特開 2024-113106 抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024113106

(43)【公開日】2024-08-21

(54)【発明の名称】抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240814BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240814BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20240814BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20240814BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240814BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20240814BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 G

G01N33/543 501A

G01N33/536 A

G01N33/543 511A

G01N33/536 C

G01N33/536 E

G01N33/536 D

C07K16/18 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

C07K16/18

【審査請求】有

【請求項の数】33

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024092086

(22)【出願日】2024-06-06

(62)【分割の表示】P 2023212198の分割

【原出願日】2019-07-26

(31)【優先権主張番号】P 2018140912

(32)【優先日】2018-07-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】307010166

【氏名又は名称】第一三共株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】相馬 雅子

(72)【発明者】

【氏名】久我 洋

(72)【発明者】

【氏名】益田 剛

(72)【発明者】

【氏名】河村 淳子

(72)【発明者】

【氏名】石橋 裕美

(72)【発明者】

【氏名】安田 哲

(57)【要約】      （修正有）

【課題】エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いて、哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法の提供。
【解決手段】下式で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体－薬物コンジュゲートの、薬物部位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いて、上記の抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法。

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法であって、
前記抗体が、
式

【化1】

で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体－薬物コンジュゲートの、薬物部位を認識する抗体であり、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項2】

抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式

【化2】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式

【化3】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式

【化4】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が２から８の範囲である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数の違いによって該抗体－薬物コンジュゲートに対する認識性が実質的に異ならない、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法であって、
前記抗体が、
式

【化5】

で示される薬物を認識する抗体であり、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項8】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法であって、
前記抗体が、
式

【化6】

で示される薬物を認識する抗体であり、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項9】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法であって、
前記抗体が、
式

【化7】

で示される薬物を認識する抗体であり、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項10】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法であって、
前記抗体が、
式

【化8】

で示される薬物を認識する抗体であり、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項11】

前記抗体が、配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含んでなる抗体であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体が、マウス抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体が、配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記抗体が、キメラ抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記抗体が、ウサギキメラ化抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

前記抗体が、配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

前記抗体が、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体であり、
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記抗体が、配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記抗体が、配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記抗体が、薬物への認識性について、
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体と競合する抗体であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法であって、
前記抗体が、
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項22】

前記抗体が、配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記抗体が、配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

（１）抗体－薬物コンジュゲートの標的抗原が固相化されたプレートに血漿中の抗体－薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）マーカーで標識化された、前記抗体を該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

（１）前記抗体が固相化されたプレートに血漿中の抗体－薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該抗体－薬物コンジュゲートの抗体部位を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物の血漿中濃度を定量する方法であって、
前記抗体が、
式

【化9】

で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体－薬物コンジュゲートの、薬物部位を認識する抗体であり、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項27】

（１）前記抗体が固相化されたプレートに、マーカーで標識化された競合薬物の存在下で、血漿中の抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物を接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

抗体を用いて、抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を確認する方法であって、
前記抗体が、
式

【化10】

で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体－薬物コンジュゲートの、薬物部位を認識する抗体であり、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であり、
前記抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＴＲＯＰ２抗体ではない、
方法。

【請求項29】

（１）組織中の抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物を前記抗体と接触させ複合体を形成させるステップ、（２）前記抗体を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

（１）組織中の抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物を、マーカーで標識化された前記抗体と接触させ複合体を形成させるステップ、次いで（２）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記マーカーが蛍光物質であり、該マーカーの検出が該マーカーの発する蛍光を感知することにより行われる、請求項２４、２５、２７、２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

前記マーカーが酵素であり、該マーカーの検出が該酵素と基質との反応により生じる発光又は発色を感知することにより行われる、請求項２４、２５、２７、２９又は３０に記載の方法。

【請求項33】

前記マーカーが発光物質であり、該マーカーの検出が電気化学反応に基づく該マーカーの発光を感知することにより行われる、請求項２４、２５、２７、２９又は３０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体－薬物コンジュゲートの薬物部
位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いて、上記の抗体－薬物コンジュゲートを投与さ
れた哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組
織分布を確認する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

がん細胞表面に発現する抗原に結合し、かつ細胞に内在化できる抗体に、細胞毒性を有
する薬物を結合させた抗体－薬物コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ； ＡＤＣ）は、がん細胞に選択的に薬物を送達できることによって、がん
細胞内に薬物を蓄積させ、がん細胞を死滅させることが期待できる（非特許文献１～５）
。

【0003】

低分子化合物や抗体と同様に、抗体－薬物コンジュゲートの医薬品開発においても薬物
動態試験（ＰＫ試験）の実施は不可欠である。動物におけるＰＫ試験結果と薬理試験結果
及び安全性試験結果との相関関係を把握した上で、ヒトにおけるＰＫ試験を行うことによ
り、臨床試験デザインの策定やヒトでの有効性及び安全性の考察に有用な情報を取得でき
るためである。

【0004】

抗体－薬物コンジュゲートのＰＫ試験は、投薬後の抗体－薬物コンジュゲートの血漿中
濃度を定量することを基本に行われる。抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量す
るための方法としてＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。例えば、（１）抗原が固相化さ
れたプレートに抗体－薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２
）該抗体－薬物コンジュゲートを認識することができ、マーカーで標識化された蛋白質を
該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）酵素反応等に
よる発色・発光等により該マーカーを検出するステップ、を経ることにより、抗体－薬物
コンジュゲートの血漿中濃度を定量することができる。

【0005】

しかし、抗体－薬物コンジュゲートの抗体部位を認識する蛋白質を用いた場合、薬物を
保持した状態の抗体－薬物コンジュゲートのみならず、薬物が遊離した状態の抗体－薬物
コンジュゲート（すなわち、実質的に抗体部位のみとなったもの）も含めた血漿中濃度が
算出され、正確な定量を行うことができない。

【0006】

抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質を用いたＥＬＩＳＡ法により、
抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法が知られている（非特許文献６～
１１）。

【0007】

抗体－薬物コンジュゲートの一つとして、抗体とトポイソメラーゼＩ阻害剤であるエキ
サテカンの誘導体を構成要素とする抗体－薬物コンジュゲートが知られている（特許文献
１～７、非特許文献１２～１５）。これらの抗体－薬物コンジュゲートは、優れた抗腫瘍
効果と安全性を有することから、現在、臨床試験が進行中である。

【0008】

上記のエキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体－薬物コンジュゲートについて、薬
物を保持した状態での血漿中濃度を定量する方法は知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第2014/057687号

【特許文献2】国際公開第2014/061277号

【特許文献3】国際公開第2015/098099号

【特許文献4】国際公開第2015/115091号

【特許文献5】国際公開第2015/146132号

【特許文献6】国際公開第2015/155976号

【特許文献7】国際公開第2015/155998号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.

【非特許文献2】Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.

【非特許文献3】Damle N. K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.

【非特許文献4】Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.

【非特許文献5】Howard A. et al., J Clin Oncol 29: 398-405.

【非特許文献6】Xie H. et al., J Pharmacol Exp Ther. (2004) 308(3), 1073-1082.

【非特許文献7】Sanderson RJ. et al., Clinical Cancer Research (2005) Vol.11, 843-852.

【非特許文献8】Stephan JP. et al., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1673-1683.

【非特許文献9】Stephan JP. et al., Bioanalysis (2011) 3(6), 677-700.

【非特許文献10】Kaur S. et al., Bioanalysis (2013) 5(2), 201-226.

【非特許文献11】Dere R. et al., Bioanalysis (2013) 5(9), 1025-1040.

【非特許文献12】Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research (2016) 22(20), 5097-5108.

【非特許文献13】Ogitani Y. et al., Cancer Science (2016) 107, 1039-1046.

【非特許文献14】Doi T, et al., Lancet Oncol 2017; 18: 1512-22.

【非特許文献15】Takegawa N, et al., Int. J. Cancer: 141, 1682-1689 (2017).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体－薬物コンジュゲートの薬物部
位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いて、上記の抗体－薬物コンジュゲートを投与さ
れた哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組
織分布を確認する方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、特定の免疫スクリーニ
ングにより取得された蛋白質が、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体－薬物コン
ジュゲートの薬物部位を特異的に認識することを見出した。また、該蛋白質を用いた、上
記の抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲ
ートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法を確立した。

【0013】

すなわち、本発明は、以下の［１］～［５１］を提供する。
［１］
式

【0014】

【化1】

【0015】

で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体－薬物コンジュゲートの、
薬物部位を認識する蛋白質。
［２］
抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式

【0016】

【化2】

【0017】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によっ
て結合している）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［３］
抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式

【0018】

【化3】

【0019】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によっ
て結合している）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［４］
抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式

【0020】

【化4】

【0021】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によっ
て結合している）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［５］
抗体－薬物コンジュゲートが、式

【0022】

【化5】

【0023】

（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あた
りの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［６］
抗体－薬物コンジュゲートが、式

【0024】

【化6】

【0025】

（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あた
りの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［７］
抗体－薬物コンジュゲートが、式

【0026】

【化7】

【0027】

（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あた
りの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［８］
抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が２から
８の範囲である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［９］
抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＴＲ
ＯＰ２抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、又は抗ＣＤＨ６抗体である、［１］
～［８］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［１０］
抗体－薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数の違いに
よって該抗体－薬物コンジュゲートに対する認識性が実質的に異ならない、［１］～［９
］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［１１］
式

【0028】

【化8】

【0029】

で示される薬物を認識する蛋白質。
［１２］
式

【0030】

【化9】

【0031】

で示される薬物を認識する蛋白質。
［１３］
式

【0032】

【化10】

【0033】

で示される薬物を認識する蛋白質。
［１４］
式

【0034】

【化11】

【0035】

で示される薬物を認識する蛋白質。
［１５］
抗体であることを特徴とする、［１］～［１４］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［１６］
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるア
ミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ
Ｈ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列
番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸
配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるア
ミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ
Ｈ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列
番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸
配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示される
アミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤ
ＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配
列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ
酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示され
るアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる
ＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ
１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミ
ノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１５］
に記載の蛋白質。
［１７］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖
可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のア
ミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１
６］に記載の蛋白質。
［１８］
マウス抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［１９］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖
及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［２０］
キメラ抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［２１］
ウサギキメラ化抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。

【0036】

［２２］
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖
及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［２３］
［１９］又は［２２］に記載の抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失してい
る抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２４］
［１９］又は［２２］に記載の抗体のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つ
アミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２５］
［１９］又は［２２］に記載の抗体のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つ
アミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２６］
薬物への認識性について、［１９］又は［２２］に記載の抗体と競合する抗体であるこ
とを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２７］
［１５］～［２６］のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片であることを特徴とす
る、［１］～［１４］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［２８］
抗体の抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’又はＦｖである、［２７］
に記載の蛋白質。
［２９］
［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体－薬物コンジュゲート
を投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方
法。
［３０］
（１）抗体－薬物コンジュゲートの標的抗原が固相化されたプレートに血漿中の抗体－
薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）マーカーで標識化さ
れた、［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形
成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とす
る、［２９］に記載の方法。
［３１］
（１）［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質が固相化されたプレートに血漿
中の抗体－薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該抗体－
薬物コンジュゲートの抗体部位を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋
白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出
するステップ、を含むことを特徴とする、［２９］に記載の方法。
［３２］
［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体－薬物コンジュゲート
を投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物の血漿中
濃度を定量する方法。
［３３］
（１）［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質が固相化されたプレートに、マ
ーカーで標識化された競合薬物の存在下で、血漿中の抗体－薬物コンジュゲートから遊離
した薬物を接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該マーカーを検出するステップ
、を含むことを特徴とする、［３２］に記載の方法。
［３４］
［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体－薬物コンジュゲート
を投与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コ
ンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を確認する方法。
［３５］
（１）組織中の抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから
遊離した薬物を［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質と接触させ複合体を形成
させるステップ、（２）［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を認識すること
ができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させる
ステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、［３
４］に記載の方法。

【0037】

［３６］
（１）組織中の抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから
遊離した薬物を、マーカーで標識化された［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白
質と接触させ複合体を形成させるステップ、次いで（２）該マーカーを検出するステップ
、を含むことを特徴とする、［３４］に記載の方法。
［３７］
マーカーが発色試薬であり、該マーカーの検出が該マーカーの発色を感知することによ
り行われる、［３０］、［３１］、［３３］、［３５］又は［３６］に記載の方法。
［３８］
マーカーが酵素であり、該マーカーの検出が該酵素と基質との反応により生じた発光又
は発色を感知することにより行われる、［３０］、［３１］、［３３］、［３５］又は［
３６］に記載の方法。
［３９］
マーカーが発光物質であり、該マーカーの検出が電気化学反応に基づく該マーカーの発
光を感知することにより行われる、［３０］、［３１］、［３３］、［３５］又は［３６
］に記載の方法。
［４０］
［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
［４１］
［４０］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［４２］
［４０］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
［４３］
［４１］に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
［４４］
［４２］又は［４３］に記載の宿主細胞を培養する工程、次いで、前記培養工程で得ら
れた培養産物から蛋白質を精製する工程、を含む、［１］～［２８］のいずれか１項に記
載の蛋白質の製造方法。
［４５］
［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を含む組成物。
［４６］
［１］～［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質、又は［４５］に記載の組成物を含む
キット。
［４７］
抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、抗体－薬物コンジュゲート
及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物の血漿中濃度を定量するための
、［４６］に記載のキット。
［４８］
抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、抗体－薬物コンジュゲート
及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を確認するための、
［４６］に記載のキット。
［４９］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖
可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のア
ミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含んでなる抗体。
［５０］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖
及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖を含んでなる、［４９］に記載の抗体。
［５１］
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖
及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖を含んでなる、［４９］に記載の抗体。

【発明の効果】

【0038】

本発明により、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体－薬物コンジュゲートの薬
物部位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いた、上記の抗体－薬物コンジュゲートを投
与された哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及
び組織分布を確認する方法が提供された。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。

【図2】マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。

【図3】マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。

【図4】マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。

【図5】ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。

【図6】ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。

【図7】抗ＨＥＲ２抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。

【図8】抗ＨＥＲ２抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。

【図9】抗ＨＥＲ３抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。

【図10】抗ＨＥＲ３抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。

【図11】抗ＴＲＯＰ２抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。

【図12】抗ＴＲＯＰ２抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。

【図13】抗Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。

【図14】抗Ｂ７－Ｈ３抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。

【図15】マウス抗体１Ａ３をキャプチャー試薬とした場合における、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図16】マウス抗体８Ｂ２をキャプチャー試薬とした場合における、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図17】マウス抗体１１Ｂ１をキャプチャー試薬とした場合における、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図18】マウス抗体１Ａ３を検出試薬とした場合における、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図19】マウス抗体８Ｂ２を検出試薬とした場合における、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図20】マウス抗体１１Ｂ１を検出試薬とした場合における、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図21】マウス抗体１Ａ３を検出試薬とした場合における、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【0040】

【図22】マウス抗体８Ｂ２を検出試薬とした場合における、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図23】マウス抗体１１Ｂ１を検出試薬とした場合における、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。

【図24】ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定のための検量線を示す。

【図25】ＨＥＲ３－ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定のための検量線を示す。

【図26】ＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定のための検量線を示す。

【図27】Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定のための検量線を示す。

【図28】ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す。

【図29】ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。

【図30】ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す。

【図31】抗ＧＰＲ２０抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。

【図32】抗ＧＰＲ２０抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。

【図33】抗ＣＤＨ６抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。

【図34】抗ＣＤＨ６抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。

【図35】ウサギキメラ化抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。ヒト頭頸部がん細胞株ＦａＤｕを皮下移植したヌードマウスにＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）又はＡｎｔｉ－ＴＲＯＰ２ Ａｂを投与した場合の染色像を比較している。

【図36】ウサギキメラ化抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。ＧＰＲ２０過剰発現ヒト消化管間質腫瘍細胞株ＧＩＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０を皮下移植したヌードマウスにＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）を投与した場合、又は未投与の場合の染色像を比較している。

【図37】マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。淡明細胞型腎細胞癌患者より採取された腫瘍組織を皮下移植したヌードマウスにＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ）を投与した場合、又は未投与の場合の染色像を比較している。

【図38】マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。淡明細胞型腎細胞癌患者より採取された腫瘍組織を皮下移植したヌードマウスにＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ）を投与し、マウス抗体１Ａ３を化合物（２）又はＳＮ－３８とあらかじめ混合した後、免疫染色に用いた場合、又は、そうでない場合の染色像を比較している。

【図39】ＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定のための検量線を示す。

【図40】ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）のヒト血清中濃度測定のための検量線を示す。

【図41】マウス抗体１Ａ３のＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）への認識に対する競合阻害用化合物の阻害率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0041】

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実
施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これによって本発明の
範囲が狭く解釈されることはない。

【0042】

１．定義
本発明において、「蛋白質」とは、「ペプチド」又は「ポリペプチド」と同義である。

【0043】

本発明の蛋白質は、好適には、抗体又は抗体の抗原結合断片であるが、抗体と同様に抗
原を認識する機能を有する蛋白質であれば、抗体及び抗体の抗原結合断片以外の蛋白質（
抗体オルタナティブ）であっても良い。抗体オルタナティブとしては、例えば、Ｆｉｂｒ
ｏｎｅｃｔｉｎ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ、ＴｒｘＡ、Ａ－ｄｏｍａｉｎ
、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ、ＡＰＰＩ、Ｒａｓ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＡＦ－６等のス
キャフォールド蛋白を挙げることができる（Kasper Binz H. et al., Current Opinion i
n Biotechnology 2005, 16:459-469、Kasper Binz H. et al., Nature Biotechnology 23
(10) 2005, 1257-1268、Skerra A., Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:295-3
04、Nygren P., FEBS Journal 275 (2008) 2668-2676、Gronwall C. et al., Journal of
Biotechnology 140 (2009) 254-269）。

【0044】

本発明において、「抗体」とは、特定の抗原を認識する機能を有する糖蛋白質を示す。
抗体の具体例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ウサギ
化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体等を挙げることができる。

【0045】

本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。

【0046】

本発明において、「抗体の抗原結合断片」とは、抗原を認識する機能を保持した抗体の
部分断片を意味し、「抗体の機能性断片」と同義である。抗体の抗原結合断片としては、
例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、一本鎖免疫グロブリン等を挙げ
ることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の機能性断片は、抗体
の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、
組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。

【0047】

本発明の蛋白質が抗原を「認識する」とは、本発明の蛋白質が分子間力（静電相互作用
、ファンデルワールス力、水素結合等）により抗原と結合することを意味する。本発明の
蛋白質が抗原を「認識する」ことは、例えば、種々の免疫化学的手法により生じるシグナ
ルを検出することにより確認することができる。

【0048】

本発明の蛋白質の抗原に対する「認識性」が異なる、とは、本発明の蛋白質の抗原に対
する結合の強さや性質が実質的に異なることを意味する。本発明の蛋白質の抗原に対する
「認識性」が異なるか否かは、例えば、種々の免疫化学的手法により生じるシグナルの強
さを比較することや、抗原の濃度とシグナルの強さの相関関係を表した検量線を比較する
ことにより確認することがきできる。

【0049】

本発明の蛋白質が認識する「部位」とは、本発明の蛋白質が認識する対象の中の特定の
部分構造を意味する。本発明の蛋白質が認識する対象を「抗原」と呼び、本発明の蛋白質
が認識する特定の部位を「エピトープ」と呼ぶこともある。

【0050】

抗体の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅ
ｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。
相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）とも呼ば
れ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり
、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離し
ている。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重
鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖
の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤ
ＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、抗原に対する特異性を
決定している。

【0051】

本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が
含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードす
るヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、
オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含
まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ
鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキ
シリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本
鎖または三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。

【0052】

本発明において、「ヌクレオチド」と「核酸」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等も「ヌクレオチド」
の意味に含まれる。かかるヌクレオチドは一本鎖、二本鎖または三本以上の鎖からなるヌ
クレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレ
オチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのような
ヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本以上の鎖の会合体も「ヌクレオチド」の意味に含
まれる。

【0053】

本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培
養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。

【0054】

２．抗体－薬物コンジュゲート
本発明において「抗体－薬物コンジュゲート」とは、抗体と薬物とが、リンカーを介し
て結合した結合体を意味する。

【0055】

本発明において「薬物リンカー」とは、抗体－薬物コンジュゲートのうち、リンカー及
び薬物からなる部分構造を意味する。

【0056】

本発明の蛋白質は、式

【0057】

【化12】

【0058】

で示される薬物（以下、「化合物（１）」と呼ぶ）と、抗体とが、リンカーを介して結合
した抗体－薬物コンジュゲート（以下、「本発明に係る抗体－薬物コンジュゲート」と呼
ぶ）の、薬物部位を認識することを特徴とする。

【0059】

化合物（１）は、エキサテカン（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エ
チル－５－フルオロ－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－９－ヒドロキシ－４
－メチル－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ
［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン、（化学名：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ
－９－エチル－５－フルオロ－２，３－ジヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１Ｈ，
１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノ
リン－１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）－ジオンとして表すこともできる））と呼ばれる抗腫
瘍薬であり、トポイソメラーゼＩ阻害活性を有することが知られている。

【0060】

なお、本発明の蛋白質は、化合物（１）そのものを認識することもできる。

【0061】

本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体は、特に制限はないが、例えば、
抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗ＣＤ３抗体
、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ９８抗体
、抗ＤＲ５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＰＨＡ２抗体、抗ＦＧＦＲ２抗体、抗ＦＧＦＲ４
抗体、抗ＦＯＬＲ１抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ７
０抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗Ａ３３抗体、
抗ＣａｎＡｇ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭ
Ｂ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体
、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗ＣＤＨ６抗体を挙げることができ、好適には、抗ＨＥＲ２抗
体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗
ＣＤＨ６抗体を挙げることができる。

【0062】

本発明において、「抗ＨＥＲ２抗体」とは、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ ２； ＥｒｂＢ－２）
に特異的に結合し、好ましくは、ＨＥＲ２と結合することによってＨＥＲ２発現細胞に内
在化する活性を有する抗体を示す。

【0063】

抗ＨＥＲ２抗体としては、例えば、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（米国
特許第５８２１３３７号）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（国際公開第０１／
００２４５号）を挙げることができ、好適にはトラスツズマブを挙げることができる。

【0064】

本発明において、「抗ＨＥＲ３抗体」とは、ＨＥＲ３（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａ
ｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ ３； ＥｒｂＢ－３）
に特異的に結合し、好ましくは、ＨＥＲ３と結合することによってＨＥＲ３発現細胞に内
在化する活性を有する抗体を示す。

【0065】

抗ＨＥＲ３抗体としては、例えば、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ； Ｕ３－１
２８７）、Ｕ１－５９（国際公開第２００７／０７７０２８号）、ＭＭ－１２１（Ｓｅｒ
ｉｂａｎｔｕｍａｂ）、国際公開２００８／１００６２４号記載の抗ＥＲＢＢ３抗体、Ｒ
Ｇ－７１１６（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、及びＬＪＭ－７１６（Ｅｌｇｅｍｔｕｍａ
ｂ）を挙げることができ、好適には、パトリツマブ、及びＵ１－５９を挙げることができ
る。

【0066】

本発明において、「抗ＴＲＯＰ２抗体」とは、ＴＲＯＰ２（ＴＡＣＳＴＤ２：Ｔｕｍｏ
ｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ２
； ＥＧＰ－１）に特異的に結合し、好ましくは、ＴＲＯＰ２と結合することによってＴ
ＲＯＰ２発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。

【0067】

抗ＴＲＯＰ２抗体としては、例えば、ｈＴＩＮＡ１－Ｈ１Ｌ１（国際公開第２０１５／
０９８０９９号）を挙げることができる。

【0068】

本発明において、「抗Ｂ７－Ｈ３抗体」とは、Ｂ７－Ｈ３（Ｂ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇ
ｅｎ ＃７ ｈｏｍｏｌｏｇ ３； ＰＤ－Ｌ３； ＣＤ２７６）に特異的に結合し、好
ましくは、Ｂ７－Ｈ３と結合することによってＢ７－Ｈ３発現細胞に内在化する活性を有
する抗体を示す。

【0069】

抗Ｂ７－Ｈ３抗体としては、例えば、Ｍ３０－Ｈ１－Ｌ４（国際公開第２０１４／０５
７６８７号）を挙げることができる。

【0070】

本発明において、「抗ＧＰＲ２０抗体」とは、ＧＰＲ２０（Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏ
ｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２０）に特異的に結合し、好ましくは、ＧＰＲ２０と結
合することによってＧＰＲ２０発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。

【0071】

抗ＧＰＲ２０抗体としては、例えば、ｈ０４６－Ｈ４ｅ／Ｌ７（国際公開第２０１８／
１３５５０１号）を挙げることができる。

【0072】

本発明において、「抗ＣＤＨ６抗体」とは、ＣＤＨ６（Ｃａｄｈｅｒｉｎ－６）に特異
的に結合し、好ましくは、ＣＤＨ６と結合することによってＣＤＨ６発現細胞に内在化す
る活性を有する抗体を示す。

【0073】

抗ＣＤＨ６抗体としては、例えば、Ｈ０１Ｌ０２（国際公開第２０１８／２１２１３６
号）を挙げることができる。

【0074】

本発明の蛋白質は、好適には、
式

【0075】

【化13】

【0076】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によっ
て結合している）
で示される薬物リンカーを有する抗体－薬物コンジュゲート（以下、「抗体－薬物コンジ
ュゲート（Ｉ）」と呼ぶ）、
式

【0077】

【化14】

【0078】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によっ
て結合している）
で示される薬物リンカーを有する抗体－薬物コンジュゲート（以下、「抗体－薬物コンジ
ュゲート（ＩＩ）」と呼ぶ）、又は、
式

【0079】

【化15】

【0080】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によっ
て結合している）
で示される薬物リンカーを有する抗体－薬物コンジュゲート（以下、「抗体－薬物コンジ
ュゲート（ＩＩＩ）」と呼ぶ）の、薬物部位を特異的に認識することを特徴とする。

【0081】

抗体－薬物コンジュゲート（Ｉ）～（ＩＩＩ）の薬物リンカーは、抗体の鎖間のジスル
フィド結合部位（２箇所の重鎖－重鎖間、及び２箇所の重鎖－軽鎖間）において生じたチ
オール基（言い換えれば、システイン残基の硫黄原子）に結合している。

【0082】

本発明の蛋白質は、より好適には、抗体－薬物コンジュゲート（Ｉ）の薬物部位を特異
的に認識することを特徴とする。

【0083】

抗体－薬物コンジュゲート（Ｉ）は、次式で示すこともできる。

【0084】

【化16】

【0085】

ここで、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している。また、ｎはい
わゆる平均薬物結合数（ＤＡＲ； Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ）と
同義であり、１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す。

【0086】

なお、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートの抗体一分子あたりの平均薬物結合数の
算出は、例えば、２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長における抗体－薬物コンジュゲート
とそのコンジュゲーション前駆体のＵＶ吸光度を測定することにより算出する方法（ＵＶ
法）や、抗体－薬物コンジュゲートを還元剤で処理し得られた各フラグメントをＨＰＬＣ
測定により定量し算出する方法（ＨＰＬＣ法）により行うことができる。

【0087】

抗体－薬物コンジュゲート（Ｉ）は、がん細胞内に移行した後にリンカー部分が切断さ
れ、
式

【0088】

【化17】

【0089】

で表される化合物（以下、「化合物（２）」と呼ぶ）を遊離する。

【0090】

化合物（２）は、本発明で使用される抗体－薬物コンジュゲートのリンカー部分が切断
されることにより生じると考えられる、
式

【0091】

【化18】

【0092】

で表される化合物（以下、「化合物（３）」と呼ぶ）のアミナール構造が分解することに
より生じると考えられる。

【0093】

化合物（２）は、抗体－薬物コンジュゲート（Ｉ）の抗腫瘍活性の本体であると考えら
れ、トポイソメラーゼＩ阻害作用を有することが確認されている（Ogitani Y. et al., C
linical Cancer Research, 2016, Oct 15;22(20):5097-5108, Epub 2016 Mar 29）。

【0094】

なお、本発明の蛋白質は、抗体－薬物コンジュゲート（Ｉ）から遊離した化合物（２）
そのものを認識することもできる。

【0095】

抗体－薬物コンジュゲート（ＩＩ）は、次式で示すこともできる。

【0096】

【化19】

【0097】

ここで、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している。また、ｎはＤ
ＡＲと同義であり、１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す。

【0098】

抗体－薬物コンジュゲート（ＩＩ）は、がん細胞内に移行した後にリンカー部分が切断
され、
式

【0099】

【化20】

【0100】

で表される化合物（以下、「化合物（４）」と呼ぶ）を遊離する。

【0101】

なお、本発明の蛋白質は、抗体－薬物コンジュゲート（ＩＩ）から遊離した化合物（４
）そのものを認識することもできる。

【0102】

抗体－薬物コンジュゲート（ＩＩＩ）は、次式で示すこともできる。

【0103】

【化21】

【0104】

ここで、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している。また、ｎはＤ
ＡＲと同義であり、１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す。

【0105】

抗体－薬物コンジュゲート（ＩＩＩ）は、がん細胞内に移行した後にリンカー部分が切
断され、
式

【0106】

【化22】

【0107】

で表される化合物（以下、「化合物（５）」と呼ぶ）を遊離する。

【0108】

なお、本発明の蛋白質は、抗体－薬物コンジュゲート（ＩＩＩ）から遊離した化合物（
５）そのものを認識することもできる。

【0109】

本発明において、「抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体－
薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＨＥＲ２抗体である抗体－薬物コンジュゲートを示
す。

【0110】

抗ＨＥＲ２抗体は、好適には、配列番号２１においてアミノ酸番号１乃至４４９に記載
のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号１乃至２１４に記載
のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、配列番号２１に記載のアミノ酸配
列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体で
ある。

【0111】

抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、
好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であ
り、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。

【0112】

抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１５／１１５０９１号等の記
載を参考に製造することができる。

【0113】

本発明において、「抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体－
薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＨＥＲ３抗体である抗体－薬物コンジュゲートを示
す。

【0114】

抗ＨＥＲ３抗体は、好適には、配列番号２３においてアミノ酸番号２６乃至３５に記載
のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２３においてアミノ酸番号５０乃至６５に
記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２３においてアミノ酸番号９８乃
至１０６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号２４に
おいてアミノ酸番号２４乃至３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２
４においてアミノ酸番号５６乃至６２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配
列番号２４においてアミノ酸番号９５乃至１０３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ
３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号２３においてアミノ酸番号１乃至１１７に記載のアミノ酸配列
からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２４においてアミノ酸番号１乃至１１３
に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２４
に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル
末端のリシン残基が欠失している抗体である。

【0115】

抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、
好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であ
り、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。

【0116】

抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１５／１５５９９８号等の記
載を参考に製造することができる。

【0117】

本発明において、「抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体
－薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＴＲＯＰ２抗体である抗体－薬物コンジュゲート
を示す。

【0118】

抗ＴＲＯＰ２抗体は、好適には、配列番号２５においてアミノ酸番号５０乃至５４に記
載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５においてアミノ酸番号６９乃至８５
に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２５においてアミノ酸番号１１
８乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号２
６においてアミノ酸番号４４乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番
号２６においてアミノ酸番号７０乃至７６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及
び配列番号２６においてアミノ酸番号１０９乃至１１７に記載のアミノ酸配列からなるＣ
ＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配
列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２６においてアミノ酸番号２１乃至１
２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ
酸配列からなる重鎖及び配列番号２６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミ
ノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン
残基が欠失している抗体である。

【0119】

抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は
、好適には２から８であり、より好適には３から５であり、更により好適には３．５から
４．５であり、更により好適には約４である。

【0120】

抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１５／０９８０９９号等の
記載を参考に製造することができる。

【0121】

本発明において、「抗Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体
－薬物コンジュゲートにおける抗体が抗Ｂ７－Ｈ３抗体である抗体－薬物コンジュゲート
を示す。

【0122】

抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、好適には、配列番号２７においてアミノ酸番号５０乃至５４に記
載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２７においてアミノ酸番号６９乃至８５
に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２７においてアミノ酸番号１１
８乃至１３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号２
８においてアミノ酸番号４４乃至５３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番
号２８においてアミノ酸番号６９乃至７５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及
び配列番号２８においてアミノ酸番号１０８乃至１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣ
ＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配
列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至１
２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ
酸配列からなる重鎖及び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミ
ノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン
残基が欠失している抗体である。

【0123】

抗Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は
、好適には２から８であり、より好適には３から５であり、更により好適には３．５から
４．５であり、更により好適には約４である。

【0124】

抗Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１４／０５７６８７号等の
記載を参考に製造することができる。

【0125】

本発明において、「抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体
－薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＧＰＲ２０抗体である抗体－薬物コンジュゲート
を示す。

【0126】

抗ＧＰＲ２０抗体は、好適には、配列番号３２においてアミノ酸番号４５乃至５４に記
載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３２においてアミノ酸番号６９乃至７８
に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３２においてアミノ酸番号１１
８乃至１３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号３
３においてアミノ酸番号４４乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番
号３３においてアミノ酸番号７０乃至７６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及
び配列番号３３においてアミノ酸番号１０９乃至１１７に記載のアミノ酸配列からなるＣ
ＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号３２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配
列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号３３においてアミノ酸番号２１乃至１
２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号３２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ
酸配列からなる重鎖及び配列番号３３においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミ
ノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン
残基が欠失している抗体である。

【0127】

抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は
、好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８で
あり、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。

【0128】

抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１８／１３５５０１号等の
記載を参考に製造することができる。

【0129】

本発明において、「抗ＣＤＨ６抗体－薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体－
薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＣＤＨ６抗体である抗体－薬物コンジュゲートを示
す。

【0130】

抗ＣＤＨ６抗体は、好適には、配列番号３４においてアミノ酸番号４５乃至５４に記載
のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３４においてアミノ酸番号６９乃至７８に
記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３４においてアミノ酸番号１１８
乃至１３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号３５
においてアミノ酸番号４４乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号
３５においてアミノ酸番号７０乃至７６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
配列番号３５においてアミノ酸番号１０９乃至１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤ
ＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号３４においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配
列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号３５においてアミノ酸番号２１乃至１
２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号３４においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ
酸配列からなる重鎖及び配列番号３５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミ
ノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン
残基が欠失している抗体である。

【0131】

抗ＣＤＨ６抗体－薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、
好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であ
り、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。

【0132】

抗ＣＤＨ６抗体－薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１８／２１２１３６号等の記
載を参考に製造することができる。

【0133】

３．本発明の蛋白質の製造
本発明の蛋白質は、好適には抗体（以下、「本発明の抗体」と呼ぶ）として取得するこ
とができる。本発明の抗体は、化合物（１）又はその誘導体とキャリア蛋白とがリンカー
を介して結合した抗原蛋白質を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製する
ことによって得ることができる。

【0134】

上記の抗原蛋白質は、例えば、
式

【0135】

【化23】

【0136】

で表される化合物（以下、「化合物（６）と呼ぶ」）に、キャリア蛋白を付加したものを
用いることができる。

【0137】

キャリア蛋白としては、低分子化合物やペプチドのような小さな抗原であっても免疫応
答を誘発できるような蛋白質であれば特に限定はされないが、例えば、ウシサイログロブ
リン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びＫｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍ
ｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）を用いることができる。

【0138】

得られた抗血清は、陽性対照及び陰性対照を用いたＥＬＩＳＡ法により、所望の性質を
有するものを選別することができる。

【0139】

陽性対照としては、例えば、化合物（１）、化合物（２）、化合物（６）を挙げること
ができ、これらの陽性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を選
別することができる。

【0140】

なお、化合物（１）が有するラクトン環は、酸性水性溶媒中（例えばｐＨ３程度）では
閉環体に平衡が偏り、塩基性水性溶媒中（例えばｐＨ１０程度）では開環体に平衡が偏る
ことが知られているが、ラクトン環の開閉に関係なく化合物（１）の基本骨格そのものを
認識する抗体を選別する観点から、ラクトン環が還元された化合物、例えば、
式

【0141】

【化24】

【0142】

で表される化合物（以下、「化合物（７）と呼ぶ」）も陽性対照として用いることができ
、この陽性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を選別すること
ができる。ただし、化合物（１）と化合物（７）を同程度に認識する抗体を選別する観点
から、化合物（１）よりも化合物（７）への認識性が特に高い抗体は除外することが好ま
しい。

【0143】

さらに、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲート（好適には、抗体－薬物コンジュゲー
ト（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ））も陽性対照として用いることができ、これらの陽
性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を選別することができる
。

【0144】

一方、化合物（１）の基本骨格から離れた部分を認識する抗体を除外する観点から、例
えば、リンカー付近の部分構造である、シクロヘキサン環からなる化合物である、
式

【0145】

【化25】

【0146】

で表される化合物（以下、「化合物（８）と呼ぶ」）を陰性対照として用いることができ
る。この陰性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を除外するこ
とができる。

【0147】

以上のようにして選別した抗血清をクローニングすることにより、本発明の抗体を産生
する細胞を取得することができる。

【0148】

次に、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature (1975)256,p.495-497、Ken
net,R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press,N.Y.(1980)）に従って、
本発明の抗体を産生する細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマ
を樹立し、モノクローナル抗体を得ることができる。このような方法の具体的な例は、国
際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット（２００９年４月１６日公開）及び第ＷＯ
１０／１１７０１１号（２０１０年１０月１４日公開）パンフレットに記載されている。

【0149】

得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質
で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、
フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電
点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Strate
gies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual, D
aniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)、Antibod
ies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laborator
y(1988)）が、これらに限定されるものではない。

【0150】

クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフ
ィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ア
フィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテ
インＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ
，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる
。また、抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製すること
も可能である。

【0151】

さらに、本発明の抗体は、好適には、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートにおける
１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数（ＤＡＲ）の違いによって該抗体－薬物コンジ
ュゲートに対する認識性が実質的に異ならないことを特徴とする。このような性質を有す
る抗体であることは、例えば、高ＤＡＲ（ＤＡＲ８）の抗体－薬物コンジュゲートに対す
る検量線と、低ＤＡＲ（ＤＡＲ４）の抗体－薬物コンジュゲートに対する検量線を比較し
、実質的に差異がないことにより確認することができる。

【0152】

このようにして取得された本発明の抗体の実例としては、マウス抗体１Ａ３を挙げるこ
とができる。マウス抗体１Ａ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５においてア
ミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列で示され、これをコードするヌクレオチ
ド配列は配列番号１７においてヌクレオチド番号５８乃至４２３に記載のヌクレオチド配
列で示される。マウス抗体１Ａ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６において
アミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列で示され、これをコードするヌクレオ
チド配列は配列番号１８においてヌクレオチド番号６１乃至３８１に記載のヌクレオチド
配列で示される。

【0153】

本発明の抗体は、マウス抗体１Ａ３に由来する６種全てのＣＤＲ配列を保持し、且つ、
本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を特異的に認識する抗体であればよい
。ＣＤＲ配列の決定には、数種の方法が知られており、例えば、Ａｂｍの定義、Ｃｈｏｔ
ｈｉａの定義、Ｋａｂａｔの定義、及びＩｍｇｔ（登録商標）（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
（登録商標））の定義を挙げることができる。本発明の抗体のＣＤＲ配列はいずれの方法
によって定義されたものでもよい。

【0154】

Ａｂｍの定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ
酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧＭＶ）、配列番号２に示されるアミノ酸配
列からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配
列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、本発明の抗体の
軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶ
ＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ
）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）
を保有している。

【0155】

Ｃｈｏｔｈｉａの定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に示され
るアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹ）、配列番号８に示されるアミノ酸
配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＳＧＳＳＡ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列から
なるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、本発明の抗体の軽鎖可
変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡ
ＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）、及
び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有
している。

【0156】

Ｋａｂａｔの定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるア
ミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＧＭＶ）、配列番号１０に示されるアミノ酸配列か
らなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹＹＡＤＴＶＫＧ）、及び配列番号３に示される
アミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、本発
明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（Ｋ
ＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡ
ＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳ
ＹＰＶＴ）を保有している。

【0157】

Ｉｍｇｔ（登録商標）の定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号１１
に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧ）、配列番号１２に示さ
れるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＩＳＳＧＳＳＡＩ）、及び配列番号１３に示され
るアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＡＲＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており
、本発明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ
Ｌ１（ＱＤＶＧＳＡ）、ＷＡＳ（トリプトファン－アラニン－セリン）で示されるトリペ
プチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３
（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有している。

【0158】

本発明の抗体には、上記のモノクローナル抗体に加え、異種抗原性を低下させること等
を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ
）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、又はウサギ化（Ｒａｂｂｉｔ ｔｙｐｅ）
抗体、マウス化抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することが
できる。

【0159】

キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウ
ス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げるこ
とができる（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984)参照）。また、他の例と
してはマウス又はラット由来の抗体の可変領域をウサギ由来の定常領域に接合したキメラ
抗体（ウサギキメラ化抗体）を挙げることができる。

【0160】

ウサギキメラ化抗体の更に具体的な例としてはマウス抗体１Ａ３由来の重鎖可変領域と
ウサギ抗体重鎖の定常領域を含むことからなる重鎖、並びに、マウス抗体１Ａ３抗体由来
の軽鎖可変領域とウサギ抗体軽鎖の定常領域を含むことからなる軽鎖を含むことからなる
抗体（ウサギキメラ化抗体１Ａ３）を挙げることができる。ウサギキメラ化抗体１Ａ３の
重鎖は配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなり
、ウサギキメラ化抗体１Ａ３の軽鎖は配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３
に記載のアミノ酸配列からなる。

【0161】

がん研究の非臨床動物モデルとしてマウスが使用されることが多いが、マウス抗体を用
いた場合、内因性のマウスＩｇＧとの競合を避けるために使用方法が限定的となってしま
う。そこで、ウサギキメラ化抗体を用いることにより、マウス由来サンプル、ヒト由来サ
ンプルの両者を同一プラットフォームで比較評価が可能となり、トランスレーショナル研
究に有用となりえる。

【0162】

ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Nature
(1986)321,p.522-525参照）、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基
もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット）を挙げる
ことができる。ウサギ化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみをウサギ由来の抗体に組み込
んだ抗体、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もウサギ抗体に移植
した抗体を挙げることができる。

【0163】

なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失
することが知られており（Journal of Chromatography A,705:129-134(1995)）、また、
同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカル
ボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Analytical
Biochemistry,360:75-83(2007)）。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体
の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）には
影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシ
ル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体
（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等を挙げること
ができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗
体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を
構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれ
か一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の
量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得る
が、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのア
ミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。

【0164】

本発明の抗体は、本発明の抗体の性質が維持されていれば、マウス抗体１Ａ３又はウサ
ギキメラ化抗体１Ａ３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性（好適には、少なくと
も９９％の同一性）を持つアミノ酸配列からなる抗体であってもよい。

【0165】

二種類のアミノ酸配列間の同一性は、Ｂｌａｓｔ（Nucl. Acids Res., 25, p.3389-340
2(1997)）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂ
ｌａｓｔは、インターネットでwww. ncbi. nlm. nih. gov/blastにアクセスすることによ
っても使用することができる。

【0166】

また、本発明の抗体は、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物部位への
認識性について、マウス抗体１Ａ３又はウサギキメラ化抗体１Ａ３と競合する抗体であっ
てもよい。

【0167】

以上の方法によって得られた抗体は、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートにおける
薬物部位への認識性について評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を
比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カ
ロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ
）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定
し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保
存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Lori Burton,
et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273）、熱安
定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標とし
ては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙
げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないの
で、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、最も適した抗体を選抜する必要があ
る。

【0168】

また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノ
グロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方
法も知られている（Lee, H-S, et al., Molecular Immunology (1999) 36, p.61-71、Sh
irrmann, T. et al., mAbs (2010), 2, (1) p.1-4）。このような一本鎖イムノグロブリ
ンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持す
ることが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有
さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏ
ｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれ
ており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告され
ている（Muyldemans S. et al., Protein Eng. (1994) 7(9), 1129-35、Hamers-Casterma
n C. et al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8）。上記の抗体は、本発明における抗体
の抗原結合性断片の一種と解釈することも可能である。

【0169】

抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な
宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては
、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする
遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖
配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり
、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用
する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、
（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. Cell (1981) 23
, p.175-182、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220）を挙げることができる。また
、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの
細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によっ
て収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬として
の生産が容易なものを選別することが可能である。

【0170】

本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２
，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇ
Ｅ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１
又はＩｇＧ２を挙げることができる。

【0171】

また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合性断片又はその修飾物
であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは
抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることに
よって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子
の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合性断片と呼ぶことができ
る。

【0172】

例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦ
ｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（
ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げ
ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の
断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。

【0173】

さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異
性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即
ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「
多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包
含するものである。

【0174】

本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ
（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（
ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作
製することができる（Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539）。

【0175】

本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる
（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113（Rosenberg及びMoore
編、Springer Verlag, New York, p.269-315(1994)、Nature Biotechnology (2005), 23,
p.1126-1136)。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製される
ＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。

【0176】

一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，
９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号
、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と
軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリ
ンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(19
88), 85, p.5879-5883）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗
体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリ
ンカーとしては、例えば１２～１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。

【0177】

ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ
、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は
所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー
対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードす
るＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組
み合わせて増幅することにより得られる。

【0178】

また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクタ
ー、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また
、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗
体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができ
る。

【0179】

本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化
する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する
複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと
２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン－へリック
スモチーフの導入等を挙げることができる。

【0180】

本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗体の混合物である、ポリクローナ
ル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の
抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗
体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る
（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。

【0181】

抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体
を使用することもできる。

【0182】

本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（
Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放
射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Nature Bio
technology (2005) 23, p.1137-1146）。

【0183】

４．本発明の蛋白質の使用
本発明の蛋白質は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂ
ｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法、ＥＣＬ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ
）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍ
ｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、Ｃ
ＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃ
ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、及びＦＣＭ（Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）などの検出方法、並びに免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）法に利用することができ、好適には、ＥＬＩＳＡ法、ＥＣ
Ｌ法、並びにＩＨＣ法に利用することができる。

【0184】

ＥＬＩＳＡ法及びＥＣＬ法としては、例えば、本発明の抗体－薬物コンジュゲートを投
与された哺乳動物（本発明における「哺乳動物」としては、例えば、ヒト、マウス、ラッ
ト、サル、ウサギ等を挙げることができるが、哺乳動物である限りこれらに限定されない
）における、該抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法に利用することが
できる。

【0185】

具体的には、（１）抗体－薬物コンジュゲートの標的抗原が固相化されたプレートに血
漿中の抗体－薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）マーカ
ーで標識化された、本発明の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、
次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含む。

【0186】

また、（１）本発明の蛋白質が固相化されたプレートに血漿中の抗体－薬物コンジュゲ
ートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該抗体－薬物コンジュゲートの抗体
部位を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を接触させ、さらなる
複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むこと
もできる。

【0187】

また、ＥＬＩＳＡ法及びＥＣＬ法は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートを投与された
哺乳動物における、該抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物（例えば、化合物（１
）、化合物（２）、化合物（４）、及び化合物（５））の血漿中濃度を定量する方法に利
用することもできる。

【0188】

具体的には、（１）本発明の蛋白質が固相化されたプレートに、マーカーで標識化され
た競合薬物の存在下で、血漿中の抗体－薬物コンジュゲートから遊離した薬物を接触させ
複合体を形成させるステップ、（２）該マーカーを検出するステップ、を含む。

【0189】

ＩＨＣ法としては、例えば、本発明の抗体－薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物
における、該抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから遊離
した薬物の組織分布を定量する方法に利用することができる。

【0190】

具体的には、（１）組織中の抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジ
ュゲートから遊離した薬物を本発明の蛋白質と接触させ複合体を形成させるステップ、（
２）本発明の蛋白質を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を接触
させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステッ
プ、を含む。

【0191】

また、（１）組織中の抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲー
トから遊離した薬物を、マーカーで標識化された本発明の蛋白質と接触させ複合体を形成
させるステップ、次いで（２）該マーカーを検出するステップ、を含むこともできる。

【0192】

なお、本発明において「マーカー」とは、検出可能なシグナルを生成する、又は他の基
質に対し検出可能な信号を生成するように誘導する、任意の物質を意味する。かかるマー
カーとしては、例えば、蛍光物質、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触
媒、染料、発光物質、増感剤、及び放射性物質を挙げることができる。

【0193】

本発明において、「マーカーで標識化された」とは、マーカーが直接又は任意の部分構
造（例えばリンカー）を介して結合していることを意味する。ビオチンとアビジン（又は
ストレプトアビジン）の相互作用による結合もこれに含まれる。

【0194】

本発明の蛋白質をマーカーで標識化するためには、例えば、マーカーを構成要素とする
試薬（活性エステル基を有するもの）を、本発明の蛋白質のリシン残基と反応させアミド
結合を形成させれば良いが、これに限定されない。

【0195】

マーカーが蛍光物質である場合は、該マーカーの検出は該マーカーの蛍光を感知するこ
とにより行われる。

【0196】

このような蛍光物質としては、例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）３５０、ＤｙＬｉ
ｇｈｔ（登録商標）４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録
商標）５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６３３
、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０、ＤｙＬｉｇ
ｈｔ（登録商標）７４７、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）７５５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商
標）８００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登
録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ
（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕ
ｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆ
ｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＢＯＤ
ＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５
、Ｃｙ（登録商標）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ
（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉ
ｃ Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ（登録商標）を挙げることができる。

【0197】

また、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商
標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５、及びＱｄｏｔ
（登録商標）８００のようなナノクリスタルや、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰ
Ｃ）、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（Ｒ－ＰＥ）、Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＰ）、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ
（ＧＦＰ）、及びＲｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＰ）のような
蛍光蛋白質も、蛍光物質として使用することができる。

【0198】

マーカーが酵素である場合は、該マーカーの検出が該酵素と基質との反応により生じた
発光又は発色を感知することにより行われる。

【0199】

このような酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ；ＨＲＰ等）を挙げることができ、この場合、酵素の基質としては、例え
ば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＤＡ
Ｂ（３，３’－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、及びＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈ
ｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を挙げること
ができる。

【0200】

また、他の酵素としては、アルカリフォスファターゼを挙げることができ、この場合、
酵素の基質としては、例えば、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎ
ｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及びＰＮＰＰ（ρ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ）を挙げることができる。

【0201】

また、他の酵素としては、ルシフェラーゼを挙げることができ、この場合、酵素の基質
としては、例えば、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、及びＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ類を挙げる
ことができる。

【0202】

さらに、その他の酵素としては、β－ガラクトシダーゼを挙げることができ、この場合
、酵素の基質としては、例えば、ｏ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏ
ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＯＮＰＧ）を挙げることができる。

【0203】

マーカーが発光物質である場合は、該マーカーの検出は電気化学反応に基づく該マーカ
ーの発光を感知することにより行われる。

【0204】

このような発光物質としては、例えば、ルテニウム錯体を挙げることができ、好適には
、ルテニウム－ピリジン錯体を挙げることができ、より好適には、ルテニウム（ＩＩ）ト
リス（ビピリジル）錯体を挙げることができる。

【0205】

上記の電気化学反応は、例えば、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）の共存下で行うことが
できる。具体的には、電極反応によりＴＰＡカチオンラジカルと３価のルテニウム錯体を
生じさせた後、ＴＰＡカチオンラジカルは直ちに水素イオンを失い、強い還元作用を持つ
ＴＰＡラジカルとなり、これが３価のルテニウム錯体と反応することにより発光が生じる
。

【0206】

マーカーが放射性物質である場合は、該マーカーの検出は、該マーカーが発する放射線
を感知することにより行われる。

【0207】

このような放射性物質としては、例えば、トリチウム（^３Ｈ）、炭素－１４（^１４Ｃ）
、窒素－１５（^１５Ｎ）、硫黄－３５（^３５Ｓ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、テク
ネチウム－９９（^９９Ｔｃ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、ヨウ素－１２５（^１
２５Ｉ）、及びヨウ素－１３１（^１３１Ｉ）等を挙げることができる。

【0208】

本発明の蛋白質は、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増
感剤、凝集防止剤等を含有せしめることにより、組成物（以下、「本発明の組成物」とい
う。）として使用することができる。

【0209】

本発明の蛋白質（又は本発明の組成物）は、アッセイを行うのに使用される材料及び試
薬と組み合わせたキット（以下、「本発明のキット」という。）として使用することがで
きる。試薬は、それらの安定性に応じて、同一又は別個の容器中に液体又は凍結乾燥され
た状態で提供され得る。本発明のキット中に提供される試薬の量及び割合は、特定の用途
に最適な結果を提供するように選択され得る。本発明のキットには、本発明の蛋白質（又
は本発明の組成物）以外に、例えば、マーカーで標識するための試薬、酵素の基質、ブロ
ッキング試薬、ポリマー試薬、抗原賦活液、キャリブレーター、希釈用緩衝液、洗浄用緩
衝液、固相化用緩衝液、固相化抗体、検出用抗体、及びマイクロタイターウェル等が含ま
れ得る。また、本発明のキットを使用するための指示書等が含まれていても良い。本キッ
トを用いて、抗体－薬物コンジュゲート及び／又は該抗体－薬物コンジュゲートから遊離
した薬物の組織分布の確認や、血漿中濃度の定量等が可能となる。

【実施例0210】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はなく、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されない。なお、下記実施例にお
いて遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ
．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、
市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。また、本明細書
において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源から容易に入手可能
である。

【0211】

［実施例１］化合物の合成
ｉ） ８－［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］－N－（４－｛［（１
Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジ
オキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］
ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ
｝－４－オキソブチル）－８－オキソオクタンアミド（化合物（６））の合成

【0212】

【化26】

【0213】

４－アミノ－Ｎ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４
－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ
，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キ
ノリン－１－イル］ブタンアミド（０．０３２ｇ、０．０５０ｍｍｏＬ）（国際公開第２
０１４／０５７６８７号に記載の実施例１工程２にて得られる化合物）のＮ，Ｎ－ジメチ
ルホルムアミド（０．５ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（７μＬ，０．０５０ｍｍｏＬ
）、スベリン酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）（２０．４ｍｇ，０．０５５ｍｍｏＬ）を加
え、室温で２０分間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて
精製し、標記化合物（１６．０ｍｇ，４１％）を淡黄色固体として得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．
６Ｈｚ），１．１８－１．３７（４Ｈ，ｍ），１．４０－１．５０（２Ｈ，ｍ），１．５
４－１．６４（２Ｈ，ｍ），１．６５－１．７４（２Ｈ，ｍ），１．７８－１．９３（２
Ｈ，ｍ），２．０２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．０９－２．２０（４Ｈ，ｍ），
２．４０（３Ｈ，ｓ），２．６０－２．６８（２Ｈ，ｍ），２．８０（４Ｈ，ｓ），３．
００－３．０８（２Ｈ，ｍ），３．１３－３．２１（２Ｈ，ｍ），５．１９（２Ｈ，ｄｄ
，Ｊ ＝３２．０，１８．０Ｈｚ），５．３７－５．４７（２Ｈ，ｍ），５．５３－５．
６０（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．７４－７．８２
（２Ｈ，ｍ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：７７４（Ｍ＋Ｈ）^＋

【0214】

ｉｉ） ４－アミノ－Ｎ－［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９，１０－ジ
ヒドロキシ－４－メチル－１３－オキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ
－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－
ｂ］キノリン－１－イル］ブタンアミド トリフルオロ酢酸塩（化合物（７））の合成

【0215】

【化27】

【0216】

工程１：
ｔｅｒｔ－ブチル（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロ
キシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒド
ロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２
－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル）カーバメート（０．０９２ｇ
、０．１４８ｍｍｏＬ）（国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の実施例１工程１
にて得られる化合物）をメタノール（１．６ｍＬ）に溶解し、氷冷した。水素化ホウ素ナ
トリウム（０．０２８ｇ、０．７４０ｍｍｏＬ）を加え氷冷下にて２０分間攪拌した。メ
タノール(１０ｍＬ）及びクロロホルム(５０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液を加
え、クロロホルムで抽出した。得られた有機層を１０％クエン酸水溶液、続いて飽和食塩
水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物を
シリカゲルカラムクロマトグラフィ－［クロロホルム：メタノール＝１００：０～９５：
５（ｖ／ｖ）］にて精製し、薄黄色固体のｔｅｒｔ－ブチル（４－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－
９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１３－オキソ－２，３，９，
１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：
６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－４－オキソブチル
）カーバメート（０．０７８ｇ、８５％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．
４Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．６２－１．７３（４Ｈ，ｍ），２．０８－２．１
８（４Ｈ，ｍ）， ２．３９（３Ｈ，ｓ），２．９１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３
．１２－３．２０（２Ｈ，ｍ），４．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．６１（
１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｓ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．
７Ｈｚ），５．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．
８Ｈｚ），５．５４－５．５８（１Ｈ，ｍ），６．７４－６．８２（２Ｈ，ｍ），７．３
３（１Ｈ，ｓ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
８．６Ｈｚ）．
工程２：
上記工程１で得た化合物（０．０７８ｇ、０．１２５ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（２
ｍＬ）を加え、氷冷し、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加え、４０分間攪拌した。溶媒を
減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～ク
ロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製した。
得られた固体をメタノールに溶解し、エーテルを加えて生成した沈殿を濾取、真空乾燥し
、黄色固体の標記化合物（０．０４５ｇ、５６％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．
４Ｈｚ），１．７１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．８０－１．８８（２Ｈ，ｍ），
２．０９－２．１９（２Ｈ，ｍ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．４０（
３Ｈ，ｓ），２．８４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．１３－３．２０（２Ｈ，ｍ）
，４．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ）
，４．９７－５．０２（２Ｈ，ｍ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２
１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．５５－５．５９（１Ｈ，ｍ），６．７９（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｓ），７．６４－７．７５（３Ｈ，ｍ），７
．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：５２３（Ｍ＋Ｈ）^＋

【0217】

ｉｉｉ） ４－アミノ－Ｎ-シクロヘキシル－ブタンアミド塩酸塩（化合物（８））の合
成

【0218】

【化28】

【0219】

工程１：
４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（０．４９２ｇ、２．４２ｍｍ
ｏＬ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）及びＮ, Ｎ-ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶
解し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（０．２７９ｇ、２．４２ｍｍｏＬ）及び、ＥＤＣ
Ｉ（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏ
ｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（０．４６４ｇ、２．４２ｍｍｏＬ）を
加え室温にて３０分間攪拌した。その反応溶液をシクロヘキシルアミン（０．２００ｇ、
２．０２ｍｍｏＬ）のジクロロメタン溶液（２ｍＬ）に滴下し、室温にて２０分間攪拌し
た。反応液をジクロロメタンで希釈し、１０％クエン酸水溶液を加え、ジクロロメタンで
抽出した。得られた有機層を飽和重曹水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。
溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ－［ヘキサン：
酢酸エチル＝５０：５０～２５：７５（ｖ／ｖ）］にて精製し、無色油状のｔｅｒｔ－ブ
チル Ｎ-[４－（シクロヘキシルアミノ）－４－オキソ－ブチル]カーバメート（０．３
０８ｇ、５４％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ：１．０８－１．２３（４Ｈ，ｍ），
１．２９－１．４２（２Ｈ，ｍ），１．４４（９Ｈ，ｓ），１．６６－１．７５（２Ｈ，
ｍ），１．７７－１．８３（２Ｈ，ｍ），１．８６－１．９５（２Ｈ，ｍ），２．１７（
２Ｈ，ｔ， Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１１－３．２１（２Ｈ，ｍ），３．６９－３．８２
（１Ｈ，ｍ），４．７５（１Ｈ，ｂｒｓ），５．８９（１Ｈ，ｂｒｓ）．
工程２：
上記工程１で得た化合物（０．２００ｇ、０．７０３ｍｍｏＬ）を酢酸エチル（５０ｍ
Ｌ）及びジオキサン（１０ｍＬ）に溶解した。４Ｎ塩酸ジオキサン（１０ｍＬ）を加え２
時間攪拌した。生成した沈殿を濾取、真空乾燥し、無色固体の標記化合物（０．０９８ｇ
、６３％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ：１．０６－１．３０（５Ｈ，ｍ
），１．５０－１．５８（１Ｈ，ｍ），１．６２－１．８２（６Ｈ，ｍ），２．１６（２
Ｈ，ｔ，Ｊ＝ ７．２Ｈｚ），２．６９－２．７９（２Ｈ，ｍ），３．４５－３．５８（
１Ｈ，ｍ），４．７３（１Ｈ，ｂｒｓ），７．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．
９６－８．１０（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１８５（Ｍ＋Ｈ）^＋

【0220】

［実施例２］抗体－薬物コンジュゲートの製造
ｉ） 抗Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の製造方法に従って、抗Ｂ７－Ｈ３抗体（
配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体）を用いて、式

【0221】

【化29】

【0222】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗Ｂ７－Ｈ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗
Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）」と
称する）を製造した。

【0223】

ｉｉ） 抗Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲートの製造（２）
国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の製造方法に従って、抗Ｂ７－Ｈ３抗体（
配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体）を用いて、式

【0224】

【化30】

【0225】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗Ｂ７－Ｈ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗
Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩ）」
と称する）を製造した。

【0226】

ｉｉｉ） 抗Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲートの製造（３）
国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の製造方法に従って、抗Ｂ７－Ｈ３抗体（
配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体）を用いて、式

【0227】

【化31】

【0228】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗Ｂ７－Ｈ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗
Ｂ７－Ｈ３抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩＩ）
」と称する）を製造した。

【0229】

ｉｖ） 抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１５／１１５０９１号に記載の製造方法に従って、抗ＨＥＲ２抗体（配
列番号２１においてアミノ酸番号１乃至４４９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配
列番号２２においてアミノ酸番号１乃至２１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含ん
でなる抗体）を用いて、式

【0230】

【化32】

【0231】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ２抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗Ｈ
ＥＲ２抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）」と称する
）を製造した。

【0232】

ｖ） 抗ＨＥＲ３抗体－薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１５／１５５９９８号に記載の製造方法に従って、抗ＨＥＲ３抗体（配
列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列か
らなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式

【0233】

【化33】

【0234】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗Ｈ
ＥＲ３抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＨＥＲ３－ＡＤＣ（Ｉ）」と称する
）を製造した。

【0235】

ｖｉ） 抗ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１５／０９８０９９号に記載の製造方法に従って、抗ＴＲＯＰ２抗体（
配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号２６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体）を用いて、式

【0236】

【化34】

【0237】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＴＲＯＰ２抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗
ＴＲＯＰ２抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）」と
称する）を製造した。

【0238】

［実施例３］ モノクローナル抗体作製
ｉ） 抗原蛋白質の調製
抗原蛋白質は化合物（６）にキャリア蛋白としてウシサイログロブリンを付加したもの
（以下、「抗原蛋白質（１）」と呼ぶ）及びＢＳＡを付加したもの（以下、「抗原蛋白質
（２）」と呼ぶ）を使用した。

【0239】

ｉｉ） 免疫
免疫にはＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ（ＢＡＬＢ／ｃ）マウス（４個体）及びＢ
６Ｄ２Ｆ１／Ｃｒｌｊ（ＢＤＦ１）マウス（４個体）の雌（日本チャールス・リバー株式
会社）を使用した。初回は抗原蛋白質（１）とＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａ
ｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）を混合したものを、２回目以降は抗原蛋白質（１）とＦ
ｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）を混合した
ものを皮下及び皮内に投与した。７日毎に合計４回投与した。

【0240】

ｉｉｉ） 抗血清の抗体価評価
免疫前及び４回投与後のＢＡＬＢ／ｃマウス（４個体）及びＢＤＦ１マウス（４個体）
の血清をそれぞれ２００倍から２０４８００倍まで希釈して、陽性対照として抗原蛋白質
（２）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩ）、陰性対照としてＢＳＡに対する抗体価を確認し
た。抗原蛋白質（２）、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩ）、及びＢＳＡをＥＬＩＳＡ用イムノ
プレートに固相化し、希釈した免疫前及び４回投与後のマウス血清を３７℃で３０分間反
応させた。洗浄後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ）を３７
℃で３０分間反させた。洗浄後、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒ
ｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＯＰＤ）溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。すべての個体において、陽性対照に対する抗体価が上昇していることを確認した。

【0241】

ｉｖ） Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ
４回投与後のＢＡＬＢ／ｃマウス（４個体）及びＢＤＦ１マウス（４個体）の血清に、
陽性対照として化合物（６）、化合物（７）及び化合物（１）、陰性対象として化合物（
８）を添加し、抗原蛋白質（２）に対する未吸収率を算出した。５００００倍希釈したマ
ウスの血清と１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍＬに調製した化合物（６）、化合物
（８）、化合物（７）及び化合物（１）を混合し、４℃で一晩反応させたのち、抗原蛋白
質（２）を固相化したＥＬＩＳＡ用イムノプレートにし添加し、３７℃で３０分間反応さ
せた。洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰを３７℃で３０分間反応させた。
洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。以下式によ
り未吸収率を算出した。
未吸収率 （％） ＝（ａ／ｂ）×１００
ａ：陽性対照又は陰性対象の添加濃度１２．５μｇ／ｍＬの吸光度
ｂ：陽性対照又は陰性対象無添加の吸光度
いずれのマウス血清も陽性対照の化合物（６）及び化合物（１）に、個体によっては化合
物（７）に高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められた。また、陰性対象の化合物（８）
にはいずれの血漿にも高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められなかった。その中でも化
合物（７）に高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められ且つ化合物（８）に高いｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ効果が認めらなかった血清を有するＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＤＦ１マウス
からそれぞれ１個体を選択し、リンパ節及び脾臓を採取してハイブリドーマ作製に用いた
。

【0242】

ｖ） ハイブリドーマ作製
ｉｖ）で選択した個体のリンパ節細胞及び脾臓細胞とマウスミエローマをＰＥＧ法にて
細胞融合した。出現したハイブリドーマの培養上清を用いて抗体産生ハイブリドーマのス
クリーニングを行った。

【0243】

ｖｉ） 抗原蛋白質（２）に対する特異的結合評価
抗原蛋白質（２）をＥＬＩＳＡ用イムノプレートに固相化し、２倍希釈した抗体産生ハ
イブリドーマ上清を３７℃で１２０分反応させた。洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ｉｇ
Ｇ－ＨＲＰを３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色停止後に
４９０ｎｍの吸光度を測定した。ＯＤ値が０．２以上の数値を示す培養上清を産生するハ
イブリドーマ１１株を陽性として選択した。

【0244】

ｖｉｉ） クロスチェック
ｖｉ）で陽性として選択した１１株について、陽性対照として化合物（６）、化合物（
１）、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩ）、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ
（ＩＩＩ）、並びに反応性確認用化合物として化合物（８）及び化合物（７）を用いて、
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡを実施した。２倍希釈したｖｉ）で陽性として選択し
た１１株の培養上清に、陽性対照及び反応性確認用化合物を最終濃度が２５μg/ｍＬにな
るように添加した。４℃で一晩反応させた後、抗原蛋白質（２）を固相化したＥＬＩＳＡ
用イムノプレートに添加し、３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓ
ｅ ＩｇＧ－ＨＲＰを３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色
停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。抗原蛋白質（２）に対する反応性が高く、陽性
対照によるｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められた８株を選択して一次クローニングに供
した。

【0245】

ｖｉｉｉ） 一次クローニング、一次スクリーニング
ｖｉｉ）で選択した８株を限界希釈法でクローニングした。ハイブリドーマを６０細胞
／９６穴プレートになるように播種し、マウス胸腺細胞を５×１０^６細胞／穴ずつ添加し
、１０％ＦＢＳ含有ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所）を用いて培養した。ｖｉｉ）と同
様なｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡを行い、特異性が確認された８株ｘ６サブクロー
ンを選択した。

【0246】

ｉｘ） 一次クロスチェック
ｖｉｉｉ）で選択した８株ｘ６サブクローンのＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩ）及びＢ７－
Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）に対する反応性を確認した。Ｂ７－Ｈ３ Ｃ１ ｄｏｍａｉｎ Ｌｏｔ
Ｂ７＿ＯｍＪ１をｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｂｕｆｆｅｒで１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａ
ｘｉ－Ｓｏｒｐプレートに１００μＬずつ添加後、４℃で一晩固相化した。翌日、プレー
トの培地を除き、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１８０μＬずつ添加し、室温で３時間静置した
。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄後、０．１μｇ／ｍＬに調製したＢ７
－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩ）、及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）を１００μＬずつ添加後、室温
でおよそ１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄後、９００μ
ｇ/ｍＬから公比３で７段階に希釈したハイブリドーマ上清を５０μＬずつ添加後、室温
で１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄後、５０００倍希釈
したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ
Ｇ， Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．）を１００μＬずつ添加し、室温
で１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ基質（Ｏ
ＰＤ ｔａｂｌｅｔ）を１００μＬずつ添加して発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを１００
μＬずつ添加して発色反応を停止させた後、ＡＲＶＯ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４
５０ｎｍの吸光度を測定した。８株ｘ６サブクローンの全てにおいてＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ
（ＩＩ）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）に対する反応性が確認された。その中でも反応性
の高かった４株ｘ６サブクローンを一次検量線確認へ供した。

【0247】

ｘ） 一次検量線確認
ｉｘ）で選択した４株ｘ６サブクローンのＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ７）とＢ
７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ５）への反応性をＥＬＩＳＡで確認した。Ａｆｆｉｎｉ
Ｐｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）をＣｏａｔ
ｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉ－Ｓｏｒｐプレートに１００μ
Ｌずつ添加後、４℃で一晩固相化した。翌日、プレートの培地を除き、ＰＢＳで洗浄後に
１０％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μＬずつ添加し、３７℃で２．５時間静置した。プレー
トの培地を除き、ハイブリドーマ４株ｘ６サブクローンを２％ＢＳＡ、０．２％Ｐｏｌｙ
ｓｏｒｂａｔｅ２０（以下、「ＰＳ２０」と呼ぶ）含有ＰＢＳで１０、２５及び１００ｎ
ｇ／ｍＬに希釈し、プレートに１００μＬずつ添加し、３７℃で１時間静置した。０．０
５％ＰＳ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、２％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ
でＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ７）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ５）を
１、２．５、１０、２５、１００、２５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、プレートに１００μＬず
つ添加し、３７℃で１時間静置した。０．０５％ＰＳ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、２％
ＢＳＡ、０．２％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７５００倍希釈したＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍ
ａｎ ｋａｐｐａ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．）を１００μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。０．０５
％ＰＳ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、ＴＭＢ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｃｙ
Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ウェルで添加して発色反応を行い、
ＴＭＢ ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ（ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００
μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、ＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で４５０ｎｍの吸光度（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ６５０ｎｍ）を
測定し、以下式により相対誤差を算出し、値の小さいクローンを選択した。
相対誤差（％） ＝｛（ＤＡＲ７の測定値）／（ＤＡＲ５の測定値）－１｝×１００
その中から、４株ｘ２サブクローンを二次クローニングへ供した。

【0248】

ｘｉ） 二次クローニング、スクリーニング
ｘ）で選択した４株ｘ２サブクローンの二次クローニングを行い、各クローンで陽性ウ
ェルの中から３ウェルを選抜することにより合計２４クローンを選択し、抗原蛋白質（２
）に対する抗体価の確認をｖｉ）と同様に実施した。さらに陽性対照として化合物（６）
、化合物（１）、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（ＩＩ）、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）及びＢ７－Ｈ
３－ＡＤＣ（ＩＩＩ）、並びに反応性確認用化合物として化合物（８）及び化合物（７）
を用いて、ｖｉｉ）と同様にｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡを実施した。

【0249】

ｘｉｉ） 二次検量線確認
ｘｉ）で選択した２４クローンのうち、化合物（１）に比較して化合物（７）への反応
性が特に高い６クローンを除いた１８クローンについて、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡ
Ｒ８)、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）、及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ２
）に対する反応性及び検量線をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲ
ＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。キャプチャー試薬はＢ
ｉｏｔｉｎ－ＳＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ
－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， Ｆｃγ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、ＩＮＣ．）を用い、０．０１％ＰＳ２０
含有ＰＢＳで１７２．５ｎＭに調製した。細胞培養上清はＲｅｘｘｉｐ ＣＣＳ（ＧＹＲ
ＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２００ｎｇ／ｍＬに調製した。Ｈ
ＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８)、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）、及びＨＥＲ
２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ２）は０．０１％ＰＳ２０含有ＰＢＳでいずれも１０００ｎｇ
/ｍＬから４倍公比で６段階に希釈し調製した。検出試薬はＧｏａｔ Ａｎｔｉ Ｈｕｍ
ａｎ ｋａｐｐａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｓ，Ｉｎｃ．）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキット（Ｔｈ
ｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で標識したものを用い、Ｒ
ｅｘｘｉｐ Ｆで１０ｎＭに調製した。上記に調製した試薬、細胞培養上清及び検量線試
料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ととも
に Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、４－Ｓｔｅｐ（２ｘ
Ｃ）－Ａ－Ｄ（ｗｉｚａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅ
ｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重
み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。評価した１８クローンはいずれもＨＥＲ２－Ａ
ＤＣ（Ｉ）のＤＡＲに依存せず、また、株間の反応性の違いも認められなかったため、同
一株でＩｇＧ濃度が高い３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）を選択して、少量生産
を行った。

【0250】

ｘｉｉｉ） ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製抗体の調製とクロスチェック
ｘｉｉ）で選択した３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）について、無血清培地（
ＡＳＦ１０４（Ｎ））でローラーボトル培養し、培養上清を回収後に０．４５μｍのフィ
ルターでろ過してＰｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した。抗原蛋白質（２）を５０ｎｇ／ｗ
ｅｌｌ／５０μＬ添加して固相化したＥＬＩＳＡ用イムノプレートに、ＰｒｏｔｅｉｎＡ
精製した３クローンを５μｇ／ｍＬから２倍公比で１０段階希釈した溶液５０μＬを添加
して３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰを３
７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸
光度を測定した。いずれのＰｒｏｔｅｉｎＡ精製抗体も抗原蛋白質（２）と良好な反応性
を示した。

【0251】

ｘｉｖ） ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製抗体の検量線確認
ｘｉｉｉ）でＰｒｏｔｅｉｎＡ精製した３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）につ
いて、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）、及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）
、並びに、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）、及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（Ｄ
ＡＲ４）に対する反応性をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて確認
した。

【0252】

キャプチャー試薬は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製後の３クローンをＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ
－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．
）でビオチン標識したものを用い、０．０１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製し
た。ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）とＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）はＲｅ
ｘｘｉｐ ＨＮで、いずれも１０００ｎｇ/ｍＬから４倍公比で６段階に希釈し調製した
。検出試薬はＧｏａｔ Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ｋａｐｐａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（
登録商標）６４７ラベリングキットで標識したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆで１０ｎＭ
に調製した。調製した試薬及び抗体－薬物コンジュゲート（検量線試料）を９６ウェルＰ
ＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００とともに Ｇｙｒｏｌａ
ｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、２００－３Ｗ－００１－Ａ（ｗｉｚａ
ｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏ
ｆｔｗａｒｅ を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎ
ｓｅ）で回帰した。クローン１Ａ３の検量線を図１５に、クローン８Ｂ２の検量線を図１
６に、クローン１１Ｂ１の検量線を図１７に示す。いずれのクローンについてもＨＥＲ２
－ＡＤＣ（Ｉ）との間でＤＡＲに依存しない反応性を示した。

【0253】

さらにキャプチャー試薬として、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎでビオ
チン標識したＨｕｍａｎ Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）、及び同様にビオチン標識したＢ７－Ｈ３ Ｃ１ ｄｏｍａｉｎを用い、０．
０１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した。ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８
）及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）、並びにＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ
８）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）についてはＲｅｘｘｉｐ ＨＮで、いず
れも１０００ｎｇ/ｍｌから４倍公比で６段階に希釈し調製した。検出試薬はＰｒｏｔｅ
ｉｎＡ精製後の３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）をＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録
商標）ラベリングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ
．）で標識したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆで１０ｎＭに調製した。調製した試薬及び
抗体－薬物コンジュゲートの検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌ
ａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００とともに Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏ
ｎにセットして、２００－３Ｗ－００１－Ａ（ｗｉｚａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）で測定し
た。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４－パラ
メータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。ＨＥＲ２－Ａ
ＤＣ（Ｉ）との反応性について、クローン１Ａ３の検量線を図１８に、クローン８Ｂ２の
検量線を図１９に、クローン１１Ｂ１の検量線を図２０に示す。また、Ｂ７－Ｈ３－ＡＤ
Ｃ（Ｉ）との反応性について、クローン１Ａ３の検量線を図２１に、クローン８Ｂ２の検
量線を図２２に、クローン１１Ｂ１の検量線を図２３に示す。いずれのクローンについて
もＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）及びＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）との間でＤＡＲに依存しない反
応性を示した。

【0254】

以上の結果から、いずれのクローンについてもＤＡＲ並びに抗体部分の違いに依存せず
に抗体－薬物コンジュゲートに対する反応性を示し、かつキャプチャー試薬と検出試薬の
どちらにも使用可能であることが確認された。この中から最もシグナル値の大きかったク
ローン１Ａ３を選択し、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートの検出に使用することに
した。

【0255】

ｘｖ） マウスモノクローナル抗体のアイソタイプ決定
ｘｉｖ）で取得したクローン１Ａ３に係るマウスモノクローナル抗体（以下、「マウス
抗体１Ａ３」と呼ぶ）のアイソタイプは、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｉｓｏｔ
ｙｐｉｎｇ ｔｅｓｔ ｋｉｔ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）により決定された。その
結果、アイソタイプはＩｇＧ２ｂ、κ鎖であることが確認された。

【0256】

ｘｖｉ） モノクローナル抗体の遺伝子クローニング及びＮ末端アミノ酸配列解析
マウス抗体１Ａ３産生ハイブリドーマより、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩＦＥ
ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。精製したマウス
抗体１Ａ３のＮ末端アミノ酸配列解析（Ｅｄｍａｎ分解法）を実施した。さらに抗体遺伝
子クローニングにより、クローン１Ａ３のヌクレオチド配列を解析した。抗体遺伝子クロ
ーニングの結果、重鎖可変領域・軽鎖可変領域ともにそれぞれ１種類の配列が得られ、精
製したマウス抗体１Ａ３のＮ末端アミノ酸配列解析の結果と抗体遺伝子クローニングによ
り得られたクローン１Ａ３のヌクレオチド配列のＮ末端アミノ酸配列は一致することが確
認された。

【0257】

マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列を配列番号１５に記した。配列番号１５において
アミノ酸番号１乃至１９に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸番号２０
乃至１４１に記載のアミノ酸配列は重鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１４２乃至４７７
に記載のアミノ酸配列は重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。

【0258】

マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１６に記した。配列番号１６において
アミノ酸番号１乃至２０に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸番号２１
乃至１２７に記載のアミノ酸配列は軽鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１２８乃至２３４
に記載のアミノ酸配列は軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。

【0259】

マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号１７に
記した。配列番号１７においてヌクレオチド番号１乃至５７に記載のヌクレオチド配列は
シグナル配列を示し、ヌクレオチド番号５８乃至４２３に記載のヌクレオチド配列は重鎖
可変領域のアミノ酸配列をコードする。

【0260】

マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号１８に
記した。配列番号１８においてヌクレオチド番号１乃至６０に記載のヌクレオチド配列は
シグナル配列を示し、ヌクレオチド番号６１乃至４５９に記載のヌクレオチド配列は重鎖
可変領域のアミノ酸配列をコードする。

【0261】

また、ＣＤＲの解析を行った。

【0262】

Ａｂｍの定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧＭＶ）、配列番号２に示されるアミノ酸
配列からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸
配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、マウス抗体１
Ａ３軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱ
ＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲ
ＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶ
Ｔ）を保有していることが判明した。

【0263】

Ｃｈｏｔｈｉａの定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号７に示さ
れるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹ）、配列番号８に示されるアミノ
酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＳＧＳＳＡ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列か
らなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、マウス抗体１Ａ３軽
鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧ
ＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）
、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を
保有していることが判明した。

【0264】

Ｋａｂａｔの定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号９に示される
アミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＧＭＶ）、配列番号１０に示されるアミノ酸配列
からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹＹＡＤＴＶＫＧ）、及び配列番号３に示され
るアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、マ
ウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１
（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（
ＷＡＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹ
ＳＳＹＰＶＴ）を保有していることが判明した。

【0265】

Ｉｍｇｔ（登録商標）の定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号１
１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧ）、配列番号１２に示
されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＩＳＳＧＳＳＡＩ）、及び配列番号１３に示さ
れるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＡＲＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有してお
り、マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣ
ＤＲＬ１（ＱＤＶＧＳＡ）、ＷＡＳ（トリプトファン－アラニン－セリン）で示されるト
リペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ
Ｌ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有していることが判明した。

【0266】

［実施例４］ 非臨床試験の血漿中濃度測定
実施例２で取得したマウス抗体１Ａ３を使用して、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血
漿中濃度、並びにＨＥＲ３－ＡＤＣ（Ｉ）、ＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）、及びＢ７－Ｈ３
－ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法を構築した。マウス抗体１Ａ３は検出試薬として
ＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録商標）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識
して使用することが可能で、どちらを使用しても本発明に係る抗体－薬物コンジュゲート
の血漿中濃度を測定することができる。さらにＤＡＲ並びに抗体部分の違いに依存せず検
量線が作成でき、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートの血漿中濃度測定に使用可能で
ある。

【0267】

ｉ） ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）
ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋ
ｓｔａｔｉｏｎで構築した。キャプチャー試薬としてＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍｏｕ
ｓｅ Ａｎｔｉ－（Ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ Ａｂ） ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ（ここで、「（
Ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ Ａｂ）」は、配列番号２１においてアミノ酸番号１乃至４４９に記
載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号１乃至２１４に記
載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体を示す）（１３Ｃ１）（ＩＢＬ） を用
い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで３５０ ｎＭに調製した。検量線試料はＲｅｘｘｉｐ
ＨＮで１００倍希釈したマウス血漿でＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、 ０．１５０
、０．２００、０．６００、１．６０、４．００、１６．０、４０．０、１００、１４０
μｇ／ｍＬ になるように調製した。検出試薬はマウス抗体１Ａ３をＤｙＬｉｇｈｔ６５
０（登録商標）ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆで１０ｎ
Ｍ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ
、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００とともに Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋ
ｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００－３Ｗ－００２－Ａ（ＰＭＴ１
）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ ３．３．９．１７５を
用いて５－パラメータロジスティックモデルで行った。検量線を図２４に示す。

【0268】

Ｔｏｔａｌ抗体（抗ＨＥＲ２抗体及びＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ））のマウス血漿中濃度測
定法をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで構築した。キャプチャー試薬と
してＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－（Ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ Ａｂ）
ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ （１３Ｃ１） （ＩＢＬ） を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢ
Ｓで３５０ ｎＭに調製した。検量線試料はＲｅｘｘｉｐ ＨＮで１００倍希釈したマウス
血漿でＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、 ０．１５０、０．２００、０．６００、１
．６０、４．００、１６．０、４０．０、１００、１４０μｇ／ｍＬ になるように調製
した。検出試薬はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｉ
ｇＧ， Ｆｃγ Ａｎｔｉｂｏｄｙ (Ｊａｋｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ.)をＲｅｘｘｉｐ Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら
調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉ
ｏａｆｆｙ ２００とともに Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセット
した。測定ｗｉｚａｒｄは２００－３Ｗ－００２－Ａ（ＰＭＴ１）を使用した。回帰解析
はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ ３．３．９．１７５を用いて５－パラメータロ
ジスティックモデルで行った。

【0269】

濃度測定結果を表１に示す。

【0270】

【表1】

【0271】

ｉｉ） ＨＥＲ３－ＡＤＣ（Ｉ）
ＨＥＲ３－ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓ
ｔａｔｉｏｎで構築し、バリデーションを取得した。キャプチャー試薬としてＥＺ－Ｌｉ
ｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でビオチン標識したＨＥＲ３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈ
ｕｍａｎ ＥｒｂＢ－３／ＨＥＲ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ ｎＭに調製した。検量線試料はサル血漿
でＨＥＲ３－ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、０．０７５０、０．ｌ００、０．２５０、０．７
５０、２．２５、６．７５、２０．０、３８．０、４８．０μｇ/ｍＬになるように調製
したものを用い、さらにＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０含有ＰＢＳ及びＲｅｘｘｉｐ Ａ
Ｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１００倍希釈した。検
出試薬はマウス抗体１Ａ３をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキッ
トでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら調製し
た試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏ
ｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００－３Ｗ－００２－Ａ（ＰＭ
Ｔ５）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ ３．３．７．１７
１を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。
検量線を図２５に示す。

【0272】

ｉｉｉ） ＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）
ＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋ
ｓｔａｔｉｏｎで構築し、バリデーションを取得した。キャプチャー試薬としてＥＺ－Ｌ
ｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎでビオチン標識したｎｅｗ ｈＴｒｏ
ｐ２（Ｌｏｔ番号Ｖ３５、第一三共（株））を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで３５
０ｎＭに調製した。検量線試料はサル血漿でＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、０．
００７５０、０．０１００、０．０２５０、０．０７５０、０．２５０、０．７５０、２
．５０、７．５０、１０．０μｇ/ｍＬになるように調製したものを用い、さらにＲｅｘ
ｘｉｐ ＨＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０倍希釈
した。検出試薬はマウス抗体１Ａ３をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリ
ングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆで１０ｎＭ に調製した。これ
ら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘ
Ｐ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００－３Ｗ－００２－
Ａ（ＰＭＴ１）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ ３．３．
７．１７１を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で
行った。検量線を図２６に示す。

【0273】

ｉｖ） Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）
Ｂ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋ
ｓｔａｔｉｏｎで構築し、バリデーションを取得した。キャプチャー試薬としてＥＺ－Ｌ
ｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でビオチン標識したＢ７－Ｈ３ Ｃ１ ｄｏｍａｉｎ（Ｌ
ｏｔ番号Ｂ７＿ＯｍＪ１、第一三共（株））を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７０
０ｎＭに調製した。検量線試料はサル血漿でＢ７－Ｈ３－ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、０．
０７５０、０．ｌ００、０．２５０、０．７５０、２．２５、６．７５、２０．０、３８
．０、４８．０μｇ/ｍＬになるように調製したものを用い、さらにＰｏｌｙｓｏｒｂａ
ｔｅ ２０含有ＰＢＳ及びＲｅｘｘｉｐ ＨＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５０倍希釈した。検出試薬はマウス抗体１Ａ３をＡｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ
Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレ
ートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚ
ａｒｄは２００－３Ｗ－００１－Ａ（ＰＭＴ５）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ
Ｅｖａｌｕａｔｏｒ ３．３．７．１７１を用いて４－パラメータロジスティックモデ
ル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。検量線を図２７に示す。

【0274】

［実施例５］ マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色
ｉ） ヒト由来皮下移植腫瘍を用いた染色性の確認
高度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）にヒト由来腫瘍を皮下移植する。本発明に係る抗
体－薬物コンジュゲート投与後にその腫瘍組織を採取してパラフィン包埋標本を作製し、
マウス抗体１Ａ３の染色性を検討する。本発明に係る抗体－薬物コンジュゲート未投与の
ＮＯＧマウスより採取した腫瘍組織を陰性対照とする。脱パラフィン及び抗原賦活はＡｕ
ｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）及び
、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｏｗ ｐＨ：
ＤＡＫＯ社製）を用いて実施する。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ Ａｕｔｏｓ
ｔａｉｎｅｒ Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて実施する。ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｆ
ＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
Ｂｌｏｃｋ ３％ Ｈ_２Ｏ_２（ＤＡＫＯ社製）を加えインキュベートし、ＥｎＶｉｓｉ
ｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲで洗浄する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ ｓ
ｅｒｕｍ ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、インキュベートし、Ａｉｒ ｂｌｏｗで液
を除去する。マウス抗体１Ａ３をＲＥＡＬ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫ
Ｏ社製）で希釈し、反応させる。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲ
で洗浄後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍ
ｅｒ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＃Ｋ４０００（ＤＡＫＯ社製）を加え、インキュベートし
た後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲで洗浄する。

【0275】

ＤＡＫＯ Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍを加えインキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦ
ＥＲで洗浄する。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加えインキュ
ベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水
で洗浄する。

【0276】

本発明に係る抗体－薬物コンジュゲートを投与されたＮＯＧマウスに対してマウス抗体
１Ａ３は良好な染色性を示し、マウス抗体１Ａ３の濃度の増加に伴って染色強度が増加す
ることを確認する。また、本発明に係る抗体－薬物コンジュゲート未投与のＮＯＧマウス
に対してマウス抗体１Ａ３は染色性を示さないことを確認する。なお、ＮＯＧマウスはＢ
細胞を欠損しているため、マウス由来の内在性ＩｇＧによるバックグラウンド染色は認め
られないことが知られている（Ito M, et al. Blood 100(9):3175-3182, 2002）。

【0277】

ｉｉ） マウス抗体１Ａ３の特異性確認
マウス抗体１Ａ３を化合物（２）又はＳＮ－３８とあらかじめ混合した後、免疫染色に
用いる。混合比は分子量に基づいて抗体１Ａ３：化合物（２）：ＳＮ－３８＝０．１：０
．０４：０．０３とする。染色はｉ）と同様の方法で実施する。

【0278】

化合物（２）との混合によってマウス抗体１Ａ３の染色性が消失することを確認する。
また、ＳＮ－３８との混合によってマウス抗体１Ａ３の染色性は消失しないことを確認す
る。

【0279】

［実施例６］ウサギキメラ化抗体の作製
ｉ） マウス抗体１Ａ３のウサギキメラ化抗体のデザイン
マウス抗体１Ａ３のウサギキメラ化抗体（以下、「ウサギキメラ化抗体１Ａ３」と呼ぶ
）を以下の通りデザインした。ウサギキメラ化抗体の配列は、ウサギの重鎖定常領域ＩＧ
ＨＧ＊０２とウサギの軽鎖定常領域ＩＧＫＣ２＊０１をＩＭＧＴ（登録商標）から参照し
て、クローン１Ａ３のそれぞれの可変領域につなげることで設計した。

【0280】

ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列を配列番号１９に記した。配列番号１９
においてアミノ酸番号１乃至１９に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸
番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列は重鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１４２乃
至４６４に記載のアミノ酸配列は重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。

【0281】

ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２０に記した。配列番号２０
においてアミノ酸番号１乃至２０に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸
番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列は軽鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１２８乃
至２３３に記載のアミノ酸配列は軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。

【0282】

ｉｉ） 抗体発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限
酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、ヒト軽鎖
シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列
番号２９）を有するＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクロ
ーニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作
製した。

【0283】

ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫからネオマイシン発現ユニットを除去することによりｐＣＭＡ
－ＬＫを構築した。

【0284】

ｉｉｉ） ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖発現ベクターの構築
ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）をコードするヌクレオ
チド配列（配列番号３０）を有するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列番
号３０においてヌクレオチド番号２６乃至８２に記載のヌクレオチド配列はシグナル配列
を示し、ヌクレオチド番号８３乃至４４８に記載のヌクレオチド配列は重鎖可変領域のア
ミノ酸配列をコードし、ヌクレオチド番号４４９乃至１４１７に記載のヌクレオチド配列
は定常領域のアミノ酸配列をコードする。

【0285】

Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用い
て、合成したＤＮＡ断片とｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナ
ル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２
９）を取り除いたＤＮＡ断片を結合することにより、ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖発現
ベクターを構築した。

【0286】

ｉｖ） ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖発現ベクターの構築
ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）をコードするヌクレオ
チド配列（配列番号３１）を有するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列番
号３１においてヌクレオチド番号２６乃至８５に記載のヌクレオチド配列はシグナル配列
を示し、ヌクレオチド番号８６乃至４０６に記載のヌクレオチド配列は軽鎖可変領域のア
ミノ酸配列をコードし、ヌクレオチド番号４０７乃至７２４に記載のヌクレオチド配列は
定常領域のアミノ酸配列をコードする。ｉｉｉ）と同様の方法でウサギキメラ化抗体１Ａ
３軽鎖発現ベクターを構築した。

【0287】

ｖ） ウサギキメラ化抗体１Ａ３の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、
継代、培養をおこなった。対数増殖期の２．４×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３
Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＯｐｔｉｍｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ ５Ｌ Ｆｌａｓｋ
（Ｔｈｏｍｓｏｎ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍ
ｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して１．８８×１０６細胞／ｍＬに調製
した。４０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に０．４８
ｍｇのウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖発現ベクターと０．７２ｍｇのウサギキメラ化抗体
１Ａ３軽鎖発現ベクターと３．６ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙ
ｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦ
ｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで４
時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に１２００ｍＬのＥＸ－ＣＥＬＬ ＶＰＲＯ培地（ＳＡ
ＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）
、及び６０ｍＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）
を添加し、３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して
得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ （Ａｄｖａ
ｎｔｅｃ ＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過することにより、ウサギキメラ化抗体１Ａ
３を含む培養上清を得た。

【0288】

ｖｉ） ウサギキメラ化抗体１Ａ３の精製
ｖ）で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの
１段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充
填されたカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライ
したのちに、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩
酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈ
ｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ
Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳへのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ
ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を２ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最
後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、ウ
サギキメラ化抗体１Ａ３の精製サンプルを得た。

【0289】

［実施例７］抗体－薬物コンジュゲートの製造
ｉ） 抗ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１８／１３５５０１号に記載の製造方法に従って、抗ＧＰＲ２０抗体（
配列番号３２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号３３においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖
を含んでなる抗体）を用いて、式

【0290】

【化35】

【0291】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＧＰＲ２０抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗
ＧＰＲ２０抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）」と
称する）を製造した。

【0292】

ｉｉ） 抗ＣＤＨ６抗体－薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１８／２１２１３６号に記載の製造方法に従って、抗ＣＤＨ６抗体（配
列番号３４においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び
配列番号３５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を
含んでなる抗体）を用いて、式

【0293】

【化36】

【0294】

（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＣＤＨ６抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗Ｃ
ＤＨ６抗体－薬物コンジュゲート（本発明において「ＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ）」と称する
）を製造した。

【0295】

［実施例８］ウサギキメラ化抗体１Ａ３を用いた免疫染色
ｉ） ヒト由来皮下移植腫瘍を用いたＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）投与後の染色性の確認
免疫不全マウス（ヌードマウス）にヒト頭頸部がん細胞株ＦａＤｕを皮下移植した。Ｔ
ＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）投与後にその腫瘍組織を採取してパラフィン包埋標本を作製し、
ウサギキメラ化抗体１Ａ３の染色性を検討した。また、抗ＴＲＯＰ２抗体（配列番号２５
においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２
６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる
抗体、以下、「Ａｎｔｉ－ＴＲＯＰ２ Ａｂ」と称する。）を投与したヌードマウスより
採取した腫瘍組織を陰性対照とした。脱パラフィンおよび抗原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎ
ｅｒ Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）を用いて、抗原賦活
液（Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｏｗ ｐＨ：ＤＡＫＯ社
製）を用いて、９７℃で４０分間実施した。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ Ａ
ｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて室温で実施した。ＥｎＶ
ｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で１回洗浄した後、Ｒ
ＥＡＬ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ社製
）を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥ
Ｒで１回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製
）を加え、３０分間インキュベートし、Ａｉｒ ｂｌｏｗで液を除去した。ウサギキメラ
化抗体１Ａ３をＲＥＡＬ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫＯ社製）で０．１
μｇ／ｍＬに希釈し、３０分間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ Ｂ
ＵＦＦＥＲで３回洗浄後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ Ｌａｂｅｌｌｅ
ｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ （ＤＡＫＯ社製）を加え、３０分インキ
ュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した
。

【0296】

ＤＡＫＯ Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ
ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを
加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥ
Ｒ及びイオン交換水で計３回洗浄した。

【0297】

図３５に典型的な染色像を示す。ＴＲＯＰ２－ＡＤＣ（Ｉ）を投与された動物の皮下腫
瘍組織に対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は良好な染色性を示す一方、Ａｎｔｉ－ＴＲＯ
Ｐ２ Ａｂを投与された動物の皮下腫瘍組織に対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は染色性
を示さなかった。

【0298】

ｉｉ） ヒト由来皮下移植腫瘍を用いたＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）投与後の染色性の確認
免疫不全マウス（ヌードマウス）にＧＰＲ２０過剰発現ヒト消化管間質腫瘍細胞株ＧＩ
ＳＴ－Ｔ１／ＧＰＲ２０を皮下移植した。ＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）投与後にその腫瘍組
織を採取してパラフィン包埋標本を作製し、ウサギキメラ化抗体１Ａ３の染色性を検討し
た。また、ＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）非投与マウスより採取した腫瘍組織を陰性対照とし
た。ｉ）と同様の方法で染色を行った。

【0299】

図３６に典型的な染色像を示す。ＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）投与動物の皮下腫瘍組織に
対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は良好な染色性を示す一方、ＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）
非投与動物の皮下腫瘍組織に対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は染色性を示さなかった。

【0300】

［実施例９］ マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色
ｉ） ヒト由来皮下移植腫瘍を用いたＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ）投与後の染色性の確認
高度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）に淡明細胞型腎細胞癌患者より採取された腫瘍組
織を皮下移植した。ＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ）投与後にその腫瘍組織を採取してパラフィン
包埋標本を作製し、マウス抗体１Ａ３の染色性を検討した。また、ＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ
）未投与のＮＯＧマウスより採取した腫瘍組織を陰性対照とした。脱パラフィンおよび抗
原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ Ｌｉｎｋ：ＤＡＫ
Ｏ社製）を用いて、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｌｏｗ ｐＨ：ＤＡＫＯ社製）、９７℃で４０分間実施した。その後の染色作業は自動
染色装置（ダコ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて室温
で実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で
１回洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋ ３％ Ｈ_２Ｏ_２（ＤＡＫＯ社製）
を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲ
で１回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）
を加え、３０分間インキュベートし、Ａｉｒ ｂｌｏｗで液を除去した。マウス抗体１Ａ
３をＲＥＡＬ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫＯ社製）で０．０３μｇ／ｍ
Ｌ～０．３μｇ／ｍＬに希釈し、６０分間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ Ｗ
ＡＳＨ ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ Ｌａ
ｂｅｌｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＃Ｋ４０００（ＤＡＫＯ社製）
を加え、３０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦ
ＦＥＲで２回洗浄した。

【0301】

ＤＡＫＯ Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ
ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを
加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＷＡＳＨ ＢＵＦＦＥ
Ｒ及びイオン交換水で計３回洗浄した。

【0302】

図３７に典型的な染色像を示す。ＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ）投与動物に対してマウス抗体
１Ａ３は良好な染色性を示し、マウス抗体１Ａ３の濃度の増加に伴って染色強度が増加し
た。一方、ＣＤＨ６－ＡＤＣ（Ｉ）非投与動物に対してマウス抗体１Ａ３は染色性を示さ
なかった。なお、ＮＯＧマウスはＢ細胞を欠損しているため、マウス由来の内在性ＩｇＧ
によるバックグラウンド染色は認められていない（Ito M, et al. Blood 100(9):3175-31
82, 2002）。

【0303】

ｉｉ） マウス抗体１Ａ３の特異性確認
マウス抗体１Ａ３を化合物（２）又はＳＮ－３８とあらかじめ混合した後、免疫染色に
用いた。

【0304】

なお、化合物（２）は、式

【0305】

【化37】

【0306】

で表される化合物である。
ＳＮ－３８は、式

【0307】

【化38】

【0308】

で表される化合物である。

【0309】

混合比は分子量に基づいてマウス抗体１Ａ３：化合物（２）：ＳＮ－３８＝０．１：０
．０４：０．０３とした。染色はｉ）と同様の方法で実施した。

【0310】

図３８に典型的な染色像を示す。化合物（２）との混合によってマウス抗体１Ａ３の染
色性は消失したが、ＳＮ－３８との混合ではマウス抗体１Ａ３の染色性は消失しなかった
。このことから、マウス抗体１Ａ３が組織中の化合物（２）を特異的に認識していること
が示された。

【0311】

［実施例１０］ 非臨床試験の血漿中濃度測定
ＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒ
ｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構築し
た。キャプチャー試薬としてマウス抗体１Ａ３をラベリングキット（ＣｈｒｏｍａＬｉｎ
ｋ Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）で
ビオチンラベル化したものを用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した
。検量線試料はマウス血漿でＧＰＲ２０－ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が、０、５、１０、２０、
５０、ｌ００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００ｎｇ/ｍＬ
になるように調製したものをＲｅｘｘｉｐ ＡＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０倍希釈した。検出試薬はＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－（Ａｎｔｉ
－ＧＰＲ２０ Ａｂ）（ここで、「（Ａｎｔｉ－ＧＰＲ２０ Ａｂ）」は、配列番号３２
においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３
３においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる
抗体を示す）ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ（７１Ｃ１）（ＩＢＬ）をＤｙＬｉｇｈｔ６５０（
登録商標）ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ（ＧＹＲＯＳ
ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０ｎＭ に調製した。これら調製し
た試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏ
ｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。Ｂｉｏａｆｆｙ２００を使用し、ｗｉｚａｒｄは２０
０－３Ｗ－００２－Ａ（ＰＭＴ１）で測定した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕ
ａｔｏｒ ３．３．９．１７５を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒ
ｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。検量線を図３９に示す。

【0312】

［実施例１１］ 臨床試験の血清中濃度測定
ＥＣＬを使用したＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）のヒト血清中濃度測定法を構築した。マウス
抗体１Ａ３をＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ、ＬＬＣ：ＭＳＤ）にコーティング後にプレートを洗浄した。ブロッキング緩衝
液（ＢＳＡ入りのＰＳ２０含有ＰＢＳ）でブロッキング後に０、２００、４００、８００
、１６００、３２００、６４００、１２８００、２００００および２５６００ｎｇ/ｍＬ
に調製したＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）をアッセイ希釈液で１０００倍に希釈して検量線試料
とした。さらに、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔ
ｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）でビオチン標識したＢｉ
ｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－（Ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）ｉｄｉｏｔｙｐ
ｅ Ａｂ（１３Ｃ１）（ＩＢＬ）とスルホタグストレプトアビジン（ＭＳＤ）をプレイン
キュベートして検出溶液を調製した。検量線試料添加後にインキュベートおよび洗浄した
プレートに検出溶液を加え、複合体を形成させた。４×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍ
ＳＤ）を精製水で２倍希釈し、洗浄後のプレートに添加してＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａ
ｇｅｒ ６０００（コントロールソフト：ＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎ
ｃｈ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０．１８）で測定した。回帰解析は４－パラメータロジステ
ィックモデル（重み：１/Ｒｅｓｐｏｎｓｅ^２）で行った。検量線を図４０に示す。

【0313】

［実施例１２］ マウス抗体１Ａ３が認識する化学構造の検証
マウス抗体１Ａ３が認識する化学構造をＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏ
ｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＥＲ２－ＡＤ
Ｃ（Ｉ）の競合阻害により検証した。競合阻害用化合物としては、化合物（１）、化合物
（２）、化合物（７）、化合物（８）、化合物（９）、化合物（１０）、化合物（１１）
、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、及びＲｕｂｉｔｅｃａｎを選定した。

【0314】

なお、化合物（１）は、式

【0315】

【化39】

【0316】

で表される化合物である。
化合物（２）は、式

【0317】

【化40】

【0318】

で表される化合物である。
化合物（７）は、式

【0319】

【化41】

【0320】

で表される化合物である。
化合物（８）は、式

【0321】

【化42】

【0322】

で表される化合物である。
化合物（９）は、式

【0323】

【化43】

【0324】

で表される化合物である（Sugimori M. et al., J Med. Chem. 1994, 3033-3039）。
化合物（１０）は、式

【0325】

【化44】

【0326】

で表される化合物である（米国特許第５８３４４７６号）。
化合物（１１）は、式

【0327】

【化45】

【0328】

で表される化合物である（Atsumi R. et al., Arzneimittel-Forschung 2001, 253-257）
。
Ｔｏｐｏｔｅｃａｎは、式

【0329】

【化46】

【0330】

で表される化合物である。
Ｒｕｂｉｔｅｃａｎは、式

【0331】

【化47】

【0332】

で表される化合物である。

【0333】

キャプチャー試薬としてマウス抗体１Ａ３をラベリングキット（ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ
Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＡＢＥＬＩＮＧ Ｋｉｔ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）でビ
オチンラベル化したものを用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した。
競合阻害用化合物である、化合物（１）、化合物（２）、化合物（７）、化合物（８）、
化合物（９）、化合物（１０）、化合物（１１）、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、及びＲｕｂｉｔ
ｅｃａｎをそれぞれＤＭＳＯに溶解後、１０％または２０％ＤＭＳＯ ｉｎ Ｒｅｘｘｉ
ｐ ＨＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、０、１
および１００ μｇ/ｍＬに調製後に７００ ｎＭのマウス抗体１Ａ３溶液を等量加えて混
和し、室温・暗所で1時間以上反応させた。ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）はＲｅｘｘｉｐ Ｈ
Ｎで、０、０．２４４、０．９７７、３．９１、１５．６、６２．５、２５０、１０００
ｎｇ/ｍＬに調製した。検出試薬はＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－（Ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ Ａｂ
）ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ（１３Ｃ１）（ＩＢＬ）をＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録商標）
ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴ
ＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０ｎＭ に調製した。上記の溶液をＧｙｒｏｌ
ａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットし、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２
００を用いて２００－３Ｗ－００２－Ａ（ＰＭＴ５）で測定した。回帰解析はＧｙｒｏｌ
ａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ ３．４．０．２４を用いて４－パラメータロジスティックモ
デル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。競合阻害用化合物の濃度ごとにＨＥＲ２－Ａ
ＤＣ（Ｉ）の検量線を作製し、ＨＥＲ２－ＡＤＣ（Ｉ）濃度の２５０ｎｇ／ｍＬ時のＲｅ
ｓｐｏｓｅを化合物非添加（濃度０ｎｇ/ｍＬ）に比較した阻害率（％）を算出した。

【0334】

阻害率グラフを図４１に示す。化合物（１）、化合物（２）、化合物（７）、及び化合
物（９）は強い競合阻害を示した。一方、化合物（８）、化合物（１０）、化合物（１１
）、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、及びＲｕｂｉｔｅｃａｎは競合阻害を示さなかった。この結果
から、マウス抗体１Ａ３は、化合物（１）の基本骨格からなり４位のメチル基が保持され
た化学構造を特異的に認識することが示された。

【配列表フリーテキスト】

【0335】

配列番号１：ＣＤＲＨ１
配列番号２：ＣＤＲＨ２
配列番号３：ＣＤＲＨ３
配列番号４：ＣＤＲＬ１
配列番号５：ＣＤＲＬ２
配列番号６：ＣＤＲＬ３
配列番号７：ＣＤＲＨ１
配列番号８：ＣＤＲＨ２
配列番号９：ＣＤＲＨ１
配列番号１０：ＣＤＲＨ２
配列番号１１：ＣＤＲＨ１
配列番号１２：ＣＤＲＨ２
配列番号１３：ＣＤＲＨ３
配列番号１４：ＣＤＲＬ１
配列番号１５：マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列
配列番号１６：マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１７：マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列
配列番号１８：マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列
配列番号１９：ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列
配列番号２０：ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２１：抗ＨＥＲ２抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２２：抗ＨＥＲ２抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２３：抗ＨＥＲ３抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２４：抗ＨＥＲ３抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２５：抗ＴＲＯＰ２抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２６：抗ＴＲＯＰ２抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２７：抗Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２８：抗Ｂ７－Ｈ３抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２９：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列
配列番号３０：ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列
配列番号３１：ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列
配列番号３２：抗ＧＰＲ２０抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号３３：抗ＧＰＲ２０抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３４：抗ＣＤＨ６抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号３５：抗ＣＤＨ６抗体軽鎖のアミノ酸配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【配列表】

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