特開 2024-114840 新規乳酸菌用培地

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024114840

(43)【公開日】2024-08-23

(54)【発明の名称】新規乳酸菌用培地

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20240816BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20240816BHJP

   C12N 1/04 20060101ALI20240816BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

A23L33/135

C12N1/20 D

C12N1/20 B

C12N1/04

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024102902

(22)【出願日】2024-06-26

(62)【分割の表示】P 2020021764の分割

【原出願日】2020-02-12

(71)【出願人】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】110000590

【氏名又は名称】弁理士法人 小野国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】曽根 春恵

(72)【発明者】

【氏名】島川 康久

(57)【要約】

【課題】食品素材で構成され、乳酸菌の増殖性が良好な培地を提供すること。
【解決手段】酵母エキス及び発酵大麦エキスを含有する乳酸菌用培地。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

酵母エキス及び発酵大麦エキスを含有する乳酸菌用培地。

【請求項2】

酵母エキスがビール酵母エキスである請求項１記載の乳酸菌用培地。

【請求項3】

発酵大麦エキスが、大麦焼酎蒸留残液である請求項１または２記載の乳酸菌用培地。

【請求項4】

更に、乳化剤を含有する請求項１～３のいずれかの項記載の乳酸菌用培地。

【請求項5】

乳化剤が、モノオレイン酸デカグリセリンである請求項４記載の乳酸菌用培地。

【請求項6】

更に、糖類を含有する請求項１～５のいずれかの項記載の乳酸菌用培地。

【請求項7】

糖類が、グルコースである請求項６項記載の乳酸菌用培地。

【請求項8】

乳成分を含まないものである請求項１～７のいずれかの項記載の乳酸菌用培地。

【請求項9】

大豆成分を含まないものである請求項１～８のいずれかの項記載の乳酸菌用培地。

【請求項10】

乳酸菌の凍結保存用である請求項１～９のいずれかの項記載の乳酸菌用培地。

【請求項11】

ラクトバチルス属乳酸菌用である請求項１～１０のいずれかの項記載の乳酸菌用培地。

【請求項12】

ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ブレビスまたはラクトバチルス・プランタラムである請求項１１記載の乳酸菌用培地。

【請求項13】

乳酸菌を、請求項１～１２のいずれかの項記載の乳酸菌用培地で培養することを特徴とする乳酸菌の培養方法。

【請求項14】

乳酸菌を、請求項１～１２のいずれかの項記載の乳酸菌用培地で培養して得られる乳酸菌培養物。

【請求項15】

請求項１４記載の乳酸菌培養物を含有する飲食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌の培養に好適な乳酸菌用培地に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌の培養に用いられる培地としては、主にＭＲＳ（ｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ）培地が用いられている（例えば、特許文献１）が、ＭＲＳ培地には、食品素材として使用できない試薬が含まれているため、培養した乳酸菌を直接食品用途に用いることができなかった。これまで、乳酸菌用の培地で、食品素材で構成されたものが報告されているが、乳酸菌の増殖性等が十分ではない場合があった。

【0003】

これに対して、乳酸菌の増殖を促進するためにさらに別の食品素材を栄養成分として添加することが考えられる。一方、近年、食物アレルギーに対する認識が高まっており、その原因物質であるアレルゲンとして、様々な食物由来のものが知られている。その中でも、症例数や重篤度などから、卵や乳、小麦などの７品目は、食品に表示する必要性が高い特定原材料として表示が義務付けられている。またアーモンド、いか、大豆などの２１品目についても、症例数や重篤度などからみて特定原材料に準ずるものとして、表示が推奨されている。

【0004】

乳酸菌は、整腸作用の他、様々な生理活性を有しており、乳酸菌を含む飲食品を摂取することで、その生理的機能が発揮されるが、乳酸菌を培養する培地中に、上記特定原材料等を使用すると、最終製品にもアレルゲンが残存する可能性があるため、これらに対しアレルギーを有する消費者が、乳酸菌による生理効果を享受し得ないことになる。そのため、特定原材料等以外の食品素材で、乳酸菌の増殖性を向上できることが望ましい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１９－３０２９２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の課題は、食品素材で構成され、乳酸菌の増殖性が良好な培地を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、培地中に酵母エキス及び発酵大麦エキスを添加することによって、乳酸菌の増殖性が良好であり、大量生産を実現可能な程度にまで生菌数を高め得ることを見出し、本発明を完成させた。

【0008】

すなわち、本発明は、酵母エキス及び発酵大麦エキスを含有する乳酸菌用培地である。

【0009】

また、本発明は、乳酸菌を、上記乳酸菌用培地で培養することを特徴とする乳酸菌の培養方法である。

【0010】

更に、本発明は、乳酸菌を、上記乳酸菌用培地で培養して得られる乳酸菌培養物である。

【0011】

更にまた本発明は、上記乳酸菌培養物を含有する飲食品である。

【発明の効果】

【0012】

本発明の乳酸菌用培地は、乳酸菌の増殖促進作用に優れ、培養後の生菌数が高いものである。また凍結後においても生菌数を高く維持でき、凍結保存用としても優れるものである。

【0013】

本発明の乳酸菌用培地は、食品素材で構成されているため、培養後、そのまま各種飲食品に利用できる。さらに、特定原材料等を添加しなくても乳酸菌の増殖が良好であるため、特定原材料等不使用の乳酸菌含有飲食品または乳酸菌発酵飲食品を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明の乳酸菌用培地（以下、「本発明培地」という）は、酵母エキス及び発酵大麦エキスを含有するものである。

【0015】

上記酵母エキスは、酵母由来のエキスであれば特に限定されないが、例えば、酵母の自己消化液、酵母の抽出液等が挙げられる。酵母の抽出液を得る方法は特に限定されず、例えば、熱水、アルコール等の溶媒で抽出する方法等が挙げられる。酵母エキスは、酵母の自己消化液、酵母の抽出液そのもの、あるいはこれらの濃縮液または粉末等でもよい。酵母の種類は特に限定されず、例えば、ビール酵母、パン酵母、ワイン酵母等が挙げられるが、ビール酵母が好ましい。また、これら酵母エキスは１種または２種以上を用いることができる。これら酵母エキスの中でもビール酵母エキスが好ましい。ビール酵母エキスとしては、ミーストＰ１Ｇ（登録商標、アサヒビール食品（株））、ミーストＰ２Ｇ（登録商標、アサヒビール食品（株））、酵母エキス Ｂ２（オリエンタル酵母工業（株））等が市販されている。

【0016】

本発明培地における酵母エキスの含有量は、特に限定されないが、例えば、酵母エキス粉末として０．１～１０質量％（以下、特に断らない限り「％」は「質量％」を意味する）、好ましくは０．５～５％である。

【0017】

上記発酵大麦エキスは、発酵大麦由来のエキスであれば、特に限定されないが、例えば、大麦を発酵させて焼酎等の酒類を製造する際に得られる、酒類の蒸留後の残液等が挙げられ、具体的には、大麦焼酎蒸留残液等が挙げられる。また、これら発酵大麦エキスは１種または２種以上を用いることができる。発酵大麦エキスの中でも大麦焼酎蒸留残液が好適である。大麦焼酎蒸留残液としては、バーレックス（登録商標、三和酒類（株））、バーレックスＳ（登録商標、三和酒類（株））等が市販されている。

【0018】

本発明培地における発酵大麦エキスの含有量は、特に限定されないが、例えば、エキス（液体）として０．１～１５％、好ましくは１～１０％である。

【0019】

本発明培地には、乳酸菌の増殖性等の観点から、さらに乳化剤を添加することが好ましい。乳化剤としては、特に限定されないが、例えば、モノオレイン酸デカグリセリン、モノステアリン酸デカグリセリン等のポリグリセリン脂肪酸エステルが挙げられる。また、これら乳化剤は１種または２種以上を用いることができる。ポリグリセリン脂肪酸エステルの中でも、親水性のポリグリセリン脂肪酸エステルが好ましく、特にモノオレイン酸デカグリセリンが好ましい。モノオレイン酸デカグリセリンとしては、サンソフトＱ－１７Ｓ（登録商標、太陽化学（株））、NIKKOL DECAGLYN 1-OV（日光ケミカルズ（株））等が市販されている。

【0020】

本発明培地における乳化剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１％、好ましくは０．０５～０．５％である。

【0021】

本発明培地には、乳酸菌の増殖性等の観点から、さらに糖類を添加することが好ましい。糖類としては、乳酸菌が資化できるものであれば特に限定されないが、例えば、グルコース、果糖、ショ糖等が挙げられ、これら糖類は１種または２種以上を用いることができる。これら糖類の中でもグルコースが好ましい。グルコースとしてはＤ－（＋）－グルコース（シグマ アルドリッチ ジャパン（株））等が市販されている。

【0022】

本発明培地における糖類の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１０％、好ましくは０．０５～５％である。

【0023】

更に、本発明培地には、ミネラル分や乳酸菌の増殖を阻害しない成分であって操作性をよくする成分(消泡剤等)等を含有させてもよい。

【0024】

一方、本発明培地には、食品素材として、乳糖等の乳成分や豆乳等の大豆成分などの特定原材料等を使用しないことが好ましい。本発明培地は、特定原材料等を使用しなくても、乳酸菌の増殖が良好であるため、特定原材料等を添加しないことにより、特定原材料等不使用の飲食品を製造することが可能である。本明細書において、特定原材料等とは、食品表示法（平成25年法律第70号）第４条第１項の規定に基づく食品表示基準に規定された特定原材料７品目（えび、かに、小麦、そば、卵、乳、落花生（ピーナッツ））及び、特定原材料に準ずるもの２１品目（アーモンド、あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン）を意味する。

【0025】

本発明培地の好ましい態様としては、次のものが挙げられる。
酵母エキス ０．１～１０％、好ましくは０．５～５％
発酵大麦エキス ０．１～１５％、好ましくは１～１０％
乳化剤 ０．０１～１％、好ましくは０．０５～０．５％
糖類 ０．０１～１０％、好ましくは０．０５～５％
水 残量

【0026】

本発明培地の最も好ましい態様としては、以下の組成であり、この組成の培地をＭＢＧ培地という。
酵母エキス ２％
発酵大麦エキス ５％
モノオレイン酸デカグリセリン ０．１％
グルコース ２％
水 残量

【0027】

本発明培地は、上記成分を水に溶解させ、ｐＨ調整、殺菌等をすることにより調製することができる。ｐＨ調整方法としては水酸化ナトリウム等を添加すればよく、好ましいｐＨとしては６～８、より好ましいｐＨとしては６．５～７．５が挙げられる。

【0028】

なお、本発明培地は、水以外の成分を一つに封入し、培地キットとすることもできる。そして、使用時に、この培地キットを適宜水に溶解させればよい。

【0029】

以上説明した本発明培地は、乳酸菌の培養に用いることができる。本発明培地を用いた乳酸菌の培養条件は特に限定されず、通常の乳酸菌の培養条件を適用することができる。本発明培地で培養できる乳酸菌の種類は特に限定されず、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ビフィドバクテリウム属の乳酸菌等が挙げられる。これらの乳酸菌の中でもラクトバチルス属の乳酸菌が好ましく、ラクトバチルス属の乳酸菌の中でもラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・アシジピスシス（Lactobacillus acidipiscis）、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・コリニフォルミス(Lactobacillus coryniformis)、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・デルブルッキー(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)、ラクトバチルス・ケフィーリ(Lactobacillus kefiri)、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス・サブスピーシーズ・ケフィラノファシエンス(Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens)、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス・サブスピーシーズ・ケフィリグラナム(Lactobacillus kefranofaciens subsp. kefirgranum)、ラクトバチルス・ノデンシス(Lactobacillus nodensis)、ラクトバチルス・パラブレビス(Lactobacillus parabrevis)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・パラケフィーリ(Lactobacillus parakefiri)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・ぺロレンス(Lactobacillus perolens)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・ツセッティ（Lactobacillus tucceti）、ラクトバチルス・クルバタス(Lactobacillus curvatus)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）がより好ましく、これらの１種以上を培養することができる。これらの中でもラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・プランタラム等がさらに好ましく、特にラクトバチルス・カゼイが好ましい。ラクトバチルス・カゼイとしては、例えば、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ０１８０^Ｔ等が挙げられ、特にラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９が好ましい。ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９は、本出願人が既に１９８７年５月１８日付で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（なお、前記微生物工業技術研究所は、現在では独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターとなり、新住所〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８ １２０号室に移転している）にＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６として寄託している。

【0030】

本発明培地で乳酸菌を培養することにより、乳酸菌培養物が得られる。培養温度は乳酸菌によって適宜設定すればよいが、３０～３７℃が好ましい。本発明培地は、食品素材で構成されているため、この乳酸菌培養物は、そのままあるいは、濃縮、希釈、乾燥等の処理をした後、飲食品等に配合することができる。

【0031】

上記乳酸菌培養物を配合することのできる飲食品としては、特に限定されるものではないが、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、ヨーグルトや発酵乳、清涼飲料、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料等が挙げられる。また、飲食品の形態としては、通常用いられる飲食品の形態、例えば、粉末、顆粒等の固体状、ペースト状、液状等が挙げられる。また、錠剤、散剤、チュアブル剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、丸剤、ガム等に加工してもよい。なお、口腔用組成物として、洗口剤、練歯磨、粉歯磨、水歯磨、口腔用軟膏剤、ゲル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、グミゼリー、トローチ、タブレット、カプセル、キャンディー、チューインガムなどに、またペットフード等に使用することも可能である。

【0032】

培養された乳酸菌は、菌体または培養物を凍結保護剤に分散させて凍結保存することができ、例えば、グリセリン溶液と混合し凍結させたグリセロールストックなどの凍結菌体や凍結乾燥菌体として保存される。本発明培地によって培養された乳酸菌は、凍結しても生菌数が低下せず、生残率が高いため、各種乳酸菌発酵飲食品の製造におけるスターターとして利用することが可能である。例えば、脱脂粉乳などの乳成分や豆乳を含有する培地で培養することにより、発酵乳飲料や発酵豆乳を製造することができる。また培養基材として、これらの乳成分や大豆成分を使用しない培地においても、良好な増殖性を示すため、乳成分及び／または大豆成分フリーの乳酸菌発酵飲食品を製造することができる。さらに乳成分及び大豆成分に限らず特定原材料等を含まない培地で培養することにより、特定原材料等不使用の乳酸菌発酵飲食品の製造が可能となる。このような特定原材料等以外の培養基材としては、パイン果汁、マンゴー果汁、みかん果汁、トマト汁、青汁、ニンジン汁などが挙げられる。

【0033】

乳酸菌凍結菌体または凍結乾燥菌体を製造する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜用いることが可能であるが、好ましくは、本発明培地を用いて培養した乳酸菌菌体を分散媒に分散した後、凍結または凍結乾燥を行う方法である。

【0034】

上記乳酸菌菌体を分散させる分散媒は乳酸菌の種類に合わせて適宜選択すればよいが、例えば、凍結保護剤を含有する水溶液を用いることが好ましい。乳酸菌菌体を分散媒に分散させる方法は特に限定されず、分散媒に乳酸菌菌体または培養物を添加し、撹拌等をすればよい。また、分散媒に分散させる乳酸菌菌体の量は特に限定されないが、例えば、１．０×１０^５～１．０×１０^１０（ｃｆｕ／ｍｌ）程度である。なお、分散させる乳酸菌は基本的に生菌体だが、死菌体が含まれていてもよい。

【0035】

分散媒に用いられる凍結保護剤は、特に限定されず、例えば、グリセリン、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム等のグルタミン酸の塩、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類、マルトデキストリン、サイクロデキストリン、馬鈴薯デンプン、乳類、ＤＭＳＯ等が挙げられる。これら凍結保護剤は１種または２種以上を用いることができ、グリセリン等を用いることが好ましい。分散媒における凍結保護剤の含有量は、特に限定されないが、最終濃度として例えば、１～２５％が好ましく、５～２０％がより好ましく、８～１５％が特に好ましい。

【0036】

分散媒には、さらに抗酸化剤を添加することができ、例えば、アスコルビン酸や、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム等のアスコルビン酸の塩、ビタミンＥ、カテキン、グルタチオン、アスタキサンチン等が挙げられる。これら抗酸化剤は１種または２種以上を用いることができる。分散媒における抗酸化剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．０１～５％が好ましく、０．０５～１％がより好ましい。

【0037】

上記のように乳酸菌菌体または培養物を分散媒に分散した後、例えば、ドライアイスエタノールバス内で急速冷凍することにより、凍結菌体を得ることができる。

【0038】

一方、凍結乾燥菌体は、乳酸菌菌体を分散媒に分散した後、例えば、－３５℃～－４５℃で６～４８時間の凍結処理を行った後、１２℃～３５℃で４０～９０時間の乾燥処理を行って凍結乾燥を行うことによって調製できる。なお、凍結乾燥機の例としては、ＴＦ２０－８０ＴＡＮＮＳ（（株）宝製作所製）等を挙げることができる。また、ドライアイスエタノールバスや凍結ブロック等を用いて瞬間凍結を行うことも可能である。

【0039】

かくして得られる乳酸菌凍結菌体または凍結乾燥菌体は、保存後も高い生菌数を維持することができる。例えば、（凍結後の生菌数／凍結前の生菌数）×１００として求められる生残率が７５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。

【実施例0040】

以下、本発明について実施例等を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

【0041】

実 施 例 １
培地の調製および乳酸菌の培養：
下記表１に記載の成分を水に混合、溶解させ、次いで、ｐＨを水酸化ナトリウムで６.７に調整した後、殺菌して、培地を調製した(以下、「ＭＢＧ培地」という)。この培地に凍結保存されたラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９（以下、「ＬｃＳ」という）を１％（生菌数としては１．０×１０^５～１．０×１０^７（ｃｆｕ／ｍｌ）程度）接種し、３７℃で２４時間静置培養した。培養後の生菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を測定した結果を表１に示す。増殖性の良否の基準として、生菌数５．０×１０^８（ｃｆｕ／ｍｌ）以上とした。

【0042】

【表1】

【0043】

酵母エキス及び発酵大麦エキスを含むＭＢＧ培地は、増殖性が良好であり、培養後の生菌数が高いレベルにまで到達することが示された。

【0044】

実 施 例 ２
グリセロールストックの作製及び評価：
（１）菌体または培養液のグリセロールストックの調製
ＭＢＧ培地で前培養したＬｃＳの培養液を、ＭＢＧ培地に０．１％接種後、３７℃で２４時間静置培養した（本培養）。次いで、培養液を遠心し、遠心上清を除去して菌体を得て、滅菌処理したグリセロールに懸濁し、終濃度１２．５％とした（菌体サンプル）。
また、氷冷した本培養液を採取し、滅菌処理をしたグリセロールと混合し、終濃度１２．５％とした（培養液サンプル）。
これらをクライオチューブに１ｍｌずつ分注し、ドライアイスエタノールバス内で急速冷凍した。出来上がったグリセロールストックは、－７０℃で保存した。

【0045】

（２）保存試験
（１）で得た２種類のグリセロールストックについて、生菌数測定を行った。生菌数はグリセロールストックを生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ溶液）で希釈後、ＭＲＳ寒天培地（ＢＤ社、Ｄｉｆｃｏ^ＴＭ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ ａｇａｒ）にスパイラルプレーターＥＤＤＹ ＪＥＴ２（ＩＵＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて塗布し、３７℃、２日間以上好気培養した。得られたコロニー数をコロニーカウンター（Ｑｃｏｕｎｔ）で測定した。なお、本培養後及び凍結前の生菌数についても同様にして測定した。また以下の式により生残率（％）を求めた。
（生残率）
生残率（％）＝（凍結後の生菌数／凍結前の生菌数）×１００

【0046】

【表2】

【0047】

本培養におけるＬｃＳの増殖性は良好であった。またグリセロールストックについても、凍結後の生菌数の低下は認められず、高い生残率を示すことが確認された。

【0048】

実 施 例 ３
Ｌｃｓ以外の菌種でのグリセロールストックの作製及び評価：
（１）菌体のグリセロールストックの調製
実施例２と同様の方法で、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）の菌体のグリセロールストックを調整した。

【0049】

（２）保存試験
実施例２と同様の方法で、凍結前、凍結後における菌体のグリセロールストックの生菌数を調べ、生残率を求めた。なお、ラクトバチルス・ガセリのみ嫌気条件下で培養した。

【0050】

【表3】

【0051】

ＬｃＳ以外の菌種についてのグリセロールストックについても、凍結後の生菌数の大幅な低下は認められず、高い生残率を示すことが確認された。

【0052】

実 施 例 ４
グリセロールストックのスターターとしての培養性状評価：
脱脂粉乳（雪印株式会社）を用いて１０％脱脂粉乳培地を調製した。また調整豆乳（株式会社ヤクルト本社）を３倍希釈し、ブドウ糖（扶桑薬品工業株式会社）を１％添加して豆乳培地を調製した。実施例２で調製した菌体及び培養液のグリセロールストックを室温で溶解し、脱脂粉乳培地または豆乳培地に０．１％接種後、攪拌し、３７℃で培養した。培養は２連で行った（培養(1)及び(2)）。培養時間は、脱脂粉乳培地では４８時間、豆乳培地では２４時間とした。培養後及び４℃で所定日数保存後、生菌数、酸度及びｐＨを以下のようにして測定した。脱脂粉乳培地での結果を表３（培養後）及び４（４℃１４日保存後）、豆乳培地での結果を表５（培養後）及び６（１０℃１０日保存後）に示す。
（生菌数測定）
培養物を良く攪拌し、生理食塩水で希釈後、ＭＲＳ寒天培地（ＢＤ社製）にスパイラルプレーターＥＤＤＹ ＪＥＴ２（ＩＵＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で塗布した。これを好気下で３７℃、２日間以上培養した。得られたコロニーをコロニーカウンター（Ｑｃｏｕｎｔ）で測定し、１ｍｌ当りのコロニー数（ｃｆｕ）を求めた。増殖性の良否の基準は、脱脂粉乳培地では１．０×１０^９（ｃｆｕ／ｍｌ）以上、豆乳培地では１．０×１０^９（ｃｆｕ／ｍｌ）以上とした。
（酸度測定）
各サンプルを良く攪拌後、６ｇ採取しＲＯ水（２７．３ｍｌ）を添加して酸度測定用サンプル（固形分濃度１８．０２％）とした。酸度滴定装置（ＣＯＭ－１７００平沼産業）にて、ｐＨ８．５に達するまでに用いた０．１Ｎ ＮａＯＨの量（ｍｌ）を測定した。得られた値をサンプル９ｇ当たりに換算し酸度（ｍｌ／９ｇ）とした。増殖性の良否の基準は脱脂粉乳培地では８．５（ｍｌ／９ｇ）以上、豆乳培地では８．５（ｍｌ／９ｇ）以上とした。
（ｐＨ測定）
培養物をよく攪拌後、ポータブルｐＨメーター ＬａｑｕａＡｃｔ（ＨＯＲＩＢＡ社製）を用いて測定した。

【0053】

脱脂粉乳培地、培養後

【表4】

【0054】

脱脂粉乳培地、４℃１４日保存後

【表5】

【0055】

豆乳培地、培養後

【表6】

【0056】

豆乳培地、４℃１０日保存後

【表7】

【0057】

菌体及び培養液のグリセロールストックは、脱脂粉乳培地及び豆乳培地のいずれにおいても、培養性状が良好であり、スターターとして利用可能であることが示された。脱脂粉乳培地に代えて、パイン果汁やみかん果汁を含有する培地を用いても、同様に良好な培養性状を示す。

【産業上の利用可能性】

【0058】

本発明の培地は、乳酸菌の培養に好適であり、各種乳酸菌含有飲食品等に利用可能である。