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▶ ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024112981
(43)【公開日】2024-08-21
(54)【発明の名称】インビトロ細胞培養粘液系
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240814BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20240814BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/074
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024087182
(22)【出願日】2024-05-29
(62)【分割の表示】P 2021517604の分割
【原出願日】2019-11-15
(31)【優先権主張番号】62/768,259
(32)【優先日】2018-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】501345323
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＮＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＡＴ ＣＨＡＰＥＬ ＨＩＬＬ
(74)【代理人】
【識別番号】100107364
【弁理士】
【氏名又は名称】斉藤 達也
(72)【発明者】
【氏名】アルブリトン，ナンシー，エル．
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ユリ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法を提供する。
【解決手段】方法が：細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、を含む、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法である。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】方法が：細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、を含む、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法である。
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
方法が：
細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；
幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、
を含み、
細胞単層の粘液産生細胞が、細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる、
粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法。
細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；
幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、
を含み、
細胞単層の粘液産生細胞が、細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる、
粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法。
【請求項2】
粘液層が微小物体にとって実質的に透過不可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
粘液層の厚さが約１ミクロンから約１ｃｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
粘液層の厚さが約３０ミクロンから約１ｃｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
基底リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の基底側の下方に存在し、内腔リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側の上方に存在し、基底リザーバ及び内腔リザーバは其々が液体培地を含み；
方法が：更に、
内腔リザーバ内の液体培地を取り除いて、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に気液界面を生ずる事；及び／又は
内腔リザーバ内の液体培地の体積を、細胞単層の内腔側の上方に於いて、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲の深さに調整する事、
を含む、
請求項１に記載の方法。
方法が：更に、
内腔リザーバ内の液体培地を取り除いて、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に気液界面を生ずる事；及び／又は
内腔リザーバ内の液体培地の体積を、細胞単層の内腔側の上方に於いて、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲の深さに調整する事、
を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項6】
更に、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に又は其の上方に、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアを配置する事を含む、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
【請求項7】
不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアが、粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は細胞単層の粘液産生細胞に依って生ずる粘液層の内腔側と直接的接触をしている、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
液体培地が、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアと、粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は粘液層の内腔側との間にあり、液体培地の深さが約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
液体培地がホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液を含む（ホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液）、請求項５に記載の方法。
【請求項10】
幹細胞が、上皮幹細胞、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、呼吸器幹細胞、胃幹細胞、鼻腔幹細胞、生殖器官細胞（子宮頸部、膣、子宮）、尿道細胞、嗅覚細胞、口腔細胞、舌細胞、及び／又は結膜細胞である、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
【請求項11】
幹細胞が腸上皮幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
粘液層が、約１から約１００ミクロンのサイズ範囲のビーズ又は微生物にとって実質的に透過不可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
力が細胞単層の表面に平行して適用される、請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項14】
力が表面張力の力の適用又は機械的な力の適用を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
機械的な力が、攪拌子、細胞表面に平行して動く半固体材料、及び／又は細胞表面の上側に於けるスラリーの循環である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
請求項１～１５の何れか１項に記載の方法に依って生ずる、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
【請求項17】
粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、請求項１６に記載の生細胞コンストラクト。
【請求項18】
粘液層が微小物体（micro－objective）にとって実質的に透過不可能である、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
【請求項19】
粘液層が約１ミクロンから約１ｃｍの厚さを含む、請求項１８に記載の生細胞コンストラクト。
【請求項20】
粘液層が約１ミクロンから約１００ミクロンのサイズ範囲の微小物体にとって透過不可能である、請求項１８に記載の生細胞コンストラクト。
【請求項21】
粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、請求項１８に記載の生細胞コンストラクト。
【請求項22】
方法が：
請求項１６に記載の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、薬物、又は粒子と接触させる事と；
生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと動く距離を測定し、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する事と、
を含む、
細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する方法。
請求項１６に記載の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、薬物、又は粒子と接触させる事と；
生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと動く距離を測定し、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する事と、
を含む、
細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する方法。
【請求項23】
生物が細菌、ウイルス、真菌、原虫、及び／又は蠕虫である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は２０１８年１１月１６日出願の米国仮特許出願シリアルＮｏ．６２／７６８，２５９の利益及び優先権を主張し、此れの開示は其の全体が参照に依って本願に組み込まれる。
本願は２０１８年１１月１６日出願の米国仮特許出願シリアルＮｏ．６２／７６８，２５９の利益及び優先権を主張し、此れの開示は其の全体が参照に依って本願に組み込まれる。
【0002】
政府の支援の申し立て
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号ＤＫ１０９５５９に依る政府の支援に依って成された。政府は本発明に或る種の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号ＤＫ１０９５５９に依る政府の支援に依って成された。政府は本発明に或る種の権利を有する。
【0003】
本開示は、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含むインビトロ細胞培養、及び其れを作り用いる方法に関する。
【背景技術】
【0004】
小及び大腸の内腔表面は粘液の厚いブランケットに依って保護されている。小腸は粘液の５０から４５０μｍの単一層を生じるが、大腸の粘液コーティングは２つの構造的に別個の層から構成される（非特許文献１）１。４００から８００μｍの外側粘液（mucosal）層は緩く詰まっており、細菌が生息する為の快適な環境を提供するが、１００から３００μｍの内側粘液（mucosal）層は細菌にとって透過不可能で且つ上皮に固く取り付いた儘である（非特許文献２及び３）２，３。両方の臓器に於いて、粘液は腸上皮を内張りする杯細胞に依って連続的に作り出され、分泌される。細胞の上方の粘液層は数時間のオーダーで取り替えられると概算されている（非特許文献４）４。ムチン２（Ｍｕｃ２）は腸粘液の最も豊富なゲル形成コンポーネントである（非特許文献５）５。粘液層はインビボの結腸粘膜のホメオスタシスを持続させる為に必須である。粘液層の主な機能は、下に重なる上皮を病原体侵入から保護する為のバリアとして働く事と、粘液中に存在する高い濃度の水（約９７％）を原因として結腸の内張りを潤滑な且つ湿った儘に保つ事とである（非特許文献６及び７）６，７。粘液層は、食品又は細菌に由来する分子及び其れ等の代謝物の拡散を妨害する為のバリアとしてもまた作用し、腸に依って分泌される分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）及び抗細菌ペプチド等の分子をトラップする（非特許文献８）８。
【0005】
インビトロ腸上皮モデルは、高度に複雑な腸上皮系をコントロールされた様式で研究する為の価値あるツールを提供する。Ｃａｃｏ－２及びＨＴ－２９を包含する腺癌細胞株は腸上皮のインビトロモデルとして広く用いられているが、其れ等は高密度の粘液層を生じない（非特許文献９）９。メトトレキサートに依る処置後に派生するＨＴ－２０の安定な均質な亜集団のＨＴ２９－ＭＴＸは、多くの場合に粘液分泌細胞モデルとして用いられる（非特許文献１０）１０。然し乍ら、此れ等の腫瘍細胞は正常なシグナル伝達経路、生理的な粘液分泌、又は外部刺激に対する適切な応答を保有しない。近年、腸幹細胞生物学に於けるブレークスルーは初代腸上皮幹細胞に基づくインビトロモデルを築く事を可能にしている（非特許文献１１）１１。オルガノイド培養モデルは、初めて、成人腸上皮幹細胞のインビトロの拡大培養及び系列操作を実現した。作り出された「ミニガット」オルガノイドは、粘液を分泌する杯細胞を包含するインビボの上皮に於いて見出される細胞系列の多様性を保有する（非特許文献１１～１４）１１－１４。細胞は、其れ等の頂端表面が閉じられたルーメンに面し、且つ其れ等の基底側がマトリゲル（登録商標）又は他のＥＣＭコンポーネントに取り付けられる様にして、極性化している（非特許文献１５）１５。然し乍ら、粘液は、細胞の層及びマトリゲル（登録商標）又はコラーゲン等の高密度のハイドロゲルによって取り囲まれたオルガノイドのルーメンへと分泌及び蓄積される。此の粘液分泌は容易に定量又は操作されず、粘液もまた外部刺激に対するバリアとして作用しない。
【0006】
内腔表面を露出する試みに於いて、細胞外マトリックスの厚い又は薄い層何方かに依ってコーティングされた多孔質膜上に於いて腸上皮幹細胞（例えば、単離された陰窩、又は解離したオルガノイド断片から）を培養する事に依って、単層モデルが築かれている（非特許文献１６～２３）１６－２３。細胞は成長因子（Ｗｎｔ－３Ａ、Ｒ－スポンジン（spondin）、及びノギン（Noggin））の存在下で増殖し、成長因子の不在下では分化して、生理的な経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を保有する連続的な単層を形成した。其れ等の開放された内腔表面に依って、単層はオルガノイドと比べて固有の利点を保有する。此れは、食品コンポーネント、微生物、生物活性代謝物、薬物、及び有毒化合物のインパクト、吸収、又は代謝をアッセイする為の頂端上皮への容易なアクセスを許す。単層モデルはＩｇＡトランスサイトーシス（非特許文献１６）１６、細菌との共培養（非特許文献１７及び１８）１７，１８、鉄輸送（非特許文献１９）１９、ホルモン分泌（非特許文献１９）１９、マクロファージとの共培養（非特許文献２０）２０、筋線維芽細胞及び腸ニューロンとの共培養（非特許文献２１）２１、並びにサイトカイン分泌（非特許文献２０及び２１）２０，２１を研究する為に用いられている。初代細胞の上記の報告された単層モデルの全てでは、細胞は浸漬培養系であり、即ち、水性培地が基底及び内腔リザーバ内に置かれた。Ｍｕｃ２抗体に依る染色に依って、微量の粘液が同定された（非特許文献１８）１８。粘液厚さは、細胞に蛍光マイクロビーズを重層する事と、細胞と粘液を透過するには大き過ぎるビーズとの間の距離を測定する事とに依って測定される（非特許文献１６）１６。然し乍ら、粘液層は連続的ではなく（非特許文献１８）１８、マイクロビーズを上皮から分離するにも十分に厚くはなかった（非特許文献１６）１６。其れ故に、ビーズは顕微鏡画像の解像度内では頂端上皮表面との接触をしている様に見える。然し乍ら、Ｍｕｃ２は細胞の上方の上清中に検出され、幾らかの量のＭｕｃ２が合成及び分泌されるが、粘液層を再現するには十分な数量又は密度ではないという事を示唆した（非特許文献２４）２４。
【0007】
其れ故に、コントロール可能な厚さを有する実質的にマイクロビーズ又は細菌透過不可能である高密度の粘液層は、初代腸上皮細胞から構築される何れかのインビトロ腸上皮モデルに於いては未だ達成されていない。かかるインビトロモデルはインビボの条件を反映する為に必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】アレン（Allen）Ａ，キャロル（Carroll）ＮＪＨ著，「胃及び十二指腸に於ける粘着性の且つ可溶性の粘液（Adherent and Soluble Mucus in the Stomach and Duodenum）」，ディジェスティブ・ディジージズ・アンド・サイエンシズ（Digestive Diseases and Sciences），１９８５年；第３０巻：ｐ．５５Ｓ
【非特許文献2】ペラセイエド（Pelaseyed）Ｔ，ベリストローム（Bergstrom）ＪＨ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，エルムント（Ermund）Ａ，バーシュノー（Birchenough）ＧＭＨ，シュッテ（Schutte）Ａ，ファンデルポスト（van der Post）Ｓ，スベンソン（Svensson）Ｆ，ロドリゲス・ピネイロ（Rodriguez－Pineiro）ＡＭ，ニストローム（Nystrom）ＥＥＬ，ワイズング（Wising）Ｃ，ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「杯細胞及びエンテロサイトの粘液及びムチンは胃腸管の第一防衛線を提供し、免疫系と相互作用する（The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system）」，イミュノロジカル・レビューズ（Immunological reviews），２０１４年；第２６０巻：ｐ．８－２０
【非特許文献3】ムルジア（Murgia）Ｘ，ロレッツ（Loretz）Ｂ，ハートウィグ（Hartwig）Ｏ，ヒッティンガー（Hittinger）Ｍ，レアー（Lehr）ＣＭ著，「薬物輸送に対する粘液の役割と治療アウトカムに影響する其のポテンシャル（The role of mucus on drug transport and its potential to affect therapeutic outcomes）」，アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Advanced Drug Delivery Reviews），２０１８年；第１２４巻：ｐ．８２－９７
【非特許文献4】レアー（Lehr）ＣＭ，ポールマ（Poelma）ＦＧＪ，ジャンギンガー（Junginger）ＨＥ，タッカー（Tukker）ＪＪ著，「ラットのインサイチュループに於ける腸粘液ゲル層のターンオーバー時間の概算（An estimate of turnover time of intestinal mucus gel layer in the rat in situ loop）」，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（International Journal of Pharmaceutics），１９９１年；第７０巻：ｐ．２３５－２４０
【非特許文献5】ウェイ（Wei）ＸＣ，ヤン（Yang）Ｚ，レイ（Rey）ＦＥ，リドーラ（Ridaura）ＶＫ，デビッドソン（Davidson）ＮＯ，ゴードン（Gordon）ＪＩ，セメンコビッチ（Semenkovich）ＣＦ著，「脂肪酸シンターゼはムチン２のパルミトイル化に依って腸バリア機能を調節する（Fatty Acid Synthase Modulates Intestinal Barrier Function through Palmitoylation of Mucin 2）」，セル・ホスト＆マイクローブ（Cell Host & Microbe），２０１２年；第１１巻：ｐ．１４０－１５２
【非特許文献6】ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，フィリプソン（Phillipson）Ｍ，ペテルソン（Petersson）Ｊ，ベルシック（Velcich）Ａ，ホルム（Holm）Ｌ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「結腸に於ける２つのＭｕｃ２ムチン依存的な粘液層の内側は細菌を欠く（The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria）」，米国科学アカデミー紀要，２００８年；第１０５巻：ｐ．１５０６４－１５０６９
【非特許文献7】ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ガット感染及び炎症に於ける粘液層の役割（Role of mucus layers in gut infection and inflammation）」，カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー（Current Opinion in Microbiology），２０１２年；第１５巻：ｐ．５７－６２
【非特許文献8】カールソン（Carlson）ＴＬ，ロック（Lock）ＪＹ，キャリア（Carrier）ＲＬ著，「粘液バリアを人工する（Engineering the Mucus Barrier）」，アニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング（Annual Review of Biomedical Engineering），２０１８年；第２０巻：ｐ．１９７－２２０
【非特許文献9】ワーラング（Werlang）Ｃ，カルカルモ・オジャルセ（Carcarmo－Oyarce）Ｇ，リベック（Ribbeck）Ｋ著，「マイクロバイオームを研究及び支配する為に粘液を人工する（Engineering mucus to study and influence the microbiome）」，ネイチャー・レビューズ・マテリアルズ（Nature Reviews Materials），２０１９年；第４巻：ｐ．１３４－１４５
【非特許文献10】ロジェ（Rogier）ＥＷ，フランツ（Frantz）ＡＬ，ブルーノ（Bruno）ＭＥＣ，ケッツェル（Kaetzel）ＣＳ著，「分泌型ＩｇＡはガット細菌と共に結腸粘液の外側層に濃縮される（Secretory IgA is Concentrated in the Outer Layer of Colonic Mucus along with Gut Bacteria）」，パソジェンズ（Pathogens），２０１４年；第３巻：ｐ．３９０－４０３
【非特許文献11】グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，スピア（Speer）Ｊ，ワン（Wang）Ｙ，グエン（Nguyen）ＤＬ，リード（Reed）ＭＩ，スミディ（Smiddy）ＮＭ，パーカー（Parker）ＪＳ，ファロン（Fallon）ＪＫ，スミス（Smith）ＰＣ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「薬物輸送研究の為の剛性の勾配を有する足場上に作り出された初代結腸上皮の単層（A Monolayer of Primary Colonic Epithelium Generated on a Scaffold with a Gradient of Stiffness for Drug Transport Studies）」，アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）２０１８年；第９０巻：ｐ．１３３３１－１３３４０
【非特許文献12】キグレイ（Quigley）ＥＭＭ著，「健康及び疾患に於けるガット細菌（Gut bacteria in health and disease）」，ガストロエンテロロジー＆ヘパトロジー（Gastroenterology & hepatology），２０１３年；第９巻：ｐ．５６０－５６９
【非特許文献13】ガニョン（Gagnon）Ｍ，ベルナー（Berner）ＡＺ，シェルベ（Chervet）Ｎ，シャサール（Chassard）Ｃ，ラクロワ（Lacroix）Ｃ著，「サルモネラ接着及び侵入を検討する為のＣａｃｏ－２、ＨＴ－２９、及び粘液分泌ＨＴ２９－ＭＴＸ腸細胞モデルの比較（Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion）」，ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ（Journal of Microbiological Methods），２０１３年；第９４巻：ｐ．２７４－２７９
【非特許文献14】ルスフルール（Lesuffleur）Ｔ，バルバット（Barbat）Ａ，デュソー（Dussaulx）Ｅ，ツヴァイバウム（Zweibaum）Ａ著，「ＨＴ－２９ヒト結腸癌細胞のメトトレキサートに対する成長適応は柱状吸収及び粘液分泌細胞に分化する其れ等の能力に関連する（Growth adaptation to methotrexate of HT-29 human colon carcinoma cells is associated with their ability to differentiate into columnar absorptive and mucus-secreting cells）」，キャンサー・リサーチ（Cancer Research），１９９０年；第５０巻：ｐ．６３３４－６３４３
【非特許文献15】ヌスラト（Nusrat）Ａ，フォンエイヒェル・シュトライバー（von Eichel－Streiber）Ｃ，ターナー（Turner）ＪＲ，ヴェルカーデ（Verkade）Ｐ，マダラ（Madara）ＪＬ，パルコス（Parkos）ＣＡ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素はタイトジャンクション蛋白質の膜マイクロドメイン局在を変改する事に依って上皮バリア機能を破壊する（Clostridium difficile Toxins Disrupt Epithelial Barrier Function by Altering Membrane Microdomain Localization of Tight Junction Proteins）」，インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity），２００１年；第６９巻：ｐ．１３２９－１３３６
【非特許文献16】サトー（Sato）Ｔ，ブリーズ（Vries）ＲＧ，スニッペルト（Snippert）ＨＪ，ファンデウェテリンク（van de Wetering）Ｍ，バーカー（Barker）Ｎ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，ファンエス（van Es）ＪＨ，アボ（Abo）Ａ，クジャラ（Kujala）Ｐ，ピーターズ（Peters）ＰＪ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「単一のＬｇｒ５幹細胞は間葉系ニッチなしに陰窩－絨毛構造をインビトロで築く（Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche）」，ネイチャー（Nature），２００９年；第４５９巻：ｐ．２６２－Ｕ１４７
【非特許文献17】ダテ（Date）Ｓ，サトー（Sato）Ｔ著，「ミニガットオルガノイド：幹細胞ニッチの再構成（Mini-Gut Organoids: Reconstitution of Stem Cell Niche）」，シェクマン（Schekman）Ｒ編，アニュアル・レビュー・オブ・セル・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー（Annual Review of Cell and Developmental Biology），Ｖｏｌ３１，第３１巻，２０１５年：ｐ．２６９－２８９
【非特許文献18】サトー（Sato）Ｔ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，フェラント（Ferrante）Ｍ，ブリーズ（Vries）ＲＧＪ，ファンエス（van Es）ＪＨ，ファンデンブリンク（van den Brink）Ｓ，ファンフート（van Houdt）ＷＪ，プロンク（Pronk）Ａ，ヴァンガープ（van Gorp）Ｊ，シアセマ（Siersema）ＰＤ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「ヒト結腸、腺腫、腺癌、及びバレット上皮からの上皮オルガノイドの長期拡大培養（Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２０１１年；第１４１巻：ｐ．１７６２－１７７２
【非特許文献19】イン（Yin）ＸＬ，ファリン（Farin）ＨＦ，ファンエス（van Es）ＪＨ，クレバース（Clevers）Ｈ，ランガー（Langer）Ｒ，カープ（Karp）ＪＭ著，「Ｌｇｒ５（＋）腸幹細胞及び其れ等の子孫のニッチ非依存的な高純度培養（Niche-independent high-purity cultures of Lgr5(+) intestinal stem cells and their progeny）」，ネイチャー・メソッズ（Nature Methods），２０１４年；第１１巻：ｐ．１０６－１１２
【非特許文献20】フェトフラー（Fatehullah）Ａ，アップルトン（Appleton）ＰＬ，ナトケ（Nathke）ＩＳ著，「腫瘍形成の間の腸管に於ける細胞及び組織極性：細胞は依然として正しい上下方向を知るが、組織の秩序は失われる（Cell and tissue polarity in the intestinal tract during tumourigenesis: cells still know the right way up, but tissue organization is lost）」，フィロソフィカル・トランザクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティー・Ｂ－バイオロジカル・サイエンシズ（Philosophical Transactions of the Royal Society B－Biological Sciences），２０１３年；第３６８巻：ｐ．２０１３００１４
【非特許文献21】ムーン（Moon）Ｃ，ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「ＩｇＡトランスサイトーシスを調節する因子を評価する為の初代マウス腸上皮細胞単層培養系の開発（Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis）」，ムコサル・イミュノロジー（Mucosal Immunology），２０１４年；第７巻：ｐ．８１８－８２８
【非特許文献22】ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，マリンショー（Marinshaw）ＪＭ，シャイク（Shaikh）Ｎ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，ムーン（Moon）Ｃ，ター（Tarr）ＰＩ，チョルバ（Ciorba）ＭＡ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「患者に基づくアッセイを容易化する為の強化ヒト胃腸上皮培養系の開発（Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays）」，ガット（Gut），２０１５年；第６４巻：ｐ．９１１－９２０
【非特許文献23】イン（In）Ｊ，フォルケ・アーベル（Foulke－Abel）Ｊ，ザコス（Zachos）ＮＣ，ハンセン（Hansen）Ａ－Ｍ，ケイパー（Kaper）ＪＢ，バーンスタイン（Bernstein）ＨＤ，ハルシュカ（Halushka）Ｍ，ブラット（Blutt）Ｓ，エステス（Estes）ＭＫ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ著，「腸管出血性大腸菌はヒト幹細胞由来コロノイドに於いて粘液及び微絨毛間ブリッジを縮減する（Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１６年；第２巻：ｐ．４８－６２．ｅ３
【非特許文献24】コズカ（Kozuka）Ｋ，ヒー（He）Ｙ，クー・マッコイ（Koo－Mccoy）Ｓ，クマラスワミ（Kumaraswamy）Ｐ，ニー（Nie）Ｂ，ショー（Shaw）Ｋ，チャン（Chan）Ｐ，レッドベター（Leadbetter）Ｍ，ヒー（He）Ｌ，ルイス（Lewis）ＪＧ，ジョン（Zhong）Ｚ，シャルモット（Charmot）Ｄ，バラー（Balaa）Ｍ，キング（King）ＡＪ，コールドウェル（Caldwell）ＪＳ，シーゲル（Siegel）Ｍ著，「ヒト及びマウス腸上皮細胞単層プラットフォームの開発及びキャラクタリゼーション（Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform）」，ステム・セル・レポーツ（Stem Cell Reports）２０１７年；第９巻：ｐ．１９７６－１９９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
此の概要は本開示の主題の幾つかの実施形態を列記し、多くのケースでは、此れ等の実施形態の変形及び順列を列記する。此の概要は数々の及び様々な実施形態を単に例示する。所与の実施形態の１つ以上の代表的特徴の言及は同様に例示的である。典型的には、斯かる実施形態は言及される特徴（単数又は複数）の有り又は無しに存在し得る；同様に、其れ等の特徴は、此の概要に於いて列記されるか否かにかかわらず本開示の主題の他の実施形態に適用され得る。過剰な繰り返しを避ける為に、此の概要は斯かる特徴の全ての可能な組み合わせを列記又は示唆はしない。
【0010】
幾つかの実施形態では、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法が本明細書に於いて提供され、細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞（例えば、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、及び同類）を培養する事と、幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞（例えば、杯細胞ＧＣ）及び他の細胞型（ＯＣ。エンテロサイト、腸内分泌細胞、パネート細胞、幹細胞等を包含する）を含む細胞単層を生ずる事とを含み、細胞単層は基底側及び内腔（頂端）側を有し、細胞単層の粘液産生細胞は細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる。粘液層は微小物体にとって実質的に又は完全に透過不可能であり得る。幾つかの態様では、粘液層の厚さは約１ミクロンから約１ｃｍであり得る。幾つかの実施形態では、粘液層の厚さは約３０ミクロンから約１ｃｍであり得る。ＧＣ対ＯＣの比は幾つかの実施形態では約０．１％から約９９．９％の範囲であり得る。
【0011】
幾つかの実施形態では、基底リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の基底側の下方に存在し、内腔リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側の上方に存在し、基底リザーバ及び内腔リザーバは其々が液体培地を含む。方法は、更に：内腔リザーバ内の液体培地を取り除いて、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に気液界面を生ずる事、及び／又は内腔リザーバ内の液体培地の体積を、細胞単層の内腔側の上方に於いて、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲の深さに調整する事を含む（粘液層は液体培地及び細胞単層の間にある（又は発生する））。幾つかの実施形態では、方法は、更に、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に又は其の上方に、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアを配置する事を含み得る。幾つかの態様では、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアは、粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は細胞単層の粘液産生細胞に依って生ずる粘液層の内腔側と直接的接触をしている。液体培地は不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアと粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は粘液層の内腔側との間にあり得、液体培地の深さは約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲である。幾つかの実施形態では、液体培地はホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液を含む（ホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液）。幾つかの実施形態では、幹細胞は、上皮幹細胞、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、呼吸器幹細胞、胃幹細胞、鼻腔幹細胞、生殖器官細胞（子宮頸部、膣、子宮）、尿道細胞、嗅覚細胞、口腔細胞、舌細胞、及び／又は結膜細胞である。幾つかの実施形態では、幹細胞は腸上皮幹細胞である。粘液層は約１から約１００ミクロンのサイズ範囲のビーズ又は微生物にとって実質的に透過不可能であり得る。
【0012】
幾つかの実施形態では、力が細胞単層の表面に平行して適用される。幾つかの実施形態では、力は表面張力の力の適用又は機械的な力の適用を含む。幾つかの実施形態では、機械的な力は、攪拌子、細胞表面に平行して動く半固体材料、及び／又は細胞表面の上側に於けるスラリーの循環である。
【0013】
幾つかの実施形態では、本明細書に於いて開示される方法に依って生ずる粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトが本明細書に於いて提供される。幾つかの実施形態では、粘液層は基底側及び内腔側を含み、基底側は粘液産生細胞に隣接し且つ下方である。
【0014】
幾つかの実施形態では、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトが本明細書に於いて提供され、粘液層は微小物体（micro－objective）にとって実質的に透過不可能である。粘液層は約１ミクロンから約１ｃｍの厚さを含み得る。粘液層は約１ミクロンから約１００ミクロンのサイズ範囲の微小物体にとって透過不可能であり得る。幾つかの実施形態では、粘液層は基底側及び内腔側を含み得、基底側は粘液産生細胞に隣接し且つ下方である。
【0015】
幾つかの実施形態では、細胞単層の粘液層を横断する（透過する）生物、薬物、又は粒子の能力を決定する方法が本明細書に於いて提供され、方法は、本明細書に於いて開示される生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、薬物、又は粒子と接触させる事と、生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと動く距離を測定し、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層を横断する（透過する）生物、薬物、又は粒子の能力を決定する事とを含む。
【0016】
幾つかの実施形態では、粘液層を含む細胞単層に感染する生物の能力を研究及び評価する方法が本明細書に於いて提供され、本明細書に於いて開示される生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物と接触させる事と、生物が粘液層を横断し生細胞コンストラクトの細胞単層に接触するかどうかを決定する事とを含む。生物が粘液層を横断し細胞単層に接触すると決定される時には、生物は、粘液層を含む細胞単層に感染する能力があると決定される。
【0017】
幾つかの実施形態では、生物に依る感染を防止又は縮減する薬物の有効性を評価する方法が本明細書に於いて提供され、本明細書に於いて開示される生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物と接触させる事と、生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を薬物と接触させる事と、生物が細胞単層の粘液層を透過及び／又は生細胞コンストラクトの細胞単層の１つ以上の細胞に感染するかどうかを決定する事とを含む。薬物は、コントロール（即ち、生物とは接触させられるが、薬物とは接触させられない）と比較して、生物が粘液層を透過及び／又は生細胞コンストラクトの細胞単層の１つ以上の細胞に感染しない場合には、感染を防止又は縮減する事に有効であると決定される。生物が粘液層を透過及び／又は生細胞コンストラクトの細胞単層の１つ以上の細胞に感染する場合には、有効ではないと決定される。生物を生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側と接触させる事は、薬物を生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側と接触させる事に先行するか、同時か、又は後であり得る。
【0018】
幾つかの実施形態では、生物に依る侵入、粒子に依る接触、及び／又は化学物質／化合物に依る接触に対する粘液層を含む細胞の免疫学的応答を評価する方法が本明細書に於いて提供され、本明細書に於いて開示される生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、粒子、及び／又は化学物質／化合物と接触させる事と、生細胞コンストラクトの細胞単層の細胞を免疫応答に関連するマーカー（例えば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、神経伝達物質、及び／又は抗微生物ペプチド）の産生についてアッセイし、其れに依って、生物、粒子、及び／又は化学物質／化合物に依る接触に対する生細胞コンストラクトの細胞単層の免疫学的応答を評価する事とを含む。生物は細菌、ウイルス、真菌、原虫、及び／又は蠕虫であり得る。
【0019】
幾つかの実施形態では、インビトロ細胞系に於いて粘液制御異常を評価する方法が本明細書に於いて開示され、本明細書に於いて開示される生細胞コンストラクトの粘液層を研究する事を含み、培養される幹細胞は粘液制御異常に関連する疾患を有する対象からであるか、及び／又は培養される幹細胞は健康な対象からであり、且つ粘液制御異常に関連する疾患からの幹細胞を概括する様に遺伝子編集され；研究する事は、生細胞コンストラクトの粘液層を、厚さ、組成、粘度、微小物体に依る透過度、感染する微生物の能力、及び／又は薬物に対する応答性について評価する事を含み；其れに依って、インビトロ細胞系に於いて粘液制御異常を評価する。幾つかの実施形態では、粘液制御異常に関連する疾患は、炎症性腸疾患、便秘、嚢胞性線維症、過敏性腸症候群、リーキーガット症候群、細菌異常増殖症候群、セリアック病、乳糖不耐症、過剰ガス症候群、下痢性疾患、及び／又はポリープ・虫垂炎である。
【0020】
本開示の前述の及び他の対象及び態様は下で提示される明細書に於いて詳細に説明される。
【0021】
本開示の主題に依って全体的に又は部分的に達成される本開示の主題の実施形態が本明細書に於いて上で申し立てられている。他の実施形態は、本明細書に於いて下で最良に記載される付随する例との組み合わせにされる時に、記載が進むに連れて明白に成るであろう。
【0022】
本開示の主題は次の図を参照する事に依ってより良く理解され得る。図中のコンポーネントは必ずしも一定縮尺ではなく、代わりに、本開示の主題の原理を（多くの場合には概略的に）例解する事に重点が置かれる。図中の同類の参照数字は異なる視点に於いて一貫して対応するパーツを指定する。本開示の主題の更なる理解は、付随する図面の例解に於いて提示される実施形態の参照に依って得られ得る。例解される実施形態は本開示の主題を実行する為の系を単に例示するが、本開示の主題の作用の方法及び構成両方は、一般的に、其れ等の更なる目標及び利点と一緒に、図面及び次の記載の参照に依ってより容易に理解され得る。図面は、添付又は爾後に補正される請求項に於いて特定して提示される本開示の主題の範囲を限定する事ではなく、単に本開示の主題を明瞭化及び例示する事が意図される。
【0023】
本開示の主題のより完全な理解の為に、此処で次の図面の参照が成される。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１Ａから１Ｅは、インビトロ粘液層を作り出す為の本開示に従う系及び方法の概略図を提供する。図１Ａは気液界面（ＡＬＩ）培養を提供する。頂端側は空気に対して露出され、液体又は培地は取り除かれており、粘液がコンパクト化した形態で蓄積する事を許す。図１Ｂは改変されたＡＬＩ培養を例解する。頂端側に於いて液体の体積はコントロールされ、粘液がコンパクト化した形態で及び増大した水和を有して蓄積する事を許す。図１Ｃは多孔質膜の代わりとしての足場の使用の例を例解する。図１Ｄは、蓄積した粘液を封じ込める為の部分的に透過性の物理的バリア（セパレータ）の使用の例を提供する。図１Ｅは、粘液蓄積をコントロールする為の不透過性の物理的バリア（ブロッカー）の使用の例を例解する。
【図2】図２Ａから２Ｅは、頂端上皮側からの液体を取り除いた（removal）コンパクトな粘液層の作出の概略的な例解（ＡＬＩ培養）、及び齎されたデータを提供する。図２Ａは、浸漬並びにＡＬＩ培養フォーマットを示す概略図であり、幹細胞（ＳＣ）、粘液産生杯細胞（ＧＣ）、他の非粘液産生細胞（ＯＣ）、及びムチン（又は希釈されたムチン）（Ｍ）を包含する。図２Ｂはパラフィン包埋された単層の断面の免疫蛍光染色を示す（Ｍｕｃ２及び核が標識されている）。矢印は杯細胞を区分する。Ａ：頂端側；Ｂ：基底側。下側パネル（ｉ、ｉｉ、及びｉｉｉ）は、上側の２つのパネルに於ける対応する点線枠に依ってマークされたより高倍率の領域を示す。図２ＣはＳＥＭに依って検査されたヒト結腸単層の頂端表面トポグラフィーを示す。上側パネル：浸漬培養。下側パネル：ＡＬＩ培養。図２Ｄ及び２Ｅでは、共焦点顕微鏡法に依る視覚化の為に、粘液層に１μｍ赤色蛍光ビーズ（図２Ｄ）又はＧＦＰ発現大腸菌（図２Ｅ）を重層した。腸細胞の核はヘキスト３３３４２に依って染色した。点線は粘液とマイクロビーズ又は大腸菌との間の境界を示す。
【図3】図３Ａから３Ｇは、水和した粘液層が、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）とインキュベーションされた上皮から細菌又はマイクロビーズを分離する事を示す。図３Ａは培養フォーマットを示す概略図である。ＶＩＰはルーメン又は内腔側ＬＳへの水の動きを容易化し、此れは粘液層を水和する。図３Ｂは、２４ｈのインキュベーション後のＶＩＰに依る濃度依存的な水分泌を示すデータのグラフ的な図示である。図３Ｃはピンセットに依って上皮から持ち上げられた水和した粘液層の画像である。図３Ｄは、其々０、２、４、及び６日に於ける細菌を分離する粘液蓄積を有している組織を示す代表的な側面共焦点顕微鏡写真を包含する。ＧＦＰ発現大腸菌及び核が標識されている。図３ＥはＡＬＩの期間に対する粘液厚さのプロットである。図３Ｆは、粘液層が１μｍ赤色蛍光ビーズを上皮から分離したという事を示す代表的な側面共焦点顕微鏡写真である。図３ＧはＳＥＭに依って検査された上皮の頂端表面トポグラフィーの画像を示す。上皮を明らかにする為に、粘液層を部分的に取り除いた（点線）。上側の右パネルは粘液層の上方の且つ上皮表面には不在の細菌（桿状構造）を示す。
【図4】図４Ａから４Ｆは、ＶＩＰに依って強化された粘液層の不在下又は存在下に於けるヒト結腸上皮に対するＣ．ディフィシルＡ毒素の効果を示す。図４Ａは細胞培養系を示す概略的な例解である。図４Ｂ及び４ＣはＡ毒素に対する４ｈ暴露後の上皮の透過性（図４Ｂ）及びＩＬ－８分泌（図４Ｃ）を示す。図４Ｄは共焦点顕微鏡画像を示し、頂端膜のＦ－アクチンアーキテクチャ（上側パネル）及びＺＯ－１に依って染色するタイトジャンクション（下側パネル）を示す。図４Ｅ及び４ＦはＡ毒素に対する８ｈ暴露後の上皮の透過性（図４Ｅ）及びＩＬ－８分泌（図４Ｆ）を示す。対応のないｔ検定：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５；＃統計的に有意ではない。Ｎ＝条件当たり３サンプル。スケールバー＝２０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【0025】
此処で、本開示の主題が本明細書に於いて以降でより詳しく記載され、此れに於いては、本開示の主題の全てではなく幾つかの実施形態が記載される。実際に、本開示の主題は多くの異なる形態で実施され得、本明細書に於いて提示される実施形態に限定されると解されるべきではない；寧ろ、此れ等の実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たす様に提供される。
【0026】
別様に定義されない限り、本明細書に於いて用いられる全ての技術及び科学用語は、本開示の主題が属する分野の業者に依って普通に理解される同じ意味を有する。本明細書に於いて本開示の主題の記載に用いられる術語は、特定の実施形態を記載する目的の為のみであり、本開示の主題について限定的である事を意図しない。
【0027】
本明細書に於いて引用される全ての公開物、特許出願、特許、及び他の参照は、参照が提出されている文及び／又は段落に該当する教示について、其れ等の全体が参照に依って組み込まれる。
【0028】
文脈が別様に指示しない限り、本明細書に記載される本開示の主題の種々の特徴は何れかの組み合わせで用いられ得るという事が特に意図される。其の上、本開示の主題は、本開示の主題の幾つかの実施形態では、本明細書に於いて提示される何れかの特徴又は特徴の組み合わせが排除又は除外され得るという事をもまた企図する。例解すると、明細書が、組成物がコンポーネントＡ、Ｂ、及びＣを含むという事を申し立てる場合には、Ａ、Ｂ、若しくはＣの何れか又は其れ等の組み合わせが単数で又は何れかの組み合わせで除外され得、請求されずにあり得るという事が特に意図される。
【0029】
同類の番号は一貫して同類の要素を言う。図に於いては、或る種の線、層、コンポーネント、要素、又は特徴の厚さは明瞭性の為に誇張され得る。用いられる所では、別様に規定されない限り、破線は任意の特徴又は作用を例解する。
【0030】
本開示の主題及び添付の請求項の記載に用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭に別様に指示しない限り、複数形も包含する事が意図される。
【0031】
また、本明細書に於いて用いられる「及び／又は」は、関連する列記されている項目の何れか及び１つ以上の全ての可能な組み合わせ、並びに選択的に（「又は」）解釈される時には組み合わせの欠如を言い、包摂する。
【0032】
量又は濃度及び同類等の測定可能な値を言う時に本明細書に於いて用いられる用語「約」は、規定の値、及び規定の値の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は更には±０．１％の変動を包摂する事が意味される。例えば、「約Ｘ」は、Ｘが測定可能な値である所では、Ｘ、及びＸの±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は更には±０．１％の変動を包含する事が意味される。測定可能な値について本明細書に於いて提供される範囲は、其の中の何れかの他の範囲及び／又は個々の値を包含し得る。
【0033】
本明細書に於いて用いられる「Ｘ及びＹの間」及び「約Ｘ及びＹの間」等の句はＸ及びＹを包含すると解釈されるべきである。本明細書に於いて用いられる「約Ｘ及びＹの間」等の句は「約Ｘ及び約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹ」等の句は「約Ｘから約Ｙ」を意味する。
【0034】
或る要素が別の要素「の上にある」、に「取り付けられる」、に「接続される」、と「結び付けられる」、「に接触する」等と言われる時には、其れが直接的に他方の要素の上にあり、取り付けられ、接続され、結び付けられ、及び／若しくは接触し得るか、又は介在する要素もまた存在し得るという事は理解されるであろう。対照的に、或る要素が例えば別の要素「の直接的に上にある」、に「直接的に取り付けられる」、に「直接的に接続される」、と「直接的に結び付けられる」、又は「に直接的に接触する」と言われる時には、介在する要素は存在しない。別の特徴「に隣接して」配される構造又は特徴を言う事は、隣接する特徴にオーバーラップするか又は下に重なる部分を有し得るという事もまた当業者に依って了解されるであろう。
【0035】
空間的に相対的な用語、例えば「の下」、「の下方」、「下側」、「の上」、「上側」、及び同類は、図に於いて例解されている通り、別の要素（単数若しくは複数）又は特徴（単数若しくは複数）に対する或る要素の又は特徴の関係性を記載する為の記載の容易さから、本明細書に於いて用いられ得る。
【0036】
第１の、第２の等の用語は、種々の要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は切片を記載する為に本明細書に於いて用いられ得るが、此れ等の要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は切片は此れ等の用語に依って限定されるべきではないという事は理解されるであろう。寧ろ、此れ等の用語は、１つの要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は切片を別の要素、コンポーネント、領域、層、及び／又は切片から区別する為にのみ用いられる。其れ故に、本明細書に於いて論じられる第１の要素、コンポーネント、領域、層、又は切片は、本開示の主題の教示から逸脱する事なしに、第２の要素、コンポーネント、領域、層、又は切片と呼称され得る。作用（又はステップ）のシークエンスは、特に別様に指示されない限り、請求項又は図に於いて提出される順序に限定されない。
【0037】
本明細書に於いて用いられる用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含む（comprising）」は、申し立てられる特徴、完全体、ステップ、作用、要素、及び／又はコンポーネントの存在を規定するが、１つ以上の他の特徴、完全体、ステップ、作用、要素、コンポーネント、及び／又は其れ等の群の存在又は追加を妨げない。
【0038】
本明細書に於いて用いられる移行句「から本質的に成る」は、請求項の範囲が、請求項に記載される規定の材料又はステップと請求される発明の基本的な及び新規の性質（単数又は複数）に実質的に影響しない物とを包摂すると解釈されるべきである事を意味する。其れ故に、用語「から本質的に成る」は、本発明の請求項に用いられる時には、「含む」と同等であると解釈される様に意図されない。
【0039】
本明細書に於いて用いられる用語「増大する」、「増大する事」、「増大した」、「強化する」、「強化された」、「強化する事」、及び「強化」（並びに其れ等の文法上の変形）は、コントロールと比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はより多くの上昇を言い表す。
【0040】
本明細書に於いて用いられる用語「縮減する」、「縮減された」、「縮減する事」、「縮減」、「逓減」、及び「減少」（並びに其れ等の文法上の変形）は、例えば、コントロールと比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の減少を言い表す。特定の実施形態では、縮減は、検出可能な活性又は量を齎さずに又は本質的に齎さずにあり得る（即ち、有意でない量、例えば約１０％又は更には５％未満を齎し得る）。
【0041】
本明細書に於いて用いられる用語「微小物体」は約０．１～１００μｍの寸法を有する物体を意味し、此れは粘液層の透過可能性を決定する為に用いられ得る。微小物体の例は微生物（例えば細菌）及び微粒子（例えばビーズ）を包含するが、是等に限定されない。
【0042】
本開示は、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを作り出す方法の発見を記載し、此れは例えばヒト及び動物対象の腸管及び／又は生殖器官に存在するインビボの粘液層を概括する。厚いインビボ様の粘液バリアは、微生物叢の為のガット環境の首尾良い再現にとって重要であり得、粘膜の薬物及び粒子送達を検討する為のインビトロツールとしても働き得る。粘液産生はインビトロ細胞系に於いて以前に観察されているが、此れ等の系は、インビボの状況で見出される粘液層を模倣する粘液層を再現する様な十分な数量又は密度で粘液を生ずる能力はなかった。何れかの特定の理論に限定される事なしに、此れ等の以前のインビトロ細胞系の粘液は、其れが浸漬培養系に於いて杯細胞から分泌された後に急速に希釈され得、因って、蓄積し高密度の層（微生物及び微粒子にとって実質的に透過不可能）を形成する能力がないという事が本明細書に於いて仮定される。本明細書に記載される通り、本開示の主題は此れ等の限定を克服する。
【0043】
幾つかの実施形態では、且つ図１Ａから１Ｅに示されている通り、本開示は、粘液分泌杯細胞ＧＣ及び他の非粘液産生細胞ＯＣ、例えばエンテロサイト、腸内分泌細胞、パネート細胞、幹細胞等の組み合わせ又は混合物を含有する細胞層を含むリザーバＲ内の生細胞コンストラクト（細胞は細胞に対して内腔側ＬＳ又は頂端側及び基底側ＢＳを有し、多孔質マトリックス（ＰＭ）／足場／ベースを細胞の下方に有する）；並びに、細胞の頂端／内腔側ＬＳの上方に於ける粘液蓄積を容易化して、高密度のインビボ様の粘液層を形成する方法を提供する。ＧＣ対ＯＣの比は幾つかの実施形態では約０．１％から約９９．９％の範囲であり得る。其れ故に、本明細書に於いて開示される生細胞コンストラクトの細胞単層は、幾つかの態様では、粘液産生細胞及び非粘液産生細胞の混合物を含み得る。
【0044】
粘液分泌細胞を含有する細胞層を作り出す為には、上皮幹細胞が多孔質膜の表面上で拡大培養される。細胞を支持する為に、膜は薄い（例えば、約１から１，０００ナノメートル）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）若しくは他の化学物質に依って又は厚い（例えば、約１から約１００，０００マイクロメートル）ハイドロゲル足場材料（ＥＣＭ若しくは合成ハイドロゲル）に依ってコーティングされ得る。表面の或る部分が細胞に依って被覆される迄、細胞は培地中で成長させられる。幹細胞ＳＣは、其れ等が表面を被覆し始める及び／又は隣接する培地中の栄養素を消費するに連れて自発的に分化する事を許され得る。代替的には、細胞は、粘液産生細胞（例えば、杯細胞（ＧＣ））及び他の細胞型（ＯＣ）の形成を促す異なる培地に切り替えられ得るか、又は分化を誘導する為の化学的添加剤が培地に組み込まれ得る（例えば、酪酸、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、ガンマセクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ、ＬＹ４１１５７５、ジベンザゼピン）等。
【0045】
其れから、粘液層が、図２Ａから２Ｅに例解される通り異なる方法を用いて頂端細胞側／内腔細胞側ＬＳに確立され得る。例えば、図２Ａに示されている通り、気液界面（ＡＬＩ）培養が調製され得、此れに於いては液体又は培地が頂端リザーバ又は内腔側ＬＳ又は内腔リザーバから取り除かれる。ＡＬＩ条件は、粘液産生杯細胞ＧＣ及び／又はＯＣ（上皮を形成する）の上方に於いて、（基底側ＢＳとは反対の）内腔側ＬＳの頂端表面に沿って、高密度のコンパクト化した層又はコンパクト化した粘液層ＣＭＬとして、粘液蓄積を可能にする。幾つかの実施形態では、ＡＬＩ条件は、（ａ）分泌される粘液の希釈を最小化する事、（ｂ）表面張力若しくは他の効果を原因とする細胞表面に対する力を増大させる事（此れ等は粘液産生及び／又は分泌を促進する）、及び／又は（ｃ）細胞の上方の局所的な培地オスモラリティを増大させる事等に依って、高密度の又は濃縮された粘液層ＣＭＬの蓄積を許し得る。其れ等の表面に於ける蒸発を原因とする粘液産生杯細胞ＧＣ）を通る水の動きもまた粘液産生を刺激し得る。例１を見よ。
【0046】
別の例として、改変されたＡＬＩ培養が図１Ｂに示されている通り調製され得る。此のアプローチは、細胞単層の上方に蓄積した粘液が、高密度で、水和し、且つインビボ様である、即ち水和した粘液層である様に、粘液産生細胞単層の頂端／内腔側ＬＳ上の液体培地の高さのコントロールを提供する。経時的に蓄積する粘液がＡＬＩの物に対して相対的により水和した状態である様に、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍの範囲の液体又は培地深さが頂端又は内腔細胞側ＬＳの上方に提供及び維持され得る。リザーバＲの内腔側ＬＳの液体／培地の体積は、実験的な必要に依存して幅広い粘液密度及びコンパクト性を有する粘液を生ずる様にコントロールされ得る。
【0047】
幾つかの実施形態では、１つ以上の材料又は物質が、頂端細胞表面の上方に水性のフィルムを維持する事を補助する為に細胞の頂端表面又は内腔側に追加され得、また、経時的に所望の液体高さをプログラミング又は維持する事を補助する為に用いられ得る。例えば、半液体塊（例えばハイドロゲル）、気体不透過性膜、気体透過性膜、及び吸湿材料（蜂蜜、グリセリン、糖、ナイロン、ＡＢＳ（アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン）、ポリカーボネート、セルロース、及びポリ（メタクリル酸メチル））が、頂端表面に置かれ得る。化学試薬、ホルモン、食品代謝物、細菌生成物、及び他の化合物もまた、所望の流体高さ並びに結果的に粘液の厚さ及び密度をもまたプログラミングする事を補助する為に培養系に追加され得る。ホルモンが内腔水分泌を促進する為に基底培地に追加される例２を見よ。
【0048】
此処で図１Ｃに目を向けると、其の上で細胞単層、例えば分化した上皮細胞が培養され得る多孔質膜ＰＭの使用に加えて、幾つかの態様では、斯かる細胞は多孔質の又は非多孔質の足場上で培養又は支持され得る。細胞単層を支持する足場の例は、ハイドロゲル（天然及び合成）、多孔質材料、非多孔質材料、プラスチック、セラミック等を包含するが、是等に限定されない。他の例は無機材料又は有機及び無機材料のコンポジットを包含する。支持体に好適な無機材料の例は、ガラス、ヒドロキシアパタイト、４５Ｓ５バイオガラス等のバイオガラス、リン酸カルシウム、ケイ素、酸化ケイ素、酸化チタン、金、酸化アルミニウム等を包含するが、是等に限定されない。本来的に多孔質ではない所では、此れ等の材料は、焼結、エッチング、リーチング、リソグラフィー等を包含するが是等に限定されない種々の方法に依って多孔質に成され得る。例えば、ケイ素及び金の多孔質メッシュがリソグラフィー／エッチングに依って作製され得る。かかる足場は多孔質膜ＰＭ上で支持され得るか又は其れに隣接して置かれ得る。
【0049】
図１Ｄは、粘液希釈を防止及び粘液の高密度の層の形成を補助する為の、リザーバＲ内の内腔側ＬＳ上の細胞単層の上側に配置されているセパレータ（半透過性の／部分的に透過性の物理的バリア）の使用を示す。セパレータはムチンにとっては不透過性だが例えば水にとっては透過性であり得る。此れ等のセパレータの例は、多孔質膜、ハイドロゲル（例えばアガロース、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル（登録商標）等）、多孔質材料、半液体塊、油（例えばミネラルオイル、パーフルオロカーボン等）、固体フローター（例えばワックス、プラスチック等）、及びメッシュ（ナイロン、フォトレジスト、ポリジメチルシロキサン、及び他の合成ポリマー等）を包含するが、是等に限定されない。セパレータは水性培地（単数又は複数）又は粘液構成成分に対する拡散バリアとして作用し得る。
【0050】
代替的には、幾つかの実施形態では、高密度の粘液層の蓄積を容易化する為に、不透過性の物理的バリア（ブロッカー）もまた図１Ｅに示されている通り用いられ得る。不透過性の物理的バリアは、リザーバＲ内の粘液産生細胞単層の上側に（上方に）、即ち内腔側ＬＳ上に配置され得る。不透過性の物理的バリア又はブロッカーは、其れが粘液蓄積を封じ込める様にムチン及び水にとって不透過性であり得る。ブロッカーの例は、ハイドロゲル（例えばアガロース、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル（登録商標）等）、多孔質材料、油（例えばミネラルオイル、パーフルオロカーボン等）、固体フローター（例えばワックス、プラスチック等）、及びメッシュ（ナイロン、フォトレジスト、ポリジメチルシロキサン、及び他の合成ポリマー等）を包含するが、是等に限定されない。
【0051】
粘液層の密度を更に強化する為に、粘液産生細胞単層の表面上に高密度の粘液層を作り出す為の追加の方法が用いられ得る。例えば、幾つかの実施形態では、ＡＬＩに依って作り出されるメニスカス形成の間に存在し得る表面張力の力のインパクトを（粘液を希釈する事なしに）模倣する為に、表面力又は機械刺激が粘液産生細胞を含む細胞単層の表面に適用され得る。非希釈的な様式で剪断力を行使する為のメカニズムは、攪拌子、細胞の上方の層又は材料の機械的回転、細胞表面上に重層された粘稠な層に依って誘導される表面に平行した前後の動き（此れはロッキング運動を例えば機械的ロッカーに依って提供する事を包含し得る）を包含し得るが、是等に限定されない。粘液産生及び蓄積を容易化する為に、機械刺激が例えば内腔側ＬＳのリザーバＲ内に於いてもまた細胞表面に適用され得る。機械刺激は、流体の流れに依って頂端表面に適用される剪断応力、頂端粘液層の機械的引っ掻き、及び／又は蠕動等を模倣する為の細胞の周期的変形を包含し得るが、是等に限定されない。
【0052】
粘液産生細胞を含む細胞単層の上方に於ける粘液層の形成を容易化する為に、本明細書に於いて記載される方法の何れかの組み合わせが用いられ得る。本明細書に記載される方法及び方法の組み合わせを調整する事に依って、異なる厚さ、異なる密度、及び異なる密度／厚さの領域を包含する異なる特性を有する粘液層が作り出され得る。
【0053】
従って、幾つかの実施形態では、本開示の主題は、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法を提供し得、方法は：（ａ）細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞（例えば、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、及び同類）を上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上に於いて培養する事と；（ｂ）幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞（例えば杯細胞）を含む細胞単層を生ずる事とを含み、細胞単層は基底側及び内腔（頂端）側を有し、細胞単層の粘液産生細胞は細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、且つ粘液層は微小物体にとって実質的に透過不可能であり、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる。幾つかの実施形態では、粘液層は約１ミクロンから約１ｃｍの厚さを有し得る。
【0054】
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法を提供し得、方法は：（ａ）細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞（例えば、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、及び同類）を上側表面及び下側表面を有する細胞支持体構造の上側表面上に於いて培養する事と；（ｂ）幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞（例えば杯細胞）を含む細胞単層を生ずる事とを含み、細胞単層は基底側及び内腔（頂端）側を有し、細胞単層の粘液産生細胞は細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、粘液層は約１ミクロンから１ｃｍの厚さを有し、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる。幾つかの実施形態では、粘液層は微小物体にとって透過不可能又は実質的に透過不可能であり得る。
【0055】
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法を提供し得、方法は：（ａ）細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞（例えば、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、及び同類）を上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上に於いて培養する事と；（ｂ）幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞（例えば杯細胞）を含む細胞単層を生ずる事とを含み、細胞単層は基底側及び内腔（頂端）側を有し、細胞単層の粘液産生細胞は第１の粘液層及び第２の粘液層を細胞単層の内腔側に確立し、第１の粘液層は第２の粘液層の上方に於いて且つ隣接し、第２の粘液層は細胞単層の上方に於いて且つ隣接し、第２の粘液層は微小物体にとって透過不可能又は実質的に透過不可能であり、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる。幾つかの実施形態では、第２の粘液層の厚さは本明細書に更に記載される通り約１ミクロンから約１ｃｍであり得る。
【0056】
幾つかの実施形態では、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法が提供され、方法は：（ａ）細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞（例えば、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、及び同類）を上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上に於いて培養する事と；（ｂ）幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞（例えば杯細胞）を含む細胞単層を生ずる事とを含み、細胞単層は基底側及び内腔（頂端）側を有し、細胞単層の粘液産生細胞は第１の粘液層及び第２の粘液層を細胞単層の内腔側に確立し、第１の粘液層は第２の粘液層の上方に於いて且つ隣接し、第２の粘液層は細胞単層の上方に於いて且つ隣接し、第２の粘液層は約１ミクロンから１ｃｍの厚さを含み、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる。幾つかの実施形態では、第２の粘液層は微小物体にとって透過不可能又は実質的に透過不可能であり得る。
【0057】
幾つかの実施形態では、本開示の主題の方法に於いて、基底リザーバが粘液産生細胞の細胞層の基底側の下方に画定され得、内腔リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側の上方に画定され得、基底リザーバ及び内腔リザーバは其々が液体培地を含み得る；方法は、更に：（ａ）内腔リザーバ内の液体培地を取り除いて、粘液産生細胞を含む細胞層の内腔側に気液界面を生ずる事；及び／又は（ｂ）内腔（頂端）リザーバ内の液体培地の体積を、細胞単層の内腔側の上方に於いて、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲の深さに調整する事を含む。幾つかの実施形態では、粘液層は液体培地及び細胞単層の間に存在するか又は発生する。其れ故に、幾つかの実施形態では、液体の体積は、粘液産生細胞に依る粘液の産生に先行してか、間か、又は後に調整され得る。一度粘液産生細胞が生細胞コンストラクト中に存在すると、少なくとも薄い粘液のフィルムが粘液産生細胞（例えば杯細胞）に依って恒常的に生じ得る。其れから、粘液の厚い層が内腔リザーバ内の液体の体積の調整後に蓄積し得る。幾つかの実施形態では、粘液層は細胞単層の表面上に於いて連続的であり得るか、又は其れは不連続であり得る。
【0058】
幾つかの実施形態では、本開示に有用な幹細胞は、上皮幹細胞、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、呼吸器幹細胞、胃幹細胞、鼻腔幹細胞、生殖器官細胞（子宮頸部、膣、子宮）、尿道細胞、嗅覚細胞、口腔細胞、舌細胞、及び／又は結膜細胞を包含し得るが、是等に限定されない。幾つかの実施形態では、幹細胞は腸上皮幹細胞である。
【0059】
幾つかの実施形態では、粘液産生細胞を含む細胞単層を含む生細胞コンストラクトは、粘液産生細胞（例えば杯細胞）に加えて１つ以上の異なる細胞型（例えば、１、２、３、４、５、又はより多く）を含み得る。本明細書に於いて用いられる「細胞型」は、或る種に於ける形態学的に又は表現型的に別個の細胞形態同士を言う。幾つかの実施形態では、細胞支持体構造上に配置される細胞は、健康な、炎症した、又は有疾患のヒト又は動物組織からであり得る。幾つかの実施形態では、本開示の主題の生細胞コンストラクトを作ることに有用な細胞は、炎症性腸疾患、便秘、嚢胞性線維症、過敏性腸症候群、リーキーガット症候群、細菌異常増殖症候群、セリアック病、乳糖不耐症、過剰ガス症候群、下痢性疾患、及び／又はポリープ・虫垂炎を包含するが、是等に限定されない粘液制御異常を含む疾患を有するヒト又は動物組織からであり得る。
【0060】
幾つかの実施形態では、本開示の主題の細胞層は、例えば図１Ａから１Ｅに例解されている通り平らな２次元的（dimenional）であり得る。幾つかの実施形態では、本開示の主題の細胞単層は、例えばインビボの腸の陰窩構造又は陰窩－絨毛構造を模倣する様に３次元的（dimentional）形状又は構造にもまた折り畳まれ得る。
【0061】
幾つかの実施形態では、本開示の主題の方法は、更に、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の（即ち半透過性の）物理的バリアを粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に又は其の上方一面に（且つ粘液層の上に又は上方／上方一面に）配置する事を含み得る。幾つかの実施形態では、液体／水の動き又は水蒸気の動きをコントロールする事に依って、水の通行が制御され得る。
【0062】
幾つかの実施形態では、不透過性の及び／又は部分的に透過性の物理的バリアは、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に直接的に又は粘液層（既に存在する場合）上に直接的に配置され得る。詰まり、不透過性の及び／又は部分的に不透過性の物理的バリアは、粘液産生細胞及び／又は粘液層との直接的な接触をする様に配置され得る。代替的には、物理的バリアが配置される時には、液体培地が物理的バリアと粘液産生細胞及び／又は粘液層との間に存在し得る。幾つかの実施形態では、物理的バリアと粘液産生細胞及び／又は粘液層との間に存在する時には、液体培地は、細胞単層の内腔側の上方に於いて（及び／又は粘液層の内腔側の上方に於いて）且つ物理的バリアの下方に於いて、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲の深さで存在し得る。
【0063】
幾つかの実施形態では、液体培地の体積は、（物理的バリア有り若しくは無しの）内腔（頂端）リザーバ内に於いて又は細胞の内腔側に於いて、細胞単層の内腔側の上方に於いて約０．００１ｍｍから約１０ｍｍの範囲の深さであり得る（例えば、約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、若しくは１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、１０ｍｍ、又は其の中の何れかの値若しくは範囲）（例えば、約０．００５ｍｍから約１０ｍｍ、０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、０．１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約１０ｍｍ、１ｍｍから約１０ｍｍ、約５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．００１ｍｍから約１ｍｍ、約０．００５から約１ｍｍ、０．０１ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、０．１ｍｍから約１ｍｍ、約０．５ｍｍから約１ｍｍ、約０．００１ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．００５から約０．１ｍｍ、０．０１ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．１ｍｍ、０．１ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．５ｍｍから約０．１ｍｍ、又は其の中の何れかの値若しくは範囲）。
【0064】
本明細書に於いて用いられる「部分的に透過性の物理的バリア」はムチンにとっては不透過性又は実質的に不透過性であるが、水はバリアを通過し得る。其れ故に、幾つかの実施形態では、部分的に透過性の物理的バリアは約１００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有し得る。即ち、バリアは約１００ｋＤａよりも多大な（＞）分子にとって不透過性である。幾つかの実施形態では、部分的に透過性のバリアは約１００から約１５０ｋＤａのＭＷＣＯを有し得る）。ムチンは約２００ｋＤａ～２００ＭＤａの分子量を有する。
【0065】
本明細書に於いて用いられる「不透過性の物理的バリア」は、少なくとも実質的に、好ましくは完全に、液体培地（例えば水）及びムチンにとって不透過性である。
【0066】
其れ故に、幾つかの実施形態では、ムチン産生細胞単層の表面上に又は近くにムチンを封じ込める為に、不透過性の物理的バリア又は部分的に透過性の物理的バリアが用いられ得る。幾つかの実施形態では、其れが細胞単層に依って生ずるに連れてのムチンの液体培地に依る希釈を防止又は縮減する為に、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアが用いられ得る。
【0067】
物理的バリアの限定しない例は、半液体塊（例えばハイドロゲル）、気体不透過性の膜、気体透過性の膜、及び吸湿材料（蜂蜜、グリセリン、糖、ナイロン、ＡＢＳ（アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン）、ポリカーボネート、セルロース、及びポリ（メチルメタクリレート））を包含する。幾つかの実施形態では、部分的に透過性の（例えば、約１００ｋＤａの分子量カットオフ）物理的バリアは、多孔質膜を包含する多孔質材料、幾つかの合成ポリマー、ハイドロゲル（例えば、アガロース、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル（登録商標）等）、幾つかの油、及び／又はメッシュ（例えば、ナイロン、フォトレジスト、ポリジメチルシロキサン、及び他の合成ポリマー等）を包含し得るが、是等に限定されない。幾つかの実施形態では、蒸気透過性の（粘液不透過性の）物理的バリアが用いられ得る。本開示の主題に有用な蒸気透過性の膜の限定しない例は、コーティング／フィラーなしのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、幾つかの合成ポリマー、及び／又はメッシュを包含する。不透過性の膜（水及びムチンにとって不透過性）の限定しない例は、固体フローター（例えば、ワックス、プラスチック等）、メッシュ（ナイロン、フォトレジスト、ポリジメチルシロキサン、及び他の合成ポリマー等）、油（例えば、ミネラルオイル、パーフルオロカーボン、天然油等）、及び／又は合成ポリマーを包含する。
【0068】
幾つかの実施形態では、本開示の主題の生細胞コンストラクトの粘液層の厚さは、約１ミクロンから約１ｃｍ（１０，０００ミクロン）であり得る（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、３３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００ミクロン、又は其の中の何れかの値若しくは範囲）。其れ故に、幾つかの実施形態では、粘液層の厚さは、約２ミクロンから約１ｃｍ、約３ミクロンから約１ｃｍ、約４ミクロンから約１ｃｍ、約５ミクロンから約１ｃｍ、約６ミクロンから約１ｃｍ、約７ミクロンから約１ｃｍ、約８ミクロンから約１ｃｍ、約９ミクロンから約１ｃｍ、約１０ミクロンから約１ｃｍ、約２０ミクロンから約１ｃｍ、約３０ミクロンから約１ｃｍ、約４０ミクロンから約１ｃｍ、約５０ミクロンから約１ｃｍ、約６０ミクロンから約１ｃｍ、約７０ミクロンから約１ｃｍ、約８０ミクロンから約１ｃｍ、約９０ミクロンから約１ｃｍ、約１００ミクロンから約１ｃｍ、約２００ミクロンから約１ｃｍ、約３００ミクロンから約１ｃｍ、約４００ミクロンから約１ｃｍ、約５００ミクロンから約１ｃｍ、約１０００ミクロンから約１ｃｍ、約１５００ミクロンから約１ｃｍ、約３０ミクロンから約７５００ミクロン、約４０ミクロンから約７５００ミクロン、約５０ミクロンから約７５００ミクロン、約６０ミクロンから約７５００ミクロン、約７０ミクロンから約７５００ミクロン、約８０ミクロンから約７５００ミクロン、約９０ミクロンから約７５００ミクロン、約１００ミクロンから約７５００ミクロン、約５００ミクロンから約７５００ミクロン、約１０００ミクロンから約７５００ミクロン、約３０ミクロンから約５０００ミクロン、約４０ミクロンから約５０００ミクロン、約５０ミクロンから約５０００ミクロン、約６０ミクロンから約５０００ミクロン、約７０ミクロンから約５０００ミクロン、約８０ミクロンから約５０００ミクロン、約９０ミクロンから約５０００ミクロン、約１００ミクロンから約５０００ミクロン、約５００ミクロンから約５０００ミクロン、約１０００ミクロンから約５０００ミクロン、約３０ミクロンから約２５００ミクロン、約４０ミクロンから約２５００ミクロン、約５０ミクロンから約２５００ミクロン、約６０ミクロンから約２５００ミクロン、約７０ミクロンから約２５００ミクロン、約８０ミクロンから約２５００ミクロン、約９０ミクロンから約２５００ミクロン、約１００ミクロンから約２５００ミクロン、約２００ミクロンから約２５００ミクロン、約３００ミクロンから約２５００ミクロン、約５００ミクロンから約２５００ミクロン、約１０ミクロンから約１０００ミクロン、約２０ミクロンから約１０００ミクロン、約３０ミクロンから約１０００ミクロン、約４０ミクロンから約１０００ミクロン、約５０ミクロンから約１０００ミクロン、約６０ミクロンから約１０００ミクロン、約７０ミクロンから約１０００ミクロン、約８０ミクロンから約１０００ミクロン、約９０ミクロンから約１０００ミクロン、約１００ミクロンから約１０００ミクロン、約２００ミクロンから約１０００ミクロン、約３００ミクロンから約１０００ミクロン、約５００ミクロンから約１０００ミクロン、約３０ミクロンから約５００ミクロン、約４０ミクロンから約５００ミクロン、約５０ミクロンから約５００ミクロン、約６０ミクロンから約５００ミクロン、約７０ミクロンから約５００ミクロン、約８０ミクロンから約５００ミクロン、約９０ミクロンから約５００ミクロン、約１００ミクロンから約５００ミクロン、約２００ミクロンから約５００ミクロン、約３０ミクロンから約４００ミクロン、約５０ミクロンから約４００ミクロン、約７０ミクロンから約４００ミクロン、約１００ミクロンから約４００ミクロン、約５０ミクロンから約３５０ミクロン、約７０ミクロンから約３５０ミクロン、約１００ミクロンから約３５０ミクロン、約５０ミクロンから約３００ミクロン、約７０ミクロンから約３００ミクロン、約１００ミクロンから約３００ミクロン、約３０ミクロンから約２５０ミクロン、約５０ミクロンから約２５０ミクロン、約３０ミクロンから約２００ミクロン、約５０ミクロンから約２００ミクロン、約１００ミクロンから約２００ミクロン、約３０ミクロンから約１５０ミクロン、約５０ミクロンから約１５０ミクロン、約１ミクロンから約１００ミクロン、約５ミクロンから約１００ミクロン、約１０ミクロンから約１００ミクロン、約２０ミクロンから約１００ミクロン、約３０ミクロンから約１００ミクロン、約５０ミクロンから約１００ミクロン、又は其の中の何れかの範囲若しくは値であり得る。
【0069】
幾つかの実施形態では、本開示の主題の生細胞コンストラクトの粘液産生細胞に依って生ずる粘液層は、微小物体（の集団）（例えば、約０．１ミクロンから約１００ミクロン（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ミクロン（μｍ））のサイズ範囲の微生物又はマイクロ粒子（例えばビーズ））にとって透過不可能又は実質的に透過不可能であり得る（例えば、約０．１から約５μｍ、約０．１から約１０μｍ、約０．１から約２μｍ、約０．１から約３０μｍ、約０．１から約４０μｍ、約０．１から約５０μｍ、約０．１から約６０μｍ、約０．１から約７０μｍ、約０．５から約５μｍ、約０．５から約１０μｍ、約０．５から約２μｍ、約０．５から約３０μｍ、約０．５から約４０μｍ、約０．５から約５０μｍ、約０．５から約６０μｍ、約０．５から約７０μｍ、約０．５から約８０μｍ、約０．５から約９０μｍ、約０．５から約１００μｍ、約１から約５μｍ、約１から約１０μｍ、約１から約２μｍ、約１から約３０μｍ、約１から約４０μｍ、約１から約５０μｍ、約１から約６０μｍ、約１から約７０μｍ、約１から約８０μｍ、約１から約９０μｍ、約１から約１００μｍ、約２から約５μｍ、約２から約１０μｍ、約２から約２０μｍ、約２から約５０μｍ、約２から約７０μｍ、約２から約８０μｍ、約２から約９０μｍ、約２から約１００μｍ、約５から約２０μｍ、約５から約５０μｍ、約５から約７０μｍ、約５から約８０μｍ、約５から約９０μｍ、約５から約１００μｍ、約１０から約２０μｍ、約１０から約５０μｍ、約１０から約７０μｍ、約１０から約８０μｍ、約１０から約９０μｍ、約１０から約１００μｍ、又は其の中の何れかの量若しくは範囲）。粘液の透過可能性を測定する為に有用な微生物は例えば細菌であり得る。当分野に於いて公知である粘液層の透過性を確かめる為に用いられ得る細菌の限定しない例は、例えばフィルミクテス、バクテロイデテス、アクチノバクテリア、プロテオバクテリア、バクテロイデス、クロストリジウム、フィーカリバクテリウム、ユーバクテリウム、ルミノコッカス、ペプトコッカス、ペプトストレプトコッカス、及びビフィドバクテリウムを包含し得る。幾つかの実施形態では、細菌はエスケリキアｓｐｐ．又はラクトバシラスｓｐｐ．の属であり得る）。加えて、粘液層の透過可能性／透過不可能性（impenetrabiltiy）を決定する為に有用な微小物体（microobjective）は、約０．１ミクロンから約１００ミクロンのサイズを有するマイクロ粒子（例えばビーズ）であり得る。一般的に、透過性を測定する為に有用なマイクロ粒子は球状であり、１つ以上のポリマーに依って構成される（例えばビーズ）。
【0070】
本明細書に於いて用いられる「実質的に透過不可能」は、微小物体の集団の約７０％超が粘液層を透過する能力がない（例えば、微小物体の集団の約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％超、及び其の中の何れかの範囲又は値；例えば、約７０％から約９９％、約７５％から約９９％、約８０％から約９９％、約８５％から約９９％、約９０％から約９９％、約９５％から約９９％、及び其の中の何れかの範囲又は値は、粘液層を透過する能力がない）、及び／又は透過する微小物体が粘液層の厚さ中へと約３０％未満の距離（又は粘液層の内腔側から粘液層の基底側への距離の３０％未満）を移動し得る（例えば、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％；例えば、約０．５％から約３０％、約１％から約３０％、約５％から約３０％、約１０％から約３０％、約１５％から約３０％、約２０％から約３０％、約０．５％から約２０％、約１％から約２０％、約５％から約２０％、約１０％から約２０％、約１５％から約２０％、約２０％から約２５％、約０．５％から約１５％、約１％から約１５％、約５％から約１５％、約１０％から約１５％、約０．５％から約１０％、約１％から約１０％、約５％から約１０％、約０．５％から約５％、約１％から約５％、約２．５％から約５％、約０．５％から約１％、及び其の中の何れかの範囲又は値）という事を意味する。幾つかの実施形態では、実質的に透過不可能である粘液層は、微小物体の集団の９０％超（例えば、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、及び其の中の何れかの範囲又は値；例えば約９０％から約９９％）にとって透過不可能であり得る。幾つかの実施形態では、実質的に透過不可能である粘液層は９０％超にとって透過不可能であり得、透過する微小物体は粘液層の内腔側から粘液層の基底側への距離の１０％未満（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％未満）を移動する。
【0071】
本明細書に於いて用いられる「透過不可能」は、微小物体の集団の約９９％超（例えば、約９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９、１００％、及び其の中の何れかの範囲又は値；例えば９９～１００％）が粘液層を透過する能力がない、及び／又は透過する微小物体が粘液層の厚さ中へと約１０％未満の距離を移動する（例えば、粘液層の内腔側から粘液層の基底側への距離の１０％未満）（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％未満）という事を意味する。
【0072】
本明細書に於いて用いられる「細胞支持体構造」は、其れの上に１つ以上の細胞及び／又は組織が配置され得る何れかの構造であり得、例えば何れかの多孔質又はメッシュ膜を包含する有機、無機、又は其れ等のコンポジットであり得る。
【0073】
幾つかの実施形態では、細胞支持体構造は、典型的には下で論じられる他の成分との組み合わせで、コラーゲン等の有機ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、支持体は多孔質である。支持体は、下でもまた論じられる通り、其れに構造的な支持を持たせる為に、多孔質担体（例えば、多孔質膜、メッシュ、無機グリッド、ハイドロゲル、又は其れ等の組み合わせ）上に提供又はマウントされ得る。支持体は、（例えば、肉眼的解剖的構造を真似る為に）平らな、管状の、湾曲した、球形の、楕円体等を包含する何れかの好適な形状又は構成であり得、其れ等の（there）コンポジットを包含する。
【0074】
其れ故に、本開示の主題に有用な細胞支持体構造は、膜、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）、ハイドロゲル、天然若しくは合成ポリマー、及び／又は２若しくは３次元的な足場、並びに／或いは其れ等の何れかの組み合わせを包含し得るが、是等に限定されない。幾つかの実施形態では、例えば、内腔リザーバの下側の壁は細胞支持体構造（例えば膜）であり得る。幾つかの実施形態では、細胞支持体構造はマイクロ構造を含み得る（例えば、約１ｍｍ未満のサイズを有するフィーチャ（例えば、約１００、２００、又は３００ミクロンの深さ、最高で８００又は１０００ミクロンの深さ若しくはより多く、及び／又は約１０又は５０ミクロンの幅、最高で１００又は２００ミクロンの幅若しくはより多く；例えば、マイクロウェル、ポスト、及び／又は溝）。幾つかの実施形態では、細胞支持体構造は、例えばポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、酢酸セルロース、再生セルロース、セルロースニトリド、ナイロン、カーボングリッド、グラフェンフィルム、ガラス、バイオガラス（例えば、４５Ｓ５バイオガラス）、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、金、ニッケル、及び／若しくはステンレス鋼、又は其れ等の何れかの組み合わせに依って構成され得る。
【0075】
幾つかの実施形態では、天然には多孔質でない本開示の主題の細胞支持体構造として有用な材料は、焼結、エッチング、リーチング、リソグラフィー、レーザーマイクロマシニング等を包含するが、是等に限定されない方法に依って多孔質に成され得る。例えば、ケイ素及び金の多孔質メッシュがリソグラフィー／エッチングに依って作製され得る。幾つかの実施形態では、フォトリソグラフィーに依ってマイクロ若しくはナノポアを有するフィルム又はマイクロ若しくはナノメッシュへと作製されるフォトレジスト等の光反応性ポリマーが、細胞支持体構造に用いられ得る。幾つかの実施形態では、ソフトリソグラフィー又はモールド成形に依って多孔質フィルム又はマイクロ／ナノメッシュへと作製されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）又はＥｃｏＦｌｅｘ等のエラストマーフィルムもまた、細胞支持体構造として用いられ得る。幾つかの実施形態では、細胞支持体構造は、脱水された又はフレキシブルだが強いマトリックス、例えばコラーゲン若しくはフィブリンフィルム又はコンポジットでもまたあり得る。
【0076】
細胞及び／又は組織は、追加の接着蛋白質又は細胞外マトリックス有り又は無しに、細胞支持体構造又は足場上に置かれ得る。幾つかの実施形態では、足場は、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレス・ホルム・スワームマウス肉腫細胞に依って分泌されるゼラチン質蛋白質混合物（例えばマトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及び／又は市販で利用可能な細胞基質（例えば、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）ＣＴＳ（商標））、及び其れ等の何れかの組み合わせ（例えば、コラーゲン／マトリゲル（登録商標）混合物）を包含するが是等に限定されない細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を含み得る。幾つかの実施形態では、天然ポリマー、合成ポリマー、及びハイブリッドハイドロゲルからのハイドロゲルが、２次元又は３次元で足場を築く為に用いられ得る。天然ポリマー及び合成ポリマーの例は、キトサン、アガロース、アルギン酸（例えば、ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（登録商標））、フィブリン、絹、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、合成ペプチド、ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド、及び／又はポリアクリルアミド、及び／又は其れ等の何れかの組み合わせを包含するが、是等に限定されない。幾つかの実施形態では、足場の表面は、ポリ－ｌ－リジン、ＲＧＤペプチド、及び他のインテグリン認識ペプチドセグメントを包含するが是等に限定されないＥＣＭ分子、天然若しくは合成ポリマー、又は合成ペプチドの何れか１つ又は組み合わせに依って、細胞接着を促進する様に人工され得る。幾つかの実施形態では、本開示の主題に有用な細胞支持体構造は、細胞性材料（免疫細胞若しくは他の細胞型、組織、血液）又は非細胞性材料（薬物、ポリマービーズ、磁性粒子等）と混合され得る。幾つかの実施形態では、細胞支持体構造は２又は３次元的なマイクロパターン又はマイクロ構造を含み得る。
【0077】
幾つかの実施形態では、生細胞コンストラクトの細胞は、例えば、細胞層を通る水平衡に寄与し、其れに依って粘液層の形成を補助し得る添加剤、化合物、及び／又は溶液を含む液体培地に依って培養され得る。幾つかの実施形態では、添加剤、化合物、及び／又は溶液は、ホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液を包含し得るが、是等に限定されない。幾つかの実施形態では、添加剤、化合物、及び／又は溶液は、内腔リザーバ（細胞単層の内腔側）内に及び／又は基底リザーバ（細胞単層の基底側）内に存在し得る／導入され得る。其れ故に、例えば、細胞単層を通る流体の動きの平衡を補助する為に、腸ルーメンへの水及び電解質の分泌を刺激するホルモンが細胞単層の基底側（基底リザーバ）に追加され得る。対照的に、食品添加剤及び細菌代謝物が細胞単層の内腔側（内腔リザーバ）に追加され得る。
【0078】
幾つかの実施形態では、本開示の主題に有用なホルモンは、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン、５－ＨＴ）、Ｐ物質、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、ガストリン、コレシストキニン、セクレチン、グレリン、モチリン、胃抑制ポリペプチド、レプチン、グルカゴン様ペプチド、ソマトスタチン、及び／又はニューロテンシンを包含し得るが、是等に限定されない。
【0079】
有用な化学的添加剤の限定しない例は、酪酸、ジベンザゼピン、ガンマセクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ、ＬＹ４１１５７５）、フォルスコリン、グアイフェネシン、カルバコール、プロスタグランジン、ホルボール（phorbal）エステル（ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート）、ヒスタミン、及び／又はＮ－（１－オキソブチル）－環状３’，５’－（リン酸水素）２’－ブタノアート－アデノシン一ナトリウム塩（即ち、ジブチリル－ｃＡＭＰナトリウム塩）（ＣＡＳ１６９８０－８９－５）を包含するが、是等に限定されない。
【0080】
例示的な食品添加剤はＮ－ニトロソアナバシン、マタイレシノール（matairesimol）、及び／又はカフェインを包含する。
【0081】
幾つかの実施形態では、細菌代謝物は短鎖脂肪酸を包含し得るが、此れに限定されない。
【0082】
幾つかの実施形態では、本開示の主題に有用である高張塩溶液中の塩は、ナトリウム、塩素、カリウム、マグネシウム、リン酸、炭酸、及び／又はリチウムを包含し得るが、是等に限定されない。幾つかの実施形態では、高張溶液中の塩の濃度は、約１ｍＭから約１０００ｍＭであり得る（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、３３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、１０００ｍＭ、及び其の中の何れかの値又は範囲）。其れ故に、幾つかの実施形態では、溶液中の塩の濃度は、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約５ｍＭから約１００ｍＭ、約１０ｍＭから約１００ｍＭ、約１０ｍＭから約２５０ｍＭ、約１０ｍＭから約５００ｍＭ、約１０ｍＭから約１０００ｍＭ、約５０ｍＭから約１００ｍＭ、約５０ｍＭから約５００ｍＭ、約５０ｍＭから約１０００ｍＭ、約１００ｍＭから約２５０ｍＭ、約１００ｍＭから約５００ｍＭ、約１００ｍＭから約１０００ｍＭ、約２００ｍＭから約５００ｍＭ、約２００ｍＭから約１０００ｍＭ、約３００ｍＭから約５００ｍＭ、約３００ｍＭから約８００ｍＭ、約３００ｍＭから約１０００ｍＭ、約４００ｍＭから約５００ｍＭ、約４００ｍＭから約８００ｍＭ、約４００ｍＭから約１０００ｍＭ、約５００ｍＭから約７５０ｍＭ、約５００ｍＭから約１０００ｍＭ、約６００ｍＭから約１０００ｍＭ、約７００ｍＭから約１０００ｍＭ、約８００ｍＭから約１０００ｍＭ、及び其の中の何れかの値又は範囲であり得る。
【0083】
細胞及び／又は組織の成長／維持に有用な何れかの物質が基底リザーバ又は内腔リザーバに導入され得る。幾つかの実施形態では、物質は、フィブロネクチン；ラミニン；上皮成長因子（ＥＧＦ）；Ｒ－スポンジン（spondin）；ノギン（Noggin）；サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））；エフリン受容体（例えば、エフリンＢ、ＥｐｈＢ）；骨形成蛋白質（ＢＭＰ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７）；Ｗｎｔ（ウイングレス関連インテグレーション部位）（例えば、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、及び他のＷｎｔ）；ノッチシグナル伝達因子（ノッチ受容体）；Ｄｌｌ１／４；ノギン（Noggin）；Ｇｒｅｍ１；Ｇｒｅｍ２；酢酸；酪酸；プロピオン酸（proprionate）、デスアミノチロシン、カテコールアミン（例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン）、サイトカイン、及び／又は短鎖脂肪酸を包含し得るが、是等に限定されない。
【0084】
幾つかの実施形態では、粘液層を確立する事を補助する為に、力が例えば細胞層の表面に平行して適用され得る。幾つかの実施形態では、力は例えば表面張力の力（例えば、気液界面（ＡＬＩ））の適用であり得るか、又は其れは機械的な力の適用に依ってであり得る。機械的な力の適用の限定しない例は、攪拌子、細胞表面に平行して半固体材料（例えば、ハイドロゲル）を動かす事、及び／又は細胞表面の上側に於いてスラリーを循環させる事に依って作り出される動きを包含する。
【0085】
本開示の主題は、更に、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを提供し、粘液層は、微小物体（例えば、微生物（例えば細菌）又はマイクロ粒子（例えばビーズ））にとって透過不可能又は実質的に透過不可能である。幾つかの実施形態では、粘液層は、約０．１から約１００ミクロンのサイズ範囲の微小物体にとって透過不可能又は実質的に透過不可能であり得る。幾つかの実施形態では、粘液層は厚さ（深さ）が約１ミクロンから約１ｃｍであり得る。幾つかの実施形態では、本開示の主題の生細胞コンストラクトの粘液層は基底側及び内腔側を含み得、基底側は粘液層の下方で且つ粘液産生細胞に隣接し（直接的に上方であり）、内腔側は粘液及び粘液産生細胞の上方で且つ内腔リザーバ内の液体培地又は空気に隣接する（直接的に下方である）。
【0086】
本開示の主題は、更に、本開示の主題の生細胞コンストラクトを用いる方法を提供し、（ａ）細胞の粘液層を横断する（透過する）生物、薬物、又は粒子の能力；（ｂ）生物に依る侵入又は粒子及び／若しくは化学物質／化合物との接触に対する粘液層を含む細胞の免疫学的応答；（ｃ）粘液層を含む細胞に感染する生物の能力；（ｄ）生物に依る感染を防止するか又は感染する生物の能力を縮減する薬物の有効性；（ｅ）炎症性腸疾患、便秘、嚢胞性線維症、過敏性腸症候群、リーキーガット症候群、細菌異常増殖症候群、セリアック病、乳糖不耐症、過剰ガス症候群、下痢性疾患、及び／又はポリープ・虫垂炎を包含するが是等に限定されない疾患に於ける粘液の制御異常を研究する事を包含するが、是等に限定されない。
【0087】
其れ故に、幾つかの実施形態では、本開示の主題は、細胞単層の粘液層を横断する（透過する）生物、薬物、又は粒子の能力を決定する方法を提供し：本開示の主題の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、薬物、又は粒子と接触させる事と；生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと／を通って（例えば、粘液層の内腔側から粘液層の基底側に）動く距離を測定し、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層を横断する（透過する）生物、薬物、又は粒子の能力を決定する事とを含む。幾つかの実施形態では、生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと動く距離は経時的に測定され得、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層中への／を通る生物、薬物、又は粒子の動きの速度を決定する。
【0088】
幾つかの実施形態では、粘液層を含む細胞単層に感染する生物の能力を研究及び評価する方法が提供され、方法は：本開示の主題の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物と接触させる事と；生物が粘液層を横断し、生細胞コンストラクトの細胞単層に接触するかどうかを決定する事とを含む。生物が粘液層を横断し細胞単層に接触すると決定される時には、生物は、粘液層を含む細胞単層に感染する能力があると決定される。
【0089】
幾つかの実施形態では、生物に依る感染を防止するか又は感染する生物の能力を縮減する薬物の有効性を評価する方法が提供され：本開示の主題の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物と接触させる事と；生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を薬物と接触させる事と、生物が粘液層を透過及び／又は生細胞コンストラクトの細胞単層の１つ以上の細胞に感染するかどうかを決定する事とを含む。生物が、コントロール（即ち、生物とは接触させられるが、薬物とは接触させられない）と比較して粘液層を透過しない及び／又は生細胞コンストラクトの細胞単層の１つ以上の細胞に感染しない場合には、薬物は、感染を防止する事又は感染する生物の能力を縮減する事に有効であると決定される。幾つかの実施形態では、生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物と接触させる事は、生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を薬物と接触させる事に先行するか、同時か、又は後である。幾つかの実施形態では、生物の約２５％から約１００％が粘液層を透過する事を防止及び／又は殺害される時には、薬物は有効であると決定され得る（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、及び其の中の何れかの範囲又は値が、粘液層を透過する事を防止及び／又は殺害される。
【0090】
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、生物の侵入、粒子に依る接触、及び／又は化学物質／化合物に依る接触に対する粘液層を含む細胞単層の免疫学的応答を評価する方法を提供し：本開示の主題の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、粒子、及び／又は化学物質／化合物と接触させる事と；生細胞コンストラクトの細胞単層の細胞を免疫応答に関連するマーカー（例えば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、神経伝達物質、及び／又は抗微生物ペプチド）の産生についてアッセイする事とを含み、其れに依って、生物、粒子、及び／又は化学物質／化合物に依る接触に対する生細胞コンストラクトの細胞単層の免疫学的応答を評価する。
【0091】
幾つかの実施形態では、化学物質及び／又は化合物は、食物代謝物及び／又は細菌代謝物、例えばビタミン又は短鎖脂肪酸を包含し得るが、是等に限定されない。
【0092】
本開示の主題の方法及び生細胞コンストラクトを用いて研究され得る生物は、何れかの生物であり得、例えば細菌、ウイルス、真菌、原虫、及び／又は蠕虫を包含する。其れ故に、例えば、生物に依る感染を防止／感染する生物の能力を縮減する薬物の有効性を評価する為に及び／又は生物に依る接触に応答した生細胞コンストラクトの細胞の免疫学的応答を評価する為に、何れかの細菌、ウイルス、真菌、原虫、又は蠕虫は、細胞の粘液層を透過する其の能力について研究され得る。
【0093】
幾つかの実施形態では、生物は細菌であり得る。細菌の限定しない例は、エスケリキアｓｐｐ．、エルシニアｓｐｐ．、サルモネラｓｐｐ．、カンピロバクターｓｐｐ．、クロストリジウムｓｐｐ．、ヘリコバクターｓｐｐ．、バクテロイデスｓｐｐ．、ペプトストレプトコッカスｓｐｐ．、ビブリオｓｐｐ．、シゲラｓｐｐ．、サルモネラｓｐｐ．、リステリアｓｐｐ．、及びスタフィロコッカスｓｐｐ．の属からの物を包含する。幾つかの実施形態では、細菌は、アシネトバクター・バウマニ、アクチノマイセス・イスラエリ、バシラス・アンスラシス、バクテロイデス・フラジリス、バルトネラ・ヘンセラエ、ボルデテラ・パーツシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・ガリニイ、ボレリア・アフゼリル、ボレリア・リカレンシス、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、バークホルデリア・シュードマレイ、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、クラミドフィラ・シッタシ、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・アミコラタム、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、コクシエラ・バーネティ、エールリキア・カニス、エールリキア・シャフェンシス、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、腸管出血性大腸菌、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム・レプラエ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンジティディス（meningitidus）、パラクラミジア、シュードモナス・エルギノーザ、ノカルジア・アステロイデス、リケッチア・リケッチ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・エンテリカ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ビリダンス、トレポネーマ・パリダム、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・バルニフィカス、ビブリオ・パラヘモリティカス、及び／又はエルシニア・ペスティスを包含し得るが、是等に限定されない。
【0094】
幾つかの実施形態では、生物は原虫であり得る。原虫の限定しない例は、アメーボゾア、エクスカバータ、及び／又はクロムアルベオラータの門からの物を包含する。幾つかの実施形態では、原虫は、アメーバｓｐｐ．、エントアメーバｓｐｐ．、プラスモジウムｓｐｐ．、ジアルジアｓｐｐ．、及び／又はトリパノソーマｓｐｐ．の属からの物を包含し得るが、是等に限定されない。幾つかの実施形態では、原虫は、エントアメーバ・ヒストリティカ、クリプトスポリジウム・パルバム、クリプトスポリジウム・ホミニス、サイクロスポラ・カエタネンシス、及び／又はジアルジア・ランブリアを包含し得るが、是等に限定されない。
【0095】
幾つかの実施形態では、生物はウイルスであり得る。ウイルスの限定しない例は、単純ウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、カリシウイルス、マストアデノウイルス、アルファパピローマウイルス、ベータパピローマウイルス、ガンマパピローマウイルス、ミューパピローマウイルス、ニューパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、モルシポックスウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アルファトルクウイルス、ベータトルクウイルス、ガンマトルクウイルス、ゲミサーキュラーウイルス、エリスロウイルス、ディペンドウイルス、ボカウイルス、コルチウイルス、ロタウイルス、シードルナウイルス、ヘペウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、トロウイルス、マムアストロウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペギウイルス、カルディオウイルス、コサウイルス、エンテロウイルス、ヘパトウイルス（例えばＡ型肝炎）、コブウイルス、パレコウイルス、ロサウイルス、サリウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、デルタウイルス、リッサウイルス、ベシキュロウイルス、フィロウイルス科、エボラウイルス、マールブルグウイルス、パラミクソウイルス科、ヘニパウイルス、モルビリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、メタニューモウイルス、ニューモウイルス、アレナウイルス、ペリブニヤウイルス科、オルトブニヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フェヌイウイルス科、フレボウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、及び／又はオルトヘパドナウイルスを包含する。
【0096】
幾つかの実施形態では、生物は、腸管吸虫、回虫、蟯虫、及び／又は条虫を包含するが、是等に限定されない蠕虫であり得る。幾つかの実施形態では、蠕虫は、アスカリスｓｐｐ．、アンシロストーマｓｐｐ．、トリクリスｓｐｐ．、ストロンギロイデスｓｐｐ．、ネカトールｓｐｐ．、スキストソーマｓｐｐ．、及び／又はトリキネラｓｐｐ．の属からの蠕虫を包含し得るが、是等に限定されない。蠕虫の更なる限定しない例は、アスカリス・ランブリコイデス（回虫）、アンシロストーマ・ドゥオデナーレ（鉤虫）、ネカトール・アメリカヌス（鉤虫）、ストロンギロイデス・ステルコラリス、トリキネラ・スピラリス、及び／又はトリクリス・トリキウラ（鞭虫）を包含する。
【0097】
幾つかの実施形態では、生物は真菌であり得る。真菌の限定しない例は、カンジダｓｐｐ．、アスペルギルスｓｐｐ．、ムコールｓｐｐ．、フザリウムｓｐｐ．、ブラストミセスｓｐｐ．、コクシジオイデスｓｐｐ．、クリプトコッカスｓｐｐ．、ヒストプラスマｓｐｐ．、リゾプスｓｐｐ．、リクテイミアｓｐｐ．、ニューモシスティスｓｐｐ．、スポロスリックスｓｐｐ．、及び／又はカニングハメラｓｐｐ．の属からの物を包含する。真菌の更なる限定しない例は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ニガー、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、ニューモシスティス・イロベチイ、及び／又はトルロプシス・グラブラタを包含する。
【0098】
本開示の主題は、更に、インビトロ細胞系に於いて粘液制御異常を評価する方法を提供する。幾つかの実施形態では、インビトロ細胞系に於いて粘液制御異常を評価する方法は、粘液制御異常に関連する疾患を有する対象からの幹細胞から本開示の主題の生細胞コンストラクトを作り出す事を含む。幾つかの実施形態では、本開示の主題の生細胞コンストラクトは、ゲノム編集（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ）に依って粘液制御異常に関連する疾患からの細胞を概括する様に改変されている健康な対象からの幹細胞から作り出され得る。其れから、其の様に作り出されたインビトロ細胞系からの粘液層は、本明細書に記載される通り、厚さ、組成、粘度、微小物体に依る透過度、感染する微生物の能力、及び／又は薬物に対する応答性を包含するが是等に限定されない性質について研究され得る。粘液制御異常に関連する疾患は、炎症性腸疾患、便秘、嚢胞性線維症、過敏性腸症候群、リーキーガット症候群、細菌異常増殖症候群、セリアック病、乳糖不耐症、過剰ガス症候群、下痢性疾患、及び／又はポリープ・虫垂炎を包含するが、是等に限定されない。
【0099】
此処で、本開示の主題が次の例の参照に依って記載される。此れ等の例は、請求項の範囲を本開示の主題に限定する事を意図せず、寧ろ、或る種の実施形態を例示する事が意図されるという事は了解される筈である。当業者に思い浮かぶ例示される方法の何れかの変形は、本開示の主題の範囲内に収まる事が意図される。
【実施例0100】
次の例は本開示の主題の種々の実施形態を更に例解する為に包含される。然し乍ら、本開示に照らして、当業者は、本開示の主題の趣旨及び範囲から逸脱する事なしに、開示される具体的な実施形態に多くの変更が成され得るという事を了解し、依然として同類の又は類似の結果を得る筈である。
【0101】
例１～４の材料及び方法
コラーゲンハイドロゲル上に於けるヒト結腸上皮幹細胞のインビトロ拡大培養．ヒト由来腸上皮幹細胞を拡大培養する為には、単層培養技術を以前に公開されたプロトコールに従って用いた２７，３０。手短には、結腸陰窩を死体ドナー（男性、２３歳）の横行結腸組織標本から単離し、１，０００陰窩／標準的な６ウェル培養プレート（１ｍｍ厚コラーゲンハイドロゲルを保有する）のウェルの密度でコラーゲンハイドロゲルに直接的にプレーティングし、４ｍＬの幹細胞用培地を重層した（ＳＭ－表１）。培地は４８時間毎に換えた。細胞のコンフルエンシーが≧８０％に達した時に（典型的には５～７日）、単層を継代し、新鮮なコラーゲンハイドロゲル上で１：３の継代比で継代培養した２７，３０。細胞をＰ１１に於いて核型分析し、１０個の塗沫標本中の１０個が正常な核型を呈した。本明細書の全ての実験は細胞をＰ１５未満の継代数で用いた。
コラーゲンハイドロゲル上に於けるヒト結腸上皮幹細胞のインビトロ拡大培養．ヒト由来腸上皮幹細胞を拡大培養する為には、単層培養技術を以前に公開されたプロトコールに従って用いた２７，３０。手短には、結腸陰窩を死体ドナー（男性、２３歳）の横行結腸組織標本から単離し、１，０００陰窩／標準的な６ウェル培養プレート（１ｍｍ厚コラーゲンハイドロゲルを保有する）のウェルの密度でコラーゲンハイドロゲルに直接的にプレーティングし、４ｍＬの幹細胞用培地を重層した（ＳＭ－表１）。培地は４８時間毎に換えた。細胞のコンフルエンシーが≧８０％に達した時に（典型的には５～７日）、単層を継代し、新鮮なコラーゲンハイドロゲル上で１：３の継代比で継代培養した２７，３０。細胞をＰ１１に於いて核型分析し、１０個の塗沫標本中の１０個が正常な核型を呈した。本明細書の全ての実験は細胞をＰ１５未満の継代数で用いた。
【0102】
ヒト結腸上皮の単層上の粘液層の生成．多孔質膜（０．４μｍポアサイズ、コーニング・インコーポレイテッド（Corning Incorporated）、＃３４６０）を保有するトランズウェルインサートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に於いて３７℃で一晩、１ｖｏｌ％マトリゲルに依ってコーティングした。細胞プレーティングに先行して、インサートをＰＢＳ×１に依ってリンスした。腸上皮細胞は上に記載されている手続きに従って継代した。ただし、細胞は拡大培養培地に懸濁し（ＥＭ－表１）、トランズウェルインサートの上側区画に直接的にプレーティングした。６ウェルプレートの１つのウェルからの細胞を６つの別々の１２ウェルトランズウェルインサート内に分散した（上側［頂端］リザーバ内に１ｍＬ、下側［基底］リザーバ内に２ｍＬ）。培地は４８ｈ毎に交換した。細胞分化及び粘液産生を誘導する為に、培地を５日後に分化培地に切り替えた（ＤＭ－表１）。浸漬培養には、１ｍＬのＤＭを頂端リザーバに、２ｍＬを基底リザーバに追加した。其の後、培地を４８ｈ毎に交換した。ＡＬＩ培養には、頂端リザーバ内の培地を完全に吸い取り、１ｍＬのＤＭ又はＤＭ－ＶＩＰ（３３０ｎｇ／ｍＬのＶＩＰ［アナスペック・インク（AnaSpec, Inc.）、＃ＡＳ－２２８７２］を含有するＤＭ）を基底リザーバに追加し、其の後、培地を２４ｈ毎に交換した。第１０日迄に、系はキャラクタリゼーション及びサイトカインアッセイに好適であった。
【0103】
【表1】
【0104】
ヒト結腸上皮及び粘液層のキャラクタリゼーション．細胞及び粘液層をカルノア液（エタノール６：酢酸３：クロロホルム１、ｖ／ｖ／ｖ）に依って４℃で２ｈに渡って固定した。組織をエタノールに依って脱水し、切片化の為にパラフィン包埋した。切片を抗Ｍｕｃ２抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）、＃ｓｃ－１５３３４）に依って染色して粘液層を明らかにし（Ｍｕｃ２は結腸粘液層の主要な構造コンポーネントである）、細胞の核のＤＮＡはヘキスト３３３４２に依って染色した（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、＃６２２４９）３０。粘液層及び細胞の頂端の特徴を明らかにする為に、組織を（浸漬及びＡＬＩ培養では）カルノア液又は（ＤＭ－ＶＩＰありのＡＬＩ培養では）グリオキサール何方かに依って４℃で２ｈに渡って固定し、段階的なエタノールに依って脱水し（２５％、５０％、７５％、及び１００％）、臨界点乾燥装置（トーシミス・リサーチ・コーポレーション（Tousimis Research Corporation）Ｓｅｍｉｄｒｉ－ＰＶＴ３）に依って乾燥し、スパッタコーター（クレシントン・サイエンティフィック・インスツルメンツ（Cressington Scientific Instruments）１０８）に依って１０ｎｍ金属でコーティングし、ＳＥＭ（ＦＥＩ－Ｑｕａｎｔａ２００ＥＳＥＭ、ＦＥＩカンパニー）に依って検査した。
粘液層の細菌分離能を実証する為には、２μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２を含有する１ｍＬ培地を基底リザーバに１ｈに渡って追加する事に依って、上皮生細胞を第１にヘキスト３３３４２に依って染色し、其れから、２億コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬの密度のＧＦＰ－ＥＣ（ＡＴＣＣ、＃２５９２２ＧＦＰ）又は１０８ビーズ／ｍＬの密度の１μｍ赤色蛍光ビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、＃Ｆ１３０８３）の０．５ｍＬの懸濁液を頂端リザーバに追加した。２０ｍｉｎの播種後に、トランズウェルインサートをカバーガラス上に置き、組織をオリンパス株式会社ＦｌｕｏＶｉｅｗ－ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡に依ってイメージングした。
粘液層の細菌分離能を実証する為には、２μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２を含有する１ｍＬ培地を基底リザーバに１ｈに渡って追加する事に依って、上皮生細胞を第１にヘキスト３３３４２に依って染色し、其れから、２億コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬの密度のＧＦＰ－ＥＣ（ＡＴＣＣ、＃２５９２２ＧＦＰ）又は１０８ビーズ／ｍＬの密度の１μｍ赤色蛍光ビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、＃Ｆ１３０８３）の０．５ｍＬの懸濁液を頂端リザーバに追加した。２０ｍｉｎの播種後に、トランズウェルインサートをカバーガラス上に置き、組織をオリンパス株式会社ＦｌｕｏＶｉｅｗ－ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡に依ってイメージングした。
【0105】
Ａ毒素実験．０又は１２μｇ／ｍＬの天然のＣ．ディフィシルＡ毒素蛋白質（アブカムＰＬＣ（Abcam PLC）、＃ａｂ１２３９９９）及び５ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－デキストラン（シグマ・アルドリッチＣｏ．ＬＬＣ（Sigma-Aldrich Co. LLC）、＃ＦＤ４０Ｓ）の混合物の２０μＬを、ヒト結腸上皮単層（±粘液）の頂端側に追加した。此れは広がって１８０μｍ液体層を形成した。１ｍＬのハンクス平衡塩溶液（カルシウム／マグネシウム有り。１０％ウシ胎児血清及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補った）を基底区画に追加した。１５０μＬのサンプルを基底区画から２、４、８、及び２４ｈに於いて収集した。収集されたサンプルの蛍光強度をマイクロプレートリーダーに依って測定し、パーセントの透過性を％透過性＝１００×（サンプル－ブランク）／（トランズウェル－ブランク）として計算した。式中、「トランズウェル」は細胞なしのインサートから収集された液体を指示する。細胞をエタノールに依って固定し、ファロイジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、＃Ｒ３７１１０）及びＺＯ－１抗体（プロテインテックグループ・インク（Proteintech Group, Inc.）、＃２１７７３－１－ＡＰ）に依って染色して、Ｆ－アクチン及びタイトジャンクションを明らかにした。
【0106】
大腸菌及びＰＢＭＣとの共培養．新鮮な正常なヒトＰＢＭＣをフィジシャンズ・プラズマ・アライアンス（Physician's Plasma Alliance）（ジョンソンシティ、ＴＮ）から購入した。ＰＢＭＣを１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ培地に２８６万細胞／ｍＬで懸濁した。ＧＦＰ－ＥＣを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを有する栄養素ブロスに依って培養した。２億ｃｆｕ／ｍＬの密度のＧＦＰ－ＥＣの懸濁液を１０ｍＬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に依って調製し、２３００ｇで遠心し、ＰＢＳに依って２回洗浄した。ＧＦＰ－ＥＣを、１０％ＦＢＳを含有する０．２ｍＬのＲＰＭＩ培地に再懸濁した。コントロールされていない細菌成長を避ける為に、ゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を培地に追加した５４。５日に渡るＤＭに依る浸漬培養の結腸単層では、培地を上側及び下側リザーバ両方から吸い取った。５日に渡るＤＭ－ＶＩＰに依るＡＬＩ培養の物では、培地を下側リザーバからのみ吸い取った。２０μＬのＧＦＰ－ＥＣ懸濁液（２０００万ｃｆｕ）を上皮の頂端側に追加した。５００μＬのＰＢＭＣ懸濁液（１４３万）を基底リザーバに追加した。２４ｈの共培養後に、基底リザーバからの培地を収集し、５０００ｒｐｍで６ｍｉｎに渡って遠心し、小分けし、－２０℃で保存した。
【0107】
サイトカインの定量．サイトカイン（ＩＬ－８、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、及びＴＮＦ－α）の濃度は製造者の説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific））を用いて決定した。測定が所与のキットの直線範囲内に収まる様に、サンプルを（ＩＬ－８では）４０×、（ＩＬ－６では）１０×、又は（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－αでは）５×希釈した。３つのサンプルを各条件について用いた。無処置のコントロールと比較したサイトカイン濃度の変化を対応のない両側ｔ検定に依って統計的に分析した。全ての図に於いて、「＊＊」はｐ＜０．００５、「＊」はｐ＜０．０５、「＃」は統計的に有意ではないの印である。
【0108】
例１
気液界面（ＡＬＩ）培養はコンパクトな粘液層が頂端結腸上皮上に蓄積する事を可能化する
最初に、粘液層の生成を助ける為に、気液界面（ＡＬＩ）培養を試験した。何故なら、標準的な浸漬培養に於いて上に重なる培地は、粘液が分泌されるに連れて其れを希釈して行き、高密度の粘液層が形成される事を防止し得るという仮説が立てられたからである。横行結腸から得られたヒト上皮幹細胞をマトリゲルコーティングされたトランズウェル（多孔質膜）にプレーティングし、拡大培養培地（ＥＭ）中で５日に渡って培養して、細胞が増殖しコンフルエントな単層を形成する事を可能化した。第５日に、培地を分化培地（ＤＭ）に切り替え、細胞を浸漬培養（頂端及び基底リザーバ両方に培地）として又はＡＬＩ培養（基底リザーバのみに培地）としての何方かで追加の５日に渡って培養した（図２Ａ）。ＤＭ中の成長因子の不在を原因として、細胞は其れ等の増殖能を失い、結腸細胞、杯細胞、及び腸内分泌細胞の混合物から構成される成熟した細胞系列に自発的に分化した２９。培養の第１０日に、粘液層は浸漬培養では不在であった（図２Ｂ）。図２Ｃに示されている通り、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）に依って観た時に、粘液層は此れ等の単層上には可視ではなく、上皮及び其の頂端特徴（杯細胞の分泌顆粒、矢印）が容易く明らかであった（図１Ｃ、上側パネル）。以前に記載されている通り、溶解したムチンが酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に依って内腔培地中に検出可能であった３０。其れ故に、杯細胞に依って分泌されるムチンは培地に依って急速に希釈され、其れ故に、高密度の生理的なハイドロゲルを築く能力がないという事が可能であった。
気液界面（ＡＬＩ）培養はコンパクトな粘液層が頂端結腸上皮上に蓄積する事を可能化する
最初に、粘液層の生成を助ける為に、気液界面（ＡＬＩ）培養を試験した。何故なら、標準的な浸漬培養に於いて上に重なる培地は、粘液が分泌されるに連れて其れを希釈して行き、高密度の粘液層が形成される事を防止し得るという仮説が立てられたからである。横行結腸から得られたヒト上皮幹細胞をマトリゲルコーティングされたトランズウェル（多孔質膜）にプレーティングし、拡大培養培地（ＥＭ）中で５日に渡って培養して、細胞が増殖しコンフルエントな単層を形成する事を可能化した。第５日に、培地を分化培地（ＤＭ）に切り替え、細胞を浸漬培養（頂端及び基底リザーバ両方に培地）として又はＡＬＩ培養（基底リザーバのみに培地）としての何方かで追加の５日に渡って培養した（図２Ａ）。ＤＭ中の成長因子の不在を原因として、細胞は其れ等の増殖能を失い、結腸細胞、杯細胞、及び腸内分泌細胞の混合物から構成される成熟した細胞系列に自発的に分化した２９。培養の第１０日に、粘液層は浸漬培養では不在であった（図２Ｂ）。図２Ｃに示されている通り、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）に依って観た時に、粘液層は此れ等の単層上には可視ではなく、上皮及び其の頂端特徴（杯細胞の分泌顆粒、矢印）が容易く明らかであった（図１Ｃ、上側パネル）。以前に記載されている通り、溶解したムチンが酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に依って内腔培地中に検出可能であった３０。其れ故に、杯細胞に依って分泌されるムチンは培地に依って急速に希釈され、其れ故に、高密度の生理的なハイドロゲルを築く能力がないという事が可能であった。
【0109】
ＡＬＩ培養では、連続的な粘液層（Ｍｕｃ２＋）が免疫蛍光に依って上皮の頂端表面全体に観察された（図２Ｂ）。此の粘液層の厚さは不均質であり、７６から１５４μｍの範囲であった。粘液は場合に依っては杯細胞に関連していた（図２Ｂの矢印に依って指示されている）。ＳＥＭに依って観た時に、粘液は上皮の連続的な被覆を実証し（図２Ｃ、下側パネル）、ＳＥＭイメージングに要求される脱水プロセスを原因とする散在した割れ目を有した。高密度の粘液層の下の細胞は視覚化され得なかった（右パネルの高倍率画像）。此処で見られる通り粘液分泌を強化する為には、希釈のポテンシャルに加えて、粘液産生にインパクトを及ぼす種々のメカニズムが作用可能であり得る。ＡＬＩ培養は呼吸器系並びに胃及び腸に由来する幾つかの組織培養された腫瘍細胞株に於ける粘液産生を増大させる事が示されているが３１－３７、此の効果は以前には初代腸組織を用いて実証されていない。ＡＬＩとの組み合わせでの機械的な力は、腫瘍細胞の母地に依る粘液産生を強化する事が示されており、其の為、薄い流体層に依って行使される表面張力の力は寄与因子であり得る３７。残存する水の薄いフィルムのオスモラリティの増大を原因として、蒸発もまた追加の刺激を提供し得る。何故なら、高オスモル溶液はヒト気管支上皮細胞に於いて粘液過分泌を引き起こす事が示されているからである３８，３９。最後に、オスモラリティの変化は結腸上皮細胞に依るトレフォイルファクター３の産生をもまた刺激する事が公知であり、此れは粘液の品質及び密度を改善する様に作用する８，４０。
【0110】
コンパクトな粘液層がマイクロビーズ又は細菌を上皮から有効に分離する為のバリアとして働くかどうかを決定する為に、１μｍ赤色蛍光ビーズ（図２Ｄ）又は緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現大腸菌（ＧＦＰ－ＥＣ）の懸濁液（図２Ｅ）を、ヘキスト３３３４２に依って染色された上皮のＡＬＩ培養後の内腔リザーバに追加した。其れから、粘液層の厚さを共焦点顕微鏡法に依って評価した（図２Ｄ及び２Ｅ）。上皮細胞からのビーズ及び細菌の距離は図２Ｄ及び２Ｅに示されている代表的な画像に於いては７１から３８１μｍの範囲であり、１３８±６２μｍの平均を有した（Ｎ＝３つの場所）。此の粘液層はマイクロビーズ又は細菌を分離する為のバリアとして有効に作用したが、其れは不均質な厚さを有する粘液の集塊を形成した。
【0111】
例２
改変されたＡＬＩ培養に於いて内腔の水分泌を促進する事に依って、水和した厚い粘液層が作出され得る
細菌代謝を起源とする気体が大腸のルーメン内に存在する；然し乍ら、インビボの内腔表面は、主として、高い水含量を保有する非消化性の材料及び老廃物との接触をしている。其れ故に、幾つかの実施形態では、頂端表面に於ける水の不在を原因として、上に記載されているＡＬＩ培養はインビボの腸内腔環境を詳しくは反映しない。実際に、結腸粘膜の水及び電解質のホメオスタシスは、水がルーメン内に及び外に動く事に依って平衡化されている。健康な成人では、ルーメンから外への水の動きの速度は１７．８ｍＬ／ｍｉｎであり、ルーメン内への物は１６ｍＬ／ｍｉｎであり、１．８５ｍＬ／ｍｉｎの正味の水流出を齎し、糞便の固化を引き起こす４１。腸ホルモン、例えば５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン；５－ＨＴ）、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、及びＰ物質は、大腸の内腔内容物の流体平衡又は水含量を制御する事に主要な役割を演ずる４２。均一な厚さの厚い高度に水和した途切れない粘液層を生ずる為の戦略を開発する為に、ＶＩＰ含有ＤＭ（ＤＭ－ＶＩＰ）を用いるホルモンＶＩＰに対する基底上皮表面の暴露を用いて、上皮を通る流体の動きの平衡を補助した（図３Ａ）。ＶＩＰは内因性のホルモンであり、健康な成人の血漿中濃度は１４から７６ｐｇ／ｍＬの範囲である４３。腸に於ける其の役割は、腸ルーメンへの水及び電解質の分泌を刺激する事である４４。ＶＩＰは、杯細胞に依る粘液分泌及び産生を増大させ、杯細胞への系列配分を強化する様にもまた作用し得る４５。
改変されたＡＬＩ培養に於いて内腔の水分泌を促進する事に依って、水和した厚い粘液層が作出され得る
細菌代謝を起源とする気体が大腸のルーメン内に存在する；然し乍ら、インビボの内腔表面は、主として、高い水含量を保有する非消化性の材料及び老廃物との接触をしている。其れ故に、幾つかの実施形態では、頂端表面に於ける水の不在を原因として、上に記載されているＡＬＩ培養はインビボの腸内腔環境を詳しくは反映しない。実際に、結腸粘膜の水及び電解質のホメオスタシスは、水がルーメン内に及び外に動く事に依って平衡化されている。健康な成人では、ルーメンから外への水の動きの速度は１７．８ｍＬ／ｍｉｎであり、ルーメン内への物は１６ｍＬ／ｍｉｎであり、１．８５ｍＬ／ｍｉｎの正味の水流出を齎し、糞便の固化を引き起こす４１。腸ホルモン、例えば５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン；５－ＨＴ）、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、及びＰ物質は、大腸の内腔内容物の流体平衡又は水含量を制御する事に主要な役割を演ずる４２。均一な厚さの厚い高度に水和した途切れない粘液層を生ずる為の戦略を開発する為に、ＶＩＰ含有ＤＭ（ＤＭ－ＶＩＰ）を用いるホルモンＶＩＰに対する基底上皮表面の暴露を用いて、上皮を通る流体の動きの平衡を補助した（図３Ａ）。ＶＩＰは内因性のホルモンであり、健康な成人の血漿中濃度は１４から７６ｐｇ／ｍＬの範囲である４３。腸に於ける其の役割は、腸ルーメンへの水及び電解質の分泌を刺激する事である４４。ＶＩＰは、杯細胞に依る粘液分泌及び産生を増大させ、杯細胞への系列配分を強化する様にもまた作用し得る４５。
【0112】
水分泌を刺激するＶＩＰの機能を検証する為に、ヒト結腸幹細胞をＥＭに依って５日に渡って培養した。第５日に、基底培地を変動するＶＩＰ濃度を有するＤＭに切り替え、細胞をＡＬＩ培養条件下に置いた。２４ｈ後に、頂端リザーバに蓄積した水を収集し、分析天秤に依って秤量した。ＶＩＰの不在下では、頂端リザーバ内の水の蓄積は測定可能ではなかった。ＶＩＰの存在下では、水の分泌はＶＩＰ濃度依存的であり、２１０ｐｇ／ｍＬの有効用量５０（ＥＤ５０）を有した（図３Ｂ）。ＶＩＰ濃度が＞１ｎｇ／ｍＬである時に、プラトーに達した。此の飽和濃度では、４２０μｍのリザーバ内の水の深さに対応する凡そ４２ｍｇ／ｃｍ２の水がＶＩＰとの２４ｈインキュベーション後に蓄積した。
【0113】
ＤＭ－ＶＩＰ（飽和濃度のＶＩＰを含有するＤＭ）に依るＡＬＩ培養では、液体の層が２４ｈ以内に頂端側に蓄積し、此の液体層は５～６日の分化培養条件の間に維持された。頂端液体層は段々粘稠に成り、５日には、滑り性の粘液ハイドロゲルが作り出された。此れは視覚化の為にピンセットに依って上皮から持ち上げられ得た（図３Ｃ）。此れ等の条件下では、粘液厚さは粘液蓄積の期間（即ち、ＡＬＩプラスＤＭ－ＶＩＰ下に於ける時間）に依存的であった。経時的な粘液層の蓄積を実証する為に、ヒト結腸上皮細胞を、５日に渡るＥＭに依る浸漬培養に依って、次に６日に渡るＤＭ－ＶＩＰに依る培養に依って、上に記載されているＡＬＩ条件下に於いて維持した。共焦点イメージングを０、２、４、及び６日に行った。単層の細胞核はヘキスト３３３４２に依って染色した。ＧＦＰ－ＥＣの懸濁液を記載した通り粘液層に重層し、細菌及び上皮細胞の間の距離をマイクロビーズについて記載されている通り測定した。大腸菌（矢印に依って標識されている）及び核（矢印に依って標識されている）の間の距離は、粘液層コンポーネントが経時的に細菌を上皮から有効に分離したという事を示している（図３Ｄ）。第０及び２日に、細菌は上皮の頂端表面との接触をしていた。４日後に、細菌を分離する粘液層は厚さが１４２±２１μｍであった（Ｎ＝３サンプル）。６日後に、細菌及び上皮単層の間の分離に依って示される通り、粘液層の厚さは３０２±２８μｍに増大していた。図３Ｄを見よ。此れ等の結果は、粘液厚さがＡＬＩの期間に依って容易に調整され得るという事を実証している（図３Ｅ）。可能性として、其の水含量の結果として流動及び再分布する其の能力を原因として、粘液の厚さは表面に渡って一定であった（３０２±２８μｍ）。１μｍ赤色蛍光ビーズを粘液層に重層する事に依って、類似の結果が観察された（図３Ｆ）。此のインビトロで作り出された粘液層は、上皮を内腔微生物及びマイクロビーズから隔離する為の有能なバリアを形成する事に依って、インビボの結腸の内側粘液層の性質に似通っている４６。粘液及び上皮両方を視覚化する為に、サンプルを脱水し、粘液を上皮から部分的に取り除いた（図３Ｇの点線が境界である）。大腸菌は粘液層の表面のみに見出され、上皮との接触をしては見られなかった。再び、此の結果は、水和した粘液層が上皮及び微生物を隔離する為のバリアを形成したという事を実証している（図３Ｇ）。
【0114】
ＡＬＩ培養法は気管支上皮細胞４７、ケラチノサイト４８、腺癌腸細胞株３７、及び腸オルガノイド４９に用いられている。ＡＬＩは市販製品に依って多孔質膜インサート上で初代小腸上皮細胞を培養する為にもまた用いられている（ＭａｔＴｅｋコーポレーションからのＭａｔＴｅｋコーポレーション（MatTek Corporation）の３Ｄ組織モデル）。然し乍ら、ＭａｔＴｅｋの３Ｄ組織モデルは、コントロール可能な厚さで以ってマイクロビーズ又は細菌を分離する高密度の連続的な粘液層を支持する事は示されていない。出願人は上のＡＬＩ戦略（ＤＭ又はＤＭ－ＶＩＰ）を用いて初代ヒト小腸（空腸）上皮細胞を試験したが、高密度の且つ厚い粘液層は作り出されなかった。本開示の方法は初代ヒト結腸細胞に適用可能であり、此れ等のデータは、インビボ様の粘液の性質を保有するインビトロ結腸粘液系の作出を初めて示す。
【0115】
例３
粘液層は初代ヒト結腸上皮に対するＣ．ディフィシル毒素の効果を妨害する
粘液層がインビトロ結腸上皮モデルの生理学的な該当性を改善するという事を実証する為に、初代ヒト結腸上皮（ＧＣ及び／又はＯＣ）を粘液層の不在下又は存在下に於いてＣ．ディフィシル毒素に暴露した（図４Ａ）。Ｃ．ディフィシルはホストＧＴＰアーゼ（Ｒｈｏ、Ｒａｃ、及びＣｄｃ４２を包含する）を不活性化する事が出来る２つの強力な毒素Ａ及びＢを生じ、上皮バリアの変改、ヒト腸粘膜へのダメージ、及び結腸の炎症に至る５０。浸漬培養法に於いて、粘液層の不在下では、Ａ毒素は細胞のダメージを速やかに誘導し、最も早い変化は２ｈの毒素インキュベーション以内に観察された。４ｈには、毒素処置された上皮単層では、細胞間透過性が有意に増大し（図４Ｂ）、ＩＬ－８分泌もまた有意に強化された（図４Ｃ）。頂端Ｆ－アクチン構造及びＺＯ－１タイトジャンクション両方は毒素処置に依って顕著に変改された。コントロールの上皮単層は頂端刷子縁に於ける秩序立ったＦ－アクチンとＺＯ－１の連続的な「チキンワイヤー」パターンとを有したが、Ａ毒素処置された単層は、細胞の球状化、正常なＦ－アクチンの乱れ及び破壊、並びにＺＯ－１アーキテクチャの分解を見せた（図４Ｄ）。此の傾向は８ｈ（図４Ｅ及び４Ｆ）及び２４ｈに於いて観察された。此れ等の結果は、Ａ毒素が上皮バリア機能を破壊し、免疫学的応答を誘起するという事を実証している。此れは他の腸上皮モデルについての以前の研究と整合する１５，５１，５２。
粘液層は初代ヒト結腸上皮に対するＣ．ディフィシル毒素の効果を妨害する
粘液層がインビトロ結腸上皮モデルの生理学的な該当性を改善するという事を実証する為に、初代ヒト結腸上皮（ＧＣ及び／又はＯＣ）を粘液層の不在下又は存在下に於いてＣ．ディフィシル毒素に暴露した（図４Ａ）。Ｃ．ディフィシルはホストＧＴＰアーゼ（Ｒｈｏ、Ｒａｃ、及びＣｄｃ４２を包含する）を不活性化する事が出来る２つの強力な毒素Ａ及びＢを生じ、上皮バリアの変改、ヒト腸粘膜へのダメージ、及び結腸の炎症に至る５０。浸漬培養法に於いて、粘液層の不在下では、Ａ毒素は細胞のダメージを速やかに誘導し、最も早い変化は２ｈの毒素インキュベーション以内に観察された。４ｈには、毒素処置された上皮単層では、細胞間透過性が有意に増大し（図４Ｂ）、ＩＬ－８分泌もまた有意に強化された（図４Ｃ）。頂端Ｆ－アクチン構造及びＺＯ－１タイトジャンクション両方は毒素処置に依って顕著に変改された。コントロールの上皮単層は頂端刷子縁に於ける秩序立ったＦ－アクチンとＺＯ－１の連続的な「チキンワイヤー」パターンとを有したが、Ａ毒素処置された単層は、細胞の球状化、正常なＦ－アクチンの乱れ及び破壊、並びにＺＯ－１アーキテクチャの分解を見せた（図４Ｄ）。此の傾向は８ｈ（図４Ｅ及び４Ｆ）及び２４ｈに於いて観察された。此れ等の結果は、Ａ毒素が上皮バリア機能を破壊し、免疫学的応答を誘起するという事を実証している。此れは他の腸上皮モデルについての以前の研究と整合する１５，５１，５２。
【0116】
ＡＬＩプラスＤＭ－ＶＩＰに依って作り出される粘液層の存在下では、透過性及びＩＬ－８産生の変化（図４Ｂ及び４Ｃ）、並びに細胞形態学、Ｆ－アクチン及びＺＯ－１アーキテクチャ（図４Ｄ）の点では、４ｈに於いて、毒素処置に対する細胞の応答は観察されなかった。然し乍ら、透過性及びＩＬ－８産生の変化が８ｈに観察された（図４Ｅ及び４Ｆ）。此れ等の結果は、粘液層が毒素の物理的バリア又はトラップとして働き、其の結果、其れ等は（粘液結合部位の有り無しに拘らず）純粋な拡散に依って上皮に達し、対流混合は上皮への毒素移動を加速させる能力が最早なかったという事を示唆する。此れ等の知見は、我々の腸粘液－上皮が、Ｃ．ディフィシル感染についてホスト及び病原体の因子を研究する為の改善された生理学的に該当するモデルである事を示唆する。
【0117】
例４
粘液層は物理的バリアとして働き、細菌に依って誘導される免疫応答を無くす
インビボでは、粘液層は、片利共生微生物をホスト上皮から隔離する為の物理的バリアとして働く事に依って、粘膜免疫系の不可欠なコンポーネントとして作用する。此の物理的隔離を原因として、片利共生微生物はホスト炎症性応答を開始する事なしに上皮と共存する６。インビトロ粘液層が同じ保護機能を供し得るという事を実証する為に、上皮単層を大腸菌（内腔側）及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、基底側）と２４ｈに渡って粘液層の不在下（浸漬法に依って培養した）又は存在下（ＡＬＩプラスＤＭ－ＶＩＰ法に依って作り出した）に於いて共培養した（図５Ａ）。基底上皮側から分泌される炎症性サイトカインを定量した（図５Ｂから５Ｅ）。大腸菌への暴露なしでは、ＰＢＭＣは比較的低いレベルのサイトカインを生じた。ＰＢＭＣ及び上皮の共培養は類似のレベルのサイトカインを生じた。然し乍ら、上皮が粘液層の不在下に於いて細菌に暴露された後には、細菌無しのコントロールの物に対して相対的にサイトカイン産生の有意な増大が観察された。此れ等の結果は、粘液を産生しないＣａｃｏ－２細胞が非病原性大腸菌の存在下に於いて成長させられる時に得られる物に類似である５３，５４。
粘液層は物理的バリアとして働き、細菌に依って誘導される免疫応答を無くす
インビボでは、粘液層は、片利共生微生物をホスト上皮から隔離する為の物理的バリアとして働く事に依って、粘膜免疫系の不可欠なコンポーネントとして作用する。此の物理的隔離を原因として、片利共生微生物はホスト炎症性応答を開始する事なしに上皮と共存する６。インビトロ粘液層が同じ保護機能を供し得るという事を実証する為に、上皮単層を大腸菌（内腔側）及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、基底側）と２４ｈに渡って粘液層の不在下（浸漬法に依って培養した）又は存在下（ＡＬＩプラスＤＭ－ＶＩＰ法に依って作り出した）に於いて共培養した（図５Ａ）。基底上皮側から分泌される炎症性サイトカインを定量した（図５Ｂから５Ｅ）。大腸菌への暴露なしでは、ＰＢＭＣは比較的低いレベルのサイトカインを生じた。ＰＢＭＣ及び上皮の共培養は類似のレベルのサイトカインを生じた。然し乍ら、上皮が粘液層の不在下に於いて細菌に暴露された後には、細菌無しのコントロールの物に対して相対的にサイトカイン産生の有意な増大が観察された。此れ等の結果は、粘液を産生しないＣａｃｏ－２細胞が非病原性大腸菌の存在下に於いて成長させられる時に得られる物に類似である５３，５４。
【0118】
対照的に、粘液層の存在下では、共培養された大腸菌に対するサイトカイン応答は無くなった。大腸菌に依る攻撃なしでは、ＰＢＭＣ、上皮、及び粘液層との共培養は比較的低いレベルのサイトカインを生じた。大腸菌との２４ｈ共培養後に、サイトカイン産生は細菌無しの物と統計的に異ならなかった。此れ等のデータは、粘液層が微生物を上皮から機能的に隔離する為に首尾良く働き、其れ故に免疫応答を無くし、インビボ条件を真似たという事を実証している。
【0119】
本開示の主題の範囲から逸脱する事なしに、本開示の主題の種々の詳細は変えられ得るという事は理解されるであろう。更に其の上、前述の記載は例解のみの目的の為であり、限定の目的の為ではない。
【0120】
参照
全ての特許、特許出願、及び其れ等の公開物、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースエントリー及び其の中の全ての利用可能な注釈）を包含するが是等に限定されない本明細書に列記される全ての参照は、其れ等が本明細書に於いて採用される方法論、技術、及び／又は組成物を補うか、説明するか、背景を提供するか、又は教示する程度迄、其れ等の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
１． アレン（Allen）Ａ，キャロル（Carroll）ＮＪＨ著，「胃及び十二指腸に於ける粘着性の且つ可溶性の粘液（Adherent and Soluble Mucus in the Stomach and Duodenum）」，ディジェスティブ・ディジージズ・アンド・サイエンシズ（Digestive Diseases and Sciences），１９８５年；第３０巻：ｐ．５５Ｓ
２． ペラセイエド（Pelaseyed）Ｔ，ベリストローム（Bergstrom）ＪＨ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，エルムント（Ermund）Ａ，バーシュノー（Birchenough）ＧＭＨ，シュッテ（Schutte）Ａ，ファンデルポスト（van der Post）Ｓ，スベンソン（Svensson）Ｆ，ロドリゲス・ピネイロ（Rodriguez－Pineiro）ＡＭ，ニストローム（Nystrom）ＥＥＬ，ワイズング（Wising）Ｃ，ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「杯細胞及びエンテロサイトの粘液及びムチンは胃腸管の第一防衛線を提供し、免疫系と相互作用する（The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system）」，イミュノロジカル・レビューズ（Immunological reviews），２０１４年；第２６０巻：ｐ．８－２０
３． ムルジア（Murgia）Ｘ，ロレッツ（Loretz）Ｂ，ハートウィグ（Hartwig）Ｏ，ヒッティンガー（Hittinger）Ｍ，レアー（Lehr）ＣＭ著，「薬物輸送に対する粘液の役割と治療アウトカムに影響する其のポテンシャル（The role of mucus on drug transport and its potential to affect therapeutic outcomes）」，アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Advanced Drug Delivery Reviews），２０１８年；第１２４巻：ｐ．８２－９７
４． レアー（Lehr）ＣＭ，ポールマ（Poelma）ＦＧＪ，ジャンギンガー（Junginger）ＨＥ，タッカー（Tukker）ＪＪ著，「ラットのインサイチュループに於ける腸粘液ゲル層のターンオーバー時間の概算（An estimate of turnover time of intestinal mucus gel layer in the rat in situ loop）」，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（International Journal of Pharmaceutics），１９９１年；第７０巻：ｐ．２３５－２４０
５． ウェイ（Wei）ＸＣ，ヤン（Yang）Ｚ，レイ（Rey）ＦＥ，リドーラ（Ridaura）ＶＫ，デビッドソン（Davidson）ＮＯ，ゴードン（Gordon）ＪＩ，セメンコビッチ（Semenkovich）ＣＦ著，「脂肪酸シンターゼはムチン２のパルミトイル化に依って腸バリア機能を調節する（Fatty Acid Synthase Modulates Intestinal Barrier Function through Palmitoylation of Mucin 2）」，セル・ホスト＆マイクローブ（Cell Host & Microbe），２０１２年；第１１巻：ｐ．１４０－１５２
６． ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，フィリプソン（Phillipson）Ｍ，ペテルソン（Petersson）Ｊ，ベルシック（Velcich）Ａ，ホルム（Holm）Ｌ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「結腸に於ける２つのＭｕｃ２ムチン依存的な粘液層の内側は細菌を欠く（The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria）」，米国科学アカデミー紀要，２００８年；第１０５巻：ｐ．１５０６４－１５０６９
７． ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ガット感染及び炎症に於ける粘液層の役割（Role of mucus layers in gut infection and inflammation）」，カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー（Current Opinion in Microbiology），２０１２年；第１５巻：ｐ．５７－６２
８． カールソン（Carlson）ＴＬ，ロック（Lock）ＪＹ，キャリア（Carrier）ＲＬ著，「粘液バリアを人工する（Engineering the Mucus Barrier）」，アニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング（Annual Review of Biomedical Engineering），２０１８年；第２０巻：ｐ．１９７－２２０
９． ワーラング（Werlang）Ｃ，カルカルモ・オジャルセ（Carcarmo－Oyarce）Ｇ，リベック（Ribbeck）Ｋ著，「マイクロバイオームを研究及び支配する為に粘液を人工する（Engineering mucus to study and influence the microbiome）」，ネイチャー・レビューズ・マテリアルズ（Nature Reviews Materials），２０１９年；第４巻：ｐ．１３４－１４５
１０． ロジェ（Rogier）ＥＷ，フランツ（Frantz）ＡＬ，ブルーノ（Bruno）ＭＥＣ，ケッツェル（Kaetzel）ＣＳ著，「分泌型ＩｇＡはガット細菌と共に結腸粘液の外側層に濃縮される（Secretory IgA is Concentrated in the Outer Layer of Colonic Mucus along with Gut Bacteria）」，パソジェンズ（Pathogens），２０１４年；第３巻：ｐ．３９０－４０３
１１． グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，スピア（Speer）Ｊ，ワン（Wang）Ｙ，グエン（Nguyen）ＤＬ，リード（Reed）ＭＩ，スミディ（Smiddy）ＮＭ，パーカー（Parker）ＪＳ，ファロン（Fallon）ＪＫ，スミス（Smith）ＰＣ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「薬物輸送研究の為の剛性の勾配を有する足場上に作り出された初代結腸上皮の単層（A Monolayer of Primary Colonic Epithelium Generated on a Scaffold with a Gradient of Stiffness for Drug Transport Studies）」，アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）２０１８年；第９０巻：ｐ．１３３３１－１３３４０
１２． キグレイ（Quigley）ＥＭＭ著，「健康及び疾患に於けるガット細菌（Gut bacteria in health and disease）」，ガストロエンテロロジー＆ヘパトロジー（Gastroenterology & hepatology），２０１３年；第９巻：ｐ．５６０－５６９
１３． ガニョン（Gagnon）Ｍ，ベルナー（Berner）ＡＺ，シェルベ（Chervet）Ｎ，シャサール（Chassard）Ｃ，ラクロワ（Lacroix）Ｃ著，「サルモネラ接着及び侵入を検討する為のＣａｃｏ－２、ＨＴ－２９、及び粘液分泌ＨＴ２９－ＭＴＸ腸細胞モデルの比較（Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion）」，ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ（Journal of Microbiological Methods），２０１３年；第９４巻：ｐ．２７４－２７９
１４． ルスフルール（Lesuffleur）Ｔ，バルバット（Barbat）Ａ，デュソー（Dussaulx）Ｅ，ツヴァイバウム（Zweibaum）Ａ著，「ＨＴ－２９ヒト結腸癌細胞のメトトレキサートに対する成長適応は柱状吸収及び粘液分泌細胞に分化する其れ等の能力に関連する（Growth adaptation to methotrexate of HT-29 human colon carcinoma cells is associated with their ability to differentiate into columnar absorptive and mucus-secreting cells）」，キャンサー・リサーチ（Cancer Research），１９９０年；第５０巻：ｐ．６３３４－６３４３
１５． ヌスラト（Nusrat）Ａ，フォンエイヒェル・シュトライバー（von Eichel－Streiber）Ｃ，ターナー（Turner）ＪＲ，ヴェルカーデ（Verkade）Ｐ，マダラ（Madara）ＪＬ，パルコス（Parkos）ＣＡ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素はタイトジャンクション蛋白質の膜マイクロドメイン局在を変改する事に依って上皮バリア機能を破壊する（Clostridium difficile Toxins Disrupt Epithelial Barrier Function by Altering Membrane Microdomain Localization of Tight Junction Proteins）」，インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity），２００１年；第６９巻：ｐ．１３２９－１３３６
１６． サトー（Sato）Ｔ，ブリーズ（Vries）ＲＧ，スニッペルト（Snippert）ＨＪ，ファンデウェテリンク（van de Wetering）Ｍ，バーカー（Barker）Ｎ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，ファンエス（van Es）ＪＨ，アボ（Abo）Ａ，クジャラ（Kujala）Ｐ，ピーターズ（Peters）ＰＪ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「単一のＬｇｒ５幹細胞は間葉系ニッチなしに陰窩－絨毛構造をインビトロで築く（Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche）」，ネイチャー（Nature），２００９年；第４５９巻：ｐ．２６２－Ｕ１４７
１７． ダテ（Date）Ｓ，サトー（Sato）Ｔ著，「ミニガットオルガノイド：幹細胞ニッチの再構成（Mini-Gut Organoids: Reconstitution of Stem Cell Niche）」，シェクマン（Schekman）Ｒ編，アニュアル・レビュー・オブ・セル・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー（Annual Review of Cell and Developmental Biology），Ｖｏｌ３１，第３１巻，２０１５年：ｐ．２６９－２８９
１８． サトー（Sato）Ｔ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，フェラント（Ferrante）Ｍ，ブリーズ（Vries）ＲＧＪ，ファンエス（van Es）ＪＨ，ファンデンブリンク（van den Brink）Ｓ，ファンフート（van Houdt）ＷＪ，プロンク（Pronk）Ａ，ヴァンガープ（van Gorp）Ｊ，シアセマ（Siersema）ＰＤ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「ヒト結腸、腺腫、腺癌、及びバレット上皮からの上皮オルガノイドの長期拡大培養（Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２０１１年；第１４１巻：ｐ．１７６２－１７７２
１９． イン（Yin）ＸＬ，ファリン（Farin）ＨＦ，ファンエス（van Es）ＪＨ，クレバース（Clevers）Ｈ，ランガー（Langer）Ｒ，カープ（Karp）ＪＭ著，「Ｌｇｒ５（＋）腸幹細胞及び其れ等の子孫のニッチ非依存的な高純度培養（Niche-independent high-purity cultures of Lgr5(+) intestinal stem cells and their progeny）」，ネイチャー・メソッズ（Nature Methods），２０１４年；第１１巻：ｐ．１０６－１１２
２０． フェトフラー（Fatehullah）Ａ，アップルトン（Appleton）ＰＬ，ナトケ（Nathke）ＩＳ著，「腫瘍形成の間の腸管に於ける細胞及び組織極性：細胞は依然として正しい上下方向を知るが、組織の秩序は失われる（Cell and tissue polarity in the intestinal tract during tumourigenesis: cells still know the right way up, but tissue organization is lost）」，フィロソフィカル・トランザクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティー・Ｂ－バイオロジカル・サイエンシズ（Philosophical Transactions of the Royal Society B－Biological Sciences），２０１３年；第３６８巻：ｐ．２０１３００１４
２１． ムーン（Moon）Ｃ，ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「ＩｇＡトランスサイトーシスを調節する因子を評価する為の初代マウス腸上皮細胞単層培養系の開発（Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis）」，ムコサル・イミュノロジー（Mucosal Immunology），２０１４年；第７巻：ｐ．８１８－８２８
２２． ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，マリンショー（Marinshaw）ＪＭ，シャイク（Shaikh）Ｎ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，ムーン（Moon）Ｃ，ター（Tarr）ＰＩ，チョルバ（Ciorba）ＭＡ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「患者に基づくアッセイを容易化する為の強化ヒト胃腸上皮培養系の開発（Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays）」，ガット（Gut），２０１５年；第６４巻：ｐ．９１１－９２０
２３． イン（In）Ｊ，フォルケ・アーベル（Foulke－Abel）Ｊ，ザコス（Zachos）ＮＣ，ハンセン（Hansen）Ａ－Ｍ，ケイパー（Kaper）ＪＢ，バーンスタイン（Bernstein）ＨＤ，ハルシュカ（Halushka）Ｍ，ブラット（Blutt）Ｓ，エステス（Estes）ＭＫ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ著，「腸管出血性大腸菌はヒト幹細胞由来コロノイドに於いて粘液及び微絨毛間ブリッジを縮減する（Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１６年；第２巻：ｐ．４８－６２．ｅ３
２４． コズカ（Kozuka）Ｋ，ヒー（He）Ｙ，クー・マッコイ（Koo－Mccoy）Ｓ，クマラスワミ（Kumaraswamy）Ｐ，ニー（Nie）Ｂ，ショー（Shaw）Ｋ，チャン（Chan）Ｐ，レッドベター（Leadbetter）Ｍ，ヒー（He）Ｌ，ルイス（Lewis）ＪＧ，ジョン（Zhong）Ｚ，シャルモット（Charmot）Ｄ，バラー（Balaa）Ｍ，キング（King）ＡＪ，コールドウェル（Caldwell）ＪＳ，シーゲル（Siegel）Ｍ著，「ヒト及びマウス腸上皮細胞単層プラットフォームの開発及びキャラクタリゼーション（Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform）」，ステム・セル・レポーツ（Stem Cell Reports）２０１７年；第９巻：ｐ．１９７６－１９９０
２５． ノエル（Noel）Ｇ，ベイツ（Baetz）ＮＷ，スターブ（Staab）ＪＦ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ，パセッティ（Pasetti）ＭＦ，ザコス（Zachos）ＮＣ著，「粘膜ガットの生理及びホスト－病原体相互作用を検討する為の初代ヒトマクロファージ－エンテロイド共培養モデル（A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions）」，サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports），２０１７年；第７巻：ｐ．４５２７０
２６． プザン（Puzan）Ｍ，ホシック（Hosic）Ｓ，ギオ（Ghio）Ｃ，コッペス（Koppes）Ａ著，「腸幹細胞分化及び上皮単層機能の腸管神経系制御（Enteric Nervous System Regulation of Intestinal Stem Cell Differentiation and Epithelial Monolayer Function）」，サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports），２０１８年；第８巻：ｐ．６３１３
２７． ワン（Wang）ＹＬ，ディサルボ（DiSalvo）Ｍ，グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，ダットン（Dutton）Ｊ，プロクター（Proctor）Ａ，レバー（Lebhar）ＭＳ，ウィリアムソン（Williamson）ＩＡ，スピア（Speer）Ｊ，ハワード（Howard）ＲＬ，スミディ（Smiddy）ＮＭ，ブルトマン（Bultman）ＳＪ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「初代結腸又は直腸上皮細胞の自己複製する単層（Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１７年；第４巻：ｐ．１６５－＋
２８． マッドン（Madden）ＬＲ，グエン（Nguyen）ＴＶ，ガルシア・モヒカ（Garcia－Mojica）Ｓ，シャー（Shah）Ｖ，レ（Le）ＡＶ，ペイエ（Peier）Ａ，ビスコンティ（Visconti）Ｒ，パーカー（Parker）ＥＭ，プレスネル（Presnell）ＳＣ，グエン（Nguyen）ＤＧ，レッティング（Retting）ＫＮ著，「バイオプリンティングされた３Ｄ初代ヒト腸組織はネイティブな生理及びＡＤＭＥ／Ｔｏｘ機能の様相をモデリングする（Bioprinted 3D Primary Human Intestinal Tissues Model Aspects of Native Physiology and ADME/Tox Functions）」，アイサイエンス（iScience），２０１８年；第２巻：ｐ．１５６－１６７
２９． ワン（Wang）Ｙ，キム（Kim）Ｒ，ファン（Hwang）Ｓ－ＨＪ，ダットン（Dutton）Ｊ，シムズ（Sims）ＣＥ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「幹細胞由来ヒト腸上皮単層プラットフォームに依るインターロイキン８分泌の分析（Analysis of Interleukin 8 Secretion by a Stem-Cell-Derived Human-Intestinal-Epithelial-Monolayer Platform）」，アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry），２０１８年；第９０巻：ｐ．１１５２３－１１５３０
３０． ワン（Wang）ＹＬ，キム（Kim）Ｒ，グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，リード（Reed）ＭＩ，ディサルボ（DiSalvo）Ｍ，グエン（Nguyen）ＤＬ，ブルトマン（Bultman）ＳＪ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「成形された上皮単層を通る化学物質勾配の適用に依るヒト結腸陰窩アレイの形成（Formation of Human Colonic Crypt Array by Application of Chemical Gradients Across a Shaped Epithelial Monolayer）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１８年；第５巻：ｐ．１１３－１３０
３１． ウィットカット（Whitcutt）ＭＪ，アドラー（Adler）ＫＢ，ウー（Wu）Ｒ著，「培養気道上皮細胞の分化の極性を維持する為の二相チャンバー系（A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells）」，インビトロ・セルラー＆デベロップメンタル・バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），１９８８年；第２４巻：ｐ．４２０－４２８
３２． グレイ（Gray）ＴＥ，グズマン（Guzman）Ｋ，デイビス（Davis）ＣＷ，アブドラ（Abdullah）ＬＨ，ネッテスハイム（Nettesheim）Ｐ著，「連続経代された正常なヒト気管気管支上皮細胞の粘液線毛分化（Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells）」，アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology），１９９６年；第１４巻：ｐ．１０４－１１２
３３． レアドン（Raredon）ＭＳＢ，ガエディ（Ghaedi）Ｍ，カル（Calle）ＥＡ，ニクラソン（Niklason）ＬＥ著，「呼吸器上皮のスケーラブルな培養及び分化の為の回転バイオリアクター（A Rotating Bioreactor for Scalable Culture and Differentiation of Respiratory Epithelium）」，セル・メディシン（Cell Medicine），２０１５年；第７巻：ｐ．１０９－１２１
３４． オボイル（O'Boyle）Ｎ，サザーランド（Sutherland）Ｅ，ベリー（Berry）ＣＣ，デイビース（Davies）ＲＬ著，「気液界面に於けるヒツジ気道上皮細胞分化の時間的ダイナミクス（Temporal dynamics of ovine airway epithelial cell differentiation at an air-liquid interface）」，プロスワン（Plos One），２０１７年；第１２巻
３５． オータニ（Ootani）Ａ，トダ（Toda）Ｓ，フジモト（Fujimoto）Ｋ，スギハラ（Sugihara）Ｈ著，「気液界面は培養に依る胃表面粘液細胞（ＧＳＭ０６）の分化を促進する（An air-liquid interface promotes the differentiation of gastric surface mucous cells (GSM06) in culture）」，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications），２０００年；第２７１巻：ｐ．７４１－７４６
３６． ヨコヤマ（Yokoyama）Ｆ，サカタ（Sakata）Ｙ，オータニ（Ootani）Ａ，フジセ（Fujise）Ｔ，カキモト（Kakimoto）Ｔ，アメモリ（Amemori）Ｓ，シライシ（Shiraishi）Ｒ，クロキ（Kuroki）Ｔ，ツナダ（Tsunada）Ｓ，イワキリ（Iwakiri）Ｒ，フジモト（Fujimoto）Ｋ著，「気液界面に依って誘導される胃表面粘液細胞（ＧＳＭ０６）の分化は分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ経路に依って部分的に制御される（Differentiation of gastric surface mucous cells (GSM06) induced by air-liquid interface is regulated partly through mitogen-activated protein kinase pathway）」，ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Journal of Gastroenterology and Hepatology），２００７年；第２２巻：ｐ．２３１０－２３１５
３７． ナバビ（Navabi）Ｎ，マクガキン（McGuckin）ＭＡ，リンデン（Linden）ＳＫ著，「胃腸細胞株は機械的刺激に依ってセミウェット界面に於いて培養される時に粘着性の粘液層を有する極性化した上皮を形成する（Gastrointestinal Cell Lines Form Polarized Epithelia with an Adherent Mucus Layer when Cultured in Semi-Wet Interfaces with Mechanical Stimulation）」，プロスワン（Plos One），２０１３年；第８巻
３８． エルキンズ（Elkins）ＭＲ，バイ（Bye）ＰＴＰ著，「高張食塩水のメカニズム及び適用（Mechanisms and applications of hypertonic saline）」，ジャーナル・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティ・オブ・メディシン（Journal of the Royal Society of Medicine），２０１１年；第１０４巻：ｐ．Ｓ２－Ｓ５
３９． Ｊ．Ｔ，Ｊ．Ｍ．Ｐ，Ｖ．Ｐ．Ｋ，Ｘ．Ｄ．Ｚ著，「ヒト気道上皮細胞に於ける高張性に依る粘液分泌に対する浸透圧応答エレメント結合蛋白質の効果（Effect of osmotic response element binding protein on mucus secretion with hypertonicity in human airway epithelial cells）」，中華医学雑誌（Zhonghua Yi Xue Za Zhi），２０１１年；第９１巻：ｐ．５４９－５５３
４０． ラデキン（Ludeking）Ａ，フェガート（Fegert）Ｐ，ブリン（Blin）Ｎ，ゴット（Gott）Ｐ著，「浸透圧変化及びエタノールは胃腸細胞株に於けるＴＦＦ遺伝子発現を改変する（Osmotic changes and ethanol modify TFF gene expression in gastrointestinal cell lines）」，フェブス・レターズ（Febs Letters），１９９８年；第４３９巻：ｐ．１８０－１８４
４１． シールズ（Shields）Ｒ，マイルズ（Miles）ＪＢ，ギルバートソン（Gilbertson）Ｃ著，「原発性アルドステロン症を有する患者のインタクトな結腸に依る水及び電解質の吸収及び分泌（Absorption and secretion of water and electrolytes by the intact colon in a patient with primary aldosteronism）」，ブリティッシュ・メディカル・ジャーナル（British Medical Journal），１９６８年；第１巻：ｐ．９３－９６
４２． ワプニール（Wapnir）ＲＡ，タイヒベルク（Teichberg）Ｓ著，「腸分泌の制御メカニズム：栄養素吸収への関与（Regulation mechanisms of intestinal secretion: implications in nutrient absorption）」，ザ・ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・バイオケミストリー（The Journal of Nutritional Biochemistry），２００２年；第１３巻：ｐ．１９０－１９９
４３． コーク（Koch）ＴＲ，ミッチェナー（Michener）ＳＲ，ゴー（Go）ＶＬＷ著，「下痢を有する患者に於ける血漿中の血管作動性腸ポリペプチド濃度決定（Plasma vasoactive intestinal polypeptide concentration determination in patients with diarrhea）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１９９１年；第１００巻：ｐ．９９－１０６
４４． シュワルツ（Schwartz）ＣＪ，キンバーグ（Kimberg）ＤＶ，シーリン（Sheerin）ＨＥ，フィールド（Field）Ｍ，サイード（Said）ＳＩ著，「腸粘膜に於けるアデニル酸シクラーゼ及び能動的電解質分泌の血管作動性腸ペプチド刺激（Vasoactive intestinal peptide stimulation of adenylate cyclase and active electrolyte secretion in intestinal mucosa）」，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation），１９７４年；第５４巻：ｐ．５３６－５４４
４５． ウー（Wu）Ｘ，コンリン（Conlin）ＶＳ，モランプディ（Morampudi）Ｖ，リズ（Ryz）ＮＲ，ナセル（Nasser）Ｙ，ビンダー（Bhinder）Ｇ，ベルグストロム（Bergstrom）ＫＳ，ユー（Yu）ＨＢ，ウォーターハウス（Waterhouse）ＣＣＭ，バカン（Buchan）ＡＭＪ，ポペスク（Popescu）ＯＥ，ギブソン（Gibson）ＷＴ，ワシェク（Waschek）ＪＡ，バランス（Vallance）ＢＡ，ヤコブソン（Jacobson）Ｋ著，「血管作動性腸ポリペプチドはマウスに於いて腸バリアのホメオスタシス及び大腸炎からの保護を促進する（Vasoactive Intestinal Polypeptide Promotes Intestinal Barrier Homeostasis and Protection Against Colitis in Mice）」，プロスワン（Plos One），２０１５年；第１０巻：ｐ．ｅ０１２５２２５
４６． ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，ホルメン・ラーソン（Holmen－Larsson）Ｊ，ジャバー（Jabbar）ＫＳ，シャ（Xia）Ｌ，シュー（Xu）Ｈ，ギシャン（Ghishan）ＦＫ，カルバーリョ（Carvalho）ＦＡ，ジュワーツ（Gewirtz）ＡＴ，フェーヴァル（Sjovall）Ｈ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ネズミ大腸炎モデル及び潰瘍性大腸炎を有する患者両方に於いて、細菌は正常では透過不可能な結腸の内側粘液層を透過する（Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis）」，ガット（Gut），２０１４年；第６３巻：ｐ．２８１－２９１
４７． リン（Lin）ＨＸ，リ（Li）Ｈ，チョウ（Cho）ＨＪ，ビアン（Bian）Ｓ，ロー（Roh）ＨＪ，リー（Lee）ＭＫ，キム（Kim）ＪＳ，チョン（Chung）ＳＪ，シム（Shim）ＣＫ，キム（Kim）ＤＤ著，「気道薬物輸送研究の為のインビトロモデルとしてのヒト気管支上皮細胞単層の気液界面（ＡＬＩ）培養（Air-liquid interface (ALI) culture of human bronchial epithelial cell monolayers as an in vitro model for airway drug transport studies）」，ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Journal of Pharmaceutical Sciences），２００７年；第９６巻：ｐ．３４１－３５０
４８． バーンスタム（Bernstam）ＬＩ，ヴォーン（Vaughan）ＦＬ，バーンスタイン（Bernstein）ＩＡ著，「気液界面に於いて成長したケラチノサイト（Keratinocytes grown at the air-liquid interface）」，インビトロ・セルラー＆デベロップメンタル・バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），１９８６年；第２２巻：ｐ．６９５－７０５
４９． オータニ（Ootani）Ａ，リ（Li）ＸＮ，サンジョルジ（Sangiorgi）Ｅ，ホー（Ho）ＱＴ，ウエノ（Ueno）Ｈ，トダ（Toda）Ｓ，スギハラ（Sugihara）Ｈ，フジモト（Fujimoto）Ｋ，ワイスマン（Weissman）ＩＬ，カペッキ（Capecchi）ＭＲ，クオ（Kuo）ＣＪ著，「Ｗｎｔ依存的な幹細胞ニッチ内に於ける持続的なインビトロ腸上皮培養（Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche）」，ネイチャー・メディシン（Nature Medicine），２００９年；第１５巻：ｐ．１－Ｕ１４０
５０． フォート（Voth）ＤＥ，バラード（Ballard）ＪＤ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素：疾患に於ける作用及び役割のメカニズム（Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease）」，クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Clinical microbiology reviews），２００５年；第１８巻：ｐ．２４７－２６３
５１． ヒー（He）Ｄ，ソウギオウルジス（Sougioultzis）Ｓ，ヘイゲン（Hagen）Ｓ，リウ（Liu）Ｊ，キーテス（Keates）Ｓ，キーテス（Keates）ＡＣ，ポゾウラキス（Pothoulakis）Ｃ，ラモント（LaMont）ＪＴ著，「クロストリジウム・ディフィシルＡ毒素はミトコンドリアの酸素ラジカル生成に依ってヒト結腸細胞ＩＬ－８放出を誘発する（Clostridium difficile toxin A triggers human colonocyte IL-8 release via mitochondrial oxygen radical generation）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２００２年；第１２２巻：ｐ．１０４８－１０５７
５２． マヒダ（Mahida）ＹＲ，マハ（Makh）Ｓ，ハイド（Hyde）Ｓ，グレイ（Gray）Ｔ，ボレイロ（Borriello）ＳＰ著，「ヒト腸上皮細胞に対するクロストリジウム・ディフィシルＡ毒素の効果：細胞剥離後のインターロイキン８産生及びアポトーシスの誘導（Effect of Clostridium difficile toxin A on human intestinal epithelial cells: induction of interleukin 8 production and apoptosis after cell detachment）」，ガット（Gut），１９９６年；第３８巻：ｐ．３３７－３４７
５３． ハラー（Haller）Ｄ，ボーデ（Bode）Ｃ，ハメス（Hammes）ＷＰ，ファイファー（Pfeifer）ＡＭＡ，シフリン（Schiffrin）ＥＪ，ブルム（Blum）Ｓ著，「非病原性細菌は腸上皮細胞／白血球共培養に依る差別的サイトカイン応答を誘起する（Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures）」，ガット（Gut），２０００年；第４７巻：ｐ．７９－８７
５４． パーレサック（Parlesak）Ａ，ハラー（Haller）Ｄ，ブリンツ（Brinz）Ｓ，バウアーライン（Baeuerlein）Ａ，ボーデ（Bode）Ｃ著，「単核白血球及び非病原性細菌との区画化共培養モデルに於ける分化ＣＡＣＯ－２細胞に依るサイトカイン放出の調節（Modulation of Cytokine Release by Differentiated CACO-2 Cells in a Compartmentalized Coculture Model with Mononuclear Leucocytes and Nonpathogenic Bacteria）」，スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Scandinavian Journal of Immunology），２００４年；第６０巻：ｐ．４７７－４８５
全ての特許、特許出願、及び其れ等の公開物、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースエントリー及び其の中の全ての利用可能な注釈）を包含するが是等に限定されない本明細書に列記される全ての参照は、其れ等が本明細書に於いて採用される方法論、技術、及び／又は組成物を補うか、説明するか、背景を提供するか、又は教示する程度迄、其れ等の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
１． アレン（Allen）Ａ，キャロル（Carroll）ＮＪＨ著，「胃及び十二指腸に於ける粘着性の且つ可溶性の粘液（Adherent and Soluble Mucus in the Stomach and Duodenum）」，ディジェスティブ・ディジージズ・アンド・サイエンシズ（Digestive Diseases and Sciences），１９８５年；第３０巻：ｐ．５５Ｓ
２． ペラセイエド（Pelaseyed）Ｔ，ベリストローム（Bergstrom）ＪＨ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，エルムント（Ermund）Ａ，バーシュノー（Birchenough）ＧＭＨ，シュッテ（Schutte）Ａ，ファンデルポスト（van der Post）Ｓ，スベンソン（Svensson）Ｆ，ロドリゲス・ピネイロ（Rodriguez－Pineiro）ＡＭ，ニストローム（Nystrom）ＥＥＬ，ワイズング（Wising）Ｃ，ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「杯細胞及びエンテロサイトの粘液及びムチンは胃腸管の第一防衛線を提供し、免疫系と相互作用する（The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system）」，イミュノロジカル・レビューズ（Immunological reviews），２０１４年；第２６０巻：ｐ．８－２０
３． ムルジア（Murgia）Ｘ，ロレッツ（Loretz）Ｂ，ハートウィグ（Hartwig）Ｏ，ヒッティンガー（Hittinger）Ｍ，レアー（Lehr）ＣＭ著，「薬物輸送に対する粘液の役割と治療アウトカムに影響する其のポテンシャル（The role of mucus on drug transport and its potential to affect therapeutic outcomes）」，アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Advanced Drug Delivery Reviews），２０１８年；第１２４巻：ｐ．８２－９７
４． レアー（Lehr）ＣＭ，ポールマ（Poelma）ＦＧＪ，ジャンギンガー（Junginger）ＨＥ，タッカー（Tukker）ＪＪ著，「ラットのインサイチュループに於ける腸粘液ゲル層のターンオーバー時間の概算（An estimate of turnover time of intestinal mucus gel layer in the rat in situ loop）」，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（International Journal of Pharmaceutics），１９９１年；第７０巻：ｐ．２３５－２４０
５． ウェイ（Wei）ＸＣ，ヤン（Yang）Ｚ，レイ（Rey）ＦＥ，リドーラ（Ridaura）ＶＫ，デビッドソン（Davidson）ＮＯ，ゴードン（Gordon）ＪＩ，セメンコビッチ（Semenkovich）ＣＦ著，「脂肪酸シンターゼはムチン２のパルミトイル化に依って腸バリア機能を調節する（Fatty Acid Synthase Modulates Intestinal Barrier Function through Palmitoylation of Mucin 2）」，セル・ホスト＆マイクローブ（Cell Host & Microbe），２０１２年；第１１巻：ｐ．１４０－１５２
６． ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，フィリプソン（Phillipson）Ｍ，ペテルソン（Petersson）Ｊ，ベルシック（Velcich）Ａ，ホルム（Holm）Ｌ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「結腸に於ける２つのＭｕｃ２ムチン依存的な粘液層の内側は細菌を欠く（The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria）」，米国科学アカデミー紀要，２００８年；第１０５巻：ｐ．１５０６４－１５０６９
７． ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ガット感染及び炎症に於ける粘液層の役割（Role of mucus layers in gut infection and inflammation）」，カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー（Current Opinion in Microbiology），２０１２年；第１５巻：ｐ．５７－６２
８． カールソン（Carlson）ＴＬ，ロック（Lock）ＪＹ，キャリア（Carrier）ＲＬ著，「粘液バリアを人工する（Engineering the Mucus Barrier）」，アニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング（Annual Review of Biomedical Engineering），２０１８年；第２０巻：ｐ．１９７－２２０
９． ワーラング（Werlang）Ｃ，カルカルモ・オジャルセ（Carcarmo－Oyarce）Ｇ，リベック（Ribbeck）Ｋ著，「マイクロバイオームを研究及び支配する為に粘液を人工する（Engineering mucus to study and influence the microbiome）」，ネイチャー・レビューズ・マテリアルズ（Nature Reviews Materials），２０１９年；第４巻：ｐ．１３４－１４５
１０． ロジェ（Rogier）ＥＷ，フランツ（Frantz）ＡＬ，ブルーノ（Bruno）ＭＥＣ，ケッツェル（Kaetzel）ＣＳ著，「分泌型ＩｇＡはガット細菌と共に結腸粘液の外側層に濃縮される（Secretory IgA is Concentrated in the Outer Layer of Colonic Mucus along with Gut Bacteria）」，パソジェンズ（Pathogens），２０１４年；第３巻：ｐ．３９０－４０３
１１． グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，スピア（Speer）Ｊ，ワン（Wang）Ｙ，グエン（Nguyen）ＤＬ，リード（Reed）ＭＩ，スミディ（Smiddy）ＮＭ，パーカー（Parker）ＪＳ，ファロン（Fallon）ＪＫ，スミス（Smith）ＰＣ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「薬物輸送研究の為の剛性の勾配を有する足場上に作り出された初代結腸上皮の単層（A Monolayer of Primary Colonic Epithelium Generated on a Scaffold with a Gradient of Stiffness for Drug Transport Studies）」，アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）２０１８年；第９０巻：ｐ．１３３３１－１３３４０
１２． キグレイ（Quigley）ＥＭＭ著，「健康及び疾患に於けるガット細菌（Gut bacteria in health and disease）」，ガストロエンテロロジー＆ヘパトロジー（Gastroenterology & hepatology），２０１３年；第９巻：ｐ．５６０－５６９
１３． ガニョン（Gagnon）Ｍ，ベルナー（Berner）ＡＺ，シェルベ（Chervet）Ｎ，シャサール（Chassard）Ｃ，ラクロワ（Lacroix）Ｃ著，「サルモネラ接着及び侵入を検討する為のＣａｃｏ－２、ＨＴ－２９、及び粘液分泌ＨＴ２９－ＭＴＸ腸細胞モデルの比較（Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion）」，ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ（Journal of Microbiological Methods），２０１３年；第９４巻：ｐ．２７４－２７９
１４． ルスフルール（Lesuffleur）Ｔ，バルバット（Barbat）Ａ，デュソー（Dussaulx）Ｅ，ツヴァイバウム（Zweibaum）Ａ著，「ＨＴ－２９ヒト結腸癌細胞のメトトレキサートに対する成長適応は柱状吸収及び粘液分泌細胞に分化する其れ等の能力に関連する（Growth adaptation to methotrexate of HT-29 human colon carcinoma cells is associated with their ability to differentiate into columnar absorptive and mucus-secreting cells）」，キャンサー・リサーチ（Cancer Research），１９９０年；第５０巻：ｐ．６３３４－６３４３
１５． ヌスラト（Nusrat）Ａ，フォンエイヒェル・シュトライバー（von Eichel－Streiber）Ｃ，ターナー（Turner）ＪＲ，ヴェルカーデ（Verkade）Ｐ，マダラ（Madara）ＪＬ，パルコス（Parkos）ＣＡ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素はタイトジャンクション蛋白質の膜マイクロドメイン局在を変改する事に依って上皮バリア機能を破壊する（Clostridium difficile Toxins Disrupt Epithelial Barrier Function by Altering Membrane Microdomain Localization of Tight Junction Proteins）」，インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity），２００１年；第６９巻：ｐ．１３２９－１３３６
１６． サトー（Sato）Ｔ，ブリーズ（Vries）ＲＧ，スニッペルト（Snippert）ＨＪ，ファンデウェテリンク（van de Wetering）Ｍ，バーカー（Barker）Ｎ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，ファンエス（van Es）ＪＨ，アボ（Abo）Ａ，クジャラ（Kujala）Ｐ，ピーターズ（Peters）ＰＪ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「単一のＬｇｒ５幹細胞は間葉系ニッチなしに陰窩－絨毛構造をインビトロで築く（Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche）」，ネイチャー（Nature），２００９年；第４５９巻：ｐ．２６２－Ｕ１４７
１７． ダテ（Date）Ｓ，サトー（Sato）Ｔ著，「ミニガットオルガノイド：幹細胞ニッチの再構成（Mini-Gut Organoids: Reconstitution of Stem Cell Niche）」，シェクマン（Schekman）Ｒ編，アニュアル・レビュー・オブ・セル・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー（Annual Review of Cell and Developmental Biology），Ｖｏｌ３１，第３１巻，２０１５年：ｐ．２６９－２８９
１８． サトー（Sato）Ｔ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，フェラント（Ferrante）Ｍ，ブリーズ（Vries）ＲＧＪ，ファンエス（van Es）ＪＨ，ファンデンブリンク（van den Brink）Ｓ，ファンフート（van Houdt）ＷＪ，プロンク（Pronk）Ａ，ヴァンガープ（van Gorp）Ｊ，シアセマ（Siersema）ＰＤ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「ヒト結腸、腺腫、腺癌、及びバレット上皮からの上皮オルガノイドの長期拡大培養（Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２０１１年；第１４１巻：ｐ．１７６２－１７７２
１９． イン（Yin）ＸＬ，ファリン（Farin）ＨＦ，ファンエス（van Es）ＪＨ，クレバース（Clevers）Ｈ，ランガー（Langer）Ｒ，カープ（Karp）ＪＭ著，「Ｌｇｒ５（＋）腸幹細胞及び其れ等の子孫のニッチ非依存的な高純度培養（Niche-independent high-purity cultures of Lgr5(+) intestinal stem cells and their progeny）」，ネイチャー・メソッズ（Nature Methods），２０１４年；第１１巻：ｐ．１０６－１１２
２０． フェトフラー（Fatehullah）Ａ，アップルトン（Appleton）ＰＬ，ナトケ（Nathke）ＩＳ著，「腫瘍形成の間の腸管に於ける細胞及び組織極性：細胞は依然として正しい上下方向を知るが、組織の秩序は失われる（Cell and tissue polarity in the intestinal tract during tumourigenesis: cells still know the right way up, but tissue organization is lost）」，フィロソフィカル・トランザクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティー・Ｂ－バイオロジカル・サイエンシズ（Philosophical Transactions of the Royal Society B－Biological Sciences），２０１３年；第３６８巻：ｐ．２０１３００１４
２１． ムーン（Moon）Ｃ，ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「ＩｇＡトランスサイトーシスを調節する因子を評価する為の初代マウス腸上皮細胞単層培養系の開発（Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis）」，ムコサル・イミュノロジー（Mucosal Immunology），２０１４年；第７巻：ｐ．８１８－８２８
２２． ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，マリンショー（Marinshaw）ＪＭ，シャイク（Shaikh）Ｎ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，ムーン（Moon）Ｃ，ター（Tarr）ＰＩ，チョルバ（Ciorba）ＭＡ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「患者に基づくアッセイを容易化する為の強化ヒト胃腸上皮培養系の開発（Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays）」，ガット（Gut），２０１５年；第６４巻：ｐ．９１１－９２０
２３． イン（In）Ｊ，フォルケ・アーベル（Foulke－Abel）Ｊ，ザコス（Zachos）ＮＣ，ハンセン（Hansen）Ａ－Ｍ，ケイパー（Kaper）ＪＢ，バーンスタイン（Bernstein）ＨＤ，ハルシュカ（Halushka）Ｍ，ブラット（Blutt）Ｓ，エステス（Estes）ＭＫ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ著，「腸管出血性大腸菌はヒト幹細胞由来コロノイドに於いて粘液及び微絨毛間ブリッジを縮減する（Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１６年；第２巻：ｐ．４８－６２．ｅ３
２４． コズカ（Kozuka）Ｋ，ヒー（He）Ｙ，クー・マッコイ（Koo－Mccoy）Ｓ，クマラスワミ（Kumaraswamy）Ｐ，ニー（Nie）Ｂ，ショー（Shaw）Ｋ，チャン（Chan）Ｐ，レッドベター（Leadbetter）Ｍ，ヒー（He）Ｌ，ルイス（Lewis）ＪＧ，ジョン（Zhong）Ｚ，シャルモット（Charmot）Ｄ，バラー（Balaa）Ｍ，キング（King）ＡＪ，コールドウェル（Caldwell）ＪＳ，シーゲル（Siegel）Ｍ著，「ヒト及びマウス腸上皮細胞単層プラットフォームの開発及びキャラクタリゼーション（Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform）」，ステム・セル・レポーツ（Stem Cell Reports）２０１７年；第９巻：ｐ．１９７６－１９９０
２５． ノエル（Noel）Ｇ，ベイツ（Baetz）ＮＷ，スターブ（Staab）ＪＦ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ，パセッティ（Pasetti）ＭＦ，ザコス（Zachos）ＮＣ著，「粘膜ガットの生理及びホスト－病原体相互作用を検討する為の初代ヒトマクロファージ－エンテロイド共培養モデル（A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions）」，サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports），２０１７年；第７巻：ｐ．４５２７０
２６． プザン（Puzan）Ｍ，ホシック（Hosic）Ｓ，ギオ（Ghio）Ｃ，コッペス（Koppes）Ａ著，「腸幹細胞分化及び上皮単層機能の腸管神経系制御（Enteric Nervous System Regulation of Intestinal Stem Cell Differentiation and Epithelial Monolayer Function）」，サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports），２０１８年；第８巻：ｐ．６３１３
２７． ワン（Wang）ＹＬ，ディサルボ（DiSalvo）Ｍ，グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，ダットン（Dutton）Ｊ，プロクター（Proctor）Ａ，レバー（Lebhar）ＭＳ，ウィリアムソン（Williamson）ＩＡ，スピア（Speer）Ｊ，ハワード（Howard）ＲＬ，スミディ（Smiddy）ＮＭ，ブルトマン（Bultman）ＳＪ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「初代結腸又は直腸上皮細胞の自己複製する単層（Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１７年；第４巻：ｐ．１６５－＋
２８． マッドン（Madden）ＬＲ，グエン（Nguyen）ＴＶ，ガルシア・モヒカ（Garcia－Mojica）Ｓ，シャー（Shah）Ｖ，レ（Le）ＡＶ，ペイエ（Peier）Ａ，ビスコンティ（Visconti）Ｒ，パーカー（Parker）ＥＭ，プレスネル（Presnell）ＳＣ，グエン（Nguyen）ＤＧ，レッティング（Retting）ＫＮ著，「バイオプリンティングされた３Ｄ初代ヒト腸組織はネイティブな生理及びＡＤＭＥ／Ｔｏｘ機能の様相をモデリングする（Bioprinted 3D Primary Human Intestinal Tissues Model Aspects of Native Physiology and ADME/Tox Functions）」，アイサイエンス（iScience），２０１８年；第２巻：ｐ．１５６－１６７
２９． ワン（Wang）Ｙ，キム（Kim）Ｒ，ファン（Hwang）Ｓ－ＨＪ，ダットン（Dutton）Ｊ，シムズ（Sims）ＣＥ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「幹細胞由来ヒト腸上皮単層プラットフォームに依るインターロイキン８分泌の分析（Analysis of Interleukin 8 Secretion by a Stem-Cell-Derived Human-Intestinal-Epithelial-Monolayer Platform）」，アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry），２０１８年；第９０巻：ｐ．１１５２３－１１５３０
３０． ワン（Wang）ＹＬ，キム（Kim）Ｒ，グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，リード（Reed）ＭＩ，ディサルボ（DiSalvo）Ｍ，グエン（Nguyen）ＤＬ，ブルトマン（Bultman）ＳＪ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「成形された上皮単層を通る化学物質勾配の適用に依るヒト結腸陰窩アレイの形成（Formation of Human Colonic Crypt Array by Application of Chemical Gradients Across a Shaped Epithelial Monolayer）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１８年；第５巻：ｐ．１１３－１３０
３１． ウィットカット（Whitcutt）ＭＪ，アドラー（Adler）ＫＢ，ウー（Wu）Ｒ著，「培養気道上皮細胞の分化の極性を維持する為の二相チャンバー系（A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells）」，インビトロ・セルラー＆デベロップメンタル・バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），１９８８年；第２４巻：ｐ．４２０－４２８
３２． グレイ（Gray）ＴＥ，グズマン（Guzman）Ｋ，デイビス（Davis）ＣＷ，アブドラ（Abdullah）ＬＨ，ネッテスハイム（Nettesheim）Ｐ著，「連続経代された正常なヒト気管気管支上皮細胞の粘液線毛分化（Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells）」，アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology），１９９６年；第１４巻：ｐ．１０４－１１２
３３． レアドン（Raredon）ＭＳＢ，ガエディ（Ghaedi）Ｍ，カル（Calle）ＥＡ，ニクラソン（Niklason）ＬＥ著，「呼吸器上皮のスケーラブルな培養及び分化の為の回転バイオリアクター（A Rotating Bioreactor for Scalable Culture and Differentiation of Respiratory Epithelium）」，セル・メディシン（Cell Medicine），２０１５年；第７巻：ｐ．１０９－１２１
３４． オボイル（O'Boyle）Ｎ，サザーランド（Sutherland）Ｅ，ベリー（Berry）ＣＣ，デイビース（Davies）ＲＬ著，「気液界面に於けるヒツジ気道上皮細胞分化の時間的ダイナミクス（Temporal dynamics of ovine airway epithelial cell differentiation at an air-liquid interface）」，プロスワン（Plos One），２０１７年；第１２巻
３５． オータニ（Ootani）Ａ，トダ（Toda）Ｓ，フジモト（Fujimoto）Ｋ，スギハラ（Sugihara）Ｈ著，「気液界面は培養に依る胃表面粘液細胞（ＧＳＭ０６）の分化を促進する（An air-liquid interface promotes the differentiation of gastric surface mucous cells (GSM06) in culture）」，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications），２０００年；第２７１巻：ｐ．７４１－７４６
３６． ヨコヤマ（Yokoyama）Ｆ，サカタ（Sakata）Ｙ，オータニ（Ootani）Ａ，フジセ（Fujise）Ｔ，カキモト（Kakimoto）Ｔ，アメモリ（Amemori）Ｓ，シライシ（Shiraishi）Ｒ，クロキ（Kuroki）Ｔ，ツナダ（Tsunada）Ｓ，イワキリ（Iwakiri）Ｒ，フジモト（Fujimoto）Ｋ著，「気液界面に依って誘導される胃表面粘液細胞（ＧＳＭ０６）の分化は分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ経路に依って部分的に制御される（Differentiation of gastric surface mucous cells (GSM06) induced by air-liquid interface is regulated partly through mitogen-activated protein kinase pathway）」，ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Journal of Gastroenterology and Hepatology），２００７年；第２２巻：ｐ．２３１０－２３１５
３７． ナバビ（Navabi）Ｎ，マクガキン（McGuckin）ＭＡ，リンデン（Linden）ＳＫ著，「胃腸細胞株は機械的刺激に依ってセミウェット界面に於いて培養される時に粘着性の粘液層を有する極性化した上皮を形成する（Gastrointestinal Cell Lines Form Polarized Epithelia with an Adherent Mucus Layer when Cultured in Semi-Wet Interfaces with Mechanical Stimulation）」，プロスワン（Plos One），２０１３年；第８巻
３８． エルキンズ（Elkins）ＭＲ，バイ（Bye）ＰＴＰ著，「高張食塩水のメカニズム及び適用（Mechanisms and applications of hypertonic saline）」，ジャーナル・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティ・オブ・メディシン（Journal of the Royal Society of Medicine），２０１１年；第１０４巻：ｐ．Ｓ２－Ｓ５
３９． Ｊ．Ｔ，Ｊ．Ｍ．Ｐ，Ｖ．Ｐ．Ｋ，Ｘ．Ｄ．Ｚ著，「ヒト気道上皮細胞に於ける高張性に依る粘液分泌に対する浸透圧応答エレメント結合蛋白質の効果（Effect of osmotic response element binding protein on mucus secretion with hypertonicity in human airway epithelial cells）」，中華医学雑誌（Zhonghua Yi Xue Za Zhi），２０１１年；第９１巻：ｐ．５４９－５５３
４０． ラデキン（Ludeking）Ａ，フェガート（Fegert）Ｐ，ブリン（Blin）Ｎ，ゴット（Gott）Ｐ著，「浸透圧変化及びエタノールは胃腸細胞株に於けるＴＦＦ遺伝子発現を改変する（Osmotic changes and ethanol modify TFF gene expression in gastrointestinal cell lines）」，フェブス・レターズ（Febs Letters），１９９８年；第４３９巻：ｐ．１８０－１８４
４１． シールズ（Shields）Ｒ，マイルズ（Miles）ＪＢ，ギルバートソン（Gilbertson）Ｃ著，「原発性アルドステロン症を有する患者のインタクトな結腸に依る水及び電解質の吸収及び分泌（Absorption and secretion of water and electrolytes by the intact colon in a patient with primary aldosteronism）」，ブリティッシュ・メディカル・ジャーナル（British Medical Journal），１９６８年；第１巻：ｐ．９３－９６
４２． ワプニール（Wapnir）ＲＡ，タイヒベルク（Teichberg）Ｓ著，「腸分泌の制御メカニズム：栄養素吸収への関与（Regulation mechanisms of intestinal secretion: implications in nutrient absorption）」，ザ・ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・バイオケミストリー（The Journal of Nutritional Biochemistry），２００２年；第１３巻：ｐ．１９０－１９９
４３． コーク（Koch）ＴＲ，ミッチェナー（Michener）ＳＲ，ゴー（Go）ＶＬＷ著，「下痢を有する患者に於ける血漿中の血管作動性腸ポリペプチド濃度決定（Plasma vasoactive intestinal polypeptide concentration determination in patients with diarrhea）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１９９１年；第１００巻：ｐ．９９－１０６
４４． シュワルツ（Schwartz）ＣＪ，キンバーグ（Kimberg）ＤＶ，シーリン（Sheerin）ＨＥ，フィールド（Field）Ｍ，サイード（Said）ＳＩ著，「腸粘膜に於けるアデニル酸シクラーゼ及び能動的電解質分泌の血管作動性腸ペプチド刺激（Vasoactive intestinal peptide stimulation of adenylate cyclase and active electrolyte secretion in intestinal mucosa）」，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation），１９７４年；第５４巻：ｐ．５３６－５４４
４５． ウー（Wu）Ｘ，コンリン（Conlin）ＶＳ，モランプディ（Morampudi）Ｖ，リズ（Ryz）ＮＲ，ナセル（Nasser）Ｙ，ビンダー（Bhinder）Ｇ，ベルグストロム（Bergstrom）ＫＳ，ユー（Yu）ＨＢ，ウォーターハウス（Waterhouse）ＣＣＭ，バカン（Buchan）ＡＭＪ，ポペスク（Popescu）ＯＥ，ギブソン（Gibson）ＷＴ，ワシェク（Waschek）ＪＡ，バランス（Vallance）ＢＡ，ヤコブソン（Jacobson）Ｋ著，「血管作動性腸ポリペプチドはマウスに於いて腸バリアのホメオスタシス及び大腸炎からの保護を促進する（Vasoactive Intestinal Polypeptide Promotes Intestinal Barrier Homeostasis and Protection Against Colitis in Mice）」，プロスワン（Plos One），２０１５年；第１０巻：ｐ．ｅ０１２５２２５
４６． ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，ホルメン・ラーソン（Holmen－Larsson）Ｊ，ジャバー（Jabbar）ＫＳ，シャ（Xia）Ｌ，シュー（Xu）Ｈ，ギシャン（Ghishan）ＦＫ，カルバーリョ（Carvalho）ＦＡ，ジュワーツ（Gewirtz）ＡＴ，フェーヴァル（Sjovall）Ｈ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ネズミ大腸炎モデル及び潰瘍性大腸炎を有する患者両方に於いて、細菌は正常では透過不可能な結腸の内側粘液層を透過する（Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis）」，ガット（Gut），２０１４年；第６３巻：ｐ．２８１－２９１
４７． リン（Lin）ＨＸ，リ（Li）Ｈ，チョウ（Cho）ＨＪ，ビアン（Bian）Ｓ，ロー（Roh）ＨＪ，リー（Lee）ＭＫ，キム（Kim）ＪＳ，チョン（Chung）ＳＪ，シム（Shim）ＣＫ，キム（Kim）ＤＤ著，「気道薬物輸送研究の為のインビトロモデルとしてのヒト気管支上皮細胞単層の気液界面（ＡＬＩ）培養（Air-liquid interface (ALI) culture of human bronchial epithelial cell monolayers as an in vitro model for airway drug transport studies）」，ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Journal of Pharmaceutical Sciences），２００７年；第９６巻：ｐ．３４１－３５０
４８． バーンスタム（Bernstam）ＬＩ，ヴォーン（Vaughan）ＦＬ，バーンスタイン（Bernstein）ＩＡ著，「気液界面に於いて成長したケラチノサイト（Keratinocytes grown at the air-liquid interface）」，インビトロ・セルラー＆デベロップメンタル・バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），１９８６年；第２２巻：ｐ．６９５－７０５
４９． オータニ（Ootani）Ａ，リ（Li）ＸＮ，サンジョルジ（Sangiorgi）Ｅ，ホー（Ho）ＱＴ，ウエノ（Ueno）Ｈ，トダ（Toda）Ｓ，スギハラ（Sugihara）Ｈ，フジモト（Fujimoto）Ｋ，ワイスマン（Weissman）ＩＬ，カペッキ（Capecchi）ＭＲ，クオ（Kuo）ＣＪ著，「Ｗｎｔ依存的な幹細胞ニッチ内に於ける持続的なインビトロ腸上皮培養（Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche）」，ネイチャー・メディシン（Nature Medicine），２００９年；第１５巻：ｐ．１－Ｕ１４０
５０． フォート（Voth）ＤＥ，バラード（Ballard）ＪＤ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素：疾患に於ける作用及び役割のメカニズム（Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease）」，クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Clinical microbiology reviews），２００５年；第１８巻：ｐ．２４７－２６３
５１． ヒー（He）Ｄ，ソウギオウルジス（Sougioultzis）Ｓ，ヘイゲン（Hagen）Ｓ，リウ（Liu）Ｊ，キーテス（Keates）Ｓ，キーテス（Keates）ＡＣ，ポゾウラキス（Pothoulakis）Ｃ，ラモント（LaMont）ＪＴ著，「クロストリジウム・ディフィシルＡ毒素はミトコンドリアの酸素ラジカル生成に依ってヒト結腸細胞ＩＬ－８放出を誘発する（Clostridium difficile toxin A triggers human colonocyte IL-8 release via mitochondrial oxygen radical generation）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２００２年；第１２２巻：ｐ．１０４８－１０５７
５２． マヒダ（Mahida）ＹＲ，マハ（Makh）Ｓ，ハイド（Hyde）Ｓ，グレイ（Gray）Ｔ，ボレイロ（Borriello）ＳＰ著，「ヒト腸上皮細胞に対するクロストリジウム・ディフィシルＡ毒素の効果：細胞剥離後のインターロイキン８産生及びアポトーシスの誘導（Effect of Clostridium difficile toxin A on human intestinal epithelial cells: induction of interleukin 8 production and apoptosis after cell detachment）」，ガット（Gut），１９９６年；第３８巻：ｐ．３３７－３４７
５３． ハラー（Haller）Ｄ，ボーデ（Bode）Ｃ，ハメス（Hammes）ＷＰ，ファイファー（Pfeifer）ＡＭＡ，シフリン（Schiffrin）ＥＪ，ブルム（Blum）Ｓ著，「非病原性細菌は腸上皮細胞／白血球共培養に依る差別的サイトカイン応答を誘起する（Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures）」，ガット（Gut），２０００年；第４７巻：ｐ．７９－８７
５４． パーレサック（Parlesak）Ａ，ハラー（Haller）Ｄ，ブリンツ（Brinz）Ｓ，バウアーライン（Baeuerlein）Ａ，ボーデ（Bode）Ｃ著，「単核白血球及び非病原性細菌との区画化共培養モデルに於ける分化ＣＡＣＯ－２細胞に依るサイトカイン放出の調節（Modulation of Cytokine Release by Differentiated CACO-2 Cells in a Compartmentalized Coculture Model with Mononuclear Leucocytes and Nonpathogenic Bacteria）」，スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Scandinavian Journal of Immunology），２００４年；第６０巻：ｐ．４７７－４８５
【符号の説明】
【0121】
Ａ 頂端側
Ｂ 基底側
ＢＳ 基底側
ＣＭＬ 濃縮された粘液層
ＤＭ 分化培地
ＥＭ 拡大培養培地
ＧＣ 杯細胞
ＬＳ 内腔側
Ｍ ムチン
ＯＣ 他の細胞型
ＰＭ 多孔質マトリックス
Ｒ リザーバ
ＳＣ 幹細胞
Ｂ 基底側
ＢＳ 基底側
ＣＭＬ 濃縮された粘液層
ＤＭ 分化培地
ＥＭ 拡大培養培地
ＧＣ 杯細胞
ＬＳ 内腔側
Ｍ ムチン
ＯＣ 他の細胞型
ＰＭ 多孔質マトリックス
Ｒ リザーバ
ＳＣ 幹細胞
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
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【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
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【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
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【図5E】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
方法が：
細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；
幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、
を含む、
粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法。
細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；
幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、
を含む、
粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0120】
参照
全ての特許、特許出願、及び其れ等の公開物、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースエントリー及び其の中の全ての利用可能な注釈）を包含するが是等に限定されない本明細書に列記される全ての参照は、其れ等が本明細書に於いて採用される方法論、技術、及び／又は組成物を補うか、説明するか、背景を提供するか、又は教示する程度迄、其れ等の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
１． アレン（Allen）Ａ，キャロル（Carroll）ＮＪＨ著，「胃及び十二指腸に於ける粘着性の且つ可溶性の粘液（Adherent and Soluble Mucus in the Stomach and Duodenum）」，ディジェスティブ・ディジージズ・アンド・サイエンシズ（Digestive Diseases and Sciences），１９８５年；第３０巻：ｐ．５５Ｓ
２． ペラセイエド（Pelaseyed）Ｔ，ベリストローム（Bergstrom）ＪＨ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，エルムント（Ermund）Ａ，バーシュノー（Birchenough）ＧＭＨ，シュッテ（Schutte）Ａ，ファンデルポスト（van der Post）Ｓ，スベンソン（Svensson）Ｆ，ロドリゲス・ピネイロ（Rodriguez－Pineiro）ＡＭ，ニストローム（Nystrom）ＥＥＬ，ワイズング（Wising）Ｃ，ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「杯細胞及びエンテロサイトの粘液及びムチンは胃腸管の第一防衛線を提供し、免疫系と相互作用する（The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system）」，イミュノロジカル・レビューズ（Immunological reviews），２０１４年；第２６０巻：ｐ．８－２０
３． ムルジア（Murgia）Ｘ，ロレッツ（Loretz）Ｂ，ハートウィグ（Hartwig）Ｏ，ヒッティンガー（Hittinger）Ｍ，レアー（Lehr）ＣＭ著，「薬物輸送に対する粘液の役割と治療アウトカムに影響する其のポテンシャル（The role of mucus on drug transport and its potential to affect therapeutic outcomes）」，アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Advanced Drug Delivery Reviews），２０１８年；第１２４巻：ｐ．８２－９７
４． レアー（Lehr）ＣＭ，ポールマ（Poelma）ＦＧＪ，ジャンギンガー（Junginger）ＨＥ，タッカー（Tukker）ＪＪ著，「ラットのインサイチュループに於ける腸粘液ゲル層のターンオーバー時間の概算（An estimate of turnover time of intestinal mucus gel layer in the rat in situ loop）」，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（International Journal of Pharmaceutics），１９９１年；第７０巻：ｐ．２３５－２４０
５． ウェイ（Wei）ＸＣ，ヤン（Yang）Ｚ，レイ（Rey）ＦＥ，リドーラ（Ridaura）ＶＫ，デビッドソン（Davidson）ＮＯ，ゴードン（Gordon）ＪＩ，セメンコビッチ（Semenkovich）ＣＦ著，「脂肪酸シンターゼはムチン２のパルミトイル化に依って腸バリア機能を調節する（Fatty Acid Synthase Modulates Intestinal Barrier Function through Palmitoylation of Mucin 2）」，セル・ホスト＆マイクローブ（Cell Host & Microbe），２０１２年；第１１巻：ｐ．１４０－１５２
６． ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，フィリプソン（Phillipson）Ｍ，ペテルソン（Petersson）Ｊ，ベルシック（Velcich）Ａ，ホルム（Holm）Ｌ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「結腸に於ける２つのＭｕｃ２ムチン依存的な粘液層の内側は細菌を欠く（The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria）」，米国科学アカデミー紀要，２００８年；第１０５巻：ｐ．１５０６４－１５０６９
７． ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ガット感染及び炎症に於ける粘液層の役割（Role of mucus layers in gut infection and inflammation）」，カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー（Current Opinion in Microbiology），２０１２年；第１５巻：ｐ．５７－６２
８． カールソン（Carlson）ＴＬ，ロック（Lock）ＪＹ，キャリア（Carrier）ＲＬ著，「粘液バリアを人工する（Engineering the Mucus Barrier）」，アニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング（Annual Review of Biomedical Engineering），２０１８年；第２０巻：ｐ．１９７－２２０
９． ワーラング（Werlang）Ｃ，カルカルモ・オジャルセ（Carcarmo－Oyarce）Ｇ，リベック（Ribbeck）Ｋ著，「マイクロバイオームを研究及び支配する為に粘液を人工する（Engineering mucus to study and influence the microbiome）」，ネイチャー・レビューズ・マテリアルズ（Nature Reviews Materials），２０１９年；第４巻：ｐ．１３４－１４５
１０． ロジェ（Rogier）ＥＷ，フランツ（Frantz）ＡＬ，ブルーノ（Bruno）ＭＥＣ，ケッツェル（Kaetzel）ＣＳ著，「分泌型ＩｇＡはガット細菌と共に結腸粘液の外側層に濃縮される（Secretory IgA is Concentrated in the Outer Layer of Colonic Mucus along with Gut Bacteria）」，パソジェンズ（Pathogens），２０１４年；第３巻：ｐ．３９０－４０３
１１． グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，スピア（Speer）Ｊ，ワン（Wang）Ｙ，グエン（Nguyen）ＤＬ，リード（Reed）ＭＩ，スミディ（Smiddy）ＮＭ，パーカー（Parker）ＪＳ，ファロン（Fallon）ＪＫ，スミス（Smith）ＰＣ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「薬物輸送研究の為の剛性の勾配を有する足場上に作り出された初代結腸上皮の単層（A Monolayer of Primary Colonic Epithelium Generated on a Scaffold with a Gradient of Stiffness for Drug Transport Studies）」，アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）２０１８年；第９０巻：ｐ．１３３３１－１３３４０
１２． キグレイ（Quigley）ＥＭＭ著，「健康及び疾患に於けるガット細菌（Gut bacteria in health and disease）」，ガストロエンテロロジー＆ヘパトロジー（Gastroenterology & hepatology），２０１３年；第９巻：ｐ．５６０－５６９
１３． ガニョン（Gagnon）Ｍ，ベルナー（Berner）ＡＺ，シェルベ（Chervet）Ｎ，シャサール（Chassard）Ｃ，ラクロワ（Lacroix）Ｃ著，「サルモネラ接着及び侵入を検討する為のＣａｃｏ－２、ＨＴ－２９、及び粘液分泌ＨＴ２９－ＭＴＸ腸細胞モデルの比較（Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion）」，ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ（Journal of Microbiological Methods），２０１３年；第９４巻：ｐ．２７４－２７９
１４． ルスフルール（Lesuffleur）Ｔ，バルバット（Barbat）Ａ，デュソー（Dussaulx）Ｅ，ツヴァイバウム（Zweibaum）Ａ著，「ＨＴ－２９ヒト結腸癌細胞のメトトレキサートに対する成長適応は柱状吸収及び粘液分泌細胞に分化する其れ等の能力に関連する（Growth adaptation to methotrexate of HT-29 human colon carcinoma cells is associated with their ability to differentiate into columnar absorptive and mucus-secreting cells）」，キャンサー・リサーチ（Cancer Research），１９９０年；第５０巻：ｐ．６３３４－６３４３
１５． ヌスラト（Nusrat）Ａ，フォンエイヒェル・シュトライバー（von Eichel－Streiber）Ｃ，ターナー（Turner）ＪＲ，ヴェルカーデ（Verkade）Ｐ，マダラ（Madara）ＪＬ，パルコス（Parkos）ＣＡ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素はタイトジャンクション蛋白質の膜マイクロドメイン局在を変改する事に依って上皮バリア機能を破壊する（Clostridium difficile Toxins Disrupt Epithelial Barrier Function by Altering Membrane Microdomain Localization of Tight Junction Proteins）」，インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity），２００１年；第６９巻：ｐ．１３２９－１３３６
１６． サトー（Sato）Ｔ，ブリーズ（Vries）ＲＧ，スニッペルト（Snippert）ＨＪ，ファンデウェテリンク（van de Wetering）Ｍ，バーカー（Barker）Ｎ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，ファンエス（van Es）ＪＨ，アボ（Abo）Ａ，クジャラ（Kujala）Ｐ，ピーターズ（Peters）ＰＪ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「単一のＬｇｒ５幹細胞は間葉系ニッチなしに陰窩－絨毛構造をインビトロで築く（Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche）」，ネイチャー（Nature），２００９年；第４５９巻：ｐ．２６２－Ｕ１４７
１７． ダテ（Date）Ｓ，サトー（Sato）Ｔ著，「ミニガットオルガノイド：幹細胞ニッチの再構成（Mini-Gut Organoids: Reconstitution of Stem Cell Niche）」，シェクマン（Schekman）Ｒ編，アニュアル・レビュー・オブ・セル・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー（Annual Review of Cell and Developmental Biology），Ｖｏｌ３１，第３１巻，２０１５年：ｐ．２６９－２８９
１８． サトー（Sato）Ｔ，シュタンゲ（Stange）ＤＥ，フェラント（Ferrante）Ｍ，ブリーズ（Vries）ＲＧＪ，ファンエス（van Es）ＪＨ，ファンデンブリンク（van den Brink）Ｓ，ファンフート（van Houdt）ＷＪ，プロンク（Pronk）Ａ，ヴァンガープ（van Gorp）Ｊ，シアセマ（Siersema）ＰＤ，クレバース（Clevers）Ｈ著，「ヒト結腸、腺腫、腺癌、及びバレット上皮からの上皮オルガノイドの長期拡大培養（Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２０１１年；第１４１巻：ｐ．１７６２－１７７２
１９． イン（Yin）ＸＬ，ファリン（Farin）ＨＦ，ファンエス（van Es）ＪＨ，クレバース（Clevers）Ｈ，ランガー（Langer）Ｒ，カープ（Karp）ＪＭ著，「Ｌｇｒ５（＋）腸幹細胞及び其れ等の子孫のニッチ非依存的な高純度培養（Niche-independent high-purity cultures of Lgr5(+) intestinal stem cells and their progeny）」，ネイチャー・メソッズ（Nature Methods），２０１４年；第１１巻：ｐ．１０６－１１２
２０． フェトフラー（Fatehullah）Ａ，アップルトン（Appleton）ＰＬ，ナトケ（Nathke）ＩＳ著，「腫瘍形成の間の腸管に於ける細胞及び組織極性：細胞は依然として正しい上下方向を知るが、組織の秩序は失われる（Cell and tissue polarity in the intestinal tract during tumourigenesis: cells still know the right way up, but tissue organization is lost）」，フィロソフィカル・トランザクションズ・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティー・Ｂ－バイオロジカル・サイエンシズ（Philosophical Transactions of the Royal Society B－Biological Sciences），２０１３年；第３６８巻：ｐ．２０１３００１４
２１． ムーン（Moon）Ｃ，ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「ＩｇＡトランスサイトーシスを調節する因子を評価する為の初代マウス腸上皮細胞単層培養系の開発（Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis）」，ムコサル・イミュノロジー（Mucosal Immunology），２０１４年；第７巻：ｐ．８１８－８２８
２２． ヴァンデュッセン（VanDussen）ＫＬ，マリンショー（Marinshaw）ＪＭ，シャイク（Shaikh）Ｎ，ミヨシ（Miyoshi）Ｈ，ムーン（Moon）Ｃ，ター（Tarr）ＰＩ，チョルバ（Ciorba）ＭＡ，スタッペンベック（Stappenbeck）ＴＳ著，「患者に基づくアッセイを容易化する為の強化ヒト胃腸上皮培養系の開発（Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays）」，ガット（Gut），２０１５年；第６４巻：ｐ．９１１－９２０
２３． イン（In）Ｊ，フォルケ・アーベル（Foulke－Abel）Ｊ，ザコス（Zachos）ＮＣ，ハンセン（Hansen）Ａ－Ｍ，ケイパー（Kaper）ＪＢ，バーンスタイン（Bernstein）ＨＤ，ハルシュカ（Halushka）Ｍ，ブラット（Blutt）Ｓ，エステス（Estes）ＭＫ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ著，「腸管出血性大腸菌はヒト幹細胞由来コロノイドに於いて粘液及び微絨毛間ブリッジを縮減する（Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１６年；第２巻：ｐ．４８－６２．ｅ３
２４． コズカ（Kozuka）Ｋ，ヒー（He）Ｙ，クー・マッコイ（Koo－Mccoy）Ｓ，クマラスワミ（Kumaraswamy）Ｐ，ニー（Nie）Ｂ，ショー（Shaw）Ｋ，チャン（Chan）Ｐ，レッドベター（Leadbetter）Ｍ，ヒー（He）Ｌ，ルイス（Lewis）ＪＧ，ジョン（Zhong）Ｚ，シャルモット（Charmot）Ｄ，バラー（Balaa）Ｍ，キング（King）ＡＪ，コールドウェル（Caldwell）ＪＳ，シーゲル（Siegel）Ｍ著，「ヒト及びマウス腸上皮細胞単層プラットフォームの開発及びキャラクタリゼーション（Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform）」，ステム・セル・レポーツ（Stem Cell Reports）２０１７年；第９巻：ｐ．１９７６－１９９０
２５． ノエル（Noel）Ｇ，ベイツ（Baetz）ＮＷ，スターブ（Staab）ＪＦ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ，パセッティ（Pasetti）ＭＦ，ザコス（Zachos）ＮＣ著，「粘膜ガットの生理及びホスト－病原体相互作用を検討する為の初代ヒトマクロファージ－エンテロイド共培養モデル（A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions）」，サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports），２０１７年；第７巻：ｐ．４５２７０
２６． プザン（Puzan）Ｍ，ホシック（Hosic）Ｓ，ギオ（Ghio）Ｃ，コッペス（Koppes）Ａ著，「腸幹細胞分化及び上皮単層機能の腸管神経系制御（Enteric Nervous System Regulation of Intestinal Stem Cell Differentiation and Epithelial Monolayer Function）」，サイエンティフィック・レポーツ（Scientific Reports），２０１８年；第８巻：ｐ．６３１３
２７． ワン（Wang）ＹＬ，ディサルボ（DiSalvo）Ｍ，グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，ダットン（Dutton）Ｊ，プロクター（Proctor）Ａ，レバー（Lebhar）ＭＳ，ウィリアムソン（Williamson）ＩＡ，スピア（Speer）Ｊ，ハワード（Howard）ＲＬ，スミディ（Smiddy）ＮＭ，ブルトマン（Bultman）ＳＪ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「初代結腸又は直腸上皮細胞の自己複製する単層（Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１７年；第４巻：ｐ．１６５－＋
２８． マッドン（Madden）ＬＲ，グエン（Nguyen）ＴＶ，ガルシア・モヒカ（Garcia－Mojica）Ｓ，シャー（Shah）Ｖ，レ（Le）ＡＶ，ペイエ（Peier）Ａ，ビスコンティ（Visconti）Ｒ，パーカー（Parker）ＥＭ，プレスネル（Presnell）ＳＣ，グエン（Nguyen）ＤＧ，レッティング（Retting）ＫＮ著，「バイオプリンティングされた３Ｄ初代ヒト腸組織はネイティブな生理及びＡＤＭＥ／Ｔｏｘ機能の様相をモデリングする（Bioprinted 3D Primary Human Intestinal Tissues Model Aspects of Native Physiology and ADME/Tox Functions）」，アイサイエンス（iScience），２０１８年；第２巻：ｐ．１５６－１６７
２９． ワン（Wang）Ｙ，キム（Kim）Ｒ，ファン（Hwang）Ｓ－ＨＪ，ダットン（Dutton）Ｊ，シムズ（Sims）ＣＥ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「幹細胞由来ヒト腸上皮単層プラットフォームに依るインターロイキン８分泌の分析（Analysis of Interleukin 8 Secretion by a Stem-Cell-Derived Human-Intestinal-Epithelial-Monolayer Platform）」，アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry），２０１８年；第９０巻：ｐ．１１５２３－１１５３０
３０． ワン（Wang）ＹＬ，キム（Kim）Ｒ，グナセカラ（Gunasekara）ＤＢ，リード（Reed）ＭＩ，ディサルボ（DiSalvo）Ｍ，グエン（Nguyen）ＤＬ，ブルトマン（Bultman）ＳＪ，シムズ（Sims）ＣＥ，マグネス（Magness）ＳＴ，アルブリットン（Allbritton）ＮＬ著，「成形された上皮単層を通る化学物質勾配の適用に依るヒト結腸陰窩アレイの形成（Formation of Human Colonic Crypt Array by Application of Chemical Gradients Across a Shaped Epithelial Monolayer）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１８年；第５巻：ｐ．１１３－１３０
３１． ウィットカット（Whitcutt）ＭＪ，アドラー（Adler）ＫＢ，ウー（Wu）Ｒ著，「培養気道上皮細胞の分化の極性を維持する為の二相チャンバー系（A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells）」，インビトロ・セルラー＆デベロップメンタル・バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），１９８８年；第２４巻：ｐ．４２０－４２８
３２． グレイ（Gray）ＴＥ，グズマン（Guzman）Ｋ，デイビス（Davis）ＣＷ，アブドラ（Abdullah）ＬＨ，ネッテスハイム（Nettesheim）Ｐ著，「連続経代された正常なヒト気管気管支上皮細胞の粘液線毛分化（Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells）」，アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology），１９９６年；第１４巻：ｐ．１０４－１１２
３３． レアドン（Raredon）ＭＳＢ，ガエディ（Ghaedi）Ｍ，カル（Calle）ＥＡ，ニクラソン（Niklason）ＬＥ著，「呼吸器上皮のスケーラブルな培養及び分化の為の回転バイオリアクター（A Rotating Bioreactor for Scalable Culture and Differentiation of Respiratory Epithelium）」，セル・メディシン（Cell Medicine），２０１５年；第７巻：ｐ．１０９－１２１
３４． オボイル（O'Boyle）Ｎ，サザーランド（Sutherland）Ｅ，ベリー（Berry）ＣＣ，デイビース（Davies）ＲＬ著，「気液界面に於けるヒツジ気道上皮細胞分化の時間的ダイナミクス（Temporal dynamics of ovine airway epithelial cell differentiation at an air-liquid interface）」，プロスワン（Plos One），２０１７年；第１２巻
３５． オータニ（Ootani）Ａ，トダ（Toda）Ｓ，フジモト（Fujimoto）Ｋ，スギハラ（Sugihara）Ｈ著，「気液界面は培養に依る胃表面粘液細胞（ＧＳＭ０６）の分化を促進する（An air-liquid interface promotes the differentiation of gastric surface mucous cells (GSM06) in culture）」，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications），２０００年；第２７１巻：ｐ．７４１－７４６
３６． ヨコヤマ（Yokoyama）Ｆ，サカタ（Sakata）Ｙ，オータニ（Ootani）Ａ，フジセ（Fujise）Ｔ，カキモト（Kakimoto）Ｔ，アメモリ（Amemori）Ｓ，シライシ（Shiraishi）Ｒ，クロキ（Kuroki）Ｔ，ツナダ（Tsunada）Ｓ，イワキリ（Iwakiri）Ｒ，フジモト（Fujimoto）Ｋ著，「気液界面に依って誘導される胃表面粘液細胞（ＧＳＭ０６）の分化は分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ経路に依って部分的に制御される（Differentiation of gastric surface mucous cells (GSM06) induced by air-liquid interface is regulated partly through mitogen-activated protein kinase pathway）」，ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Journal of Gastroenterology and Hepatology），２００７年；第２２巻：ｐ．２３１０－２３１５
３７． ナバビ（Navabi）Ｎ，マクガキン（McGuckin）ＭＡ，リンデン（Linden）ＳＫ著，「胃腸細胞株は機械的刺激に依ってセミウェット界面に於いて培養される時に粘着性の粘液層を有する極性化した上皮を形成する（Gastrointestinal Cell Lines Form Polarized Epithelia with an Adherent Mucus Layer when Cultured in Semi-Wet Interfaces with Mechanical Stimulation）」，プロスワン（Plos One），２０１３年；第８巻
３８． エルキンズ（Elkins）ＭＲ，バイ（Bye）ＰＴＰ著，「高張食塩水のメカニズム及び適用（Mechanisms and applications of hypertonic saline）」，ジャーナル・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティ・オブ・メディシン（Journal of the Royal Society of Medicine），２０１１年；第１０４巻：ｐ．Ｓ２－Ｓ５
３９． Ｊ．Ｔ，Ｊ．Ｍ．Ｐ，Ｖ．Ｐ．Ｋ，Ｘ．Ｄ．Ｚ著，「ヒト気道上皮細胞に於ける高張性に依る粘液分泌に対する浸透圧応答エレメント結合蛋白質の効果（Effect of osmotic response element binding protein on mucus secretion with hypertonicity in human airway epithelial cells）」，中華医学雑誌（Zhonghua Yi Xue Za Zhi），２０１１年；第９１巻：ｐ．５４９－５５３
４０． ラデキン（Ludeking）Ａ，フェガート（Fegert）Ｐ，ブリン（Blin）Ｎ，ゴット（Gott）Ｐ著，「浸透圧変化及びエタノールは胃腸細胞株に於けるＴＦＦ遺伝子発現を改変する（Osmotic changes and ethanol modify TFF gene expression in gastrointestinal cell lines）」，フェブス・レターズ（Febs Letters），１９９８年；第４３９巻：ｐ．１８０－１８４
４１． シールズ（Shields）Ｒ，マイルズ（Miles）ＪＢ，ギルバートソン（Gilbertson）Ｃ著，「原発性アルドステロン症を有する患者のインタクトな結腸に依る水及び電解質の吸収及び分泌（Absorption and secretion of water and electrolytes by the intact colon in a patient with primary aldosteronism）」，ブリティッシュ・メディカル・ジャーナル（British Medical Journal），１９６８年；第１巻：ｐ．９３－９６
４２． ワプニール（Wapnir）ＲＡ，タイヒベルク（Teichberg）Ｓ著，「腸分泌の制御メカニズム：栄養素吸収への関与（Regulation mechanisms of intestinal secretion: implications in nutrient absorption）」，ザ・ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・バイオケミストリー（The Journal of Nutritional Biochemistry），２００２年；第１３巻：ｐ．１９０－１９９
４３． コーク（Koch）ＴＲ，ミッチェナー（Michener）ＳＲ，ゴー（Go）ＶＬＷ著，「下痢を有する患者に於ける血漿中の血管作動性腸ポリペプチド濃度決定（Plasma vasoactive intestinal polypeptide concentration determination in patients with diarrhea）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１９９１年；第１００巻：ｐ．９９－１０６
４４． シュワルツ（Schwartz）ＣＪ，キンバーグ（Kimberg）ＤＶ，シーリン（Sheerin）ＨＥ，フィールド（Field）Ｍ，サイード（Said）ＳＩ著，「腸粘膜に於けるアデニル酸シクラーゼ及び能動的電解質分泌の血管作動性腸ペプチド刺激（Vasoactive intestinal peptide stimulation of adenylate cyclase and active electrolyte secretion in intestinal mucosa）」，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation），１９７４年；第５４巻：ｐ．５３６－５４４
４５． ウー（Wu）Ｘ，コンリン（Conlin）ＶＳ，モランプディ（Morampudi）Ｖ，リズ（Ryz）ＮＲ，ナセル（Nasser）Ｙ，ビンダー（Bhinder）Ｇ，ベルグストロム（Bergstrom）ＫＳ，ユー（Yu）ＨＢ，ウォーターハウス（Waterhouse）ＣＣＭ，バカン（Buchan）ＡＭＪ，ポペスク（Popescu）ＯＥ，ギブソン（Gibson）ＷＴ，ワシェク（Waschek）ＪＡ，バランス（Vallance）ＢＡ，ヤコブソン（Jacobson）Ｋ著，「血管作動性腸ポリペプチドはマウスに於いて腸バリアのホメオスタシス及び大腸炎からの保護を促進する（Vasoactive Intestinal Polypeptide Promotes Intestinal Barrier Homeostasis and Protection Against Colitis in Mice）」，プロスワン（Plos One），２０１５年；第１０巻：ｐ．ｅ０１２５２２５
４６． ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，ホルメン・ラーソン（Holmen－Larsson）Ｊ，ジャバー（Jabbar）ＫＳ，シャ（Xia）Ｌ，シュー（Xu）Ｈ，ギシャン（Ghishan）ＦＫ，カルバーリョ（Carvalho）ＦＡ，ジュワーツ（Gewirtz）ＡＴ，フェーヴァル（Sjovall）Ｈ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ネズミ大腸炎モデル及び潰瘍性大腸炎を有する患者両方に於いて、細菌は正常では透過不可能な結腸の内側粘液層を透過する（Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis）」，ガット（Gut），２０１４年；第６３巻：ｐ．２８１－２９１
４７． リン（Lin）ＨＸ，リ（Li）Ｈ，チョウ（Cho）ＨＪ，ビアン（Bian）Ｓ，ロー（Roh）ＨＪ，リー（Lee）ＭＫ，キム（Kim）ＪＳ，チョン（Chung）ＳＪ，シム（Shim）ＣＫ，キム（Kim）ＤＤ著，「気道薬物輸送研究の為のインビトロモデルとしてのヒト気管支上皮細胞単層の気液界面（ＡＬＩ）培養（Air-liquid interface (ALI) culture of human bronchial epithelial cell monolayers as an in vitro model for airway drug transport studies）」，ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Journal of Pharmaceutical Sciences），２００７年；第９６巻：ｐ．３４１－３５０
４８． バーンスタム（Bernstam）ＬＩ，ヴォーン（Vaughan）ＦＬ，バーンスタイン（Bernstein）ＩＡ著，「気液界面に於いて成長したケラチノサイト（Keratinocytes grown at the air-liquid interface）」，インビトロ・セルラー＆デベロップメンタル・バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），１９８６年；第２２巻：ｐ．６９５－７０５
４９． オータニ（Ootani）Ａ，リ（Li）ＸＮ，サンジョルジ（Sangiorgi）Ｅ，ホー（Ho）ＱＴ，ウエノ（Ueno）Ｈ，トダ（Toda）Ｓ，スギハラ（Sugihara）Ｈ，フジモト（Fujimoto）Ｋ，ワイスマン（Weissman）ＩＬ，カペッキ（Capecchi）ＭＲ，クオ（Kuo）ＣＪ著，「Ｗｎｔ依存的な幹細胞ニッチ内に於ける持続的なインビトロ腸上皮培養（Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche）」，ネイチャー・メディシン（Nature Medicine），２００９年；第１５巻：ｐ．１－Ｕ１４０
５０． フォート（Voth）ＤＥ，バラード（Ballard）ＪＤ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素：疾患に於ける作用及び役割のメカニズム（Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease）」，クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Clinical microbiology reviews），２００５年；第１８巻：ｐ．２４７－２６３
５１． ヒー（He）Ｄ，ソウギオウルジス（Sougioultzis）Ｓ，ヘイゲン（Hagen）Ｓ，リウ（Liu）Ｊ，キーテス（Keates）Ｓ，キーテス（Keates）ＡＣ，ポゾウラキス（Pothoulakis）Ｃ，ラモント（LaMont）ＪＴ著，「クロストリジウム・ディフィシルＡ毒素はミトコンドリアの酸素ラジカル生成に依ってヒト結腸細胞ＩＬ－８放出を誘発する（Clostridium difficile toxin A triggers human colonocyte IL-8 release via mitochondrial oxygen radical generation）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２００２年；第１２２巻：ｐ．１０４８－１０５７
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５４． パーレサック（Parlesak）Ａ，ハラー（Haller）Ｄ，ブリンツ（Brinz）Ｓ，バウアーライン（Baeuerlein）Ａ，ボーデ（Bode）Ｃ著，「単核白血球及び非病原性細菌との区画化共培養モデルに於ける分化ＣＡＣＯ－２細胞に依るサイトカイン放出の調節（Modulation of Cytokine Release by Differentiated CACO-2 Cells in a Compartmentalized Coculture Model with Mononuclear Leucocytes and Nonpathogenic Bacteria）」，スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Scandinavian Journal of Immunology），２００４年；第６０巻：ｐ．４７７－４８５
〔付記１〕
方法が：
細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；
幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、
を含み、
細胞単層の粘液産生細胞が、細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる、
粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法。
〔付記２〕
粘液層が微小物体にとって実質的に透過不可能である、付記１に記載の方法。
〔付記３〕
粘液層の厚さが約１ミクロンから約１ｃｍである、付記１に記載の方法。
〔付記４〕
粘液層の厚さが約３０ミクロンから約１ｃｍである、付記３に記載の方法。
〔付記５〕
基底リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の基底側の下方に存在し、内腔リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側の上方に存在し、基底リザーバ及び内腔リザーバは其々が液体培地を含み；
方法が：更に、
内腔リザーバ内の液体培地を取り除いて、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に気液界面を生ずる事；及び／又は
内腔リザーバ内の液体培地の体積を、細胞単層の内腔側の上方に於いて、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲の深さに調整する事、
を含む、
付記１に記載の方法。
〔付記６〕
更に、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に又は其の上方に、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアを配置する事を含む、付記１～５の何れか１項に記載の方法。
〔付記７〕
不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアが、粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は細胞単層の粘液産生細胞に依って生ずる粘液層の内腔側と直接的接触をしている、付記６に記載の方法。
〔付記８〕
液体培地が、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアと、粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は粘液層の内腔側との間にあり、液体培地の深さが約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲である、付記６に記載の方法。
〔付記９〕
液体培地がホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液を含む（ホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液）、付記５に記載の方法。
〔付記１０〕
幹細胞が、上皮幹細胞、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、呼吸器幹細胞、胃幹細胞、鼻腔幹細胞、生殖器官細胞（子宮頸部、膣、子宮）、尿道細胞、嗅覚細胞、口腔細胞、舌細胞、及び／又は結膜細胞である、付記１～５の何れか１項に記載の方法。
〔付記１１〕
幹細胞が腸上皮幹細胞である、付記１に記載の方法。
〔付記１２〕
粘液層が、約１から約１００ミクロンのサイズ範囲のビーズ又は微生物にとって実質的に透過不可能である、付記１に記載の方法。
〔付記１３〕
力が細胞単層の表面に平行して適用される、付記１～１２の何れか１項に記載の方法。
〔付記１４〕
力が表面張力の力の適用又は機械的な力の適用を含む、付記１３に記載の方法。
〔付記１５〕
機械的な力が、攪拌子、細胞表面に平行して動く半固体材料、及び／又は細胞表面の上側に於けるスラリーの循環である、付記１４に記載の方法。
〔付記１６〕
付記１～１５の何れか１項に記載の方法に依って生ずる、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
〔付記１７〕
粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、付記１６に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記１８〕
粘液層が微小物体（micro－objective）にとって実質的に透過不可能である、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
〔付記１９〕
粘液層が約１ミクロンから約１ｃｍの厚さを含む、付記１８に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記２０〕
粘液層が約１ミクロンから約１００ミクロンのサイズ範囲の微小物体にとって透過不可能である、付記１８に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記２１〕
粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、付記１８に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記２２〕
方法が：
付記１６に記載の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、薬物、又は粒子と接触させる事と；
生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと動く距離を測定し、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する事と、
を含む、
細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する方法。
〔付記２３〕
生物が細菌、ウイルス、真菌、原虫、及び／又は蠕虫である、付記２２に記載の方法。
全ての特許、特許出願、及び其れ等の公開物、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースエントリー及び其の中の全ての利用可能な注釈）を包含するが是等に限定されない本明細書に列記される全ての参照は、其れ等が本明細書に於いて採用される方法論、技術、及び／又は組成物を補うか、説明するか、背景を提供するか、又は教示する程度迄、其れ等の全体が参照に依って本明細書に組み込まれる。
１． アレン（Allen）Ａ，キャロル（Carroll）ＮＪＨ著，「胃及び十二指腸に於ける粘着性の且つ可溶性の粘液（Adherent and Soluble Mucus in the Stomach and Duodenum）」，ディジェスティブ・ディジージズ・アンド・サイエンシズ（Digestive Diseases and Sciences），１９８５年；第３０巻：ｐ．５５Ｓ
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２３． イン（In）Ｊ，フォルケ・アーベル（Foulke－Abel）Ｊ，ザコス（Zachos）ＮＣ，ハンセン（Hansen）Ａ－Ｍ，ケイパー（Kaper）ＪＢ，バーンスタイン（Bernstein）ＨＤ，ハルシュカ（Halushka）Ｍ，ブラット（Blutt）Ｓ，エステス（Estes）ＭＫ，ドノヴィッツ（Donowitz）Ｍ，コブバスンジャック（Kovbasnjuk）Ｏ著，「腸管出血性大腸菌はヒト幹細胞由来コロノイドに於いて粘液及び微絨毛間ブリッジを縮減する（Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids）」，セルラー・アンド・モレキュラー・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology），２０１６年；第２巻：ｐ．４８－６２．ｅ３
２４． コズカ（Kozuka）Ｋ，ヒー（He）Ｙ，クー・マッコイ（Koo－Mccoy）Ｓ，クマラスワミ（Kumaraswamy）Ｐ，ニー（Nie）Ｂ，ショー（Shaw）Ｋ，チャン（Chan）Ｐ，レッドベター（Leadbetter）Ｍ，ヒー（He）Ｌ，ルイス（Lewis）ＪＧ，ジョン（Zhong）Ｚ，シャルモット（Charmot）Ｄ，バラー（Balaa）Ｍ，キング（King）ＡＪ，コールドウェル（Caldwell）ＪＳ，シーゲル（Siegel）Ｍ著，「ヒト及びマウス腸上皮細胞単層プラットフォームの開発及びキャラクタリゼーション（Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform）」，ステム・セル・レポーツ（Stem Cell Reports）２０１７年；第９巻：ｐ．１９７６－１９９０
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３７． ナバビ（Navabi）Ｎ，マクガキン（McGuckin）ＭＡ，リンデン（Linden）ＳＫ著，「胃腸細胞株は機械的刺激に依ってセミウェット界面に於いて培養される時に粘着性の粘液層を有する極性化した上皮を形成する（Gastrointestinal Cell Lines Form Polarized Epithelia with an Adherent Mucus Layer when Cultured in Semi-Wet Interfaces with Mechanical Stimulation）」，プロスワン（Plos One），２０１３年；第８巻
３８． エルキンズ（Elkins）ＭＲ，バイ（Bye）ＰＴＰ著，「高張食塩水のメカニズム及び適用（Mechanisms and applications of hypertonic saline）」，ジャーナル・オブ・ザ・ロイヤル・ソサエティ・オブ・メディシン（Journal of the Royal Society of Medicine），２０１１年；第１０４巻：ｐ．Ｓ２－Ｓ５
３９． Ｊ．Ｔ，Ｊ．Ｍ．Ｐ，Ｖ．Ｐ．Ｋ，Ｘ．Ｄ．Ｚ著，「ヒト気道上皮細胞に於ける高張性に依る粘液分泌に対する浸透圧応答エレメント結合蛋白質の効果（Effect of osmotic response element binding protein on mucus secretion with hypertonicity in human airway epithelial cells）」，中華医学雑誌（Zhonghua Yi Xue Za Zhi），２０１１年；第９１巻：ｐ．５４９－５５３
４０． ラデキン（Ludeking）Ａ，フェガート（Fegert）Ｐ，ブリン（Blin）Ｎ，ゴット（Gott）Ｐ著，「浸透圧変化及びエタノールは胃腸細胞株に於けるＴＦＦ遺伝子発現を改変する（Osmotic changes and ethanol modify TFF gene expression in gastrointestinal cell lines）」，フェブス・レターズ（Febs Letters），１９９８年；第４３９巻：ｐ．１８０－１８４
４１． シールズ（Shields）Ｒ，マイルズ（Miles）ＪＢ，ギルバートソン（Gilbertson）Ｃ著，「原発性アルドステロン症を有する患者のインタクトな結腸に依る水及び電解質の吸収及び分泌（Absorption and secretion of water and electrolytes by the intact colon in a patient with primary aldosteronism）」，ブリティッシュ・メディカル・ジャーナル（British Medical Journal），１９６８年；第１巻：ｐ．９３－９６
４２． ワプニール（Wapnir）ＲＡ，タイヒベルク（Teichberg）Ｓ著，「腸分泌の制御メカニズム：栄養素吸収への関与（Regulation mechanisms of intestinal secretion: implications in nutrient absorption）」，ザ・ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・バイオケミストリー（The Journal of Nutritional Biochemistry），２００２年；第１３巻：ｐ．１９０－１９９
４３． コーク（Koch）ＴＲ，ミッチェナー（Michener）ＳＲ，ゴー（Go）ＶＬＷ著，「下痢を有する患者に於ける血漿中の血管作動性腸ポリペプチド濃度決定（Plasma vasoactive intestinal polypeptide concentration determination in patients with diarrhea）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），１９９１年；第１００巻：ｐ．９９－１０６
４４． シュワルツ（Schwartz）ＣＪ，キンバーグ（Kimberg）ＤＶ，シーリン（Sheerin）ＨＥ，フィールド（Field）Ｍ，サイード（Said）ＳＩ著，「腸粘膜に於けるアデニル酸シクラーゼ及び能動的電解質分泌の血管作動性腸ペプチド刺激（Vasoactive intestinal peptide stimulation of adenylate cyclase and active electrolyte secretion in intestinal mucosa）」，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation），１９７４年；第５４巻：ｐ．５３６－５４４
４５． ウー（Wu）Ｘ，コンリン（Conlin）ＶＳ，モランプディ（Morampudi）Ｖ，リズ（Ryz）ＮＲ，ナセル（Nasser）Ｙ，ビンダー（Bhinder）Ｇ，ベルグストロム（Bergstrom）ＫＳ，ユー（Yu）ＨＢ，ウォーターハウス（Waterhouse）ＣＣＭ，バカン（Buchan）ＡＭＪ，ポペスク（Popescu）ＯＥ，ギブソン（Gibson）ＷＴ，ワシェク（Waschek）ＪＡ，バランス（Vallance）ＢＡ，ヤコブソン（Jacobson）Ｋ著，「血管作動性腸ポリペプチドはマウスに於いて腸バリアのホメオスタシス及び大腸炎からの保護を促進する（Vasoactive Intestinal Polypeptide Promotes Intestinal Barrier Homeostasis and Protection Against Colitis in Mice）」，プロスワン（Plos One），２０１５年；第１０巻：ｐ．ｅ０１２５２２５
４６． ヨハンソン（Johansson）ＭＥＶ，グスタフソン（Gustafsson）ＪＫ，ホルメン・ラーソン（Holmen－Larsson）Ｊ，ジャバー（Jabbar）ＫＳ，シャ（Xia）Ｌ，シュー（Xu）Ｈ，ギシャン（Ghishan）ＦＫ，カルバーリョ（Carvalho）ＦＡ，ジュワーツ（Gewirtz）ＡＴ，フェーヴァル（Sjovall）Ｈ，ハンソン（Hansson）ＧＣ著，「ネズミ大腸炎モデル及び潰瘍性大腸炎を有する患者両方に於いて、細菌は正常では透過不可能な結腸の内側粘液層を透過する（Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis）」，ガット（Gut），２０１４年；第６３巻：ｐ．２８１－２９１
４７． リン（Lin）ＨＸ，リ（Li）Ｈ，チョウ（Cho）ＨＪ，ビアン（Bian）Ｓ，ロー（Roh）ＨＪ，リー（Lee）ＭＫ，キム（Kim）ＪＳ，チョン（Chung）ＳＪ，シム（Shim）ＣＫ，キム（Kim）ＤＤ著，「気道薬物輸送研究の為のインビトロモデルとしてのヒト気管支上皮細胞単層の気液界面（ＡＬＩ）培養（Air-liquid interface (ALI) culture of human bronchial epithelial cell monolayers as an in vitro model for airway drug transport studies）」，ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Journal of Pharmaceutical Sciences），２００７年；第９６巻：ｐ．３４１－３５０
４８． バーンスタム（Bernstam）ＬＩ，ヴォーン（Vaughan）ＦＬ，バーンスタイン（Bernstein）ＩＡ著，「気液界面に於いて成長したケラチノサイト（Keratinocytes grown at the air-liquid interface）」，インビトロ・セルラー＆デベロップメンタル・バイオロジー（In Vitro Cellular & Developmental Biology），１９８６年；第２２巻：ｐ．６９５－７０５
４９． オータニ（Ootani）Ａ，リ（Li）ＸＮ，サンジョルジ（Sangiorgi）Ｅ，ホー（Ho）ＱＴ，ウエノ（Ueno）Ｈ，トダ（Toda）Ｓ，スギハラ（Sugihara）Ｈ，フジモト（Fujimoto）Ｋ，ワイスマン（Weissman）ＩＬ，カペッキ（Capecchi）ＭＲ，クオ（Kuo）ＣＪ著，「Ｗｎｔ依存的な幹細胞ニッチ内に於ける持続的なインビトロ腸上皮培養（Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche）」，ネイチャー・メディシン（Nature Medicine），２００９年；第１５巻：ｐ．１－Ｕ１４０
５０． フォート（Voth）ＤＥ，バラード（Ballard）ＪＤ著，「クロストリジウム・ディフィシル毒素：疾患に於ける作用及び役割のメカニズム（Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease）」，クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Clinical microbiology reviews），２００５年；第１８巻：ｐ．２４７－２６３
５１． ヒー（He）Ｄ，ソウギオウルジス（Sougioultzis）Ｓ，ヘイゲン（Hagen）Ｓ，リウ（Liu）Ｊ，キーテス（Keates）Ｓ，キーテス（Keates）ＡＣ，ポゾウラキス（Pothoulakis）Ｃ，ラモント（LaMont）ＪＴ著，「クロストリジウム・ディフィシルＡ毒素はミトコンドリアの酸素ラジカル生成に依ってヒト結腸細胞ＩＬ－８放出を誘発する（Clostridium difficile toxin A triggers human colonocyte IL-8 release via mitochondrial oxygen radical generation）」，ガストロエンテロロジー（Gastroenterology），２００２年；第１２２巻：ｐ．１０４８－１０５７
５２． マヒダ（Mahida）ＹＲ，マハ（Makh）Ｓ，ハイド（Hyde）Ｓ，グレイ（Gray）Ｔ，ボレイロ（Borriello）ＳＰ著，「ヒト腸上皮細胞に対するクロストリジウム・ディフィシルＡ毒素の効果：細胞剥離後のインターロイキン８産生及びアポトーシスの誘導（Effect of Clostridium difficile toxin A on human intestinal epithelial cells: induction of interleukin 8 production and apoptosis after cell detachment）」，ガット（Gut），１９９６年；第３８巻：ｐ．３３７－３４７
５３． ハラー（Haller）Ｄ，ボーデ（Bode）Ｃ，ハメス（Hammes）ＷＰ，ファイファー（Pfeifer）ＡＭＡ，シフリン（Schiffrin）ＥＪ，ブルム（Blum）Ｓ著，「非病原性細菌は腸上皮細胞／白血球共培養に依る差別的サイトカイン応答を誘起する（Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures）」，ガット（Gut），２０００年；第４７巻：ｐ．７９－８７
５４． パーレサック（Parlesak）Ａ，ハラー（Haller）Ｄ，ブリンツ（Brinz）Ｓ，バウアーライン（Baeuerlein）Ａ，ボーデ（Bode）Ｃ著，「単核白血球及び非病原性細菌との区画化共培養モデルに於ける分化ＣＡＣＯ－２細胞に依るサイトカイン放出の調節（Modulation of Cytokine Release by Differentiated CACO-2 Cells in a Compartmentalized Coculture Model with Mononuclear Leucocytes and Nonpathogenic Bacteria）」，スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Scandinavian Journal of Immunology），２００４年；第６０巻：ｐ．４７７－４８５
〔付記１〕
方法が：
細胞支持体構造の上側表面の少なくとも或る部分が幹細胞に依って被覆される迄、上側表面及び下側表面両方を有する細胞支持体構造の上側表面上の粘液産生細胞に分化する事が出来る幹細胞を培養する事と；
幹細胞を更に培養して、粘液産生細胞を含む細胞単層を生じ、細胞単層が基底側及び内腔側を有する事と、
を含み、
細胞単層の粘液産生細胞が、細胞単層の内腔側に粘液層を確立し、其れに依って、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる、
粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクトを生ずる方法。
〔付記２〕
粘液層が微小物体にとって実質的に透過不可能である、付記１に記載の方法。
〔付記３〕
粘液層の厚さが約１ミクロンから約１ｃｍである、付記１に記載の方法。
〔付記４〕
粘液層の厚さが約３０ミクロンから約１ｃｍである、付記３に記載の方法。
〔付記５〕
基底リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の基底側の下方に存在し、内腔リザーバが粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側の上方に存在し、基底リザーバ及び内腔リザーバは其々が液体培地を含み；
方法が：更に、
内腔リザーバ内の液体培地を取り除いて、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に気液界面を生ずる事；及び／又は
内腔リザーバ内の液体培地の体積を、細胞単層の内腔側の上方に於いて、約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲の深さに調整する事、
を含む、
付記１に記載の方法。
〔付記６〕
更に、粘液産生細胞を含む細胞単層の内腔側に又は其の上方に、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアを配置する事を含む、付記１～５の何れか１項に記載の方法。
〔付記７〕
不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアが、粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は細胞単層の粘液産生細胞に依って生ずる粘液層の内腔側と直接的接触をしている、付記６に記載の方法。
〔付記８〕
液体培地が、不透過性の物理的バリア及び／又は部分的に透過性の物理的バリアと、粘液産生細胞を含む細胞単層及び／又は粘液層の内腔側との間にあり、液体培地の深さが約０．００１ｍｍから約１０ｍｍ、任意に約０．００１ｍｍから約１ｍｍの範囲である、付記６に記載の方法。
〔付記９〕
液体培地がホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液を含む（ホルモン、化学的添加剤、食品添加剤、細菌代謝物、及び／又は高張塩溶液）、付記５に記載の方法。
〔付記１０〕
幹細胞が、上皮幹細胞、腸上皮幹細胞、基底幹細胞、人工多能性幹細胞、呼吸器幹細胞、胃幹細胞、鼻腔幹細胞、生殖器官細胞（子宮頸部、膣、子宮）、尿道細胞、嗅覚細胞、口腔細胞、舌細胞、及び／又は結膜細胞である、付記１～５の何れか１項に記載の方法。
〔付記１１〕
幹細胞が腸上皮幹細胞である、付記１に記載の方法。
〔付記１２〕
粘液層が、約１から約１００ミクロンのサイズ範囲のビーズ又は微生物にとって実質的に透過不可能である、付記１に記載の方法。
〔付記１３〕
力が細胞単層の表面に平行して適用される、付記１～１２の何れか１項に記載の方法。
〔付記１４〕
力が表面張力の力の適用又は機械的な力の適用を含む、付記１３に記載の方法。
〔付記１５〕
機械的な力が、攪拌子、細胞表面に平行して動く半固体材料、及び／又は細胞表面の上側に於けるスラリーの循環である、付記１４に記載の方法。
〔付記１６〕
付記１～１５の何れか１項に記載の方法に依って生ずる、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
〔付記１７〕
粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、付記１６に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記１８〕
粘液層が微小物体（micro－objective）にとって実質的に透過不可能である、粘液産生細胞を含む細胞単層と粘液層とを含む生細胞コンストラクト。
〔付記１９〕
粘液層が約１ミクロンから約１ｃｍの厚さを含む、付記１８に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記２０〕
粘液層が約１ミクロンから約１００ミクロンのサイズ範囲の微小物体にとって透過不可能である、付記１８に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記２１〕
粘液層が基底側及び内腔側を含み、基底側が粘液産生細胞に隣接し且つ下方である、付記１８に記載の生細胞コンストラクト。
〔付記２２〕
方法が：
付記１６に記載の生細胞コンストラクトの粘液層の内腔側を生物、薬物、又は粒子と接触させる事と；
生物、薬物、又は粒子が粘液層中へと動く距離を測定し、其れに依って、生細胞コンストラクトの細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する事と、
を含む、
細胞単層の粘液層を横断する生物、薬物、又は粒子の能力を決定する方法。
〔付記２３〕
生物が細菌、ウイルス、真菌、原虫、及び／又は蠕虫である、付記２２に記載の方法。
【外国語明細書】