特開 2024-113375 試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024113375

(43)【公開日】2024-08-22

(54)【発明の名称】試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20240815BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20240815BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20240815BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240815BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 515A

G01N33/543 575

G01N33/545 Z

G01N33/543 597

G01N33/483 C

G01N21/64 F

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023018310

(22)【出願日】2023-02-09

(71)【出願人】

【識別番号】000230962

【氏名又は名称】日本光電工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】中村 勘彦

(72)【発明者】

【氏名】金 大憲

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 禎司

【テーマコード（参考）】

2G043

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA16

2G043CA04

2G043DA02

2G043EA01

2G043NA01

2G043NA02

2G045FA37

2G045FB03

2G045FB12

(57)【要約】

【課題】非特異的反応を検出可能な免疫測定方法を提供すること。
【解決手段】試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法であって、前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定した蛍光粒子および前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定したラテックス粒子と、試料と、を反応させて反応物を得、フローサイトメトリーを用いて前記反応物の大きさ情報および蛍光情報を得ることによって測定対象物を検出することを有する、免疫測定方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法であって、
前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定した蛍光粒子および前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定したラテックス粒子と、試料と、を反応させて反応物を得、
フローサイトメトリーを用いて前記反応物の大きさ情報および蛍光情報を得ることによって測定対象物を検出することを有する、免疫測定方法。

【請求項2】

前記蛍光粒子に固定した特異的結合物質と、前記ラテックス粒子に固定した特異的結合物質とが、異なる物質である、請求項１に記載の免疫測定方法。

【請求項3】

前記蛍光粒子に固定した特異的結合物質および前記ラテックス粒子に固定した特異的結合物質が、抗原または抗体である、請求項１または２に記載の免疫測定方法。

【請求項4】

前記蛍光粒子および前記ラテックス粒子の平均粒子径が０．５μｍ以上である、請求項１または２に記載の免疫測定方法。

【請求項5】

前記ラテックス粒子に対する前記蛍光粒子の平均粒子径比（蛍光粒子の平均粒子径（μｍ）／ラテックス粒子の平均粒子径（μｍ））が０．５～２．０である、請求項１または２に記載の免疫測定方法。

【請求項6】

前記大きさ情報および蛍光情報の２パラメーターヒストグラムから特異的反応を判別する、請求項１または２に記載の免疫測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫測定法とは、抗原抗体反応を利用して試料中の測定対象物を測定する方法であり、微量成分を特異的に、かつ、精度よく測定できることから、広く利用されている。

【0003】

このような免疫測定法の一つに、ラテックス凝集免疫比濁法が知られている。ラテックス凝集免疫比濁法は、測定対象物と抗体もしくは抗原等を結合したラテックス粒子を反応させることでラテックス粒子を凝集させ、凝集程度の差異を吸光度測定することにより測定対象物質量の測定を行う。このようなラテックス凝集免疫比濁法は、臨床検査などでも広く使用されている。

【0004】

ラテックス凝集反応では非特異的反応が起こる場合があることが知られている。このようなラテックス凝集反応の非特異的反応を抑制するために、例えば、特許文献１では、測定試薬に脂肪酸（塩）を含ませることが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１３－１４８４９６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

このようにラテックス凝集免疫法においては、非特異的反応が起こりうるため、正確な測定結果を得るためには、非特異的反応の影響を極力排除することが望まれる。

【0007】

また、従来のラテックス凝集反応では、測定対象物の測定可能な濃度に限界がある。さらには、例えば、測定対象物が血清／血漿に含まれるものである場合などは、成分の分離を行ったりするなどの前処理が必要となる。

【0008】

そこで本発明の一目的は、非特異的反応を検出可能な免疫測定方法を提供することである。

【0009】

本発明の他の目的は、測定の高感度化を図り、また測定対象による検体の前処理を不要とする免疫測定方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法であって、前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定した蛍光粒子および前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定したラテックス粒子と、試料と、を反応させて反応物を得、フローサイトメトリーを用いて前記反応物の大きさ情報および蛍光情報を得ることによって測定対象物を検出することを有する、免疫測定方法である。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、非特異的反応が起こった場合であっても、特異的反応と切り分けることができるため、特異的反応の検出がより正確となる。また、本発明によれば、測定の高感度化を図り、また試料が例えば全血であっても試料の前処理を不要とする。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】左図はＣＲＰポリクローナル抗体を感作した蛍光粒子を調製試料に対して反応させた反応物について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）および蛍光（ＦＬ）の２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）である。右図は、蛍光強度でのヒストグラムである。

【図2A】全血を溶血処理した後の溶血サンプル（試料）について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）および蛍光（ＦＬ）の２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）である。

【図2B】全血（試料）に対して、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）および蛍光（ＦＬ）の２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）である。

【図3】本発明の一態様によって大きさ情報と蛍光情報を取得した際に得られる２パラメーターヒストグラムのイメージ図である。

【図4】トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作した蛍光粒子およびトロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作したラテックス粒子を試料に反応させた反応物について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）（ＲＡＷデータ）である。

【図5】トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作した蛍光粒子およびトロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作したラテックス粒子を試料に反応させた反応物について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）（ＲＡＷデータ）である。

【図6】トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作した蛍光粒子およびトロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作したラテックス粒子を試料に反応させた反応物について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）（解析データ）である。

【図7】トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作した蛍光粒子およびトロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作したラテックス粒子を試料に反応させた反応物について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）（解析データ）である。

【図8】実施例１、２で得られるデータにおける同時通過の集団を示す図である。

【図9】図５、図７における解析データを説明するイメージ図である。

【図10】トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作した蛍光粒子（小粒子径）およびトロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作したラテックス粒子を試料に反応させた反応物について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されず、特許請求の範囲内で種々改変することができる。また、本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。本明細書において、「Ｘおよび／またはＹ」とは、ＸおよびＹの少なくとも一方を含むことを意味し、「Ｘ単独」、「Ｙ単独」および「ＸおよびＹの組み合わせ」を包含する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～３０℃）／相対湿度２０～８５％ＲＨの条件で測定する。

【0014】

本発明の一態様は、試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法であって、当該測定対象物に対する特異的結合物質を固定した蛍光粒子および当該測定対象物に対する特異的結合物質を固定したラテックス粒子と、試料と、を反応させて反応物を得、フローサイトメトリーを用いて前記反応物の大きさおよび蛍光強度を測定することによって測定対象物を検出することを有する、免疫測定方法である。ここで、免疫測定とは、上記反応物の濃度や量等を測定することを意味する。また、測定対象物の「検出」とは、測定対象物が試料中に存在するか否かを検出する任意の方法を指し、例えば、発現の検出、量の検出が挙げられる。

【0015】

本態様においては、フローサイトメトリーを用いる。フローサイトメトリーでは、反応液全体としての粒子の凝集の程度を測定するのではなく、凝集したラテックス粒子および／または蛍光粒子を１つの塊として一つずつ複数個測定するので、少しでも凝集があれば検出できる。また、フローサイトメトリーを用いることで、散乱光からの大きさ情報（前方散乱光（ＦＳ））および蛍光情報（ＦＬ）を得ることができる。ゆえに、本態様によれば高感度化が可能となる。

【0016】

また、ラテックス凝集免疫比濁法では、採取した血液（全血）をそのまま用いると、赤血球やヘモグロビン等の影響を受け、正確な定量測定を行うことができない。このため、例えば、血清中に含まれるものを測定する場合には、採取した血液を遠心分離するなど前処理を行っていた。このため測定時間が長くかかり、緊急の場合や遠心分離器の無い施設では測定が困難であった。

【0017】

本態様においては、試料中の測定対象物を認識可能な蛍光粒子とラテックス粒子とが、測定対象物に結合することで、凝集物を形成する。血球細胞は自家蛍光を有するが、当該凝集物は、蛍光粒子による強い蛍光情報を持つため、血球細胞の蛍光強度の弱い自家発光とは明確に区別がつく。よって、試料の前処理が不要となる。

【0018】

図１左図は、ＣＲＰポリクローナル抗体（日本バイオテスト研究所）を感作した蛍光粒子（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，０．７５μｍ ＹＧ（ポリサイエンス社））を調製試料に対して反応させた反応物に対して、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｖｉａ、ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製）を用いて得られた前方散乱光（ＦＳ）および蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（スキャッタグラム）である。図１右図は、蛍光強度でのヒストグラムである。ここで、調製試料は、高濃度ＣＲＰ抗原（ＣＬＩＮＩＱＡ社、ＣＲＰ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｅｒｕｍ）を１％ＢＳＡ含有生理食塩水で希釈したものであり、ＣＲＰ抗原濃度は２００μｇ／ｍＬである。図１左図においては３つの集団が存在しているが、一番サイズの小さい集団は、蛍光粒子が凝集していない集団、二番目のサイズの集団は、蛍光粒子がＣＲＰ抗原に２つ結合した集団、三番目のサイズの集団は、蛍光粒子がＣＲＰ抗原に３つ結合した集団である。そして、図１においては、粒子が凝集していない一番サイズの小さい集団を未反応と、粒子が凝集している二番目のサイズ、三番目のサイズ以上の集団を反応とみなす。なお、図１において、未反応、反応の境界を示す線は、例えば、蛍光強度を横軸、取り込み数（イベント数）を縦軸にしてヒストグラムを作成し（図１右図）、となり合う粒子１つの集団の山と、粒子２つが結合した集団の山の裾が十分に下がったところの箇所で切り分けることができる。図２Ａは、全血（ヒト、健常者）を溶血処理した後の溶血サンプル（試料）について、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）および蛍光（ＦＬ）の２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）である。図２Ｂは、全血（試料）に対して、フローサイトメトリーを用いて得られた、前方散乱光（ＦＳ）および蛍光（ＦＬ）の２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）である。なお、ヒトからの全血試料の採取はすべて、インフォームドコンセントを行って提供者の意思を確認した後に実施した。

【0019】

図１と図２の横軸の蛍光強度のスケールから理解されるように、血球細胞の自家蛍光の蛍光強度は、測定対象物と反応した凝集物の蛍光強度と比較して非常に弱い。このため、測定対象物と反応した凝集物は、図１のヒストグラム内で血球細胞と明確に分けることができる。ゆえに、本態様の測定方法によれば、血液試料の前処理を行って成分の分離を行う必要がない。なお、上記図１に示されるデータの取得における方法においては、本態様の理解を深めるために、ラテックス粒子を用いていないが、上記図１の形式によって本発明の技術的範囲は何ら影響を受けるものではない。

【0020】

さらには、大きさ情報だけで測定対象物を検出する場合、粒子凝集物の集団と血液中の成分（例えば、血小板）の集団とが切り分けられない場合がある。本態様のように、蛍光粒子だけではなく、蛍光を発しないラテックス粒子を組み合わせることで、大きさ情報の他、蛍光情報も得られるので、試料中の非特異的成分と切り分けることが可能となる。

【0021】

これについて、以下、図３を用いて説明する。

【0022】

図３は、本態様によって大きさ情報と蛍光情報を取得した際に得られるイメージ図である。●がラテックス粒子、○が蛍光粒子となる。図３において、縦軸は大きさ情報、横軸は蛍光情報となる。試料と反応させると、試料中の測定対象物を蛍光粒子および／またはラテックス粒子中の特異的結合物質が認識して凝集物を形成する。ラテックス粒子および蛍光粒子の粒子径がおおよそ同じである場合、下から粒子が凝集していない集団、粒子が２つ結合した集団、粒子が３つ結合した集団、粒子が４つ結合した集団の大きさの順に並ぶ。そして、横軸は蛍光強度の大きさとなるため、一番左から蛍光粒子が１つ存在する集団、蛍光粒子が２つ結合した集団、蛍光粒子が３つ結合した集団となる。通常、測定対象物は有意に小さい大きさ（おおよそ数１００ｋＤａ以下）であるため、測定に影響を与えない。また、●のみの粒子または凝集体は、蛍光を発しないため、前方散乱光（ＦＳ）および蛍光（ＦＬ）の２パラメーターヒストグラムには表示されないが、ここでは理解を容易にするために、参考的に図示している。

【0023】

ラテックス粒子と蛍光粒子の２つの粒子が測定対象物に結合するように特異的結合物質を設計することで、測定対象物には、ラテックス粒子および蛍光粒子の双方が結合し、凝集物を形成しやすくなる。ゆえに、蛍光粒子に固定した特異的結合物質と、ラテックス粒子に固定した特異的結合物質とが、異なる物質であることが好ましい。一例として、蛍光粒子に固定された特異的結合物質およびラテックス粒子に固定された特異的結合物質が、双方ともモノクローナル抗体であり、抗体認識部位（エピトープ）が互いに異なる。

【0024】

このように、ラテックス粒子と蛍光粒子の双方が結合した凝集物が測定対象物と特異的に反応した反応物とみなすことができる。そして、ラテックス粒子のみ２つ以上凝集した凝集物（例えば、抗体同士の凝集体）や、蛍光粒子のみ２つ以上凝集した凝集物（例えば、抗体同士の凝集体）は非特異的反応となる（図３参照）。よって、非特異的反応が生じた場合であっても、本態様によれば、特異的反応と切り分けて検出可能となる。

【0025】

本態様は、（１）反応工程：測定対象物に対する特異的結合物質を結合した蛍光粒子および測定対象物に対する特異的結合物質を結合したラテックス粒子と、試料と、を反応させて反応物を得る、（２）測定工程：フローサイトメトリーを用いて反応物の大きさおよび蛍光強度を測定することによって測定対象物を検出する、ことを有する。

【0026】

以下、各工程について説明する。

【0027】

（１）反応工程：測定対象物に対する特異的結合物質を固定した蛍光粒子および測定対象物に対する特異的結合物質を固定したラテックス粒子と、試料と、を反応させて反応物を得る。ここで反応とは、測定対象物と特異的結合物質が結合するようないかなる形式も含む。また、反応物とは、反応（接触）後に得られた凝集物を含む反応液全体を意図する。

【0028】

蛍光粒子と、ラテックス粒子と、は同時に反応させても、別々に（順次）反応させてもよい。

【0029】

蛍光粒子およびラテックス粒子と、試料とを反応させる際の反応温度は、通常４～５０℃、好ましくは４～４２℃、さらに好ましくは２０～４０℃であり、反応時間は、例えば、１～６０分間であり、１～３０分間であってもよい。

【0030】

蛍光粒子およびラテックス粒子の平均粒子径比は、反応性の観点から、蛍光粒子の平均粒子径（μｍ）／ラテックス粒子の平均粒子径（μｍ）＝０．２～４．０であることが好ましく、０．５～２．０であることがより好ましい。

【0031】

なお、本明細書における平均粒子径は、統計上有意な数（例えば、少なくとも２００個、好ましくは少なくとも３００個）のサンプルについて透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像より調べられる粒子の粒子径の平均値である。ここで、「粒子径」とは、粒子の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の距離を意味するものとする。

【0032】

以下、本工程に用いられる材料について説明する。

【0033】

＜試料＞
測定対象の試料は、例えば、被験者から採取された生体試料である。

【0034】

本明細書において、「被験者」は、動物であれば特に限定されないが、例えば、哺乳動物等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、被験者はヒトである。

【0035】

また、生体試料について特に制限はなく、従来臨床検査において一般的に用いられている生体試料が用いられうる。生体試料としては、例えば、被験者である動物由来の組織、細胞、細胞抽出成分、体液等が挙げられる。組織としては、脾臓、リンパ節、腎臓、肺、心臓、肝臓等が、細胞としては、脾細胞、リンパ細胞、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、抗体産生細胞等が、体液としては、血液試料のほか、腹水、体腔液、尿、汗、脊髄液、唾液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液等が挙げられる。なかでも、生体試料は好ましくは血液試料、尿、唾液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液であり、より好ましくは血液試料である。

【0036】

「血液試料」としては、特に制限されないが、本態様においては、特別な前処理をすることなく測定対象物を検出することができる。したがって、生体試料として、全血試料は好適な形態である。ここで、全血試料とは、被験者から採取した血液であって、血清や血漿を分離する処理を行っていないものを意味する。

【0037】

生体試料は、被験者から採取直後のものを測定に用いることが好ましいが、保存したものを用いてもよい。生体試料の保存方法としては、測定対象物が変化しない条件であれば特に制限はなく、例えば０～１０℃の凍結しない程度の低温条件、暗所条件および無振動条件下が好ましい。

【0038】

試料は、緩衝液（希釈液）で希釈してもよい。緩衝液と混合して希釈することで、免疫凝集反応を効率的に行わせることができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝溶液、トリシン緩衝液等を使用することができる。緩衝液のｐＨは、例えば、６～８．５である。緩衝液には、ＰＥＧやプルロニック等の増感剤、ＢＳＡなどのタンパク質安定剤、アジ化ナトリウムなどの防腐剤を使用してもよい。試料を緩衝液で希釈する場合の希釈倍率は、試料の形態などを考慮して適宜設定すればよいが、例えば１０～８０倍である。

【0039】

＜蛍光粒子＞
蛍光粒子としては、特に限定されるものではないが、例えば、蛍光色素、蛍光顔料および希土類等を含む、ポリマー粒子（例えばポリスチレン粒子）、シリカ粒子、および、シリコン粒子などが挙げられる。これらは、市販品も利用可能である。また、特異的結合物質（例えば、抗体）との反応性を向上させるために、蛍光粒子は、表面にカルボキシル基、アミノ基、メチル基、チオール基、ヒドロキシル基、ビオチン、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）鎖を有することが好ましい。

【0040】

蛍光粒子に含まれうる蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、フィコエリスリン（ＰＥ）などが挙げられる。

【0041】

本態様においては、大きさ情報を得ることができる蛍光を発する物質は「粒子」である。ここで、フローサイトメトリーにて大きさの情報を取得するためには、使用するレーザーの波長より粒子の平均粒子径が大きいことが好ましい。一般的に使用されるレーザーの波長は４８８ｎｍ（青色）、６４０ｎｍ（赤色）であるため、（特異的結合物質結合前の）蛍光粒子の平均粒子径は、０．５μｍ以上であることが好ましい。また、（特異的結合物質結合前の）蛍光粒子の平均粒子径は、１０μｍ以下であることが好ましく、試薬の調製の際に分散液を作製しやすい、粒子数を多くすることができるなどの理由から、３μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以下であってもよい。

【0042】

蛍光粒子に特異的結合物質を固定する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシル基が導入された蛍光粒子を、カルボジイミドによって活性化し、抗体中のアミノ基と結合させるなどの方法が挙げられる。このような活性化は、市販のキットを用いて行ってもよい。

【0043】

蛍光粒子は通常懸濁液として使用され、溶媒としては、水、緩衝液等が用いられ、水であることが好ましい。緩衝液としては、上記で記載したものが挙げられる。

【0044】

＜ラテックス粒子＞
ラテックス粒子としては、通常公知のものを用いることができ、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン－ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート－ブタジエン共重合体、アクリロニトリル－ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子が挙げられる。

【0045】

ラテックス粒子に特異的結合物質を固定する方法は、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、特異的結合物質が抗体である場合、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックス粒子とを化学結合により固相する方法（例えば、カルボキシル基が導入されたラテックス粒子を、カルボジイミドによって活性化し、抗体中のアミノ基と結合させるなどの方法）や、ビオチン－アビジン反応により抗体を固定化する方法も選択できる。

【0046】

フローサイトメトリーにて大きさの情報を取得するためには、使用するレーザーの波長より粒子の粒径が大きいことが好ましい。一般的に使用されるレーザーの波長は４８８ｎｍ（青色）、６４０ｎｍ（赤色）であるため、（特異的結合物質結合前の）ラテックス粒子の平均粒子径は、０．５μｍ以上であることが好ましい。また、（特異的結合物質結合前の）ラテックス粒子の平均粒子径は、１０μｍ以下であることが好ましく、試薬の調製の際に分散液を作製しやすい、粒子数を多くすることができるなどの理由から、３μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以下であってもよい。

【0047】

ラテックス粒子は通常懸濁液として使用され、溶媒としては、水、緩衝液等が用いられ、水であることが好ましい。緩衝液としては、上記で記載したものが挙げられる。

【0048】

＜特異的結合物質＞
特異的結合物質としては、抗体、改変抗体、抗原、アプタマー、リガンド分子、リガンドミミックス、リガンドとの結合に競合する阻害剤、接着分子に対して結合する細胞外基質や接着因子、それらのミミックス（ｍｉｍｉｃｓ）、酵素に対する基質、当該酵素の阻害剤、当該酵素に対してアロステリック効果を及ぼす物質、糖鎖に対して結合するレクチン、ホルモンや神経伝達物質といったシグナル物質やその受容体、アビジンやビオチン等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。なお、抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。ここで、ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。好適な態様は、反応性の観点から、蛍光粒子に固定した特異的結合物質およびラテックス粒子に固定した特異的結合物質が、抗原または抗体であり、より好ましくは抗体である。

【0049】

蛍光粒子に結合する特異的結合物質とラテックス粒子に結合する特異的結合物質とは、測定対象物の異なる位置に結合することが好ましい。同じ位置に結合すると、両者の結合が競合し、蛍光粒子およびラテックス粒子の両方が結合できない可能性がある。例えば、特異的結合物質が抗体である場合、蛍光粒子に結合する特異的結合物質とラテックス粒子に結合する特異的結合物質は、測定対象物の異なる部位を認識する異なる２種の抗体である。当該２種の抗体は、各々モノクローナル抗体であることが好ましい。

【0050】

測定対象物に対する特異的結合物質を固定した蛍光粒子、測定対象物に対する特異的結合物質を固定したラテックス粒子における「固定」とは、特異的結合物質が直接に蛍光粒子またはラテックス粒子に結合している場合だけではなく、他の分子結合やリンカーを介して間接的に特異的結合物質が蛍光粒子またはラテックス粒子に結合している場合を含む。

【0051】

＜測定対象物＞
測定対象物は特に限定されず、タンパク質、ペプチド型ホルモンなどのペプチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質等である。

【0052】

タンパク質としては、例えば、血漿タンパク質、血清タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ホルモン、腫瘍マーカー、アポタンパク質、ウイルス抗原、自己抗体、疾患マーカー等が挙げられる。

【0053】

血漿タンパク質や血清タンパク質としては、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体成分（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ１ｑ）、ＣＲＰ、α１－アンチトリプシン、α１－マイクログロブリン、β２－マイクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチンなどが挙げられる。

【0054】

ホルモンとしては、例えば、下垂体ホルモン（ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＨ、ＡＣＴＨ、ＴＳＨ、プロラクチン）、甲状腺ホルモン（Ｔ３、Ｔ４、サイログロブリン）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質ホルモン（アルドステロン、コルチゾール）、性腺ホルモン（ｈＣＧ、エストロゲン、テストステロン、ｈＰＬ）、膵・消化管ホルモン（インスリン、Ｃ－ペプチド、グルカゴン、ガストリン）等が挙げられる。

【0055】

腫瘍マーカーとしては、例えば、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９－９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＳＣＣ抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、γ－セミノプロテイン、ＴＰＡ、エラスターゼＩ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）などが挙げられる。

【0056】

疾患マーカーとしては、例えば、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）、ＣＫのアイソザイムであるＣＫ－ＭＢ、ミオグロビン、心臓型脂肪酸結合蛋白（Ｈ－ＦＡＢＰ）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、心筋トロポニンＴ（ＴｎＴ）、心筋トロポニンＩ（ＴｎＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）などが挙げられる。

【0057】

また、測定対象物が複合体である場合、例えば、四量体であるヘモグロビンの場合、特異的結合物質が結合できるように、単量体となるような前処理を行えばよい。

【0058】

（２）測定工程：フローサイトメトリーを用いて凝集物の大きさおよび蛍光強度を測定する。

【0059】

＜フローサイトメトリー＞
測定工程で使用できるフローサイトメーターは、特に制限されず、公知の機器を用いることができる。フローサイトメーターとしては、セルソーター（自動細胞解析分取装置）、セルアナライザー（自動細胞解析装置）、高分解能型セルアナライザー、高速型セルアナライザーなどが挙げられる。

【0060】

フローサイトメトリーの具体的な手順については、特に制限されず、従来公知の知見（例えば、特開２０１２－４７５９４号公報、特開２０１４－２３４３９号公報など）を適宜参照することができる。また、フローサイトメトリーは、フローサイトメーターの製造会社のプロトコルに従って、行うことができる。

【0061】

フローサイトメトリーにより、蛍光発光および前方散乱光に基づくデータを取得することができる。

【0062】

フローサイトメトリーの測定は以下の条件が好ましい。すなわち、励起光は、青色固体レーザー（波長λ＝４８８ｎｍ）を用い、前方散乱光ＦＳＣ（＜１５°）、及び蛍光粒子の蛍光波長に合わせて３種類の蛍光シグナルＦＬ１～３のいずれか（または全て）を測定することが好ましい。なお、蛍光シグナルＦＬ１～３を測定するために、緑の蛍光（ＦＬ１）には５１５～５４５ｎｍ、特に５３０ｎｍの帯域フィルター（band pass filter）を使用することが好ましく、黄橙色の蛍光（ＦＬ２）には５６４～６０６ｎｍ、特に５８５ｎｍの帯域フィルターを使用することが好ましく、赤色の蛍光（ＦＬ３）には６５５～８００ｎｍ、特に６７０ｎｍの長波長帯域フィルターを使用することが好ましい。

【0063】

順番に青色固体レーザー（λ４８８ｎｍ）を照射すると、レーザー光の軸に対して１．５°～１９°の小さい角度で散乱する。これは前方散乱光（Forward Scattered Light：ＦＳＣ）と呼ばれ、その散乱度は粒子の大きさにほぼ比例する。そして、例えば、前方散乱光パルス面積（ＦＳＣ－Ａ）と蛍光発光パルス面積（ＦＬ－Ａ）で展開し、測定対象領域にゲーティングする。「ゲーティング」とは、サンプルの中の関心のある細胞集団だけを選び出し、その細胞のみのヒストグラムを作ることをいう（「ゲートを設定する」ともいう）。この際、例えば、同時通過（検出部を凝集体または粒子が２個以上通過してしまうこと）を解析から除く必要がある。そして、ゲーティングした領域の細胞をヒストグラムで展開し、例えば２パラメータヒストグラムなどを作成する。このように作成されたヒストグラムから、非特異的結合および特異的結合を切り分け、特異的反応を判別する。非特異的結合の切り分けは、上記図３の説明の欄で記載したとおりである。そして、例えば、特異的結合と判別された集団の個数をカウントすると、測定対象物の量や濃度が測定できる。具体的には、既知の濃度の測定対象物について、本態様の方法により測定対象物について濃度（横軸）と特異的結合（反応物）の割合（縦軸）（反応物のカウント数／総カウント数（反応物のカウント数＋未反応物のカウント数））との検量線を作成した後、目的試料について、本態様の方法により大きさ情報および蛍光情報から特異的結合（反応物）の割合を得て、上記検量線から目的試料中の測定対象物の濃度を算出することができる。さらに、本態様の方法によれば、測定について非特異的反応が存在することを検知することができる。

【実施例0064】

本発明の効果を、以下の実施例を用いて説明する。特記しない限り、各操作は、室温（２０～３０℃）で行われる。

【0065】

＜参考例 ＣＲＰポリクローナル抗体を結合させた蛍光粒子を用いたフローサイトメトリー（測定感度、スキャッタグラムの検証）＞
１．使用装置
フローサイトメーター：ＦＡＣＳ Ｖｉａ
測定条件
流速：Ｆａｓｔ（６６μＬ／ｍｉｎ）
測定量：５０μＬ
スレッショルド：ＦＳＣ：５０００
２．抗体
ＣＲＰポリクローナル抗体（日本バイオテスト研究所）
３．粒子
蛍光粒子：Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２．５％ Ｓｏｌｉｄｓ－Ｌａｔｅｘ），０．７５μｍ ＹＧ（ポリサイエンス社）、ＦＬ１で検出可能
４．試薬
・粒子試薬：０．１％（～０．２％）粒子濃度（ｗ／ｖ）（粒子に抗体を感作したものを使用）、粒子を蒸留水で分散
・希釈試薬：
（以下の希釈試薬の組成に増感剤を含む場合がある。増感剤としてはＰＥＧ２００００（０．２５～０．５０％（ｗ／ｖ））、プルロニック（登録商標）Ｆ－１２７（１．０％（ｗ／ｖ））を使用）

【0066】

【表1】

【0067】

５．測定手順
（１）希釈試薬：０．１％蛍光粒子溶液＝１００．６：６０．９（ｖ／ｖ）の割合で混合した。
（２）（１）の反応液に２μＬのサンプルを加えた。測定サンプルは、高濃度ＣＲＰ抗原（ＣＬＩＮＩＱＡ社、ＣＲＰ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｅｒｕｍ）を１％ＢＳＡ含有生理食塩水で希釈したものであり、ＣＲＰ抗原濃度は２００μｇ／ｍＬである。
（３）３７℃，９０秒（～２０分）反応させた。
（４）希釈試薬１９９８μＬへ２μＬの（２）を加えた。
（５）フローサイトメーターで測定し、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）を得た。

【0068】

結果を図１に示す。図１において、蛍光粒子１個、２個、３個・・となるにつれ、大きさと蛍光強度が比例的に増加する。したがって、図１において、蛍光強度が一番小さく、大きさが一番小さい集団が蛍光粒子１個の集団であり、順に、蛍光粒子２個の集団、蛍光粒子３個の集団となる。そして、蛍光粒子１個の集団は未反応物であり、蛍光粒子２個以上の集団が特異的反応物となる（測定対象物（ＣＲＰ）と反応した凝集物である）。ゆえに、図１のヒストグラム内で未反応物と反応物とが明確に分けられていることがわかる。

【0069】

＜実施例１：トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作した蛍光粒子およびトロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作した通常ラテックス粒子を用いた測定＞
１．使用装置
フローサイトメーター：ＦＡＣＳ Ｖｉａ
測定条件
流速：Ｆａｓｔ（６６μＬ／ｍｉｎ）
測定量：５０μＬ
スレッショルド：ＦＳＣ：５０００
２．抗体
トロポニンＴモノクローナル抗体（ＴＴ－５０２、ＴＴ－５０３、日本バイオテスト研究所）
３．粒子
蛍光粒子：Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，（２．５％ Ｓｏｌｉｄｓ－Ｌａｔｅｘ），０．７５μｍ ＹＧ（ポリサイエンス社）、ＦＬ１で検出可能
ラテックス粒子：平均粒子径０．６２６μｍ（ポリスチレン系、日本光電工業）
４．試薬
・粒子試薬：０．１％（～０．２％）粒子濃度（ｗ／ｖ）（粒子に抗体を感作したものを使用）、粒子を下記に示す希釈試薬で分散
・希釈試薬：
（以下の希釈試薬の組成に増感剤を含む場合がある。増感剤としてはＰＥＧ２００００（０．２５～０．５０％（ｗ／ｖ））、プルロニック（登録商標）Ｆ－１２７（１．０％（ｗ／ｖ））を使用）

【0070】

【表2】

【0071】

５．測定手順
（１）希釈：測定サンプル＝１００．６：２（ｖ：ｖ）の割合で混合した。これをサンプルミックスとした。なお、測定サンプルは、トロポニンＴ抗原濃度が１０μｇ／ｍＬ，７μｇ／ｍＬ，４μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬ，０μｇ／ｍＬとした（希釈溶媒：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，７Ｍ Ｕｒｅａ，１５ｍＭメルカプトエタノール，５ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａ，ｐＨ７．５＋／－０．１。抗原はＳＣＲＩＰＰＳ社、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ，Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｒｔ， Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ（カタログＮｏ．Ｔ１５１４））。
（２）サンプルミックス６８．４μＬを適当なチューブへ移した。
（３）３７℃でプレインキュベートした。
（４）トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作した０．１％（ｗ／ｖ）蛍光粒子（０．７３μｍ）溶液２０．３μＬを６８．４μＬサンプルミックスに加えた。
（５）３７℃で９０秒反応させた。
（６）トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作した０．１％（ｗ／ｖ）ラテックス粒子（０．６２６μｍ）溶液２０．３μＬを（５）に加えた。
（７）３７℃，９０秒反応させた。
（８）希釈試薬１９９８μＬへ２μＬの（７）を加えた。
（９）フローサイトメーターで測定し、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）を得た。

【0072】

結果を図４、図６に示す。図４はＲＡＷデータであり、図６は、ＲＡＷデータのスキャッタグラムからラテックス粒子のみの反応、同時通過（検出部を通過した２個以上の粒子。フローサイトメトリーでは通常、粒子は一つずつ検出部を通過する。図８の○部分）を除去し同一のゲートを適用したものである。

【0073】

＜実施例２：トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を感作した蛍光粒子およびトロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を感作した通常ラテックス粒子を用いた測定＞
１．使用装置、２．抗体、３．粒子、４．試薬については、実施例１と同様のものを用いた。

【0074】

５．測定手順
（１）希釈：測定サンプル＝１００．６：２（ｖ／ｖ）の割合で混合した。これをサンプルミックスとする。なお、測定サンプルは、トロポニンＴ抗原濃度が１０μｇ／ｍＬ，７μｇ／ｍＬ，４μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬ，０μｇ／ｍＬとした（希釈溶媒：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，７Ｍ Ｕｒｅａ，１５ｍＭメルカプトエタノール，５ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａ，ｐＨ７．５＋／－０．１。抗原はＳＣＲＩＰＰＳ社、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ，Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｒｔ， Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ（カタログＮｏ．Ｔ１５１４））。
（２）サンプルミックス６８．４μＬを適当なチューブへ移した。
（３）３７℃でプレインキュベートした。
（４）トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を物理吸着により感作した０．１％（ｗ／ｖ）ラテックス粒子（０．６２６μｍ）溶液２０．３μＬを６８．４μＬサンプルミックスに加えた。
（５）３７℃で９０秒反応させた。
（６）トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を化学結合により感作した０．１％（ｗ／ｖ）蛍光粒子（０．７３μｍ）溶液２０．３μＬを（５）に加えた。
（７）３７℃，９０秒反応させた。
（８）希釈試薬１９９８μＬへ２μＬの（７）を加えた。
（９）フローサイトメーターで測定し、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）を得た。

【0075】

結果を図５、図７に示す。図５はＲＡＷデータであり、図７は、ＲＡＷデータのスキャッタグラムからラテックス粒子のみの反応、同時通過（検出部を通過した２個以上の粒子。フローサイトメトリーでは通常、粒子は一つずつ検出部を通過する。図８の○部分）を除去し同一のゲートを適用したものである。

【0076】

図４、図５のＲＡＷデータから図６，図７のような解析データが作成できる。図９は、解析データのイメージ図である。解析データの作成は特に限定されるものではないが、例えば以下の様な手順で行われる。（１）同時通過の集団を除去する。（２）大きさ情報、蛍光情報から、（ラテックス粒子を含まない）蛍光粒子１個のみの集団群を未反応として判別する（図９未反応対照）。（３）蛍光情報から、蛍光粒子が１個存在する集団を特定し、（２）で未反応として判別された集団よりも大きさが大きい集団を特異的反応と判別する（図９蛍光粒子１個と複数のラテックスが結合した領域、ここで複数とは、ラテックス粒子が１個以上結合していることを意味する）。（４）蛍光情報から蛍光粒子が２個存在する集団を特定する。（５）大きさ情報から、（ラテックス粒子を含まない）蛍光粒子２個のみの集団を特定する。（６）（４）、（５）と同様に蛍光粒子がｎ個存在する集団、（ラテックス粒子を含まない）蛍光粒子ｎ個のみの集団を特定する。（７）（４）～（６）の情報から、（ラテックス粒子を含まない）蛍光粒子のみの集団を非特異的反応として判別する（図９蛍光粒子の非特異反応が出てくる領域）。
以上の（１）～（７）の手順により、非特異的反応／特異的反応を判別することができる。

【0077】

トロポニンＴ抗体 ＴＴ５０２とＴＴ５０３は抗原抗体反応でサンドイッチ反応が行えるペアである。ＴＴ５０２は事前の検証においてそれのみで抗原抗体反応でサンドイッチ反応が確認できたのでポリクローナル抗体の様な反応を示す。よって、ＴＴ５０２の抗体を感作した粒子はそれのみで凝集塊を作るため疑似的な非特異的反応が起こっているとしてみることができる。一方で、ＴＴ５０３抗体はそれのみでは凝集塊を作らないことを確認している。

【0078】

ＴＴ５０３感作蛍光粒子、ＴＴ５０２感作ラテックス粒子を使用した反応（実施例１）においては、疑似的な非特異的反応が蛍光を発しないラテックス粒子同士の凝集のため、縦軸粒子の大きさ、横軸蛍光強度としたスキャッタグラムでは当該凝集はほぼ表示されない。したがって、縦軸粒子の大きさ、横軸蛍光強度としたスキャッタグラム（図６）では、非特異的反応は表示されず、主に特異的反応が表示される。

【0079】

逆に、ＴＴ５０２感作蛍光粒子、ＴＴ５０３感作ラテックス粒子を使用した反応（実施例２）では、疑似的な非特異的反応が蛍光粒子同士の凝集のため、縦軸粒子の大きさ、横軸蛍光強度としたスキャッタグラム（図５、図７）では、図３のイメージ図で示されたような蛍光粒子同士の非特異的反応が表示される。このように、本測定方法によれば抗体同士の結合のような非特異的反応が生じた場合に、当該非特異的反応を検出できることがわかる。

【0080】

＜実施例３.蛍光粒子サイズの検証＞
１．使用装置、２．抗体、４．試薬については、実施例１と同様のものを用いた。

【0081】

３．粒子
蛍光粒子：Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２．５％ Ｓｏｌｉｄｓ－Ｌａｔｅｘ），０．２０μｍ ＹＧ（ポリサイエンス社）、ＦＬ１で検出可能
ラテックス粒子：平均粒子径０．６２６μｍ（ポリスチレン系、日本光電工業）
５．測定手順
（１）希釈：測定サンプル＝１００．６：２（ｖ／ｖ）の割合で混合した。これをサンプルミックスとする。なお、測定サンプルは、トロポニンＴ抗原濃度が１０μｇ／ｍＬ，７μｇ／ｍＬ，４μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬ，０μｇ／ｍＬとした（希釈溶媒：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，７Ｍ Ｕｒｅａ，１５ｍＭメルカプトエタノール，５ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａ，ｐＨ７．５＋／－０．１。抗原はＳＣＲＩＰＰＳ社、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ，Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｒｔ， Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ（カタログＮｏ．Ｔ１５１４））。
（２）サンプルミックス６８．４μＬを適当なチューブへ移した。
（３）３７℃でプレインキュベートした。
（４）トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０３）を化学結合により感作した０．１％（ｗ／ｖ）蛍光粒子（０．１９μｍ）溶液２０．３μＬを６８．４μＬサンプルミックスに加えた。
（５）３７℃で９０秒反応させた。
（６）トロポニンＴ抗体（ＴＴ５０２）を物理吸着により感作した０．１％（ｗ／ｖ）ラテックス粒子（０．６２６μｍ）溶液２０．３μＬを（５）に加えた。
（７）３７℃，９０秒反応させた。
（８）希釈試薬１９９８μＬへ２μＬの（７）を加えた。
（９）フローサイトメーターで測定し、前方散乱光（ＦＳ）と蛍光（ＦＬ）との２パラメーターヒストグラム（ＦＳ×ＦＬ ２サイトグラム）を得た。

【0082】

結果を図１０に示す。図４（実施例１）と図１０（実施例３）の結果を比較すると、図４のほうが蛍光強度が高く、また、解析にて血球細胞と分離する際に有利であると考えられる。これは、実施例１で用いた蛍光粒子の平均粒子径が０．５μｍ以上であることに起因すると考えられる。

【0083】

本発明の実施形態を詳細に説明したが、これは説明的かつ例示的なものであって限定的ではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって解釈されるべきであることは明らかである。

【0084】

本発明は、下記態様または形態を包含する。

【0085】

１．試料中の測定対象物を検出する免疫測定方法であって、
前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定した蛍光粒子および前記測定対象物に対する特異的結合物質を固定したラテックス粒子と、試料と、を反応させて反応物を得、
フローサイトメトリーを用いて前記反応物の大きさ情報および蛍光情報を得ることによって測定対象物を検出することを有する、免疫測定方法。

【0086】

２．前記蛍光粒子に固定した特異的結合物質と、前記ラテックス粒子に固定した特異的結合物質とが、異なる物質である、１．に記載の免疫測定方法。

【0087】

３．前記蛍光粒子に固定した特異的結合物質および前記ラテックス粒子に固定した特異的結合物質が、抗原または抗体である、１．または２．のいずれかに記載の免疫測定方法。

【0088】

４．前記蛍光粒子および前記ラテックス粒子の平均粒子径が０．５μｍ以上である、１．～３．のいずれかに記載の免疫測定方法。

【0089】

５．前記ラテックス粒子に対する前記蛍光粒子の平均粒子径比（蛍光粒子の平均粒子径（μｍ）／ラテックス粒子の平均粒子径（μｍ））が０．５～２．０である、１．～４．のいずれかに記載の免疫測定方法。

【0090】

６．前記大きさ情報および蛍光情報の２パラメーターヒストグラムから特異的反応を判別する、１．～５．のいずれかに記載の免疫測定方法。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】