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特開2024-112952肺炎連鎖球菌多糖－タンパク質コンジュゲートの免疫原性の増強
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024112952
(43)【公開日】2024-08-21
(54)【発明の名称】肺炎連鎖球菌多糖－タンパク質コンジュゲートの免疫原性の増強
(51)【国際特許分類】
A61K 39/09 20060101AFI20240814BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240814BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240814BHJP
C07K 1/107 20060101ALI20240814BHJP
C07K 14/34 20060101ALI20240814BHJP
【ＦＩ】
A61K39/09 ZNA
A61P31/04
A61K47/64
C07K1/107
C07K14/34
A61K39/09
【審査請求】有
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024084665
(22)【出願日】2024-05-24
(62)【分割の表示】P 2023000606の分割
【原出願日】2018-02-20
(31)【優先権主張番号】62/463,216
(32)【優先日】2017-02-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/555,444
(32)【優先日】2017-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．プルロニック
３．ＢＲＩＪ
４．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522242018
【氏名又は名称】メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ヘ，ジアン
(72)【発明者】
【氏名】スミス，ウィリアム・ジェー
(72)【発明者】
【氏名】ジョイス，ジョセフ・ジー
(72)【発明者】
【氏名】アビーグナーワードナ，チトラナンダ
(72)【発明者】
【氏名】プージャー，ハリ
(72)【発明者】
【氏名】ランカスター，キャサリン
(72)【発明者】
【氏名】マクネア，ジョン・イー
(72)【発明者】
【氏名】ウィンターズ，マイケル・エー
(72)【発明者】
【氏名】ミュージー，ルイ
(72)【発明者】
【氏名】スキナー，ジュリー・エム
(72)【発明者】
【氏名】ウェン，エミリー
(72)【発明者】
【氏名】マクヒュー，パトリック
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアムズ，ジョン・マイケル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】多糖－タンパク質コンジュゲートを調製する方法を提供する。
【解決手段】還元的アミノ化により肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）肺炎球菌血清型３多糖を酸化剤と反応させて、活性化肺炎球菌血清型３多糖を形成すること、およびｂ）非プロトン性溶媒中で前記活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させて、肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートを形成することを含み、得られたコンジュゲートが、工程ａ）及びｂ）であって、但し水溶液中で活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させる工程に従って調製された肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートに比較して、オプソニン食作用性死滅アッセイおよび電気化学発光免疫原性アッセイで測定した、より高い抗原性を有する、方法とする。
【選択図】図１
【解決手段】還元的アミノ化により肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）肺炎球菌血清型３多糖を酸化剤と反応させて、活性化肺炎球菌血清型３多糖を形成すること、およびｂ）非プロトン性溶媒中で前記活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させて、肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートを形成することを含み、得られたコンジュゲートが、工程ａ）及びｂ）であって、但し水溶液中で活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させる工程に従って調製された肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートに比較して、オプソニン食作用性死滅アッセイおよび電気化学発光免疫原性アッセイで測定した、より高い抗原性を有する、方法とする。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ｃ
、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ
、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１
、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を含む免疫
原性組成物であって、前記多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲ
ーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、免疫原性組成物。
、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ
、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１
、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を含む免疫
原性組成物であって、前記多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲ
ーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、免疫原性組成物。
【請求項2】
肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび１４の１つ以上に由
来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１
に記載の免疫原性組成物。
来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１
に記載の免疫原性組成物。
【請求項3】
肺炎連鎖球菌血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ
、１７Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、
３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担
体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
、１７Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、
３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担
体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
肺炎連鎖球菌血清型３および１８Ｃの１つ以上に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中
で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
肺炎連鎖球菌血清型３に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコン
ジュゲートされる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
ジュゲートされる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
肺炎連鎖球菌血清型１８Ｃに由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質に
コンジュゲートされる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
コンジュゲートされる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
前記コンジュゲーション反応が還元的アミノ化である、請求項１～６のいずれか一項に
記載の免疫原性組成物。
記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
前記非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１～７のい
ずれか一項に記載の免疫原性組成物。
ずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫
原性組成物。
原性組成物。
【請求項10】
ＤＭＳＯ中で調製された前記コンジュゲートが５．０より大きいリシン損失値を有する
、請求項８または９に記載の免疫原性組成物。
、請求項８または９に記載の免疫原性組成物。
【請求項11】
ＤＭＳＯ中で調製された前記コンジュゲートが両端値を含む７．０～１８．０のリシン
損失値を有する、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
損失値を有する、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項12】
担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ
、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆのうちの１つ以上に由来する多
糖を更に含み、前記多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーショ
ン反応が非プロトン性溶媒中で行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫原
性組成物。
、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆのうちの１つ以上に由来する多
糖を更に含み、前記多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーショ
ン反応が非プロトン性溶媒中で行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫原
性組成物。
【請求項13】
前記コンジュゲーション反応が還元的アミノ化である、請求項１２に記載の免疫原性組
成物。
成物。
【請求項14】
前記非プロトン性溶媒がＤＭＳＯである、請求項１２または１３に記載の免疫原性組成
物。
物。
【請求項15】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の
免疫原性組成物。
免疫原性組成物。
【請求項16】
担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ
、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖を含み、前記肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６
Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆに由来する多糖を前記担体タンパク質に
コンジュゲートさせるコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、請求項
１２～１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖を含み、前記肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６
Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆに由来する多糖を前記担体タンパク質に
コンジュゲートさせるコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、請求項
１２～１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項17】
担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ
、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１
４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、
２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４
、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、前記
肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、
８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１
７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ
、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する多
糖を前記担体タンパク質にコンジュゲーションするコンジュゲーション反応が水性溶媒中
で行われる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１
４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、
２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４
、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、前記
肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、
８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１
７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ
、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する多
糖を前記担体タンパク質にコンジュゲーションするコンジュゲーション反応が水性溶媒中
で行われる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項18】
前記血清型の３５～１００％がＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、
かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項１７に記
載の免疫原性組成物。
かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項１７に記
載の免疫原性組成物。
【請求項19】
ＣＲＭ１９７多糖にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、
６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来
する多糖から本質的になり、肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１
９Ｆおよび２３Ｆのコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われ、前記非プロ
トン性溶媒がＤＭＳＯであり、かつ、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、
２２Ｆおよび３３Ｆのコンジュゲーション反応が水性溶媒中で行われ、約０．２％ｗ／ｖ
のＰＳ－２０を更に含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来
する多糖から本質的になり、肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１
９Ｆおよび２３Ｆのコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われ、前記非プロ
トン性溶媒がＤＭＳＯであり、かつ、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、
２２Ｆおよび３３Ｆのコンジュゲーション反応が水性溶媒中で行われ、約０．２％ｗ／ｖ
のＰＳ－２０を更に含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物をヒト対象に投与することを含
む、前記対象において防御的免疫応答を誘導するための方法。
む、前記対象において防御的免疫応答を誘導するための方法。
【請求項21】
前記対象が５０歳以上である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記対象が免疫無防備状態である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンに対する増強された免疫応答を提供す
るための方法であって、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた２つ以上の肺
炎連鎖球菌血清型の第一セットに由来する肺炎球菌莢膜多糖を含む多糖－タンパク質コン
ジュゲートを含む免疫原性組成物を動物対象に投与することを含み、前記第一セットに由
来する前記多糖－タンパク質コンジュゲートの２つ以上が、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）条件下での還元的アミノ化を用いて調製される、方法。
るための方法であって、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた２つ以上の肺
炎連鎖球菌血清型の第一セットに由来する肺炎球菌莢膜多糖を含む多糖－タンパク質コン
ジュゲートを含む免疫原性組成物を動物対象に投与することを含み、前記第一セットに由
来する前記多糖－タンパク質コンジュゲートの２つ以上が、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）条件下での還元的アミノ化を用いて調製される、方法。
【請求項24】
前記免疫原性組成物が、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた２つ以上の
肺炎球菌血清型の第二セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多糖を含む多糖－タンパク質コ
ンジュゲートを更に含み、前記第二セットに由来する前記多糖－タンパク質コンジュゲー
トのうちの２つ以上が、水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、前記第二セッ
トに由来する血清型が、前記第一セットの血清型とは異なる、請求項２３に記載の方法。
肺炎球菌血清型の第二セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多糖を含む多糖－タンパク質コ
ンジュゲートを更に含み、前記第二セットに由来する前記多糖－タンパク質コンジュゲー
トのうちの２つ以上が、水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、前記第二セッ
トに由来する血清型が、前記第一セットの血清型とは異なる、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記肺炎球菌血清型が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、
７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ
、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２
３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８から選
択される、請求項２３または２４に記載の方法。
７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ
、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２
３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８から選
択される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
血清型３または１８Ｃに由来する多糖－タンパク質コンジュゲートが、ＤＭＳＯ条件下
での還元的アミノ化を用いて調製される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法
。
での還元的アミノ化を用いて調製される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項27】
前記肺炎球菌血清型の第一セットに由来する前記多糖－タンパク質コンジュゲートが、
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される、請求項
２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される、請求項
２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖－タン
パク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、血
清型の第二セットに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、
請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
パク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、血
清型の第二セットに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、
請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記免疫原性組成物が、ＣＲＭ１９７多糖にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型
１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２
３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になり、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、
１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖－タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件
下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２
２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、
請求項２８に記載の方法。
１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２
３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になり、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、
１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖－タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件
下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２
２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、
請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記免疫原性組成物における前記血清型の３５～１００％に由来する多糖タンパク質コ
ンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖
タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
ンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖
タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項31】
前記血清型の４５～６０％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下
での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水
性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水
性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項32】
前記血清型の６０～１００％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件
下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが
水性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが
水性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項33】
前記担体タンパク質が、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、ジフ
テリアトキソイド、タンパク質ＤおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される、請求項
２３～３２のいずれか一項に記載の方法。
テリアトキソイド、タンパク質ＤおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される、請求項
２３～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製された前記コンジュゲートが５．０よ
り大きいリシン損失値を有する、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の方法。
り大きいリシン損失値を有する、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製された前記コンジュゲートが両端値を
含む７．０～１８のリシン損失値を有する、請求項３５に記載の方法。
含む７．０～１８のリシン損失値を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記増強された免疫応答が幾何平均力価によって測定される、請求項２３～３６のいず
れか一項に記載の方法。
れか一項に記載の方法。
【請求項38】
肺炎球菌血清型に対する前記増強された免疫応答が、水性条件下で調製された同じ肺炎
球菌血清型に由来する多糖－タンパク質コンジュゲートと比較して１０％以上大きい、請
求項２３～３７のいずれか一項に記載の方法。
球菌血清型に由来する多糖－タンパク質コンジュゲートと比較して１０％以上大きい、請
求項２３～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記動物対象が、５０歳以上のヒト対象である、請求項２３～３８のいずれか一項に記
載の方法。
載の方法。
【請求項40】
動物被検体が２歳以下のヒト対象である、請求項２３～３８のいずれか一項記載の方法
。
。
【請求項41】
前記動物対象が免疫無防備状態のヒトである、請求項２３～３８のいずれか一項に記載
の方法。
の方法。
【請求項42】
前記増強された免疫応答が、前記第一セットに由来する１つ以上の多糖－タンパク質コ
ンジュゲートが水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製される免疫原性組成物を与え
られる対照動物に対して測定される、請求項２３に記載の方法。
ンジュゲートが水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製される免疫原性組成物を与え
られる対照動物に対して測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項43】
前記対照動物がマウスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記対照動物がヒトである、請求項４２に記載の方法。
【請求項45】
還元的アミノ化により肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートを調製する方法であっ
て、
ａ）血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２
３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌多糖をある量の酸化剤と反応させて、０．
０５～０．２２の活性化レベルを有する活性化多糖を形成し、
ｂ）非プロトン性溶媒中で前記活性化多糖を担体タンパク質と反応させて多糖－タンパ
ク質コンジュゲートを形成すること
を含み、
得られた多糖－タンパク質コンジュゲートが両端値を含む７．０～１８．０の範囲内の
リシン損失値を有する、方法。
て、
ａ）血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２
３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌多糖をある量の酸化剤と反応させて、０．
０５～０．２２の活性化レベルを有する活性化多糖を形成し、
ｂ）非プロトン性溶媒中で前記活性化多糖を担体タンパク質と反応させて多糖－タンパ
ク質コンジュゲートを形成すること
を含み、
得られた多糖－タンパク質コンジュゲートが両端値を含む７．０～１８．０の範囲内の
リシン損失値を有する、方法。
【請求項46】
前記活性化レベルが０．０９～０．２２である、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
工程ｂ）における前記反応が還元剤の存在下で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ１９７
からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項49】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
活性化多糖中のアルデヒドレベルを決定するための方法であって、
ａ）完了するまで誘導体化剤と反応させることによって前記活性化多糖を誘導体化して
誘導体化多糖を形成する工程、
ｂ）高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより前記誘導体化多糖を単離する工程、お
よび
ｃ）前記誘導体化多糖のＵＶ吸光度を定量する工程
を含み、
前記誘導体化剤が、チオセミカルバジド、チオセミカルバジド構造類似体、ヒドラジド
、ヒドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または
芳香族アミンからなる群から選択される、方法。
ａ）完了するまで誘導体化剤と反応させることによって前記活性化多糖を誘導体化して
誘導体化多糖を形成する工程、
ｂ）高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより前記誘導体化多糖を単離する工程、お
よび
ｃ）前記誘導体化多糖のＵＶ吸光度を定量する工程
を含み、
前記誘導体化剤が、チオセミカルバジド、チオセミカルバジド構造類似体、ヒドラジド
、ヒドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または
芳香族アミンからなる群から選択される、方法。
【請求項51】
前記誘導体化剤がチオセミカルバジドである、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
工程ｃ）における前記定量化が、誘導体標準との比較によるものである、請求項５０に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項53】
工程ｃ）における前記定量化が、所定の吸光係数に対する測定によるものである、請求
項５０に記載の方法。
項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような非プロトン性溶媒中で還元的ア
ミノ化を用いてＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた少なくとも１つの肺炎連鎖球菌（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を含む免疫原性組成物を提供す
る。本発明はまた、肺炎連鎖球菌莢膜に由来する１つ以上の多糖がＤＭＳＯなどの非プロ
トン性溶媒中で行われる還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせた
１つ以上の多糖－タンパク質コンジュゲートを有する免疫原性組成物の免疫原性を増強す
るための方法を提供する。
ミノ化を用いてＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた少なくとも１つの肺炎連鎖球菌（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を含む免疫原性組成物を提供す
る。本発明はまた、肺炎連鎖球菌莢膜に由来する１つ以上の多糖がＤＭＳＯなどの非プロ
トン性溶媒中で行われる還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせた
１つ以上の多糖－タンパク質コンジュゲートを有する免疫原性組成物の免疫原性を増強す
るための方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
肺炎連鎖球菌はグラム陽性菌で、乳児や小児の侵襲性細菌性疾患（肺炎、菌血症、髄膜
炎、中耳炎など）の最も一般的な原因である。肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学
的に結合した多糖で被包されている。肺炎球菌には９０を超える既知の血清型があり、莢
膜は、細菌の内表面を補体から保護するだけでなく、それ自体免疫原性も低いので、肺炎
球菌の主要な病原性決定因子である。多糖はＴ細胞非依存性抗原であるので、Ｔ細胞と相
互作用するようにＭＨＣ分子上で処理または提示されることはできない。しかしながらそ
れらは、Ｂ細胞上の表面受容体の架橋を伴う他のメカニズムを通して免疫系を刺激するこ
とができる。
炎、中耳炎など）の最も一般的な原因である。肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学
的に結合した多糖で被包されている。肺炎球菌には９０を超える既知の血清型があり、莢
膜は、細菌の内表面を補体から保護するだけでなく、それ自体免疫原性も低いので、肺炎
球菌の主要な病原性決定因子である。多糖はＴ細胞非依存性抗原であるので、Ｔ細胞と相
互作用するようにＭＨＣ分子上で処理または提示されることはできない。しかしながらそ
れらは、Ｂ細胞上の表面受容体の架橋を伴う他のメカニズムを通して免疫系を刺激するこ
とができる。
【0003】
２歳未満の子供は、ほとんどの多糖ワクチンに対して免疫応答を起こさないので、タン
パク質担体への化学的コンジュゲーションによって多糖を免疫原性にすることが必要であ
った。多糖（Ｔ細胞非依存性抗原）をタンパク質（Ｔ細胞依存性抗原）にカップリングす
ることにより、アイソタイプ転換、親和性成熟および記憶誘導を含むＴ細胞依存性の特性
が多糖に付与される。
パク質担体への化学的コンジュゲーションによって多糖を免疫原性にすることが必要であ
った。多糖（Ｔ細胞非依存性抗原）をタンパク質（Ｔ細胞依存性抗原）にカップリングす
ることにより、アイソタイプ転換、親和性成熟および記憶誘導を含むＴ細胞依存性の特性
が多糖に付与される。
【0004】
多くのコンジュゲーション反応が、多糖をタンパク質に共有結合させるために使用され
てきた。より一般的に用いられている方法には以下の３つの方法が含まれる。１）還元的
アミノ化：反応の一方の成分上のアルデヒドまたはケトン基が他方の成分上のアミノまた
はヒドラジド基と反応し、続いて、形成されたＣ＝Ｎ二重結合が還元剤によりＣ－Ｎ単結
合に還元される。２）シアニル化コンジュゲーション：多糖が臭化シアン（ＣＮＢｒ）ま
たは１－シアノ－４－ジメチルアンモニウムピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤ
ＡＰ）のいずれかによって活性化されて、ヒドロキシル基にシアネート基を導入し、これ
がタンパク質成分の添加により、アミノまたはヒドラジド基との共有結合を形成する。３
）カルボジイミド反応：カルボジイミドがコンジュゲーション反応の一方の成分上のカル
ボキシル基を活性化させ、活性化したカルボニル基が他方の成分上のアミノまたはヒドラ
ジド基と反応する。これらの反応はまた、コンジュゲーション反応の前にコンジュゲート
の成分を活性化するためにもしばしば用いられる。
てきた。より一般的に用いられている方法には以下の３つの方法が含まれる。１）還元的
アミノ化：反応の一方の成分上のアルデヒドまたはケトン基が他方の成分上のアミノまた
はヒドラジド基と反応し、続いて、形成されたＣ＝Ｎ二重結合が還元剤によりＣ－Ｎ単結
合に還元される。２）シアニル化コンジュゲーション：多糖が臭化シアン（ＣＮＢｒ）ま
たは１－シアノ－４－ジメチルアンモニウムピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤ
ＡＰ）のいずれかによって活性化されて、ヒドロキシル基にシアネート基を導入し、これ
がタンパク質成分の添加により、アミノまたはヒドラジド基との共有結合を形成する。３
）カルボジイミド反応：カルボジイミドがコンジュゲーション反応の一方の成分上のカル
ボキシル基を活性化させ、活性化したカルボニル基が他方の成分上のアミノまたはヒドラ
ジド基と反応する。これらの反応はまた、コンジュゲーション反応の前にコンジュゲート
の成分を活性化するためにもしばしば用いられる。
【0005】
還元的アミノ化は、肺炎連鎖球菌多糖をコンジュゲートさせるために利用されてきた。
例えば、米国特許第８，１９２，７４６号、米国特許出願公開第２０１７００２１００６
号、国際公開第２０１１／１１０３８１号および国際公開第２０１５／１１０９４１号を
参照のこと。還元的アミノ化は、以下の２つの工程を含む：（１）抗原の酸化、および（
２）当該抗原と担体タンパク質の還元によるコンジュゲートの形成。還元工程は水性溶媒
またはＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中で行われ得る。例えば、国際公開第２０１６
／１１３６４４号を参照のこと。
例えば、米国特許第８，１９２，７４６号、米国特許出願公開第２０１７００２１００６
号、国際公開第２０１１／１１０３８１号および国際公開第２０１５／１１０９４１号を
参照のこと。還元的アミノ化は、以下の２つの工程を含む：（１）抗原の酸化、および（
２）当該抗原と担体タンパク質の還元によるコンジュゲートの形成。還元工程は水性溶媒
またはＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中で行われ得る。例えば、国際公開第２０１６
／１１３６４４号を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許第８，１９２，７４６号
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１７００２１００６号
【特許文献3】国際公開第２０１１／１１０３８１号
【特許文献4】国際公開第２０１５／１１０９４１号
【特許文献5】国際公開第２０１６／１１３６４４号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４
、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５
Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２
８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖
を含む免疫原性組成物であって、該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせるコン
ジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、免疫原性組成物を提供する。一実
施形態において、同一の血清型を有する組成物に関して、非プロトン性溶媒中で調製され
た１つ以上の血清型は、水性条件下で調製された同じ１つ以上の血清型と比較したときに
免疫原性が高い。
、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５
Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２
８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖
を含む免疫原性組成物であって、該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせるコン
ジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、免疫原性組成物を提供する。一実
施形態において、同一の血清型を有する組成物に関して、非プロトン性溶媒中で調製され
た１つ以上の血清型は、水性条件下で調製された同じ１つ以上の血清型と比較したときに
免疫原性が高い。
【0008】
本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４
、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５
Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２
８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上から調製された
多糖タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、該多糖タンパク質コンジ
ュゲートが、非プロトン性溶媒中で該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせる工
程を含むプロセスによって製造される、免疫原性組成物を提供する。
、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５
Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２
８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上から調製された
多糖タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、該多糖タンパク質コンジ
ュゲートが、非プロトン性溶媒中で該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせる工
程を含むプロセスによって製造される、免疫原性組成物を提供する。
【0009】
本発明はまた、肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８
、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０
、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ
、３５Ｆまたは３８に由来する多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせる方法であっ
て、非プロトン性溶媒中で該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせる工程を含む
方法を提供する。
、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０
、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ
、３５Ｆまたは３８に由来する多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせる方法であっ
て、非プロトン性溶媒中で該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせる工程を含む
方法を提供する。
【0010】
本発明はまた、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３
、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、
１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７
、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する１つ以上の多糖を
含む免疫原性組成物を用いて被検体を処置する方法であって、該多糖が非プロトン性溶媒
中で該担体タンパク質にコンジュゲートされる、方法も提供する。
、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、
１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７
、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する１つ以上の多糖を
含む免疫原性組成物を用いて被検体を処置する方法であって、該多糖が非プロトン性溶媒
中で該担体タンパク質にコンジュゲートされる、方法も提供する。
【0011】
特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ
および１４の１つ以上に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジ
ュゲートされる。特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、
７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３
Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１
つ以上に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる
。
および１４の１つ以上に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジ
ュゲートされる。特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、
７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３
Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１
つ以上に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる
。
【0012】
特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌血清型３および１８Ｃのうちの１つ以上に由来
する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形
態の１つの態様において、肺炎連鎖球菌血清型３に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中
で担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形態の１つの態様において、肺炎連
鎖球菌血清型１８Ｃに由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュ
ゲートされる。
する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形
態の１つの態様において、肺炎連鎖球菌血清型３に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中
で担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形態の１つの態様において、肺炎連
鎖球菌血清型１８Ｃに由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュ
ゲートされる。
【0013】
特定の実施形態において、多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせるために使用さ
れるコンジュゲーション反応は還元的アミノ化である。
れるコンジュゲーション反応は還元的アミノ化である。
【0014】
特定の実施形態において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。
【0015】
特定の実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【0016】
特定の実施形態において、ＤＭＳＯ中で調製されたコンジュゲートは、５．０より大き
いリシン損失値を有する。１つの態様において、ＤＭＳＯ中で調製されたコンジュゲート
は、両端値を含む７．０～１８．０のリシン損失値を有する。
いリシン損失値を有する。１つの態様において、ＤＭＳＯ中で調製されたコンジュゲート
は、両端値を含む７．０～１８．０のリシン損失値を有する。
【0017】
特定の実施形態において、免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた
肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３
Ｆおよび３３Ｆのうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、該多糖を担体タンパク質に
コンジュゲートさせるコンジュゲーション反応は、非プロトン性溶媒中で行われる。この
実施形態の特定の態様において、コンジュゲーション反応は還元的アミノ化である。特定
の態様において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。特定の態様において、担体タンパ
ク質はＣＲＭ１９７である。１つの態様において、免疫原性組成物は、担体タンパク質に
コンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆお
よび２３Ｆに由来する多糖を含み、該肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１
９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆに由来する多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせるコ
ンジュゲーション反応は、非プロトン性溶媒中で行われる。特定の態様において、多糖は
肺炎連鎖球菌血清型１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆ由来である。
肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３
Ｆおよび３３Ｆのうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、該多糖を担体タンパク質に
コンジュゲートさせるコンジュゲーション反応は、非プロトン性溶媒中で行われる。この
実施形態の特定の態様において、コンジュゲーション反応は還元的アミノ化である。特定
の態様において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。特定の態様において、担体タンパ
ク質はＣＲＭ１９７である。１つの態様において、免疫原性組成物は、担体タンパク質に
コンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆお
よび２３Ｆに由来する多糖を含み、該肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１
９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆに由来する多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせるコ
ンジュゲーション反応は、非プロトン性溶媒中で行われる。特定の態様において、多糖は
肺炎連鎖球菌血清型１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆ由来である。
【0018】
特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲー
トさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ
、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１
６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ
、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび
３８のうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、該肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４
、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、
１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２
０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３
３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する多糖を該担体タンパク質にコ
ンジュゲートさせるコンジュゲーション反応は、水性溶媒中で行われる。１つの態様にお
いて、免疫原性組成物における血清型の３５～１００％はＤＭＳＯ条件下での還元的アミ
ノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性条件下で調製
される。
トさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ
、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１
６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ
、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび
３８のうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、該肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４
、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、
１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２
０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３
３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する多糖を該担体タンパク質にコ
ンジュゲートさせるコンジュゲーション反応は、水性溶媒中で行われる。１つの態様にお
いて、免疫原性組成物における血清型の３５～１００％はＤＭＳＯ条件下での還元的アミ
ノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性条件下で調製
される。
【0019】
１つの特定実施形態において、本発明は、ＣＲＭ１９７多糖にコンジュゲートさせた肺
炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１
９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になる免疫原性組成物であ
って、該肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆの
コンジュゲーション反応はＤＭＳＯ条件下で行われ、かつ、該肺炎連鎖球菌血清型１、３
、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆのコンジュゲーション反応は水性溶媒中で行
われ、約０．２％ｗ／ｖのＰＳ－２０を更に含んでいてもよい免疫原性組成物を提供する
。
炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１
９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になる免疫原性組成物であ
って、該肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆの
コンジュゲーション反応はＤＭＳＯ条件下で行われ、かつ、該肺炎連鎖球菌血清型１、３
、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆのコンジュゲーション反応は水性溶媒中で行
われ、約０．２％ｗ／ｖのＰＳ－２０を更に含んでいてもよい免疫原性組成物を提供する
。
【0020】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物のいずれかを投与することを含む、ヒト被検体
において防御的免疫応答を誘導するための方法を提供する。特定の実施形態において、被
検体は、５０歳以上および／または免疫無防備状態である。特定の実施形態において、被
検体は２歳以下である。特定の実施形態において、被検体は免疫無防備状態である。
において防御的免疫応答を誘導するための方法を提供する。特定の実施形態において、被
検体は、５０歳以上および／または免疫無防備状態である。特定の実施形態において、被
検体は２歳以下である。特定の実施形態において、被検体は免疫無防備状態である。
【0021】
本発明はまた、肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）タンパク質コンジュゲートワクチンに対する増
強された免疫応答を提供するための方法であって、１つ以上の担体タンパク質にコンジュ
ゲートさせた２つ以上の肺炎連鎖球菌血清型の第一セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多
糖を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を動物被検体に投与する
ことを含み、該第一セットに由来する該多糖－タンパク質コンジュゲートの２つ以上が、
ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製される、方法を提供する。一実施形態に
おいて、前記増強された免疫応答は、第一セットに由来する２つ以上の多糖－タンパク質
コンジュゲートのうちの１つ以上が水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製される免
疫原性組成物を与えられる対照動物に対するものである。一実施形態において、対照動物
はマウスである。別の実施形態において、対照動物はヒトである。特定の実施形態におい
て、本方法は、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎球菌血清型の第二
セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多糖を含む更なる多糖－タンパク質コンジュゲートを
含む肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用するものであり、該多糖－タ
ンパク質コンジュゲートは水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、第二セット
に由来する血清型は第一セットの血清型とは異なる。
強された免疫応答を提供するための方法であって、１つ以上の担体タンパク質にコンジュ
ゲートさせた２つ以上の肺炎連鎖球菌血清型の第一セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多
糖を含む多糖－タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を動物被検体に投与する
ことを含み、該第一セットに由来する該多糖－タンパク質コンジュゲートの２つ以上が、
ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製される、方法を提供する。一実施形態に
おいて、前記増強された免疫応答は、第一セットに由来する２つ以上の多糖－タンパク質
コンジュゲートのうちの１つ以上が水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製される免
疫原性組成物を与えられる対照動物に対するものである。一実施形態において、対照動物
はマウスである。別の実施形態において、対照動物はヒトである。特定の実施形態におい
て、本方法は、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎球菌血清型の第二
セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多糖を含む更なる多糖－タンパク質コンジュゲートを
含む肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用するものであり、該多糖－タ
ンパク質コンジュゲートは水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、第二セット
に由来する血清型は第一セットの血清型とは異なる。
【0022】
特定の実施形態において、本方法は、肺炎球菌血清型が血清型１、２、３、４、５、６
Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、
１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１
、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３３Ｆ、３４、３
５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８から選択される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲート
ワクチンを使用する。
Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、
１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１
、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３３Ｆ、３４、３
５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８から選択される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲート
ワクチンを使用する。
【0023】
特定の実施形態において、本方法は、血清型３または１８Ｃに由来する多糖－タンパク
質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製される肺炎球菌多糖
タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。
質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製される肺炎球菌多糖
タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。
【0024】
特定の実施形態において、本方法は、肺炎球菌血清型の第一セットに由来する多糖－タ
ンパク質コンジュゲートが血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３
Ｆから選択される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。
ンパク質コンジュゲートが血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３
Ｆから選択される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。
【0025】
特定の実施形態において、本方法は、肺炎球菌血清型の第一セットに由来する多糖－タ
ンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製された血清型
６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含み、血清型の第二セットに
由来する多糖－タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タンパ
ク質コンジュゲートワクチンを使用する。
ンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製された血清型
６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含み、血清型の第二セットに
由来する多糖－タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タンパ
ク質コンジュゲートワクチンを使用する。
【0026】
１つの特定実施形態において、本方法は、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、
１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖－タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還
元的アミノ化を用いて調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３
Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タン
パク質コンジュゲートワクチンを使用する。
１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖－タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還
元的アミノ化を用いて調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３
Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タン
パク質コンジュゲートワクチンを使用する。
【0027】
特定の実施形態において、本方法は、血清型の３５～１００％に由来する多糖タンパク
質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの
多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タンパク質コンジ
ュゲートワクチンを使用する。１つの態様において、血清型の４５～８０％に由来する多
糖タンパク質コンジュゲートはＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、か
つ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性条件下で調製される。別の態様において
、血清型の７５～１００％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートはＤＭＳＯ条件下で
の還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性
条件下で調製される。
質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの
多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タンパク質コンジ
ュゲートワクチンを使用する。１つの態様において、血清型の４５～８０％に由来する多
糖タンパク質コンジュゲートはＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、か
つ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性条件下で調製される。別の態様において
、血清型の７５～１００％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートはＤＭＳＯ条件下で
の還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性
条件下で調製される。
【0028】
特定の実施形態において、本方法は、担体タンパク質が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、
ジフテリアトキソイド、タンパク質ＤおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される肺炎
球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。１つの態様において、担体タン
パク質はＣＲＭ１９７である。
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、
ジフテリアトキソイド、タンパク質ＤおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される肺炎
球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。１つの態様において、担体タン
パク質はＣＲＭ１９７である。
【0029】
特定の実施形態において、本方法は、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製
されたコンジュゲートが、５．０より大きいタンパク質リシン損失値によって測定される
場合、より高い割合の形成されたグリコペプチド結合を有する肺炎球菌多糖タンパク質コ
ンジュゲートワクチンを使用する。この実施形態の１つの態様において、ＤＭＳＯ条件下
での還元的アミノ化を用いて調製されたコンジュゲートは、両端値を含む７．０～１８の
リシン損失値を有する。別の態様において、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて
調製されたコンジュゲートは、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５または
１０．０より大きいリシン損失値を有する。
されたコンジュゲートが、５．０より大きいタンパク質リシン損失値によって測定される
場合、より高い割合の形成されたグリコペプチド結合を有する肺炎球菌多糖タンパク質コ
ンジュゲートワクチンを使用する。この実施形態の１つの態様において、ＤＭＳＯ条件下
での還元的アミノ化を用いて調製されたコンジュゲートは、両端値を含む７．０～１８の
リシン損失値を有する。別の態様において、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて
調製されたコンジュゲートは、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５または
１０．０より大きいリシン損失値を有する。
【0030】
別の特定実施形態において、本発明は、ＣＲＭ１９７多糖にコンジュゲートさせた肺炎
球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、
２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になる肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）タ
ンパク質コンジュゲートワクチンに対する増強された免疫応答を提供するための方法であ
って、肺炎球菌血清型の第一セットおよび同第二セットに由来する多糖－タンパク質コン
ジュゲートを含む免疫原性組成物をヒト被検体に投与することを含み、血清型の第一セッ
トが、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆからなり、かつ、ＤＭＳ
Ｏ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、血清型の第二セットが、１、３、４、５
、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆからなり、かつ、水性条件下で調製される、方法を提
供する。
球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、
２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になる肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）タ
ンパク質コンジュゲートワクチンに対する増強された免疫応答を提供するための方法であ
って、肺炎球菌血清型の第一セットおよび同第二セットに由来する多糖－タンパク質コン
ジュゲートを含む免疫原性組成物をヒト被検体に投与することを含み、血清型の第一セッ
トが、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆからなり、かつ、ＤＭＳ
Ｏ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、血清型の第二セットが、１、３、４、５
、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆからなり、かつ、水性条件下で調製される、方法を提
供する。
【0031】
特定の実施形態において、本発明の方法によって産生された免疫原性組成物をワクチン
接種された動物における増強された免疫応答は、血清ＩｇＧまたはオプソニン食作用性抗
体の幾何平均力価によって測定される。１つの態様において、肺炎球菌血清型に対する増
強された免疫応答は、水性条件下で調製された同じ肺炎球菌血清型に由来する多糖－タン
パク質コンジュゲートと比較して１０％以上である。一実施形態において、動物はマウス
である。別の実施形態において、動物はヒトである。
接種された動物における増強された免疫応答は、血清ＩｇＧまたはオプソニン食作用性抗
体の幾何平均力価によって測定される。１つの態様において、肺炎球菌血清型に対する増
強された免疫応答は、水性条件下で調製された同じ肺炎球菌血清型に由来する多糖－タン
パク質コンジュゲートと比較して１０％以上である。一実施形態において、動物はマウス
である。別の実施形態において、動物はヒトである。
【0032】
特定の実施形態において、本方法は、５０歳以上のヒト被検体に対して用いられる。特
定の実施形態において、本方法は、２歳以下のヒト被検体に対して用いられる。特定の実
施形態において、本方法は、免疫無防備状態のヒト被検体に対して用いられる。
定の実施形態において、本方法は、２歳以下のヒト被検体に対して用いられる。特定の実
施形態において、本方法は、免疫無防備状態のヒト被検体に対して用いられる。
【0033】
本発明はまた、還元的アミノ化により肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートを調製
する方法であって、
ａ）血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２
３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌多糖をある量の酸化剤（例えば過ヨウ素酸
塩）と反応させて、０．０５～０．２２の活性化レベルを有する活性化多糖を形成し、
ｂ）任意選択的に還元剤の存在下で、非プロトン性溶媒中で活性化多糖を担体タンパク
質と反応させて多糖－タンパク質コンジュゲートを形成することを含み、
コンジュゲートが両端値を含む７．０～１８．０の範囲内のリシン損失値を有する、方
法を提供する。
する方法であって、
ａ）血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２
３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌多糖をある量の酸化剤（例えば過ヨウ素酸
塩）と反応させて、０．０５～０．２２の活性化レベルを有する活性化多糖を形成し、
ｂ）任意選択的に還元剤の存在下で、非プロトン性溶媒中で活性化多糖を担体タンパク
質と反応させて多糖－タンパク質コンジュゲートを形成することを含み、
コンジュゲートが両端値を含む７．０～１８．０の範囲内のリシン損失値を有する、方
法を提供する。
【0034】
特定の実施形態において、活性化レベルは０．０９～０．２２である。
【0035】
特定の実施形態において、酸化剤は過ヨウ素酸塩である。
【0036】
特定の実施形態において、活性化レベルは、チオセミカルバジドを用いて多糖上のアル
デヒドを誘導体化することによって測定される。
デヒドを誘導体化することによって測定される。
【0037】
特定の実施形態において、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどのシアノ水素化
ホウ素塩である。
ホウ素塩である。
【0038】
特定の実施形態において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイ
ドおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される。一実施形態において、担体タンパク質
はＣＲＭ１９７である。
ドおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される。一実施形態において、担体タンパク質
はＣＲＭ１９７である。
【0039】
本発明はまた、活性化多糖中のアルデヒドレベル（すなわち、過ヨウ素酸塩活性化レベ
ル）を決定するための定量的方法であって、
ａ）完了する（すなわち、反応プラトー）まで誘導体化剤と反応させることによって活
性化多糖を誘導体化して誘導体化多糖を形成する工程；
ｂ）（未反応誘導体化剤およびマトリックス成分を除去するために）高性能サイズ排除
クロマトグラフィーにより誘導体化多糖を単離する工程；および
ｃ）誘導体化多糖のＵＶ吸光度を定量する工程
を含む方法を提供する。
ル）を決定するための定量的方法であって、
ａ）完了する（すなわち、反応プラトー）まで誘導体化剤と反応させることによって活
性化多糖を誘導体化して誘導体化多糖を形成する工程；
ｂ）（未反応誘導体化剤およびマトリックス成分を除去するために）高性能サイズ排除
クロマトグラフィーにより誘導体化多糖を単離する工程；および
ｃ）誘導体化多糖のＵＶ吸光度を定量する工程
を含む方法を提供する。
【0040】
誘導体化剤は、チオセミカルバジド、チオセミカルバジド構造類似体、ヒドラジド、ヒ
ドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または芳香
族アミンからなる群から選択することができる。
ドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または芳香
族アミンからなる群から選択することができる。
【0041】
一実施形態において、工程ｃ）における定量化は、誘導体標準との比較による。一実施
形態において、工程ｃ）における定量化は、所定の吸光係数に対する測定によるものであ
る。
形態において、工程ｃ）における定量化は、所定の吸光係数に対する測定によるものであ
る。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】トリプシンペプチドマッピングにより決定された、ＣＲＭ１９７上の異なるリシン部位でのコンジュゲーションの程度。水溶液中またはＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって調製された血清型１９ＡＰｓ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートをトリプシンによって消化し、ＬＣ－ＵＶ－ＭＳによって分析した。ＣＲＭ１９７対照試料と比較したペプチドシグナルの損失をコンジュゲーション部位に対してプロットした。
【図2】水溶液中またはＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって調製された血清型３Ｐｓ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを比較する、マウス試験群から得られた電気化学発光（ＥＣＬ）免疫原性の結果。リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を配合したコンジュゲート。ワクチン接種前（Ｐｒｅ）および３回目の投与後（ＰＤ３）の結果が示されている。ＡＰＡのみの対照についての結果も示されている。
【図3】水溶液中またはＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって調製された血清型３Ｐｓ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを比較する、マウス試験群から得られた３回目の投与後の食作用活性（ＯＰＡ）の結果。ワクチン接種前（免疫前）およびＡＰＡのみの対照についてのＯＰＡ結果も示す。
【発明を実施するための形態】
【0043】
本発明は、少なくとも１つの肺炎球菌血清型に由来するコンジュゲートがＤＭＳＯなど
の非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された肺炎球菌多糖－タンパク質
コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、多糖－タンパク質コンジュ
ゲートの還元的アミノ化の間に溶媒として使用されるＤＭＳＯが、水性条件下で調製され
た同じコンジュゲートと比較して、それらの血清型に関して予想外に優れた安定性および
増強された免疫原性をもたらすという発見に部分的に基づく。本発明は、担体タンパク質
の表面上にあるリシン残基の直接消費によって多糖のタンパク質への共有会合を増強する
上でのＤＭＳＯ溶媒の利点に関する。試験した大半の血清型について、水性バッファー中
よりも非プロトン性溶媒中でのコンジュゲーションによる方が、より低い多糖活性化レベ
ル（０．０５～０．２２）で、良好な免疫原性（≧７．０）を与える「リシン損失」を達
成することができた。共有会合の増加は、多糖タンパク質コンジュゲートの安定性を増加
させ、ＤＭＳＯ中でコンジュゲートさせたそれら特定の多糖抗原に対する免疫応答を増強
する上で直接的な利益を有する。
の非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された肺炎球菌多糖－タンパク質
コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、多糖－タンパク質コンジュ
ゲートの還元的アミノ化の間に溶媒として使用されるＤＭＳＯが、水性条件下で調製され
た同じコンジュゲートと比較して、それらの血清型に関して予想外に優れた安定性および
増強された免疫原性をもたらすという発見に部分的に基づく。本発明は、担体タンパク質
の表面上にあるリシン残基の直接消費によって多糖のタンパク質への共有会合を増強する
上でのＤＭＳＯ溶媒の利点に関する。試験した大半の血清型について、水性バッファー中
よりも非プロトン性溶媒中でのコンジュゲーションによる方が、より低い多糖活性化レベ
ル（０．０５～０．２２）で、良好な免疫原性（≧７．０）を与える「リシン損失」を達
成することができた。共有会合の増加は、多糖タンパク質コンジュゲートの安定性を増加
させ、ＤＭＳＯ中でコンジュゲートさせたそれら特定の多糖抗原に対する免疫応答を増強
する上で直接的な利益を有する。
【0044】
いかなる理論にも縛られることなく、ＤＭＳＯ中で調製された複合糖質で観察される免
疫原性増強のための１つの可能なメカニズムとして、担体タンパク質表面上にあるリシン
残基と炭水化物（莢膜多糖）との結合数が増えると、タンパク質と多糖との結合点が増え
、それによって安定性を付与すると共に、ペプチド炭水化物結合の破壊または化学的解重
合を阻止することが挙げられる。例えば、Ｈｓｉｅｈ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ＣＲＭ１９７ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ｆ，Ｃｏｒｂｅｌ Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｅ（ｅｄｓ）：Ｐ
ｈｙｓｉｃｏ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋ
ａｒｇｅｒ，２０００，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．９３－１０４を参照のこと。ＤＭＳＯ溶
媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖－タンパク質結合が増えることの更なる
利点は、ペプチド－炭水化物のＴ細胞への提示が成功する可能性が増えることであり得る
。ヒト集団における遺伝的可変性が炭水化物抗原にコンジュゲートさせた特定のペプチド
配列との会合またはその使用（ｌｏａｄｉｎｇ）の感受性や能力の変動をもたらすにこと
に起因して、担体タンパク質上の結合点が増えることで、ＡＰＣ表面での抗原提示が成功
する可能性が高まり、別種のＴ細胞非依存性抗原に対するＴ細胞依存性応答が可能となる
ことが分かる。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーションによって観察される免疫原性増強
のもう１つの可能なメカニズムは、有機溶媒中でのＣＲＭ１９７変性に起因するものであ
り得る。この変性により、更なるリシンが多糖結合に供されて、ＡＰＣ表面でのグリコペ
プチド提示の可能性が高くなり、異なるペプチドエピトープに対するＴ細胞依存性応答が
得られる。Ａｖｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７
：１６０２－１６１０を参照のこと。
疫原性増強のための１つの可能なメカニズムとして、担体タンパク質表面上にあるリシン
残基と炭水化物（莢膜多糖）との結合数が増えると、タンパク質と多糖との結合点が増え
、それによって安定性を付与すると共に、ペプチド炭水化物結合の破壊または化学的解重
合を阻止することが挙げられる。例えば、Ｈｓｉｅｈ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ＣＲＭ１９７ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ｆ，Ｃｏｒｂｅｌ Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｅ（ｅｄｓ）：Ｐ
ｈｙｓｉｃｏ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋ
ａｒｇｅｒ，２０００，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．９３－１０４を参照のこと。ＤＭＳＯ溶
媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖－タンパク質結合が増えることの更なる
利点は、ペプチド－炭水化物のＴ細胞への提示が成功する可能性が増えることであり得る
。ヒト集団における遺伝的可変性が炭水化物抗原にコンジュゲートさせた特定のペプチド
配列との会合またはその使用（ｌｏａｄｉｎｇ）の感受性や能力の変動をもたらすにこと
に起因して、担体タンパク質上の結合点が増えることで、ＡＰＣ表面での抗原提示が成功
する可能性が高まり、別種のＴ細胞非依存性抗原に対するＴ細胞依存性応答が可能となる
ことが分かる。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーションによって観察される免疫原性増強
のもう１つの可能なメカニズムは、有機溶媒中でのＣＲＭ１９７変性に起因するものであ
り得る。この変性により、更なるリシンが多糖結合に供されて、ＡＰＣ表面でのグリコペ
プチド提示の可能性が高くなり、異なるペプチドエピトープに対するＴ細胞依存性応答が
得られる。Ａｖｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７
：１６０２－１６１０を参照のこと。
【0045】
コンジュゲート中に変性ＣＲＭ１９７を生成する有機溶媒中でのコンジュゲーションの
更に別の利点は、天然のＣＲＭ１９７エピトープに対する抗体の免疫学的干渉の減少であ
り得る。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖－タンパク質結合増
加の更なる利点は、より大きなサイズの多糖－タンパク質コンジュゲートが形成されて、
免疫原性の増強をもたらすことであり得る。本発明の組成物は、ヒト応答を誘導する上で
有意な利点を提供すると考えられている。
更に別の利点は、天然のＣＲＭ１９７エピトープに対する抗体の免疫学的干渉の減少であ
り得る。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖－タンパク質結合増
加の更なる利点は、より大きなサイズの多糖－タンパク質コンジュゲートが形成されて、
免疫原性の増強をもたらすことであり得る。本発明の組成物は、ヒト応答を誘導する上で
有意な利点を提供すると考えられている。
【0046】
実施例５に示すように、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いて肺炎連鎖球菌血清型３
から調製された多糖タンパク質コンジュゲートは、（水中での還元的アミノ化を用いて調
製された同じコンジュゲートと比較して）食作用活性（ＯＰＡ）によって測定されるマウ
スモデルでの免疫原性の増加を示した。更に、実施例６に示すように、ＤＭＳＯ中での還
元的アミノ化を用いて調製された７つの血清型（および水性溶媒中で調製された他の８つ
の血清型）を有する１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、１５の血清型全てが、水
性溶媒中で調製された場合の対応する１５価ＰＣＶと比較して、ＤＭＳＯ中で調製された
７つの血清型全てに関し、（統計学的有意性を有する優れた４つの血清型を持つ）ヒトに
おいて優れた免疫原性を示す傾向があった。
から調製された多糖タンパク質コンジュゲートは、（水中での還元的アミノ化を用いて調
製された同じコンジュゲートと比較して）食作用活性（ＯＰＡ）によって測定されるマウ
スモデルでの免疫原性の増加を示した。更に、実施例６に示すように、ＤＭＳＯ中での還
元的アミノ化を用いて調製された７つの血清型（および水性溶媒中で調製された他の８つ
の血清型）を有する１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、１５の血清型全てが、水
性溶媒中で調製された場合の対応する１５価ＰＣＶと比較して、ＤＭＳＯ中で調製された
７つの血清型全てに関し、（統計学的有意性を有する優れた４つの血清型を持つ）ヒトに
おいて優れた免疫原性を示す傾向があった。
【0047】
実施例４に示されるように、（ＣＲＭ１９７対照と比較して）血清型１９Ａコンジュゲ
ート中のＣＲＭ１９７タンパク質上のリシン位置についてのペプチドシグナル減少を、可
能なコンジュゲーション部位に対してプロットすることにより、以前に同定された一般的
なヒトＴ細胞ペプチドエピトープに更なるコンジュゲーション部位があることが明らかに
なった（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２
０７－３２１４を参照；ＣＲＭ１９７配列のペプチド４１１～４３０およびペプチド４３
１～４５０にある）。したがって、特定の実施形態において、本発明はまた、１つ以上の
多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、該多糖－ＣＲＭ１９
７コンジュゲートの少なくとも１つが非プロトン性溶媒中で調製され、かつ、非プロトン
性溶媒中で調製されたコンジュゲートが、水性溶媒中で調製された同じコンジュゲートと
比較して、ＣＲＭ１９７のアミノ酸４１１～４３０または４３１～４５０におけるリシン
残基のより大きなアクセシビリティを実証する、免疫原性組成物にも関する。特定の実施
形態において、本発明はまた、１つ以上の多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを含む免疫
原性組成物であって、該多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの少なくとも１つが非プロト
ン性溶媒中で調製され、かつ、非プロトン性溶媒中で調製されたコンジュゲート中のＣＲ
Ｍ１９７のアミノ酸４１１～４３０または４３１～４５０における１つ以上のリシン残基
が１０％を超えてコンジュゲートされる、免疫原性組成物に関する。特定の実施形態にお
いて、本発明は、非プロトン性溶媒中で多糖をＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせること
を含む、ＣＲＭ１９７内、特にＣＲＭ１９７のアミノ酸４１１～４３０または４３１～４
５０におけるリシン残基のアクセシビリティを高める方法に関する。この実施形態の特定
の態様において、非プロトン性溶媒中で調製されたコンジュゲート中のＣＲＭ１９７のア
ミノ酸４１１～４３０または４３１～４５０における１つ以上のリシン残基は１０％を超
えてコンジュゲートされる。これらの実施形態において、多糖は、免疫原性組成物を調製
するのに適した任意の生物由来のものであり得る。特定の態様において、多糖は、髄膜炎
菌または肺炎連鎖球菌由来のものである。多糖はこれら生物の任意の血清型に由来し得る
。
ート中のＣＲＭ１９７タンパク質上のリシン位置についてのペプチドシグナル減少を、可
能なコンジュゲーション部位に対してプロットすることにより、以前に同定された一般的
なヒトＴ細胞ペプチドエピトープに更なるコンジュゲーション部位があることが明らかに
なった（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２
０７－３２１４を参照；ＣＲＭ１９７配列のペプチド４１１～４３０およびペプチド４３
１～４５０にある）。したがって、特定の実施形態において、本発明はまた、１つ以上の
多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、該多糖－ＣＲＭ１９
７コンジュゲートの少なくとも１つが非プロトン性溶媒中で調製され、かつ、非プロトン
性溶媒中で調製されたコンジュゲートが、水性溶媒中で調製された同じコンジュゲートと
比較して、ＣＲＭ１９７のアミノ酸４１１～４３０または４３１～４５０におけるリシン
残基のより大きなアクセシビリティを実証する、免疫原性組成物にも関する。特定の実施
形態において、本発明はまた、１つ以上の多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを含む免疫
原性組成物であって、該多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの少なくとも１つが非プロト
ン性溶媒中で調製され、かつ、非プロトン性溶媒中で調製されたコンジュゲート中のＣＲ
Ｍ１９７のアミノ酸４１１～４３０または４３１～４５０における１つ以上のリシン残基
が１０％を超えてコンジュゲートされる、免疫原性組成物に関する。特定の実施形態にお
いて、本発明は、非プロトン性溶媒中で多糖をＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせること
を含む、ＣＲＭ１９７内、特にＣＲＭ１９７のアミノ酸４１１～４３０または４３１～４
５０におけるリシン残基のアクセシビリティを高める方法に関する。この実施形態の特定
の態様において、非プロトン性溶媒中で調製されたコンジュゲート中のＣＲＭ１９７のア
ミノ酸４１１～４３０または４３１～４５０における１つ以上のリシン残基は１０％を超
えてコンジュゲートされる。これらの実施形態において、多糖は、免疫原性組成物を調製
するのに適した任意の生物由来のものであり得る。特定の態様において、多糖は、髄膜炎
菌または肺炎連鎖球菌由来のものである。多糖はこれら生物の任意の血清型に由来し得る
。
【0048】
本明細書で使用される際、用語「水性溶媒」または「水性条件」は、還元的アミノ化な
どのコンジュゲーションと共に使用される場合、コンジュゲーション反応のための溶媒と
しての水の使用を指す。有機溶媒が存在しないことを除いて、この水はバッファーおよび
他の成分を含有してもよい。
どのコンジュゲーションと共に使用される場合、コンジュゲーション反応のための溶媒と
しての水の使用を指す。有機溶媒が存在しないことを除いて、この水はバッファーおよび
他の成分を含有してもよい。
【0049】
本明細書で使用される際、用語「非プロトン性溶媒」は、還元的アミノ化のようなコン
ジュゲーションと共に使用される場合、コンジュゲーション反応のための溶媒としての、
極性非プロトン性溶媒の使用または極性非プロトン性溶媒の組み合わせを指す。極性非プ
ロトン溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）が挙げられるが、これらに限定
されない。非プロトン性溶媒には、例えば１％、２％、５％、１０％または２０％までの
いくらかの水が存在していてもよい。
ジュゲーションと共に使用される場合、コンジュゲーション反応のための溶媒としての、
極性非プロトン性溶媒の使用または極性非プロトン性溶媒の組み合わせを指す。極性非プ
ロトン溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）が挙げられるが、これらに限定
されない。非プロトン性溶媒には、例えば１％、２％、５％、１０％または２０％までの
いくらかの水が存在していてもよい。
【0050】
本明細書で使用される際、「ＤＭＳＯ溶媒」および「ＤＭＳＯ条件」は互換的に使用さ
れる。
れる。
【0051】
本明細書で使用される際、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、本発明の免疫
原性組成物について用いる場合、アジュバントおよび賦形剤などの任意の他の成分の包含
（抗原混合物に対する文言「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の制限を受け
る）を指す。用語「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、多価多糖－タンパ
ク質コンジュゲート混合物について用いる場合、混合物がそれらの特定の肺炎連鎖球菌多
糖タンパク質コンジュゲートを有するが、異なる血清型に由来する他の肺炎連鎖球菌多糖
タンパク質コンジュゲートは有さないことを指す。
原性組成物について用いる場合、アジュバントおよび賦形剤などの任意の他の成分の包含
（抗原混合物に対する文言「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の制限を受け
る）を指す。用語「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、多価多糖－タンパ
ク質コンジュゲート混合物について用いる場合、混合物がそれらの特定の肺炎連鎖球菌多
糖タンパク質コンジュゲートを有するが、異なる血清型に由来する他の肺炎連鎖球菌多糖
タンパク質コンジュゲートは有さないことを指す。
【0052】
本明細書で使用される際、「リシン損失」は、コンジュゲーション中のリシン消費量を
指し、コンジュゲート中の平均測定リシン量と出発タンパク質中の予想リシン量との間の
差によって決定される。実施例４は、「リシン損失」を決定するための一方法を記載する
。
指し、コンジュゲート中の平均測定リシン量と出発タンパク質中の予想リシン量との間の
差によって決定される。実施例４は、「リシン損失」を決定するための一方法を記載する
。
【0053】
本明細書で使用される際、用語「多糖」は、免疫学的および細菌性ワクチンの分野で一
般的に使用される任意の抗原性糖要素（または抗原性単位）を包含することを意味し、「
糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ糖」、「リポ－オリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多
糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「複合糖質」などを含むがこれらに限定されない
。
般的に使用される任意の抗原性糖要素（または抗原性単位）を包含することを意味し、「
糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ糖」、「リポ－オリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多
糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「複合糖質」などを含むがこれらに限定されない
。
【0054】
非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中で調製される免疫原性組成物および水性条件
下で調製される残りの多糖タンパク質コンジュゲート中の血清型のパーセンテージについ
て言及する場合、単に、非プロトン性溶媒中で調製された血清型の数を、組成物中の血清
型の総数で割った数を指すことを意味する。
下で調製される残りの多糖タンパク質コンジュゲート中の血清型のパーセンテージについ
て言及する場合、単に、非プロトン性溶媒中で調製された血清型の数を、組成物中の血清
型の総数で割った数を指すことを意味する。
【0055】
本明細書で使用される際、ｐＨ、温度および濃度などの全ての範囲は両端値を含むこと
を意味する。例えば、５．０～９．０のｐＨ範囲は、５．０のｐＨおよび９．０のｐＨを
含むことを意味する。同様に、４～２５℃の温度範囲は、と当該範囲の外側限界、すなわ
ち４℃および２５℃を含むことを意味する。
を意味する。例えば、５．０～９．０のｐＨ範囲は、５．０のｐＨおよび９．０のｐＨを
含むことを意味する。同様に、４～２５℃の温度範囲は、と当該範囲の外側限界、すなわ
ち４℃および２５℃を含むことを意味する。
【0056】
多糖
本発明の方法、すなわち非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化によって調製すること
ができる肺炎連鎖球菌莢膜多糖は、血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６
Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５
Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、
２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ
、３５Ｆおよび３８を含むが、これらに限定されない。多糖は、オリゴ糖の形態で使用し
てもよい。これらは、精製された多糖の断片化によって（例えば加水分解によって）都合
よく形成され、通常は、所望のサイズの断片の精製が続く。
本発明の方法、すなわち非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化によって調製すること
ができる肺炎連鎖球菌莢膜多糖は、血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６
Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５
Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、
２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ
、３５Ｆおよび３８を含むが、これらに限定されない。多糖は、オリゴ糖の形態で使用し
てもよい。これらは、精製された多糖の断片化によって（例えば加水分解によって）都合
よく形成され、通常は、所望のサイズの断片の精製が続く。
【0057】
特定の実施形態において、血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、
９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、
２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、
３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて
調製される。特定の態様において、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび
１４のうちの１つ以上に由来する肺炎球菌多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ
化を用いて調製される。特定の態様において、血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、
９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ
、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ
以上に由来する肺炎球菌多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製さ
れる。ある態様において、血清型３または１８Ｃの一方または両方に由来する肺炎球菌多
糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート
される。多価組成物中の他の血清型に由来する多糖は、水性溶媒中または非プロトン性溶
媒中での還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされていてもよい。また、多価組成物中
の他の血清型に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中または水性溶媒中で行われ得る他の
化学を用いてコンジュゲートされてもよい。
９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、
２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、
３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて
調製される。特定の態様において、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび
１４のうちの１つ以上に由来する肺炎球菌多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ
化を用いて調製される。特定の態様において、血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、
９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ
、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ
以上に由来する肺炎球菌多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製さ
れる。ある態様において、血清型３または１８Ｃの一方または両方に由来する肺炎球菌多
糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲート
される。多価組成物中の他の血清型に由来する多糖は、水性溶媒中または非プロトン性溶
媒中での還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされていてもよい。また、多価組成物中
の他の血清型に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中または水性溶媒中で行われ得る他の
化学を用いてコンジュゲートされてもよい。
【0058】
肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖は、当業者に知られている標準的な技術によって調製する
ことができる。例えば、多糖は細菌から単離することができ、既知の方法によって（例え
ば、欧州特許第４９７５２４号および同第４９７５２５号を参照）、および好ましくはホ
モジナイザーを用いて達成されるマイクロフルイダイズによって、または化学的加水分解
によって、ある程度の大きさにサイジングすることができる。一実施形態において、各肺
炎球菌多糖血清型は、大豆ベースの媒体中で増殖する。次に、遠心分離、沈殿および限外
濾過を含む標準的な工程により個々の多糖を精製する。例えば、米国特許公開第２００８
／０２８６８３８号および米国特許第５，８４７，１１２号を参照のこと。多糖試料中の
粘度を低下させるために、および／または機械的または化学的サイジングなどの技術を用
いてコンジュゲートさせた生成物の濾過性を向上させるために、多糖をサイジングするこ
とができる。化学的加水分解は酢酸を用いて実施することができる。機械的サイジングは
高圧均質化剪断を用いて実施することができる。
ことができる。例えば、多糖は細菌から単離することができ、既知の方法によって（例え
ば、欧州特許第４９７５２４号および同第４９７５２５号を参照）、および好ましくはホ
モジナイザーを用いて達成されるマイクロフルイダイズによって、または化学的加水分解
によって、ある程度の大きさにサイジングすることができる。一実施形態において、各肺
炎球菌多糖血清型は、大豆ベースの媒体中で増殖する。次に、遠心分離、沈殿および限外
濾過を含む標準的な工程により個々の多糖を精製する。例えば、米国特許公開第２００８
／０２８６８３８号および米国特許第５，８４７，１１２号を参照のこと。多糖試料中の
粘度を低下させるために、および／または機械的または化学的サイジングなどの技術を用
いてコンジュゲートさせた生成物の濾過性を向上させるために、多糖をサイジングするこ
とができる。化学的加水分解は酢酸を用いて実施することができる。機械的サイジングは
高圧均質化剪断を用いて実施することができる。
【0059】
いくつかの実施形態において、コンジュゲーション前の精製多糖は、５ｋＤａ～４，０
００ｋＤａの分子量を有する。分子量は、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）および屈折率
検出器（ＲＩ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算す
ることができる。他のかかる実施形態において、多糖は、１０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ
；５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２，０
００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤ
ａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１０
０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５
００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋ
Ｄａ～５００ｋＤａ；１００～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；２００
ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５０
０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａの、または２００ｋＤａ～５００ｋＤａの分
子量を有する。
００ｋＤａの分子量を有する。分子量は、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）および屈折率
検出器（ＲＩ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算す
ることができる。他のかかる実施形態において、多糖は、１０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ
；５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２，０
００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤ
ａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１０
０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５
００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋ
Ｄａ～５００ｋＤａ；１００～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；２００
ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５０
０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａの、または２００ｋＤａ～５００ｋＤａの分
子量を有する。
【0060】
精製多糖は、糖を担体タンパク質と反応させることができるように化学的に活性化する
ことができる。精製多糖はリンカーに接続することができる。一旦活性化されるかまたは
リンカーに接続されると、各莢膜多糖は別々に担体タンパク質にコンジュゲートされて複
合糖質を形成する。多糖コンジュゲートは、既知のカップリング技術によって調製しても
よい。
ことができる。精製多糖はリンカーに接続することができる。一旦活性化されるかまたは
リンカーに接続されると、各莢膜多糖は別々に担体タンパク質にコンジュゲートされて複
合糖質を形成する。多糖コンジュゲートは、既知のカップリング技術によって調製しても
よい。
【0061】
多糖をリンカーにカップリングさせて、リンカーの遊離末端がエステル基である多糖－
リンカー中間体を形成することができる。したがって、リンカーは、少なくとも１つの末
端がエステル基であるものである。他方の末端は、リンカーが多糖と反応して多糖－リン
カー中間体を形成することができるように選択される。
リンカー中間体を形成することができる。したがって、リンカーは、少なくとも１つの末
端がエステル基であるものである。他方の末端は、リンカーが多糖と反応して多糖－リン
カー中間体を形成することができるように選択される。
【0062】
多糖は、その中の第一級アミン基を使用してリンカーにカップリングすることができる
。この場合、リンカーは典型的には両末端にエステル基を有する。これは、求核アシル置
換により多糖中でエステル基の１つを第一級アミン基と反応させることによりカップリン
グを生じさせることを可能にする。反応は、多糖がアミド結合を介してリンカーにカップ
リングしている多糖－リンカー中間体をもたらす。したがって、リンカーは、多糖中の第
一級アミン基と反応するための第一エステル基と、担体分子中の第一級アミン基と反応す
るための第二エステル基とを提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーはアジ
ピン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。
。この場合、リンカーは典型的には両末端にエステル基を有する。これは、求核アシル置
換により多糖中でエステル基の１つを第一級アミン基と反応させることによりカップリン
グを生じさせることを可能にする。反応は、多糖がアミド結合を介してリンカーにカップ
リングしている多糖－リンカー中間体をもたらす。したがって、リンカーは、多糖中の第
一級アミン基と反応するための第一エステル基と、担体分子中の第一級アミン基と反応す
るための第二エステル基とを提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーはアジ
ピン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。
【0063】
カップリングはまた、間接的に、すなわちリンカーへのカップリングの前に多糖を誘導
体化するために使用される更なるリンカーを用いても起こり得る。
体化するために使用される更なるリンカーを用いても起こり得る。
【0064】
多糖は、多糖の還元末端にあるカルボニル基を使用して更なるリンカーにカップリング
される。このカップリングは、（ａ１）カルボニル基を更なるリンカーと反応させ、（ａ
２）更なるリンカーの遊離末端をリンカーと反応させるという２つの工程を含む。これら
の実施形態において、更なるリンカーは典型的には両末端に第一級アミン基を有し、それ
によって還元アミノ化により第一級アミン基の１つを多糖中のカルボニル基と反応させる
ことによって工程（ａ１）の実施を可能にする。多糖中のカルボニル基と反応性のある第
一級アミン基が使用される。ヒドラジドまたはヒドロキシルアミノ基が適している。同じ
第一級アミン基が、典型的には更なるリンカーの両末端に存在する。当該反応は、多糖が
更なるリンカーにＣ－Ｎ結合を介してカップリングしている多糖－更なるリンカー中間体
をもたらす。
される。このカップリングは、（ａ１）カルボニル基を更なるリンカーと反応させ、（ａ
２）更なるリンカーの遊離末端をリンカーと反応させるという２つの工程を含む。これら
の実施形態において、更なるリンカーは典型的には両末端に第一級アミン基を有し、それ
によって還元アミノ化により第一級アミン基の１つを多糖中のカルボニル基と反応させる
ことによって工程（ａ１）の実施を可能にする。多糖中のカルボニル基と反応性のある第
一級アミン基が使用される。ヒドラジドまたはヒドロキシルアミノ基が適している。同じ
第一級アミン基が、典型的には更なるリンカーの両末端に存在する。当該反応は、多糖が
更なるリンカーにＣ－Ｎ結合を介してカップリングしている多糖－更なるリンカー中間体
をもたらす。
【0065】
多糖は、その中の異なる基、特にカルボキシル基を使用して更なるリンカーにカップリ
ングすることができる。このカップリングは、（ａ１）当該基を更なるリンカーと反応さ
せ、（ａ２）更なるリンカーの遊離末端をリンカーと反応させるという２つの工程を含む
。この場合、更なるリンカーは典型的には両末端に第一級アミン基を有し、それにより第
一級アミン基の１つを多糖中のカルボキシル基とＥＤＡＣ活性化によって反応させること
により工程（ａ１）の実施を可能にする。多糖中のＥＤＡＣ活性化カルボキシル基と反応
性のある第一級アミン基が使用される。ヒドラジド基が適している。同じ第一級アミン基
が、典型的には更なるリンカーの両末端に存在する。当該反応は、多糖が更なるリンカー
にアミド結合を介してカップリングしている多糖－更なるリンカー中間体をもたらす。
ングすることができる。このカップリングは、（ａ１）当該基を更なるリンカーと反応さ
せ、（ａ２）更なるリンカーの遊離末端をリンカーと反応させるという２つの工程を含む
。この場合、更なるリンカーは典型的には両末端に第一級アミン基を有し、それにより第
一級アミン基の１つを多糖中のカルボキシル基とＥＤＡＣ活性化によって反応させること
により工程（ａ１）の実施を可能にする。多糖中のＥＤＡＣ活性化カルボキシル基と反応
性のある第一級アミン基が使用される。ヒドラジド基が適している。同じ第一級アミン基
が、典型的には更なるリンカーの両末端に存在する。当該反応は、多糖が更なるリンカー
にアミド結合を介してカップリングしている多糖－更なるリンカー中間体をもたらす。
【0066】
一実施形態において、多糖の化学的活性化およびそれに続く還元的アミノ化による担体
タンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、同第４，６７
３，５７４号および同第４，９０２，５０６号、米国特許公開第２００６／０２２８３８
０号、同第２００７／１８４０７２号、同第２００７／０２３１３４０号および同第２０
０７／０１８４０７１号、ならびに国際公開第２００６／１１０３８１号、同第２００８
／０７９６５３号および同第２００８／１４３７０９号）に記載されている手段によって
達成することができる。化学は、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリ
ウムまたは過ヨウ素酸を含む）などの、末端ヒドロキシル基を酸化してアルデヒドにする
任意の酸化剤との反応による肺炎球菌多糖の活性化を必要とする場合がある。当該反応は
、反応性アルデヒド基を形成しつつ、炭水化物の隣接するヒドロキシル基のランダムな酸
化的開裂をもたらす。
タンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、同第４，６７
３，５７４号および同第４，９０２，５０６号、米国特許公開第２００６／０２２８３８
０号、同第２００７／１８４０７２号、同第２００７／０２３１３４０号および同第２０
０７／０１８４０７１号、ならびに国際公開第２００６／１１０３８１号、同第２００８
／０７９６５３号および同第２００８／１４３７０９号）に記載されている手段によって
達成することができる。化学は、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリ
ウムまたは過ヨウ素酸を含む）などの、末端ヒドロキシル基を酸化してアルデヒドにする
任意の酸化剤との反応による肺炎球菌多糖の活性化を必要とする場合がある。当該反応は
、反応性アルデヒド基を形成しつつ、炭水化物の隣接するヒドロキシル基のランダムな酸
化的開裂をもたらす。
【0067】
一実施形態では、０．０１～１０．０、０．０５～５．０、０．１～１．０、０．５～
１．０、０．７～０．８、０．０５～０．５、０．１～０．３モル当量の酸化剤と多糖を
反応させる。一実施形態では、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３
５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．
８、０．８５、０．９、０．９５モル当量の酸化剤と多糖を反応させる。限定された多糖
活性化を達成するべく、活性化のためにより少量の、例えば０．１～０．３Ｍｅｑの過ヨ
ウ素酸塩を使用する（例えば、多糖反復単位１モル当たり０．０５～０．２２または０．
０９～０．２２モルのアルデヒド）ことが一般に好ましい。本明細書で使用される際、「
活性化レベル」は、多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数を指す。多糖の活性
化が少ないほど、より天然に近い多糖となる。すなわち、より少ないヒドロキシル基がア
ルデヒドに変換される。
１．０、０．７～０．８、０．０５～０．５、０．１～０．３モル当量の酸化剤と多糖を
反応させる。一実施形態では、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３
５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．
８、０．８５、０．９、０．９５モル当量の酸化剤と多糖を反応させる。限定された多糖
活性化を達成するべく、活性化のためにより少量の、例えば０．１～０．３Ｍｅｑの過ヨ
ウ素酸塩を使用する（例えば、多糖反復単位１モル当たり０．０５～０．２２または０．
０９～０．２２モルのアルデヒド）ことが一般に好ましい。本明細書で使用される際、「
活性化レベル」は、多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数を指す。多糖の活性
化が少ないほど、より天然に近い多糖となる。すなわち、より少ないヒドロキシル基がア
ルデヒドに変換される。
【0068】
別の実施形態において、酸化反応の期間は、１時間～５０時間、１０時間～３０時間、
１５時間～２０時間、１５時間～１７時間、または約１６時間である。
１５時間～２０時間、１５時間～１７時間、または約１６時間である。
【0069】
別の実施形態において、酸化反応の温度は１５℃～４５℃、１５℃～３０℃、２０℃～
２５℃で維持される。別の実施形態において、反応の温度は約２３℃で維持される。
２５℃で維持される。別の実施形態において、反応の温度は約２３℃で維持される。
【0070】
担体タンパク質へのカップリングは、当該タンパク質のリシル基への直接アミノ化によ
る還元的アミノ化によって行われる。例えば、活性化多糖と担体タンパク質との混合物を
、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と、ニッケルの存在下で反応させることに
よってコンジュゲーションが行われる。コンジュゲーション反応は、水溶液下またはジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で起こり得る。例えば、米国特許公開第２０１５
／０２３１２７０号および同第２０１１／０１９５０８６号ならびに欧州特許第ＥＰ０４
７１１７７Ｂ１号を参照のこと。次いで、未反応アルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウム
などの強力な還元剤の添加でキャッピングする。
る還元的アミノ化によって行われる。例えば、活性化多糖と担体タンパク質との混合物を
、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と、ニッケルの存在下で反応させることに
よってコンジュゲーションが行われる。コンジュゲーション反応は、水溶液下またはジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で起こり得る。例えば、米国特許公開第２０１５
／０２３１２７０号および同第２０１１／０１９５０８６号ならびに欧州特許第ＥＰ０４
７１１７７Ｂ１号を参照のこと。次いで、未反応アルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウム
などの強力な還元剤の添加でキャッピングする。
【0071】
還元的アミノ化は、（１）多糖を酸化して反応性アルデヒドを形成し、（２）活性化多
糖と担体タンパク質との間に形成されたイミン（シッフ塩基）を還元して安定なアミン共
役結合を形成するという２つの工程を含む。酸化の前に多糖をサイズ縮小させてもよい。
機械的方法（例えば、均質化）または化学的加水分解を使用してもよい。化学的加水分解
は酢酸を用いて実施することができる。酸化工程は過ヨウ素酸塩との反応を含み得る。本
発明の目的のために、用語「過ヨウ素酸塩」は過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む。
この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）およびオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ －）
の両方を含み、過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素
酸カリウム）を含む。一実施形態において、莢膜多糖は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好
ましくは過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化される。別の実施形態にお
いて、莢膜多糖は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは過ヨウ素酸の存在下で酸化
される。
糖と担体タンパク質との間に形成されたイミン（シッフ塩基）を還元して安定なアミン共
役結合を形成するという２つの工程を含む。酸化の前に多糖をサイズ縮小させてもよい。
機械的方法（例えば、均質化）または化学的加水分解を使用してもよい。化学的加水分解
は酢酸を用いて実施することができる。酸化工程は過ヨウ素酸塩との反応を含み得る。本
発明の目的のために、用語「過ヨウ素酸塩」は過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む。
この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）およびオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ －）
の両方を含み、過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素
酸カリウム）を含む。一実施形態において、莢膜多糖は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好
ましくは過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化される。別の実施形態にお
いて、莢膜多糖は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは過ヨウ素酸の存在下で酸化
される。
【0072】
一実施形態において、酸化剤は、第一級ヒドロキシルを選択的に酸化する酸化剤の存在
下で、安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物、例えば（国際公開第２０
１４／０９７０９９号に記載されるような）ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－
Ｎ－オキシ化合物である。前記反応において、実際の酸化剤は、触媒サイクルにおいてＮ
－オキソアンモニウム塩である。１つの態様において、前記安定なニトロキシルまたはニ
トロキシドラジカル化合物は、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化
合物である。１つの態様において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル
化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）また
はＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を有す
る。１つの態様において、前記安定なニトロキシルラジカル化合物はＴＥＭＰＯまたはそ
の誘導体である。１つの態様において、前記酸化剤は、Ｎ－ハロ部分を有する分子である
。１つの態様において、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシン
イミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ
－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３
，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシ
アヌル酸および１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリ
オンからなる群から選択される。
下で、安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物、例えば（国際公開第２０
１４／０９７０９９号に記載されるような）ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－
Ｎ－オキシ化合物である。前記反応において、実際の酸化剤は、触媒サイクルにおいてＮ
－オキソアンモニウム塩である。１つの態様において、前記安定なニトロキシルまたはニ
トロキシドラジカル化合物は、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化
合物である。１つの態様において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル
化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）また
はＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を有す
る。１つの態様において、前記安定なニトロキシルラジカル化合物はＴＥＭＰＯまたはそ
の誘導体である。１つの態様において、前記酸化剤は、Ｎ－ハロ部分を有する分子である
。１つの態様において、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシン
イミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ
－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３
，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシ
アヌル酸および１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリ
オンからなる群から選択される。
【0073】
特定の態様において、酸化剤は、（国際公開第２０１４／０９７０９９号に記載される
ような）共酸化剤としての２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（Ｔ
ＥＭＰＯ）フリーラジカルおよびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である。したがっ
て、１つの態様において、肺炎連鎖球菌由来の複合糖質は、ａ）水性溶媒中で２，２，６
，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシン
イミド（ＮＣＳ）と糖を反応させて活性化糖を生成し、ｂ）活性化された糖を、１つ以上
のアミン基を含む担体タンパク質と反応させる工程を含む方法によって得られる（以下、
前記方法を「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化」と呼ぶ）。
ような）共酸化剤としての２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（Ｔ
ＥＭＰＯ）フリーラジカルおよびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である。したがっ
て、１つの態様において、肺炎連鎖球菌由来の複合糖質は、ａ）水性溶媒中で２，２，６
，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシン
イミド（ＮＣＳ）と糖を反応させて活性化糖を生成し、ｂ）活性化された糖を、１つ以上
のアミン基を含む担体タンパク質と反応させる工程を含む方法によって得られる（以下、
前記方法を「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化」と呼ぶ）。
【0074】
酸化反応は失活剤の添加により失活されてもよい。失活剤は、ビシナルジオール、１，
２－アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩
、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸（グリセロー
ル、エチレングリコール、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，２－ジオールまた
はブタン－２，３－ジオール、アスコルビン酸など）から選択され得る。
２－アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩
、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸（グリセロー
ル、エチレングリコール、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，２－ジオールまた
はブタン－２，３－ジオール、アスコルビン酸など）から選択され得る。
【0075】
コンジュゲーションプロセスの第二工程は、還元剤を用いて、活性化多糖と担体タンパ
ク質とのイミン（シッフ塩基）結合を還元して安定なコンジュゲート結合を形成すること
（いわゆる還元的アミノ化）である。適切な還元剤には、シアノ水素化ホウ素（シアノ水
素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムなど）が含まれる。一実施形態にお
いて、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
ク質とのイミン（シッフ塩基）結合を還元して安定なコンジュゲート結合を形成すること
（いわゆる還元的アミノ化）である。適切な還元剤には、シアノ水素化ホウ素（シアノ水
素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムなど）が含まれる。一実施形態にお
いて、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
【0076】
本発明の方法の特定実施形態において、還元的アミノ化反応は非プロトン性溶媒（また
は非プロトン性溶媒の混合物）中で行われる。一実施形態において、還元反応はＤＭＳＯ
中またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。凍結乾燥される場合には、
ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて活性化多糖および担体タンパク質を再構成することが
できる。一実施形態において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。
は非プロトン性溶媒の混合物）中で行われる。一実施形態において、還元反応はＤＭＳＯ
中またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。凍結乾燥される場合には、
ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて活性化多糖および担体タンパク質を再構成することが
できる。一実施形態において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。
【0077】
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に未反応のアルデヒド基が残っている可能性が
あり、適切なキャッピング剤を用いてこれをキャッピングすることができる。一実施形態
において、このキャッピング剤は水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。適切な
代替物としては、ブレンステッド酸またはルイス酸の存在下でのトリアセトキシ水素化ホ
ウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは亜鉛、ピリジンボラン、２－ピコ
リンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ’
ＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン
（ＰＥＭＢ）などのアミンボラン、または水素化ホウ素交換樹脂が挙げられる。コンジュ
ゲーション（還元反応および任意選択的にキャッピング）に続いて、複合糖質を、当業者
に知られている様々な技術によって精製してもよい（多糖－タンパク質コンジュゲートの
量に関して濃縮してもよい）。これらの技術には、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾
過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモ
ーダルイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー）、および深層濾過が含まれる。一実施形態において、複合糖質は、透析濾過またはイ
オン交換クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される
。
あり、適切なキャッピング剤を用いてこれをキャッピングすることができる。一実施形態
において、このキャッピング剤は水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。適切な
代替物としては、ブレンステッド酸またはルイス酸の存在下でのトリアセトキシ水素化ホ
ウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは亜鉛、ピリジンボラン、２－ピコ
リンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ’
ＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン
（ＰＥＭＢ）などのアミンボラン、または水素化ホウ素交換樹脂が挙げられる。コンジュ
ゲーション（還元反応および任意選択的にキャッピング）に続いて、複合糖質を、当業者
に知られている様々な技術によって精製してもよい（多糖－タンパク質コンジュゲートの
量に関して濃縮してもよい）。これらの技術には、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾
過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモ
ーダルイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー）、および深層濾過が含まれる。一実施形態において、複合糖質は、透析濾過またはイ
オン交換クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される
。
【0078】
非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された複合糖質は、一般に多価肺
炎球菌コンジュゲートワクチンにおいて使用される。したがって、全ての血清型が非プロ
トン性溶媒中で調製されるとは限らない多価組成物についての特定実施形態において、残
りの血清型の還元反応は、水性溶媒（例えば、ｐＨ６．０～８．５、７．０～８．０、ま
たは７．０～７．５で、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリ
ノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ、（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジ
ンエタンスルホン酸）、ビス－トリス、ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸
）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ、Ｎ’）－ビス（２－エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ
（３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ、Ｎ－ビス（２－
ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ
））プロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－２
－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンス
ルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ－（２－ヒド
ロキシプロパンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ
－３－プロパンスルホン酸））、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（４－（２
－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－プロパンスルホン酸）、ビシンまたはＨＥＰＢか
ら選択される）中で実施される。
炎球菌コンジュゲートワクチンにおいて使用される。したがって、全ての血清型が非プロ
トン性溶媒中で調製されるとは限らない多価組成物についての特定実施形態において、残
りの血清型の還元反応は、水性溶媒（例えば、ｐＨ６．０～８．５、７．０～８．０、ま
たは７．０～７．５で、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリ
ノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ、（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジ
ンエタンスルホン酸）、ビス－トリス、ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸
）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ、Ｎ’）－ビス（２－エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ
（３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ、Ｎ－ビス（２－
ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ
））プロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－２
－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンス
ルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ－（２－ヒド
ロキシプロパンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ
－３－プロパンスルホン酸））、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（４－（２
－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－プロパンスルホン酸）、ビシンまたはＨＥＰＢか
ら選択される）中で実施される。
【0079】
いくつかの実施形態において、本発明の複合糖質は、１０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ
の分子量を有する多糖を含む。他のかかる実施形態において、多糖は２５ｋＤａ～５，０
００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は５０ｋＤａ～１，０
００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は７０ｋＤａ～９００
ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１００ｋＤａ～８００ｋ
Ｄａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は、２００ｋＤａ～６００ｋ
Ｄａの分子量を有する。更なるかかる実施形態において、多糖は１００ｋＤａ～１０００
ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７
００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ
～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５
０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；
１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤ
ａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９
００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ
～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋ
Ｄａ～３００；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０
ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２
５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ
；３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８０
０ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～
５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００
ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４
００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。
の分子量を有する多糖を含む。他のかかる実施形態において、多糖は２５ｋＤａ～５，０
００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は５０ｋＤａ～１，０
００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は７０ｋＤａ～９００
ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１００ｋＤａ～８００ｋ
Ｄａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は、２００ｋＤａ～６００ｋ
Ｄａの分子量を有する。更なるかかる実施形態において、多糖は１００ｋＤａ～１０００
ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７
００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ
～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５
０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；
１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤ
ａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９
００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ
～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋ
Ｄａ～３００；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０
ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２
５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ
；３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８０
０ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～
５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００
ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４
００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。
【0080】
いくつかの実施形態において、本発明の複合糖質は、１，０００ｋＤａ～１０，０００
ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１，０００ｋＤａ～７，
０００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１，０００ｋＤａ
～６，０００ｋＤａの分子量を有する。
ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１，０００ｋＤａ～７，
０００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１，０００ｋＤａ
～６，０００ｋＤａの分子量を有する。
【0081】
特定の実施形態において、コンジュゲーション反応は還元的アミノ化によって行われ、
ここでニッケルはより大きいコンジュゲーション反応効率のためおよび遊離シアン化物の
除去を助けるために使用される。遷移金属は、シアン化物と安定な錯体を形成することが
知られており、かつ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いてタンパク質アミノ基および
ホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている（Ｓ Ｇｉｄｌｅｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８２，２０３：３３１－３３４；Ｊｅｎｔｏｆ
ｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０，１０６：１８６－１９０）。残
留する阻害シアン化物を錯化することにより、ニッケルの添加は、コンジュゲーション中
のタンパク質の消費を増加させ、より大きく、潜在的により免疫原性の高いコンジュゲー
トの形成をもたらす。
ここでニッケルはより大きいコンジュゲーション反応効率のためおよび遊離シアン化物の
除去を助けるために使用される。遷移金属は、シアン化物と安定な錯体を形成することが
知られており、かつ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いてタンパク質アミノ基および
ホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている（Ｓ Ｇｉｄｌｅｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８２，２０３：３３１－３３４；Ｊｅｎｔｏｆ
ｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０，１０６：１８６－１９０）。残
留する阻害シアン化物を錯化することにより、ニッケルの添加は、コンジュゲーション中
のタンパク質の消費を増加させ、より大きく、潜在的により免疫原性の高いコンジュゲー
トの形成をもたらす。
【0082】
シアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロット中の開始シアン化物レベルの差によっても、
コンジュゲーション性能にばらつきが生じ、その結果、コンジュゲートサイズやコンジュ
ゲートのＰｓ対ＣＲＭ１９７比などの製品属性が変化する。ニッケルの添加は、シアン化
物を錯化することによってコンジュゲーションのばらつきを減少させ、シアノ水素化ホウ
素ナトリウムロット間の差を解消した。
コンジュゲーション性能にばらつきが生じ、その結果、コンジュゲートサイズやコンジュ
ゲートのＰｓ対ＣＲＭ１９７比などの製品属性が変化する。ニッケルの添加は、シアン化
物を錯化することによってコンジュゲーションのばらつきを減少させ、シアノ水素化ホウ
素ナトリウムロット間の差を解消した。
【0083】
適切な代替化学は、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレ
ート（ＣＤＡＰ）によって糖を活性化させて、シアネートエステルを形成することを含む
。故に、活性化された糖は、直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介して担体タン
パク質上のアミノ基にカップリングされ得る。例えば、スペーサーは、シスタミンまたは
システアミンであって、チオール化多糖を生じることができ、このチオール化多糖は、マ
レイミド活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いて）またはハロアセチル化担体
タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［エチルヨードアセトイミドＨＣｌなど］また
はＮ－スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢまたはＳＩＡまたはＳＢＡＰを
用いて）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングできる。例
えば、シアネートエステル（ＣＤＡＰ化学によって作成されていてもよい）をヘキサンジ
アミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、タンパク質担体上
のカルボキシル基を介してカルボジイミド（ＥＤＡＣまたはＥＤＣなど）化学を用いて、
アミノ誘導体化した糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせる。かかるコンジュゲート
は、国際公開第９３／１５７６０号、同第９５／０８３４８号および同第９６／２９０９
４号、ならびにＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４
０：２４５－２５６に記載されている。
ート（ＣＤＡＰ）によって糖を活性化させて、シアネートエステルを形成することを含む
。故に、活性化された糖は、直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介して担体タン
パク質上のアミノ基にカップリングされ得る。例えば、スペーサーは、シスタミンまたは
システアミンであって、チオール化多糖を生じることができ、このチオール化多糖は、マ
レイミド活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いて）またはハロアセチル化担体
タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［エチルヨードアセトイミドＨＣｌなど］また
はＮ－スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢまたはＳＩＡまたはＳＢＡＰを
用いて）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングできる。例
えば、シアネートエステル（ＣＤＡＰ化学によって作成されていてもよい）をヘキサンジ
アミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、タンパク質担体上
のカルボキシル基を介してカルボジイミド（ＥＤＡＣまたはＥＤＣなど）化学を用いて、
アミノ誘導体化した糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせる。かかるコンジュゲート
は、国際公開第９３／１５７６０号、同第９５／０８３４８号および同第９６／２９０９
４号、ならびにＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４
０：２４５－２５６に記載されている。
【0084】
他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニ
トロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用す
る。多くが国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカル
ボニルリンカーを含んでいてもよく、このカルボニルリンカーは、糖の遊離ヒドロキシル
基とＣＤＩとを反応させ（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５４：２５７２－４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ．２１８：５０９－１８を参照）、その後、タンパク質と反応させることによ
りカルバメート結合を形成することによって形成してもよい。これは、アノマー末端の第
一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護、第一級ヒド
ロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバメート中間体の形成、およびＣＤＩカル
バメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでいてもよい。
トロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用す
る。多くが国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカル
ボニルリンカーを含んでいてもよく、このカルボニルリンカーは、糖の遊離ヒドロキシル
基とＣＤＩとを反応させ（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５４：２５７２－４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ．２１８：５０９－１８を参照）、その後、タンパク質と反応させることによ
りカルバメート結合を形成することによって形成してもよい。これは、アノマー末端の第
一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護、第一級ヒド
ロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバメート中間体の形成、およびＣＤＩカル
バメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでいてもよい。
【0085】
莢膜多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせた後、多糖－タンパク質コンジュゲー
トを、様々な技術のうちの１つ以上によって精製する（多糖－タンパク質コンジュゲート
の量に関して濃縮する）。これらの技術の例は当業者に周知であり、濃縮／透析濾過操作
、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィーおよび深層濾過を含む。例えば、米
国特許第６，１４６，９０２号を参照のこと。
トを、様々な技術のうちの１つ以上によって精製する（多糖－タンパク質コンジュゲート
の量に関して濃縮する）。これらの技術の例は当業者に周知であり、濃縮／透析濾過操作
、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィーおよび深層濾過を含む。例えば、米
国特許第６，１４６，９０２号を参照のこと。
【0086】
本発明の複合糖質を特徴付ける別の方法は、糖とコンジュゲートされるようになる担体
タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものであり、これは、コ
ンジュゲートリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる。多
糖への共有結合による、担体タンパク質のリシン修飾の証拠は、当業者に知られている日
常的な方法を用いたアミノ酸分析によって得ることができる。コンジュゲーションは、コ
ンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収
されるリシン残基数を減少させる。一実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲ
ーション度は、２～１８、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～
１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１８、５～１３、７
～１８、７～１３、８～１８、８～１３、１０～１８または１０～１３である。一実施形
態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約
６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。
一実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は７～１８である。いく
つかのかかる態様において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものであり、これは、コ
ンジュゲートリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる。多
糖への共有結合による、担体タンパク質のリシン修飾の証拠は、当業者に知られている日
常的な方法を用いたアミノ酸分析によって得ることができる。コンジュゲーションは、コ
ンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収
されるリシン残基数を減少させる。一実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲ
ーション度は、２～１８、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～
１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１８、５～１３、７
～１８、７～１３、８～１８、８～１３、１０～１８または１０～１３である。一実施形
態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約
６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。
一実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は７～１８である。いく
つかのかかる態様において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【0087】
本発明の複合糖質はまた、糖対担体タンパク質の比（重量／重量）によっても特徴付け
ることもできる。いくつかの実施形態において、複合糖質中の多糖対担体タンパク質の比
（ｗ／ｗ）は０．５～３．０（約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約
１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約
１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約
２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０など）である。他の実施形態に
おいて、糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．
８～１．２、０．５～１．０、１．０～１．５または１．０～２．０である。更なる実施
形態において、糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は０．８～１．２である。一実施形態
において、コンジュゲート中の莢膜多糖対担体タンパク質の比は、０．９～１．１である
。いくつかのかかる態様において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。本発明の複合
糖質および免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有結合されていない遊離糖を含有して
いてもよいが、それでもなお複合糖質組成物中に存在する。遊離糖は、複合糖質に非共有
会合（つまり、非共有結合、吸着、またはその中にもしくはそれと共に捕捉）させてもよ
い。
ることもできる。いくつかの実施形態において、複合糖質中の多糖対担体タンパク質の比
（ｗ／ｗ）は０．５～３．０（約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約
１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約
１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約
２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０など）である。他の実施形態に
おいて、糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．
８～１．２、０．５～１．０、１．０～１．５または１．０～２．０である。更なる実施
形態において、糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は０．８～１．２である。一実施形態
において、コンジュゲート中の莢膜多糖対担体タンパク質の比は、０．９～１．１である
。いくつかのかかる態様において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。本発明の複合
糖質および免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有結合されていない遊離糖を含有して
いてもよいが、それでもなお複合糖質組成物中に存在する。遊離糖は、複合糖質に非共有
会合（つまり、非共有結合、吸着、またはその中にもしくはそれと共に捕捉）させてもよ
い。
【0088】
一実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約５０％、４５％、４０％
、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離多糖を含む。一実施形態にお
いて、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖を含む。一実施形態
において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約２０％未満の遊離多糖を含む。一実施
形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約１５％未満の遊離多糖を含む。
、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離多糖を含む。一実施形態にお
いて、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖を含む。一実施形態
において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約２０％未満の遊離多糖を含む。一実施
形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約１５％未満の遊離多糖を含む。
【0089】
多価多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン
多価肺炎球菌免疫原性組成物は、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた１
、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０
Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ
、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８
Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８の少なくとも１つから選択
される肺炎連鎖球菌血清型に由来する莢膜多糖を含むことができ、少なくとも１つの血清
型に由来する多糖は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調
製される。本発明は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の血清型に由
来する多糖を有する多価肺炎球菌免疫原性組成物を企図する。好ましくは、特定の血清型
に由来する糖は、複数の担体タンパク質にコンジュゲートされていない。
多価肺炎球菌免疫原性組成物は、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた１
、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０
Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ
、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８
Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８の少なくとも１つから選択
される肺炎連鎖球菌血清型に由来する莢膜多糖を含むことができ、少なくとも１つの血清
型に由来する多糖は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調
製される。本発明は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の血清型に由
来する多糖を有する多価肺炎球菌免疫原性組成物を企図する。好ましくは、特定の血清型
に由来する糖は、複数の担体タンパク質にコンジュゲートされていない。
【0090】
特定の実施形態において、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の血
清型に由来する多糖は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて
調製される。
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の血
清型に由来する多糖は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて
調製される。
【0091】
特定の実施形態において、血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまた
は２３Ｆのうちの１つ以上が、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製され
る。この実施形態の特定の態様において、血清型３または１８Ｃの一方または両方は、非
プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。
は２３Ｆのうちの１つ以上が、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製され
る。この実施形態の特定の態様において、血清型３または１８Ｃの一方または両方は、非
プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。
【0092】
特定の実施形態において、多価組成物中の血清型の少なくとも３０、３５、４０、４５
、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％が非プ
ロトン性溶媒中で調製される。残りの血清型は、代替化学を用いておよび／または水性溶
媒中で調製される。
、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％が非プ
ロトン性溶媒中で調製される。残りの血清型は、代替化学を用いておよび／または水性溶
媒中で調製される。
【0093】
特定の実施形態において、血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、
９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、
２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、
３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて
調製される。特定の態様において、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび
１４のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。
ある態様において、血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１
６Ｆ、１７Ｆ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、
３１、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８の１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的ア
ミノ化を用いて調製される。
９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、
２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、
３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて
調製される。特定の態様において、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび
１４のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。
ある態様において、血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１
６Ｆ、１７Ｆ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、
３１、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８の１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的ア
ミノ化を用いて調製される。
【0094】
一実施形態において、多価組成物は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的ア
ミノ化を用いて調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３
Ｆに由来する多糖および水性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された血清型１、３
、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖からなる。
ミノ化を用いて調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３
Ｆに由来する多糖および水性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された血清型１、３
、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖からなる。
【0095】
個々の複合糖質を精製した後、それらを配合して本発明の免疫原性組成物を配合する。
これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別個の方法によって調製され、単回投与配合物にバ
ルクで配合される。
これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別個の方法によって調製され、単回投与配合物にバ
ルクで配合される。
【0096】
担体タンパク質
本発明の特定実施形態において、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として使用される。Ｃ
ＲＭ１９７は、ジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。一実施
形態において、ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸および酵母抽出物ベースの媒体で増殖させた
ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１
９７）の培養物から単離される。別の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５
，６１４，３８２号に記載されている方法に従って組換え調製される。通常、ＣＲＭ１９
７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わ
せによって精製される。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ社、カリフォルニ
ア州サンディエゴ）を使用して、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において調製される。
本発明の特定実施形態において、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として使用される。Ｃ
ＲＭ１９７は、ジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。一実施
形態において、ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸および酵母抽出物ベースの媒体で増殖させた
ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１
９７）の培養物から単離される。別の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５
，６１４，３８２号に記載されている方法に従って組換え調製される。通常、ＣＲＭ１９
７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わ
せによって精製される。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ社、カリフォルニ
ア州サンディエゴ）を使用して、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において調製される。
【0097】
他の適切な担体タンパク質としては、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）またはＤＴ（ＤＴ
ＦＢ）の断片Ｂ、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コ
レラトキソイド（例えば、国際公開第２００４／０８３２５１号に記載されているような
もの）、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａのような更なる不活化細菌毒素が挙げられる。細菌外膜タン
パク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク
質、肺炎球菌の表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際出願公開第０２／０９１９９８号参照
）、肺炎球菌の吸着タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群の連鎖球菌由来Ｃ５ａペ
プチダーゼ、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
）タンパク質Ｄ、肺炎球菌のニューモリシン（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆ
ｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６－１３）（何らかの方法で無毒化されたｐｌｙ、例
えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（国際公開第０４／０８１５１５号を参照）もしくはｄＰＬＹ
－ｆｏｒｍｏｌ）、ＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥおよびＰｈｔタ
ンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際公開第０１／９
８３３４号および同第０３／５４００７号を参照））を使用することもできる。他のタン
パク質、例えば、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）もしくはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（髄
膜炎菌由来）、ＰＤ（インフルエンザ菌のタンパク質Ｄ；例えば、欧州特許第０５９４６
１０Ｂ号参照）、またはその免疫学的機能等価体、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８
８１号および同第０４２７３４７号参照）、熱ショックタンパク質（国際公開第９３／１
７７１２号および同第９４／０３２０８号参照）、百日咳タンパク質（国際公開第９８／
５８６６８号および欧州特許第０４７１１７７号参照）、サイトカイン、リンホカイン、
成長因子もしくはホルモン（国際公開第９１／０１１４６号参照）、様々な病原体由来抗
原から得られる複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇ
ｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６－３８２４
を参照）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉ
ｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４－７を参照）、鉄取込みタンパク質（国際公開
第０１／７２３３７号を参照）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡもしくはＢ（国際公開
第００／６１７６１号参照）、ならびにフラジェリン（Ｂｅｎ－Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９を参照）も担体タンパク質とし
て使用できる。
ＦＢ）の断片Ｂ、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コ
レラトキソイド（例えば、国際公開第２００４／０８３２５１号に記載されているような
もの）、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａのような更なる不活化細菌毒素が挙げられる。細菌外膜タン
パク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク
質、肺炎球菌の表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際出願公開第０２／０９１９９８号参照
）、肺炎球菌の吸着タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群の連鎖球菌由来Ｃ５ａペ
プチダーゼ、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
）タンパク質Ｄ、肺炎球菌のニューモリシン（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆ
ｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６－１３）（何らかの方法で無毒化されたｐｌｙ、例
えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（国際公開第０４／０８１５１５号を参照）もしくはｄＰＬＹ
－ｆｏｒｍｏｌ）、ＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥおよびＰｈｔタ
ンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際公開第０１／９
８３３４号および同第０３／５４００７号を参照））を使用することもできる。他のタン
パク質、例えば、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）もしくはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（髄
膜炎菌由来）、ＰＤ（インフルエンザ菌のタンパク質Ｄ；例えば、欧州特許第０５９４６
１０Ｂ号参照）、またはその免疫学的機能等価体、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８
８１号および同第０４２７３４７号参照）、熱ショックタンパク質（国際公開第９３／１
７７１２号および同第９４／０３２０８号参照）、百日咳タンパク質（国際公開第９８／
５８６６８号および欧州特許第０４７１１７７号参照）、サイトカイン、リンホカイン、
成長因子もしくはホルモン（国際公開第９１／０１１４６号参照）、様々な病原体由来抗
原から得られる複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇ
ｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６－３８２４
を参照）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉ
ｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４－７を参照）、鉄取込みタンパク質（国際公開
第０１／７２３３７号を参照）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡもしくはＢ（国際公開
第００／６１７６１号参照）、ならびにフラジェリン（Ｂｅｎ－Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９を参照）も担体タンパク質とし
て使用できる。
【0098】
他のＤＴ変異体、例えば、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａ
ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８－３８４４）；Ｃ
ＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、ならびにＮｉｃ
ｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによってＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９９２
に記載された他の変異；Ｇｌｕ－１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの、および
／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または変異、ならびに米国特許第４，７０９，
０１７号または第４，９５０，７４０号に開示された他の変異；残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙ
ｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つ以上の変異、なら
びに米国特許第５，９１７，０１７号または第６，４５５，６７３号に開示された他の変
異；あるいは米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片、を第二の担体タンパク
質として使用することができる。また、かかるＤＴ変異体を使用して、Ｂ断片を含むＤＴ
ＦＢ変異体にエピトープ領域を含有させることができる。
ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８－３８４４）；Ｃ
ＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、ならびにＮｉｃ
ｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによってＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９９２
に記載された他の変異；Ｇｌｕ－１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの、および
／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または変異、ならびに米国特許第４，７０９，
０１７号または第４，９５０，７４０号に開示された他の変異；残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙ
ｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つ以上の変異、なら
びに米国特許第５，９１７，０１７号または第６，４５５，６７３号に開示された他の変
異；あるいは米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片、を第二の担体タンパク
質として使用することができる。また、かかるＤＴ変異体を使用して、Ｂ断片を含むＤＴ
ＦＢ変異体にエピトープ領域を含有させることができる。
【0099】
多価ワクチンを使用する場合、多価ワクチン中の抗原のうちの１つ以上に対して第二の
担体を使用することができる。第二の担体タンパク質は、好ましくは非毒性かつ非反応原
性であって、十分な量および純度で得られるタンパク質である。第二の担体タンパク質も
また、抗原の免疫原性を増強するために、抗原、例えば肺炎連鎖球菌多糖とコンジュゲー
トまたは接合している。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に従うべき
である。一実施形態において、第一の担体タンパク質にコンジュゲートされていない各莢
膜多糖を、同じ第二の担体タンパク質にコンジュゲートさせる（例えば、各莢膜多糖分子
は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。別の実施形態において、第一の担体
タンパク質にコンジュゲートしていない莢膜多糖を、２つ以上の担体タンパク質にコンジ
ュゲートさせる（各莢膜多糖分子は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。か
かる実施形態において、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には、同じ担体タンパク質に
コンジュゲートされる。
担体を使用することができる。第二の担体タンパク質は、好ましくは非毒性かつ非反応原
性であって、十分な量および純度で得られるタンパク質である。第二の担体タンパク質も
また、抗原の免疫原性を増強するために、抗原、例えば肺炎連鎖球菌多糖とコンジュゲー
トまたは接合している。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に従うべき
である。一実施形態において、第一の担体タンパク質にコンジュゲートされていない各莢
膜多糖を、同じ第二の担体タンパク質にコンジュゲートさせる（例えば、各莢膜多糖分子
は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。別の実施形態において、第一の担体
タンパク質にコンジュゲートしていない莢膜多糖を、２つ以上の担体タンパク質にコンジ
ュゲートさせる（各莢膜多糖分子は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。か
かる実施形態において、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には、同じ担体タンパク質に
コンジュゲートされる。
【0100】
医薬／ワクチン組成物
本発明は更に、薬学的に許容される担体およびアジュバントと共に、上記の多糖血清型
の組み合わせのいずれかを含む、それから本質的になる、またはそれからなる、医薬組成
物、免疫原性組成物およびワクチン組成物を包含する組成物を更に提供する。
本発明は更に、薬学的に許容される担体およびアジュバントと共に、上記の多糖血清型
の組み合わせのいずれかを含む、それから本質的になる、またはそれからなる、医薬組成
物、免疫原性組成物およびワクチン組成物を包含する組成物を更に提供する。
【0101】
本発明の多糖－タンパク質コンジュゲートの配合は、当技術分野において認識されてい
る方法を使用して達成することができる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組
成物を調製するために生理学的に許容されるビヒクルを配合することができる。かかるビ
ヒクルの例としては、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピ
レングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が挙げられる
が、これらに限定されない。
る方法を使用して達成することができる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組
成物を調製するために生理学的に許容されるビヒクルを配合することができる。かかるビ
ヒクルの例としては、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピ
レングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が挙げられる
が、これらに限定されない。
【0102】
一実施形態において、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むＬ－ヒスチジンバッフ
ァーにて配合される。
ァーにて配合される。
【0103】
本明細書で定義されるように、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原
性を増強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与されると免疫原性
が弱い抗原に対する免疫応答を増強する、例えば、無もしくは弱い抗体力価または細胞性
免疫応答を誘導し、抗原に対する抗体力価を高め、かつ／または個々における免疫反応を
達成するのに効果的な抗原の用量を低減することができる。したがって、アジュバントは
、しばしば免疫応答を高めるために投与され、当業者に周知である。組成物の有効性を増
強するのに適するアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定され
ない。
性を増強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与されると免疫原性
が弱い抗原に対する免疫応答を増強する、例えば、無もしくは弱い抗体力価または細胞性
免疫応答を誘導し、抗原に対する抗体力価を高め、かつ／または個々における免疫反応を
達成するのに効果的な抗原の用量を低減することができる。したがって、アジュバントは
、しばしば免疫応答を高めるために投与され、当業者に周知である。組成物の有効性を増
強するのに適するアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定され
ない。
【0104】
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニ
ウム、硫酸アルミニウム；
（２）水中油型乳剤配合物（ムラミルペプチド（以下に定義される）または細菌細胞壁
成分のような他の特定の免疫刺激剤を含むまたは含まない）、例えば、（ａ）５％スクア
レン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有し（様々な量のＭＴＰ
－ＰＥを含有していてもよい）、Ｍｏｄｅｌ１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒ
ｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）などのマイクロフルイダイザーを
用いてサブミクロン粒子に配合されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）；（ｂ
）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１
２１およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有し、サブミクロンの乳剤にマイクロフルイダイズされて
いるか、またはボルテックスされてより大きな粒度の乳剤を生成するＳＡＦ；（ｃ）２％
スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号に記載
の３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコー
ル酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（
商標））からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュ
バント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ社、マサチューセッツ州ハミルトン）；ならびに（ｄ
）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ；
（３）サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ ＡもしくはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標
）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州フレーミングハム）（例えば
、米国特許第５，０５７，５４０号を参照）が使用され得るか、またはこのアジュバント
から生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質および
両親媒性タンパク質の組み合わせによって形成される免疫刺激複合体）およびＩｓｃｏｍ
ａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが当該タンパク質を含
まない）；
（４）細菌リポ多糖、合成脂質Ａ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェ
ート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体、Ｃｏｒｉｘａから入手可能で
あり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；かかる１つのＡＧＰは、２－
［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－
４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］
－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－ｂ－Ｄ－グル
コピラノシドであり、５２９としても知られており（以前は、ＲＣ５２９として知られて
いた）、水性形態または安定な乳剤として配合されるものである；
（５）合成ポリヌクレオチド、例えば、（１または複数の）ＣｐＧモチーフを含有する
オリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ
－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）、インタ
ーフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（
ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）、共刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２；
（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体。
ウム、硫酸アルミニウム；
（２）水中油型乳剤配合物（ムラミルペプチド（以下に定義される）または細菌細胞壁
成分のような他の特定の免疫刺激剤を含むまたは含まない）、例えば、（ａ）５％スクア
レン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有し（様々な量のＭＴＰ
－ＰＥを含有していてもよい）、Ｍｏｄｅｌ１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒ
ｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）などのマイクロフルイダイザーを
用いてサブミクロン粒子に配合されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）；（ｂ
）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１
２１およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有し、サブミクロンの乳剤にマイクロフルイダイズされて
いるか、またはボルテックスされてより大きな粒度の乳剤を生成するＳＡＦ；（ｃ）２％
スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号に記載
の３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコー
ル酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（
商標））からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュ
バント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ社、マサチューセッツ州ハミルトン）；ならびに（ｄ
）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ；
（３）サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ ＡもしくはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標
）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州フレーミングハム）（例えば
、米国特許第５，０５７，５４０号を参照）が使用され得るか、またはこのアジュバント
から生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質および
両親媒性タンパク質の組み合わせによって形成される免疫刺激複合体）およびＩｓｃｏｍ
ａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが当該タンパク質を含
まない）；
（４）細菌リポ多糖、合成脂質Ａ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェ
ート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体、Ｃｏｒｉｘａから入手可能で
あり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；かかる１つのＡＧＰは、２－
［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－
４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］
－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－ｂ－Ｄ－グル
コピラノシドであり、５２９としても知られており（以前は、ＲＣ５２９として知られて
いた）、水性形態または安定な乳剤として配合されるものである；
（５）合成ポリヌクレオチド、例えば、（１または複数の）ＣｐＧモチーフを含有する
オリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ
－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）、インタ
ーフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（
ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）、共刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２；
（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体。
【0105】
別の実施形態において、アジュバントは、上記のアジュバントの２、３またはそれ以上
の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３－脱アシル化モノホスホリル脂質ＡおよびＱＳ２１も
含有する水中油型乳剤）である。
の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３－脱アシル化モノホスホリル脂質ＡおよびＱＳ２１も
含有する水中油型乳剤）である。
【0106】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグル
タミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－
２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミ
ン（ＭＴＰ－ＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
タミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－
２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミ
ン（ＭＴＰ－ＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0107】
特定の実施形態において、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジ
ュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミ
ニウム塩アジュバントは当技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．お
よびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ならびにＮ
ｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９－４９３）に記載されている。アルミニウム
塩としては、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウ
ム水和物、アルミニウム三水和物、ヒドロゲル、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、
水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウム、リン酸アルミニウ
ムアジュバント（ＡＰＡ）、非晶質アルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシア
ルミニウムが挙げられるが、これらに限定されない。
ュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミ
ニウム塩アジュバントは当技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．お
よびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ならびにＮ
ｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９－４９３）に記載されている。アルミニウム
塩としては、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウ
ム水和物、アルミニウム三水和物、ヒドロゲル、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、
水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウム、リン酸アルミニウ
ムアジュバント（ＡＰＡ）、非晶質アルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシア
ルミニウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【0108】
ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミ
ニウムとリン酸ナトリウムを１：１の容量比でブレンドし、ヒドロキシリン酸アルミニウ
ムを沈殿させることによって製造される。ブレンドプロセスの後、その材料を高剪断ミキ
サーでサイズ縮小し、単分散粒度分布を達成する。次いで、生成物を生理食塩水に対して
透析濾過し、蒸気滅菌する。
ニウムとリン酸ナトリウムを１：１の容量比でブレンドし、ヒドロキシリン酸アルミニウ
ムを沈殿させることによって製造される。ブレンドプロセスの後、その材料を高剪断ミキ
サーでサイズ縮小し、単分散粒度分布を達成する。次いで、生成物を生理食塩水に対して
透析濾過し、蒸気滅菌する。
【0109】
特定の実施形態において、市販のＡｌ（ＯＨ）３（例えば、ニューヨーク州ウェストベ
リーにあるＤｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ社のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用して、タンパク質
を、５０～２００ｇタンパク質／ｍｇ水酸化アルミニウムの比率で吸着させる。タンパク
質の吸着は、別の実施形態では、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）および媒体のｐＨに依存
する。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強く正電荷アルミニウムイ
オンに吸着される。アルミニウム塩は、２～３週間にわたってゆっくりと放出される抗原
の貯蔵部を確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、かつ／
または（おそらく尿酸の刺激により）先天性免疫機構を刺激し得る。例えば、Ｌａｍｂｒ
ｅｃｈｔら，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照のこと
。
リーにあるＤｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ社のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用して、タンパク質
を、５０～２００ｇタンパク質／ｍｇ水酸化アルミニウムの比率で吸着させる。タンパク
質の吸着は、別の実施形態では、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）および媒体のｐＨに依存
する。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強く正電荷アルミニウムイ
オンに吸着される。アルミニウム塩は、２～３週間にわたってゆっくりと放出される抗原
の貯蔵部を確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、かつ／
または（おそらく尿酸の刺激により）先天性免疫機構を刺激し得る。例えば、Ｌａｍｂｒ
ｅｃｈｔら，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照のこと
。
【0110】
一価のバルク水性コンジュゲートは、典型的には一緒にブレンドし、目標の１６μｇ／
ｍＬまで希釈する６Ｂ以外、全ての血清型を目標の８μｇ／ｍＬまで希釈する。希釈した
ら、バッチを濾過滅菌し、等容量のリン酸アルミニウムアジュバントを、目標とする最終
アルミニウム濃度２５０μｇ／ｍＬまで無菌的に添加する。アジュバントを加えた配合バ
ッチを、単回使用の０．５ｍＬ／用量バイアルに充填する。
ｍＬまで希釈する６Ｂ以外、全ての血清型を目標の８μｇ／ｍＬまで希釈する。希釈した
ら、バッチを濾過滅菌し、等容量のリン酸アルミニウムアジュバントを、目標とする最終
アルミニウム濃度２５０μｇ／ｍＬまで無菌的に添加する。アジュバントを加えた配合バ
ッチを、単回使用の０．５ｍＬ／用量バイアルに充填する。
【0111】
特定の実施形態において、アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、Ｃ
ｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ
ＯＤＮ）である。別の実施形態において、アジュバントは、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯＤＮ１８２６である。
ｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ
ＯＤＮ）である。別の実施形態において、アジュバントは、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯＤＮ１８２６である。
【0112】
「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌ
クレオチド」および類似の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含有する６～５０ヌクレオチ
ド長のヌクレオチド分子を指す。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃ
ｉｎｅ ２１：４２９７を参照のこと。別の実施形態では、この用語の任意の他の技術分
野で認められた定義が意図される。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、任意の合成ヌクレ
オシド間結合を用いた修飾オリゴヌクレオチド、修飾塩基および／または修飾糖を含む。
クレオチド」および類似の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含有する６～５０ヌクレオチ
ド長のヌクレオチド分子を指す。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃ
ｉｎｅ ２１：４２９７を参照のこと。別の実施形態では、この用語の任意の他の技術分
野で認められた定義が意図される。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、任意の合成ヌクレ
オシド間結合を用いた修飾オリゴヌクレオチド、修飾塩基および／または修飾糖を含む。
【0113】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ｓｕ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４－９３；Ｖｅｒｔ
ｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９－５８；およ
びＹａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃ
ａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：８９－１１０に記載されている。
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４－９３；Ｖｅｒｔ
ｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９－５８；およ
びＹａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃ
ａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：８９－１１０に記載されている。
【0114】
投与／投薬量
本発明の組成物および配合物は、全身経路または粘膜経路によりワクチンを投与するこ
とによって、感染、例えば肺炎球菌感染にかかりやすいヒトを保護または処置するために
使用することができる。一実施形態において、本発明は、免疫学的有効量の本発明の免疫
原性組成物をヒトに投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する
免疫応答の誘導方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、免疫学的有効量の本
発明の免疫原性組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒトに肺炎球菌感染に対するワクチ
ンを接種する方法を提供する。
本発明の組成物および配合物は、全身経路または粘膜経路によりワクチンを投与するこ
とによって、感染、例えば肺炎球菌感染にかかりやすいヒトを保護または処置するために
使用することができる。一実施形態において、本発明は、免疫学的有効量の本発明の免疫
原性組成物をヒトに投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する
免疫応答の誘導方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、免疫学的有効量の本
発明の免疫原性組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒトに肺炎球菌感染に対するワクチ
ンを接種する方法を提供する。
【0115】
特定のワクチンに最適な成分量は、被検体における適切な免疫応答の観察を伴う標準的
な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトへのワクチ
ン接種のための投薬量は、動物試験をヒトのデータに外挿することによって決定される。
別の実施形態において、この投薬量は経験的に決定される。このワクチンが乳児アカゲザ
ルの動物データにおいて免疫原性であることを証明した。
な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトへのワクチ
ン接種のための投薬量は、動物試験をヒトのデータに外挿することによって決定される。
別の実施形態において、この投薬量は経験的に決定される。このワクチンが乳児アカゲザ
ルの動物データにおいて免疫原性であることを証明した。
【0116】
本発明の組成物の「有効量」は、後の攻撃の間に、微生物、例えば肺炎連鎖球菌の感染
の尤度または重症度を有意に低下させる抗体を誘導するのに必要とされる用量を指す。
の尤度または重症度を有意に低下させる抗体を誘導するのに必要とされる用量を指す。
【0117】
本発明の方法は、侵襲性感染（髄膜炎、肺炎および菌血症）と非侵襲性感染（急性中耳
炎および副鼻腔炎）の両方を含む、微生物、例えば肺炎連鎖球菌によって引き起こされる
主要な臨床症候群の予防および／または軽減のために使用できる。
炎および副鼻腔炎）の両方を含む、微生物、例えば肺炎連鎖球菌によって引き起こされる
主要な臨床症候群の予防および／または軽減のために使用できる。
【0118】
本発明の組成物の投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射；または
口道／消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与のうちの１つ以上を含み得る。一実施
形態において、鼻腔内投与は、肺炎または中耳炎の処置に使用される（肺炎球菌の鼻咽頭
保菌をより効果的に予防し、それにより、最初期段階で感染を軽減することができるため
）。
口道／消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与のうちの１つ以上を含み得る。一実施
形態において、鼻腔内投与は、肺炎または中耳炎の処置に使用される（肺炎球菌の鼻咽頭
保菌をより効果的に予防し、それにより、最初期段階で感染を軽減することができるため
）。
【0119】
各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、著しい悪影響なしに免疫防御応答を誘導す
る量として選択される。かかる量は、肺炎球菌の血清型に応じて異なり得る。一般的に、
多糖類をベースとするコンジュゲートについて、各用量は、各多糖を０．１～１００μｇ
、詳細には０．１～１０μｇ、より詳細には１～５μｇ含む。例えば、各用量は、１００
、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、または７５０ｎｇまたは１、１．
５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１０
０μｇを含み得る。
る量として選択される。かかる量は、肺炎球菌の血清型に応じて異なり得る。一般的に、
多糖類をベースとするコンジュゲートについて、各用量は、各多糖を０．１～１００μｇ
、詳細には０．１～１０μｇ、より詳細には１～５μｇ含む。例えば、各用量は、１００
、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、または７５０ｎｇまたは１、１．
５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１０
０μｇを含み得る。
【0120】
特定のワクチンに最適な成分量は、被検体における適切な免疫応答の観察を伴う標準的
な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトへのワクチ
ン接種のための投薬量は、動物試験をヒトのデータに外挿することによって決定される。
別の実施形態において、この投薬量は経験的に決定される。
な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトへのワクチ
ン接種のための投薬量は、動物試験をヒトのデータに外挿することによって決定される。
別の実施形態において、この投薬量は経験的に決定される。
【0121】
一実施形態において、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０
、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００もしくは７００μｇ、または
１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ以上である。更に別の実施形態において、上記のミ
ョウバン塩の用量は、組換えタンパク質１μｇ当たりの用量である。
、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００もしくは７００μｇ、または
１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ以上である。更に別の実施形態において、上記のミ
ョウバン塩の用量は、組換えタンパク質１μｇ当たりの用量である。
【0122】
本発明のいずれかの方法によれば、かつ、一実施態様において、被検体はヒトである。
特定の実施形態において、ヒト被検体は乳児（１歳未満）、幼児（約１２～２４ヶ月）ま
たは小児（約２～５歳）である。他の実施形態において、ヒト被検体は高齢の被検体（例
えば、５０歳を超えるまたは６５歳を超える）である。本発明の組成物はまた、年長児、
青年および成人（例えば、１８～４５歳または１８～６５歳）での使用にも適している。
特定の実施形態において、ヒト被検体は乳児（１歳未満）、幼児（約１２～２４ヶ月）ま
たは小児（約２～５歳）である。他の実施形態において、ヒト被検体は高齢の被検体（例
えば、５０歳を超えるまたは６５歳を超える）である。本発明の組成物はまた、年長児、
青年および成人（例えば、１８～４５歳または１８～６５歳）での使用にも適している。
【0123】
本発明の方法の一実施形態において、本発明の組成物は単回接種物として投与される。
別の実施形態において、ワクチンは、十分に間隔をあけて、２回、３回、４回またはそれ
以上投与される。例えば、当該組成物は、１、２、３、４、５もしくは６ヶ月間隔で、ま
たはその任意の組み合わせの間隔で投与することができる。免疫化スケジュールは、肺炎
球菌ワクチン用に指定されたものに従ったスケジュールであり得る。例えば、肺炎連鎖球
菌によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児および幼児の常套的なスケジュールは
、年齢が２、４、６および１２～１５ヶ月のときである。したがって、一実施形態におい
て、組成物は、年齢が２、４、６および１２～１５ヶ月のときに４回シリーズとして投与
される。
別の実施形態において、ワクチンは、十分に間隔をあけて、２回、３回、４回またはそれ
以上投与される。例えば、当該組成物は、１、２、３、４、５もしくは６ヶ月間隔で、ま
たはその任意の組み合わせの間隔で投与することができる。免疫化スケジュールは、肺炎
球菌ワクチン用に指定されたものに従ったスケジュールであり得る。例えば、肺炎連鎖球
菌によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児および幼児の常套的なスケジュールは
、年齢が２、４、６および１２～１５ヶ月のときである。したがって、一実施形態におい
て、組成物は、年齢が２、４、６および１２～１５ヶ月のときに４回シリーズとして投与
される。
【0124】
本発明の組成物はまた、肺炎連鎖球菌に由来する１つ以上のタンパク質を含んでいても
よい。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０８３８
５５号および同第０２／０５３７６１号に特定されているものが挙げられる。
よい。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０８３８
５５号および同第０２／０５３７６１号に特定されているものが挙げられる。
【0125】
配合物
本発明の組成物は、非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮膚内、鼻内、皮
下、腹腔内などの当業者に知られている１つ以上の方法によって被検体に投与され、それ
に応じて配合され得る。
本発明の組成物は、非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮膚内、鼻内、皮
下、腹腔内などの当業者に知られている１つ以上の方法によって被検体に投与され、それ
に応じて配合され得る。
【0126】
一実施形態において、本発明の組成物は、液体製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、
動脈内、皮下注射、または気道内粘膜注射により投与される。注射用の液体配合物には溶
液などが含まれる。
動脈内、皮下注射、または気道内粘膜注射により投与される。注射用の液体配合物には溶
液などが含まれる。
【0127】
本発明の組成物は、単回投与バイアル、複数回投与バイアルとして、またはプレフィル
ドシリンジとして配合することができる。
ドシリンジとして配合することができる。
【0128】
別の実施形態において、本発明の組成物は経口投与されるので、経口投与に適した形態
で、すなわち固体または液体製剤として配合される。固体経口配合物としては、錠剤、カ
プセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。液体経口配合物としては、液剤
、懸濁剤、分散剤、乳剤、油剤などが挙げられる。
で、すなわち固体または液体製剤として配合される。固体経口配合物としては、錠剤、カ
プセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。液体経口配合物としては、液剤
、懸濁剤、分散剤、乳剤、油剤などが挙げられる。
【0129】
液体配合物用の薬学的に許容される担体は、水性もしくは非水性溶液、懸濁液、乳濁液
または油である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アル
コール／水溶液、乳液または懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。
油の例は、動物性、植物性、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリー
ブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵からの脂質である。
または油である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アル
コール／水溶液、乳液または懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。
油の例は、動物性、植物性、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリー
ブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵からの脂質である。
【0130】
医薬組成物は、等張性、低張性または高張性であり得る。しかしながら、注入または注
射用の医薬組成物は、投与時に本質的に等張性であることが好ましい場合が多い。したが
って、保存のために、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性であり得る。医薬組
成物が保存のために高張性である場合、投与前に等張液になるように希釈するのがよい。
射用の医薬組成物は、投与時に本質的に等張性であることが好ましい場合が多い。したが
って、保存のために、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性であり得る。医薬組
成物が保存のために高張性である場合、投与前に等張液になるように希釈するのがよい。
【0131】
等張剤は、塩などのイオン性等張剤であっても、炭水化物などの非イオン性等張剤であ
ってもよい。イオン性等張化剤の例としては、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇ
Ｃｌ２が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性等張化剤の例としては、マン
ニトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
ってもよい。イオン性等張化剤の例としては、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇ
Ｃｌ２が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性等張化剤の例としては、マン
ニトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0132】
少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤がバッファーであることもまた好ましい。
いくつかの目的のために、例えば、医薬組成物が注入または注射用である場合、この組成
物はバッファーを含むことがしばしば望ましく、このバッファーは溶液を処理してｐＨ４
～１０、例えば５～９（６～８など）にすることができる。
いくつかの目的のために、例えば、医薬組成物が注入または注射用である場合、この組成
物はバッファーを含むことがしばしば望ましく、このバッファーは溶液を処理してｐＨ４
～１０、例えば５～９（６～８など）にすることができる。
【0133】
バッファーは、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、
酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハ
ク酸塩およびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択してもよい。
酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハ
ク酸塩およびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択してもよい。
【0134】
更に、バッファーは、例えば、特に医薬配合物が非経口使用のためのものである場合、
非経口使用のためのＵＳＰ適合バッファーから選択してもよい。例えば、バッファーは、
一塩基酸、例えば、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸；二塩基酸、
例えば、アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、
コハク酸および酒石酸；多塩基酸、例えば、クエン酸およびリン酸；ならびに、塩基、例
えば、アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびＴＲＩ
Ｓ、からなる群から選択され得る。
非経口使用のためのＵＳＰ適合バッファーから選択してもよい。例えば、バッファーは、
一塩基酸、例えば、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸；二塩基酸、
例えば、アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、
コハク酸および酒石酸；多塩基酸、例えば、クエン酸およびリン酸；ならびに、塩基、例
えば、アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびＴＲＩ
Ｓ、からなる群から選択され得る。
【0135】
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内または筋肉内注射用）には、塩化ナトリウム溶
液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液お
よび不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給剤、リンゲルデキ
ストロースをベースとするものなどの電解質補給剤などが含まれる。例は、界面活性剤お
よび他の薬学的に許容されるアジュバントを添加したまたは添加していない、水や油など
の無菌液体である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液
、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、ポリソルベー
ト８０（ＰＳ－８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ－２０）、およびポロキサマー１８８
（Ｐ１８８）が好ましい液体担体であり、特に注射液用である。油の例は、動物性、植物
性、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝
油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵からの脂質である。
液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液お
よび不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給剤、リンゲルデキ
ストロースをベースとするものなどの電解質補給剤などが含まれる。例は、界面活性剤お
よび他の薬学的に許容されるアジュバントを添加したまたは添加していない、水や油など
の無菌液体である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液
、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、ポリソルベー
ト８０（ＰＳ－８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ－２０）、およびポロキサマー１８８
（Ｐ１８８）が好ましい液体担体であり、特に注射液用である。油の例は、動物性、植物
性、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝
油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵からの脂質である。
【0136】
本発明の配合物はまた界面活性剤を含有し得る。界面活性剤としては、ポリオキシエチ
レンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にＰＳ－２０お
よびＰＳ－８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（Ｅ
Ｏ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマ
ー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール、これは反復エトキシ
（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数が異なり、オクトキシノール－９（トリトンＸ
－１００、またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（
オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４
０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）Ｎ
Ｐシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリ
ルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルア
ルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）から誘導されたポリオキシエチレン脂肪
族エーテル；およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノ
ラウレートのようなソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られている）が挙げら
れるが、これらに限定されない。乳剤に包含させるのに好ましい界面活性剤はＰＳ－８０
である。
レンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にＰＳ－２０お
よびＰＳ－８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（Ｅ
Ｏ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマ
ー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール、これは反復エトキシ
（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数が異なり、オクトキシノール－９（トリトンＸ
－１００、またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（
オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４
０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）Ｎ
Ｐシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリ
ルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルア
ルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）から誘導されたポリオキシエチレン脂肪
族エーテル；およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノ
ラウレートのようなソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られている）が挙げら
れるが、これらに限定されない。乳剤に包含させるのに好ましい界面活性剤はＰＳ－８０
である。
【0137】
ＰＳ－８０／スパン８５混合物などの界面活性剤の混合物を使用することができる。ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ－８０）のようなポリオキシエチレン
ソルビタンエステルと、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適している。別の有用な組み合
わせは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキ
シノールとを含む。
リオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ－８０）のようなポリオキシエチレン
ソルビタンエステルと、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適している。別の有用な組み合
わせは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキ
シノールとを含む。
【0138】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は以下の通りである：ポリオキシエチレンソルビタ
ンエステル（例えばＰＳ－８０）０．０１～１％、特に約０．１％。オクチル－またはノ
ニルフェノキシポリオキシエタノール（トリトンＸ－１００、またはトリトンシリーズの
他の洗剤など）０．００１～０．１％、特に０．００５～０．０２％。ポリオキシエチレ
ンエーテル（例えばラウレス９）０．１～２０％、好ましくは０．１～１０％、特に０．
１～１％または約０．５％。
ンエステル（例えばＰＳ－８０）０．０１～１％、特に約０．１％。オクチル－またはノ
ニルフェノキシポリオキシエタノール（トリトンＸ－１００、またはトリトンシリーズの
他の洗剤など）０．００１～０．１％、特に０．００５～０．０２％。ポリオキシエチレ
ンエーテル（例えばラウレス９）０．１～２０％、好ましくは０．１～１０％、特に０．
１～１％または約０．５％。
【0139】
特定の実施形態において、組成物は、ヒスチジン（２０ｍＭ）、生理食塩水（１５０ｍ
Ｍ）、およびｐＨ５．８の０．０２％ＰＳ－２０または０．０４％ＰＳ－８０と、２５０
μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）とから本質的になる。ＰＳ－２
０は、模擬製造中および一次包装を使用した出荷中の配合制御凝集においてＰＳ－２０ま
たはＰＳ－８０の存在下で０．００５％～０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。プロセ
スは、ヒスチジン、生理食塩水、およびＰＳ－２０またはＰＳ－８０中の最大２４の血清
型のブレンドを組み合わせ、次いで抗菌防腐剤を用いてまたは用いずにこのブレンド材料
をＡＰＡおよび生理食塩水と組み合わせることからなる。
Ｍ）、およびｐＨ５．８の０．０２％ＰＳ－２０または０．０４％ＰＳ－８０と、２５０
μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）とから本質的になる。ＰＳ－２
０は、模擬製造中および一次包装を使用した出荷中の配合制御凝集においてＰＳ－２０ま
たはＰＳ－８０の存在下で０．００５％～０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。プロセ
スは、ヒスチジン、生理食塩水、およびＰＳ－２０またはＰＳ－８０中の最大２４の血清
型のブレンドを組み合わせ、次いで抗菌防腐剤を用いてまたは用いずにこのブレンド材料
をＡＰＡおよび生理食塩水と組み合わせることからなる。
【0140】
界面活性剤の選択は、異なる医薬品および原薬に対して最適化する必要があり得る。１
５種以上の血清型を有する多価ワクチンについては、ＰＳ－２０およびＰ１８８が好まし
い。コンジュゲートを製造するために使用される化学の選択もまた配合物の安定化におい
て重要な役割を果たし得る。特に、多価組成物中の異なる多糖タンパク質コンジュゲート
を調製するために使用されるコンジュゲーション反応が水性溶媒およびＤＭＳＯ溶媒の両
方を含む場合、特定の界面活性剤系が安定性に有意な差をもたらすことを見出した。ポリ
ソルベートタンパク質コンジュゲートの改善された安定性は、ポリソルベート２０単独で
、またはポリオールと組み合わせたポロキサマー１８８で見られた。
５種以上の血清型を有する多価ワクチンについては、ＰＳ－２０およびＰ１８８が好まし
い。コンジュゲートを製造するために使用される化学の選択もまた配合物の安定化におい
て重要な役割を果たし得る。特に、多価組成物中の異なる多糖タンパク質コンジュゲート
を調製するために使用されるコンジュゲーション反応が水性溶媒およびＤＭＳＯ溶媒の両
方を含む場合、特定の界面活性剤系が安定性に有意な差をもたらすことを見出した。ポリ
ソルベートタンパク質コンジュゲートの改善された安定性は、ポリソルベート２０単独で
、またはポリオールと組み合わせたポロキサマー１８８で見られた。
【0141】
特定の洗剤がどのように生物学的薬物を保護するかの正確なメカニズムはよく分かって
おらず、先験的に予測することはできない。可能な安定化メカニズムには、優先的水和、
優先的排除、生物学的薬物と表面との間の空気／液体界面の競合、表面張力、および／ま
たは凝集の種として働く疎水性パッチを隠すための生物学的薬剤との界面活性剤の直接会
合が含まれる。
おらず、先験的に予測することはできない。可能な安定化メカニズムには、優先的水和、
優先的排除、生物学的薬物と表面との間の空気／液体界面の競合、表面張力、および／ま
たは凝集の種として働く疎水性パッチを隠すための生物学的薬剤との界面活性剤の直接会
合が含まれる。
【0142】
ポロキサマーも本発明の組成物に使用することができる。ポロキサマーは、ポリオキシ
エチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接したポリオキシプロピレ
ン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロッ
クコポリマーである。ポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）としても知
られている。ポリマーブロックの長さをカスタマイズすることができるので、わずかに異
なる特性を有する多くの異なるポロキサマーが存在する。一般用語「ポロキサマー」につ
いて、これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）とそれに続く
３桁の数字で表記され、最初の２桁の数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおおよ
その分子質量を示す。最後の桁の数字×１０はポリオキシエチレン含有量のパーセンテー
ジを示す（例えば、Ｐ４０７＝４，０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量お
よび７０％ポリオキシエチレン含有量を有するポロキサマー）。商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
（登録商標）の場合、これらのコポリマーのコーディングは、室温でのその物理的形態を
定義するための文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、２桁
または３桁の数字が続く。数値表示の最初の桁の数字（３桁の数字のうちの２桁の数字）
に３００を掛けたものが、疎水性物質のおおよその分子量を示し、最後の桁の数字×１０
は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを示す（例えば、Ｌ６１＝１，８００ｇ
／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および１０％ポリオキシエチレン含有量を有す
るＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））。米国特許第３７４０４２１号を参照のこと。
エチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接したポリオキシプロピレ
ン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロッ
クコポリマーである。ポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）としても知
られている。ポリマーブロックの長さをカスタマイズすることができるので、わずかに異
なる特性を有する多くの異なるポロキサマーが存在する。一般用語「ポロキサマー」につ
いて、これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）とそれに続く
３桁の数字で表記され、最初の２桁の数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおおよ
その分子質量を示す。最後の桁の数字×１０はポリオキシエチレン含有量のパーセンテー
ジを示す（例えば、Ｐ４０７＝４，０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量お
よび７０％ポリオキシエチレン含有量を有するポロキサマー）。商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
（登録商標）の場合、これらのコポリマーのコーディングは、室温でのその物理的形態を
定義するための文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、２桁
または３桁の数字が続く。数値表示の最初の桁の数字（３桁の数字のうちの２桁の数字）
に３００を掛けたものが、疎水性物質のおおよその分子量を示し、最後の桁の数字×１０
は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを示す（例えば、Ｌ６１＝１，８００ｇ
／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および１０％ポリオキシエチレン含有量を有す
るＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））。米国特許第３７４０４２１号を参照のこと。
【0143】
ポロキサマーの例は、以下の一般式を有する：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
式中、ａブロックおよびｂブロックは以下の値を有する：
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） ポロキサマー ａ ｂ 分子量
Ｌ３１ ２ １６ １１００（平均）
Ｌ３５ １９００（平均）
Ｌ４４ＮＦ １２４ １２ ２０ ２０９０～２３６０
Ｌ６４ ２９００（平均）
Ｌ８１ ２８００（平均）
Ｌ１２１ ４４００（平均）
Ｐ１２３ ２０ ７０ ５７５０（平均）
Ｆ６８ＮＦ １８８ ８０ ２７ ７６８０～９５１０
Ｆ８７ＮＦ ２３７ ６４ ３７ ６８４０～８８３０
Ｆ１０８ＮＦ ３３８ １４１ ４４ １２７００～１７４００
Ｆ１２７ＮＦ ４０７ １０１ ５６ ９８４０～１４６００
本明細書で使用される場合、分子量単位はダルトン（Ｄａ）またはｇ／ｍｏｌである。
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
式中、ａブロックおよびｂブロックは以下の値を有する：
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） ポロキサマー ａ ｂ 分子量
Ｌ３１ ２ １６ １１００（平均）
Ｌ３５ １９００（平均）
Ｌ４４ＮＦ １２４ １２ ２０ ２０９０～２３６０
Ｌ６４ ２９００（平均）
Ｌ８１ ２８００（平均）
Ｌ１２１ ４４００（平均）
Ｐ１２３ ２０ ７０ ５７５０（平均）
Ｆ６８ＮＦ １８８ ８０ ２７ ７６８０～９５１０
Ｆ８７ＮＦ ２３７ ６４ ３７ ６８４０～８８３０
Ｆ１０８ＮＦ ３３８ １４１ ４４ １２７００～１７４００
Ｆ１２７ＮＦ ４０７ １０１ ５６ ９８４０～１４６００
本明細書で使用される場合、分子量単位はダルトン（Ｄａ）またはｇ／ｍｏｌである。
【0144】
好ましくは、ポロキサマーは一般に、１１００～１７，４００Ｄａ、７，５００～１５
，０００Ｄａ、または７，５００～１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ポロキサ
マーは、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７から選択することができる。配合
物中のポロキサマーの終濃度は、０．００１％～５％重量／容量、または０．０２５％～
１％重量／容量である。特定の態様において、ポリオールはプロピレングリコールであり
、１％～２０％重量／容量の終濃度である。特定の態様において、ポリオールはポリエチ
レングリコール４００であり、１％～２０％重量／容量の終濃度である。
，０００Ｄａ、または７，５００～１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ポロキサ
マーは、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７から選択することができる。配合
物中のポロキサマーの終濃度は、０．００１％～５％重量／容量、または０．０２５％～
１％重量／容量である。特定の態様において、ポリオールはプロピレングリコールであり
、１％～２０％重量／容量の終濃度である。特定の態様において、ポリオールはポリエチ
レングリコール４００であり、１％～２０％重量／容量の終濃度である。
【0145】
本発明の配合物に適したポリオールは、ポリマーポリオール、特に、プロピレングリコ
ールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを含む
がこれらに限定されないポリエーテルジオールである。プロピレングリコールは、～４２
５から～２７００までのモノマー分子量範囲で入手可能である。ポリエチレングリコール
およびポリエチレングリコールモノメチルエーテルもまた、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００
、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ６００、
ＰＥＧ ＭＭＥ ２０００、ＰＥＧ ＭＭＥ３３５０およびＰＥＧ ＭＭＥ ４０００を
含む（がこれらに限定されない）～２００から～３５０００までの範囲の分子量範囲で入
手可能である。好ましいポリエチレングリコールはポリエチレングリコール４００である
。本発明の配合物中のポリオールの終濃度は、１％～２０％重量／容量または６％～２０
％重量／容量であってもよい。
ールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを含む
がこれらに限定されないポリエーテルジオールである。プロピレングリコールは、～４２
５から～２７００までのモノマー分子量範囲で入手可能である。ポリエチレングリコール
およびポリエチレングリコールモノメチルエーテルもまた、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００
、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ６００、
ＰＥＧ ＭＭＥ ２０００、ＰＥＧ ＭＭＥ３３５０およびＰＥＧ ＭＭＥ ４０００を
含む（がこれらに限定されない）～２００から～３５０００までの範囲の分子量範囲で入
手可能である。好ましいポリエチレングリコールはポリエチレングリコール４００である
。本発明の配合物中のポリオールの終濃度は、１％～２０％重量／容量または６％～２０
％重量／容量であってもよい。
【0146】
配合物はまた、ｐＨ緩衝生理食塩水を含有する。バッファーは、例えば、ＴＲＩＳ、酢
酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸
塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロ
キシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）
プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリ
エタノールアミンバッファーからなる群から選択してもよい。バッファーは、溶液を処理
して４～１０、５．２～７．５、または５．８～７．０の範囲のｐＨにすることができる
。本発明のある態様において、バッファーは、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＭＥ
Ｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩またはクエン酸塩からなる群から選択される。更に、
バッファーは、例えば、特に医薬配合物が非経口用である場合、非経口用途のためのＵＳ
Ｐ適合バッファーから選択してもよい。バッファーの濃度は、１ｍＭ～５０ｍＭまたは５
ｍＭ～５０ｍＭ範囲であろう。特定の態様において、バッファーは、終濃度が５ｍＭ～５
０ｍＭヒスチジン、または終濃度が１ｍＭ～１０ｍＭコハク酸塩である。特定の態様にお
いて、ヒスチジンは終濃度が２０ｍＭ±２ｍＭである。
酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸
塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロ
キシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）
プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリ
エタノールアミンバッファーからなる群から選択してもよい。バッファーは、溶液を処理
して４～１０、５．２～７．５、または５．８～７．０の範囲のｐＨにすることができる
。本発明のある態様において、バッファーは、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＭＥ
Ｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩またはクエン酸塩からなる群から選択される。更に、
バッファーは、例えば、特に医薬配合物が非経口用である場合、非経口用途のためのＵＳ
Ｐ適合バッファーから選択してもよい。バッファーの濃度は、１ｍＭ～５０ｍＭまたは５
ｍＭ～５０ｍＭ範囲であろう。特定の態様において、バッファーは、終濃度が５ｍＭ～５
０ｍＭヒスチジン、または終濃度が１ｍＭ～１０ｍＭコハク酸塩である。特定の態様にお
いて、ヒスチジンは終濃度が２０ｍＭ±２ｍＭである。
【0147】
生理食塩水（すなわち、ＮａＣｌを含有する溶液）が好ましいが、配合物に適した他の
塩には、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２、ならびにそれらの組み合わせが含まれる
が、これらに限定されない。ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよび
グリセロールを含むがこれらに限定されない非イオン性等張化剤を塩の代わりに使用する
ことができる。適切な塩の範囲としては、２５ｍＭ～５００ｍＭまたは４０ｍＭ～１７０
ｍＭが挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様において、生理食塩水はＮａＣ
ｌであり、２０ｍＭ～１７０ｍＭ濃度で存在してもよい。
塩には、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２、ならびにそれらの組み合わせが含まれる
が、これらに限定されない。ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよび
グリセロールを含むがこれらに限定されない非イオン性等張化剤を塩の代わりに使用する
ことができる。適切な塩の範囲としては、２５ｍＭ～５００ｍＭまたは４０ｍＭ～１７０
ｍＭが挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様において、生理食塩水はＮａＣ
ｌであり、２０ｍＭ～１７０ｍＭ濃度で存在してもよい。
【0148】
一実施形態において、配合物は塩化ナトリウムを含むＬ－ヒスチジンバッファーを含む
。
。
【0149】
本明細書に記載の配合物の特定実施形態において、多糖－タンパク質コンジュゲートは
、担体タンパク質にコンジュゲートさせた１つ以上の肺炎球菌多糖を含む。担体タンパク
質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアト
キソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレ
ラトキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌由来の外毒素Ａ、およびそれらの組み合
わせから選択することができる。１つの態様において、全ての多糖－タンパク質コンジュ
ゲートは水溶性化学（ｃｈｅｍｉｓｔｙ）を用いて調製される。別の態様において、１つ
以上の多糖タンパク質コンジュゲートは、ＤＭＳＯ溶媒を用いて調製される。一例として
、多糖－タンパク質コンジュゲート配合物は、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ
、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ溶媒を用いて
調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タン
パク質コンジュゲートが水性溶媒を用いて調製される１５価肺炎球菌コンジュゲート（１
５ｖＰｎＣ）配合物であり得る。
、担体タンパク質にコンジュゲートさせた１つ以上の肺炎球菌多糖を含む。担体タンパク
質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアト
キソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレ
ラトキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌由来の外毒素Ａ、およびそれらの組み合
わせから選択することができる。１つの態様において、全ての多糖－タンパク質コンジュ
ゲートは水溶性化学（ｃｈｅｍｉｓｔｙ）を用いて調製される。別の態様において、１つ
以上の多糖タンパク質コンジュゲートは、ＤＭＳＯ溶媒を用いて調製される。一例として
、多糖－タンパク質コンジュゲート配合物は、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ
、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ溶媒を用いて
調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タン
パク質コンジュゲートが水性溶媒を用いて調製される１５価肺炎球菌コンジュゲート（１
５ｖＰｎＣ）配合物であり得る。
【0150】
別の実施形態において、医薬組成物は徐放系で送達される。例えば、薬剤は、静脈内注
入、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を用いて投与することができる。別の実
施形態において、ポリマー材料は、例えばミクロスフェア中またはインプラント中で使用
される。
入、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を用いて投与することができる。別の実
施形態において、ポリマー材料は、例えばミクロスフェア中またはインプラント中で使用
される。
【0151】
本発明の組成物はまた、肺炎連鎖球菌に由来する１つ以上のタンパク質を含んでいても
よい。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０８３８
５５号および同第０２／０５３７６１号に特定されているものが挙げられる。
よい。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０８３８
５５号および同第０２／０５３７６１号に特定されているものが挙げられる。
【0152】
添付の説明および図面を参照して本発明の様々な実施形態を説明したが、本発明はそれ
らの正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の範
囲または精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更および修正が行われ得る
ことを理解されたい。
らの正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の範
囲または精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更および修正が行われ得る
ことを理解されたい。
【0153】
以下の実施例が例証されるが、本発明を限定するものではない。
【0154】
［実施例］
実施例１：肺炎連鎖球菌莢膜多糖の調製
肺炎球菌の培養方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７
，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ １：５２を参照のこと。肺炎球菌莢膜多糖の調製方法もまた当該分野で周知である
。例えば、欧州特許第０４９７５２４号を参照のこと。肺炎球菌サブタイプの分離菌は、
アメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス）から入手可能である。当該細
菌は、莢膜を有し、非運動性であり、グラム陽性であり、ランセット形状の双球菌（血液
寒天上でα－溶血性である）として同定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたＱ
ｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいて識別することができる。例えば、米国特許第５，８４７，
１１２号を参照のこと。
実施例１：肺炎連鎖球菌莢膜多糖の調製
肺炎球菌の培養方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７
，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ １：５２を参照のこと。肺炎球菌莢膜多糖の調製方法もまた当該分野で周知である
。例えば、欧州特許第０４９７５２４号を参照のこと。肺炎球菌サブタイプの分離菌は、
アメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス）から入手可能である。当該細
菌は、莢膜を有し、非運動性であり、グラム陽性であり、ランセット形状の双球菌（血液
寒天上でα－溶血性である）として同定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたＱ
ｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいて識別することができる。例えば、米国特許第５，８４７，
１１２号を参照のこと。
【0155】
存在する各肺炎連鎖球菌血清型を表す細胞バンクを、Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ニュージャージー州ローウェー）から凍結バイアルにて入手した。
解凍した種培養物を、肺炎連鎖球菌に適切な予備滅菌した増殖媒体を入れた種発酵槽に移
した。培養物を温度およびｐＨ制御しながら種発酵槽中で増殖させた。種発酵槽の全容量
を、予備滅菌した増殖媒体を入れた生産発酵槽に移した。生産発酵は、プロセスの最後の
細胞増殖段階であった。温度、ｐＨおよび攪拌速度を制御した。
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ニュージャージー州ローウェー）から凍結バイアルにて入手した。
解凍した種培養物を、肺炎連鎖球菌に適切な予備滅菌した増殖媒体を入れた種発酵槽に移
した。培養物を温度およびｐＨ制御しながら種発酵槽中で増殖させた。種発酵槽の全容量
を、予備滅菌した増殖媒体を入れた生産発酵槽に移した。生産発酵は、プロセスの最後の
細胞増殖段階であった。温度、ｐＨおよび攪拌速度を制御した。
【0156】
不活化剤の添加により発酵プロセスを終了させた。不活化後、バッチを不活化タンクに
移し、制御された温度および攪拌下で保持した。遠心分離と濾過の組み合わせを用いて細
胞残屑を除去した。バッチを限外濾過および透析濾過した。次いで、バッチを溶媒での分
別に供し、これによって不純物を除去し、多糖を回収した。
移し、制御された温度および攪拌下で保持した。遠心分離と濾過の組み合わせを用いて細
胞残屑を除去した。バッチを限外濾過および透析濾過した。次いで、バッチを溶媒での分
別に供し、これによって不純物を除去し、多糖を回収した。
【0157】
実施例２：水溶液中での還元アミノ化を用いた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７
Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３ＦのＣＲＭ１９７
へのコンジュゲーション
異なる多糖血清型を、一般的なプロセスフローを用いて、精製ＣＲＭ１９７担体タンパ
ク質に個々にコンジュゲートさせる。多糖を溶解させ、サイズ縮小させ、化学的に活性化
させ、限外濾過によってバッファー交換する。次いで、精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物
中のＮｉＣｌ２（２ｍＭ）を利用して活性化多糖にコンジュゲートさせ、得られたコンジ
ュゲートを、限外濾過によって精製した後、０．２ミクロンフィルターで最終濾過した。
ｐＨ、温度、濃度および時間などの各工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下の
章では血清型特異的な値に制御される。
Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３ＦのＣＲＭ１９７
へのコンジュゲーション
異なる多糖血清型を、一般的なプロセスフローを用いて、精製ＣＲＭ１９７担体タンパ
ク質に個々にコンジュゲートさせる。多糖を溶解させ、サイズ縮小させ、化学的に活性化
させ、限外濾過によってバッファー交換する。次いで、精製ＣＲＭ１９７を、反応混合物
中のＮｉＣｌ２（２ｍＭ）を利用して活性化多糖にコンジュゲートさせ、得られたコンジ
ュゲートを、限外濾過によって精製した後、０．２ミクロンフィルターで最終濾過した。
ｐＨ、温度、濃度および時間などの各工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下の
章では血清型特異的な値に制御される。
【0158】
多糖のサイズ縮小および酸化
精製した肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．
４５ミクロンフィルターで濾過した。血清型１９Ａを除く全ての血清型を均質化して多糖
の分子質量を減少させた。血清型１９Ａは、その開始サイズが比較的小さいので、サイズ
縮小させなかった。血清型特異的分子質量を達成するために、均質化圧力およびホモジナ
イザーを通過する回数を、血清型特異的目標値（１５０～１０００ｂａｒ；４～７回通過
）に制御した。サイズ縮小させた多糖を０．２ミクロンフィルターで濾過し、次いで濃縮
し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対して透析濾過した。
精製した肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．
４５ミクロンフィルターで濾過した。血清型１９Ａを除く全ての血清型を均質化して多糖
の分子質量を減少させた。血清型１９Ａは、その開始サイズが比較的小さいので、サイズ
縮小させなかった。血清型特異的分子質量を達成するために、均質化圧力およびホモジナ
イザーを通過する回数を、血清型特異的目標値（１５０～１０００ｂａｒ；４～７回通過
）に制御した。サイズ縮小させた多糖を０．２ミクロンフィルターで濾過し、次いで濃縮
し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対して透析濾過した。
【0159】
次に、多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで血清型特異的温度（４～２２℃）および
ｐＨ（４～５）に調整して、活性化による多糖のサイズ減少を最小限に抑えた。全ての血
清型（血清型４を除く）について、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して
多糖活性化を開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり
、多糖反復単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約０．１～０．５モルの範囲であ
った。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、目標レベルの多糖活性化を達成
することであった（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数）。血清型４につい
ては、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する前に、バッチを約５０℃およびｐＨ４．１で
インキュベートして多糖を部分的に脱ケタール化した。
ｐＨ（４～５）に調整して、活性化による多糖のサイズ減少を最小限に抑えた。全ての血
清型（血清型４を除く）について、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して
多糖活性化を開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり
、多糖反復単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約０．１～０．５モルの範囲であ
った。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、目標レベルの多糖活性化を達成
することであった（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数）。血清型４につい
ては、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する前に、バッチを約５０℃およびｐＨ４．１で
インキュベートして多糖を部分的に脱ケタール化した。
【0160】
血清型５および７Ｆを除く全ての血清型について、活性化生成物を、１０ｋＤａのＮＭ
ＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対して透析
濾過した。血清型５および７Ｆを１０ｍＭ酢酸ナトリウムに対して透析濾過した。全ての
血清型についての限外濾過は、２～８℃で行われた。
ＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対して透析
濾過した。血清型５および７Ｆを１０ｍＭ酢酸ナトリウムに対して透析濾過した。全ての
血清型についての限外濾過は、２～８℃で行われた。
【0161】
ＣＲＭ１９７への多糖のコンジュゲーション
酸化した多糖溶液を、血清型に応じて、水および１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０
またはｐＨ７．０）と混合した。選択したバッファーのｐＨは、コンジュゲーション反応
中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。前述のように（国際公開第２０
１２／１７３８７６号）、シュードモナス・フルオレッセンスでの発現により得られた精
製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロンフィルターで濾過し、血清型に応じて０．４～１．０ｗ
／ｗの範囲の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で緩衝多糖溶液と組み合わせた。得られたコンジ
ュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比を制御するために質量比を選択した。多糖濃度お
よびリン酸濃度は、血清型特異的であり、血清型に応じてそれぞれ３．６～１０．０ｇ／
Ｌおよび１００～１５０ｍＭ範囲であった。得られたコンジュゲートのサイズを制御する
べく、血清型特異的多糖濃度を選択した。次いで、溶液を０．２ミクロンフィルターで濾
過した。１００ｍＭ塩化ニッケル溶液を用いて塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シア
ノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を添加した。コンジュゲ
ーションを血清型特異的期間（７２～１２０時間）進行させて、多糖およびタンパク質の
消費を最大にした。
酸化した多糖溶液を、血清型に応じて、水および１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０
またはｐＨ７．０）と混合した。選択したバッファーのｐＨは、コンジュゲーション反応
中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。前述のように（国際公開第２０
１２／１７３８７６号）、シュードモナス・フルオレッセンスでの発現により得られた精
製ＣＲＭ１９７を０．２ミクロンフィルターで濾過し、血清型に応じて０．４～１．０ｗ
／ｗの範囲の多糖対ＣＲＭ１９７質量比で緩衝多糖溶液と組み合わせた。得られたコンジ
ュゲートにおける多糖対ＣＲＭ１９７比を制御するために質量比を選択した。多糖濃度お
よびリン酸濃度は、血清型特異的であり、血清型に応じてそれぞれ３．６～１０．０ｇ／
Ｌおよび１００～１５０ｍＭ範囲であった。得られたコンジュゲートのサイズを制御する
べく、血清型特異的多糖濃度を選択した。次いで、溶液を０．２ミクロンフィルターで濾
過した。１００ｍＭ塩化ニッケル溶液を用いて塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シア
ノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を添加した。コンジュゲ
ーションを血清型特異的期間（７２～１２０時間）進行させて、多糖およびタンパク質の
消費を最大にした。
【0162】
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度まで希釈し、２～８℃
に冷却し、１．２ミクロンフィルターで濾過した。全ての血清型（血清型５を除く）を、
１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２～８℃で１００ｍＭリン酸カリ
ウム（ｐＨ７．０）に対して透析濾過した。次いで、保持液中に回収されたバッチを、約
２．０ｇ多糖／Ｌまで希釈し、１．２Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐ
Ｈ調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加した。
１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を後で加えた。１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流
限外濾過膜を使用して、血清型５を３００ｍＭリン酸カリウムに対して透析濾過した。
コンジュゲーション反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度まで希釈し、２～８℃
に冷却し、１．２ミクロンフィルターで濾過した。全ての血清型（血清型５を除く）を、
１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２～８℃で１００ｍＭリン酸カリ
ウム（ｐＨ７．０）に対して透析濾過した。次いで、保持液中に回収されたバッチを、約
２．０ｇ多糖／Ｌまで希釈し、１．２Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐ
Ｈ調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加した。
１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を後で加えた。１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流
限外濾過膜を使用して、血清型５を３００ｍＭリン酸カリウムに対して透析濾過した。
【0163】
最終濾過および製品保存
次に、バッチを濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して４℃で
１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して透析濾過
した。保持液バッチを０．２ミクロンフィルターで濾過した。
次に、バッチを濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して４℃で
１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して透析濾過
した。保持液バッチを０．２ミクロンフィルターで濾過した。
【0164】
血清型１９Ｆコンジュゲートを２２℃で約７日間インキュベートし、１００ｋＤａのＮ
ＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）
中１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して透析濾過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した
。
ＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）
中１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対して透析濾過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した
。
【0165】
バッチを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の更なる１０ｍＭ Ｌ－ヒスチ
ジンを用いて、１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、≦－
６０℃で凍結した。
ジンを用いて、１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、≦－
６０℃で凍結した。
【0166】
実施例３：ジメチルスルホキシド中での還元アミノ化を用いた血清型３、４、６Ａ、６
Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３ＦのＣＲＭ
１９７へのコンジュゲーション方法
異なる多糖血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、
２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを、一般的なプロセスフローを用いて、精製ＣＲＭ１９７担
体タンパク質に個々にコンジュゲートさせる。多糖を溶解させ、目標とする分子質量にサ
イジングし、化学的に活性化させ、限外濾過によってバッファー交換する。活性化多糖お
よび精製ＣＲＭ１９７を個々に凍結乾燥させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶
解させた。次いで、再溶解した多糖溶液およびＣＲＭ１９７溶液を下記のように組み合わ
せてコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを限外濾過によって精製し、その後
、０．２ミクロンフィルターで最終濾過を行った。ｐＨ、温度、濃度および時間などの各
工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下の章では血清型特異的な値に制御される
。
Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３ＦのＣＲＭ
１９７へのコンジュゲーション方法
異なる多糖血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、
２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを、一般的なプロセスフローを用いて、精製ＣＲＭ１９７担
体タンパク質に個々にコンジュゲートさせる。多糖を溶解させ、目標とする分子質量にサ
イジングし、化学的に活性化させ、限外濾過によってバッファー交換する。活性化多糖お
よび精製ＣＲＭ１９７を個々に凍結乾燥させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶
解させた。次いで、再溶解した多糖溶液およびＣＲＭ１９７溶液を下記のように組み合わ
せてコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを限外濾過によって精製し、その後
、０．２ミクロンフィルターで最終濾過を行った。ｐＨ、温度、濃度および時間などの各
工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下の章では血清型特異的な値に制御される
。
【0167】
多糖のサイズ縮小および酸化
精製した肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．
４５ミクロンフィルターで濾過した。血清型１８Ｃおよび１９Ａを除く全ての血清型を均
質化してＰｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数
は、血清型特異的目標値（１５０～１０００ｂａｒ；４～７回の通過）に制御された。血
清型１８Ｃは、９０℃以上での酸加水分解によりサイズ縮小された。
精製した肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．
４５ミクロンフィルターで濾過した。血清型１８Ｃおよび１９Ａを除く全ての血清型を均
質化してＰｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数
は、血清型特異的目標値（１５０～１０００ｂａｒ；４～７回の通過）に制御された。血
清型１８Ｃは、９０℃以上での酸加水分解によりサイズ縮小された。
【0168】
サイズ縮小させた多糖を０．２ミクロンフィルターで濾過し、次いで濃縮し、１０ｋＤ
ａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対して透析濾過した。５ｋＤａのＮＭＷ
ＣＯ膜を血清型１８Ｃのために使用した。
ａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対して透析濾過した。５ｋＤａのＮＭＷ
ＣＯ膜を血清型１８Ｃのために使用した。
【0169】
次に、多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで血清型特異的温度（４～２２℃）および
ｐＨ（４～５）に調整して、活性化による多糖のサイズ減少を最小限に抑えた。全ての血
清型（血清型４を除く）について、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して
多糖活性化を開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり
、多糖反復単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約０．１～０．５モルの範囲であ
った。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、目標レベルの多糖活性化を達成
することであった（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数）。血清型４につい
ては、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する前に、バッチを約５０℃およびｐＨ４．１で
インキュベートして多糖を部分的に脱ケタール化した。
ｐＨ（４～５）に調整して、活性化による多糖のサイズ減少を最小限に抑えた。全ての血
清型（血清型４を除く）について、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して
多糖活性化を開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり
、多糖反復単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約０．１～０．５モルの範囲であ
った。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、目標レベルの多糖活性化を達成
することであった（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数）。血清型４につい
ては、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する前に、バッチを約５０℃およびｐＨ４．１で
インキュベートして多糖を部分的に脱ケタール化した。
【0170】
活性化生成物を、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭリン酸
カリウム（ｐＨ６．４）に対して透析濾過し、次いで、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用
して水に対して透析濾過または透析した。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を血清型１８Ｃのため
に使用した。全ての血清型についての限外濾過または透析は、２～８℃で行われた。
カリウム（ｐＨ６．４）に対して透析濾過し、次いで、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用
して水に対して透析濾過または透析した。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を血清型１８Ｃのため
に使用した。全ての血清型についての限外濾過または透析は、２～８℃で行われた。
【0171】
ＣＲＭ１９７への多糖のコンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、シュードモナス・
フルオレッセンスでの発現を通して得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａのＮＭＷＣＯ
接線流限外濾過膜を使用して２～５ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）バッファーに対して透析濾
過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した。
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、シュードモナス・
フルオレッセンスでの発現を通して得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａのＮＭＷＣＯ
接線流限外濾過膜を使用して２～５ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）バッファーに対して透析濾
過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した。
【0172】
血清型３以外の血清型については、酸化多糖を水中において６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬおよび
５％ｗ／ｖショ糖（５０ｍｇショ糖／ｍＬ）で配合した。血清型３については、酸化多糖
を水中において２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬおよび１０％ｗ／ｖショ糖（１００ｍｇショ糖／ｍＬ
）で配合した。タンパク質溶液を、リン酸バッファー中において６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬおよ
び１％ｗ／ｖショ糖（１０ｍｇショ糖／ｍＬ）で配合した。
５％ｗ／ｖショ糖（５０ｍｇショ糖／ｍＬ）で配合した。血清型３については、酸化多糖
を水中において２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬおよび１０％ｗ／ｖショ糖（１００ｍｇショ糖／ｍＬ
）で配合した。タンパク質溶液を、リン酸バッファー中において６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬおよ
び１％ｗ／ｖショ糖（１０ｍｇショ糖／ｍＬ）で配合した。
【0173】
配合したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個々に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよび
ＣＲＭ１９７材料をＤＭＳＯに再溶解し、混合ティーを用いて組み合わせた。シアノ水素
化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーション
を血清型特異的期間（１～４８時間）進行させて、目標とするコンジュゲートサイズを達
成した。
ＣＲＭ１９７材料をＤＭＳＯに再溶解し、混合ティーを用いて組み合わせた。シアノ水素
化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーション
を血清型特異的期間（１～４８時間）進行させて、目標とするコンジュゲートサイズを達
成した。
【0174】
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後に、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２
モル）を添加した。約４℃で約０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を用いてま
たは用いずに、バッチを１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に希釈した。次に、リン酸カリウム
バッファーを加えてｐＨを中和した。血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９
Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆについては、バッチを濃縮し、３０ｋＤａのＮ
ＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、約４℃で２５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７）を用
いてまたは用いずに、１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析濾過した。
コンジュゲーション反応後に、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２
モル）を添加した。約４℃で約０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を用いてま
たは用いずに、バッチを１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に希釈した。次に、リン酸カリウム
バッファーを加えてｐＨを中和した。血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９
Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆについては、バッチを濃縮し、３０ｋＤａのＮ
ＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、約４℃で２５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７）を用
いてまたは用いずに、１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析濾過した。
【0175】
最終濾過および製品保存
血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを
濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、４℃で０．０１５％（
ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を用いてまたは用いずに、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ
７．０）中１０ｍＭヒスチジンに対して透析濾過した。保持液バッチを０．２ミクロンフ
ィルターで濾過した。
血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを
濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、４℃で０．０１５％（
ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を用いてまたは用いずに、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ
７．０）中１０ｍＭヒスチジンに対して透析濾過した。保持液バッチを０．２ミクロンフ
ィルターで濾過した。
【0176】
血清型１９Ｆを約５日間インキュベートし、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過
膜を使用して約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭヒスチジンに
対して透析濾過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した。
膜を使用して約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭヒスチジンに
対して透析濾過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した。
【0177】
血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび
３３Ｆを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の更なる１０ｍＭヒスチジンで希
釈し、アリコートに分注し、≦－６０℃で凍結した。
３３Ｆを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の更なる１０ｍＭヒスチジンで希
釈し、アリコートに分注し、≦－６０℃で凍結した。
【0178】
血清型４および１４を、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して、約４℃で１５０ｍＭ
塩化ナトリウムに対して透析し、０．２ミクロンフィルターで濾過し、アリコートに分注
し、≦－６０℃で凍結した。
塩化ナトリウムに対して透析し、０．２ミクロンフィルターで濾過し、アリコートに分注
し、≦－６０℃で凍結した。
【0179】
実施例４：コンジュゲートの分析
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを用いたコンジュゲートの分子量および濃
度分析
コンジュゲート試料を注入し、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）に
よって分離した。検出は、直列の紫外線（ＵＶ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）および屈折
率（ＲＩ）検出器を用いて達成された。タンパク質濃度は、吸光係数を用いてＵＶ２８０
から計算した。溶液の屈折率の変化と溶質濃度の変化（ｍＬ／ｇで報告）であるｄｎ／ｄ
ｃ係数を使用して、多糖濃度をＲＩシグナル（タンパク質と多糖の両方によって寄与）か
らデコンボリュートした。試料の平均分子量は、全試料ピークにわたる測定濃度および光
散乱情報を使用して、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンタバーバラ）により計算した。
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを用いたコンジュゲートの分子量および濃
度分析
コンジュゲート試料を注入し、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）に
よって分離した。検出は、直列の紫外線（ＵＶ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）および屈折
率（ＲＩ）検出器を用いて達成された。タンパク質濃度は、吸光係数を用いてＵＶ２８０
から計算した。溶液の屈折率の変化と溶質濃度の変化（ｍＬ／ｇで報告）であるｄｎ／ｄ
ｃ係数を使用して、多糖濃度をＲＩシグナル（タンパク質と多糖の両方によって寄与）か
らデコンボリュートした。試料の平均分子量は、全試料ピークにわたる測定濃度および光
散乱情報を使用して、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンタバーバラ）により計算した。
【0180】
多糖活性化度アッセイ
コンジュゲーションは、活性化アルデヒドと、主に担体タンパク質上のリシン残基との
還元的アミノ化によって生じる。多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数で表さ
れる活性化のレベルは、コンジュゲーション反応を制御するために重要である。活性化度
を測定するためのアッセイは、米国特許公開第２０１７／００２１００６号に記載されて
いる。
コンジュゲーションは、活性化アルデヒドと、主に担体タンパク質上のリシン残基との
還元的アミノ化によって生じる。多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数で表さ
れる活性化のレベルは、コンジュゲーション反応を制御するために重要である。活性化度
を測定するためのアッセイは、米国特許公開第２０１７／００２１００６号に記載されて
いる。
【0181】
アルデヒド基（多糖の過ヨウ素酸塩酸化中に生成される）とチオセミカルバジド（商業
的供給源から入手可能）との反応に基づいて活性化度を測定するために内部アッセイを開
発した。
的供給源から入手可能）との反応に基づいて活性化度を測定するために内部アッセイを開
発した。
【0182】
定量化は、ＮＭＲ（核磁気共鳴）によって、または誘導体化多糖を適切な参照標準と比
較することによって、および／または誘導体の吸光係数を使用することによって達成する
ことができる。このアッセイの吸光係数の使用は、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法
での使用と似ている。
較することによって、および／または誘導体の吸光係数を使用することによって達成する
ことができる。このアッセイの吸光係数の使用は、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法
での使用と似ている。
【0183】
一般に、アッセイは、以下の反応条件下で実行することができる。
【0184】
時間：０．５時間～３５時間（これは血清型特異的であるが、反応は完了まで、すなわ
ち時間経過においてプラトーになるまで続けられる）
温度：１５～３７℃、好ましくはおよそ２１～２７℃
ＴＳＣ濃度：１～５ｍｇ／ｍＬ
反応のｐＨ：ｐＨ３～５．５、好ましくは４．０
実施例４については、多糖を１．２５～２．５ｍｇ／ｍＬのチオセミカルバジド（ＴＳ
Ｃ）を用いてｐＨ４．０で誘導体化して発色団を導入した（血清型１、５、および９Ｖ用
の活性化多糖の誘導体化は１．２５ｍｇ／ｍＬのＴＳＣを使用）。誘導体化反応をプラト
ーに達するまで進行させた。実際の時間は、各血清型の反応速度に応じて異なった。次い
で、ＴＳＣ－Ｐｓを、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによってＴＳＣおよび他の低
分子量成分から分離した。シグナルは２６６ｎｍのＵＶ吸光度により検出された。活性化
アルデヒドのレベルは、Ｍｏｎｏ－ＴＳＣの標準曲線注入に対して、または所定の吸光係
数を直接用いて計算される。Ｍｏｎｏ－ＴＳＣは、単糖の合成チオセミカルバゾン誘導体
である。次いで、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイにより測定されたＰｓ濃度
を用いて、アルデヒドレベルを反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数（Ａｌｄ／Ｒ
Ｕ）に変換する。
ち時間経過においてプラトーになるまで続けられる）
温度：１５～３７℃、好ましくはおよそ２１～２７℃
ＴＳＣ濃度：１～５ｍｇ／ｍＬ
反応のｐＨ：ｐＨ３～５．５、好ましくは４．０
実施例４については、多糖を１．２５～２．５ｍｇ／ｍＬのチオセミカルバジド（ＴＳ
Ｃ）を用いてｐＨ４．０で誘導体化して発色団を導入した（血清型１、５、および９Ｖ用
の活性化多糖の誘導体化は１．２５ｍｇ／ｍＬのＴＳＣを使用）。誘導体化反応をプラト
ーに達するまで進行させた。実際の時間は、各血清型の反応速度に応じて異なった。次い
で、ＴＳＣ－Ｐｓを、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによってＴＳＣおよび他の低
分子量成分から分離した。シグナルは２６６ｎｍのＵＶ吸光度により検出された。活性化
アルデヒドのレベルは、Ｍｏｎｏ－ＴＳＣの標準曲線注入に対して、または所定の吸光係
数を直接用いて計算される。Ｍｏｎｏ－ＴＳＣは、単糖の合成チオセミカルバゾン誘導体
である。次いで、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイにより測定されたＰｓ濃度
を用いて、アルデヒドレベルを反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数（Ａｌｄ／Ｒ
Ｕ）に変換する。
【0185】
誘導体が有意なＵＶ吸収を有する限り、チオセミカルバジド構造類似体、ヒドラジド、
ヒドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または芳
香族アミンを用いて同様の誘導体化を行うことができる。ＵＶ吸光度は、誘導体化剤に結
合した発色団、またはチオセミカルバジドの場合のようにアルデヒド誘導体化の結果とし
て生成される発色団からのものであり得る。
ヒドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または芳
香族アミンを用いて同様の誘導体化を行うことができる。ＵＶ吸光度は、誘導体化剤に結
合した発色団、またはチオセミカルバジドの場合のようにアルデヒド誘導体化の結果とし
て生成される発色団からのものであり得る。
【0186】
多糖と担体タンパク質との共有結合数の尺度としてのコンジュゲートタンパク質中のリ
シン消費量の決定
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ－Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて、コンジュゲート試
料中のコンジュゲーションの程度を測定した。担体タンパク質をそれらの成分アミノ酸に
分解するために、Ｅｌｄｅｘワークステーションで気相酸加水分解を用いて試料を加水分
解した。遊離アミノ酸は、６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバ
メート（ＡＱＣ）を用いて誘導体化した。次に、誘導体化した試料を、Ｃ１８カラムでの
ＵＶ検出を伴うＵＰＬＣを使用して分析した。平均タンパク質濃度は、リシン以外の代表
的なアミノ酸を用いて得た。コンジュゲーション中のリシン消費量（すなわち、リシン損
失）を、コンジュゲート中の平均測定リシン量と出発タンパク質中の予想リシン量との差
によって決定した。
シン消費量の決定
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ－Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて、コンジュゲート試
料中のコンジュゲーションの程度を測定した。担体タンパク質をそれらの成分アミノ酸に
分解するために、Ｅｌｄｅｘワークステーションで気相酸加水分解を用いて試料を加水分
解した。遊離アミノ酸は、６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバ
メート（ＡＱＣ）を用いて誘導体化した。次に、誘導体化した試料を、Ｃ１８カラムでの
ＵＶ検出を伴うＵＰＬＣを使用して分析した。平均タンパク質濃度は、リシン以外の代表
的なアミノ酸を用いて得た。コンジュゲーション中のリシン消費量（すなわち、リシン損
失）を、コンジュゲート中の平均測定リシン量と出発タンパク質中の予想リシン量との差
によって決定した。
【0187】
水溶液中およびＤＭＳＯ溶液中での還元的アミノ化を用いて製造したコンジュゲートの
属性
実施例２および３に記載のプロセスを用いて製造したコンジュゲートについての多糖活
性化およびリシン消費量（すなわち、リシン損失）の結果を表１に列挙する。ＤＭＳＯ中
で製造したコンジュゲート（実施例３）は、水溶液中で製造したコンジュゲート（実施例
２）よりも高いリシン消費量を有し、低い多糖活性化を有するという明らかな相違点があ
る。これは、コンジュゲートをＤＭＳＯ溶液中で調製することにより、天然の多糖構造へ
の活性化または破壊を少なくしつつ、多糖が担体タンパク質上のより多くのコンジュゲー
ション部位に結合するのを可能にすることを示唆する。結果として、水溶液中よりもＤＭ
ＳＯ溶液中で調製したコンジュゲートにおける架橋の方がより高いために、このコンジュ
ゲートは、多糖反復単位当たりより多くのグリコペプチドを平均して含有する。グリコペ
プチドは、免疫応答が生じる抗原性ドメインであると考えられている。結果として、ＤＭ
ＳＯ中で生成されたコンジュゲートは、水溶液中で生成されたコンジュゲートよりも免疫
原性が高いと予想される。
属性
実施例２および３に記載のプロセスを用いて製造したコンジュゲートについての多糖活
性化およびリシン消費量（すなわち、リシン損失）の結果を表１に列挙する。ＤＭＳＯ中
で製造したコンジュゲート（実施例３）は、水溶液中で製造したコンジュゲート（実施例
２）よりも高いリシン消費量を有し、低い多糖活性化を有するという明らかな相違点があ
る。これは、コンジュゲートをＤＭＳＯ溶液中で調製することにより、天然の多糖構造へ
の活性化または破壊を少なくしつつ、多糖が担体タンパク質上のより多くのコンジュゲー
ション部位に結合するのを可能にすることを示唆する。結果として、水溶液中よりもＤＭ
ＳＯ溶液中で調製したコンジュゲートにおける架橋の方がより高いために、このコンジュ
ゲートは、多糖反復単位当たりより多くのグリコペプチドを平均して含有する。グリコペ
プチドは、免疫応答が生じる抗原性ドメインであると考えられている。結果として、ＤＭ
ＳＯ中で生成されたコンジュゲートは、水溶液中で生成されたコンジュゲートよりも免疫
原性が高いと予想される。
【0188】
表１中のコンジュゲートの平均分子量（Ｍｗ）は、ＨＰＳＥＣ ＵＶ－ＭＡＬＳ－ＲＩ
アッセイによって測定された。水溶液中での還元的アミノ化によって生成されたコンジュ
ゲートは９９０～３４１０ｋＤａの範囲であった。ＤＭＳＯ中で生成されたコンジュゲー
トは、一般により大きく、サイズは１３００～５８２２ｋＤａの範囲であった。
アッセイによって測定された。水溶液中での還元的アミノ化によって生成されたコンジュ
ゲートは９９０～３４１０ｋＤａの範囲であった。ＤＭＳＯ中で生成されたコンジュゲー
トは、一般により大きく、サイズは１３００～５８２２ｋＤａの範囲であった。
【表1】
【0189】
ＣＲＭ１９７上の異なる部位におけるコンジュゲーションの程度の定量化
多糖は、担体タンパク質のＮ末端のアミン基、またはＣＲＭ１９７中の３９個のリシン
残基の側鎖のいずれかにコンジュゲートさせることができる。ＣＲＭ１９７のアミノ酸配
列は表２に提供されており、この表において、リシン（Ｋと略記される）には下線を引い
て太字で示す。ＣＲＭ１９７タンパク質上の異なる部位での多糖コンジュゲーションの程
度を特定し定量化するために、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳペプチドマッピング法を使用した。代表
的なコンジュゲート試料（ＤＭＳＯまたは水溶液を用いて調製）をトリプシンで二重に消
化し、トリプシンペプチドを生成した。次に、混合物を逆相Ｃ１８カラムで分離し、ＵＶ
および質量分析計で分析した。ＣＲＭ１９７タンパク質試料（多糖とコンジュゲートして
いない）もまた、対照と同時に三重に処理した。トリプシンはリシンおよびアルギニン残
基のＣ末端側のタンパク質を切断するので、リシン残基でのコンジュゲーションはその部
位をプロテアーゼ耐性にする。特定の部位でのコンジュゲーションの程度は、ＣＲＭ１９
７対照と比較したトリプシンペプチドのピーク強度の減少を計算することによって決定さ
れた。切断部位および配列に応じて、特定のペプチドのシグナル減少は、先行するペプチ
ドでのリシンの誤った切断、またはペプチド末端でのリシンの誤った切断、またはペプチ
ド配列の中間でのコンジュゲーションに起因し得る。
多糖は、担体タンパク質のＮ末端のアミン基、またはＣＲＭ１９７中の３９個のリシン
残基の側鎖のいずれかにコンジュゲートさせることができる。ＣＲＭ１９７のアミノ酸配
列は表２に提供されており、この表において、リシン（Ｋと略記される）には下線を引い
て太字で示す。ＣＲＭ１９７タンパク質上の異なる部位での多糖コンジュゲーションの程
度を特定し定量化するために、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳペプチドマッピング法を使用した。代表
的なコンジュゲート試料（ＤＭＳＯまたは水溶液を用いて調製）をトリプシンで二重に消
化し、トリプシンペプチドを生成した。次に、混合物を逆相Ｃ１８カラムで分離し、ＵＶ
および質量分析計で分析した。ＣＲＭ１９７タンパク質試料（多糖とコンジュゲートして
いない）もまた、対照と同時に三重に処理した。トリプシンはリシンおよびアルギニン残
基のＣ末端側のタンパク質を切断するので、リシン残基でのコンジュゲーションはその部
位をプロテアーゼ耐性にする。特定の部位でのコンジュゲーションの程度は、ＣＲＭ１９
７対照と比較したトリプシンペプチドのピーク強度の減少を計算することによって決定さ
れた。切断部位および配列に応じて、特定のペプチドのシグナル減少は、先行するペプチ
ドでのリシンの誤った切断、またはペプチド末端でのリシンの誤った切断、またはペプチ
ド配列の中間でのコンジュゲーションに起因し得る。
【0190】
ＣＲＭ１９７対照と比較した血清型１９Ａコンジュゲートについてのペプチドシグナル
減少の相対パーセンテージを、図１の可能なコンジュゲーション部位に対してプロットし
た。ｘ軸に列挙されたリシン位置は、ＣＲＭ１９７タンパク質配列上のそれらの順序に基
づいて番号付けされ、分析したペプチドの可能なコンジュゲーション部位を表す。例えば
、「３３」は、ペプチドのシグナルの減少が３３番目のリシンでのコンジュゲーションに
起因するものであったことを意味し、「６，７」は、ペプチドのシグナルの減少が６番目
もしくは７番目、またはその両方のリシン（ｌｙｉｎｅｓ）でのコンジュゲーションに起
因するものであったことを意味する。図１のデータは、水溶液と比較して、ＤＭＳＯ中で
調製されたコンジュゲートについて、各部位におけるコンジュゲーションの程度が一般的
に高いだけでなく、ＤＭＳＯ中のコンジュゲーション部位も多いことを示唆した。それら
の更なるコンジュゲーション部位には２９、３０、３１および３２番目のリシンが含まれ
、これらは以前に同定された一般的なヒトＴ細胞ペプチドエピトープにあるリシンのみで
あった（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２
０７－３２１４を参照；ＣＲＭ１９７配列のペプチド４１１～４３０およびペプチド４３
１～４５０にある）。試験した他の血清型でも同様の結果が観察された。
減少の相対パーセンテージを、図１の可能なコンジュゲーション部位に対してプロットし
た。ｘ軸に列挙されたリシン位置は、ＣＲＭ１９７タンパク質配列上のそれらの順序に基
づいて番号付けされ、分析したペプチドの可能なコンジュゲーション部位を表す。例えば
、「３３」は、ペプチドのシグナルの減少が３３番目のリシンでのコンジュゲーションに
起因するものであったことを意味し、「６，７」は、ペプチドのシグナルの減少が６番目
もしくは７番目、またはその両方のリシン（ｌｙｉｎｅｓ）でのコンジュゲーションに起
因するものであったことを意味する。図１のデータは、水溶液と比較して、ＤＭＳＯ中で
調製されたコンジュゲートについて、各部位におけるコンジュゲーションの程度が一般的
に高いだけでなく、ＤＭＳＯ中のコンジュゲーション部位も多いことを示唆した。それら
の更なるコンジュゲーション部位には２９、３０、３１および３２番目のリシンが含まれ
、これらは以前に同定された一般的なヒトＴ細胞ペプチドエピトープにあるリシンのみで
あった（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２
０７－３２１４を参照；ＣＲＭ１９７配列のペプチド４１１～４３０およびペプチド４３
１～４５０にある）。試験した他の血清型でも同様の結果が観察された。
【表2】
【0191】
実施例５：水溶液中で調製した血清型３Ｐｓ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートと、ＤＭＳ
Ｏ中で調製した血清型３Ｐｓ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートとを比較するマウス免疫原性
試験
全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の勧告に従っ
て厳密に行われた。プロトコールは、ペンシルベニア州ウェストポイントにあるＭＲＬの
動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
Ｏ中で調製した血清型３Ｐｓ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートとを比較するマウス免疫原性
試験
全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の勧告に従っ
て厳密に行われた。プロトコールは、ペンシルベニア州ウェストポイントにあるＭＲＬの
動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【0192】
８週齢のメスＣＤ１マウスを、ペンシルベニア州ウェストポイントにあるＭＲＬの動物
施設のマイクロアイソレータケージ（ｎ＝１０／ケージ）に収容した。食物と水は自由に
摂取可能であった。マウス（ｎ＝１０／群）を、表３に記載されるようにリン酸アルミニ
ウムアジュバント（ＡＰＡ）を用いて配合したＳＴ３－ＣＲＭ１９７コンジュゲート（０
．４μｇのＳＴ３多糖）で筋肉内（ＩＭ）免疫化した。陰性対照動物にはＡＰＡのみを与
えた。免疫化を０日目、１４日目および２８日目に行った。６日目および３４日目に、血
液を尾静脈を介して血清分離チューブ（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス
）内に採取した。
施設のマイクロアイソレータケージ（ｎ＝１０／ケージ）に収容した。食物と水は自由に
摂取可能であった。マウス（ｎ＝１０／群）を、表３に記載されるようにリン酸アルミニ
ウムアジュバント（ＡＰＡ）を用いて配合したＳＴ３－ＣＲＭ１９７コンジュゲート（０
．４μｇのＳＴ３多糖）で筋肉内（ＩＭ）免疫化した。陰性対照動物にはＡＰＡのみを与
えた。免疫化を０日目、１４日目および２８日目に行った。６日目および３４日目に、血
液を尾静脈を介して血清分離チューブ（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス
）内に採取した。
【表3】
【0193】
電気化学発光（ＥＣＬ）免疫原性アッセイ
マウス抗体応答は、９６ウェルマルチプレックス電気化学発光アッセイにおいて、わず
かな修正を加えて以前に記載されたように測定した。Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，
２００９，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６（３）：３８７－９６；Ｓ
ｋｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（４８）：８８７０－６
およびＣａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（６
）：８６５－７２を参照のこと。簡潔には、Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、メリーランド州ロックビル
）上で１時間試験血清インキュベーションを行い、洗浄した後、２５μｌの２μｇ／ｍｌ
Ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、メリーランド
州ロックビル）標識ヤギ抗マウスＩｇＧを各ウェルに加えた。プレートを振盪しながら室
温で１時間インキュベートし、次いで前述のように処理し、ＭＥＳＯ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ
６００で読み取った。
マウス抗体応答は、９６ウェルマルチプレックス電気化学発光アッセイにおいて、わず
かな修正を加えて以前に記載されたように測定した。Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，
２００９，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６（３）：３８７－９６；Ｓ
ｋｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（４８）：８８７０－６
およびＣａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（６
）：８６５－７２を参照のこと。簡潔には、Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、メリーランド州ロックビル
）上で１時間試験血清インキュベーションを行い、洗浄した後、２５μｌの２μｇ／ｍｌ
Ｓｕｌｆｏ－ｔａｇ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、メリーランド
州ロックビル）標識ヤギ抗マウスＩｇＧを各ウェルに加えた。プレートを振盪しながら室
温で１時間インキュベートし、次いで前述のように処理し、ＭＥＳＯ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ
６００で読み取った。
【0194】
カットオフ値（所定の陽性対照プールマウス血清の肺炎球菌多糖ＥＣＬ幾何平均シグナ
ル）に対応する線形補間した希釈の逆数としてＥＣＬ力価を計算した。ＥＣＬの対数目盛
および希釈を用いて補間を行った。次いで、線形補間した希釈を逆変換することによって
力価を得た。カットオフラインを完全に上回る試料曲線についての最後３つのＥＣＬデー
タ点の切片および勾配を用いた、または、カットオフラインを完全に下回る試料曲線につ
いての最初２つのＥＣＬデータ点の切片および勾配を用いた線形外挿（対数－対数目盛）
に基づいて、試験希釈範囲１００～１，５６２，５００から外れる試料について力価を外
挿した。次いで、線形外挿した希釈を逆変換することによって力価を得た。
ル）に対応する線形補間した希釈の逆数としてＥＣＬ力価を計算した。ＥＣＬの対数目盛
および希釈を用いて補間を行った。次いで、線形補間した希釈を逆変換することによって
力価を得た。カットオフラインを完全に上回る試料曲線についての最後３つのＥＣＬデー
タ点の切片および勾配を用いた、または、カットオフラインを完全に下回る試料曲線につ
いての最初２つのＥＣＬデータ点の切片および勾配を用いた線形外挿（対数－対数目盛）
に基づいて、試験希釈範囲１００～１，５６２，５００から外れる試料について力価を外
挿した。次いで、線形外挿した希釈を逆変換することによって力価を得た。
【0195】
オプソニン食作用性死滅アッセイ（ＯＰＡ）
肺炎球菌血清型３のオプソニン食作用性死滅アッセイ（ＯＰＡ）を、わずかな修正を加
えて以前に記載されたように行った（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１
７ Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（６）：８６５－７２およびＢｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２
００６，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（９）：１００４－９）。血
清、細菌、補体およびＨＬ－６０細胞のインキュベーション後、１０μｌのオプソニン食
作用性反応物を２００μｌ／ウェルの滅菌水を含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅの９６ウェル
フィルタープレート上の個々のウェルに移した。プレートを真空濾過し、１００μｌのＴ
ｏｄｄ Ｈｅｗｅｔｔ酵母抽出物（ＴＨＹＥ、Ｔｅｋｎｏｖａ）ブロスを添加した。媒体
を濾過し、湿ったプレートを密封したプラスチックバッグに２７℃で一晩置いた。次いで
、プレートフィルターを１００μｌ／ウェルの０．１％クマシーブルー溶液（Ｂｉｏ－Ｒ
ａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で染色した。染色物をプレートを通して濾過し
、コロニーをクマシー脱色溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で脱色し、乾燥するまで再度真空濾過
した。染色した細菌コロニーをＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔリーダー（オハイオ州シェ
ーカーハイツ）で計数した。ＯＰＫ力価は、補体対照（無血清対照）ウェルにおける平均
増殖と比較した、少なくとも５０％の死滅を伴う血清希釈の逆数として定義され、そのシ
グナルが５０％の死滅を示す（ｂｒａｃｋｅｔ）連続した希釈の間を線形補間することに
よって計算した。
肺炎球菌血清型３のオプソニン食作用性死滅アッセイ（ＯＰＡ）を、わずかな修正を加
えて以前に記載されたように行った（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１
７ Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（６）：８６５－７２およびＢｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２
００６，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（９）：１００４－９）。血
清、細菌、補体およびＨＬ－６０細胞のインキュベーション後、１０μｌのオプソニン食
作用性反応物を２００μｌ／ウェルの滅菌水を含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅの９６ウェル
フィルタープレート上の個々のウェルに移した。プレートを真空濾過し、１００μｌのＴ
ｏｄｄ Ｈｅｗｅｔｔ酵母抽出物（ＴＨＹＥ、Ｔｅｋｎｏｖａ）ブロスを添加した。媒体
を濾過し、湿ったプレートを密封したプラスチックバッグに２７℃で一晩置いた。次いで
、プレートフィルターを１００μｌ／ウェルの０．１％クマシーブルー溶液（Ｂｉｏ－Ｒ
ａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で染色した。染色物をプレートを通して濾過し
、コロニーをクマシー脱色溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で脱色し、乾燥するまで再度真空濾過
した。染色した細菌コロニーをＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔリーダー（オハイオ州シェ
ーカーハイツ）で計数した。ＯＰＫ力価は、補体対照（無血清対照）ウェルにおける平均
増殖と比較した、少なくとも５０％の死滅を伴う血清希釈の逆数として定義され、そのシ
グナルが５０％の死滅を示す（ｂｒａｃｋｅｔ）連続した希釈の間を線形補間することに
よって計算した。
【0196】
免疫化前および３回目の投与後の結果を、ＥＣＬ免疫原性については図２および表４に
、ＯＰＡについては図３に示す。水溶液およびＤＭＳＯ溶液を使用するプロセスによって
調製した両方のコンジュゲートは免疫原性であり、細菌に対して機能的な死滅活性を提供
する。興味深いことに、ＤＭＳＯ溶液を使用するプロセスによって調製したコンジュゲー
トは、水溶液を使用して調製したコンジュゲートよりもＥＣＬ免疫原性およびＯＰＡ応答
の両方が高かった。ＥＣＬ免疫原性の差は統計学的に有意である。群２に対する群３のＧ
ＭＴ比は３．４１である（９５％信頼区間の下限値および上限値はそれぞれ１．２６およ
び９．２６）。
、ＯＰＡについては図３に示す。水溶液およびＤＭＳＯ溶液を使用するプロセスによって
調製した両方のコンジュゲートは免疫原性であり、細菌に対して機能的な死滅活性を提供
する。興味深いことに、ＤＭＳＯ溶液を使用するプロセスによって調製したコンジュゲー
トは、水溶液を使用して調製したコンジュゲートよりもＥＣＬ免疫原性およびＯＰＡ応答
の両方が高かった。ＥＣＬ免疫原性の差は統計学的に有意である。群２に対する群３のＧ
ＭＴ比は３．４１である（９５％信頼区間の下限値および上限値はそれぞれ１．２６およ
び９．２６）。
【表4】
【0197】
実施例６：水溶液中で還元アミノ化を用いて調製した肺炎球菌多糖－タンパク質コンジ
ュゲートと、ＤＭＳＯ中で還元アミノ化を用いて調製した肺炎球菌多糖－タンパク質コン
ジュゲートとを比較した成人の免疫原性試験
本実施例では、５０歳以上の健康な肺炎球菌ワクチン未接種成人における２つの１５価
肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１５）の免疫原性および安全性について説明す
る。
ュゲートと、ＤＭＳＯ中で還元アミノ化を用いて調製した肺炎球菌多糖－タンパク質コン
ジュゲートとを比較した成人の免疫原性試験
本実施例では、５０歳以上の健康な肺炎球菌ワクチン未接種成人における２つの１５価
肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１５）の免疫原性および安全性について説明す
る。
【0198】
試験設計
健康な５０歳以上の成人被検体（基礎慢性疾患があれば、それが安定した状態にあるこ
とを文書に記す必要がある）において、２種類の異なるＰＣＶ１５配合物（ＰＣＶ１５－
ＡおよびＰＣＶ１５－Ｂ）とＰｒｅｖｎａｒ １３（商標）（肺炎球菌１３価コンジュゲ
ートワクチン［ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質］、Ｐｆｉｚｅｒ社の子会社であるＷ
ｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア
））の単回投与の安全性、忍容性および免疫原性を比較するために、無作為化多施設二重
盲検試験を、Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに準拠して実施した。
健康な５０歳以上の成人被検体（基礎慢性疾患があれば、それが安定した状態にあるこ
とを文書に記す必要がある）において、２種類の異なるＰＣＶ１５配合物（ＰＣＶ１５－
ＡおよびＰＣＶ１５－Ｂ）とＰｒｅｖｎａｒ １３（商標）（肺炎球菌１３価コンジュゲ
ートワクチン［ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質］、Ｐｆｉｚｅｒ社の子会社であるＷ
ｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア
））の単回投与の安全性、忍容性および免疫原性を比較するために、無作為化多施設二重
盲検試験を、Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに準拠して実施した。
【0199】
５０歳以上の合計６９０人の健康な肺炎球菌ワクチン未接種者を登録し、３つの異なる
ワクチン接種群：Ｐｒｅｖｎａｒ １３（商標）、ＰＣＶ１５－ＡおよびＰＣＶ１５－Ｂ
に１：１：１の比で無作為に分けた。無作為化を、試験参加時の年齢（５０～６４歳、６
５～７４歳、および７５歳以上）で層別化した。
ワクチン接種群：Ｐｒｅｖｎａｒ １３（商標）、ＰＣＶ１５－ＡおよびＰＣＶ１５－Ｂ
に１：１：１の比で無作為に分けた。無作為化を、試験参加時の年齢（５０～６４歳、６
５～７４歳、および７５歳以上）で層別化した。
【0200】
ＰＣＶ１５は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた２μｇ／０．５ｍＬ用量の以下の
各血清型（１，３，４，５，６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４，１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ
、２３Ｆ、３３Ｆ）の肺炎球菌多糖、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた４μｇ／０．
５ｍＬ用量の血清型６Ｂの肺炎球菌多糖、１２５μｇ／０．５ｍＬ用量のリン酸アルミニ
ウムアジュバント、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．８
）を含有していた。ＰＣＶ１５－Ａは０．２％ｗ／ｖのＰ１８８を用いて配合した。ＰＣ
Ｖ１５－Ｂは０．１％ｗ／ｖのＰＳ－２０を用いて配合した。
各血清型（１，３，４，５，６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４，１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ
、２３Ｆ、３３Ｆ）の肺炎球菌多糖、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた４μｇ／０．
５ｍＬ用量の血清型６Ｂの肺炎球菌多糖、１２５μｇ／０．５ｍＬ用量のリン酸アルミニ
ウムアジュバント、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．８
）を含有していた。ＰＣＶ１５－Ａは０．２％ｗ／ｖのＰ１８８を用いて配合した。ＰＣ
Ｖ１５－Ｂは０．１％ｗ／ｖのＰＳ－２０を用いて配合した。
【0201】
ＰＣＶ１５－Ａについては、１５種の多糖血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ
、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）全てを、実施例
２に記載の水溶液中での還元的アミノ化を用いてＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた。
これらのコンジュゲート（コンジュゲートロット番号１の材料）のいくつかについての属
性を表１に列挙する。
、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）全てを、実施例
２に記載の水溶液中での還元的アミノ化を用いてＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた。
これらのコンジュゲート（コンジュゲートロット番号１の材料）のいくつかについての属
性を表１に列挙する。
【0202】
ＰＣＶ１５－Ｂ、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを、
実施例３に記載のＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いてＣＲＭ１９７にコンジュゲート
させた。これらのコンジュゲート（コンジュゲートロット番号２の材料）の属性を表１に
列挙する。残りの血清型（１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆ）のコンジ
ュゲートは、ＰＣＶ１５－Ａで使用されたものと同じコンジュゲートである。
実施例３に記載のＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いてＣＲＭ１９７にコンジュゲート
させた。これらのコンジュゲート（コンジュゲートロット番号２の材料）の属性を表１に
列挙する。残りの血清型（１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆ）のコンジ
ュゲートは、ＰＣＶ１５－Ａで使用されたものと同じコンジュゲートである。
【0203】
両方のＰＣＶ１５配合物は、累積安全性評価（データは示さず）に基づいて、一般にＰ
ｒｅｖｎａｒ １３（商標）と同等の安全性プロファイルを有していた。血清型特異的Ｉ
ｇＧのＧＭＣおよびＯＰＡのＧＭＴを３０日目に測定した。（ＯＰＡの結果は含まれてい
ない）。
ｒｅｖｎａｒ １３（商標）と同等の安全性プロファイルを有していた。血清型特異的Ｉ
ｇＧのＧＭＣおよびＯＰＡのＧＭＴを３０日目に測定した。（ＯＰＡの結果は含まれてい
ない）。
【0204】
結果
ＩｇＧ幾何平均濃度（ＧＭＣ）および信頼区間（ＣＩ）を表６に要約する。ＰＣＶ１５
－ＡおよびＰＣＶ１５－Ｂ中の血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび
２３Ｆコンジュゲートを、上記のように異なるコンジュゲーションプロセスを用いて製造
した。表４に示される結果と一致して、表６に示される各血清型についての免疫原性応答
は、多糖血清型がＤＭＳＯ中でＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたときに改善された。
ＰＣＶ１５－Ｂ中の血清型１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３ＦのＧＭＣは、ＰＣＶ１５
－Ａ中のものよりも有意に高かった（両側α＝０．０５）。これらのデータは、免疫原性
を改善するためにＤＭＳＯ中でコンジュゲートさせる利点を強く実証している。この発見
は、肺炎球菌ワクチンまたは他のコンジュゲートワクチンについてはこれまで実証されて
いない。
ＩｇＧ幾何平均濃度（ＧＭＣ）および信頼区間（ＣＩ）を表６に要約する。ＰＣＶ１５
－ＡおよびＰＣＶ１５－Ｂ中の血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび
２３Ｆコンジュゲートを、上記のように異なるコンジュゲーションプロセスを用いて製造
した。表４に示される結果と一致して、表６に示される各血清型についての免疫原性応答
は、多糖血清型がＤＭＳＯ中でＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたときに改善された。
ＰＣＶ１５－Ｂ中の血清型１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３ＦのＧＭＣは、ＰＣＶ１５
－Ａ中のものよりも有意に高かった（両側α＝０．０５）。これらのデータは、免疫原性
を改善するためにＤＭＳＯ中でコンジュゲートさせる利点を強く実証している。この発見
は、肺炎球菌ワクチンまたは他のコンジュゲートワクチンについてはこれまで実証されて
いない。
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
還元的アミノ化により肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
ａ）肺炎球菌血清型３多糖をある量の酸化剤と反応させて、活性化肺炎球菌血清型３多糖を形成すること、および
ｂ）非プロトン性溶媒中で前記活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させて、肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートを形成すること
を含み、
得られた肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートが、工程ａ）及びｂ）であって、但し水溶液中で活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させる工程にしたがって調製された肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートに比較して、オプソニン食作用性死滅アッセイ（ＯＰＡ）および電気化学発光（ＥＣＬ）免疫原性アッセイで測定した、より高い抗原性を有する、前記方法。
ａ）肺炎球菌血清型３多糖をある量の酸化剤と反応させて、活性化肺炎球菌血清型３多糖を形成すること、および
ｂ）非プロトン性溶媒中で前記活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させて、肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートを形成すること
を含み、
得られた肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートが、工程ａ）及びｂ）であって、但し水溶液中で活性化肺炎球菌血清型３多糖をＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させる工程にしたがって調製された肺炎球菌血清型３多糖－ＣＲＭ１９７担体タンパク質コンジュゲートに比較して、オプソニン食作用性死滅アッセイ（ＯＰＡ）および電気化学発光（ＥＣＬ）免疫原性アッセイで測定した、より高い抗原性を有する、前記方法。
【請求項2】
非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】