽性選択プラスミドに対する
ＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸライブラリーをスクリーニングした（図４Ａ～４Ｂおよび表
２）。本発明者らがＮＧＴＮ選択で観察したものと酷似して、ＮＧＣＮバリアントの再ス
クリーニングは、バリアントが、最初に選択されたＮＧＣＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ－
３、－８、－９、－１７など）に対して最も高い活性を有する場合、いくつかのバリアン
トが、ＮＧＣＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ－１０など、これは、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよ
びＮＧＣＡを標的化することができる）の組み合わせを標的化することができること、な
らびにいくつかのバリアントがＮＧＣＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ－１、－２、－５、－
１８、－２６など）のすべてを標的化することができることを特定した（図４Ａ～４Ｂお
よび表２）。さまざまな合理的に生成されたＮＧＣＮバリアントを、ＳｐＣａｓ９－ＸＸ
ＸＸＸＸ選択クローンにおけるアミノ酸富化の観察に基づいてクローニングし、ＮＧＣＮ
ＰＡＭに対する活性について細菌中で試験した（図４Ａ～４Ｂ、表２、データは示さな
い）。
【0093】
次に、本発明者らは、本発明者らのＵ２ＯＳ ＥＧＦＰ破壊アッセイにおけるさまざま
なＮＧＣＮ選択ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントの活性を調べて、それらの再標的化ＰＡ
Ｍ選好性およびヌクレアーゼ活性がヒト細胞で再現されるか否かを決定した（図５Ａ～５
Ｄ）。本発明者らは、ＮＧＣＡ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、－ＬＷＲＶＶＡ
、－ＬＷＬＥＴＲなど；図５Ａ）、ＮＧＣＣ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、－
ＬＳＲＷＱＲ、－ＩＣＣＣＥＲなど；図５Ａ）、ＮＧＣＴ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱ
ＫＳＥＲ；図５Ｃ）、またはＮＧＣＣおよびＮＧＣＴ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳ
ＥＲ、－ＶＲＫＳＥＲ、－ＩＣＫＳＥＲなど；図５Ｃ）に対する多数のバリアントの活性
を観察した。さらに、全部で１５のＮＧＣＡ、ＮＧＣＣ、ＮＧＣＴおよびＮＧＣＧ部位に
対するＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、－ＶＲＫＳＥＲ、－ＩＣＫＳＥＲバリアントの試験
は、すべてのクラスのＮＧＣＮ ＰＡＭに対するそれぞれのバリアントの安定した活性を
明らかにした（図５Ｅ）。いくつかの場合において、これらのバリアントは、公表された
ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ（例えば、図５Ｂ～５Ｃに示される）より優れ得るが、これは、
一般に、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲによって効率的に標的化されないことが以前に示された
ＰＡＭに対してであった。まとめると、これらの新しいバリアントは、ＳｐＣａｓ９－Ｍ
ＱＫＳＥＲ、およびすべてのＮＧＣＮ ＰＡＭに対して安定した活性を有する他のバリア
ントにより、以前にアクセス可能であったＮＧＣＧの代わりに、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよ
びＮＧＣＡに、ＳｐＣａｓ９の標的化を拡大する。
なＮＧＣＮ選択ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントの活性を調べて、それらの再標的化ＰＡ
Ｍ選好性およびヌクレアーゼ活性がヒト細胞で再現されるか否かを決定した（図５Ａ～５
Ｄ）。本発明者らは、ＮＧＣＡ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、－ＬＷＲＶＶＡ
、－ＬＷＬＥＴＲなど；図５Ａ）、ＮＧＣＣ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、－
ＬＳＲＷＱＲ、－ＩＣＣＣＥＲなど；図５Ａ）、ＮＧＣＴ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱ
ＫＳＥＲ；図５Ｃ）、またはＮＧＣＣおよびＮＧＣＴ ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳ
ＥＲ、－ＶＲＫＳＥＲ、－ＩＣＫＳＥＲなど；図５Ｃ）に対する多数のバリアントの活性
を観察した。さらに、全部で１５のＮＧＣＡ、ＮＧＣＣ、ＮＧＣＴおよびＮＧＣＧ部位に
対するＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、－ＶＲＫＳＥＲ、－ＩＣＫＳＥＲバリアントの試験
は、すべてのクラスのＮＧＣＮ ＰＡＭに対するそれぞれのバリアントの安定した活性を
明らかにした（図５Ｅ）。いくつかの場合において、これらのバリアントは、公表された
ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ（例えば、図５Ｂ～５Ｃに示される）より優れ得るが、これは、
一般に、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲによって効率的に標的化されないことが以前に示された
ＰＡＭに対してであった。まとめると、これらの新しいバリアントは、ＳｐＣａｓ９－Ｍ
ＱＫＳＥＲ、およびすべてのＮＧＣＮ ＰＡＭに対して安定した活性を有する他のバリア
ントにより、以前にアクセス可能であったＮＧＣＧの代わりに、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよ
びＮＧＣＡに、ＳｐＣａｓ９の標的化を拡大する。
【0094】
加えて、本発明者らは、ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲ（Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３
３７Ｒ；Kleinstiver et al., Nature, 2015）およびＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ（Ｄ１１３
５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ；Kleinstiver and Pattanayak et al
., Nature, 2016）と呼ばれるＮＧＡＮ ＰＡＭ部位を効率的に標的化することができる
ＳｐＣａｓ９バリアントも以前に記載している。しかしながら、これらのバリアントは、
ＮＧＡＧ＞ＮＧＡＡ＝ＮＧＡＴ＞ＮＧＡＣの順で、ＮＧＡＮ ＰＡＭのサブクラスへの選
好性を有し、すなわち、これらは、ＮＧＡＣ ＰＡＭ部位に対する準最適な活性を有する
。ＮＧＡＮ ＰＡＭのＳｐＣａｓ９標的化を潜在的に改善するために、本発明者らは、Ｎ
ＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣおよびＮＧＡＡ ＰＡＭをコードする陽性選択プラスミドに
対する上記に記載のＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸライブラリーによる選択を行った（図６
Ａ～６Ｂおよび表３）。ＮＧＡＮバリアントの再スクリーニングは、クローンが、最初に
選択されたＮＧＡＮ ＰＡＭ（例、ＮＧＡＧにおけるｖＮＧＡＮ－１、－２、－１７、－
２６から－３０など、ＮＧＡＴにおけるｖＮＧＡＮ－３２、ＮＧＡＣにおけるｖＮＧＡＮ
－４、－５、－４０、－４１など）に対する最も高い活性を有すること、いくつかのバリ
アントがＮＧＡＮ ＰＡＭ（例、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＣを標的化することができるｖＮ
ＧＡＮ－２０、－２１など、またはＮＧＡＧおよびＮＧＡＣを標的化することができるｖ
ＮＧＡＮ－２２）の組み合わせを標的化することができること、ならびにいくつかのバリ
アントがＮＧＡＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＡＮ－３、－１３、－２５、－３１など）のすべ
てを標的化することができることを明らかにした（図６Ａ～６Ｂおよび表３）。
３７Ｒ；Kleinstiver et al., Nature, 2015）およびＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ（Ｄ１１３
５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ；Kleinstiver and Pattanayak et al
., Nature, 2016）と呼ばれるＮＧＡＮ ＰＡＭ部位を効率的に標的化することができる
ＳｐＣａｓ９バリアントも以前に記載している。しかしながら、これらのバリアントは、
ＮＧＡＧ＞ＮＧＡＡ＝ＮＧＡＴ＞ＮＧＡＣの順で、ＮＧＡＮ ＰＡＭのサブクラスへの選
好性を有し、すなわち、これらは、ＮＧＡＣ ＰＡＭ部位に対する準最適な活性を有する
。ＮＧＡＮ ＰＡＭのＳｐＣａｓ９標的化を潜在的に改善するために、本発明者らは、Ｎ
ＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣおよびＮＧＡＡ ＰＡＭをコードする陽性選択プラスミドに
対する上記に記載のＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸライブラリーによる選択を行った（図６
Ａ～６Ｂおよび表３）。ＮＧＡＮバリアントの再スクリーニングは、クローンが、最初に
選択されたＮＧＡＮ ＰＡＭ（例、ＮＧＡＧにおけるｖＮＧＡＮ－１、－２、－１７、－
２６から－３０など、ＮＧＡＴにおけるｖＮＧＡＮ－３２、ＮＧＡＣにおけるｖＮＧＡＮ
－４、－５、－４０、－４１など）に対する最も高い活性を有すること、いくつかのバリ
アントがＮＧＡＮ ＰＡＭ（例、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＣを標的化することができるｖＮ
ＧＡＮ－２０、－２１など、またはＮＧＡＧおよびＮＧＡＣを標的化することができるｖ
ＮＧＡＮ－２２）の組み合わせを標的化することができること、ならびにいくつかのバリ
アントがＮＧＡＮ ＰＡＭ（例、ｖＮＧＡＮ－３、－１３、－２５、－３１など）のすべ
てを標的化することができることを明らかにした（図６Ａ～６Ｂおよび表３）。
【0095】
多数のＳｐＣａｓ９－ＸＸＸＸＸＸバリアントが細菌スクリーニングにおける強いＮＧ
ＡＣ ＰＡＭ標的化を明らかにしたので、多くのバリアントを、本発明者らのヒト発現ベ
クターにサブクローニングして、本発明者らのヒト細胞Ｕ２ＯＳ ＥＧＦＰ破壊アッセイ
において活性を調べた。ＥＧＦＰにおける単一のＮＧＡＡ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＴおよびＮ
ＧＡＧ ＰＡＭ部位に対するバリアントのサブセットの初期スクリーニングは、ある特定
のバリアントが、ＮＧＡＣ ＰＡＭを保有する部位でＳｐＣａｓ９－ＶＱＲよりも潜在的
に優れていることを明らかにした（図７Ａ）。図７Ａからのバリアントおよび追加で選択
されたバリアントのより広範囲におよぶ試験は、複数のＳｐＣａｓ９バリアントが、Ｓｐ
Ｃａｓ９－ＬＲＳＶＲＳ、－ＭＲＡＲＫＥ、－ＳＲＱＭＲＧなどを含む、ＥＧＦＰ破壊ア
ッセイ（図７Ｂ）において調べられたＮＧＡＣ ＰＡＭの一部または４つすべてに対する
ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲと比べて活性が改善されていることを明らかにした。
ＡＣ ＰＡＭ標的化を明らかにしたので、多くのバリアントを、本発明者らのヒト発現ベ
クターにサブクローニングして、本発明者らのヒト細胞Ｕ２ＯＳ ＥＧＦＰ破壊アッセイ
において活性を調べた。ＥＧＦＰにおける単一のＮＧＡＡ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＴおよびＮ
ＧＡＧ ＰＡＭ部位に対するバリアントのサブセットの初期スクリーニングは、ある特定
のバリアントが、ＮＧＡＣ ＰＡＭを保有する部位でＳｐＣａｓ９－ＶＱＲよりも潜在的
に優れていることを明らかにした（図７Ａ）。図７Ａからのバリアントおよび追加で選択
されたバリアントのより広範囲におよぶ試験は、複数のＳｐＣａｓ９バリアントが、Ｓｐ
Ｃａｓ９－ＬＲＳＶＲＳ、－ＭＲＡＲＫＥ、－ＳＲＱＭＲＧなどを含む、ＥＧＦＰ破壊ア
ッセイ（図７Ｂ）において調べられたＮＧＡＣ ＰＡＭの一部または４つすべてに対する
ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲと比べて活性が改善されていることを明らかにした。
【0096】
次いで、本発明者らは、本発明者らのＳｐＣａｓ９バリアントの活性を、緩和されたＮ
Ｇ ＰＡＭ選好性が報告されているｘＣａｓ９と呼ばれる最近記載されたＳｐＣａｓ９
ＰＡＭバリアント（Hu et al., Nature volume 556, pages 57-63 (05 April 2018)）と
比較した。本発明者らの以前の結果と一致して、本発明者らは、ＶＲＱＲバリアント（Ｖ
ＳＲＥＱＲとしても公知）を有するＮＧＡ ＰＡＭを有する部位、ＶＲＥＲ（ＶＳＲＥＥ
Ｒとしても公知）およびＭＱＫＳＥＲバリアントを有するＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位
、ならびにＬＲＳＶＱＬバリアントを有するＮＧＴ ＰＡＭを有する部位の安定したヌク
レアーゼ標的化（Ｔ７Ｅ１アッセイによって評価された場合に、１５～５０％の間）を観
察した（図８）。しかしながら、ｘＣａｓ９バリアントにより、ＮＧＡ、ＮＧＣＧまたは
ＮＧＴ ＰＡＭを有する部位の標的化は、１０％超の効率は観察されず、さらにまた、本
発明者らは、ｘＣａｓ９が、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、ＮＧＧ ＰＡＭを有する標
的部位で平均で約２分の１の効果であったことを観察した（図８）。これらの結果は、本
発明者らのＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントが、ｘＣａｓ９と比較した場合に、いろいろ
なＰＡＭに対してより効果的なヌクレアーゼであることを実証する。
Ｇ ＰＡＭ選好性が報告されているｘＣａｓ９と呼ばれる最近記載されたＳｐＣａｓ９
ＰＡＭバリアント（Hu et al., Nature volume 556, pages 57-63 (05 April 2018)）と
比較した。本発明者らの以前の結果と一致して、本発明者らは、ＶＲＱＲバリアント（Ｖ
ＳＲＥＱＲとしても公知）を有するＮＧＡ ＰＡＭを有する部位、ＶＲＥＲ（ＶＳＲＥＥ
Ｒとしても公知）およびＭＱＫＳＥＲバリアントを有するＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位
、ならびにＬＲＳＶＱＬバリアントを有するＮＧＴ ＰＡＭを有する部位の安定したヌク
レアーゼ標的化（Ｔ７Ｅ１アッセイによって評価された場合に、１５～５０％の間）を観
察した（図８）。しかしながら、ｘＣａｓ９バリアントにより、ＮＧＡ、ＮＧＣＧまたは
ＮＧＴ ＰＡＭを有する部位の標的化は、１０％超の効率は観察されず、さらにまた、本
発明者らは、ｘＣａｓ９が、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、ＮＧＧ ＰＡＭを有する標
的部位で平均で約２分の１の効果であったことを観察した（図８）。これらの結果は、本
発明者らのＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントが、ｘＣａｓ９と比較した場合に、いろいろ
なＰＡＭに対してより効果的なヌクレアーゼであることを実証する。
【0097】
[実施例２]
正確な単一の塩基編集イベントを行うための能力は、最近、遺伝子操作されたＳｐＣａ
ｓ９塩基エディター（ＢＥ）コンストラクトを使用して実証され（例えば、Komor et al.
, Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4；Nishida et al., Science. 2016 Sep 16;353(
6305)；Kim et al., Nat Biotechnol. 2017 Apr;35(4):371-376；Komor et al., Sci Adv
. 2017 Aug 30;3(8):eaao4774；およびGaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681
):464-471を参照されたい）、これは、非標的ＤＮＡ鎖のｓｓＤＮＡ到達性を引き起こす
Ｒループを形成するＳｐＣａｓ９－ｇＲＮＡの形成を利用する。したがって、異種性のシ
チジンまたはアデニンデアミナーゼ酵素ドメインのＳｐＣａｓ９への融合体は、露出した
ｓｓＤＮＡ鎖上で作用し得、それぞれ、ＣからＴへの変更（いわゆる、シトシン塩基エデ
ィター、またはＣＢＥ）またはＡからＧへの変更（いわゆる、アデノシン塩基エディター
、またなＡＢＥ）の効率がよい導入をもたらす。細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）は、ウラ
シル塩基を除去するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ；ウラシルＮ－グリコ
シラーゼまたはＵＮＧとしても公知）を利用するので、この内因性プロセスは、シチジン
ＢＥによって生成した編集を効率的に元に戻してしまう可能性がある。これは、シチジン
の脱アミノ化がウラシル中間体をもたらすからである。したがって、シチジンＢＥの効率
を改善するために、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）などの異種エフェクタード
メインはまた、ＳｐＣａｓ９と融合して、ＵＤＧを阻害することができ、ＢＥＲの開始を
覆し、シチジンＢＥの有効性を増加させる。
正確な単一の塩基編集イベントを行うための能力は、最近、遺伝子操作されたＳｐＣａ
ｓ９塩基エディター（ＢＥ）コンストラクトを使用して実証され（例えば、Komor et al.
, Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4；Nishida et al., Science. 2016 Sep 16;353(
6305)；Kim et al., Nat Biotechnol. 2017 Apr;35(4):371-376；Komor et al., Sci Adv
. 2017 Aug 30;3(8):eaao4774；およびGaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681
):464-471を参照されたい）、これは、非標的ＤＮＡ鎖のｓｓＤＮＡ到達性を引き起こす
Ｒループを形成するＳｐＣａｓ９－ｇＲＮＡの形成を利用する。したがって、異種性のシ
チジンまたはアデニンデアミナーゼ酵素ドメインのＳｐＣａｓ９への融合体は、露出した
ｓｓＤＮＡ鎖上で作用し得、それぞれ、ＣからＴへの変更（いわゆる、シトシン塩基エデ
ィター、またはＣＢＥ）またはＡからＧへの変更（いわゆる、アデノシン塩基エディター
、またなＡＢＥ）の効率がよい導入をもたらす。細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）は、ウラ
シル塩基を除去するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ；ウラシルＮ－グリコ
シラーゼまたはＵＮＧとしても公知）を利用するので、この内因性プロセスは、シチジン
ＢＥによって生成した編集を効率的に元に戻してしまう可能性がある。これは、シチジン
の脱アミノ化がウラシル中間体をもたらすからである。したがって、シチジンＢＥの効率
を改善するために、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）などの異種エフェクタード
メインはまた、ＳｐＣａｓ９と融合して、ＵＤＧを阻害することができ、ＢＥＲの開始を
覆し、シチジンＢＥの有効性を増加させる。
【0098】
したがって、本発明者らは、本発明者らのＳｐＣａｓ９ ＰＡＭバリアントの拡大され
た標的範囲が、以前にアクセス可能ではなかった部位の編集を可能にすることによって、
塩基エディターの有用性を改善することができるか否かを決定することを試みた。そうす
るために、本発明者らは、ＢＥ３（Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-
4）ＰＡＭバリアントを構築して、ＮＧＡおよびＮＧＴ ＰＡＭを有する部位を認識する
能力があるＣＢＥを生成した。本発明者らは、ＮＧＡ ＰＡＭを有する部位において、Ｃ
ＢＥ－ＶＲＱＲバリアントが、編集ウィンドウにおいて７．５％～６４．２％の間のＣか
らＴへの変換を示した一方で、ｘＣａｓ９が、同じ部位において０％～１９．９％のＣか
らＴへの編集を示したことを見出した（図９Ａ）。同様に、ＮＧＴ ＰＡＭを有する部位
において、ＣＢＥ－ＬＲＳＶＱＬバリアントは、１０．８％～５０．３％の間のＣからＴ
への変換を示した一方で、ＣＢＥ－ｘＣａｓ９が、同じ部位において０％～２８．５％の
ＣからＴへの編集を示した（図９Ａ）。本発明者らは、ＮＧＧ ＰＡＭを有する部位にお
いて、野生型ＳｐＣａｓ９（５２．５％～６２．４％）と比較して、ＣＢＥ－ｘＣａｓ９
によるＣからＴへの編集活性（２６．７％～３７．２％）の著しい減少も観察した（図９
Ａ）。これらの結果は、ＶＲＱＲおよびＬＲＳＶＱＬのＢＥ３バージョンが、それぞれ、
ｘＣａｓ９より約２倍大きい割合で、ＮＧＡおよびＮＧＴ ＰＡＭを有する部位において
、効果的なＣＢＥであることを実証する。
た標的範囲が、以前にアクセス可能ではなかった部位の編集を可能にすることによって、
塩基エディターの有用性を改善することができるか否かを決定することを試みた。そうす
るために、本発明者らは、ＢＥ３（Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-
4）ＰＡＭバリアントを構築して、ＮＧＡおよびＮＧＴ ＰＡＭを有する部位を認識する
能力があるＣＢＥを生成した。本発明者らは、ＮＧＡ ＰＡＭを有する部位において、Ｃ
ＢＥ－ＶＲＱＲバリアントが、編集ウィンドウにおいて７．５％～６４．２％の間のＣか
らＴへの変換を示した一方で、ｘＣａｓ９が、同じ部位において０％～１９．９％のＣか
らＴへの編集を示したことを見出した（図９Ａ）。同様に、ＮＧＴ ＰＡＭを有する部位
において、ＣＢＥ－ＬＲＳＶＱＬバリアントは、１０．８％～５０．３％の間のＣからＴ
への変換を示した一方で、ＣＢＥ－ｘＣａｓ９が、同じ部位において０％～２８．５％の
ＣからＴへの編集を示した（図９Ａ）。本発明者らは、ＮＧＧ ＰＡＭを有する部位にお
いて、野生型ＳｐＣａｓ９（５２．５％～６２．４％）と比較して、ＣＢＥ－ｘＣａｓ９
によるＣからＴへの編集活性（２６．７％～３７．２％）の著しい減少も観察した（図９
Ａ）。これらの結果は、ＶＲＱＲおよびＬＲＳＶＱＬのＢＥ３バージョンが、それぞれ、
ｘＣａｓ９より約２倍大きい割合で、ＮＧＡおよびＮＧＴ ＰＡＭを有する部位において
、効果的なＣＢＥであることを実証する。
【0099】
次に、本発明者らは、本発明者らのＰＡＭバリアントのＡＢＥ（７．１０）（Gaudelli
et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471）バージョンを構築して、ヒト細胞に
おけるＡからＧへの変換を媒介するＡＢＥとしてそれらの有効性を決定した。本発明者ら
は、ＡＢＥ－ｘＣａｓ９で観察された０％～１２．５％の編集と比較して、ＮＧＡ ＰＡ
Ｍを有する部位において、ＡＢＥ－ＶＲＱＲによるＡからＧへの強い編集活性（８．０％
～７７．３％）を観察した（図９Ｂ）。同様に、ＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位において
、ＡＢＥ－ＶＲＥＲ（０％～７５．９％）およびＡＢＥ－ＭＳＱＫＥＲ（５．４％～９０
．４％）バリアントは、またもや、ＡからＧへの編集について、ＡＢＥ－ｘＣａｓ９（０
％～６２．３％）より優れていた（図９Ｂ）。本発明者らは、ＮＧＧ ＰＡＭを有する部
位において、野生型ＳｐＣａｓ９（１３．９％～５０．４％）と比較して、ＡＢＥ－ｘＣ
ａｓ９によるＡからＧへの編集の減少（０％～１６．９％）も観察した（図９Ｂ）。本発
明者らの結果は、ＶＲＱＲのＡＢＥ（７．１０）バージョンが、ＮＧＡ ＰＡＭを有する
部位におけるＡからＧへの編集の媒介に効果的であること、ならびにＶＲＥＲおよびＭＳ
ＱＫＥＲのＡＢＥ（７．１０）バージョンが、ＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位において効
果的であることを明らかにする。
et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471）バージョンを構築して、ヒト細胞に
おけるＡからＧへの変換を媒介するＡＢＥとしてそれらの有効性を決定した。本発明者ら
は、ＡＢＥ－ｘＣａｓ９で観察された０％～１２．５％の編集と比較して、ＮＧＡ ＰＡ
Ｍを有する部位において、ＡＢＥ－ＶＲＱＲによるＡからＧへの強い編集活性（８．０％
～７７．３％）を観察した（図９Ｂ）。同様に、ＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位において
、ＡＢＥ－ＶＲＥＲ（０％～７５．９％）およびＡＢＥ－ＭＳＱＫＥＲ（５．４％～９０
．４％）バリアントは、またもや、ＡからＧへの編集について、ＡＢＥ－ｘＣａｓ９（０
％～６２．３％）より優れていた（図９Ｂ）。本発明者らは、ＮＧＧ ＰＡＭを有する部
位において、野生型ＳｐＣａｓ９（１３．９％～５０．４％）と比較して、ＡＢＥ－ｘＣ
ａｓ９によるＡからＧへの編集の減少（０％～１６．９％）も観察した（図９Ｂ）。本発
明者らの結果は、ＶＲＱＲのＡＢＥ（７．１０）バージョンが、ＮＧＡ ＰＡＭを有する
部位におけるＡからＧへの編集の媒介に効果的であること、ならびにＶＲＥＲおよびＭＳ
ＱＫＥＲのＡＢＥ（７．１０）バージョンが、ＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位において効
果的であることを明らかにする。
【0100】
参照文献
【0101】
【表6-1】
【0102】
【表6-2】
【0103】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と関連して記載したが、前述の記載は、説明することを意図す
るものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明は、添付
の特許請求の範囲によって規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点およ
び改変は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と関連して記載したが、前述の記載は、説明することを意図す
るものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明は、添付
の特許請求の範囲によって規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点およ
び改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【0104】
【表7-1】
【0105】
【表7-2】
【0106】
【表7-3】
【0107】
【表8-1】
【0108】
【表8-2】
【0109】
【表8-3】
【0110】
【表9-1】
【0111】
【表9-2】
【0112】
【表9-3】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質であって、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６およびＧ１２１８で変異を有し、
Ｄ１１３５の位置での変異がＭであり、Ｓ１１３６の位置での変異がＱであり、およびＧ１２１８の位置での変異がＫである、前記ＳｐＣａｓ９タンパク質。
Ｄ１１３５の位置での変異がＭであり、Ｓ１１３６の位置での変異がＱであり、およびＧ１２１８の位置での変異がＫである、前記ＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項2】
Ｅ１２１９の位置での変異をさらに含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項3】
Ｅ１２１９の位置での変異がＳまたはＦである、請求項２に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項4】
さらに、以下の変異：
（ｉ）Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３およびＤ９８６からなる群から選ばれる位置での変異；ならびに／または
（ｉｉ）Ｈ８４０もしくはＮ８６３の位置での変異
を含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
（ｉ）Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３およびＤ９８６からなる群から選ばれる位置での変異；ならびに／または
（ｉｉ）Ｈ８４０もしくはＮ８６３の位置での変異
を含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項5】
前記変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎ、および／または
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮもしくはＨ８４０Ｙ
である、請求項４に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
（ｉ）Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎ、および／または
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮもしくはＨ８４０Ｙ
である、請求項４に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項6】
前記タンパク質が、核局在化配列、細胞透過性ペプチド配列および／またはアフィニティタグの１つまたは複数を含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項7】
異種性機能ドメインと融合された請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項8】
前記異種性機能ドメインが、転写活性化ドメインである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｒＴＡ、ＮＦ－κＢ ｐ６５または複合性ＶＰＲ（ＶＰ６４－ｐ６５－ｒＴＡ）である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記異種性機能ドメインが、転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記転写サイレンサーが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記異種性機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記異種性機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記異種性機能ドメインが、塩基エディターである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
前記異種性機能ドメインが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、または（ｉｉ）アデノシンデアミナーゼである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
前記異種性機能ドメインが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、およびｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼドメインである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記異種性機能ドメインが、アデノシンデアミナーゼであり、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子におけるヌクレオチド塩基を編集する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１８に記載の融合タンパク質、および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む、前記方法。
【請求項22】
前記異種性機能ドメインが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、およびｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼドメインである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記異種性機能ドメインが、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）からなる群から選択されるアデノシンデアミナーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
細胞のゲノムを変更する方法であって、請求項１に記載の単離されたタンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを、前記細胞で発現させることを含む、前記方法。
【請求項25】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１に記載のタンパク質、および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む、前記方法。
【請求項26】
Ｒ１３３５の位置での変異をさらに含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項27】
Ｔ１３３７の位置での変異をさらに含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項28】
Ｅ１２１９の位置での変異、Ｒ１３３５の位置での変異、およびＴ１３３７の位置での変異をさらに含む、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項29】
前記Ｅ１２１９の位置での変異がＳまたはＦであり、前記Ｒ１３３５の位置での変異がＥであり、および前記Ｔ１３３７の位置での変異がＲである、請求項２８に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項30】
前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【請求項31】
前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質。
【外国語明細書】