特開 2024-113102 組換えウイルス粒子の特徴付けのための分析超遠心分離法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024113102

(43)【公開日】2024-08-21

(54)【発明の名称】組換えウイルス粒子の特徴付けのための分析超遠心分離法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/70 20060101AFI20240814BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/70

【審査請求】有

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024091914

(22)【出願日】2024-06-06

(62)【分割の表示】P 2022065460の分割

【原出願日】2016-01-19

(31)【優先権主張番号】62/105,714

(32)【優先日】2015-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン・アール・オリオーダン

(72)【発明者】

【氏名】ブレンダ・バーナム

(57)【要約】      （修正有）

【課題】製造の均一性、純度および整合性に関して薬物製品品質をモニターするための、組換えウイルス粒子の調製物を特徴付ける方法を提供する。
【解決手段】組換えウイルス粒子の調製物を特徴付ける方法であって、ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、およびｃ）Ｃ（ｓ）分布での各ピーク下面積を積分して、各ピークの相対濃度を決定する工程であって、各ピークが組換えウイルスの組換えウイルス粒子の種に相当する工程を含む、前記方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えウイルス粒子の調製物を特徴付ける方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、および
ｃ）Ｃ（ｓ）分布での各ピーク下面積を積分して、各ピークの相対濃度を決定する工程であって、各ピークが組換えウイルスの組換えウイルス粒子の種に相当する工程
を含む、前記方法。

【請求項2】

組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子のベクターゲノムの完全性を評価する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、および
ｃ）Ｓ値に対応するプロット上のピークの存在によって該調製物中の組換えウイルス粒子の種を同定する工程であって、組換えウイルスの組換えウイルス粒子の具体的な種のゲノムサイズは、該種のＳ値を、周知のヌクレオチドサイズを有するカプシド化されたウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子のＳ値によって作成された標準曲線と比較することによって算出される工程
を含む、前記方法。

【請求項3】

Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルスの組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシドまたは変種のサイズの組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の存在を決定するための方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ならびに
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全カプシド粒子に対するピーク以外の１つまたはそれ以上のピークの存在は、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子および／または空のカプシドの存在を表す工程
を含む、前記方法。

【請求項5】

組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシド相対量を測定する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、
ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、および
ｄ）空のカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程
を含む、前記方法。

【請求項6】

組換えウイルス粒子の調製物中の変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子また
は空のウイルスカプシド粒子の相対量を測定する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、
ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、
ｄ）インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応しないＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程
を含む、前記方法。

【請求項7】

組換えウイルス粒子の調製物中の変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の相対量を測定する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、
ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、
ｄ）インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子または空のカプシド粒子に対応しないＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程
を含む、前記方法。

【請求項8】

組換えウイルス粒子の調製物中のインタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量を測定する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、
ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、
ｄ）インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、空のカプシド粒子、変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量、および／または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程
を含む、前記方法。

【請求項9】

組換えウイルス粒子の調製物の精製の際に、空のカプシドおよび／または、変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の除去をモニターする方法であって、精製工程における１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、ならびに請求項５～８のいずれか１項に記載の方法により、空のカプシドおよび／または変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の相対量についてサンプルを分析することを含み、空のカプシドおよび／または変種のゲノムを含むカプシドの完全カプシドに対する相対量における減少は、組換えウイルス粒子の調製物からの空のカプシドの除去を示す方法。

【請求項10】

空のカプシド粒子のＳ値に対応するピークの存在は、空のカプシド粒子の存在を示す、
請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全カプシド粒子または空のカプシド粒子に対するピーク以外の１つまたはそれ以上のピークの存在は、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子の存在を表す、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子は、切断型ゲノム、凝集体、組換え体および／またはＤＮＡ不純物を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の不均一性を決定する方法であって、
ａ）該調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、
ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、インタクトなウイルスゲノムを含むカプシドに相当するピークに追加してピークが存在することは、調製物中の組換え粒子の不均一性を示す工程
を含む、前記方法。

【請求項14】

追加のピークの存在は、空のカプシド粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子の存在を示す、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

変種のゲノムは、切断型ウイルスゲノム、凝集体、組換え体および／またはＤＮＡ不純物である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程をさらに含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

組換えウイルス粒子の調製物の精製の際に組換えウイルス粒子の均一性をモニターする方法であって、精製工程における１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、ならびに請求項１６に記載の方法により、組換えウイルス粒子の不均一性を決定することを含み、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量における増加は、組換えウイルス粒子の調製物中の全ウイルス粒子の均一性の増大を示す、前記方法。

【請求項18】

組換えウイルス粒子の沈降は吸光度によってモニターされる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

吸光度は約２３０ｎｍ、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおけるものである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

吸光度は約２６０ｎｍにおけるものである、請求項１８または１９に記載の方法。

【請求項21】

組換えウイルス粒子の沈降は干渉によってモニターされる、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

干渉はレイリー干渉である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

調製物は水溶液である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

水溶液は医薬製剤を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

水溶液は緩衝液を含む、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項26】

緩衝液は生理学的ｐＨを有する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

緩衝液は生理学的浸透圧を有する、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

医薬製剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

ＰＢＳは、約７．２のｐＨおよび約３００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

モニターすることは、参照サンプルとの比較をさらに含み、参照サンプルは組換えウイルス粒子を含まない水溶液を含む、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

Ｃ（Ｓ）値はラム方程式解を含むアルゴリズムによって決定される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

アルゴリズムはＳＥＤＦＩＴアルゴリズムである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

沈降は、最低密度を有する組換えウイルス粒子が超遠心機のセクターの底に沈降するまでモニターされる、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

超遠心分離法は超遠心速度セルを含む超遠心機を利用する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

沈降は組換えウイルス粒子が超遠心速度セルの底に沈降するまでモニターされる、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

沈降は最低密度を有する組換えウイルス粒子が沈降し、光学ウインドウが透明化するまでモニターされる、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

少なくとも３０スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

約３０スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

約３０から約７５スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

約３０から約５０スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される、請求項３７に記載の方法。

【請求項41】

約５０から約７５スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される、請求項３７に記載の方法。

【請求項42】

正則化は、少なくとも約０．６８のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される、請求項３１～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

正則化は二次微分正則化である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

正則化は最大エントロピー正則化である、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

正則化は約０．６８から約０．９０のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

正則化は約０．６８から約０．９９のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

正則化は約０．６８のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

以下のＣ（Ｓ）パラメーターは一定に保たれ：分解能は約２００Ｓから約５０００Ｓであり、Ｓｍｉｎは約１Ｓから約１００Ｓであり、Ｓｍａｘは約１００Ｓから約５０００Ｓであり、摩擦比は約１．０であり、または遠心分離ソフトウェアによって決定された値に移行させる、請求項３１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

分解能は約２００Ｓから約１０００Ｓである、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

分解能は約２００Ｓである、請求項４８または４９に記載の方法。

【請求項51】

Ｓｍｉｎは約１である、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

Ｓｍａｘは約１００Ｓから約１０００Ｓである、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

Ｓｍａｘは約２００Ｓから約５０００Ｓである、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

Ｓｍａｘは約２００Ｓである、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

摩擦比は遠心分離ソフトウェアによって決定された値に移行される、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

摩擦比は約１．０である、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

半径方向不変（ＲＩ）および時不変（ＴＩ）ノイズサブトラクションが適用される、請求項３１～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

組換えウイルス粒子の沈降は約１０～６０秒間ごとにモニターされる、請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

組換えウイルス粒子の沈降は約１０秒間ごとにモニターされる、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

組換えウイルス粒子の沈降は約６０秒間ごとにモニターされる、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

境界沈降速度は約３，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍで実行される、請求項１～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

境界沈降速度は約３，０００ｒｐｍから約１０，０００ｒｐｍで実行される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

境界沈降速度は約１０，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍで実行される、請求項６１に記載の方法。

【請求項64】

境界沈降速度は約１５，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍで実行される、請求項６１に記載の方法。

【請求項65】

境界沈降速度は約４℃から約２０℃で実行される、請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

境界沈降速度は約４℃で実行される、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

組換えウイルス粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、組換えアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルス粒子または組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子である、請求項１～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法を含む組換えウイルス粒子の産生のための工程を評価する方法であって、空のカプシド粒子の相対量と比較したインタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子、および／または組換えウイルス粒子の参照調製物と比較した変種の組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルスカプシド粒子の相対量における増大が、組換えウイルス粒子の産生の改善を示す、前記方法。

【請求項69】

ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

ｒＡＡＶ粒子は産生細胞株から産生される、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

ｒＡＡＶ粒子は、ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ｉｉ）ｒＡＡＶベクター配列、ならびにｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー機能をコードする核酸の三重トランスフェクションによって産生される、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

組換えウイルス粒子はＡＡＶ／ＨＳＶハイブリッドによって産生される、請求項６９に記載の方法。

【請求項73】

組換えウイルス粒子は昆虫細胞から産生される、請求項６９に記載の方法。

【請求項74】

組換えウイルス粒子は、ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される、請求項６９に記載の方法。

【請求項75】

組換えウイルス粒子は、ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする１つまたはそれ以上の核酸の好適な宿主細胞への導入によって産生され、１つまたはそれ以上の核酸は組換えヘルパーウイルスを使用して細胞に導入される、請求項６９に記載の方法。

【請求項76】

組換えヘルパーウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはバキュロウ
イルスである、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

組換えウイルス粒子は、アデノウイルスベクター配列ならびにアデノウイルス複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される、請求項６８に記載の方法。

【請求項78】

組換えウイルス粒子は、レンチウイルスベクター配列ならびに／またはレンチウイルス複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される、請求項６８に記載の方法。

【請求項79】

組換えウイルス粒子は、ＨＳＶベクター配列ならびに／またはＨＳＶ複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される、請求項６８に記載の方法。

【請求項80】

空のカプシドが低減された組換えウイルス粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子を調製するための方法であって、
ａ）組換えウイルス産生のために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であり、細胞は、
ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを端に有する異種性導入遺伝子をコードする核酸、
ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域を含む核酸であり、変異導入されたｐ５プロモーターを含み、ｐ５プロモーターからのｒｅｐ発現は野生型ｐ５プロモーターと比較して低減されている核酸、ならびに
ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸
を含む工程；
ｂ）組換えウイルス粒子を放出するように宿主細胞を溶解する工程；
ｃ）宿主細胞によって産生された組換えウイルス粒子を単離する工程；ならびに
ｄ）空のカプシドおよび／または変種のゲノムを有する組換えウイルス粒子の存在について請求項１～７９のいずれか１項に記載の方法による分析超遠心分離法によって組換えウイルス粒子を分析する工程
を含む、前記方法。

【請求項81】

ｐ５プロモーターは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐコード領域の３’に位置付けられている、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

ＡＡＶヘルパーウイルス機能は、アデノウイルスＥ１Ａ機能、アデノウイルスＥ１Ｂ機能、アデノウイルスＥ２Ａ機能、アデノウイルスＶＡ機能およびアデノウイルスＥ４ ｏｒｆ６機能を含む、請求項８０または８１に記載の方法。

【請求項83】

組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の精製工程を使用して精製される、請求項１～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

組換えウイルス粒子は、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含む、請求項６７、６９～７６、８０～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

ｓｃＡＡＶゲノムの単量体形態またはｓｃＡＡＶゲノムの二量体形態を含む組換えウイルス粒子の存在を検出するために使用される、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カ
プシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシドまたはマウスＡＡＶカプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）を含む、請求項６７、６９～７６、８０～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲまたはマウスＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項６７、６９～７６、８０～８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

ＡＡＶカプシドは、チロシン変異またはヘパリン結合変異を含む、請求項８６または８７に記載の方法。

【請求項89】

組換えウイルス粒子は組換えアデノウイルス粒子である、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項90】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型由来のカプシドを含む、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２カプシドの変種またはアデノウイルス血清型５カプシドの変種を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

組換えウイルス粒子は組換えレンチウイルス粒子である、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項93】

組換えレンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変種で偽型化される、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

組換えウイルス粒子はｒＨＳＶ粒子である、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項95】

ＨＳＶ粒子はＨＳＶ－１粒子またはＨＳＶ－２粒子である、請求項９４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連特許の相互参照
本出願は、すべての目的についてその全体を参照によって本明細書に組み入れる米国仮特許出願第６２／１０５，７１４号、２０１５年１月２０日出願に優先権を主張する。

【0002】

発明の分野
本発明は、分析超遠心分離法を使用して組換えウイルスベクター；例えば組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）粒子、組換えレンチウイルス粒子および組換え単純ヘルペスウイルス（ｒＨＳＶ）粒子を特徴付ける方法に関する。

【背景技術】

【0003】

組換えウイルスは、遺伝子治療適用のための治療用核酸を送達するためのビヒクルとしての将来性および有用性を示している。多数の異なる組換えウイルスが、送達される核酸のサイズ、核酸を送達する標的細胞または組織、治療用核酸の短期または長期発現の必要性およびレシピエントのゲノムへの治療用核酸の組み込みを含む多数の因子に基づいてこれらの遺伝子治療適用において使用されている。遺伝子治療適用において使用されるウイルスの例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルスおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

臨床用の組換えウイルスベクターの生成は、製造の均一性、純度および整合性に関して薬物製品品質をモニターする分析方法を必要としているが、今日までにそのような特徴付けを支持する方法は確立されていない。典型的には、組換えウイルスＤＮＡウイルスベクターのＤＮＡ含有量は、配列特異的プローブを使用するサザンブロット分析によって測定される。ウイルスカプシドまたはエンベロープは、具体的な組換えウイルスのカプシドまたはエンベロープタンパク質に特異的に結合する抗体を使用するイムノアッセイによって特徴付けられる。例えば、Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｓら、（１９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：１４５３～１４６２頁は、ｒＡＡＶ血清型についてのイムノアッセイを提供している。必要とされているのは、組換えウイルスゲノムの核酸配列またはカプシドの血清型を問わない組換えウイルス調製物を特徴付けるための包括的なアッセイである。

【0005】

特許出願および刊行物を含む本明細書に引用するすべての参考文献は、その全体を参照によって組み入れる。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物の特徴付け方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、およびｃ）Ｃ（ｓ）分布での各ピーク下面積を積分して、各ピークの相対濃度を決定する工程であって、各ピークが組換えウイルスの組換えウイルス粒子の種に相当する工程を含む、組換えウイルス粒子の調製物の特徴付け方法を提供する。

【0007】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子のベク
ターゲノムの完全性を評価するための方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、およびｃ）Ｓ値に対応するプロット上のピークの存在によって調製物中の組換えウイルス粒子の種を同定する工程であって、組換えウイルスの組換えウイルス粒子の具体的な種のゲノムサイズは、種のＳ値を、周知のヌクレオチドサイズを有するカプシド化されたウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子のＳ値によって作成された標準曲線と比較することによって算出される工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では方法は、Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルスの組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程をさらに含む。

【0008】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシドまたは変種のサイズの組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の存在を決定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、およびｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全カプシド粒子に対するピーク以外の１つまたはそれ以上のピークの存在は、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子および／または空のカプシドの存在を表す工程を含む、方法を提供する。

【0009】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシドの相対量を測定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、およびｄ）空のカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程を含む、組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシドの相対量を測定する方法を提供する。

【0010】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子または空のウイルスカプシド粒子の相対量を測定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、ｄ）インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応しないＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程を含む、方法を提供する。

【0011】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の相対量を測定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、ｄ）インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子または空のカプシド粒子に対応しないＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程を含む、方法を提
供する。

【0012】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中のインタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量を測定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、ｄ）インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、空のカプシド粒子、変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量、および／または調製物中の組換えウイルス粒子の総量と比較する工程を含む、方法を提供する。

【0013】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物の精製の際に、空のカプシドおよび／または、変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の除去をモニターする方法であって、精製プロセスにおける１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、ならびに請求項５～８のいずれか１項に記載の方法により、空のカプシドおよび／または変種の組換えウイルスゲノムを含むカプシド粒子の相対量についてサンプルを分析することを含み、空のカプシドおよび／または、変種のゲノムを含むカプシドの完全カプシドに対する相対量における減少は、組換えウイルス粒子の調製物からの空のカプシドの除去を示す方法を提供する。一部の実施形態では、空のカプシド粒子のＳ値に対応するピークの存在は、空のカプシド粒子の存在を示す。一部の実施形態では、インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全カプシド粒子または空のカプシド粒子に対するピーク以外の１つまたはそれ以上のピークの存在は、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子の存在を表す。一部の実施形態では、変種のサイズのゲノムを含むカプシド粒子は、切断型ゲノム、凝集体、組換え体および／またはＤＮＡ不純物を含む。

【0014】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の不均一性を決定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、インタクトなウイルスゲノムを含むカプシドに相当するピークに追加してピークが存在することは、調製物中の組換え粒子の不均一性を示す工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では追加のピークの存在は、空のカプシド粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子の存在を示す。一部の実施形態では、変種のゲノムは、切断型ウイルスゲノム、凝集体、組換え体および／またはＤＮＡ不純物である。一部の実施形態では方法は、Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程をさらに含む。

【0015】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物の精製の際に組換えウイルス粒子の均一性をモニターする方法であって、精製プロセスにおける１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、ならびに上記方法により、組換えウイルス粒子の不均一性を決定することを含み、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量における増加は、組換えウイルス粒子の調製物中の全ウイルス粒子の均一性の増大を示す、方法を提供する。

【0016】

上記態様の一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、吸光度によってモニターされる。一部の実施形態では吸光度は、約２３０ｎｍ、２６０ｎｍまたは２８０ｎｍにおけるものである。一部の実施形態では吸光度は、約２６０ｎｍにおけるものである。一部
の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、干渉によってモニターされる。一部の実施形態では干渉は、レイリー干渉である。

【0017】

上記態様の一部の実施形態では調製物は水溶液である。さらなる実施形態では水溶液は、医薬製剤を含む。一部の実施形態では水溶液は緩衝液を含む。一部の実施形態では緩衝液は生理学的ｐＨを有する。一部の実施形態では緩衝液は生理学的浸透圧を有する。一部の実施形態では医薬製剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の実施形態ではＰＢＳは、７．２のｐＨおよび約３００ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。一部の実施形態ではモニターすることは、参照サンプルとの比較をさらに含み、参照サンプルは組換えウイルス粒子を含まない水溶液を含む。

【0018】

上記態様の一部の実施形態ではＣ（Ｓ）値は、ラム方程式解を含むアルゴリズムによって決定される。一部の実施形態ではアルゴリズムは、ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムである。一部の実施形態では、沈降は最低密度を有する組換えウイルス粒子が超遠心機のセクターの底に沈降するまでモニターされる；例えばセクターは、検出系を含む超遠心機の一部であってよい。一部の実施形態では超遠心分離法は、超遠心速度セルを含む超遠心機を利用する。一部の実施形態では沈降は、組換えウイルス粒子が超遠心速度セルの底に沈降するまでモニターされる。一部の実施形態では沈降は、最低密度を有する組換えウイルス粒子が沈降し、光学ウインドウが透明化するまでモニターされる。

【0019】

一部の実施形態では半径方向の濃度は、少なくとも約０．５時間、０．７５時間、１．０時間、１．５時間、２．０時間、３．０時間、４．０時間または５．０時間のいずれかについて記録される。一部の実施形態では半径方向の濃度は、約１．０時間記録される。一部の実施形態では半径方向の濃度は、約１．２時間記録される。一部の実施形態では半径方向の濃度は、約０．５時間から約２．０時間記録される。一部の実施形態では半径方向の濃度は、約１．０時間から約２．０時間記録される。

【0020】

上記態様の一部の実施形態では少なくとも３０スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される。一部の態様では約３０スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される。他の実施形態では約３０から約７５スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される。他の実施形態では、約３０から約５０スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される。他の実施形態では、約５０から約７５スキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される。

【0021】

上記態様の一部の実施形態では正則化は、少なくとも約０．６８のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される。一部の実施形態では正則化は二次微分正則化（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）である。一部の実施形態では正則化は最大エントロピー正則化（Ｍａｘ ｅｎｔｒｏｐｙ ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）である。一部の実施形態では正則化は約０．６８から約０．９０のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される。一部の実施形態では正則化は約０．６８から約０．９９のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される。一部の実施形態では正則化は約０．６８のＦ統計の信頼レベルでフィッティングレベルに適用される。

【0022】

上記態様の一部の実施形態では以下のＣ（Ｓ）パラメーターは一定に保たれ：分解能は約２００Ｓから約５０００Ｓであり、Ｓｍｉｎは約１Ｓから約１００Ｓであり、Ｓｍａｘは約１００Ｓから約５０００Ｓであり、摩擦比は約１．０であるか、または遠心分離ソフトウェアによって決定された値に移行させる。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓから約１０００Ｓである。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓである。一部の実施形態ではＳｍｉｎは、約１である。一部の実施形態ではＳｍａｘは、約１００Ｓから約１
０００Ｓである。他の実施形態ではＳｍａｘは、約２００Ｓから約５０００Ｓである。他の実施形態ではＳｍａｘは、約２００Ｓである。一部の実施形態では摩擦比は遠心分離ソフトウェアによって決定された値に移行させる。一部の実施形態では摩擦比は約１．０である。一部の実施形態では半径方向不変（ｒａｄｉａｌ ｉｎｖａｒｉａｎｔ）（ＲＩ）および時不変（ＴＩ）ノイズサブトラクションが適用される。

【0023】

上記態様の一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、約１０～６０秒間ごとにモニターされる。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、約１０秒間ごとにモニター（例えばスキャン）される。他の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、約６０秒間ごとにモニターされる。一部の実施形態では超遠心分離法の際の組換えウイルスの沈降速度は、約１５秒間、３０秒間、４５秒間、１分間（６０秒間）、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間を超えるごとに１回組換えウイルス粒子の沈降をモニターすることによって決定される。

【0024】

上記態様の一部の実施形態では境界沈降速度は、約３，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍで実行される。一部の実施形態では境界沈降速度は、約３，０００ｒｐｍから約１０，０００ｒｐｍで実行される。他の実施形態では境界沈降速度は、約１０，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍで実行される。他の実施形態では境界沈降速度は、約１５，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍで実行される。

【0025】

上記態様の一部の実施形態では境界沈降速度は、約４℃から約２０℃で実行される。一部の実施形態では境界沈降速度は、約４℃で実行される。

【0026】

上記態様の一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、組換えアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルス粒子または組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子である。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシドまたはマウスＡＡＶカプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルスウイルス１）を含む。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲまたはＡＡＶ１２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態ではＡＡＶカプシドは、チロシン変異またはヘパリン結合変異を含む。他の実施形態では組換えウイルス粒子は、組換えアデノウイルス粒子である。一部の実施形態では組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄまたはブタＡｄ３型由来のカプシドを含む。一部の実施形態では組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２カプシドの変種またはアデノウイルス血清型５カプシドの変種を含む。他の実施形態では組換えウイルス粒子は組換えレンチウイルス粒子である。一部の実施形態では組換えレンチ
ウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはその変種で偽型化される。他の実施形態では組換えウイルス粒子はｒＨＳＶ粒子である。一部の実施形態ではＨＳＶ粒子はＨＳＶ－１粒子またはＨＳＶ－２粒子である。

【0027】

一部の態様では本発明は、請求項１から６７のいずれか１項に記載の方法を含む組換えウイルス粒子の産生のための工程を評価するための方法であって、空のカプシド粒子の相対量と比較したインタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子、および／または組換えウイルス粒子の参照調製物と比較した変種の組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルスカプシド粒子の相対量における増大が、組換えウイルス粒子の産生の改善を示す、方法を提供する。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、組換えアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルス粒子または組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子である。一部の実施形態ではｒＡＡＶ粒子は、産生細胞株から産生される。他の実施形態ではｒＡＡＶ粒子は、ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ｉｉ）ｒＡＡＶベクター配列、およびｉｉｉ）アデノウイルスヘルパー機能をコードする核酸の三重トランスフェクションによって産生される。他の実施形態では組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ／ＨＳＶハイブリッドによって産生される。他の実施形態では組換えウイルス粒子は、バキュロウイルス細胞から産生される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする１つまたはそれ以上の核酸の好適な宿主細胞への導入によって産生され、１つまたはそれ以上の核酸は組換えヘルパーウイルスを使用して細胞に導入される。一部の実施形態では組換えヘルパーウイルスは、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスである。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含む。一部の実施形態では方法は、ｓｃＡＡＶゲノムの単量体形態またはｓｃＡＡＶゲノムの二量体形態を含む組換えウイルス粒子の存在を検出するために使用される。

【0028】

上記態様の一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、アデノウイルスベクター配列ならびにアデノウイルス複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される。他の実施形態では組換えウイルス粒子は、レンチウイルスベクター配列ならびに／またはレンチウイルス複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される。他の実施形態では、組換えウイルス粒子は、ＨＳＶベクター配列ならびに／またはＨＳＶ複製およびパッケージング配列をコードする核酸の好適な宿主細胞への一過性トランスフェクションによって産生される。

【0029】

一部の態様では本発明は、空のカプシドが低減された組換えウイルス粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子を調製するための方法であって、ａ）組換えウイルス産生のために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であり、細胞は、ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを端に有する異種性導入遺伝子をコードする核酸、ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域を含む核酸であり、ｐ５プロモーターを含む核酸、およびｉｉｉ）ＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸を含む工程；ｂ）組換えウイルス粒子を放出するように宿主細胞を溶解する工程；ｃ）宿主細胞によって産生された組換えウイルス粒子を単離する工程；ならびにｄ）空のカプシドおよび／または変種のゲノムを有する組換えウイルス粒子の存在について上記方法による分析超遠心分離法によって組換えウイルス粒子を分析する工程を含む、方法を提供する。一部の態様において本発明
は、空のカプシドが低減された組換えウイルス粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子を調製するための方法であって、ａ）組換えウイルス産生のために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であり、細胞は、ｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを端に有する異種性導入遺伝子をコードする核酸、ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域を含む核酸であり、変異導入されたｐ５プロモーターを含み、ｐ５プロモーターからのｒｅｐ発現は野生型ｐ５プロモーターと比較して低減されている核酸、およびｉｉｉ）ＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸を含む工程；ｂ）組換えウイルス粒子を放出するように宿主細胞を溶解する工程；ｃ）宿主細胞によって産生された組換えウイルス粒子を単離する工程；ならびにｄ）空のカプシドおよび／または変種のゲノムを有する組換えウイルス粒子の存在について上記方法による分析超遠心分離法によって組換えウイルス粒子を分析する工程を含む、空のカプシドが低減された組換えウイルス粒子および／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子を調製するための方法を提供する。一部の実施形態では、ｐ５プロモーターは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐコード領域の３’に位置付けられている。一部の実施形態ではＡＡＶヘルパーウイルス機能は、アデノウイルスＥ１Ａ機能、アデノウイルスＥ１Ｂ機能、アデノウイルスＥ２Ａ機能、アデノウイルスＶＡ機能およびアデノウイルスＥ４ ｏｒｆ６機能を含む。

【0030】

先行する実施形態のいずれかの一部の実施形態では、組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の精製工程を使用して精製される。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1A】分析超遠心分離法（ＡＵＣ）が組換えウイルスベクター粒子を特徴付けるために使用できることを示す図である。（図１Ａ）１．２時間の時間間隔（Ｔ）でのＡＡＶ２混合物の吸光度（２６０ｎｍ）を半径（ｃｍ）に対して示す境界沈降速度の代表的スキャンプロファイル。ＡＡＶ２混合物は、空のカプシド（「空のＣａｐ」）および全ゲノムカプシド（「インタクトなベクター」）を含有していた。

【図1B】分析超遠心分離法（ＡＵＣ）が組換えウイルスベクター粒子を特徴付けるために使用できることを示す図である。（図１Ｂ）空のカプシドおよび全ゲノムカプシドの濃度を８０％／２０％混合物から測定するためにＡＵＣを使用できることを示す沈降係数（スベドベルグ単位、Ｓ）に対する検出単位、Ｃ（Ｓ）での濃度のプロット。各ピークに粒子種ならびにその対応する沈降係数（Ｓ）および相対存在（％）が示されている。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、空のＡＡＶ２カプシド（図２Ａ）およびゲノム含有ＡＡＶ２－導入遺伝子１カプシド（図２Ｂ）の純粋集団のＡＵＣを示すグラフである。各ピークにカプシド種およびその沈降係数（Ｓ）が示されている。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、ＡＵＣによる干渉と吸光度検出法との比較を示すグラフである。（図３Ａ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、空のカプシドおよびゲノム含有カプシドの１：１混合物について、干渉光学検出を使用して作成された沈降係数の分布を示す。各種についての沈降係数および相対存在（％）が示されている。（図３Ｂ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、空のカプシドおよびゲノム含有カプシドの１：１混合物について、吸光度光学検出（２６０ｎｍ）を使用して作成された沈降係数の分布を示す。各種についての沈降係数および相対存在（％）が示されている。

【図4】ＡＡＶベクター産生のための三重トランスフェクション法を例示する図である。目的の遺伝子（「ｐＶｅｃｔｏｒ」）ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子（「ｐＨＬＰ」）ならびにアデノウイルス構成成分（「ｐＩＡｄｅｎｏ」）を含有する３種のベクターが示されている。ゲノム含有（図において「ＩＴＲ導入遺伝子ＩＴＲ」と示される）および空のカプシド（空欄）の両方が産生されることに注目されたい。

【図5】ＡＡＶベクター産生のための産生細胞株法を例示する図である。表示のとおりＨｅＬａ Ｓ３細胞株は、組み込まれたＲｅｐ、Ｃａｐおよびピューロマイシン耐性遺伝子を、目的のＩＴＲ隣接導入遺伝子とともに含有する。この細胞株に組換えウイルス産生を刺激するためにアデノウイルス（「Ａｄ５」）を感染させる。アデノウイルス粒子に加えてゲノム含有（「組換えウイルスベクター」と示される）および空のカプシドの両方が産生されることに注目されたい。

【図6】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、産生細胞株および三重トランスフェクション法によるベクター産生は、ＡＵＣ分析によって明らかなとおり異なるベクター調製物を生じることを示す図である。（図６Ａ）ＡＡＶ２－導入遺伝子２ベクターおよびその３．４ｋｂゲノムの模式図。（図６Ｂ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、産生細胞株法によるベクター調製物についての沈降係数の分布を示す。各種について沈降係数および相対存在（％）が示されている。（図６Ｃ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、三重トランスフェクション法によって産生されたベクター調製物についての沈降係数の分布を示す。各種についての沈降係数および相対存在（％）が示されている。

【図7-1】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、ＡＵＣ法がベクター精製の品質および有効性をモニターするために使用できることを示すグラフである。（図７Ａ）アニオン交換クロマトグラフィーを使用する空のカプシドからの全ゲノムＡＡＶ２－導入遺伝子１カプシドの精製を示すプロットである。各種に対応するピークフラクションが示されている。（図７Ｂ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、アニオン交換カラムから溶出後のベクター調製物についての沈降係数の分布を示す。各種についての沈降係数および相対存在（％）が示されている。（図７Ｃ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、クロマトグラフィー前のベクター調製物についての沈降係数の分布を示す。各種についての沈降係数および相対存在（％）が示されている。

【図7-2】図７－１の続き。

【図8】沈降係数とベクターゲノムサイズとの間の直線関係を示すグラフである。ゲノムサイズに対して沈降係数（Ｓ）をプロットする標準曲線が最良適合直線、その式およびその相関Ｒ^２値と共に示されている。

【図9-1】図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、ＡＵＣデータを使用するカプシドゲノムサイズの評価がサザンブロットによるゲノムサイズの評価と相関することを示す図である。（図９Ａ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、ｓｃＡＡＶ９ ＥＧＦＰベクター調製物についての沈降係数の分布を示す。１本鎖単量体（８２Ｓ）および２本鎖二量体（１０１Ｓ）種は対応する沈降係数および相対存在量値（％）で示されている。ベクターの模式的図も提供されている。（図９Ｂ）ｓｃＡＡＶ９ ＥＧＦＰ（レーン１）および１本鎖ＡＡＶ９ ＥＧＦＰ（レーン２）ベクターカプシド由来のＤＮＡのアルカリサザンブロット分析。対応するバンドをブロット凡例に記載のとおり示す。４．２および２．４ｋｂサイズ標準物は標識として提供される。（図９Ｃ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、１本鎖ＡＡＶ９ ＥＧＦＰベクター調製物についての沈降係数の分布を示す。８２Ｓおよび９９Ｓ（全ゲノム）ピークは対応する沈降係数および相対存在量値（％）で示されている。

【図9-2】図９－１の続き。

【図10】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、Ｒｅｐ／Ｃａｐプロモーター位置が三重トランスフェクション法によって産生された組換えウイルスベクターでのゲノムパッケージングに影響を与えることを示す図である。（図１０Ａ）二量体および単量体ゲノム種についての推定沈降係数を伴う自己相補性ｓｃＡＡＶ２ ＥＧＦＰベクターの模式図である。（図１０Ｂ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、Ｒｅｐ７８／６発現を駆動する内在性ｐ５プロモーター（「ＷＴ Ｒｅｐ」）を有する「野生型」ヘルパープラスミドを使用して産生されたｓｃＡＡＶ２ ＥＧＦＰベクター調製物についての沈降係数の分布を示す。１本鎖単量体（８０Ｓ）および２本鎖二量体（１００Ｓ）種についてのピークは対応する相対存在量値（％）で示されている。（図１０Ｃ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、ｃａｐ２配列（「ｐＨＬＰ Ｒｅｐ」）の下流に移動したＲｅｐ７８／６８発現を駆動するｐ５プロモーターを有する「野生型」ヘルパープラスミドを使用して産生されたｓｃＡＡＶ２ ＥＧＦＰベクター調製物についての沈降係数の分布をもたらした。１本鎖単量体（８２Ｓ）および２本鎖二量体（１００Ｓ）種についてのピークは対応する相対存在量値（％）で示されている。

【図11】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄは、Ｒｅｐ／Ｃａｐプロモーター位置が２個の追加のＡＡＶベクターでのゲノムパッケージングに影響を与えることを示す図である。（図１１Ａおよび１１Ｂ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、内在性ｐ５プロモーター（「ＷＴ Ｒｅｐ」図１１Ｂ）またはｃａｐ５配列の下流にｐ５プロモーター（「ｐＨＬＰ Ｒｅｐ」図１１Ａ）を有するヘルパープラスミドで産生されたｃａｐ５配列を含有する１本鎖ＡＡＶ５第ＩＸ因子ベクター（ＡＡＶ５ ｈＦＩＸ１６）についての沈降係数の分布を示す。（図１１Ｃ～１１Ｄ）スベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値、ｃ（ｓ）のプロットは、内在性ｐ５プロモーター（「ＷＴ Ｒｅｐ」図１１Ｄ）またはｃａｐ５配列の下流にｐ５プロモーター（「ｐＨＬＰ Ｒｅｐ」図１１Ｃ）を有するヘルパープラスミドで産生されたｃａｐ５配列を含有する１本鎖ＡＡＶ５ｈＳＭＮベクター（ＡＡＶ５ＳＭＮ）についての沈降係数の分布を示す。

【図12】図１２Ａおよび１２Ｂは、サザンブロット分析はＡＵＣ分析と相関するが、ＡＵＣによって検出可能な一部の断片化ゲノムを見逃すことを明らかにした図である。（図１２Ａ）ｐＨＬＰヘルパープラスミド（レーン２）またはＷＴ Ｒｅｐプラスミド（レーン１）で作られたＡＡＶ５ＳＭＮ調製物由来のベクターＤＮＡのサザンブロット分析。４．６および２．４ｋｂサイズ標準物は、標識として提供される。（図１２Ｂ）ｐＨＬＰヘルパープラスミド（レーン１）またはＷＴ Ｒｅｐプラスミド（レーン２）で作られたＡＡＶ５ＦＩＸ調製物由来のベクターＤＮＡのサザンブロット分析。４．３、３．０および１．９ｋｂサイズ標準物は標識として提供される。

【図13】他の特性と共にｈＦＩＸ導入遺伝子、ＩＴＲ、Ｒｅｐ開始点およびＡｍｐＲマーカー遺伝子の位置を示すＡＡＶ５第ＩＸ因子ベクターのマップを示す図である。ＡｍｐＲマーカーがＩＴＲ、エンハンサーおよびプロモーター領域の上流にあることに注目されたい。

【図14】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＷＴ Ｒｅｐベクターゲノムは、ｐＨＬＰ Ｒｅｐベクターゲノムとは異なり、ＡＡＶ５第ＩＸ因子ベクター中の５’ＩＴＲの上流に配列をパッケージすることを示す図である。（図１４Ａ）ｐＨＬＰ Ｒｅｐ（レーン１）とＷＴ Ｒｅｐ（レ－ン２）ベクターゲノムとを比較するｈＦＩＸ導入遺伝子特異的プローブを使用するサザンブロット分析。（図１４Ｂ）ｐＨＬＰ Ｒｅｐ（レーン１）とＷＴ Ｒｅｐ（レーン２）ベクターゲノムとを比較するＲｅｐ ｏｒｉ／ＡｍｐＲ特異的プローブを使用するサザンブロット分析。

【図15】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＡＵＣ分析によって実証された大型のＡＡＶベクターゲノムの断片化を示す図である。（図１５Ａ）大型のゲノムを有するＡＡＶベクターについてＡＵＣによって作成された沈降係数（Ｓ）に対する濃度、Ｃ（Ｓ）のプロット。このゲノムは、β－リン酸ジエステラーゼの発現を駆動する全長ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含有している（ｓｓＡＡＶ２／５ＣＢＡ－βＰＤＥ）。検出された種についてのピークは、観察された沈降係数（Ｓ）および相対存在量値（％）によって示されている。（図１５Ｂ）切断型ゲノムを含むＡＡＶベクターについてＡＵＣによって作成された沈降係数（Ｓ）に対する濃度、Ｃ（Ｓ）のプロット。このゲノムは、β－リン酸ジエステラーゼの発現を駆動する低減されたサイズのイントロンを有するＣＢＡプロモーターを含有している（ＡＡＶ５ ｍｉｎＣＢＡＰＤＥ６Ｂ）。検出された種についてのピークは、観察された沈降係数（Ｓ）および相対存在量値（％）によって示されている。

【図16】アデノウイルスカプシドの純粋調製物のＡＵＣプロファイルを示す図である。沈降係数（Ｓ）および干渉値は各ピークに与えられている。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本発明は、分析超遠心分離法を使用して．ウイルス粒子の調製物を特徴付ける方法を提供する。調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法（ＡＵＣ）に供することによって、ウイルス粒子の沈降は、時間間隔で（例えば、１回またはそれ以上）モニターされる。次にスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対する微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））は、プロットされ、Ｃ（Ｓ）分布での各ピーク下面積は積分され、各ピークの相対濃度が決定される。各ピークは、その分子量を反映したウイルス粒子の種に相当する。これらの方法によって検出できる種は、これらに限らないが組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）粒子、組換えレンチウイルス粒子および組換え単純ヘルペスウイルス（ｒＨＳＶ）粒子を含む。例示的例としてｒＡＡＶ粒子を使用してこれらの方法は、インタクトなｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶカプシド粒子（例えば完全カプシド）、ｒＡＡＶゲノムがウイルスカプシドにカプシド化されていない空のウイルスカプシドおよび、変種ｒＡＡＶゲノムがウイルスカプシドにカプシド化されているｒＡＡＶ粒子変種（例えばＡＡＶカプシド化ＤＮＡ不純物、切断型ウイルスゲノム、凝集体などを含有する粒子）を含むｒＡＡＶ種の検出を可能にする。これらの方法は、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列、組換えウイルス粒子の場合は組換えウイルスカプシドの血清型に関わらずウイルス粒子の調製に適用できる。これらの方法は、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、組換えレンチウイルスおよびｒＨＳＶウイルス粒子に適用できる。

【0033】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子のベクターゲノムの完全性を、調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供することによって評価する方法であって、組換えウイルス粒子の沈降は時間間隔で（例えば、１回またはそれ以上）モニターされる方法を提供する。微分沈降係数分布値Ｃ（Ｓ）をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットすることによって調製物中の組換えウイルス粒子の種は、Ｓ値に対応するプロット上のピークの存在によって同定できる。組換えウイルス粒子の具体的な種のゲノムサイズは、例えば種のＳ値を、さまざまな周知のサイズを有するカプシド化されたウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子のＳ値によって作成された標準曲線と比較することによって算出できる。これらの方法によって評価できるベクターゲノムは、これらに限らないがインタクトな組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルスカプシド粒子（例えば完全カプシド）、組換えウイルスゲノムがウイルスカプシドにカプシド化されていない空のウイルスカプシド、および変種の組換えウイルスゲノム（例えばＡＡＶカプシド化ＤＮＡ不純物、切断型ウイルスゲノム、凝集体などを含有する粒子）がウイルスカプシドにカプシド化された組換えウイルス粒子変種を含む。一部の実施形態ではウイルス粒子は、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、組換えレンチウイルスまたはｒＨＳＶウイルス粒子である。

【0034】

一部の実施形態では本発明は、境界沈降速度条件下でのＡＵＣによって組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の不均一性を決定する方法であって、Ｃ（Ｓ）対Ｓのプロットにおけるインタクトなウイルスゲノムを含むカプシドに相当するピークに追加してピークが存在することは、調製物中の組換えウイルス粒子の不均一性を示す方法を提供する。一部の実施形態では調製物中の各組換えウイルス種の相対量は、プロット中の各ピークの面積を積分することによって算出される。

【0035】

本発明の一部の実施形態ではＡＵＣは、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物中の空のカプシドおよび／または組換えウイルス粒子変種の存在を決定するために使用され、Ｃ（Ｓ）対Ｓのプロットにおいて空のカプシド粒子および／または組換えウイルス粒子変種のＳ値に対応するピークの存在は、空のカプシド粒子および／または組換えウイルス粒子変種の存在を示す。一部の実施
形態では、組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシドおよび／または組換えウイルス粒子変種の相対量は、Ｓに対するＣ（Ｓ）のプロットにおける各ピーク下面積を積分することならびに空のカプシド粒子および／または組換えウイルス粒子変種に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量と比較することによって決定される。一部の実施形態では、空のカプシド粒子および／または組換えウイルス粒子変種に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量は、プロットのすべてのピーク下面積を積分および合計することによって調製物中のすべての組換えウイルス粒子の量と比較される。

【0036】

一部の実施形態では本発明は、ＡＵＣを使用することによって組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物の精製の際の空のカプシドおよび／または組換えウイルス粒子変種の除去をモニターする方法を提供する。精製プロセスの１つまたはそれ以上の工程後の調製物由来の組換えウイルス粒子サンプルは、空のカプシドおよび／または組換えウイルス粒子変種の相対量について分析され、完全カプシド粒子に対する空のカプシドおよび／または組換えウイルス粒子変種の相対量の減少は、組換えウイルス粒子の調製物からの空のカプシドおよび／または組換えウイルス粒子変種の除去を示す。

【0037】

一部の実施形態では本発明は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の産生についてＡＵＣによってプロセスを評価する方法を提供する。組換えウイルス粒子の調製物は、インタクトな全ウイルスカプシド粒子、空の粒子および／または組換えウイルス粒子変種の存在について分析される。空のカプシド粒子の相対量と比較したインタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量および／または組換えウイルス粒子（例えば、標準組換えウイルス調製プロセス）の参照調製物と比較した組換えウイルス粒子変種（例えば、ＡＡＶカプシド化ＤＮＡ不純物、切断型ウイルスゲノム、凝集体などを含有する粒子）における増大は、組換えウイルス粒子の産生の改善を示す。

【0038】

Ｉ．一般的技術
例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，第６版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９３－８）；Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，２０１１）に記載の広く利用される方法など本明細書に記載および参照する技術および手順は、一般に十分に理解され、当業者によって従来の方法を使用して一般に用いられている。

【0039】

ＩＩ．定義
本明細書において使用される「ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。

【0040】

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボ核酸のいずれかのヌクレオチドのポリマー形態を指す。それによりこの用語は、これらに限らないが、１本、２本もしくは多本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドもしくはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他に天然で、化学的にもしくは生化学に修飾された、非天然もしくは誘導ヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的にはＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて見出されるとおり）または修飾されたもしくは置換された糖もしくはリン酸基を含む。代替的にポリヌクレオチドの骨格はホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含む場合があり、それによりオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ_２）または混合ホスホロアミデート－リン酸ジエステルオリゴマーであってよい。付加的に２本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングすることによってまたは、ＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマーと共に使用して原位置で相補鎖を合成することによってのいずれかで化学合成１本鎖ポリヌクレオチド産生物から得られる。

【0041】

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指して互換的に用いられ、最短の長さに限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然またはアミノ酸残基を含有でき、これらに限らないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および多量体を含むことができる。全長タンパク質およびその断片の両方は、定義に包含される。用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに本発明の目的のために「ポリペプチド」は、タンパク質が望ましい活性を維持している限り天然配列への欠失、付加および置換（一般に性質において保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これら
の修飾は、部位特異的変異導入を通じて意図的であってよく、またはタンパク質を産生する宿主の変異を通じてまたはＰＣＲ増幅による誤りなどの偶然であってよい。

【0042】

「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、ウイルス由来ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸は少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を端に有する。一部の実施形態では組換え核酸は、２個の末端逆位配列（ＩＴＲ）を端に有する。

【0043】

「組換えＡＡＶベクター（組換えアデノ随伴ウイルスベクター）」は、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）を端に有する１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、ＡＡＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態では組換え核酸は、２個の末端逆位配列（ＩＴＲ）を端に有する。そのような組換えウイルスベクターは、好適なヘルパーウイルスを感染させ（または好適なヘルパー機能を発現しており）、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産生物（すなわちＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子中に複製およびパッケージングされる。組換えウイルスベクターが大きなポリヌクレオチド（例えば染色体またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドなどの別のベクター中）に組み込まれる場合、組換えウイルスベクターは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下で複製およびカプシド化によって「レスキュー」される「プロベクター」と称される場合がある。組換えウイルスベクターは、これらに限らないが、プラスミド、直鎖状人工染色体、脂質を含む複合体、リポソーム内にカプシド化されているおよびウイルス粒子中にカプシド化されている、例えばＡＡＶ粒子を含む任意の多数の形態であってよい。組換えウイルスベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（組換えウイルス粒子）」を生成するＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングされる。

【0044】

「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド化されたｒＡＡＶベクターゲノムからなるウイルス粒子を指す。

【0045】

「組換えアデノウイルスベクター」は、少なくとも１つのアデノウイルス末端逆位配列（ＩＴＲ）を端に有する１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、アデノウイルス由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態では組換え核酸は、２個の末端逆位配列（ＩＴＲ）を端に有する。そのような組換えウイルスベクターは、組換えウイルスゲノムから欠失された重要なアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子など）を発現している宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子中に複製およびパッケージングされる。組換えウイルスベクターが大きなポリヌクレオチド（例えば染色体またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドなどの別のベクター中）に組み込まれる場合、組換えウイルスベクターは、アデノウイルスパッケージング機能の存在下で複製およびカプシド化によって「レスキュー」される「プロベクター」と称される場合がある。組換えウイルスベクターは、これらに限らないが、プラスミド、直鎖状人工染色体、脂質を含む複合体、リポソーム内にカプシド化されているおよびウイルス粒子中にカプシド化されている、例えばアデノウイルス粒子を含む任意の多数の形態であってよい。組換えウイルスベクターは、「組換えアデノウイルス粒子」を生成するアデノウイルスウイルスカプシドにパッケージングされる。

【0046】

「組換えレンチウイルスベクター」は、少なくとも１つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）を端に有する１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、レンチウイルス由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態では組換
え核酸は、２個のレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）を端に有する。そのような組換えウイルスベクターは、好適なヘルパー機能を感染させた宿主細胞中に存在する場合感染性ウイルス粒子中に複製およびパッケージングされる。組換えレンチウイルスベクターは、「組換えレンチウイルス粒子」を生成するレンチウイルスカプシドにパッケージングされる。

【0047】

「組換え単純ヘルペスベクター（組換えＨＳＶベクター）」は、ＨＳＶ末端反復配列を端に有する１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、ＨＳＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。そのような組換えウイルスベクターは、好適なヘルパー機能を感染させた宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子中に複製およびパッケージングされる。組換えウイルスベクターが大きなポリヌクレオチド（例えば染色体またはクローニングもしくはトランスフェクションのために使用されるプラスミドなどの別のベクター中）に組み込まれる場合、組換えウイルスベクターは、ＨＳＶパッケージング機能の存在下で複製およびカプシド化によって「レスキュー」される「プロベクター」と称される場合がある。組換えウイルスベクターは、これらに限らないが、プラスミド、直鎖状人工染色体、脂質を含む複合体、リポソーム内にカプシド化されているおよびウイルス粒子中にカプシド化されている、例えばＨＳＶ粒子を含む任意の多数の形態であってよい。組換えウイルスベクターは、「組換え単純ヘルペスウイルス粒子」を生成するＨＳＶカプシドにパッケージングされる。

【0048】

「異種性」は、それが比較される、またはそれに導入もしくは組み込まれる実体の他の部分とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されるポリヌクレオチドは、異種性ポリヌクレオチドである（および発現された場合異種性ポリペプチドをコードできる）。同様にウイルスベクターに組み込まれている細胞性配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、ベクターに関して異種性ヌクレオチド配列である。

【0049】

用語「導入遺伝子」は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され、場合により好適な条件下で翻訳および／または発現されるポリヌクレオチドを指す。態様では、それが導入される細胞に望ましい特性を付与する、または望ましい治療もしくは診断結果を導く。別の態様では、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒介する分子に転写される。

【0050】

ウイルス力価を参照して使用される用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」または「ゲノムコピー」は、感染性または機能性に関わらず組換えウイルスＤＮＡゲノムまたはＲＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。具体的なベクター調製物中のゲノム粒子の数は、本明細書の実施例または例えばＣｌａｒｋら、（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１～１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら、（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２～２７８頁に記載などの手順によって測定できる。

【0051】

ウイルス力価を参照して本明細書で使用される用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」または「複製単位」は、例えばＡＡＶについて、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３～１９７３頁に記載の、複製中心アッセイとしても周知の感染中心アッセイによって測定される、感染性および複製適格組換えウイルスベクター粒子の数を指す。

【0052】

ウイルス力価を参照して使用される用語「導入単位（ｔｕ）」は、本明細書実施例に記載のものまたは例えばＡＡＶに関してＸｉａｏら、（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１１３～１２４頁またはＦｉｓｈｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０～５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載のものなどの機能性アッセイで測定される機能性導入遺伝子産生物の産生を生じる感染性組換えウイルスベクター粒子の数
を指す。

【0053】

「末端逆位配列」または「ＩＴＲ」配列は、当技術分野において十分に理解されている用語であり、ウイルスゲノムの末端に見出され反対方向にある比較的短い配列を指す。

【0054】

当技術分野において十分理解されている用語、「ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）」配列は、天然１本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチド配列である。ＩＴＲの最外側の１２５ヌクレオチドは、２つの別の方向で存在する場合があり、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間に不均一性を生じる。最外側の１２５ヌクレオチドは、自己相補性のいくつかの短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と記される）も含有し、ＩＴＲのこの部分内に生じる鎖内塩基対合を可能にしている。

【0055】

「末端分解配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製の際にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域中の配列である。変異体末端分解配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に抵抗性である。

【0056】

「ＡＡＶヘルパー機能」は、宿主細胞によるＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、これらに限らないが、ヘルパーウイルスまたはＡＡＶ複製およびパッケージングを補助するヘルパーウイルス遺伝子を含む任意の多数の形態で提供される。他のＡＡＶヘルパー機能は、遺伝毒性剤など当技術分野において周知である。

【0057】

ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（欠損パルボウイルス）が宿主細胞によって複製およびパッケージングされるようにするウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を提供する。多数のそのようなヘルパーウイルスは同定されており、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアなどのポックスウイルスおよびバキュロウイルスを含む。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを含むが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）は最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類由来の多数のアデノウイルスは周知であり、ＡＴＣＣなどの受託者から利用可能である。ＡＴＣＣなどの受託者から同様に利用可能であるヘルペスファミリーのウイルスは、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含む。ＡＡＶの複製のためのアデノウイルスヘルパー機能の例は、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能を含む。受託者から利用可能なバキュロウイルスは、オートグラファ・カルフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ
ｖｉｒｕｓ）を含む。

【0058】

ｒＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子の感染性ヘルパーウイルス粒子に対する比が少なくとも約１０^２：１、少なくとも約１０^４：１、少なくとも約１０^６：１または少なくとも約１０^８：１以上である場合はヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と考えられる。一部の実施形態では調製物は、等量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上に記載のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在した場合、そのようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在するタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／または細胞性タンパク質混入物は、ＳＤＳゲル上のクーマシー染色バンドの存在として一般に観察される（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）。

【0059】

本明細書において使用される「微分係数分布値（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）」または「Ｃ（Ｓ）」は、例えば超遠心分離法の際の、沈降粒子の分布を記載するためのラム方程式解の分布の変数である。

【0060】

本明細書において使用される「スベドベルグ単位」は、沈降速度の単位を指す。所与のサイズおよび形状の粒子の沈降速度は、どの程度早く粒子が沈降するかを測定する。１スベドベルグ単位は１０^－１３秒間に等しい。例えばスベドベルグ単位は、遠心分離の遠心力下で分子が移動する速度を反映するためにしばしば使用される。

【0061】

本明細書において使用される「沈降速度条件」または「境界沈降速度条件」は、サンプル溶液が沈降速度分析に供される任意の実験条件を指す。沈降速度は、幅広い範囲のｐＨおよびイオン強度条件ならびに温度４から４０℃にわたる粒子の研究を可能にする。沈降境界が移動する速度は、沈降する種の沈降係数の測定値である。沈降係数は、分子量（大きな粒子がより早く沈降する）および分子形状にも依存する。沈降境界の最小幅は分子の拡散係数に関連し；同様の沈降係数を有する複数の種の存在は拡散単独に基づいて予測されるよりも幅広い境界を生じる。沈降速度条件は、非限定的にローター速度、サンプルとローター中心との間の距離、温度、溶媒、サンプル、緩衝液、超遠心分離時間、検出の時間間隔、セクターおよび光学ウインドウ特徴、ＡＵＣ計測手段（超遠心機および検出装置を含む）、参照溶媒の平衡透析およびデータ分析アルゴリズムに関連する任意の条件を含む場合がある。

【0062】

本明細書において使用される用語「分析的密度グラジエント沈降平衡」は、粒子の浮遊密度を測定する、または粒子の異なる種を分離するために浮遊密度における差異を使用するための方法に関する。これらの方法は、例えばＡＵＣ沈降平衡技術を使用できる。これらの方法では粒子溶液（例えば、非限定的にポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはウイルスカプシドの溶液）は、溶媒和化合物での平衡が達成されるまで、塩化セシウムまたは硫酸セシウムグラジエントなどの溶媒和化合物グラジエント中で超遠心分離法に供される。平衡では、粒子溶液は粒子の密度が溶媒和化合物のものと等しいグラジエント中の位置に集まる、またはバンドになる。バンドの位置は粒子密度を算出するために使用でき、バンドは粒子の単一種を単離するために抽出される。

【0063】

本明細書において使用される「ＳＥＤＦＩＴアルゴリズム」は、沈降速度などの水力学的データを分析できるようにするアルゴリズムである（Ｓｃｈｕｃｋ（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６～１９頁）。ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムでは沈降係数のグリッドは、予測される範囲にわたって作製される。沈降境界は各沈降係数についてラム方程式への解を使用してシミュレートされ、一定の粒子形状および溶媒摩擦比を推定する。

【0064】

本明細書において使用される用語「Ｆ統計」または「Ｆ比」は、信頼レベルを指す。このパラメーターは、使用される正則化の量を制御する。それは、異なる範囲では異なる意味を有する：０から０．５では正則化は使用されない。値０．５から０．９９９は、蓋然性Ｐ（信頼レベル）に対応する。これらのＰ値から望ましいカイ二乗増加は、正則化の節減制約（ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）がＦ統計で算出される。値０．５１ではほとんど正則化を生じず；値０．６８から０．９０は一般に使用される信頼レベルに対応する（通常、５０スキャン以上で０．７の蓋然性に対応するカイ二乗増加は０．１％程度である）、一方０．９９に近い値は、非常に高い正則化を生じる。これらの値と蓋然性との関連は、Ｆ統計計算機を使用して検討される。数＞１が入力される場合、それらは、直接カイ二乗比と見なされる（＞１である蓋然性はないことから）。例えば１．１の値は、１０％カイ二乗増加を有する正則化を生じる。

【0065】

「低減する」は、参照と比較して活性、機能および／または量を減少させる、低現する、または抑止することである。特定の実施形態では「低減する」によって、全体で２０％以上の減少を生じる能力を意味する。別の実施形態では「低減」によって、全体で５０％以上の減少を生じる能力を意味する。さらに別の実施形態では「低減」によって、７５％、８５％、９０％、９５％以上の減少を生じる能力を意味する。

【0066】

本明細書において使用される「参照」は、比較目的のために使用される任意のサンプル、標準物またはレベルを指す。例えば水溶液中のＡＡＶの吸光度または屈折を測定する場合、溶液の吸光度または屈折はＡＡＶを含まない水溶液（すなわち参照溶液）の吸光度または屈折と比較される。他の例では参照物は、当技術分野において周知の標準的手順を指す場合がある。例えばＡＡＶ産生の品質（例えば、均一性）の改善のための手順を分析する場合、候補手順によって産生されたＡＡＶは、当技術分野において周知の手順（すなわち参照手順）と比較される。

【0067】

「単離された」分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）または細胞は、それがその天然環境の構成成分から同定および分離および／または回収されていることを意味する。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解物または産生培養上清などの供給源混合物からそれを濃縮する精製技術を使用して産生される。下に記載の通り濃縮は、例えば溶液中に存在するＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）の割合によってもしくは感染力によってなどの種々の方法によって測定される、またはそれは産生培養混入物もしくはヘルパーウイルス、培地構成成分などを含むプロセス混入物を含む混入物などの供給混合物中に存在する第２の潜在的干渉物質との関連で測定される。

【0068】

本明細書において値またはパラメーターの「約」を参照することは、値またはパラメーターそれ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は「Ｘ」の記載を含む。

【0069】

本明細書において使用される品目の単数形態「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、他に示す場合を除いて複数参照物を含む。例えば句「ｒＡＡＶ粒子（ａ ｒＡＡＶ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」は１つまたはそれ以上のｒＡＡＶ粒子を含む。

【0070】

本明細書に記載の本発明の態様および実施形態が態様および実施形態を「含む」、「からなる」および／または「本質的にからなる」ことを含むことは理解される。

【0071】

ＩＩＩ．分析超遠心分離法
分析超遠心分離法は、タンパク質または他の巨大分子の分子量ならびに水力学的および熱力学的特性を評価するための手段である。濃度、温度、イオン強度およびｐＨを含む幅広い条件にわたる沈降速度によるタンパク質または巨大分子の不均一性。例えばタンパク質は、臨床関連製剤において分析される。アデノウイルス調製物を特徴付けるための分析超遠心分離法の使用は、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，ＳＡ ＆ Ｐｈｉｌｏ ＪＳ，（２００７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６２：１６～３７頁によって提供されている。

【0072】

特定の態様では本発明は、分析超遠心分離法（ＡＵＣ）を使用するウイルス粒子の調製物を特徴付ける方法を提供する。例えば一部の実施形態では本発明は、完全、インタクトなゲノムを有するウイルス粒子、空のウイルスカプシドおよび変種（例えば、切断型、凝集体、不純物など）ウイルスゲノムを含むウイルス粒子を識別するためにＡＵＣを使用するｒＡＡＶ粒子の調製物中の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子のベクターゲノムの完全性を評価するための方法を提供する。他の実施形態ではこれらの方法は、アデノ
ウイルス、レンチウイルスおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子を分析するために同様の方法で適用される。ＡＵＣ分析は、遠心場における溶媒を通じた移行を測定することによる、粒子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびウイルスカプシド）の生物物理学的特性を特徴付けるための定量的方法を指す。ＡＵＣ分析は、数十年にわたって十分に特徴付けられており、非常に多用途である。ＡＵＣ分析が第１原理水力学および熱力学情報に依存していることから、ＡＵＣは、幅広い粒子濃度およびサイズにわたって多くの種類の粒子の生物物理学的特性を決定するために応用できる。ＡＵＣ分析は、典型的には基本的な２種類の実験：沈降速度および沈降平衡を包含する。沈降平衡分析は、化学量論および会合定数などの特徴を測定するために使用できる粒子の熱力学的特性をもたらす。沈降速度は、サイズ、形状および濃度などの特徴を測定するために使用できる粒子の水力学的特性をもたらす。ウイルス調製物のＡＵＣ分析の特性は、同じアッセイ条件をウイルスゲノムのヌクレオチド配列またはカプシドの血清型に関わらずウイルス粒子のさまざまな調製物を分析するために使用できることである。

【0073】

本開示のある特定の態様は、ウイルスカプシド特性を特徴付けるための沈降速度分析の使用に関する。一部の実施形態では沈降速度分析は、光がコンパートメントを通過できるようにするそれぞれ２個の光学ウインドウを有する透析平衡にある２つのセクター（１つは実験サンプル用、もう１つは溶媒のみの参照サンプル用）を有する超遠心速度セルを使用する。超遠心分離法は、セルに角速度を適用し、溶質粒子のセクター底への急速な沈降を導く。沈降が生じると溶質は、セル上部のメニスカス近くでは枯渇し、枯渇領域と沈降した溶質との間に沈降境界を生じる。沈降境界の移動または移行の速度は、特定の時間間隔でサンプルおよび参照セクターの特性を比較する測定値を取ることによって測定される（沈降速度について、これらの間隔は典型的には数分程度である）。複数種の溶質が存在する場合、これはそれぞれ分解可能な種に対応する複数の沈降境界の形成を生じる。

【0074】

沈降境界を光学的に検出し、その移動または移行の速度を測定するためのいつくかの方法は、当技術分野において周知である（参考のためにＣｏｌｅら、（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８４：１４３～７９頁を参照されたい）。一部の実施形態では参照およびサンプルセクターは、吸光度検出を使用してアッセイされる。この検出方法では具体的な波長での吸光度は、各セクター内の異なる半径位置でサンプルおよび参照セクターについて測定される。代替的に単一の半径位置での吸光度の経時変化は測定される。ベールの法則は、吸光度と溶質の消衰係数との間の数学的関係を提供する。

【0075】

一部の実施形態では参照物およびサンプルセクターは、干渉検出（例えば、レイリー干渉検出）を使用してアッセイされる。レイリー干渉検出法では、干渉光学系は、２個の平行スリットを有する。光の単一のコヒーレントビームは両方のウインドウを通り抜けるように分割され、次いで２本のビームは再混合される。これら２本の光波が混合される場合、それらは明暗交互のフリンジの干渉パターンを形成する。サンプルおよび参照サンプルが同一の屈折率を有する場合、生じる干渉フリンジは完全に直線状になる。溶質の濃度が増大すると、溶液の屈折率が増大し、それによりサンプル光ビームを遅らせ、垂直方向のフリンジのシフトを生じる。このフリンジシフトを測定することによって、サンプル中の溶質の濃度を測定できる。サンプルおよび参照物について絶対値を測定する吸光度検出とは異なり、干渉検出はサンプルと参照との間の相対差異を測定する。しかし干渉検出は、濃度に直接比例する統合されたピークを生じ、顕著には吸収しない種類のサンプルについて使用される。ＡＵＣでレイリー干渉光学を使用することについての参考のために、Ｆｕｒｓｔ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３５：３０７～１０頁を参照されたい。

【0076】

沈降境界が移動する速度の測定は、溶質粒子の多数の物理的特性を導くために使用される。境界移動の速度は、粒子の質量および形状（摩擦係数）に基づく沈降係数を決定する
。粒子の沈降係数ｓは、その速度と、遠心力場によってそれに適用される加速度との比を指す。沈降係数は、スベドベルグ単位、Ｓ（１スベドベルグ単位は１０^－１３秒間に等しい）で表される。粒子または粒子の溶液の沈降係数は、その特性、例えば分子量（浮力について補正される）および溶媒の特性に依存する。

【0077】

超遠心分離法の際の経時的な溶質の濃度境界における変化は、ラム方程式を使用して決定できる（Ｓｃｈｕｃｋ（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６～１９頁）。簡潔にはラム方程式は、ローターによって生じるセクター形の細胞および遠心力場を考慮して、沈降（溶質を濃縮する）および拡散（溶質を分散する）の競合する力への応答における経時的な溶質の濃度境界での変化を算出する。ラム方程式は：
式１：∂ｃ／∂ｔ＝Ｄ［（∂＾２ｃ／∂ｒ＾２）＋１／ｒ（∂ｃ／∂ｒ）］－ｓω＾２［ｒ（∂ｃ／∂ｒ）＋２ｃ］
と表すことができ、
式中ｃは溶質濃度、Ｄは溶質拡散定数を表し、ｓは沈降係数を表し、ωはローターの角速度を表し、ｒは半径であり、ｔは時間である。

【0078】

生ＡＵＣデータをラム方程式の解にフィットさせることによって、沈降係数および濃度分布の変化などの溶液の特徴を決定できる。例えば沈降境界の変化の速度について実験的に決定された値は、沈降係数、分子量または境界を形成する溶質の濃度を導くためにラム方程式を使用してモデル化される。ＳＥＤＦＩＴなどのいくつかのプログラムが当技術分野において周知であり（Ｓｃｈｕｃｋ（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６～１９頁）、ラム方程式をＡＵＣデータにモデル化するために使用される。これらのプログラムは、複数の溶質または複数の沈降境界を含有する溶液にラム方程式を適用できるようにもする。

【0079】

溶質の特徴の決定のための好適なプログラムの一例は、ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムである。一部の実施形態ではＳＥＤＦＩＴアルゴリズムは、粒子種の混合物を含有する溶液由来のＡＵＣデータを使用して微分係数分布値またはＣ（Ｓ）を算出するために使用される（参考のためにＳｃｈｕｃｋ（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６～１９頁を参照されたい）。ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムでは、予測される範囲にわたって沈降係数のグリッドが作成される。沈降境界は各沈降係数についてラム方程式への解を使用してシミュレートされ、一定の粒子形状および溶媒摩擦比を推定する。次いで実際のＡＵＣデータは微分係数分布値またはＣ（Ｓ）を導くためにこれらのラム解にフィットされる。ＡＵＣデータを分析するために有用な多数の他のプログラムは、Ｃｏｌｅ ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈ．１０：１６３～７６頁に見出される。

【0080】

本発明の一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、高度に精製され、適切に緩衝され、濃縮される。一部の実施形態ではウイルス粒子は、少なくとも約１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、２ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、３ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、４ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、６ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、７ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、８ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、９ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬ、１ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、２ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、３ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、４ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、６ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、７ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、８ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、９ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬ、１ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、２ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、３ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、４ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、６ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、７ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、８ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、９ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、１ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、２ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、３ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、４ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、６ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、７ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、８ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、９ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、１ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、２ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、３ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、４ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、６ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、７ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、８
ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、９ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、２ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、３ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、４ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、６ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、７ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、８ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、９ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、２ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、３ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、４ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、５ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、６ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、７ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、８ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、９ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬのいずれかに濃縮される。一部の実施形態ではウイルス粒子は、約１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１３ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^１０ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬ、約１ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^９ｖｇ／ｍＬまたは約１ｘ１０^７ｖｇ／ｍＬから約１ｘ１０^８ｖｇ／ｍＬに濃縮される。

【0081】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、好適な宿主細胞において生成され、精製される。一部の実施形態ではウイルス粒子は、親和性クロマトグラフィーによって精製される。ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子、アデノウイルス粒子、レンチウイルス粒子、ＨＳＶ粒子）を精製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、クロマトグラフィー媒体に固定したウイルスカプシドタンパク質の抗体またはウイルスカプシドタンパク質の結合リガンドの使用による。ウイルスカプシド親和性クロマトグラフィーの例は、これらに限らないがＡＡＶのためのＡＶＢ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、アデノウイルスおよびＨＳＶのための金属親和性クロマトグラフィー、ならびにＡＡＶおよびレンチウイルスのためのヘパリン親和性クロマトグラフィーなどを含む。アデノウイルス粒子を精製するための方法は、例えばＢｏ，Ｈら、（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６７Ｃ：１１９～１２５頁に見出される。レンチウイルス粒子を精製するための方法は、例えばＳｅｇｕｒａ ＭＭ，ら、（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ
Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（７）：９８７～１０１１頁に見出される。ＨＳＶ粒子を精製するための方法は例えばＧｏｉｎｓ，ＷＦら、（２０１４）Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３～７９頁に見出される。

【0082】

一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、医薬組成物中に製剤化される。関連する実施形態では医薬組成物は、生理学的ｐＨおよび／または生理学的浸透圧を有する緩衝剤を含有する。医薬製剤の非限定的例はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり、一部の実施形態ではＰＢＳは生理学的浸透圧（例えば、約ｐＨ７．２および約３００ｍＯｓｍ／Ｌ）である。一部の実施形態ではサンプル調整は、２６０ｎｍでの光学密度測定によって０．１から１．０の標的濃度に行われる。一部の例ではこの濃度は、再現性があり一致したＡＵＣデータを生じる。一部の例ではウイルス粒子の濃度は、ＰＢＳでの直接希釈によってまたはさらなる濃縮によって；例えば遠心フィルターデバイスを使用することによってのいずれかで調整される。

【0083】

本発明の一部の実施形態では、沈降速度分析超遠心分離法（ＳＶ－ＡＵＣ）分析は、生
物学的に適切な溶液条件下でその天然状態にあるサンプルを特徴付けることができる分析用超遠心機を使用して実施される（例えば、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＸＬ－Ｉ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））。ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＸＬ－１を使用する場合、サンプルは２個のセクター速度セルのサンプルセクターにロードされ、ビヒクル対照（例えば、組換えウイルスを含まないＰＢＳ）は対応する参照セクターにロードされる。サンプルは４穴ローターに置かれ、約２０℃の温度まで装置内で平衡化され、高真空は約１時間維持される。例示的実施形態では沈降速度遠心分離は、約２０，０００ｒｐｍ、約２０℃および約０．００３ｃｍ半径工程設定で、遅延なし、反復なしで実施される。下に記載のとおり、さまざまなパラメーターが遠心分離のために使用できる。一部の実施形態では吸光度（２６０ｎｍ）および／または干渉光学（例えば、レイリー干渉光学）は、最小沈降構成成分が光学ウインドウを透明化するまで半径方向の濃度を時間の関数として同時に記録するために使用される。一部の実施形態では半径方向の濃度は、最低密度を有する沈降種がセクターを透明化するまで記録される。一部の実施形態では沈降は、最低密度を有する組換えウイルス粒子が超遠心機のセクターの底に沈降するまでモニターされる。セクターは、超遠心機の一部；例えば超遠心速度セルである。一部の実施形態ではセクターは、サンプルが検出される超遠心機の一部である場合がある。一部の実施形態では超遠心分離法は、超遠心速度セルを含む超遠心機を利用する。一部の実施形態では、組換えウイルス粒子が超遠心速度セルの底に沈降するまでモニターされる。一部の実施形態では沈降は、最低密度を有する組換えウイルス粒子が沈降し、光学ウインドウを透明化するまでモニターされる。一部の実施形態では半径方向の濃度は、少なくとも約０．５時間、０．７５時間、１．０時間、１．５時間、２．０時間、３．０時間、４．０時間または５．０時間のいずれかについて記録される。一部の実施形態では半径方向の濃度は、約０．５時間から約０．７５時間、約０．７５時間から約１．０時間、約１．０時間から約１．５時間、約１．５時間から約２．０時間、約２時間から約３時間、約３時間から約４時間、約４時間から約５時間のいずれかの間について記録される。一部の実施形態では半径方向の濃度は、約１．２時間について記録される。実行条件を最適化することは、例えば、沈降する種がすべてセクターの底に完全に沈降するまで温度を２０℃に一定に保ち、１８，０００ｒｐｍから２０，０００ｒｐｍの速度で実行を継続することを含む。下に記載のとおり、他の温度および速度も使用できる。

【0084】

完全カプシド百分率は、ＳＥＤＦＩＴ連続サイズＣ（Ｓ）分布モデルを使用する各検出方法からの複数のスキャン（例えば、７５）を分析することによって決定される。二次（２^ｎｄ）微分正則化はフィッティングに適用される。一部の実施形態では、Ｆ統計の信頼レベルは約０．６８である。一部の実施形態ではＦ統計の信頼レベルは約０．６８、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５または０．９９のいずれかより高い。一部の実施形態ではＦ統計の信頼レベルは、約０．６８から約０．９０である。一部の実施形態ではＦ統計の信頼レベルは、約０．６８から約０．９９である。一部の実施形態では以下のＣ（Ｓ）パラメーターは一定に保たれ：分解能は約２００Ｓから約５０００Ｓであり、Ｓｍｉｎは約１Ｓから約１００Ｓであり、Ｓｍａｘは約１００Ｓから約５０００Ｓであり、摩擦比は約１．０であり、または遠心分離ソフトウェアによって決定された値に移行させる。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓまたは１０００Ｓのいずれかである。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓから約１０００Ｓ、２００Ｓから約９００Ｓ、２００Ｓから約８００Ｓ、２００Ｓから約７００Ｓ、２００Ｓから約６００Ｓ、２００Ｓから約５００Ｓ、２００Ｓから約４００Ｓ、２００Ｓから約３００Ｓ、３００Ｓから約１０００Ｓ、３００Ｓから約９００Ｓ、３００Ｓから約８００Ｓ、３００Ｓから約７００Ｓ、３００Ｓから約６００Ｓ、３００Ｓから約５００Ｓ、３００Ｓから約４００Ｓ、４００Ｓから約１０００Ｓ、４００Ｓから約９００Ｓ、４００Ｓから約８００Ｓ、４００Ｓから約７００Ｓ、４００Ｓから約６００Ｓ、４００Ｓから約５００Ｓ、５００Ｓから約１０００Ｓ、５００Ｓから約９００Ｓ、５００Ｓから約８００Ｓ、５００Ｓから約７００Ｓ、
５００Ｓから約６００Ｓ、６００Ｓから約１０００Ｓ、６００Ｓから約９００Ｓ、６００Ｓから約８００Ｓ、６００Ｓから約７００Ｓ、７００Ｓから約１０００Ｓ、７００Ｓから約９００Ｓ、７００Ｓから約８００Ｓ、８００Ｓから約１０００Ｓ、８００Ｓから約９００Ｓまたは９００Ｓから約１０００Ｓのいずれかの間である。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓである。一部の実施形態ではＳｍａｘは、約１００Ｓ、２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓまたは１０００Ｓのいずれかである。一部の実施形態ではＳｍａｘは、約１００Ｓから約１０００Ｓ、１００Ｓから約９００Ｓ、１００Ｓから約８００Ｓ、１００Ｓから約７００Ｓ、１００Ｓから約６００Ｓ、１００Ｓから約５００Ｓ、１００Ｓから約４００Ｓ、１００Ｓから約３００Ｓ、１００Ｓから約２００Ｓ、２００Ｓから約１０００Ｓ、２００Ｓから約９００Ｓ、２００Ｓから約８００Ｓ、２００Ｓから約７００Ｓ、２００Ｓから約６００Ｓ、２００Ｓから約５００Ｓ、２００Ｓから約４００Ｓ、２００Ｓから約３００Ｓ、３００Ｓから約１０００Ｓ、３００Ｓから約９００Ｓ、３００Ｓから約８００Ｓ、３００Ｓから約７００Ｓ、３００Ｓから約６００Ｓ、３００Ｓから約５００Ｓ、３００Ｓから約４００Ｓ、４００Ｓから約１０００Ｓ、４００Ｓから約９００Ｓ、４００Ｓから約８００Ｓ、４００Ｓから約７００Ｓ、４００Ｓから約６００Ｓ、４００Ｓから約５００Ｓ、５００Ｓから約１０００Ｓ、５００Ｓから約９００Ｓ、５００Ｓから約８００Ｓ、５００Ｓから約７００Ｓ、５００Ｓから約６００Ｓ、６００Ｓから約１０００Ｓ、６００Ｓから約９００Ｓ、６００Ｓから約８００Ｓ、６００Ｓから約７００Ｓ、７００Ｓから約１０００Ｓ、７００Ｓから約９００Ｓ、７００Ｓから約８００Ｓ、８００Ｓから約１０００Ｓ、８００Ｓから約９００Ｓまたは９００Ｓから約１０００Ｓのいずれかの間である。一部の実施形態ではＳｍａｘは約２００Ｓから約５０００Ｓである。一部の実施形態ではＳｍａｘは約２００Ｓである。一部の実施形態では摩擦比は、遠心分離ソフトウェアによって決定された値に移行させる。一部の実施形態では摩擦比は約１．０である。一部の実施形態では半径方向不変（ＲＩ）および時不変（ＴＩ）ノイズサブトラクションが適用される。一部の実施形態ではメニスカス位置を移行させ、ソフトウェアが最適な位置を選ぶようにされている。一部の実施形態では摩擦比を移行させ、ソフトウェアが最適な位置を選ぶようにされている。モデルはデータをラム方程式にフィットし、生じたサイズ分布はフリンジの単位またはＯＤ_２６０単位で濃度に比例する各ピーク下面積を有するクロマトグラムのような「沈降係数の分布」である。（スベドベルグ単位での）沈降係数および（ＯＤ単位での）相対濃度は、分布における各構成成分について決定される。一部の実施形態では複数回のＡＵＣ実行は独立アッセイであり、各分析は以下の帰属について結果の品質を確実にするためにモニターされる：適合度（ｒｍｓｄ）、各ピークについてのＯＤ_{２６０ｎｍ}／フリンジにおける干渉シグナルの比（Ａ２６０／ＩＦ比）、実行間での各種についての沈降係数の一致およびスキャンの全体的な品質。

【0085】

本発明の一部の実施形態では消衰係数は、吸光度データからモル濃度およびインタクトなベクターピークの実際の百分率値を算出するために使用される。空のカプシド（Ε_２６０／_カプシド＝３．７２ｅ６）およびインタクトなベクター（Ε_２６０／ベクター＝３．００ｅ７）の両方についてのモル吸光度消衰係数は、公開されている式（Ｓｏｍｍｅｒら、（２００３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，７：１２２～８頁）に基づいて算出できる。消衰係数は、空のカプシドおよびインタクトなベクターピークについて利用可能である。Ｃ（Ｓ）値は、Ｓｃｈｕｃｋ（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６～１９頁に記載されるＳＥＤＦＩＴアルゴリズムを使用して決定できる。インタクトなベクターおよび空のカプシドの両方のモル濃度は、ベールの法則を使用して算出され、完全カプシドの百分率はこれらの値から算出される。一部の実施形態では値は、完全カプシドの百分率として報告される。

【0086】

一部の実施形態では、組換えウイルス粒子（例えば、未知のサイズおよび配列の断片化ゲノムを有するウイルス粒子）の具体的な種の消衰係数を実験的に決定することは不可能
である。Ｓ値とゲノムサイズとの関係は、周知のヌクレオチドサイズを有するカプシド化されたウイルスゲノムを含む組換えウイルスベクター調製物を分析することによって確立され、対応するＳ値は本明細書に記載のとおり決定される。算出されたＳ値は、未知の分子量またはゲノムサイズの組換えウイルス種が未知の種の分子量を決定するために比較される標準曲線を生成するためにプロットされる。

【0087】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物を特徴付ける方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程（例えば、１回またはそれ以上）、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（Ｓ）分布における各ピーク下面積を積分して、各ピークの相対濃度を決定する工程であって、各ピークが組換えウイルス粒子の種に相当する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では本発明の方法により同定される組換えウイルス粒子の種は、これらに限らないが；インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全組換えウイルス粒子、空の組換えウイルスカプシド粒子、および変種の組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒を含む。一部の実施形態では変種のゲノムは、インタクトな組換えウイルスゲノムより小さい（例えば、切断型ゲノム）。一部の実施形態では変種のゲノムは、インタクトな組換えウイルスゲノムより大きい（例えば、凝集体、組換え体など）。一部の実施形態では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子のベクターゲノムの完全性を評価するための方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程（例えば、１回またはそれ以上）、ｂ）微分沈降係数分布値Ｃ（ｓ）をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｓ値に対応するプロット上のピークの存在によって調製物中の組換えウイルス粒子の種を同定する工程であって、組換えウイルス粒子の具体的な種のゲノムサイズが種のＳ値を、さまざまな周知のサイズを有するカプシド化されたウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子のＳ値によって作成された標準曲線と比較することによって算出される工程を含む、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子のベクターゲノムの完全性を評価するための方法を提供する。一部の実施形態では方法は、Ｃ（Ｓ）分布における各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程をさらに含む。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、時間間隔で１回モニターされる。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、時間間隔で１回より多くモニターされる。

【0088】

本発明の一部の実施形態では組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の沈降は、約２６０ｎｍでの光学密度または吸光度を測定することによってモニターされる。吸光度を測定する手段は、当技術分野において周知である。一部の実施形態ではＡＵＣのために使用される超遠心機は、吸光度を測定する手段を備えている。他の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、干渉によってモニターされる。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、レイリー干渉によってモニターされる。干渉を測定する手段は、当技術分野において周知である（Ｆｕｒｓｔ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．３５：３０７～１０頁）。一部の実施形態ではＡＵＣのために使用される超遠心機は、干渉を測定する手段を備えている。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降は、吸光度および干渉の両方によってモニターされる。一部の実施形態では吸光度および／または干渉は、参照標準を使用して測定される。一部の実施形態では参照標準は、組換えウイルスが存在しないことを除いて組換えウイルス調製物の溶液と一致している。例えば組換えウイルス調製物は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液中に組換えウイルスを含む。この例では参照標準は、組換えウイルス粒子を含まないリン酸緩衝生理食塩水である。

【0089】

本発明の一部の実施形態ではウイルス粒子の調製物は、医薬製剤中にある。そのような製剤は、当技術分野において十分に周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１５版，１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照されたい）。そのような医薬製剤は、水および、石油、動物、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイルなどの植物または合成由来のものを含む油などの滅菌液体であってよい。生理食塩水およびブドウ糖水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセリン溶液も液体担体として、特に注射可能な溶液に用いることができる。医薬製剤は、追加の成分、例えば保存剤、緩衝液、等張化剤、抗酸化物質および安定化剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤などをさらに含む場合がある。本発明の一部の実施形態では医薬製剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含む。

【0090】

本発明の一部の実施形態では超遠心分離法の際のウイルス粒子の沈降速度は、超遠心分離法の際に継続的にウイルス粒子の沈降をモニターすることによって決定される。さまざまな種類のウイルス粒子のためにＡＵＣのパラメーターを最適化することは当業者の管理の範囲内である。理論に束縛されることを意図せず、ＡＡＶおよびアデノウイルス粒子の両方の分析を可能にするＡＵＣ設定の範囲は、ＨＳＶおよびレンチウイルス粒子のサイズがＡＡＶおよびアデノウイルス粒子のものの間であることから、レンチウイルスおよびＨＳＶを含む他のウイルス粒子の分析も可能にするはずである。一部の実施形態ではｒＡＡＶ、ｒＨＳＶ、レンチウイルス、および／またはｒＡｄ粒子についてのデータ取得は、約３，０００から約２０，０００ｒｐｍの間のＡＵＣ速度で実施される。一部の実施形態ではｒＡＡＶ、ＨＳＶ、レンチウイルスおよび／またはアデノウイルス粒子についてのデータ分析は、約１ＳのＳ_ｍｉｎおよび約１０００ＳのＳ_ｍａｘで実施される。一部の実施形態ではｒＡＡＶ、ｒＨＳＶ、レンチウイルスおよび／またはｒＡｄ粒子についてのデータ分析は、約２００Ｓから約１，０００Ｓの分解能で実施される。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓまたは１０００Ｓのいずれかである。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓから約１０００Ｓ、２００Ｓから約９００Ｓ、２００Ｓから約８００Ｓ、２００Ｓから約７００Ｓ、２００Ｓから約６００Ｓ、２００Ｓから約５００Ｓ、２００Ｓから約４００Ｓ、２００Ｓから約３００Ｓ、３００Ｓから約１０００Ｓ、３００Ｓから約９００Ｓ、３００Ｓから約８００Ｓ、３００Ｓから約７００Ｓ、３００Ｓから約６００Ｓ、３００Ｓから約５００Ｓ、３００Ｓから約４００Ｓ、４００Ｓから約１０００Ｓ、４００Ｓから約９００Ｓ、４００Ｓから約８００Ｓ、４００Ｓから約７００Ｓ、４００Ｓから約６００Ｓ、４００Ｓから約５００Ｓ、５００Ｓから約１０００Ｓ、５００Ｓから約９００Ｓ、５００Ｓから約８００Ｓ、５００Ｓから約７００Ｓ、５００Ｓから約６００Ｓ、６００Ｓから約１０００Ｓ、６００Ｓから約９００Ｓ、６００Ｓから約８００Ｓ、６００Ｓから約７００Ｓ、７００Ｓから約１０００Ｓ、７００Ｓから約９００Ｓ、７００Ｓから約８００Ｓ、８００Ｓから約１０００Ｓ、８００Ｓから約９００Ｓまたは９００Ｓから約１０００Ｓのいずれかの間である。一部の実施形態では分解能は、約２００Ｓである。ｒＡＡＶ、ｒＨＳＶ、レンチウイルスおよび／またはｒＡｄ粒子についてのデータ分析は、約１００Ｓ、２００Ｓ、３００Ｓ、４００Ｓ、５００Ｓ、６００Ｓ、７００Ｓ、８００Ｓ、９００Ｓまたは１０００ＳいずれかのＳｍａｘで実施される。一部の実施形態ではＳｍａｘは、約１００Ｓから約１０００Ｓ、１００Ｓから約９００Ｓ、１００Ｓから約８００Ｓ、１００Ｓから約７００Ｓ、１００Ｓから約６００Ｓ、１００Ｓから約５００Ｓ、１００Ｓから約４００Ｓ、１００Ｓから約３００Ｓ、１００Ｓから約２００Ｓ、２００Ｓから約１０００Ｓ、２００Ｓから約９００Ｓ、２００Ｓから約８００Ｓ、２００Ｓから約７００Ｓ、２００Ｓから約６００Ｓ、２００Ｓから約５００Ｓ、２００Ｓから約４００Ｓ、２００Ｓから約３００Ｓ、３００Ｓから約１０００Ｓ、３００Ｓから約９００Ｓ、３００Ｓから約８００Ｓ、３００Ｓから約７００Ｓ、３００Ｓから約６００Ｓ、３００Ｓから約５００Ｓ、３００Ｓから約４００Ｓ、４００Ｓから約１０００Ｓ、４００Ｓから約９００Ｓ、４００Ｓから約８００Ｓ、４００Ｓから約７００Ｓ、４００Ｓから約６００Ｓ、４００Ｓから約５００Ｓ、
５００Ｓから約１０００Ｓ、５００Ｓから約９００Ｓ、５００Ｓから約８００Ｓ、５００Ｓから約７００Ｓ、５００Ｓから約６００Ｓ、６００Ｓから約１０００Ｓ、６００Ｓから約９００Ｓ、６００Ｓから約８００Ｓ、６００Ｓから約７００Ｓ、７００Ｓから約１０００Ｓ、７００Ｓから約９００Ｓ、７００Ｓから約８００Ｓ、８００Ｓから約１０００Ｓ、８００Ｓから約９００Ｓまたは９００Ｓから約１０００Ｓのいずれかの間である。一部の実施形態ではＳｍａｘは、約２００Ｓから約５０００Ｓである。一部の実施形態ではＳｍａｘは約２００Ｓである。一部の実施形態では、半径方向不変（ＲＩ）および時不変（ＴＩ）ノイズサブトラクションが適用される。一部の実施形態ではメニスカス位置を移行させ、ソフトウェアが最適な位置を選ぶようにされている。一部の実施形態では摩擦比を移行させ、ソフトウェアが最適な位置を選ぶようにされている。一部の実施形態ではｒＡＡＶおよび／またはアデノウイルス粒子についてのデータ分析は、１で一定に保たれる。一部の実施形態ではｒＡＡＶ、ＨＳＶ、レンチウイルス、および／またはアデノウイルス粒子についてのデータ分析は、非線形回帰を使用して最適化された値でＦＩＴコマンドを使用して移行される。

【0091】

組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）に関して、一部の実施形態では超遠心分離法の際の組換えウイルスの沈降速度は、約１５秒間、３０秒間、４５秒間、１分間（６０秒間）、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間を超えるごとに１回組換えウイルス粒子の沈降をモニター（例えば、スキャンニング）することによって決定される。スキャンは、光学系が可能な限り迅速に遅延無く継続的に取得される。干渉スキャンは迅速であり、１回のスキャンは約１０～１５秒間で完了し、一方で吸光度スキャンは約６０秒間必要である。二重検出が使用される場合、両方についてのスキャン取得速度は吸光度系によって決定される。本発明の一部の実施形態では、超遠心分離法の際に約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００を超えるスキャンが組換えウイルス粒子の沈降をモニターするために使用される。一部の実施形態では最少３０スキャンが分析のために必要であり、スキャンは沈降工程が完了するまでに回収される。一部の実施形態では沈降工程は、典型的には４０から７５スキャンの間で記載される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降速度は、約７５スキャンに基づいて決定される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降速度は、約５５スキャンから約７５スキャンに基づいて決定される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降速度は、約５５スキャンから約６０スキャンに基づいて決定される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降速度は、約６０スキャンから約７５スキャンに基づいて決定される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降速度は、約６０スキャンから約７０スキャンに基づいて決定される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降速度は、複数回の超遠心分離法（実行）に基づいて決定される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子の沈降速度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回のいずれかまたはそれを超える超遠心分離法の実行に基づいて決定される。一部の実施形態では沈降速度は、ＳＥＤＦＩＴアルゴリズムを使用してＣ（Ｓ）値を決定するために使用される。一部の実施形態では二次微分正則化は、約０．６８のＦ統計の信頼レベルを有するフィッティングレベルに適用される。一部の実施形態では以下のＣ（Ｓ）パラメーターは一定に保たれ：分解能は１００Ｓから約２００Ｓであり、Ｓｍｉｎは約１であり、Ｓｍａｘは約２００Ｓから３００Ｓであり、摩擦比は約１．０から１．２Ｓである。一部の実施形態では半径方向不変（ＲＩ）および時不変（ＴＩ）ノイズサブトラクションが適用される。

【0092】

本発明の一部の実施形態では、約５，０００ｒｐｍ；１０，０００ｒｐｍ；１５，０００ｒｐｍ；２０，０００ｒｐｍ；２５，０００ｒｐｍ；３０，０００ｒｐｍ；３５，０００ｒｐｍ；４０，０００ｒｐｍ；４５，０００ｒｐｍ；または５０，０００ｒｐｍのいずれかを超えて組換えウイルス粒子の調製物を超遠心分離することによる組換えウイルス粒
子の調製物中の組換えウイルス粒子（例えばｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の境界沈降速度。一部の実施形態では超遠心分離法は、約５，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約１５，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約２０，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約２５，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約３０，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約３５，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約４０，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約４５，０００ｒｐｍから約５０，０００ｒｐｍ；約５，０００ｒｐｍから約４５，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約４５，０００ｒｐｍ；約１５，０００ｒｐｍから約４５，０００ｒｐｍ；約２０，０００ｒｐｍから約４５，０００ｒｐｍ；約２５，０００ｒｐｍから約４５，０００ｒｐｍ；約３０，０００ｒｐｍから約４５，０００ｒｐｍ；約４０，０００ｒｐｍから約４５，０００ｒｐｍ；約５，０００ｒｐｍから約４０，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約４０，０００ｒｐｍ；約１５，０００ｒｐｍから約４０，０００ｒｐｍ；約２０，０００ｒｐｍから約４０，０００ｒｐｍ；約２５，０００ｒｐｍから約４０，０００ｒｐｍ；約３０，０００ｒｐｍから約４０，０００ｒｐｍ；約３５，０００ｒｐｍから約４０，０００ｒｐｍ；約５，０００ｒｐｍから約３５，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約３５，０００ｒｐｍ；約１５，０００ｒｐｍから約３５，０００ｒｐｍ；約２０，０００ｒｐｍから約３５，０００ｒｐｍ；約２５，０００ｒｐｍから約３５，０００ｒｐｍ；約３０，０００ｒｐｍから約３５，０００ｒｐｍ；約５，０００ｒｐｍから約３０，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約３０，０００ｒｐｍ；約１５，０００ｒｐｍから約３０，０００ｒｐｍ；約２０，０００ｒｐｍから約３０，０００ｒｐｍ；約２５，０００ｒｐｍから約３０，０００ｒｐｍ；約５，０００ｒｐｍから約２５，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約２５，０００ｒｐｍ；約２０，０００ｒｐｍから約２５，０００ｒｐｍ；約５，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍ；約１５，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍ；約５，０００ｒｐｍから約１５，０００ｒｐｍ；約１０，０００ｒｐｍから約１５，０００ｒｐｍまたは約５，０００ｒｐｍから約１０，０００ｒｐｍの間のいずれかで実行される。本発明の一部の実施形態では、組換えウイルス粒子の調製物を約２０，０００ｒｐｍで超遠心分離することによる組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度。本発明の一部の実施形態では、組換えウイルス粒子の調製物を約１５，０００ｒｐｍから約２０，０００ｒｐｍで超遠心分離することによる組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度。

【0093】

本発明の一部の実施形態では約４℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃もしくは３０℃またはそれ以上での組換えウイルス粒子の調製物を超遠心分離することによる組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度。一部の実施形態では超遠心分離法は、約４℃から約３０℃、約４℃から約２５℃、約４℃から約２０℃、約４℃から約１５℃、約４℃から約１０℃、約１０℃から約３０℃、約１０℃から約２５℃、約１０℃から約２０℃、約１０℃から約１５℃、約１５℃から約３０℃、約１５℃から約２５℃、約１５℃から約２０℃、約２０℃から約３０℃または約２０℃から約２５℃のいずれかの間で実行される。一部の実施形態では、組換えウイルス粒子の調製物を約２０℃で超遠心分離することによる組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度。一部の実施形態では、組換えウイルス粒子の調製物を約１５℃から約２０℃で超遠心分離することによる組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子の境界沈降速度。

【0094】

本明細書で開示のとおり多数の種類の組換えウイルス粒子は、本開示の方法によって分析される（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルスおよび／またはＨＳＶ粒子）。好適な超遠心分離法条件、分析アルゴリズムおよび他のパラメーターは、当技術分野において周知の方法を通じて実験的に決定できる。ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイ
ルスおよびＨＳＶ粒子についての例示的パラメーターは、具体的なパラメーター選択肢の選択についての指針と共に非限定的に下の表１に提供される。

【0095】

【表1】

【0096】

【表2】

【0097】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物中の空のカプシドの存在を決定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程（例えば、１回またはそれ以上）、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、空のカプシド粒子のＳ値に対応するピークの存在は、空のカプシド粒子の存在を示す工程を含む、組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシドの存在を決定する方法を提供する。一部の実施形態では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の空のカプシド相対量を測定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程（例えば、１回またはそれ以上）、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、ｄ）空のカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量と比較する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では空のカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量は、Ｃ（Ｓ）対Ｓのプロットでのすべてのピークを積分することによる調製物中のすべての組換えウイルス粒子の全量と比較される。

【0098】

一部の態様では本発明は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物中の組換えウイルス粒子変種の存在を決定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程（例えば、１回またはそれ以上）、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、インタクトな完全組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルスカプシド粒子のＳ値とは異なるＳ値に対応するピークの存在が組換えウイルス粒子変種の存在を示す工程を含む、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子変種の存在を決定する方法を提供する。一部の実施形態では本発明は、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子変種の相対量を測定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程（例えば、１回またはそれ以上）、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程、ｃ）Ｃ（Ｓ）分布中の各ピーク下面積を積分して、組換えウイルス粒子の各種の相対濃度を決定する工程、ｄ）空のカプシド粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量を、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子に対応するＳ値を有する組換えウイルス粒子の量と比較する工程を含む、組換えウイルス粒子の調製物中の組換えウイルス粒子変種の相対量を測定する方法を提供する。一部の実施形態では、インタクトな完全組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルスカプシド粒子のＳ値とは異なるＳ値を有する組換えウイルス粒子の量は、Ｃ（Ｓ）対Ｓのプロットでの全てのピークを積分することによって調製物中のすべての組換えウイルス粒子の全量と比較される。一部の実施形態では組換えウイルス粒子変種は、全長インタクトなウイルスゲノムより小さい（例えば、切断型）または大きい組換えウイルスゲノムを含む。他のウイルス性カプシド化ＤＮＡ不純物も検出される。

【0099】

一部の実施形態では本発明は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物の精製の際に空のカプシドおよび／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子の除去をモニターする方法であって、精製プロセスにおける１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、および本明細書に記載のＡＵＣを使用して空のカプシドの相対量についてサンプルを分析することを含む方法を提供する。空のカプシドおよび／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子の完全カプシドに対する相対量における減少は、組換えウイルス粒子の調製物からの空のカプシドの除去を示す。

【0100】

一部の実施形態では本発明は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物中の組換えウイルス粒子の不均一性を決定する方法であって、ａ）調製物を境界沈降速度条件下で分析超遠心分離法に供する工程であって、組換えウイルス粒子の沈降が時間間隔でモニターされる工程（例えば、１回またはそれ以上）、ｂ）微分沈降係数分布値（Ｃ（ｓ））をスベドベルグ単位での沈降係数（Ｓ）に対してプロットする工程であって、インタクトなウイルスゲノムを含むカプシドに相当するピークに加えたピークの存在が調製物中の組換えウイルス粒子の不均一性を示す、工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では本発明の方法によって同定された組換えウイルス粒子の種は、これらに限らないがインタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全組換えウイルス粒子、空の組換えウイルスカプシド粒子および変種の組換えウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子を含む。一部の実施形態では変種のゲノムは、インタクトな組換えウイルスゲノムより小さい（例えば、切断型ゲノム）。一部の実施形態では変種のゲノムは、インタクトな組換えウイルスゲノムより大きい（例えば、凝集体、組換え体など）。一部の実施形態では変種のゲノムは、インタクトな組換えウイルスゲノムより小さいまたは大きいゲノムを含む。

【0101】

一部の実施形態では本発明は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ、ｒＡｄ、レンチウイルスまたはｒＨＳＶ粒子）の調製物の精製の際に組換えウイルス粒子の不均一性をモニターする方法であって、精製プロセスにおける１つまたはそれ以上の工程に続いて、調製物から組換えウイルス粒子サンプルを除去すること、ならびに本明細書に記載のＡＵＣを使用して、インタクトな組換えウイルスゲノムを含む完全カプシド、空のカプシドおよび／または変種のゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量を決定することを含み、インタクトなウイルスゲノムを含む組換えウイルス粒子の相対量における増大が組換えウイルス粒子の調製物中の全ウイルス粒子の不均一性の増大を示す方法を提供する。

【0102】

上に記載の実施形態では組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の精製工程を使用して精製された。精製工程の例は、これらに限らないが平衡遠心分離、アニオン交換ろ過、接線流ろ過（ＴＦＦ）、アパタイトクロマトグラフィー、ヘルパーウイルスの熱不活性化、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ナノ濾過、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーを含む。

【0103】

上に記載の実施形態では組換えウイルス粒子は、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含む。一部の実施形態では組換えＡＡＶゲノムは、第１の異種性ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子コード鎖）および第２の異種性ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子の非コードまたはアンチセンス鎖）を含み、第１の異種性ポリヌクレオチド配列は第２のポリヌクレオチド配列とその長さの大部分または全体に沿って鎖内塩基対を形成できる。一部の実施形態では第１の異種性ポリヌクレオチド配列と第２の異種性ポリヌクレオチド配列とは、鎖内塩基対合を促進する配列によって連結される；例えばヘアピンＤＮＡ構造。ヘアピン構造は、例えばｓｉＲＮＡ分子において当技術分野において周知である。一部の実施形態では第１の異種性ポリヌクレオチド配列と第２の異種性ポリヌクレオチド配列とは、変異導入ＩＴＲによって連結される。一部の実施形態ではｓｃＡＡＶウイルス粒子は、ｓｃＡＡＶゲノムの単量体形態を含む。一部の実施形態ではｓｃＡＡＶウイルス粒子は、ｓｃＡＡＶゲノムの二量体形態を含む。一部の実施形態では本明細書に記載のＡＵＣは、ｓｃＡＡＶゲノムの単量体形態を含むｒＡＡＶ粒子の存在を検出するために使用される。一部の実施形態では本明細書に記載のＡＵＣは、ｓｃＡＡＶゲノムの二量体形態を含むｒＡＡＶ粒子の存在を検出するために使用される。一部の実施形態ではｓｃＡＡＶゲノムのカプシドへのパッケージングは本明細書に記載のＡＵＣによってモニターされる。

【0104】

上に記載の実施形態ではｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド（例えば、野生型ＡＡＶ６カプシドもしくはＳｈＨ１０などの変種ＡＡＶ６カプシド、Ｕ．Ｓ．ＰＧ Ｐｕｂ．２０１２／０１６４１０６に記載のとおり）、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９カプシド（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、もしくは修飾ＡＡＶ９カプシド、Ｕ．Ｓ．ＰＧ Ｐｕｂ．２０１３／０３２３２２６に記載のとおり）、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、チロシンカプシド変異体、ヘパリン結合カプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９カプシドもしくはＵ．Ｓ．ＰＧ Ｐｕｂ．２０１２／００６６７８３に記載の任意の他のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシドまたは米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開第ＷＯ２００３／０４２３９７号に記載のＡＡＶカプシドを含む。上に記
載の実施形態ではｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲまたはマウスＡＡＶ ＩＴＲを含む。一部の実施形態ではｒＡＡＶ粒子は、１つのＡＡＶ血清型由来のＩＴＲおよび別の血清型由来のＡＡＶカプシドを含む。例えばｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシド中にカプシド化された少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを端に有する治療用導入遺伝子を含むことができる。そのような組合せは、偽型化ｒＡＡＶ粒子と称される場合がある。

【0105】

ＩＶ．ウイルス粒子
本明細書に開示の方法は、使用を、とりわけ種々のウイルス粒子中で目的の種を特徴付けることにおいて見出す（例えば、切断型ゲノムを含むウイルス粒子および／またはＤＮＡ不純物を含むウイルス粒子と比較する全ゲノムを含むウイルス粒子）。

【0106】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲを端に有する導入遺伝子を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子中にカプシド化されている。ＡＡＶ粒子はまた、カプシドタンパク質も含む。一部の実施形態では核酸は、転写開始および終結配列を含む制御配列、構成成分に転写方向で作動可能に連結された目的のタンパク質コード配列（複数可）（例えば、治療用導入遺伝子）を含み、それにより発現カセットを形成する。発現カセットは、少なくとも１つの機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列に５’および３’末端で隣接している。「機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列」によって、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングを目的として機能することが意味される。その全体を参照により本明細書に組み入れるＤａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ，２０００，９７（７）３４２８～３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３，７７（１２）：７０３４～４０頁およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００９，１６：１０～１６頁を参照されたい。本発明のいくつかの態様を実行するために組換えベクターは、ｒＡＡＶによる感染のためのカプシド化および物理的構造に不可欠なＡＡＶの配列の少なくとも全体を含む。本発明のベクターにおける使用のためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく（例えばＫｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９４，５：７９３～８０１頁に記載のとおり）、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変更することができ、ＡＡＶ ＩＴＲはいくつかのＡＡＶ血清型のいずれにも由来できる。ＡＡＶの４０を超える血清型が現在周知であり、新たな血清および既存の血清型の変種は同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ，２００２，９９（１８）：１１８５４～６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ，２００３，１００（１０）：６０８１～６頁およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３，７７（１２）：６７９９～８１０頁を参照されたい。任意のＡＡＶ血清型の使用は、本発明の範囲内と考えられる。一部の実施形態ではｒＡＡＶベクターは、非限定的に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンカプシド変異体、ヘパリン結合カプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシドまたはマウスＡＡＶカプシドなどを含むＡＡＶ血清型由来のベクターである。一部の実施形態ではＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２などのＩＴＲを含む。さらなる実施形態ではｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２などのカプシドタンパク質を含む。さらなる実施形態では
ｒＡＡＶ粒子は、Ｃｌａｄｅｓ Ａ－Ｆ由来のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含む（Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４，７８（１２）：６３８１頁）。

【0107】

さまざまなＡＡＶ血清型は、具体的な標的細胞の形質導入を最適化するためまたは具体的な標的組織（例えば、疾患組織）内の特定の細胞型を標的化するために使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。例えばｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含むことができ、またはＡＡＶ２カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ９ ＩＴＲを含むことができる。さらに別の例ではｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９およびＡＡＶ２の両方由来のカプシドタンパク質を含むことができ、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲをさらに含む。ｒＡＡＶ粒子の産生のためのＡＡＶ血清型の任意の組合せは、各組合せが本明細書で明確に述べられた場合と同様に本明細書で提供される。

【0108】

一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲならびにＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ３ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ４ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ５ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ６ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ７ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ８ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ９ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ１１ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、
ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０および／またはＡＡＶ１２のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態ではＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ１２ ＩＴＲならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ
ｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、および／またはＡＡＶ１１のいずれか由来のカプシドタンパク質を含む。

【0109】

自己相補性ＡＡＶウイルスゲノム
一部の態様では本発明は、組換え自己相補的ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。自己相補的ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補的ＡＡＶゲノムの使用方法は、それぞれその全体を参照によって本明細書に組み入れる米国特許第６，５９６，５３５号、７，１２５，７１７号、第７，７６５，５８３号、第７，７８５，８８８号、第７，７９０，１５４号、第７，８４６，７２９号、第８，０９３，０５４号および第８，３６１，４５７号ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記載されている。自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的相補的配列（例えば、導入遺伝子の相補的コードおよび非コード鎖）の長所により２本鎖ＤＮＡ分子を急速に形成する。一部の実施形態では本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供し、ｒＡＡＶゲノムが第１の異種性ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子コード鎖）および第２の異種性ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子の非コードまたはアンチセンス鎖）を含み、第１の異種性ポリヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド配列とその長さの大部分または全てに沿って鎖間塩基対を形成できる。一部の実施形態では第１の異種性ポリヌクレオチド配列と第２の異種性ポリヌクレオチド配列とは、鎖間塩基対合を促進する配列によって連結される；例えばヘアピンＤＮＡ構造。ヘアピン構造は、例えばｓｉＲＮＡ分子において当技術分野において周知である。一部の実施形態では第１の異種性ポリヌクレオチド配列と第２の異種性ポリヌクレオチド配列とは、変異導入ＩＴＲ（例えば正しいＩＴＲ）によって連結される。変異導入ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果としてＡＡＶウイルスゲノムを複製する際に、以下の：ＡＡＶ ＩＴＲ、制御配列を含む第１の異種性ポリヌクレオチド配列、変異導入ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種性ポリヌクレオチドとは逆の方向で第２の異種性ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶ ＩＴＲを５’から３’の順で含む組換えウイルスゲノムがウイルスカプシド中にパッケージングされるようにｒｅｐタンパク質はウイルスゲノムを変異導入ＩＴＲで切断しない。

【0110】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、アデノウイルス粒子である。一部の実施形態ではアデノウイルス粒子は、組換えアデノウイルス粒子、例えば２つのＩＴＲ間に１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、アデノウイルス由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターである。一部の実施形態ではアデノウイルス粒子は、アデノウイルスを複製不全にする１つまたはそれ以上のＥ１遺伝子の欠損コピーを欠失している、または含有している。アデノウイルスは、大きな（約９５０Å）、非エンベロープ正二十面体カプシド内に直鎖の２本鎖ＤＮＡゲノムを含む。アデノウイルスは、３０ｋｂを超える異種性配列を組み込むことができる（例えば、Ｅ１および／またはＥ３領域の代わりに）大きなゲノムを有し、大きな異種性遺伝子での使用に他になく適している。それらはまた、分裂および非分裂細胞に感染することが周知であり、天然では宿主ゲノムに組み込まれない（しかしハイブリッド変種はこの能力を有する場合がある）。一部の実施形態ではアデノウイルスベクターは、Ｅ１の代わりに異種性配列を有する第１世代アデノウイルスベクターである場合がある。一部の実施形態ではアデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、および／またはＥ４に追加の変異または欠失を有する第２世代アデノウイルスベクターである場合がある。一部の実施形態ではアデノウイルスベクターは、すべてのウイルスコード遺伝子を欠失しており、ＩＴＲおよびパッケージングシグナルだけを保持し、複製およびパッケージングのためにトランスでヘルパーアデノウイルスを必要とする第３世代また
はガッティド（ｇｕｔｔｅｄ）アデノウイルスベクターである場合がある。アデノウイルス粒子は、哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションのためのベクターとしておよび遺伝子治療ベクターとしての使用のために調査されている。さらなる記載は、例えば、Ｄａｎｔｈｉｎｎｅ，Ｘ．ａｎｄ Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ，Ｍ．Ｊ．（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７０７～１４頁およびＴａｔｓｉｓ，Ｎ．ａｎｄ Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０：６１６～２９頁を参照されたい。

【0111】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、導入遺伝子を含む核酸を含む組換えアデノウイルス粒子である。任意のアデノウイルス血清型の使用は、本発明の範囲内と考えられる。一部の実施形態では組換えアデノウイルスベクターは、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ５、ＡｄＨｕ７、ＡｄＨｕ１１、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄおよびブタＡｄ３型を非限定的に含むアデノウイルス血清型由来のベクターである。アデノウイルス粒子はまた、カプシドタンパク質も含む。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、１つまたはそれ以上の外来ウイルスカプシドタンパク質との組合せでアデノウイルス粒子を含む。そのような組合せは、偽型化組換えアデノウイルス粒子と称される場合がある。一部の実施形態では偽型化組換えアデノウイルス粒子において使用される外来ウイルスカプシドタンパク質は、外来ウイルスまたは別のアデノウイルス血清型由来である。一部の実施形態では外来ウイルスカプシドタンパク質は、非限定的に、レオウイルス３型を含むもの由来である。偽型化アデノウイルス粒子において使用されるベクターおよびカプシドタンパク質組み合わせの例は、以下の参考文献（Ｔａｔｓｉｓ，Ｎ．ら、（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０（４）：６１６～６２９頁およびＡｈｉ，Ｙ．ら、（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：３０７～３２０頁）において見出すことができる。さまざまなアデノウイルス血清型が、具体的な標的細胞の形質導入を最適化するためまたは具体的な標的組織（例えば、疾患組織）内の特定の細胞型を標的化するために使用される。具体的なアデノウイルス血清型によって標的化される組織または細胞は、非限定的に、肺（例えばＨｕＡｄ３）、脾臓および肝臓（例えばＨｕＡｄ３７）、平滑筋、滑膜細胞、樹状細胞、心血管系細胞、腫瘍細胞株（例えばＨｕＡｄ１１）ならびに樹状細胞（例えばレオウイルス３型で偽型化されたＨｕＡｄ５、ＨｕＡｄ３０またはＨｕＡｄ３５）を含む。さらなる記載についてＡｈｉ，Ｙ．ら、（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：３０７～３２０頁，Ｋａｙ，Ｍ．ら、（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３～４０頁およびＴａｔｓｉｓ，Ｎ．ら、（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０（４）：６１６～６２９頁を参照されたい。

【0112】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。一部の実施形態ではレンチウイルス粒子は、組換えレンチウイルス粒子、例えば１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、レンチウイルス由来ではない核酸配列）を２つのＬＴＲ間に含むポリヌクレオチドベクターである。レンチウイルスは、およそ１０ｋｂのゲノムを有するプラスセンス、ｓｓＲＮＡレトロウイルスである。レンチウイルスは、分裂および非分裂細胞のゲノムに組み込まれることが周知である。レンチウイルス粒子は、例えば複数のプラスミド（典型的にはレンチウイルスゲノムと、複製および／またはパッケージングのために必要な遺伝子とはウイルス複製を妨げるために分離されている）を、修飾レンチウイルスゲノムをレンチウイルス粒子にパッケージングするパッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって産生される。一部の実施形態ではレンチウイルス粒子は、エンベロープタンパク質を欠失している第１世代ベクターを指す場合がある。一部の実施形態ではレンチウイルス粒子はｇａｇ／ｐｏｌおよびｔａｔ／ｒｅｖ領域以外のすべての遺伝子を欠失している第２世代ベクターを指す場合がある。一部の実施形態ではレンチウイルス粒子は、内在性ｒｅｖ、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子だけを含有し、ｔａｔ遺伝子を含まない形質導入のためのキメラＬＴＲを有する第３世代ベクターを指す場合がある（Ｄｕｌｌ，Ｔ
．ら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３～７１頁を参照されたい）。さらなる記載についてＤｕｒａｎｄ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｉｍａｒｅｌｌｉ，Ａ．（２０１１）Ｖｉｒｕｓｅｓ ３：１３２～５９頁を参照されたい。

【0113】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、導入遺伝子を含む核酸を含む組換えレンチウイルス粒子である。任意のレンチウイルスベクターの使用は、本発明の範囲内と考えられる。一部の実施形態ではレンチウイルスベクターは、非限定的にヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス－２（ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジャンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ビスナウイルス（ＶＶ）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含むレンチウイルス由来である。レンチウイルス粒子はまた、カプシドタンパク質も含む。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、レンチウイルスベクターを１つまたはそれ以上の外来ウイルスカプシドタンパク質との組合せで含む。そのような組合せは、偽型化組換えレンチウイルス粒子と称される場合がある。一部の実施形態では偽型化組換えレンチウイルス粒子において使用される外来性ウイルスカプシドタンパク質は、外来性ウイルス由来である。一部の実施形態では偽型化組換えレンチウイルス粒子において使用される外来性ウイルスカプシドタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－ＧＰ）である。ＶＳＶ－ＧＰは、偏在性細胞受容体と相互作用し、偽型化組換えレンチウイルス粒子に対する広範な組織指向性を提供する。付加的にＶＳＶ－ＧＰは、偽型化組換えレンチウイルス粒子へのより高い安定性を提供すると考えられている。他の実施形態では外来性ウイルスカプシドタンパク質は、非限定的に、チャンディプラウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネゼイラウマ脳炎ウイルス、エボラウイルスレストン、エボラウイルスザイール、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、ヒトＴ－リンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ－１）、ヒト泡沫状ウイルス、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、センダイウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、ニワトリペストウイルス（ＦＰＶ）またはオートグラファカリホルニカマルチプル核多核体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を含むものに由来する。偽型化レンチウイルス粒子において使用されるベクターとカプシドタンパク質との組合せの例は、例えばＣｒｏｎｉｎ，Ｊ．ら、（２００５）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７～３９８頁において見出すことができる。さまざまな偽型化組換えレンチウイルス粒子は、具体的な標的細胞の形質導入を最適化するためまたは具体的な標的組織（例えば、疾患組織）内の特異的な細胞型を標的化するために使用される。例えば特異的偽型化組換えレンチウイルス粒子によって標的化される組織は、非限定的に肝臓（例えばＶＳＶ－Ｇ、ＬＣＭＶ、ＲＲＶもしくはＳｅＶ Ｆタンパク質で偽型化されている）、肺（例えばエボラ、マールブルグ、ＳｅＶ ＦおよびＨＮ、またはＪＳＲＶタンパク質で偽型化されている）、膵島細胞（例えばＬＣＭＶタンパク質で偽型化されている）、中枢神経系（例えばＶＳＶ－Ｇ、ＬＣＭＶ、狂犬病またはモコラタンパク質で偽型化されている）、網膜（例えばＶＳＶ－Ｇもしくはモコラタンパク質で偽型化されている）、単球または筋肉（例えばモコラもしくはエボラタンパク質で偽型化されている）、造血系（例えばＲＤ１１４もしくはＧＡＬＶタンパク質で偽型化されている）またはがん細胞（例えばＧＡＬＶもしくはＬＣＭＶタンパク質で偽型化されている）を含む。さらなる記載について、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｊ．ら、（２００５）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７～３９８頁およびＫａｙ，Ｍ．ら、（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３～４０頁を参照されたい。

【0114】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）粒子である。一部の実施形態ではＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ粒子、例えば２つのＴＲの間に１つまたはそれ以上の異種性配列（すなわち、レンチウイルス由来の核酸配列ではない）を含むポリヌクレオチドベクターである。ＨＳＶは、およそ１５２ｋｂのゲノムを有するエンベロープ付き、２本鎖ＤＮＡウイルスである。有利なことに、その遺伝子のおよそ半分は必須ではなく、異種性配列に適応するために欠失することができる。ＨＳＶ粒子は、非分裂細胞に感染する。付加的にそれらは、天然でニューロン中の潜伏を確立し、逆行性輸送によって移動し、シナプス間を移行でき、ニューロンのトランスフェクションおよび／または神経系に関与する遺伝子治療手法のためにそれらを有利にしている。一部の実施形態ではＨＳＶ粒子は、複製欠損または複製適格（例えば、１つまたはそれ以上の後期遺伝子の不活性化を通じて単一複製サイクルについて適格性）である場合がある。さらなる記載について、Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉ，Ｒ．ら、（２０１０）Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．４：１２３～５６頁を参照されたい。

【0115】

一部の実施形態ではウイルス粒子は、導入遺伝子を含む核酸を含むｒＨＳＶ粒子である。任意のＨＳＶベクターの使用は、本発明の範囲内と考えられる。一部の実施形態ではＨＳＶベクターは、非限定的にＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２を含むＨＳＶ血清型由来である。ＨＳＶ粒子はまた、カプシドタンパク質も含む。一部の実施形態では組換えウイルス粒子は、ＨＳＶベクターを１つまたはそれ以上の外来性ウイルスカプシドタンパク質との組合せで含む。そのような組合せは、偽型化ｒＨＳＶ粒子と称される場合がある。一部の実施形態では偽型化ｒＨＳＶ粒子において使用される外来性ウイルスカプシドタンパク質は、外来性ウイルス由来または別のＨＳＶ血清型由来である。一部の実施形態では偽型化ｒＨＳＶ粒子において使用される外来性ウイルスカプシドタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－ＧＰ）である。ＶＳＶ－ＧＰは偏在性細胞受容体と相互作用し、偽型化ｒＨＳＶ粒子に対する広範な組織指向性を提供する。付加的にＶＳＶ－ＧＰは、偽型化ｒＨＳＶ粒子へのより高い安定性を提供すると考えられている。他の実施形態では外来性ウイルスカプシドタンパク質は、異なるＨＳＶ血清型由来であってよい。例えばＨＳＶ－１ベクターは、１つまたはそれ以上のＨＳＶ－２カプシドタンパク質を含有する場合がある。さまざまなＨＳＶ血清型は、具体的な標的細胞の形質導入を最適化するためまたは具体的な標的組織（例えば、疾患組織）内の特定の細胞型を標的化するために使用される。具体的なアデノウイルス血清型によって標的化される組織または細胞は、非限定的に中枢神経系およびニューロン（例えばＨＳＶ－１）を含む。さらなる記載について、Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉ，Ｒ．ら、（２０１０）Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ Ｊ ４：１２３～１５６頁，Ｋａｙ，Ｍ．ら、（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３～４０頁およびＭｅｉｇｎｉｅｒ，Ｂ．ら、（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５（５）：９２１～９３０頁を参照されたい。

【0116】

Ｖ．ウイルスベクターの産生
トランスフェクション、安定細胞株産生ならびにアデノウイルスＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルスＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０～８７８９頁）およびバキュロウイルスＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む多数の方法が、ｒＡＡＶベクターの産生のために当技術分野において周知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養はすべて；１）例えばＨｅＬａ、Ａ５４９もしくは２９３細胞などのヒト由来細胞株またはバキュロウイルス産生系の場合はＳＦ－９などの昆虫由来細胞株を含む好適な宿主細胞；２）野生型もしくは変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスなど）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスまたはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される好適なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産生物；４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を端に有する導入遺伝子（治療用導入遺伝子など）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持する好適な培
地および培地構成成分を必要とする。一部の実施形態ではＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産生物は、任意のＡＡＶ血清型由来である。必須ではなく一般的にＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産生は、ｒｅｐ遺伝子産生物がｒＡＡＶゲノムを複製およびパッケージングするように機能できる限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型のものである。当技術分野において周知の好適な培地は、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用される。これらの培地は、非限定的に、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むＨｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって産生される培地、特に組換えＡＡＶベクターの産生における使用のためのカスタム培地製剤に関してそれぞれその全体を参照によって本明細書に組み入れる米国特許第６，５６６，１１８号に記載のものなどのカスタム製剤、および米国特許第６，７２３，５５１号に記載のＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含む。一部の実施形態ではＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態ではＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は昆虫細胞（例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。

【0117】

本発明の好適なｒＡＡＶ産生培養培地は、血清または血清由来組換えタンパク質を０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで補充される場合がある。代替的に当技術分野において周知のとおり、ｒＡＡＶベクターは動物由来成分不含有培地とも称される無血清条件で産生される。ｒＡＡＶベクターの産生を支持するように設計された商業的またはカスタム培地は、産生培養物中のｒＡＡＶの力価を増加させるためのグルコース、ビタミン、アミノ酸およびまたは増殖因子を非限定的に含む当技術分野において周知の１つまたはそれ以上の細胞培養構成成分を補充されることを当業者は認識する。

【0118】

一部の態様では本発明は、空のカプシドが低減しているｒＡＡＶ粒子を調製するための方法であって、ａ）ｒＡＡＶ産生のために好適な条件下で宿主細胞を培養する工程であって、細胞はｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを端に有する異種性導入遺伝子をコードする核酸、ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域を含む核酸であり、変異導入ｐ５プロモーターを含み、ｐ５プロモーターからの発現が野生型ｐ５プロモーターと比較して低減されている核酸、およびｉｉｉ）ＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸を含む工程；ｂ）ｒＡＡＶ粒子を放出するように宿主細胞を溶解する工程；ｃ）宿主細胞によって産生されたｒＡＡＶ粒子を単離する工程；ならびにｄ）空のカプシドおよび／または変種のゲノムを有するｒＡＡＶ粒子の存在について上に記載の分析超遠心分離法によってｒＡＡＶ粒子を分析する工程を含む、空のカプシドが低減されたｒＡＡＶ粒子を調製するための方法を提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ領域をコードする核酸のｐ５プロモーターは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐコード領域の３’に位置付けられている。一部の実施形態ではＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域をコードする核酸は、プラスミドｐＨＬＰ、ｐＨＬＰ１９またはｐＨＬＰ０９である（それぞれの内容はその全体を本明細書に組み入れる米国特許第５，６２２，８５６号；第６，００１，６５０号；第６，０２７，９３１号；第６，３６５，４０３号；第６，３７６，２３７号；および第７，０３７，７１３号を参照されたい）。一部の実施形態ではＡＡＶヘルパーウイルス機能は、アデノウイルスＥ１Ａ機能、アデノウイルスＥ１Ｂ機能、アデノウイルスＥ２Ａ機能、アデノウイルスＶＡ機能およびアデノウイルスＥ４ ｏｒｆ６機能を含む。

【0119】

ｒＡＡＶ産生培養物は、利用される具体的な宿主細胞に好適な種々の条件下（広い温度範囲で、さまざまな時間にわたってなど）で増殖される。当技術分野において周知のとおり、ｒＡＡＶ産生培養は接着依存培養を含み、例えば回転ボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリアおよび充填ベッドまたは流動ベッドバイオリアクターなどの好適な接着依存容器で培養できる。ｒＡＡＶベクター産生培養物は、例えばスピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクターおよびウェーブバッグシステムなどのディスポーザブルシステム
を含む種々の方法で培養できるＨｅＬａ、２９３およびＳＦ－９細胞などの懸濁適合宿主細胞も含む。

【0120】

本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、産生培養物の宿主細胞の溶解によってまたは、細胞がインタクトな細胞から培地へのｒＡＡＶ粒子の放出を生じることが当技術分野において周知である条件下で培養される場合、産生培養物からの消費培地の収集によってｒＡＡＶ産生培養物から収集できる、さらに完全に米国特許第６，５６６，１１８号に記載のとおり）。細胞を溶解する好適な方法は、当技術分野において周知であり、例えば複数回の凍結／融解周期、超音波処理、顕微溶液化ならびに界面活性剤などの化学物質および／またはプロテアーゼでの処理を含む。

【0121】

多数の方法が、アデノウイルスベクター粒子の産生のために当技術分野において周知である。例えばガッティドアデノウイルスベクター、アデノウイルスベクターゲノムおよびヘルパーアデノウイルスゲノムは、パッケージング細胞株（例えば２９３細胞株）にトランスフェクトできる。一部の実施形態ではヘルパーアデノウイルスゲノムは、そのパッケージングシグナルに隣接する組換え部位を含有でき、両ゲノムは、目的のアデノウイルスベクターがヘルパーアデノウイルスよりもさらに効率的にパッケージングされるようにリコンビナーゼ（例えばＣｒｅ／ｌｏｘＰ系が使用される）を発現しているパッケージング細胞株にトランスフェクトされる（例えば、Ａｌｂａ，Ｒ．ら、（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１８－２７を参照されたい）。アデノウイルスベクターは、本明細書に記載のものなどの標準的方法を使用して収集および精製できる。

【0122】

多数の方法が、レンチウイルスベクター粒子の産生のために当技術分野において周知である。例えば第３世代レンチウイルスベクターのために、目的のレンチウイルスゲノムをｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子と共に含有するベクターは、パッケージング細胞株（例えば２９３細胞株）にｒｅｖ遺伝子を含有するベクターと共に同時トランスフェクトされる。目的のレンチウイルスゲノムは、Ｔａｔの非存在下で転写を促進するキメラＬＴＲも含有する（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３～７１頁を参照されたい）。レンチウイルスベクターは、本明細書に記載の方法（例えば、Ｓｅｇｕｒａ ＭＭ，ら、（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（７）：９８７～１０１１頁）を使用して収集および精製できる。

【0123】

多数の方法が、ＨＳＶ粒子の産生のために当技術分野において周知である。ＨＳＶベクターは、本明細書に記載のものなどの標準的方法を使用して収集および精製できる。例えば複製欠損ＨＳＶベクターのために、最初期（ＩＥ）遺伝子のすべてを欠失している目的のＨＳＶゲノムは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７およびＩＣＰ０などのウイルス産生のために必要な遺伝子を提供する補完細胞株にトランスフェクトされる（例えば、Ｓａｍａｎｉｅｇｏ，Ｌ．Ａ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３３０７～２０頁を参照されたい）。ＨＳＶベクターは、記載の方法を使用して収集および精製できる（例えば、Ｇｏｉｎｓ，ＷＦら、（２０１４）Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３～７９頁）。

【0124】

ＶＩ．ｒＡＡＶベクターの精製
収集の際に、本発明のｒＡＡＶ産生培養物は、以下の（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；および（７）例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリンおよび他の低分子量タンパク質を含む培地構成成分、の１つまたはそれ以上を含有できる。付加的にｒＡＡＶ産生培養物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２からなる群から選択
されるＡＡＶカプシド血清型を有するｒＡＡＶ粒子をさらに含む。一部の実施形態ではｒＡＡＶ産生培養物は、空のＡＡＶカプシド（例えば、カプシドタンパク質を含むがｒＡＡＶゲノムを含まないｒＡＡＶ粒子）をさらに含む。一部の実施形態ではｒＡＡＶ産生培養物は、変種ｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子（例えば、インタクトな全長ｒＡＡＶゲノムとは異なるｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子）をさらに含む。一部の実施形態ではｒＡＡＶ産生培養物は、切断型ｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子をさらに含む。一部の実施形態ではｒＡＡＶ産生培養物は、ＡＡＶカプシド化ＤＮＡ不純物を含むｒＡＡＶ粒子をさらに含む。

【0125】

一部の実施形態ではｒＡＡＶ産生培養収集物は、宿主細胞デブリを除去して清澄化される。一部の実施形態では産生培養収集物は、例えばｇｒａｄｅ ＤＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄ Ｆｉｌｔｅｒ、ｇｒａｄｅ Ａ１ＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄ Ｆｉｌｔｅｒおよび０．２μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ１Ｏ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ＳＨＣ親水性膜フィルターを含む一連のデプスフィルターを通じたろ過によって清澄化される。清澄化は、遠心分離または、当技術分野において周知の０．２μｍまたはさらに大きなポアサイズの任意のセルロースアセテートフィルターを通じたろ過などの当技術分野において周知の種々の他の標準的技術によっても達成される。

【0126】

一部の実施形態ではｒＡＡＶ産生培養収集物は、産生培養物中に存在するいかなる高分子量ＤＮＡも消化するためにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）でさらに処理される。一部の実施形態ではＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化は、例えば最終濃度１～２．５単位／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、周囲温度から３７℃の範囲の温度で３０分間から数時間を含む当技術分野において周知の標準的条件下で実施される。

【0127】

ｒＡＡＶ粒子は、以下の精製工程：平衡遠心分離；フロースルーアニオン交換ろ過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するための接線流ろ過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；ならびにアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉、の１つまたはそれ以上を使用して単離または精製される。これらの工程は、単独で、種々の組合せでまたはさまざまな順序で使用される。一部の実施形態では方法は、下に記載の順ですべての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えばＸｉａｏら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２頁、米国特許第６，９８９，２６４号および第８，１３７，９４８号およびＷＯ２０１０／１４８１４３において見出される。アデノウイルス粒子を精製するための方法は、例えばＢｏ，Ｈら、（２０１４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６７Ｃ：１１９～１２５頁に見出される。レンチウイルス粒子を精製するための方法は、例えばＳｅｇｕｒａ ＭＭら、（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（７）：９８７～１０１１頁に見出される。ＨＳＶ粒子を精製するための方法は、例えばＧｏｉｎｓ，ＷＦら、（２０１４）Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３～７９頁に見出される。

【実施例0128】

本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに完全に理解される。しかしそれらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示的目的のみのためであり、その観点から種々の改変または変更は当業者に示唆され、本出願の趣旨および管理範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。

【実施例0129】

分析超遠心分離法による組換えアデノ随伴ウイルスベクター調製物の特徴付け
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それらを遺伝子治療のためのベクターとして魅力的なものにする特性を有する。野生型ＡＡＶは、会合、複製および感染のために必要なすべての構造および制御エレメントをコードする２個の翻訳領域（ｒｅｐおよびｃａｐ）からなる。ｒｅｐ ＯＲＦは、ゲノム複製機能を有するＲｅｐ７８および６８タンパク質ならびに、１本鎖複製およびパッケージングに関与するＲｅｐ５２および４０タンパク質をコードする。ｃａｐ ＯＲＦは、３個の構造カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。組換えＡＡＶベクターは、「ガットレス」ベクター手法（Ｘｉａｏ，Ｘら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：２２２４～２２３２頁）を使用する三重トランスフェクション法によって典型的には産生された。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は治療用遺伝子で置き換えられ、その制御エレメントは、５’および３’末端逆位配列（ＩＴＲ）の間に挟まれ、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は別々のプラスミドにトランスで提供され、第３のプラスミドは必要とされるアデノウイルスヘルパー遺伝子に寄与する。ウイルスカプシドは、完全に会合し、次いでＩＴＲ隣接ベクターゲノムは、カプシドポアを介してカプシドに挿入されることが想定された（Ｍｙｅｒｓ，ＭＷ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，ＢＪ，１９８０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０２：７１～８２頁）。生じたカプシドの集団は、ゲノム不含有カプシド（空のカプシド）およびゲノム含有カプシドの両方を含有した。付加的にカプシドは、組換えウイルスゲノムの不完全な一部を含有する場合があった。ベクター調製物は、次いで細胞デブリからカプシドを単離するための親和性クロマトグラフィーによって精製され、アニオン交換クロマトグラフィーによってインタクトなベクターについて濃縮するためにさらに処理された。

【0130】

遺伝子治療における使用のための近年の承認に基づいて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、新規バイオ医薬製品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）の重要なクラスとして現れた。ＡＡＶベクター製品の生成は、製品の品質を均一性、純度および製造の整合性に関してモニターする分析方法を必要とするが、今日までにＡＡＶベクター特徴付けを支持する方法は確立されていない。この要求に応えるために、ＡＡＶベクターの均一性を特徴付けるための技術としての分析超遠心分離法（ＡＵＣ）の潜在的使用を調査した。

【0131】

方法
サンプル調製
正確なＡＵＣ評価を支持するために、ベクター産生物（ＡＡＶ２導入遺伝子２）を高度に精製し、適切に緩衝し、５ｘ１０^１１ｖｇ／ｍＬより高く濃縮した。これを達成するために細胞上清実行物をＡＶＢ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、１０Ｋ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＢＳ、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。産生物濃度を分光光学的方法による２６０ｎｍ（ＯＤ_２６０）での光学密度測定によって決定した。再現性のある一致したＡＵＣデータを作成するためにサンプル調整を、２６０ｎｍでの光学密度測定によって０．１から１．０の標的濃度に、ＰＢＳでの直接希釈またはＡｍｉｃｏｎ
Ｕｌｔｒａ－０．５／３０Ｋ ＭＷＣＯ遠心フィルターデバイスを使用するさらなる濃縮によってのいずれかで行った。

【0132】

沈降速度ＡＵＣデータ取得
沈降速度分析超遠心分離法（ＳＶ－ＡＵＣ）分析をＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＸＬ－Ｉ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して実施した。４００μＬサンプルを２個のセクター速度セルのサンプルセクターにロードし、４００μＬ ＰＢＳを対応する参照セクターにロードした。サンプルを４穴ローターに置き、２０℃の温度まで装置内で
平衡化し、高真空を約１時間維持した。沈降速度遠心分離を、２０，０００ｒｐｍ、２０℃、０．００３ｃｍ半径工程設定で、遅延なし、反復なしで実施した。吸光度（２６０ｎｍ）およびレイリー干渉光学を、最小沈降構成成分が光学ウインドウを透明化するまで（１．２時間）半径方向の濃度を時間の関数として同時に記録するために使用した。アッセイ処理量は、１分間より長い吸光度スキャン回収時間ならびにＡＡＶの大きなサイズおよび急速な沈降に基づいて実行１回あたり単一のサンプルに限定した。

【0133】

ＡＵＣデータ分析
完全カプシド百分率をＳＥＤＦＩＴ（ＮＩＨ／ ａｎａｌｙｔｉｃａｌｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ｃｏｍのワールドワイドウエブを参照されたい）継続的サイズＣ（Ｓ）分布モデルを使用して各検出方法からのおよそ７５スキャンを分析することによって決定した。二次（２^ｎｄ）微分正則化をＦ統計＝０．６８の信頼レベルを有するフィッティングに適用した。以下のＣ（Ｓ）パラメーターを一定に保った：分解能＝２００Ｓ、Ｓｍｉｎ＝１、Ｓｍａｘ＝２００および摩擦比＝１．０。ＲＩおよびＴＩノイズサブトラクションを適用し、メニスカス位置を移行させ、ソフトウェアに最適な位置を選ばせた。このモデルはデータをラム方程式にフィットさせ、得られたサイズ分布は、フリンジの単位またはＯＤ_２６０単位で濃度に比例する各ピーク下面積を有するクロマトグラムに似た「沈降係数の分布」であった。沈降係数（スベドベルグ単位）および相対濃度（ＯＤ単位）を分布中の各構成成分について決定した。各ＡＵＣ実行は独立アッセイであり、各分析を結果の品質を確実にするために以下の特質についてモニターした：適合度（ｒｍｓｄ）、各ピークについてのＯＤ_{２６０ｎｍ}／フリンジにおける干渉シグナルの比（Ａ２６０／ＩＦ比）、実行間での各種についての沈降係数の一致性およびスキャンの全体的品質。

【0134】

吸光度光学（２６０ｎｍ）
消衰係数を吸光度データからインタクトなベクターのモル濃度およびピークの実際の百分率値を算出するために使用した。空のカプシド（Ε_２６０／_カプシド＝３．７２ｅ６）およびインタクトなベクター（Ε_２６０／_ベクター＝３．００ｅ７）の両方についてのモル吸光度消衰係数を公開された式（Ｓｏｍｍｅｒら、（２００３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，７：１２２～８頁）に基づいて算出した。消衰係数は、空のカプシドおよびインタクトなベクターピークについて利用可能であった。Ｃ（Ｓ）値は、Ｓｃｈｕｃｋ（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６～１９頁に記載されたＳＥＤＦＩＴアルゴリズムを使用して決定した。インタクトなベクターおよび空のカプシドの両方のモル濃度をベールの法則を使用して算出し、完全カプシドの百分率をこれらの値から算出した。値は完全カプシドの百分率で報告した。

【0135】

ＡＵＣ標準曲線の生成
未知のサイズおよび配列の断片化ゲノムの消衰係数を実験的に決定することは不可能であることから、Ｓ値とゲノムサイズとの関係を確立した。これを達成するために、周知のヌクレオチドサイズを有するカプシド化されたウイルスゲノムを含むｒＡＡＶベクター調製物をＡＵＣによって分析し、対応するＳ値を上に記載のとおり決定した。

【0136】

一過性トランスフェクションによるｒＡＡＶの産生
組換えＡＡＶベクターを「ガットレス」ベクター手法（Ｘｉａｏ，Ｘら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：２２２４～２２３２頁）を使用する三重トランスフェクション法によって産生した。この手法ではｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は治療用遺伝子で置き換えられ、その制御エレメントは、５’および３’末端逆位配列（ＩＴＲ）の間に挟まれた。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は別々のプラスミドにトランスで提供され、第３のプラスミドは必要とされるアデノウイルスヘルパー遺伝子に寄与する。理論に束縛されることなく、ウイルスカプシドは、完全に会合し、次いでＩＴＲ隣接ベクターゲノムは、カプシドポアを介し
てカプシドに挿入されることが想定された（Ｍｙｅｒｓ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０２：７１～８２頁）。生じたカプシドの集団は、ゲノム不含有カプシド（空のカプシド）およびゲノム含有カプシドの両方を含有していた。

【0137】

産生細胞プラットホームによるｒＡＡＶの産生
ＡＡＶ産生細胞株は、臨床用ｒＡＡＶベクターを生成するために使用される代替的産生プラットホームである。この方法で懸濁中での培養に適合されたＨｅＬａ Ｓ３細胞をベクター配列および選択可能マーカーに加えてベクター複製およびパッケージングのために必要なＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の組み込まれたコピーを有するように操作した（例えばＰｕｒｏ：Ｔｈｏｒｎｅら、（２００９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０：７０７～１４頁を参照されたい）。複製のために必要なヘルパー機能を提供するＷＴアデノウイルスで感染させると、細胞は続くイオン交換クロマトグラフィーを使用する精製工程の際に除去された組換えＡＡＶベクターおよびアデノウイルスを産生した。

【0138】

他の方法
合成導入遺伝子を最適なプロモーターおよびウシ増殖ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ｐｏｌｙＡ）を含有するプラスミドにクローニングした。次いで導入遺伝子発現カセット全体を、ＡＡＶ２末端逆位配列を含有するプレウイルスプラスミドベクターｐＡＡＶＤＣ６４にクローニングした。それぞれの発現プラスミド中の得られたＡＡＶゲノムの合計サイズは（ＩＴＲを端に有する領域を含む）は４～４．６ｋｂであった。組換えベクターをｒｅｐ２／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー機能、ｐＡｄヘルパー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ＵＳＡ）を発現するヘルパープラスミドを使用する２９３細胞の三重トランスフェクションによって産生した。ｒｅｐ／ｃａｐヘルパーはＡＡＶ血清型２由来のｒｅｐを発現し、一方ｃａｐ配列は以下の配列の１つをコードした：ＡＡＶ ｃａｐ １、２、５、９またはｒｈ８Ｒ。ベクターを親和性クロマトグラフィーによって精製し、一部の場合では空の粒子を除去するためにさらに精製した（例えばＱｕら、（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４０：１８３～９２頁を参照されたい）。

【0139】

結果
古典的境界沈降速度を使用する分析超遠心分離法（ＡＵＣ）を組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター調製物の粒子不均一性を明らかにするために使用した。完全ゲノムを含む２０％ｒＡＡＶ２粒子および８０％空のカプシドを含有する混合物を、精製した空のカプシドと精製したゲノム含有カプシドとを規定の比で混合することによって作製した。空のカプシドおよび完全カプシドは三重トランスフェクション産生後に空のカプシドおよび完全カプシドの混合物のＣｓＣｌ_２グラジエント精製によって生成した。遠心力への応答でのｒＡＡＶ２粒子の移動をモニターするために、ｒＡＡＶ２カプシドのこの混合物を規定の時間間隔で遠心分離場に沿って２６０ｎｍ吸光度をスキャンした。図１Ａは、ＡＡＶ２混合物の２０，０００ｒｐｍ、１．２時間（最小沈降種が光学ウインドウを透明化するまで）での遠心分離後の代表的なスキャンプロファイルを示す。スキャンは、ｒＡＡＶ２ベクター調製物中の構成分ベクター粒子の完全な移行パターンを明らかにする一連の濃度スキャンを得るための、時間ｔでの半径ｒの関数としての濃度データの取得を表した。これらのシグモイド曲線または境界では、曲線の前縁はより速く沈降する種（すなわちゲノム含有ｒＡＡＶ２カプシド）を表し、後縁はより遅く沈降する種（すなわち「空の」ｒＡＡＶ２カプシド）を表す（図１Ａ）。

【0140】

微分沈降係数分布値、Ｃ（Ｓ）を沈降係数（スベドベルグ単位、Ｓ）に対してプロットすることは、空のカプシドおよびゲノム含有カプシド種の両方について固有の沈降係数を有する異なるピークをもたらした（図１Ｂ）。Ｃ（Ｓ）値をＳｃｈｕｃｋ（２０００）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，７８：１６０６～１９頁に記載のＳＥＤＦＩＴアルゴリズを使用し
て決定した。吸光度データから各カプシド種についてのモル濃度および百分率値を算出するために、消衰係数を表２に従って使用した。

【0141】

【表3】

【0142】

空のカプシド（ε_２６０／_{カプシド＝}３．７２ｅ６）およびゲノム含有カプシド（ε_２６０／_{カプシド＝}３ｅ７）両方についてのモル吸光度消衰係数をゲノムサイズおよび公開された式（Ｓｏｍｍｅｒら、２００３）を使用して算出した。次いでゲノム含有カプシドおよび空のカプシドの両方のモル濃度をベールの法則を使用して算出した。各種のモル濃度は、全てのカプシドの百分率として表されるその相対存在を算出するために使用した（図１）。これらの結果は、不均一なベクター調製物から空のカプシドとゲノム含有カプシドとを正確に識別し、定量するためにＡＵＣを使用できることを実証した。

【0143】

図１に示すｒＡＡＶ２ベクター調製物について、完全ゲノムを含有するカプシドは、９４Ｓで沈降するピークによって表され、ベクター調製物の２１％を占めた。空のカプシドは６４ＳのＳ値で沈降し、ベクター調製物の７９％を占めた。これらの沈降係数値は、空の（図２Ａ）またはゲノム含有粒子の純粋な集団のＡＵＣ分析によって確認された（図２Ｂ）。ｒＡＡＶ２空のカプシドの純粋な集団のＡＵＣプロファイルは、６４Ｓの沈降係数を有する単一のピークを明らかにした一方で、ｒＡＡＶ２ＡＵＣゲノム含有カプシドの純粋な集団のＡＵＣプロファイルは、９４Ｓのより高い沈降係数を有する単一のピークを明らかにした。これらの結果は、不均一な調製物から生じた値と一致し、ＡＵＣ法をゲノム含有カプシドおよび空のＡＡＶカプシドを両方の種を含有する不均一な調製物から定量するために使用できることをさらに確認した。

【0144】

ＡＵＣ法を、表３に示すとおり、同じベクターサンプル（ｓｃＡＡＶ２／９ＬＰ２）の５回の独立したＡＵＣ実行を実施することによって再現性についてさらに評価した。ゲノム含有カプシドおよび空のＡＡＶ２カプシドの両方についての沈降係数は、０．５～０．６％の変動で係数をもたらして高度に再現性があった。同様にゲノム含有カプシドの相対存在（合計の百分率として表される）は、係数のおよそ２％の変動を有して決定された。これらの結果は、ゲノム含有カプシドおよび空のＡＡＶ２カプシドを定量するためのＡＵＣ法が高度に再現性があり、整合がある値をもたらすことを示した。

【0145】

【表4】