特開 2024-114970 長時間の局所麻酔のための麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024114970

(43)【公開日】2024-08-23

(54)【発明の名称】長時間の局所麻酔のための麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20240816BHJP

   A61P 23/02 20060101ALI20240816BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240816BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20240816BHJP

   A61K 31/529 20060101ALI20240816BHJP

   A61K 31/56 20060101ALI20240816BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P23/02

A61K47/60

A61K45/06

A61K31/529

A61K31/56

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024106268

(22)【出願日】2024-07-01

(62)【分割の表示】P 2020529484の分割

【原出願日】2018-12-03

(31)【優先権主張番号】62/593,784

(32)【優先日】2017-12-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】596115687

【氏名又は名称】ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル エス． コヘイン

(72)【発明者】

【氏名】チャオ ジャオ

(57)【要約】

【課題】非コンジュゲート化麻酔剤と比べて低毒性で、神経遮断に有効な量の局所麻酔剤の制御放出をインビボで提供する加水分解性結合を介して生分解性及び生体適合性親水性ポリマーに共有結合的にコンジュゲート化された麻酔薬を提供すること。
【解決手段】麻酔薬放出速度は、そのポリマーの親水性の変更によって調整できる。テトロドトキシン（TTX）にコンジュゲート化された
、必要に応じてポリエチレングリコール（PEG）ポリマーを含むポリ（セバシン酸グリセロール）（PGS）の例示的製剤（PGS－PEG－TTX及びPGS－TTX）及びその使用方法が提供される。PGS－PEG－TTX及びPGS－TTXによる神経遮断は、最小限の全身毒性並びに筋肉及び末梢神経に対する局所毒性に関連した。PEG200中に均一分散したTDP－TTXコンジュゲートも記載される。PEG200は、媒介物としてだけでなく、TTXの有効性を高める化学的浸透促進剤（CPE）としても働いた。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１２月１日出願の米国特許出願第６２／５９３，７８４号の利益を主張し、その優先権を主張する。この米国特許出願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
これは、概して、毒性が低い、長時間の神経ブロックならびに局所麻酔および局所鎮痛の分野、詳細には、制御放出のために生体適合性ポリマーに共有結合的に連結されたテトロドトキシンの製剤の分野におけるものである。

【0003】

政府支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓが授与した助成金番号５Ｒ０１ＧＭ０７３６２６－１２および１Ｒ０１ＧＭ１１６９２０－０１の政府支援を受けて行われた。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
単回注射後の持続時間が長い局所麻酔は、過去２０年間、臨床的研究および科学的研究の中心であった。しかしながら、現在臨床で用いられている従来のアミノ－エステルおよびアミノ－アミド局所麻酔化合物には、関連する制限が多くある。これらの化合物は、有効な末梢神経遮断をもたらすにもかかわらず、それらの作用の持続時間が比較的短いことは、特に、慢性疼痛および神経因性疼痛の管理においては、不十分であることが多い。これらの化合物は、筋肉および末梢神経に対する局所毒性などの副作用も引き起こし、それらの副作用は、濃度が高くなるほど、および曝露の持続時間が長くなるほど、増大する。残念なことに、これらの副作用は、徐放性のビヒクルを使用してこれらの化合物を送達すると悪化し（送達ビヒクル自体の毒性が最小限に抑えられたとしても）、神経において炎症反応を引き起こすことがあり、その炎症反応は、時折、神経遮断の持続時間よりもかなり長く続く（Ｐａｄｅｒａら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １０８，９２１－９２８，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＡＬＮ．０ｂ０１３ｅ３１８１６ｃ８ａ４８（２００８）；Ｋｏｈａｎｅら、Ｐａｉｎ １０４，４１５－４２１，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０３０４－３９５９（０３）０００４９－６（２００３）；Ｋｏｈａｎｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９，４５０－４５９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍ．１２６１（２００２））。特に、多くの試薬が末梢神経の電位開口型ナトリウムチャネルに対して特異性が低いことから、重篤な全身性副作用（主に心臓血管の副作用（例えば、生命を危うくする不整脈）および神経性の副作用（例えば、発作）である）が生じ得る。

【0005】

これらの限界に照らして、全身性および局所性の副作用を最小限に抑えつつ、神経遮断を増強または延長し得る局所麻酔製剤を開発することが長年の目標であった。天然に存在するサイト１ナトリウムチャネル遮断薬（Ｓ１ＳＣＢ）であるテトロドトキシン（ＴＴＸ）が、従来の局所麻酔剤に代わるものとして過去２０年間研究されてきた（Ｌａｈａｙｅら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １２３，７４１－７４２（２０１５））。ＴＴＸは、極めて強力な局所麻酔特性を有するが（Ｋｏｈａｎｅら、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ Ｐａｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５，５２－５９，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ１０９８－７３３９（００）８００１１－５（２０００））、有意な末梢神経遮断を達成するために必要なＴＴＸの用量は、低血圧および全身の筋力低下（横隔膜麻痺および呼吸不全を含む）を引き起こし得る。ＴＴＸの治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）は狭いにもかかわらず、それを診療に導入する試みは現在も進行中であり（Ｌａｈａｙｅら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １２３，７４１－７４２（２０１５）；ＰＥＲＥら、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ Ｐａｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８，３０４－３０７（１９９３）；Ｌｏｂｏら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １２３，８７３－８８５（２０１５））、臨床で使用するためにＴＴＸの神経遮断の持続時間を延長するためのアプローチが望まれている。

【0006】

薬物を持続送達系にカプセル封入することによって、長い薬物持続時間が達成できるが、ＴＴＸは、非常に親水性であることから、効果的なカプセル封入が妨げられている（Ｒｗｅｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１２，１５７１９－１５７２４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１８７９１１１２（２０１５）；Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９，１７５５５－１７５６０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１４６３４１０９（２０１２））。リポソームはこれまでに、ＴＴＸの制御放出のための効率的なキャリアとして報告されており、カプセル封入効率は最大５０％である（Ｒｗｅｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１２，１５７１９－１５７２４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１８７９１１１２（２０１５）；Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒａｓｈ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０６，７１２５－７１３０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９００５９８１０６（２００９）；Ｚｈａｎ，Ｃ．ら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ １６，１７７－１８１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．５ｂ０３４４０（２０１６））。これらのリポソームは、ラット坐骨神経モデルにおいて、局所毒性または全身毒性を最小限に抑えつつ、最大１３．５時間続く末梢神経遮断を達成した。しかしながら、ＴＴＸの最初のバースト放出により、注射用量のさらなる増加が妨げられ、それにより、神経遮断のさらなる延長が妨げられた。理想的には、術後疼痛または慢性疼痛の管理のための注射可能な麻酔薬は、数日間から最大数週間持続し得る。さらに、時間のかかる煩雑な調製プロトコルのせいで、リポソーム製剤を臨床で使用するのは不便である。

【0007】

ゆえに、単回投与後に長時間にわたって麻酔剤を低毒性で送達するための生体適合性プラットフォームを提供することが、本発明の目的である。

【0008】

局所毒性または全身毒性を低く抑えつつ、サイト１ナトリウムチャネル遮断薬（Ｓ１ＳＣＢ）由来の麻酔の持続時間を延長する特定のＳ１ＳＣＢの生体適合性製剤を提供することも、本発明の目的である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｐａｄｅｒａら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １０８，９２１－９２８，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＡＬＮ．０ｂ０１３ｅ３１８１６ｃ８ａ４８（２００８）

【非特許文献2】Ｋｏｈａｎｅら、Ｐａｉｎ １０４，４１５－４２１，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０３０４－３９５９（０３）０００４９－６（２００３）

【非特許文献3】Ｋｏｈａｎｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９，４５０－４５９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍ．１２６１（２００２））

【非特許文献4】Ｋｏｈａｎｅら、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ Ｐａｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５，５２－５９，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ１０９８－７３３９（００）８００１１－５（２０００）

【非特許文献5】Ｌａｈａｙｅら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １２３，７４１－７４２（２０１５）；ＰＥＲＥら、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ Ｐａｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８，３０４－３０７（１９９３）

【非特許文献6】Ｌｏｂｏら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １２３，８７３－８８５（２０１５）

【非特許文献7】Ｒｗｅｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１２，１５７１９－１５７２４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１８７９１１１２（２０１５）

【非特許文献8】Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９，１７５５５－１７５６０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１４６３４１０９（２０１２）

【非特許文献9】Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒａｓｈ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０６，７１２５－７１３０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９００５９８１０６（２００９）

【非特許文献10】Ｚｈａｎ，Ｃ．ら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ １６，１７７－１８１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．５ｂ０３４４０（２０１６）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明の概要
加水分解性エステル結合を介して生分解性かつ生体適合性のポリマー骨格に共有結合された、麻酔剤（anesthetic agent）、特に、テトロドトキシンなどのサイトＩナトリウ
ムチャネル遮断薬を含むコンジュゲートが、有意に低い毒性で長時間の局所麻酔を提供する。その共有結合は、麻酔剤の最初の「バースト放出」を防ぐのに十分に安定であり、エステル結合のゆっくりとした加水分解によって、有効量の麻酔薬の徐放が達成され、それにより、単回投与後最大７２時間または７２時間超、最大１ヶ月間、インビボにおいて疼痛が阻止される。麻酔薬は、天然の形態で放出される。そのコンジュゲート内のエステル結合の加水分解速度は、ポリマー骨格の親水性を変更することによって、レシピエントのニーズに適応される。

【0011】

ＰＥＧは、コンジュゲート内の麻酔薬の有効性を高める化学的透過促進剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）として機能することも立証されている。ゆえに、ＰＥＧ２００中に均一に分散させられた麻酔薬－ポリマーコンジュゲート（anesthetic-polymer conjugates）の製剤が記載される。好ましい実施形態において、麻酔薬－ポリマーコンジュゲートの製剤は、シリンジによって注射可能な製剤としてＰＥＧ２００中に分散させられる。共有結合性の麻酔薬－ポリマー製剤を作製する方法およびそれらの使用方法も記載される。

【0012】

ある特定の実施形態において、麻酔剤は、サイト１ナトリウムチャネル遮断薬（Ｓ１ＳＣＢ）である。例示的なＳ１ＳＣＢとしては、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、ネオサキシトキシンおよびゴニオトキシンが挙げられる。ある例示的な実施形態において、Ｓ１ＳＣＢは、テトロドトキシン（ＴＴＸ）である。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、バニロイドレセプターサブタイプ１（ＴＲＰＶ１）アゴニストである麻酔剤を含む。例示的なＴＲＰＶ１アゴニストとしては、ｔｒａｎｓ８－メチル－Ｎ－バニリル－６－ノネンアミド（カプサイシン）、ジヒドロ－カプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシンおよびレシニフェラトキシンが挙げられる。

【0013】

上記コンジュゲートは、生分解性かつ生体適合性のポリマーに共有結合された麻酔剤を含む。そのポリマーの親水性は、制御された様式で、例えば、親水性ポリマーを付加することによって、改変され得る。ゆえに、コンジュゲートは、コンジュゲートにおける親水性および疎水性ポリマーおよび親水性および疎水性モノマーの濃度ならびに相対比を変化させることによって、インビボにおいて、調整可能な麻酔剤放出を可能にする。好ましい生体適合性ポリマー骨格には、ポリ無水物が含まれる。例示的なポリ無水物ポリマーは、ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）である。好ましい親水性ポリマーとしては、ポリエチレンオキシドポリマーおよびポリエチレンオキシド共重合体、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が挙げられる。例示的なＰＥＧとしては、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ７００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ９００、ＰＥＧ１０００およびＰＥＧ２０００が挙げられる。好ましい麻酔剤としては、フィコトキシンおよびバニロイドが挙げられる。

【0014】

当業者であれば、製剤内の麻酔剤の量が、レシピエントのニーズに適応され得ることを理解できるだろう。いくつかの実施形態において、上記製剤は、１用量あたり０．１μｇ～２００μｇ（両端値を含む）、好ましくは、１μｇ～１００μｇ（両端値を含む）の投与量で麻酔剤を含む。

【0015】

インビボにおいてコンジュゲートの製剤を投与することによって生じる有効な神経ブロックの持続時間は、コンジュゲートにおける親水性ポリマーの量および比を変更することによって調節され得る。ゆえに、いくつかの実施形態において、コンジュゲート内の親水性ポリマーの量および比は、レシピエントのニーズに応じて１時間から最大１ヶ月間のある期間にわたって有効な神経ブロックを提供するのに十分である。例えば、いくつかの実施形態において、製剤は、インビボにおいて最大７２時間、有効な神経遮断を提供する量の麻酔薬を送達する。他の実施形態において、製剤は、インビボにおいて少なくとも７２時間、最大２週間または２週間超、例えば、最大１ヶ月間、有効な神経遮断を提供する量の麻酔薬を送達する。製剤は、全身毒性が最小限であり、筋肉または末梢神経への局所毒性が実質的にない状態で、有効な神経遮断を提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、両親媒性ポリマーに共有結合的に連結された、１つまたはそれを超えるさらなる治療薬、予防薬または診断薬を含む。他の実施形態において、コンジュゲートは、必要に応じて１つまたはそれを超えるさらなる治療薬、予防薬または診断薬を含む、リポソームまたは他の二次送達ビヒクルに製剤化される。他の実施形態において、１つまたはそれを超えるさらなる治療薬、予防薬または診断薬は、注入物に混ぜることによって、コンジュゲートとの注射のために含められる。さらなる活性な剤は、加水分解性エステル結合を介してポリマー骨格に共有結合的に連結され得る。いくつかの実施形態において、さらなる活性な剤は、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドである。

【0016】

有効な神経遮断を必要とする被験体において単回投与後に局所毒性が存在しないまたは有意に低下した状態で最大１ヶ月間の持続時間にわたって有効な神経遮断を提供するための方法が提供される。その方法は、ＰＧＳに共有結合的にコンジュゲート化され、必要に応じてＰＥＧの付加によって改変された麻酔剤を含む有効量の製剤を、投与後最大３日間、最大１ヶ月間、投与部位において神経ブロックを提供するのに有効な量でその被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、被験体における神経因性疼痛を処置または予防するのに有効である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
持続時間が長い局所麻酔のための麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートであって、
前記コンジュゲートは、
（ａ）麻酔剤；および
（ｂ）ポリマー骨格
を含み、
前記ポリマー骨格は、１つまたはそれを超える親水性ポリマーまたは疎水性ポリマーおよび必要に応じて１つまたはそれを超えるポリエチレンオキシドポリマーを含み、
前記麻酔剤は、局所神経遮断を必要とする部位における被験体への投与後に、非コンジュゲート化麻酔剤と比べて低毒性で有効な局所神経遮断を誘導するのに有効な量で、加水分解性リンカーを介して前記ポリマー骨格に共有結合的にコンジュゲート化されている、コンジュゲート。
（項目２）
前記麻酔剤が、サイト１ナトリウムチャネル遮断薬（Ｓ１ＳＣＢ）である、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目３）
前記Ｓ１ＳＣＢが、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、ネオサキシトキシンおよびゴニオトキシンからなる群より選択される、項目２に記載のコンジュゲート。
（項目４）
前記麻酔剤が、バニロイドレセプターサブタイプ１（ＴＲＰＶ１）アゴニストである、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目５）
前記ポリマー骨格が、ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）を含む、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目６）
前記ポリマー骨格が、約１００Ｄａ～約２００，０００Ｄａ（両端値を含む）、好ましくは、約２００Ｄａ～約２，０００Ｄａ（両端値を含む）の分子量を有する１つまたはそれを超える親水性ポリマーをさらに含む、項目１または項目５に記載のコンジュゲート。
（項目７）
前記ポリマー骨格が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、項目６に記載のコンジュゲート。
（項目８）
前記ＰＥＧが、ＰＥＧモノメチルエーテル（ＰＥＧＭＭＥ）、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ７００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ９００、ＰＥＧ１０００およびＰＥＧ２０００からなる群より選択される１つまたはそれを超えるＰＥＧである、項目７に記載のコンジュゲート。前記ＰＧＳが、加水分解性エステル結合を介して前記親水性ポリマーに共有結合している、項目１に記載の製剤。
（項目９）
前記コンジュゲートが、インビボでの投与後、約２４時間～７２時間、７２時間～１週間または１週間～１ヶ月間のある期間にわたって前記麻酔剤を放出する、項目１に記載のコンジュゲート。
（項目１０）
前記骨格ポリマーに共有結合的にコンジュゲート化された１つまたはそれを超える活性な剤をさらに含む、項目１～９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
（項目１１）
前記コンジュゲートが、１つまたはそれを超える共有結合した糖質コルチコイドをさらに含む、項目１０に記載のコンジュゲート。
（項目１２）
前記糖質コルチコイドが、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルニソリド、メチルプレドニゾン、パラメタゾン
、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アルクロメタゾン、アムシノニド、クロベタゾール、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロソン、フルオシノロンアセトニド、フルオロメタロン、フルランドレノリド、ハルシノニド、メドリゾンおよびモメタゾン、ならびにそれらの薬学的に許容され得る塩および混合物からなる群より選択されるからなる群より選択される、項目１１に記載のコンジュゲート。
（項目１３）
前記コンジュゲートが、共有結合したデキサメタゾンをさらに含む、項目１０に記載のコンジュゲート。
（項目１４）
項目１～１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む、インビボで投与するための製剤。
（項目１５）
前記製剤が、ＰＥＧを賦形剤として含む、項目１４に記載の製剤。
（項目１６）
前記ＰＥＧが、ＰＥＧ２００である、項目１５に記載の製剤。
（項目１７）
０．１μｇ～２００μｇ（両端値を含む）、好ましくは、１μｇ～１００μｇ（両端値を含む）の量の麻酔剤を含む、項目１４～１６のいずれか１項に記載の製剤を含む投与単位。
（項目１８）
前記量の麻酔薬が、それを必要とする被験体への投与後最大１ヶ月間にわたって有効な局所神経遮断を誘導するのに有効な量である、項目１７に記載の投与単位。
（項目１９）
神経遮断を必要とする被験体において神経遮断を提供するための方法であって、有効量の項目１４～１６のいずれか１項に記載の製剤または項目１７に記載の投与単位を、投与部位において神経ブロックを提供するのに有効な量で前記被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２０）
前記製剤が、前記被験体において神経因性疼痛の発生を遅延させるのに有効な量で存在する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記被験体が、ヒトである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記方法が、投与後少なくとも３日間、最大１週間、２週間、３週間または１ヶ月間、疼痛緩和を提供する、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記製剤が、シリンジによって注射可能な製剤である、項目１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記製剤が、注射または浸潤を介して、有痛部位にまたは有痛部位付近に投与される、項目１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
項目１～１３のいずれか１項に記載のコンジュゲートを作製する方法であって、１つまたはそれを超える麻酔剤を１つまたはそれを超えるポリマー骨格に共有結合的にカップリングする工程を含む、方法。
（項目２６）
前記共有結合性のカップリングが、Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記共有結合性のカップリングが、前記麻酔剤を変性させないかまたは他の方法で前記麻
酔剤の生物学的活性を低下させない条件下で行われる、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
項目１４～１６のいずれか１項に記載の製剤を作製する方法であって、前記コンジュゲートをインビボでの投与に適した賦形剤中に分散させる工程を含む、方法。
（項目２９）
ある部位における疼痛の処置または予防を必要とする被験体において、前記部位における疼痛を処置または予防する方法であって、前記方法は、
（ａ）麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートであって、
ここで、前記コンジュゲートは、加水分解性リンカーを介してポリマー骨格に共有結合的にコンジュゲート化された麻酔剤を含み、
前記ポリマー骨格は、１つまたはそれを超える親水性ポリマーまたは疎水性ポリマーおよび必要に応じて１つまたはそれを超えるポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）ポリマーを含む、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲート；および
（ｂ）ＰＥＧの水溶液
を含む製剤を前記被験体に投与する工程を含み、
ここで、前記麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、前記ＰＥＧの水溶液内に分散させられ、
前記製剤は、投与後少なくとも７２時間、最大１ヶ月間のある期間にわたって、前記必要とする部位において有効な神経遮断を提供するのに有効な量である、方法。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A】図１Ａおよび１Ｂは、それぞれＴＤ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図１Ａ）、またはＰＥＧ（Ｐ）を含めてＴＤＰ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図１Ｂ）、麻酔薬（テトロドトキシン；ＴＴＸ）とジカルボン酸／トリオールポリマー（ＴＤ）との共有結合性コンジュゲートの段階的な合成の模式図である。図１Ｃは、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートの「格子」の分子モデルの模式図である。ＴＴＸは、（●）として表されており、ＰＧＳ－ＰＥＧは、（－）として表されている。

【図1B】図１Ａおよび１Ｂは、それぞれＴＤ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図１Ａ）、またはＰＥＧ（Ｐ）を含めてＴＤＰ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図１Ｂ）、麻酔薬（テトロドトキシン；ＴＴＸ）とジカルボン酸／トリオールポリマー（ＴＤ）との共有結合性コンジュゲートの段階的な合成の模式図である。図１Ｃは、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートの「格子」の分子モデルの模式図である。ＴＴＸは、（●）として表されており、ＰＧＳ－ＰＥＧは、（－）として表されている。

【図1C】図１Ａおよび１Ｂは、それぞれＴＤ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図１Ａ）、またはＰＥＧ（Ｐ）を含めてＴＤＰ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図１Ｂ）、麻酔薬（テトロドトキシン；ＴＴＸ）とジカルボン酸／トリオールポリマー（ＴＤ）との共有結合性コンジュゲートの段階的な合成の模式図である。図１Ｃは、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートの「格子」の分子モデルの模式図である。ＴＴＸは、（●）として表されており、ＰＧＳ－ＰＥＧは、（－）として表されている。

【0018】

【図2】図２Ａ～２Ｃはそれぞれ、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する接触角（度）（図２Ａ）；ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対するＴ_１／２質量損失（時間）（図２Ｂ）；ならびにＴｇＤ８

【数1】

ＴｇＤ８Ｐ２００（－●－）；
ＴｇＤ８Ｐ１０００

【数2】

およびＴｇＤ８Ｐ２０００

【数3】

の各々の場合の時間（時間）に対する質量損失（％）（図２Ｃ）を示している折れ線グラフである。

【0019】

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、ＴｇＤ８；ＴｇＤ８Ｐ２００；ＴｇＤ８Ｐ１０００；およびＴｇＤ８Ｐ２０００（これらの各々は、それぞれ０．００１ｍｇ／ｍｌ（左のバー）、０．０１ｍｇ／ｍｌ（中央のバー）および０．１ｍｇ／ｍｌ（右のバー）の投与量であった）の各々とともに２４時間インキュベートされた、Ｃ２Ｃ１２細胞（図３Ａ）またはＰＣ１２細胞（図３Ｂ）に対する％細胞生存度を示している棒グラフである。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝４である。

【0020】

【図4】図４Ａ～４Ｂはそれぞれ、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対するＴ_１／２質量損失（時間）（図４Ａ）、ならびにＴｇＤ８

【数4】

ＴｇＤ８Ｐ２００（－●－）；
ＴｇＤ８Ｐ１０００

【数5】

およびＴｇＤ８Ｐ２０００

【数6】

および遊離ＴＴＸ（－◆－）の各々の場合の時間（０～８００時間）に対する累積ＴＴＸ放出（％）（図４Ｂ）を示している折れ線グラフである。

【0021】

【図5A】図５Ａおよび５Ｂはそれぞれ、１つまたはそれを超えるさらなる「連結」ポリマーを含めてＴＤポリマー－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図５Ａ）、またはデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含めてＴＤ－Ｄｅｘ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図５Ｂ）、麻酔薬（テトロドトキシン；ＴＴＸ）とジカルボン酸／トリオールポリマー（ＴＤ）との共有結合性コンジュゲートの段階的な合成の模式図である。

【図5B】図５Ａおよび５Ｂはそれぞれ、１つまたはそれを超えるさらなる「連結」ポリマーを含めてＴＤポリマー－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図５Ａ）、またはデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含めてＴＤ－Ｄｅｘ－ＴＸＸコンジュゲートを形成するための（図５Ｂ）、麻酔薬（テトロドトキシン；ＴＴＸ）とジカルボン酸／トリオールポリマー（ＴＤ）との共有結合性コンジュゲートの段階的な合成の模式図である。

【0022】

【図6A】図６Ａ～６Ｅは、折れ線グラフである。図６Ａは、それぞれＴｇＤ８

【数7】

ＴｇＤ８Ｐ２００（－●－）；
ＴｇＤ８Ｐ１０００

【数8】

およびＴｇＤ８Ｐ２０００

【数9】

および遊離ＴＴＸ（－◆－）の各々に対する、時間（時間）に対する累積Ｄｅｘ放出（％）を示している。図６Ｂ～６Ｅはそれぞれ、ＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｂ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｃ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｄ）；およびＰＧＳ－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｅ）の各々の場合の、時間（時間）に対する２５ｍｇの各ＰＧＳ－ＰＥＧ－薬物コンジュゲートからの累積薬物放出（％）および質量損失（％）を示している。ＴＴＸは、（－●－）として表されており、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、

【数10】

として表されており、質量損失は、

【数11】

として表されている。

【図6B】図６Ａ～６Ｅは、折れ線グラフである。図６Ａは、それぞれＴｇＤ８

【数12】

ＴｇＤ８Ｐ２００（－●－）；
ＴｇＤ８Ｐ１０００

【数13】

およびＴｇＤ８Ｐ２０００

【数14】

および遊離ＴＴＸ（－◆－）の各々に対する、時間（時間）に対する累積Ｄｅｘ放出（％）を示している。図６Ｂ～６Ｅはそれぞれ、ＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｂ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｃ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｄ）；およびＰＧＳ－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｅ）の各々の場合の、時間（時間）に対する２５ｍｇの各ＰＧＳ－ＰＥＧ－薬物コンジュゲートからの累積薬物放出（％）および質量損失（％）を示している。ＴＴＸは、（－●－）として表されており、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、

【数15】

として表されており、質量損失は、

【数16】

として表されている。

【図6C】図６Ａ～６Ｅは、折れ線グラフである。図６Ａは、それぞれＴｇＤ８

【数17】

ＴｇＤ８Ｐ２００（－●－）；
ＴｇＤ８Ｐ１０００

【数18】

およびＴｇＤ８Ｐ２０００

【数19】

および遊離ＴＴＸ（－◆－）の各々に対する、時間（時間）に対する累積Ｄｅｘ放出（％）を示している。図６Ｂ～６Ｅはそれぞれ、ＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｂ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｃ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｄ）；およびＰＧＳ－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｅ）の各々の場合の、時間（時間）に対する２５ｍｇの各ＰＧＳ－ＰＥＧ－薬物コンジュゲートからの累積薬物放出（％）および質量損失（％）を示している。ＴＴＸは、（－●－）として表されており、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、

【数20】

として表されており、質量損失は、

【数21】

として表されている。

【図6D】図６Ａ～６Ｅは、折れ線グラフである。図６Ａは、それぞれＴｇＤ８

【数22】

ＴｇＤ８Ｐ２００（－●－）；
ＴｇＤ８Ｐ１０００

【数23】

およびＴｇＤ８Ｐ２０００

【数24】

および遊離ＴＴＸ（－◆－）の各々に対する、時間（時間）に対する累積Ｄｅｘ放出（％）を示している。図６Ｂ～６Ｅはそれぞれ、ＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｂ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｃ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｄ）；およびＰＧＳ－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｅ）の各々の場合の、時間（時間）に対する２５ｍｇの各ＰＧＳ－ＰＥＧ－薬物コンジュゲートからの累積薬物放出（％）および質量損失（％）を示している。ＴＴＸは、（－●－）として表されており、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、

【数25】

として表されており、質量損失は、

【数26】

として表されている。

【図6E】図６Ａ～６Ｅは、折れ線グラフである。図６Ａは、それぞれＴｇＤ８

【数27】

ＴｇＤ８Ｐ２００（－●－）；
ＴｇＤ８Ｐ１０００

【数28】

およびＴｇＤ８Ｐ２０００

【数29】

および遊離ＴＴＸ（－◆－）の各々に対する、時間（時間）に対する累積Ｄｅｘ放出（％）を示している。図６Ｂ～６Ｅはそれぞれ、ＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｂ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｃ）；ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｄ）；およびＰＧＳ－ＴＴＸ／デキサメタゾン（図６Ｅ）の各々の場合の、時間（時間）に対する２５ｍｇの各ＰＧＳ－ＰＥＧ－薬物コンジュゲートからの累積薬物放出（％）および質量損失（％）を示している。ＴＴＸは、（－●－）として表されており、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、

【数30】

として表されており、質量損失は、

【数31】

として表されている。

【0023】

【図7】図７は、ＰＥＧ２００中のＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートの注射可能な製剤を調製する溶媒蒸発プロセスの模式図である。

【0024】

【図8】図８Ａ～８Ｃは、折れ線グラフである。図８Ａは、それぞれ０．１ｒａｄ／ｓ

【数32】

１ｒａｄ／ｓ（●）；
および１０ｒａｄ／ｓ

【数33】

の各々の場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する複素粘度（Ｐａ・ｓ）を示している。図８Ｂは、それぞれＰＥＧ２００中のＰＧＳ－ＴＴＸ

【数34】

ＰＥＧ２００中のＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ（●）；
ＰＥＧ２００中のＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ

【数35】

ＰＥＧ２００中のＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸ

【数36】

およびＰＥＧ２００（◆）
の各々の場合の、角振動数（ｒａｄ／ｓ）に対する複素粘度（Ｐａ・ｓ）を示している。図８Ｃは、それぞれＧ”

【数37】

およびＧ’（●）
の各々の場合の角振動数（ｒａｄ／ｓ）に対する弾性率Ｇ’、Ｇ”（Ｐａ）を示している。

【0025】

【図9A】図９Ａ～９Ｄは、それぞれ

【数38-1】

コンジュゲート化ＴＴＸ／ＰＥＧ２００；遊離ＴＴＸ／ＰＢＳ（●）；
遊離ＴＴＸ／ＰＥＧ２００

【数39-1】

の各々の場合の、それぞれＴＴＸ用量（μｇ）に対する％ブロック成功（図９Ａ）；ＴＴＸ用量に対するブロックの持続時間（時間）（図９Ｂ）；ＴＴＸ用量（μｇ）に対する％反対側のブロック（図９Ｃ）；およびＴＴＸ用量（μｇ）に対する％死亡率（図９Ｄ）を示している折れ線グラフである。

【図9B】図９Ａ～９Ｄは、それぞれ

【数38-2】

コンジュゲート化ＴＴＸ／ＰＥＧ２００；遊離ＴＴＸ／ＰＢＳ（●）；
遊離ＴＴＸ／ＰＥＧ２００

【数39-2】

の各々の場合の、それぞれＴＴＸ用量（μｇ）に対する％ブロック成功（図９Ａ）；ＴＴＸ用量に対するブロックの持続時間（時間）（図９Ｂ）；ＴＴＸ用量（μｇ）に対する％反対側のブロック（図９Ｃ）；およびＴＴＸ用量（μｇ）に対する％死亡率（図９Ｄ）を示している折れ線グラフである。

【図9C】図９Ａ～９Ｄは、それぞれ

【数38-3】

コンジュゲート化ＴＴＸ／ＰＥＧ２００；遊離ＴＴＸ／ＰＢＳ（●）；
遊離ＴＴＸ／ＰＥＧ２００

【数39-3】

の各々の場合の、それぞれＴＴＸ用量（μｇ）に対する％ブロック成功（図９Ａ）；ＴＴＸ用量に対するブロックの持続時間（時間）（図９Ｂ）；ＴＴＸ用量（μｇ）に対する％反対側のブロック（図９Ｃ）；およびＴＴＸ用量（μｇ）に対する％死亡率（図９Ｄ）を示している折れ線グラフである。

【図9D】図９Ａ～９Ｄは、それぞれ

【数38-4】

コンジュゲート化ＴＴＸ／ＰＥＧ２００；遊離ＴＴＸ／ＰＢＳ（●）；
遊離ＴＴＸ／ＰＥＧ２００

【数39-4】

の各々の場合の、それぞれＴＴＸ用量（μｇ）に対する％ブロック成功（図９Ａ）；ＴＴＸ用量に対するブロックの持続時間（時間）（図９Ｂ）；ＴＴＸ用量（μｇ）に対する％反対側のブロック（図９Ｃ）；およびＴＴＸ用量（μｇ）に対する％死亡率（図９Ｄ）を示している折れ線グラフである。

【0026】

【図10A】図１０Ａ～１０Ｅは、グラフである。図１０Ａは、それぞれ注射された脚

【数40】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３５ｍｇのＴｇＤ８－ＴＴＸにおける２５ｍｇのＴｇＤ８ＴＴＸコンジュゲートにおける１０μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｂは、それぞれ注射された脚

【数41】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３０ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２００－ＴＴＸにおける９．２μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｃは、それぞれ注射された脚

【数42】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ１０００における２５ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける７μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｄは、それぞれ注射された脚

【数43】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２０００における３０ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける４．８μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｅは、それぞれ注射された脚

【数44】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、４．０μｇの遊離ＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｅは、グラフである。図１０Ａは、それぞれ注射された脚

【数45】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３５ｍｇのＴｇＤ８－ＴＴＸにおける２５ｍｇのＴｇＤ８ＴＴＸコンジュゲートにおける１０μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｂは、それぞれ注射された脚

【数46】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３０ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２００－ＴＴＸにおける９．２μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｃは、それぞれ注射された脚

【数47】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ１０００における２５ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける７μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｄは、それぞれ注射された脚

【数48】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２０００における３０ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける４．８μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｅは、それぞれ注射された脚

【数49】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、４．０μｇの遊離ＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。

【図10C】図１０Ａ～１０Ｅは、グラフである。図１０Ａは、それぞれ注射された脚

【数50】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３５ｍｇのＴｇＤ８－ＴＴＸにおける２５ｍｇのＴｇＤ８ＴＴＸコンジュゲートにおける１０μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｂは、それぞれ注射された脚

【数51】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３０ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２００－ＴＴＸにおける９．２μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｃは、それぞれ注射された脚

【数52】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ１０００における２５ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける７μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｄは、それぞれ注射された脚

【数53】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２０００における３０ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける４．８μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｅは、それぞれ注射された脚

【数54】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、４．０μｇの遊離ＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。

【図10D】図１０Ａ～１０Ｅは、グラフである。図１０Ａは、それぞれ注射された脚

【数55】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３５ｍｇのＴｇＤ８－ＴＴＸにおける２５ｍｇのＴｇＤ８ＴＴＸコンジュゲートにおける１０μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｂは、それぞれ注射された脚

【数56】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３０ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２００－ＴＴＸにおける９．２μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｃは、それぞれ注射された脚

【数57】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ１０００における２５ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける７μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｄは、それぞれ注射された脚

【数58】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２０００における３０ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける４．８μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｅは、それぞれ注射された脚

【数59】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、４．０μｇの遊離ＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。

【図10E】図１０Ａ～１０Ｅは、グラフである。図１０Ａは、それぞれ注射された脚

【数60】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３５ｍｇのＴｇＤ８－ＴＴＸにおける２５ｍｇのＴｇＤ８ＴＴＸコンジュゲートにおける１０μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｂは、それぞれ注射された脚

【数61】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、３０ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２００－ＴＴＸにおける９．２μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｃは、それぞれ注射された脚

【数62】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ１０００における２５ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける７μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｄは、それぞれ注射された脚

【数63】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、２５ｍｇのＴｇＤ８Ｐ２０００における３０ｍｇのＴＴＸコンジュゲートにおける４．８μｇのＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。図１０Ｅは、それぞれ注射された脚

【数64】

および反対側の脚（－●－）の各々の場合の、４．０μｇの遊離ＴＴＸの場合の時間（時間）に対する熱潜時（秒）を示している折れ線グラフである。

【0027】

【図11】図１１は、それぞれコンジュゲート化ＴＴＸ／ＰＥＧ２００

【数65】

、遊離ＴＴＸ／ＰＢＳ（－●－）および遊離ＴＴＸ／ＰＥＧ２００

【数66】

の各々の場合の、ＴＴＸ用量（μｇ）に対する遮断の持続時間（単位は時）の用量反応曲線を示している折れ線グラフである。

【0028】

【図12A】図１２Ａ～１２Ｄは、折れ線グラフである。図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれ、１０μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％死亡率（図１２Ａ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｂ）を示している。図１２Ｃおよび１２Ｄはそれぞれ、１μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％ブロック成功（図１２Ｃ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｄ）を示している。

【図12B】図１２Ａ～１２Ｄは、折れ線グラフである。図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれ、１０μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％死亡率（図１２Ａ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｂ）を示している。図１２Ｃおよび１２Ｄはそれぞれ、１μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％ブロック成功（図１２Ｃ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｄ）を示している。

【図12C】図１２Ａ～１２Ｄは、折れ線グラフである。図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれ、１０μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％死亡率（図１２Ａ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｂ）を示している。図１２Ｃおよび１２Ｄはそれぞれ、１μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％ブロック成功（図１２Ｃ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｄ）を示している。

【図12D】図１２Ａ～１２Ｄは、折れ線グラフである。図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれ、１０μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％死亡率（図１２Ａ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｂ）を示している。図１２Ｃおよび１２Ｄはそれぞれ、１μｇのＴＴＸコンジュゲートの場合の、ｆ_ｐｈｉｌ（％）に対する％ブロック成功（図１２Ｃ）およびブロックの持続時間（時間）（図１２Ｄ）を示している。

【0029】

【図13】図１３は、注射後の時間（時間）に対する相対蛍光（％）を示している折れ線グラフである。

【0030】

【図14】図１４は、それぞれＰＧＳ－Ｃａｐ

【数67】

ＰＧＳ－Ｃａｐ－２（－●－）；ＰＧＳ－ＰＥＧ－１０００－Ｃａｐ

【数68】

およびＰＧＳ－ＰＥＧ－１０００－Ｃａｐ－２

【数69】

の各々の場合の、時間（日）に対するカプサイシンの量（μｇ）によって表される、ＰＧＳ－カプサイシンコンジュゲートからのカプサイシンの放出を示している折れ線グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0031】

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
用語「サイト１ナトリウムチャネル遮断薬」または「Ｓ１ＳＣＢ」とは、「サイト１」と呼ばれる位置におけるナトリウムチャネルの外側の開口部に結合する分子のことを指す。好ましい実施形態において、サイト１ナトリウムチャネル遮断薬は、天然に存在するトキシンまたはその誘導体である。用語「その誘導体」には、誘導体化されていないサイト１ナトリウムチャネル遮断薬と実質的に同じ機能特性を有するサイト１ナトリウムチャネル遮断薬（例えば、生物学的および／または薬理学的なもの、すなわち、ナトリウムチャネルを効果的に遮断するもの）の任意の誘導体が含まれる。

【0032】

用語「麻酔」とは、感覚消失（意識消失を引き起こさない局所的；意識消失を伴う全身性）のことを指し、通常は、生体機能を失わない意識消失のことを指す。用語「麻酔薬」および「麻酔剤」とは、被験体において麻酔を誘導する作用物質のことを指す。

【0033】

用語「血管収縮薬」は、特に血管運動作用の結果としての血管内腔の狭小化を引き起こす作用物質である。

【0034】

用語「浸潤」とは、組織の複数の層または領域への注射のことを指す。

【0035】

用語「注射」とは、組織または内腔における単一のポイントへの注射のことを指す。

【0036】

用語「神経ブロック」とは、神経幹に沿ったインパルスの流れの中断によってもたらされる局所麻酔のことを指す。

【0037】

用語「最小有効濃度」（ＭＥＣ）は、疼痛緩和を提供するのに十分な、所与の場所における１つまたはそれを超える薬物の最も低い局所濃度である。

【0038】

用語「個体」、「個体」、「被験体」および「患者」は、互換的に使用され、ヒト、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）および他の実験動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物のことを指す。

【0039】

用語「生体適合性」とは、それら自体が宿主（例えば、動物またはヒト）にとって有毒でなく、宿主においてモノマーもしくはオリゴマーのサブユニットまたは他の副産物を有毒な濃度で生成する速度で分解しない（ポリマーが分解する場合）、１つまたはそれを超える材料のことを指す。

【0040】

用語「骨格ポリマー」または「骨格」とは、麻酔薬が共有結合的に付着される、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲート内に含まれる化学的部分またはポリマーのことを指す。骨格ポリマーは、賦形剤の一部を形成しない。例示的な骨格ポリマーとしては、ジカルボン酸／トリオール誘導体が挙げられる。好ましい骨格ポリマーは、ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）－ＰＥＧ共重合体（ＰＧＳ－ＰＥＧ）である。

【0041】

用語「加水分解性リンカー」とは、エステル結合などの、加水分解的に分解され得る任意の化学結合または化学的部分のことを指す。

【0042】

用語「バースト放出」とは、作用物質の急速または放出または送達、例えば、送達ビヒクルまたは送達構造体からの活性な剤の急速な送達のことを指す。例えば、インビボでの薬物送達系からの薬物の急速な放出または「バースト」放出は、送達系の拡散または分解によるより遅い薬物放出と比べて、送達系に吸着されたまたは弱く結合された薬物の一部分によって生じ得る。

【0043】

用語「薬学的に許容され得るキャリア」には、任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、活性な化合物と不適合である場合を除いて、治療的製剤におけるその使用が企図される。補充的な活性な化合物も、その製剤に組み込まれ得る。

【0044】

ＩＩ．組成物
ＰＧＳおよびＰＧＳ－ＰＥＧ骨格などの生分解性かつ生体適合性のポリマーに共有結合的にコンジュゲート化された局所麻酔剤を含む製剤は、インビボにおいて調整可能な麻酔薬放出を提供することが立証された。それらの製剤は、全身毒性および局所毒性が低い、高濃度の麻酔薬の局所送達を可能にする。投与部位において放出される麻酔薬の速度および量は、麻酔薬の量、ポリマーの分子量、組成および濃度、ならびに分子をコンジュゲート化するために使用される共有結合性リンカーのタイプを変化させることによって、制御可能である。

【0045】

例示的な麻酔剤としては、サイト１ナトリウムチャネル遮断薬およびバニロイドが挙げられる。麻酔剤は、少なくとも１つの局所的な両親媒性ポリマーにコンジュゲート化される。例示的な両親媒性ポリマーとしては、ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＰＧＳコンジュゲートは、１つまたはそれを超える親水性ポリマーを含む。例示的な親水性ポリマーとしては、ポリエチレン－グリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。これらの構成要素の各々は、下記で詳細に論じる。麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの製剤は、さらなる活性な剤（例えば、治療薬または診断薬）ならびに賦形剤および保存剤も含み得る。

【0046】

Ａ．麻酔剤
麻酔剤は、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートに含められる。コンジュゲート化の前に、麻酔剤は、１つまたはそれを超える遊離ヒドロキシル基または遊離カルボキシル基を含む。いくつかの実施形態において、麻酔剤は、コンジュゲート化の前に、またはそれを超える遊離ヒドロキシル基または遊離カルボキシル基を含むように改変される。いくつかの実施形態において、麻酔剤は、局所麻酔剤である。麻酔剤の例示的なクラスとしては、サイト１ナトリウムチャネルを遮断する作用物質（Ｓ１ＳＣＢ）およびバニロイドレセプターサブタイプ１（ＴＲＰＶ１）アゴニストが挙げられる。好ましい麻酔剤は、テトロドトキシン（ＴＴＸ）である。

【0047】

１．サイト１ナトリウムチャネル遮断薬（Ｓ１ＳＣＢ）
サイト１遮断薬は、電位開口型ナトリウムチャネルの強力かつ特異的な遮断について長く認識されている分子ファミリーである。サイトＩナトリウムチャネル遮断薬（Ｓ１ＳＣＢ）には、フィコトキシン（サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、ネオサキシトキシン（Ｎｅｏ）およびゴニオトキシン）、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、およびコノトキシンのいくつかが含まれる。

【0048】

ｉ．テトロドトキシン（ＴＴＸ）
テトロドトキシン（ＴＴＸ）は、ヒト筋細胞（筋肉の収縮性細胞）において高速のＮａ＋電流を遮断することにより、それらの収縮を阻害する、非常に強力な神経毒である。化学的には、それは、アミノポリヒドロキノリン（ａｍｉｎｏ ｐｏｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）である（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．１８
Ｎｏ．２，ｐｐ．９９７－１０４９を参照のこと）。

【0049】

テトロドトキシン単独では、有毒すぎて麻酔薬として使用できない。ラットでは、テトロドトキシンとブピバカインとの併用により、テトロドトキシン単独と比べて、強い全身毒性なしに、長い持続時間の坐骨神経遮断がもたらされた（Ｋｏｈａｎｅら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，１９９８：１１９－１３１）。電位開口型Ｎａ＋チャネルの強力な阻害は、ＴＴＸが薬物として単独で使用されるには有害すぎるが、制御された形式でそのようなチャネルを遮断することは、パーキンソン病および末期癌患者における慢性疼痛などの症状の処置において望ましいことがある。コンジュゲートの形成によって、この非常に有毒なトキシンが有用かつ安全な麻酔薬となる。

【化1】

【0050】

ａ．テトロドトキシンの起源
テトロドトキシンは、ヒョウモンダコなどの動物から単離されており、また、細菌によって産生される。ＴＴＸ産生に関連する最も一般的な細菌は、Ｖｉｂｒｉｏ属の種の細菌であり、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓが、最も一般的な種である。フグ、毛顎動物および紐形動物が、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＴＴＸを含むと示されているが、これらの事実と動物におけるＴＴＸの産生との関連性は、確固として確立されておらず、それらの細菌が本当に動物におけるＴＴＸの起源であるのかに関して文献には多くの議論が残っている。テトロドトキシンは、おそらく最も広く知られたサイト１トキシンであるが、フグに由来する必要があるため、臨床で使用するには高価である。ＴＴＸを産生する内共生細菌は、エキソビボで生育されると、ＴＴＸの産生が減少する。テトロドトキシンは、いくつかの種のフグおよびある特定の種のカリフォルニアイモリの卵巣および卵から入手できる。Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応によるものまたは炭水化物および同族体からのＴＴＸの合成（Ｏｈｙａｂｕら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｊｕｌ ２３；１２５（２９）：ｐｐ８７９８－８０５（２００３））；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４３，４７８２．ＤＯＩ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２００４６０２９３（２００４）；Ｃｈａｕ ａｎｄ Ｃｉｕｆｏｌｉｎｉ，Ｍａｒ Ｄｒｕｇｓ，９（１０）：２０４６－２０７４（２０１１）におけるレビュー）をはじめとしたテトロドトキシンの全化学合成に対する数多くのスキームが報告されている。合成は、鏡像異性的に純粋なジエノフィル（ｄｉｅｎｏｐｉｌｅ）を使用したＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加環化によるシクロヘキセンの迅速な構築、アミノ化された第四級中心の早期導入、および環の周りのさらなる官能化の相対配置を方向付けるためにその中心を使用することを特長とする。

【0051】

ｉｉ．フィコトキシン
フィコトキシンは、興奮性細胞に存在する電位依存性ナトリウムチャネルの特異的な遮断薬として作用する（Ｋａｏ，Ｃ．Ｙ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．，１８：９９７－１０４９（１９６６））。ナトリウムチャネルの阻害に起因して、神経インパルスの伝達が遮断され、神経伝達物質の放出が運動神経接合部（ｎｅｕｒｏｍｏｔｏｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のレベルで妨げられ、それにより、筋収縮が妨げられる。これらの生理学的効果に起因して、これらの化合物は、注射可能な形態で局所適用されるとき、筋肉の過活動（例えば、筋痙縮および限局性ジストニア）と関連する病理において筋活動阻害剤として使用されるとき、薬理学において潜在的に有用である。さらに、伝達レベルでの神経インパルスの遮断は、これらの化合物が局所浸潤として適用されるときにもたらされるので、それらの化合物は、遠心性神経伝達経路を遮断できるだけでなく、求心性経路も遮断でき、感覚経路の阻害を引き起こすことができ、これらの化合物が局所注射されるときに麻酔効果ももたらすことができる。米国特許第４，００１，４１３号に記載されているように、両方の効果が同時に起こるので、これは、驚くべき効果である。

【0052】

これらのフィコトキシンの化学構造は、式ＩＩの一般構造を有する。

【化2】

【0053】

この構造の特定の化学構造は、表１．１に記載の置換基Ｒ１～Ｒ５によって定義される。

【表1-1】

【0054】

ａ．サキシトキシン
サキシトキシン（ＳＴＸ）は、アラスカバタークラムであるＳａｘｉｄｏｍｕｓ ｇｉｇａｎｔｃｕｓから初めて抽出され、Ｇｏｎｙａｕｌａｘ属の藻類に存在する。報告されている化学式は、Ｃ１０Ｈ１５Ｎ７Ｏ３．２ＨＣｌである。サキシトキシンは、水およびメタノールに支障なく溶け、このトキシンは、２つのグアニジニウム部分が組み込まれたペルヒドロプリン核を有すると考えられている。ＳＴＸは、麻痺性貝中毒に関与する。ＳＴＸは、公知の最も有毒な非タンパク質化合物の１つであり、マウスでは８μｇ／Ｋｇの毒性があると報告されている（ヒトに対しては、およそ０．２～１．０ｍｇで致死性であると証明されるであろう）ので、局所麻酔剤として単独で使用するには有毒すぎると広く考えられている。

【0055】

ｂ．ネオサキシトキシンおよびデカルバモイルサキシトキシン
ネオサキシトキシンおよびデカルバモイルサキシトキシンは、潜在的により強力であり、製剤化においてはサキシトキシンにまさる利点を有する可能性がある。

【0056】

ネオサキシトキシン（「ＮｅｏＳＴＸ」または「Ｎｅｏ」）は、持続時間の長い局所麻酔剤として臨床開発中である（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｎａｖａｒｒｏら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，２００７；１０６：３３９－４５；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｎａｖａｒｒｏら、Ｎｅｕｒｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．，２００９；１６：４０８－１５；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｎａｖａｒｒｏら、Ｒｅｇ．Ａｎｅｓｔｈ．Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．，２０１１；３６：１０３－９）。ヒトボランティアにおける皮下浸潤の第１相試験は、ＮｅｏＳＴＸが、有効な皮膚知覚鈍麻を引き起こしたことを示し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｎａｖａｒｒｏら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，２００７；１０６：３３９－４５）、第２の第１相試験は、ブピバカインとの併用によって、ＮｅｏＳＴＸまたはブピバカイン単独と比べてより長時間の痛覚消失がもたらされたことを示した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｎａｖａｒｒｏら、Ｎｅｕｒｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．，２００９；１６：４０８－１５）。

【化3】

【0057】

（ｉ）フィコトキシンの起源
サキシトキシン（ＳＴＸ）およびその誘導体は、藻類由来のバイオリアクターにおいて生成され得る。フィコトキシンであるネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニオトキシン（ｇｏｎｙａｕｌａｔｏｘｉｎ）は、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属の種、Ｐｉｒｉｄｉｎｉｕｍ属の種およびＧｉｍｎｏｄｉｎｉｕｍ属の種といった有害藻類の異常発生によって産生される活性な化合物である（Ｌａｇｏｓ，Ｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３１：３７５－３８６ １９９８））。過去１５年間で、これらのフィコトキシンは、海生渦鞭毛藻類によって産生されることに加えて、光合成藍藻類などの淡水シアノバクテリアによっても産生され得ることが実証された。

【0058】

麻痺性フィコトキシンを産生できるたった４つの属のシアノバクテリアが同定されており、その各々は、産生されるフィコトキシンの量とタイプの両方が異なるフィコトキシン混合物を産生する。すなわち、それらは、異なるプロファイルの麻痺性フィコトキシンを産生する（Ｌａｇｏｓら、１９９９，ＴＯＸＩＣＯＮ，３７：１３５９－１３７３（１９９９）．Ｐｅｒｅｉｒａら、ＴＯＸＩＣＯＮ，３８：１６８９－１７０２（２０００）。

【0059】

ＳＴＸは、少なくとも３つの異なる方法に従った化学合成によっても生成され得る（Ｋｉｓｈｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９８，２８１８（１９７７））；Ｊａｃｏｂｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，，１０６（１９），ｐｐ５５９４－５５９８（１９８４）Ｆｌｅｍｉｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３９２６（２００６））。

【0060】

２つのサキシトキシン誘導体であるネオサキシトキシン（ＮｅｏＳＴＸ）およびデカルバモイルサキシトキシンが、生成プロセスおよび効力に関して利点を有する。ある研究では、ＮｅｏＳＴＸを含むサキシトキシンシリーズのいくつかのメンバーを用いてラットの坐骨神経遮断を調べた（Ｋｏｈａｎｅら、Ｒｅｇ．Ａｎｅｓｔｈ．Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．，２５：５２－９（２０００）。サキシトキシンおよびこれらの２つの誘導体のすべてが、ブピバカインまたはエピネフリンと併用されたとき、顕著に相乗的な遮断および長時間のブロック（インビボのラット坐骨神経において１～２日間）をもたらす。

【0061】

２．バニロイドレセプターサブタイプ１（ＴＲＰＶ１）アゴニスト
ａ．カプサイシンおよびその誘導体
カプサイシンは、３－ヒドロキシ－４－メトキシ－ベンジルアミド（バニロイド環）ファーマコフォアおよび疎水性アルキル側鎖を含むと特徴付けられているカプサイシノイド群の化合物のメンバーである。カプサイシノイドは、トウガラシの果実およびそれらの製品の辛味に関与する化合物である。

【0062】

カプサイシンは、１８７６年に初めて単離され、１９１９年に初めて、実験構造がＣ_１８Ｈ_２７ＮＯ_３（８－メチル－Ｎ－バニリル－ｔｒａｎｓ－６－ノネンアミド）と明らかにされた。カプサイシンは、３０５ダルトンの分子量を有し、式ＩＶに記載の、１１個の炭素の疎水性アルキル側鎖を有するバニロイド環ファーマコフォアを有する。疎水性アルキル側鎖における二重結合構造は、分子内回転を防ぐことから、この分子は、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性を示す。しかしながら、ｃｉｓ異性体は、安定性の低い配置であるので、カプサイシンは、天然にはｔｒａｎｓ異性体として存在する。

【化4】

【0063】

カプサイシンの揮発度は非常に低く、完全に無臭である。精製されたカプサイシンは、室温において蝋様の無色の物質であり、冷水に溶けないが、アルコール、脂肪および油には支障なく溶ける。長い炭化水素尾部は、脂質の多い細胞膜へのカプサイシンの組み込みを可能にし、カプサイシンは、皮膚および粘膜から局所的に効果的に吸収されると知られている。カプサイシンの薬物動態学的半減期は、およそ２４時間であると見出された。

【0064】

カプサイシンは、慢性疼痛管理のための局所薬物としてＦＤＡに承認されている。カプサイシンは、一過性受容体電位バニロイド（ＴＲＰＶ１）に結合し（Ｃａｔｅｒｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ，３８９：８１６－８２４（１９９７））、それにより、感覚ニューロンにおける侵害刺激が媒介される。カプサイシンは、動物試験において安全であると示された（Ｐａｒｋら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１８：４２０１－４２０５（１９９８））。

【0065】

カプサイシノイドは、チリペッパーの活性な構成要素である天然に存在する化合物であり、世界中で調理用途において使用されることで有名である。カプサイシノイドは、ナス科のＣａｐｓｉｃｕｍ属に属する植物の果実内で産生される。「芳しい」トウガラシ植物の果実（例えば、ハラペーニョまたはハバネロとしてよく知られているもの）は、カプサイシンの豊富な天然の起源である。カプサイシンは、種子とトウガラシ果実の肋との間に位置し、乾燥および／または粉砕されたトウガラシ果実の中に保持されている。カプサイシノイドが高含有量であることで有名なＣａｐｓｉｃｕｍ種の例としては、Ｃ．ａｎｎｕｍ（オレオレジントウガラシ）、Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ（ハラペーニョトウガラシ）およびＣ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ（ハバネロトウガラシ）が挙げられ、これらは、０．２２～２０ｍｇの総カプサイシノイド／ｇ乾燥重量を含むと見出された。カプサイシンは、トウガラシ植物内で最も豊富なカプサイシノイドであり、辛味品種のほとんどにおいて総カプサイシノイドの約７１％を占める（ｄｅ Ｌｏｕｒｄｅｓ Ｒｅｙｅｓ－Ｅｓｃｏｇｉｄｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１６：１２５３－１２７０（２０１１）を参照のこと）。カプサイシンの生合成は、酵素カプサイシンシンターゼ（ＣＳ）によって生じる、バニリルアミンと８－メチルノネン酸との縮合を必要とする。

【0066】

精製されたカプサイシンは、市販されている（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ Ｍ２８０８，ＣＡＳ＃４０４－８６－４）。カプサイシンおよびそのアナログは、中程度の圧力下の１４０～１７０℃の温度において塩化脂肪酸およびアミンを使用して産業的に生成される（Ｋａｇａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４：３４７７－３４７８，１９８９およびＫａｇａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９６，５２，８４５１－８４７０を参照のこと）。しかしながら、カプサイシンの大規模化学合成の応用は、必要とされる試薬の毒性によって限定され、この欠点が、酵素的合成を従来の化学合成に代わる魅力的なものにする。ゆえに、酵素触媒反応を用いて基質分子からカプサイシノイドをインビトロで化学合成するためのいくつかの方法が知られている（例えば、Ｋｏｂａｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２１，５４７－５５０（１９９９）を参照のこと）。インビトロにおけるカプサイシンの酵素的形成は、液体培地で生育されたＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ植物由来の細胞および組織を用いて実証されている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．７０：２２３－２２９（１９９０）を参照のこと）。インビトロで生育され、アルギン酸カルシウムで固定化された果実由来の細胞および胎座組織は、培地中でカプサイシンを産生した。カプサイシン合成の大きな可能性が、固定化された細胞よりも固定化された胎座組織で観察された。３０日間培養した後、２，４００μｇカプサイシン／ｇ固定化胎座という最大収量が観察された。

【0067】

ｂ．カプサイシンのアナログ
ｉ．カプサイシノイド
いくつかの実施形態において、カプサイシンは、カプサイシンのカプサイシノイドアナログである。カプサイシンのカプサイシノイドアナログは、当該分野で公知である。例えば、Ｒｅｉｌｌｙ ａｎｄ Ｙｏｓｔ，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．，３３：５５０－５３６（２００５）を参照のこと。ＲｅｉｌｌｙおよびＹｏｓｔは、カプサイシンの５つの天然に存在するカプサイシノイドアナログを報告している。これらの化合物は、同じ３－ヒドロキシ－４－メトキシ－ベンジルアミド（バニロイド環）ファーマコフォアを有するが、疎水性アルキル側鎖部分に違い（例えば、Ｃ１５－１６（ω－２，３位）の飽和、Ｃ１７におけるメチル基の欠失（第三級炭素の喪失）および炭化水素鎖の長さの変更）がある。カプサイシンの天然に存在するカプサイシノイドアナログとしては、式Ｖにおけるような、ホモカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシン、ｎ－バニリルオクタンアミド、ノニバミドおよびｎ－バニリルデカンアミドが挙げられるが、これらに限定されない。

【化5】

【0068】

いくつかの実施形態において、カプサイシンは、カプサイシンのカプシノイドアナログである。カプシエイト、ジヒドロカプシエイトおよびノルジヒドロカプシエイト（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｃａｐｓｏａｔｅ）を含むカプシノイド群の化合物は、カプサイシノイドと構造的に似ているが、式ＶＩにおけるように、中央の結合が異なる（カプサイシノイドではアミド部分であり、カプシノイドではエステル部分である）。カプシノイドは、少数の品種の無辛味赤唐辛子植物（例えば、ＣＨ１９ｓｗｅｅｔという栽培品種）から単離される。カプシエイトの生物作用能は、カプサイシンと似ているが、カプシノイドは、辛味または感覚刺激を示さない。

【化6】

【0069】

いくつかの実施形態において、カプサイシンは、合成カプサイシノイドであるか、またはカプサイシンのカプシノイドアナログである。カプサイシンの複数の合成（天然に存在しない）アナログが当該分野で公知である（例えば、Ｓａｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２７３：２１－３０（１９９６）を参照のこと）。辛味アナログおよび無辛味アナログは、種々のアシル鎖長および／または芳香環における化学的置換を用いて合成できる。詳細には、カプサイシノイドとカプシノイドの両方が、置換パターンの改変および／またはベンゼン環上のメトキシ基の数の改変によって合成的に修飾でき、それらの修飾は、ユビキノンのキノン環上で重ねることができる場合がある。さらに、カプサイシンは、その分子における両性のアミド結合単位の位置の変更および／またはこの単位の他の化学修飾によって改変され得る。化学修飾の例を式ＶＩＩに示す。

【化7】

【0070】

Ｂ．ポリマー
インビボで麻酔薬を制御放出するためのコンジュゲートは、麻酔薬が例えばエステル結合によって共有結合的にコンジュゲート化された１つまたはそれを超えるポリマーを含む。麻酔薬が結合するポリマーは、「骨格」ポリマーとも称されることがある。

【0071】

麻酔薬およびポリマーの共有結合性コンジュゲートは、麻酔薬が結合し得る好適なポリマー（例えば、ジカルボン酸／トリオール（ＴＤ）ポリマー）から形成される「骨格」を必要とする。そのようなポリマーの生成およびコンジュゲート化のための代表的なスキームをそれぞれ図１Ａおよび１Ｂに提供する。

【0072】

いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、ポリエステルポリマーを含む。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、１種より多いポリエステルポリマーのブレンド物を含む。好ましいポリエステルポリマーは、ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）である。

【0073】

いくつかの実施形態において、ＰＧＳは、１つまたはそれを超えるさらなるポリエステルポリマーとブレンドされて、コンジュゲートの１つまたはそれを超える材料特性を変化させる。コンジュゲートに含めるのに適したポリエステルポリマーとしては、生体吸収型の合成ポリエステル（例えば、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリ（オルト）エステル、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリブチレート）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ならびにそれらの共重合体（ｃｏｐｏｌｍｙｅｒｓ）、ブレンド物および化学的誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者が日常的に行う他の修飾）が挙げられる。－ＣＯＯＨ基または－ＯＨ基を有する任意の天然高分子または合成ポリマーが、麻酔剤をコンジュゲート化するために使用され得る。ゆえに、天然高分子および合成ポリマー（例えば、ヒアルロン酸、タンニン酸、ポリ－アクリル酸、およびカルボキシル末端または側鎖部分を含む他の化合物）が、麻酔薬コンジュゲートに含められ得る。一般に、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートに含められるポリマーは、生分解性かつ生体適合性である。しかしながら、いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える非生分解性ポリマーが、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートに含められる。麻酔薬の共有結合性コンジュゲートが、１つまたはそれを超える生分解性ポリマーおよび１つまたはそれを超える非生分解性ポリマーのブレンド物を含むとき、その生分解性ポリマーと非生分解性ポリマーとの比率は、レシピエントのニーズに応じて、例えば、麻酔剤の量および／または送達速度を調整するために変更され得る。

【0074】

１．ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）
いくつかの実施形態において、他の生体吸収型ポリエステルが、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートにおいて使用するために、ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）と併用されるか、またはＰＧＳの代わりに用いられる。インビボで麻酔薬を制御放出するための、ポリマーに共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）を含み得る。ＰＧＳは、種々の生物医学的用途において用いられる生分解性ポリエステルポリマーである。ＰＧＳは、通常、グリセロールとセバシン酸との重縮合によって調製される。ＰＧＳは、生体適合性かつ生分解性であり、ＰＧＳの機械的特性および分解動態は、硬化時間、硬化温度、反応体の濃度、およびアクリル化ＰＧＳではアクリル化の程度などの因子を制御することによって適応され得る（Ｒａｉら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖ．３７，（８），ｐｐ．１０５１－１０７８（２０１２））。

【0075】

グリセロールは、脂質の基本的な構成単位であり、一方、セバシン酸は、中鎖から長鎖脂肪酸のω－酸化における天然の代謝中間体である。さらに、グリセロール、およびセバシン酸を含む共重合体は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって医学的応用について承認されている。ＰＧＳは、その望ましい機械的特性、生体適合性および制御分解に起因して、組織工学用途に提案されている（Ｊｉａ，Ｙ．ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７，２５５３－２５６４，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ５ｐｙ０１９９３ａ（２０１６）；Ｒａｉら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，１０５１－１０７８（２０１２）；Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔ Ａ ６６Ａ，１９２－１９７，（２００３）；Ｌｏｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ ３，７６４１－７６５２（２０１５）；Ｗａｎｇら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０，６０２－６０６（２００２））。ＰＧＳは、ヒドロキシル基およびカルボキシル基を末端とし、ペプチド、タンパク質および薬物に容易に共有結合的にコンジュゲート化され得る。ＴＴＸは、図１に描かれているように、ヒドロキシル基が豊富な分子構造を有し、エステル結合を介してＰＧＳに共有結合的にコンジュゲート化され得、これらの結合の加水分解によって放出され得る。さらに、ほぼゼロ次のプロファイルに従ってＴＴＸの長期間にわたる一貫した放出を誘導する、ＰＧＳおよびＰＧＳ系共重合体の表面侵食の性質は、それらをユニークなものにし、制御された薬物送達用途について他のポリエステルよりも好ましくする（Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔ Ａ ６６Ａ，１９２－１９７（２００３））。ＰＥＧを組み込むことにより、得られるコンジュゲートの親水性の調整が可能になるので、ＴＴＸの放出速度の調整が可能になる。これらの特徴は、このコンジュゲートに、全身毒性および局所毒性を最小限に抑えながら、長い持続時間の局所麻酔の可能性を付与する。

【0076】

２．親水性を調整可能にするためのポリマー
ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）に共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、必要に応じて、１つまたはそれを超えるさらなる親水性ポリマーを含む。その親水性ポリマーは、ＰＧＳ骨格を延長し、コンジュゲートの親水性を変化させる。ＰＧＳに対する親水性ポリマーの相対量が増加すると、コンジュゲートの親水性が高まる。コンジュゲートの親水性は、インビボでのエステル結合の加水分解速度に関係する。ＰＧＳ－麻酔薬コンジュゲートにおけるエステル結合の加水分解速度は、インビボでのコンジュゲートからの麻酔剤の放出に関係する。ゆえに、インビボでのポリエステルコンジュゲートからの共有結合した麻酔薬の放出速度は、ＰＧＳ－麻酔薬コンジュゲートに付着または会合する親水性ポリマーの量およびサイズによって制御される。

【0077】

好ましい実施形態において、１つまたはそれを超える親水性ポリマー成分は、ポリ（アルキレングリコール）鎖を含む。ポリ（アルキレングリコール）鎖は、１～５００個の繰り返し単位、より好ましくは、４０～５００個の繰り返し単位を含み得る。好適なポリ（アルキレングリコール）としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン１，２－グリコール、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリプロピレン１，３－グリコールおよびそれらの共重合体が挙げられる。

【0078】

ポリβ－アミノエステルおよび１，２－アミノアルコール脂質をはじめとした多種多様の親水性ポリマーが含められ得る。いくつかの実施形態において、それらのポリマーは、アルキル修飾ポリマー、例えば、アルキル修飾ポリ（エチレングリコール）である。他の例示的なポリマーとしては、ポリ（アルキレングリコール）、多糖、ポリ（ビニルアルコール）、ポリピロリドン、ポリオキシエチレンブロック共重合体（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの共重合体が挙げられる。好ましい親水性ポリマーは、生体適合性であり（すなわち、著しい炎症応答または免疫応答を誘導せず）、無毒性である。好適な親水性ポリマーの例としては、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、およびエチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（サッカライド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ならびにそれらの共重合体、ターポリマーおよび混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える親水性ポリマー成分は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の１つまたはそれを超えるブロックを、他の生体適合性ポリマー（例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）またはポリカプロラクトン）から構成される１つまたはそれを超えるブロックとともに含む共重合体である。１つまたはそれを超える親水性ポリマーセグメントは、ＰＥＯの１つまたはそれを超えるブロックを、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を含む１つまたはそれを超えるブロックとともに含む共重合体であり得る。具体例としては、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯのトリブロック共重合体（例えば、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲＳ（商標）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））が挙げられる。

【0080】

ａ．ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）
１つまたはそれを超えるＰＥＧを必要に応じて含む（ＰＧＳ）に共有結合された麻酔薬のコンジュゲートが記載される。

【0081】

ＰＥＧは、通常使用される親水性ポリマー剤である。修飾デンドリマー系ナノ粒子（ＭＤＮＰ）に含められる両親媒性ＰＥＧのサイズ、相対量および分布は、得られるＭＤＮＰの生物物理学的特徴（例えば、構造的特長および電荷密度）に影響し得る。

【0082】

ＭＤＮＰの物理的特性は、両親媒性ＰＥＧのサイズ、相対量および分布（すなわち、ペグ化の程度）と直接関連する。改変され得る例示的な特性としては、１つまたはそれを超えるタイプの真核細胞によるＭＤＮＰ取り込みの有効性、治療薬、予防薬および診断薬の細胞内送達のスピードおよび有効性、ならびにＭＤＮＰの免疫原性および細胞傷害性が挙げられる。ある特定の実施形態において、ペグ化によって、ＭＤＮＰの電荷中和が生じる。

【0083】

通常、両親媒性ＰＥＧには、短鎖オリゴ－エチレングリコールが含まれる。例示的なオリゴ（ｏｌｉｇｏｉ）－エチレングリコールとしては、ジ－エチレングリコール、トリ－エチレングリコール、テトラ－エチレングリコール、ペンタ－エチレングリコール、ヘキサ－エチレングリコールなどが挙げられる。

【化8】

【0084】

いくつかの実施形態において、両親媒性ポリマーは、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）にコンジュゲート化されたリン脂質である。ある特定の実施形態において、脂質と会合したＰＥＧまたはｍＰＥＧは、分枝状または「マルチアーム型」のＰＥＧである。ＭＤＮＰには、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を有する少なくとも２つの分枝を有するマルチアーム型ポリエチレングリコールが含まれ得る。しかしながら、スクシンイミジルまたはマレイミド末端などの他の末端基を有するＰＥＧポリマーも使用できる。

【0085】

麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、種々の分子量を有するポリエチレングリコールポリマーを含み得る。例えば、ＰＥＧは、およそ１００Ｄａ（すなわち、ＰＥＧ１００Ｄａ）～およそ１２，０００ｋＤａ（すなわち、ＰＥＧ１２ＫＤａ）（両端値を含む）の分子量を有し得る。麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、単一種の両親媒性ＰＥＧを用いて形成され得るか、または２つもしくはそれを超える異なる種の両親媒性ＰＥＧから形成され得る。例えば、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、種々の分子量を有する複数の異なる種のＰＥＧを用いて形成され得る。

【0086】

麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、単一の両親媒性ポリマー種、または複数の異なる両親媒性ポリマー種の混合物を用いて形成され得る。両親媒性ポリマーは、付加物で修飾され得る。例えば、両親媒性ポリマーは、同じまたは異なる１つまたはそれを超える種々の付加物で修飾され得る。ゆえに、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、ＰＧＳおよび１つまたはそれを超えるＰＥＧおよび他のポリマー（必要に応じて同じまたは異なる付加物の混合物を含む）を用いて形成され得る。

【0087】

例示的なＰＥＧは、ある分子量を有するＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ（１００）；ＰＥＧ（２００）；ＰＥＧ（３００）；ＰＥＧ（４００）；ＰＥＧ（５００）；ＰＥＧ（６００）；ＰＥＧ（７５０）；ＰＥＧ（８００）；ＰＥＧ（９００）；ＰＥＧ（１，０００）；ＰＥＧ（２，０００）；ＰＥＧ（３，０００）；ＰＥＧ（５，０００）；ＰＥＧ（６，０００）；ＰＥＧ（７，０００）；ＰＥＧ（８，０００）；ＰＥＧ（９，０００）；ＰＥＧ（１０，０００）；ＰＥＧ（１２，０００）；および１２，０００を超える分子量を有するＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ（２０，０００）である。脂質成分は、飽和脂肪酸部分または不飽和脂肪酸部分を含み得る。

【0088】

いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、１つまたはそれを超える種のＰＥＧまたは［メトキシ（ポリエチレングリコール）］ｍＰＥＧ）分子を含む。単一種より多いＰＥＧおよび／またはｍＰＥＧが使用されるとき、それらは、同じまたは異なるモル比で存在し得る。麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートに組み込まれ得る例示的なＰＥＧまたはｍＰＥＧとしては、１００Ｄａ～８０，０００Ｄａ、例えば、１００Ｄａ～１０，０００Ｄａ、より好ましくは、２００Ｄａ～５，０００Ｄａ、最も好ましくは、２００～２，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧまたはｍＰＥＧ成分が挙げられる。

【0089】

ＰＥＧおよび／またはｍＰＥＧは、１：０１～１：１，０００というポリエステル対ＰＥＧのモル比で含められ得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、１：１のＰＧＳ：ＰＥＧのモル比、または１：１を超えるモル比（例えば、１：２、１：３、１：４；１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０または１：１０を超えるモル比）でＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートに存在する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、１：１のＰＥＧ：ＰＧＳのモル比、または１：１を超えるモル比（例えば、１：２、１：３、１：４；１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０または１：１０を超えるモル比）でＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートに存在する。
コンジュゲートに含められるＰＥＧ（または他の親水性ポリマー）の量およびサイズは、インビボでのコンジュゲートの所望の生理学的特性に応じて変更され得る。

【0090】

Ｃ．共有結合性リンカー部分
ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマーコンジュゲートに共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、１つまたはそれを超えるタイプの共有結合を介して１つまたはそれを超える麻酔剤に結合する。好ましい実施形態において、その共有結合は、インビボにおいて分解されるかまたはその他の方法で切断されて、分解の部位においてまたは分解の部位付近において麻酔剤を放出するような、生分解性の結合である。例示的な生分解性の共有結合は、エステル結合などの加水分解性の結合である。

【0091】

いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、例えばエステル結合を介して、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマー骨格に直接、コンジュゲート化または付着された麻酔剤および／またはさらなる活性な剤を含む。必要に応じて、それらの麻酔剤または化合物は、種々の結合（例えば、ジスルフィド、カーボネート、カルバメート、チオエステル、ヒドラジン、ヒドラジドおよびアミド結合）を介し、１つまたはそれを超えるスペーサー／リンカーを介して、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマー骨格にコンジュゲート化される。いくつかの実施形態において、その付着は、その作用物質とＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマー骨格との間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して生じる。この場合、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、身体内に見られる還元条件下におけるチオール交換反応によって、インビボにおいて作用物質を急速放出することができる。

【0092】

１．スペーサー
いくつかの実施形態において、麻酔剤は、１つまたはそれを超える中間体「スペーサー」または「リンカー」分子を介してポリマー骨格にカップリングされる。そのスペーサーまたはリンカーは、その分子の親水性を高めることができ、それにより、麻酔薬／ポリマー結合の加水分解または分解の速度を高め、その結果、インビボでの麻酔剤の放出が増大する。ゆえに、スペーサーは、インビボにおけるポリマーからの麻酔薬および／またはさらなる活性な剤の放出速度を改変するために含められ得る。

【0093】

用語「スペーサー」は、活性な剤をＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマー骨格に連結するために使用される化合物を含む。そのスペーサーは、ポリマーと麻酔剤とを架橋するために共に連結される、単一の化学的実体または２つもしくはそれを超える化学的実体であり得る。そのスペーサーには、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカーボネート末端を有する任意の低分子化学的実体、ペプチドまたはポリマーが含まれ得る。

【0094】

スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカーボネート基が末端である化合物から選択され得る。スペーサーには、チオピリジン末端の化合物、例えば、ジチオジピリジン、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）またはスルホスクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ）が含まれ得る。スペーサーには、ペプチドも含まれ得、ここで、それらのペプチドは、スルフヒドリル基を本質的に有する、直鎖状であるかまたは環状である（例えば、グルタチオン、ホモシステイン、システインおよびその誘導体、ａｒｇ－ｇｌｙ－ａｓｐ－ｃｙｓ（ＲＧＤＣ）、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）（ｃ（ＲＧＤｆＣ））、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）、シクロ（Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ））。スペーサーは、メルカプト酸誘導体（例えば、３メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、４メルカプト酪酸、チオラン－２－オン、６メルカプトヘキサン酸、５メルカプト吉草酸および他のメルカプト誘導体、例えば、２メルカプトエタノールおよび２メルカプトエチルアミン）であり得る。

【0095】

いくつかの実施形態において、スペーサーは、チオサリチル酸および／またはその誘導体、（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－アルファ－２－ピリジルチオ）トルエン、（３－［２－ピリジチオ］プロピオニルヒドラジドである。いくつかの実施形態において、スペーサーは、マレイミド末端を有し、ここで、そのスペーサーは、ポリマーまたは低分子化学的実体（例えば、ビス－マレイミドジエチレングリコールおよびビス－マレイミドトリエチレングリコール、ビス－マレイミドエタン、ビスマレイミドヘキサン）を含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ビニルスルホン、例えば、１，６－ヘキサン－ビス－ビニルスルホンを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、チオグリコシド、例えば、チオグルコースを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、１つまたはそれを超える還元タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン）、ジスルフィド結合を形成できる任意のチオール末端の化合物から形成される。スペーサーには、マレイミド、スクシンイミジルおよびチオール末端を有するポリエチレングリコールも含まれ得る。

【0096】

いくつかの実施形態において、スペーサー／リンカーは、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）リンカー、アリルリンカー、プロパルギルリンカー、エタンチオールリンカー、ピリジンジスルフィドリンカーである。いくつかの実施形態において、スペーサー／リンカーは、例えばエステル結合と比べて生理学的条件下における安定性が改善されるように、エーテル、チオエステル、カルバメート、カーボネート、ヒドラジンまたはアミド結合のうちの１つまたはそれを超える結合を介してＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマー骨格にコンジュゲート化される。

【0097】

他の実施形態において、ＮＡＣなどの活性な剤のコンジュゲート化のためのクリックケミストリーに関与し得る、種々の結合、例えば、エーテル、エステル、カルバメート、カーボネートなどを介した、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマー骨格表面に対する種々のリンカー、例えば、アリル、プロパルギルなどの連結。

【0098】

さらなる実施形態において、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマー骨格は、１つのリンカーを介して第１の麻酔薬または活性な剤にコンジュゲート化され、一方で、異なるリンカーを介して第２の麻酔薬または活性な剤にコンジュゲート化される。

【0099】

Ｄ．浸透促進賦形剤
ポリエチレンオキシドは、麻酔薬－ポリマーコンジュゲートに対して化学的浸透促進剤（ＣＰＥ）として機能することが立証されている。

【0100】

実施例におけるデータは、麻酔薬－ポリマーコンジュゲートがＰＥＧ２００の溶液中に分散させられたとき、ＰＥＧ２００がＣＰＥとして機能することを実証している。ＰＥＧ中に分散させられた麻酔薬－ポリマーコンジュゲートの溶液は、神経への薬物流入を増大させることができ、これは、ＰＥＧ２００の両親媒性の性質に起因し得る。ＣＰＥは、麻酔薬が神経周膜バリアを通り抜けて神経への薬物流入を増大させることを可能にするかまたはそのように増大させることができるように促進することがあり得る。

【0101】

下記の実施例に記載されるように、０．５ｍＬのＰＥＧ２００中の１～３μｇの用量のコンジュゲート化されていない麻酔薬（例えば、ＴＴＸ）は、試験動物の１００％において完全な神経遮断をもたらし、ブロックの持続時間は、最大５．３±０．３時間であった。これは、臨床において通常使用される麻酔薬である０．５％ブピバカインの効果よりも３倍長い。ＰＥＧ２００は、低毒性であること、および種々の薬学的製剤においてすでに広く使用されていることから、臨床における局所麻酔に適した送達媒体である。

【0102】

ゆえに、いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマーコンジュゲートの製剤は、ＰＥＧを含む賦形剤を含む。好ましい賦形剤は、ＰＥＧ２００である。賦形剤は、麻酔薬－ポリマーコンジュゲートの有効性を高める。

【0103】

ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、混和性が良いことから、ＰＥＧ２００中に容易に分散させられ、シリンジで注射可能な均一なＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤が形成された。調製されたすべてのＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤は、１０Ｐａ・ｓ未満の粘度を有する液体として挙動し、シリンジ注射による患者への投与が可能になった。

【0104】

いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマーコンジュゲートおよびＣＰＥは、１つの系に統合される。例示的な実施形態において、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸの製剤内にＰＥＧ２００を含めることにより、ＰＥＧ２００賦形剤が存在しない等量のＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸよりも広い治療指数がもたらされる。

【0105】

ゆえに、いくつかの実施形態において、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧに共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、注射製剤の有効性を高めるために、ＰＥＧ２００などのＰＥＧ中に分散させられる。

【0106】

好ましい実施形態において、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートは、注射または浸潤を介して、有痛部位にまたは有痛部位の近くに直接投与するための液体として製剤化される。好ましい賦形剤としては、１Ｄａ～１，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ２００が挙げられる。

【0107】

１．シリンジによって注射可能な製剤
ＰＧＳ－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸのシリンジによって注射可能な製剤に対する溶媒の選択は、患者による患部への適切な投与に必要な所望の特定の流動特性を考慮しなければならない（Ｍａｓｔｒｏｐｉｅｔｒｏら、Ｊ Ｄｅｖ Ｄｒｕｇｓ ２，１０８（２０１３））。例えば、ＰＧＳは、熱硬化性ポリマーであり、ＰＧＳの弾性率は、様々なパラメータ（例えば、反応時間、反応温度および硬化時間）を制御することによって容易に調整できる。

【0108】

いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、そのコンジュゲートがリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの水性媒質中に分散させられることを可能にするのに十分量の親水性ポリマーを含む。例えば、骨格に高いパーセンテージのＰＥＧを含むＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸコンジュゲートは、ＰＢＳに均一に懸濁させられ得る。しかしながら、いくつかのＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートは、ＰＢＳに容易に均一に懸濁できない。ゆえに、いくつかの実施形態において、コンジュゲートの親水性を高めるために可溶化剤が加えられ、注射製剤に適用できるようになる。例示的な可溶化剤としては、ＰＥＧが挙げられる。好ましいＰＥＧは、ＰＥＧ２００である。ＰＥＧ２００は、コンジュゲートのための可溶化媒体として機能するだけでなく、麻酔剤用の送達ビヒクルとしてのコンジュゲートの有効性を高める浸透促進剤として機能することも立証されている。

【0109】

ｉ．ＰＥＧ
いくつかの実施形態において、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートは、ＰＥＧへの均一な懸濁によって、シリンジによって注射可能な形態として製剤化される。

【0110】

用語「注入物」とは、注射される材料のことを指す。いくつかの実施形態において、注入物は、流体媒質として、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートの分散を可能にするかまたは増大させる１つまたはそれを超える賦形剤材料を含み、注射または浸潤を介した投与に適用できるようになる。ゆえに、いくつかの実施形態において、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートは、ＰＥＧの水溶液への分散による注射可能な溶液として製剤化される。

【0111】

通常、ＰＥＧは、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートの親水性を高めるために製剤に加えられる。ＰＥＧ濃度が高まると、ＰＢＳに共重合体が溶解する。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートは、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ－モノメチル－エーテル（ｍＰＥＧ）、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ２５０、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００またはＰＥＧ５００に均一に懸濁させられる。

【0112】

好ましい実施形態において、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートは、ＰＥＧ２００への均一な懸濁によって、シリンジによって注射可能な形態として製剤化される。ＰＥＧ２００は、無色透明の粘稠性の液体である。ＰＥＧ２００は、低毒性であることに部分的に起因して、種々の薬学的製剤において広く使用されている。シリンジによって注射可能な高品質の製剤を作製するために、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートは、図４の図に示されるように、溶媒蒸発プロセスを介して製剤化されて、ＰＥＧ２００中になる。

【0113】

合成された製剤の粘弾特性を、レオロジーによって調べた。ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００（５０ｍｇ／ｍｌ）の製剤の場合、損失弾性率（Ｇ”）が、貯蔵弾性率（Ｇ’）よりも高かったことから、その複素弾性率の粘稠成分が材料の挙動を支配することが示唆された（図５Ａ）。さらに、コンジュゲートにおけるＰＥＧ濃度が低下するにつれて粘度は上昇するが、すべてのＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤（５０ｍｇ／ｍｌ）が、試験された角振動数において１０Ｐａ・ｓ未満の粘度を有した（図５Ｂ）。粘稠性の挙動ではあるが低粘度であることから、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤はすべて、シリンジによって注射可能であった。

【0114】

Ｅ．麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートおよび投与単位
親水性ポリマー（例えば、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧ）に共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、（ｉ）神経遮断を提供する有効量の局所麻酔剤；（ｉｉ）親水性ポリマー骨格（好ましくは、ＰＧＳ）；ならびに（ｉｉｉ）必要に応じて、（ａ）製剤の１単位用量あたりにロードされる麻酔薬の総量；および（ｂ）インビボにおけるポリマー骨格からの麻酔薬の放出速度といった所望の機能要素を提供するのに必要な相対比でポリマー骨格に結合した１つまたはそれを超えるＰＥＧを含む。

【0115】

単位時間あたりの麻酔薬の放出速度および用量（すなわち、用量／時、用量／日など）は、投与される総量、ならびに親水性ポリマーの互いの比（例えば、ＰＧＳの量とＰＥＧの量との比）に応じて変更され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリマー－麻酔薬コンジュゲートへのＰＥＧの付加は、コンジュゲートの全親水性を決定する。コンジュゲートの全親水性は、インビボにおけるエステル結合の加水分解速度を決定する。インビボにおけるエステル結合の加水分解速度は、インビボにおける麻酔薬の放出速度を決定する。ゆえに、コンジュゲートの全親水性は、コンジュゲート内のエステル結合の加水分解がインビボにおいて生じる期間を短縮または延長するためにより多いまたはより少ないＰＥＧを付加することによって、調整され得る。

【0116】

いくつかの実施形態において、インビボにおける麻酔薬の放出速度は、活性な剤の放出をインビボにおける生理学的条件への曝露後最大１ヶ月間にわたって提供するようにポリマー－麻酔薬コンジュゲートにおけるＰＥＧセグメントのパーセンテージを調整することによって、調節される。例えば、インビボにおけるＴＴＸの放出速度は、ＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートにおけるＰＥＧセグメントのパーセンテージを調整することによって調節され得る。いくつかの実施形態において、ＴＴＸの放出速度は、ＰＧＳ－ＰＥＧ骨格に組み込まれるＰＥＧの分子量に比例して高まる。ゆえに、ＴＴＸ－ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００は、インビボにおいて、等モル量のＴＴＸ－ＰＧＳ－ＰＥＧ１００よりもかなり速い速度でＴＴＸを放出する。

【0117】

コンジュゲートは、インビボにおける放出速度が、１～３０日間の期間に全麻酔薬のおよそ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超を放出するように、製剤化され得る。ある例示的な実施形態では、２８日後に、ＴＴＸの９９．７％が、ＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸから放出されるのに対し、ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ、ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＴＴＸは、同じ期間で、それぞれ８９．５、６２．５および４３．７％のＴＴＸ放出を示した。ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートの場合、ＴＴＸは、表面侵食機構の下でのＰＧＳ系共重合体の分解に起因する、ゼロ次の放出プロファイルに従って放出される。ＰＥＧ濃度の上昇に伴うＴＴＸ放出の増加は、共重合体骨格の親水性の増大に起因する。そのような親水性の増大は、水の取り込みを増加させ、それにより、エステル結合の加水分解が加速する。実施例に提示される結果から、エステル結合の加水分解に起因して薬物放出が起きることが確かめられた。数週間にわたる目的の化合物の調整可能な徐放は、コンジュゲートが持続時間の長い局所麻酔を提供できるように支援する。

【0118】

ある例示的な実施形態において、ＰＥＧ－ＰＧＳのコンジュゲートは、ＰＥＧに対して過剰なモル比のＰＧＳを含む。例えば、ＰＧＳ－ＰＥＧ共重合体合成のための－ＣＯＯＨ基と－ＯＨとのモル比は、通常、８：７である。残りの－ＣＯＯＨ基は、麻酔薬および必要に応じてさらなる活性な剤にコンジュゲート化される（表１および２を参照のこと）。ＰＧＳ／ポリマー混合物における遊離「－ＣＯＯＨ」基と遊離「－ＯＨ」基との比を用いることにより、ＰＧＳに組み込まれるＰＥＧの総量を計算することができる。通常、コンジュゲートの設計は、少なくとも１つの麻酔薬および必要に応じてさらなる活性な剤の組み込みを可能にする。

【0119】

Ｆ．さらなる剤
麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの製剤は、１つまたはそれを超えるさらなる薬学的に活性な剤を含み得る。活性な剤（例えば、治療薬、予防薬および／または診断薬）は、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートと会合され得る。いくつかの実施形態において、それらの活性な剤は、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートと共有結合的または非共有結合的に会合される。例えば、さらなる活性な剤は、エステル結合を介してポリマー骨格に共有結合され得る。他の実施形態において、さらなる活性な剤は、共有結合性の非エステルリンカーを介して、例えば、１つまたはそれを超えるスペーサーを介して、ポリマー骨格に結合される。活性な剤が、ポリマー骨格と共有結合的に会合されるとき、その作用物質は、インビボにおける共有結合性麻酔薬の放出のタイミングと一致する時点または異なる時点において、インビボにおいて骨格から放出され得る。ゆえに、いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを含む製剤は、麻酔薬と１つまたはそれを超えるさらなる活性な剤の両方を、インビボにおいて同じ時間全体または異なる時間全体にわたって同じ速度または異なる速度で送達する。いくつかの実施形態において、さらなる活性な剤は、麻酔薬－ポリマーコンジュゲートと非共有結合的に会合される。例えば、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの製剤は、混合によって１つまたはそれを超えるさらなる活性な剤を含み得る。例示的なさらなる活性な剤としては、さらなる局所麻酔剤、血管収縮薬、ホルモン、抗炎症薬および抗感染症剤が挙げられる。

【0120】

１．局所麻酔剤
麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの製剤は、１つまたはそれを超えるさらなる局所麻酔剤を含み得る。用語「局所麻酔剤」は、局所的なしびれまたは疼痛緩和を提供する薬物を意味する。利用され得る局所麻酔剤のクラスとしては、アミノアシルアニリド化合物（例えば、リドカイン、プリロカイン、ブピバカイン、メピバカイン、および環系上またはアミン窒素上に様々な置換基を有する関連する局所麻酔化合物）；アミノアルキルベンゾエート化合物（例えば、プロカイン、クロロプロカイン、プロポキシカイン、ヘキシルカイン、テトラカイン、シクロメチカイン、ベノキシネート、ブタカイン、プロパラカインおよび関連する局所麻酔化合物）；コカインおよび関連する局所麻酔化合物；アミノカーボネート化合物（例えば、ジペロドンおよび関連する局所麻酔化合物）；Ｎ－フェニルアミジン化合物（例えば、フェナカインおよび関連する麻酔薬化合物）；Ｎ－アミノアルキルアミド化合物（例えば、ジブカインおよび関連する局所麻酔化合物）；アミノケトン化合物（例えば、ファリカイン（ｆａｌｉｃａｉｎｅ）、ジクロニンおよび関連する局所麻酔化合物）；およびアミノエーテル化合物（例えば、プラモキシン、ジメチソキン（ｄｉｍｅｔｈｉｓｏｑｕｉｅｎ）および関連する局所麻酔化合物）が挙げられる。好ましい局所麻酔剤は、アミノ－アミドおよびアミノエステルであり、最も好ましいのは、ブピバカインであり、局所麻酔剤の血管収縮活性が望ましい場合はブピバカインのレボエナンチオマーが望ましく、わずかにより感覚選択的であるテトラカインおよびロピバカインも好ましい。

【0121】

種々の部位においておよび種々のタイプの手術で投与されたとき、これらの薬物の疼痛緩和は、平均して６～１０時間続く。多くのタイプの手術の場合、疼痛緩和の持続時間が２または３日間続くことが好ましいであろう。ＮｅｏＳＴＸとの併用において使用するための好ましい局所麻酔剤は、ブピバカイン、ロピバカイン、テトラカインおよびレボブピバカインである。ブピバカインは、特に長時間作用型の強力な局所麻酔剤である。ブピバカインの他の利点としては、部分的な運動神経遮断だけでなく十分な感覚麻酔があり、幅広い利用が可能であることが挙げられる。

【0122】

２．血管収縮薬
麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの製剤は、１つまたはそれを超える血管収縮剤を含み得る。有用な血管収縮薬は、血流を制限するように局所的に作用するものであり、それにより、それらが投与された領域に、注射された薬物が保持される。これは、全身毒性を実質的に低下させる効果を有する。

【0123】

好ましい血管収縮薬は、アルファアドレナリンレセプターに対して作用するもの（例えば、エピネフリンおよびフェニルエピネフリン）である。他の薬物および色素（例えば、ブピバカインおよびレボブピバカイン）は、副作用として血管収縮させる。

【0124】

いくつかの実施形態において、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマーコンジュゲートに共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、エピネフリンとともに製剤化される。例えば、エピネフリンは、コンジュゲート内の１つまたはそれを超える麻酔剤から生じる神経遮断を増大させるまたは延長するのに有効な量で含められ得る。

【0125】

３．糖質コルチコイド
麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの製剤は、１つまたはそれを超える糖質コルチコイドを含み得る。例示的な糖質コルチコイドとしては、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルニソリド、メチルプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｍｅ）、アルクロメタゾン、アムシノニド、クロベタゾール、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロソン（ｄｉｆｌｕｒｏｓｏｎｅ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、フルオシノロンアセトニド、フルオロメタロン（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｌｏｎｅ）、フルランドレノリド、ハルシノニド、メドリゾンおよびモメタゾン、ならびにそれらの薬学的に許容され得る塩および混合物 抗炎症剤が挙げられる。

【0126】

いくつかの実施形態において、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマーコンジュゲートに共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、デキサメタゾンとともに製剤化される。デキサメタゾンは、それが、ＴＴＸのコンジュゲート化において用いられるエステル結合と同じエステル結合を介してＰＧＳ－ＰＥＧに共有結合的にコンジュゲート化されることを可能にするヒドロキシル基を有する。実施例に記載されるように、ＴＴＸおよびデキサメタゾンに対する薬物放出プロファイルは、すべてのＰＧＳ－ＰＥＧ－薬物コンジュゲートで一致していた。質量損失は、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートの薬物放出の傾向と同様の傾向に従った（図３Ａ～３Ｄ）。２８日後、ＰＧＳ－ＴＴＸの質量損失は、２７．３％であったのに対し、ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ、ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸの質量損失は、それぞれ３０．４、７０．４および９４．７％であった。

【0127】

４．他の治療薬
いくつかの実施形態において、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマーコンジュゲートに共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、さらなる活性な剤（例えば、抗炎症薬、抗感染症剤、抗増殖剤（ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｏｆｅｒａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）など）とともに製剤化される。例示的な抗炎症薬としては、非ステロイド性薬物（例えば、インドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウムおよびイブプロフェン）；およびステロイド性抗炎症薬（例えば、デキサメタゾン）が挙げられる。

【0128】

Ｇ．他の賦形剤および保存剤
ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧまたは他のポリマーに共有結合された麻酔薬のコンジュゲートは、投与のために１つまたはそれを超える賦形剤または保存剤を含むように製剤化され得る。通常、組成物は、非経口経路を介した投与のための賦形剤を含むように製剤化される。麻酔薬の共有結合性コンジュゲートの例示的な薬学的組成物は、筋肉内、腹腔内、静脈内（ｉｖ）または皮下注射、経皮投与（受動投与、またはイオン導入もしくはエレクトロポレーションを用いた投与）を介した投与のために製剤化される。

【0129】

ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧに共有結合された麻酔薬の製剤は、１つまたはそれを超えるさらなる薬学的に許容され得る賦形剤を含む。例示的なさらなる賦形剤としては、保存剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤および等張剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、麻酔薬の共有結合性コンジュゲートは、例えば非経口経路を介した投与のために、保存剤を必要に応じて含む、食塩水または酸性緩衝液中に製剤化される。麻酔薬の共有結合性コンジュゲートの薬学的組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ｉｖ）または皮下注射）、経皮（受動投与、またはイオン導入もしくはエレクトロポレーションを用いた投与）、経粘膜（経鼻、経膣、直腸または舌下）の投与経路による投与または生体内分解性挿入物を用いた投与のために製剤化され、各投与経路に適切な単位剤形に製剤化され得る。

【0130】

いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、非経口注射による投与のために水溶液中に製剤化される。その製剤は、懸濁液またはエマルジョンの形態であってもよい。一般に、有効量の麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを含む薬学的組成物が提供され、その薬学的組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアを必要に応じて含む。そのような組成物は、希釈剤（例えば、滅菌水、様々な緩衝剤の内容物（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝食塩水）；および必要に応じて、添加物（例えば、界面活性剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）および保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含む。

【0131】

非水溶媒または非水ビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油およびトウモロコシ油）、ゼラチンおよび注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。上記製剤は、凍結乾燥され、使用の直前に再度溶解／再度懸濁させられ得る。上記製剤は、例えば、細菌保持フィルターで濾過すること、滅菌剤を製剤に組み込むこと、製剤に照射すること、または加熱することによって、滅菌され得る。

【0132】

いくつかの実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、１つまたはそれを超えるタンパク質またはポリペプチドを含む溶液中に製剤化される。ある例示的な実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、アルブミンタンパク質を含む溶液中に製剤化される。例えば、水溶液へのコンジュゲートの可溶化または分散を可能にするかまたは増大させるために、ウシアルブミンなどのアルブミンタンパク質が麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの混合物に加えられ得る。

【0133】

Ｈ．剤形
好ましい実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、バイアル内に水溶液として提供される。先に概説されたおよび下記に概説されるように、製剤のタイプに応じて、バイアルのサイズは、１０μｌ～２００ｍｌ、好ましくは、約１００μｌ～約１０ｍｌの範囲であり得、１～５本のバイアルが、種々の状況における１人の患者に対して使用され得る。別の実施形態において、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、１本またはそれを超えるバイアル内に提供され、必要に応じて凍結乾燥され、次いで、使用の前に、再水和され、合わせられる。

【0134】

好ましくは、剤形は、疼痛の低減または予防を必要とする被験体において毒性なしで疼痛を低減させるまたは予防するのに有効な量の麻酔薬を含む。動物試験では、３５０～４００ｇのラットに、およそ８０μｇのコンジュゲート化ＴＴＸを含む麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを、全身毒性なしに投与した。最大１．５ｍｇ（１．５ｍｇを含む）のコンジュゲート化ＴＴＸを有する麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを含む、ヒトへの投与用の剤形が、企図される。

【0135】

ＩＩＩ．使用方法
麻酔剤を送達するために麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを使用する方法が提供される。神経遮断を必要とする被験体に麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを投与することによってその被験体において神経遮断を提供する方法が提供される。

【0136】

上記方法は、１つまたはそれを超える神経の周囲組織を有効量の麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートと接触させて、コントロールと比べてその神経における感覚活動を低減させるまたは阻害する工程を含み得る。上記方法は、毒性を最小限に抑えるかまたは低下させつつ、サイト１ナトリウムチャネル（Ｓ１ＳＣ）の遮断を延長し得る。

【0137】

いくつかの実施形態において、活性な剤は、感覚神経活動の生理学的プロセスに関連する細胞表面レセプターに結合するかまたは他の方法でその活性を阻害する。例えば、麻酔剤は、イオンチャネル（例えば、サイト１ナトリウムチャネル（Ｓ１ＳＣ）またはＴＲＰＶ１レセプター）を遮断するために有効であり得る。好ましい実施形態において、１つまたはそれを超えるポリマーに共有結合的にカップリングされた麻酔剤は、Ｓ１ＳＣＢテトロドトキシン（ＴＴＸ）である。１つまたはそれを超える神経を有効量のＴＴＸと接触させて、コントロールと比べてその神経における感覚活動を低減させるまたは阻害する工程を含む方法が提供される。麻酔剤は、共有結合したポリマーコンジュゲートとして投与され、その後、ポリマー骨格に対する共有結合の分解によって、投与部位または投与部位付近においてインビボで放出される。

【0138】

上記方法は、ある量の麻酔剤を生理的に活性な状態で一貫して放出して、長期間にわたって投与部位において有効な神経遮断を達成し得る。麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを投与する方法は、ポリマーコンジュゲートの非存在下において当量の麻酔薬を同じ部位に投与することによって達成される場合と比べて有意に長い時間にわたって、有効な神経遮断を提供し得る。ゆえに、サイト１ナトリウムチャネル遮断薬を共有結合性ポリマーコンジュゲートとしてインビボで投与する方法は、同じ部位に単独で投与される当量のサイト１ナトリウムチャネル遮断薬と比べて長時間にわたってサイト１ナトリウムチャネルを効果的に遮断できる。通常、それらの方法は、血管収縮を起こさない。

【0139】

上記方法において使用するための麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、その麻酔薬が、数分から数時間、数日間、数週間または数ヶ月間のある期間にわたって放出されるように、製剤化され得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、共有結合性ポリマーコンジュゲートの非存在下において投与される場合にレシピエントにとって有毒であり得る量の麻酔剤の安全な投与を可能にする。例えば、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートが、長時間にわたって投与部位に麻酔薬を送達するように製剤化されるとき、任意の所与の時点における遊離麻酔薬の血清濃度は、麻酔薬がボーラスとして単独で投与されたときの血清濃度未満であり得る。

【0140】

ゆえに、いくつかの実施形態において、上記方法は、低毒性でのＴＴＸによる長時間の神経遮断を提供する。通常、麻酔剤は、インビボにおいて、天然の形態で（すなわち、生理的に活性な状態で）ポリマー骨格から放出される。いくつかの実施形態において、麻酔剤は、ポリマー骨格に共有結合的にコンジュゲート化されているとき、生理的に不活性である。

【0141】

Ａ．疼痛を処置または予防するための方法
被験体において感覚神経および／または運動神経の遮断を提供する方法であって、ポリマー骨格に共有結合的にコンジュゲート化された有効量の１つまたはそれを超える麻酔剤を被験体の神経または神経付近に投与して、その神経における感覚機能および／または運動機能を低下させるまたは阻害する工程を含む方法が、提供される。好ましい実施形態において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、上記方法は、被験体における侵害受容性疼痛および／または神経因性疼痛などの疼痛の発生を遅延させるのに有効である。いくつかの実施形態において、被験体は、成人である。他の実施形態において、被験体は、小児である。記載される方法のすべてが、疼痛緩和を必要とする被験体を特定する工程を含み得る。

【0142】

いくつかの実施形態において、上記方法は、麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを、１つまたはそれを超えるさらなる活性な剤（例えば、局所麻酔剤）と併用して投与する工程を含む。用語「併用」または「併用される」は、２つまたはそれを超える異なる作用物質の併投与、同時投与または連続投与のことを指すために使用される。ゆえに、併用は、同時に（例えば、混合物として）、別々であるが同時に（例えば、同じ被験体に別個の適用によって）または連続的に（例えば、当該化合物または作用物質のうちの１つを最初に投与した後、第２のものを投与する）投与され得る。例えば、併用療法は、ＴＴＸ－ＰＧＳ－ＰＥＧおよび／またはＴＴＸ－ＰＧＳと、１つまたはそれを超えるさらなる麻酔薬または他の活性な剤とを、２つの異なる製剤として別々に、または同じ製剤（すなわち、両方の活性な剤を含む単一の薬学的組成物）として一緒に、共投与することを含み得る。２つの作用物質が、別個の製剤として投与される場合、共投与は、それらの２つの作用物質の同時投与および／または連続投与を含み得る。連続投与に適切な時間経過は、患者の疾病の性質および患者の症状などの因子に従って、医師が選択できる。ある特定の実施形態において、連続投与には、２つの作用物質が互いに数時間、数日間または数週間という期間内で共投与されることが含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、ＴＴＸ－ＰＧＳ－ＰＥＧおよび／またはＴＴＸ－ＰＧＳが最初に投与された後、アルファ－２－アドレナリンアゴニストが併用される。他の実施形態において、ＴＴＸ－ＰＧＳ－ＰＥＧおよび／またはＴＴＸ－ＰＧＳが最初に投与された後、さらなる活性な剤が続く。

【0143】

１．投与量
１つまたはそれを超える麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、別々の位置から生じる疼痛を低減させるまたは排除する目的で疼痛の惹起に関与する別々の限局部分において高度に局部的な選択的神経遮断をもたらすのに有効な量で別々の有痛部位に投与され得る。

【0144】

いくつかの実施形態において、投与量は、１つまたはそれを超える組織の浸潤麻酔のために投与されるとき、疼痛を処置または予防するのに有効な量である。いくつかの実施形態において、投与量は、伝導麻酔または神経ブロック麻酔のために投与されるとき、疼痛を処置または予防するのに有効な量である。

【0145】

上記方法は、疼痛の位置の外側における麻酔剤の潜在的な有害事象を最小限に抑える。例えば、ＰＧＳ－ＰＥＧおよび／またはＴＴＸ－ＰＧＳは、被験体のニーズに応じて、約１時間～約７２時間にわたって被験体における別々の位置から生じる疼痛を低減させるまたは排除する目的で疼痛の惹起に関与する別々の限局部分において高度に局部的な選択的神経遮断をもたらすのに有効な量で別々の有痛部位に投与され得る。

【0146】

疼痛の減弱を必要とするヒトまたは動物のある部位における疼痛を減弱するための麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの薬学的組成物は、ポリマー骨格にコンジュゲート化された１μｇ～１．５ｍｇの麻酔剤を含み得る。例えば、疼痛の減弱を必要とするヒトまたは動物のある部位における疼痛を減弱するための麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートの薬学的組成物は、１μｇ～５，０００ｍｇのコンジュゲートを含み得る。投与されるコンジュゲートの量は、ポリマー骨格のサイズおよびタイプ、ならびにコンジュゲート内の麻酔剤に依存する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート内の麻酔剤の用量は、約１μｇ～約２０００μｇ、約１０μｇ～約２００μｇまたは約２０μｇ～約５０μｇの範囲である。通常、麻酔剤の総量の少なくとも７５％、少なくとも８０％または９０％、最大１００％（１００％を含む）が、投与後の所望の時間にわたって、インビボにおいてポリマー骨格コンジュゲートから放出される。

【0147】

長時間の局所麻酔のための本開示の製剤は、当該分野で公知の任意の手段（ヒトまたは動物の皮膚を通じた別々の部位への注射を介したもの；ヒトまたは動物の皮膚、組織、筋肉、腱、関節または他の身体部分にその用量を埋め込むことによる別々の部位への植え込みを介したもの；別々の創傷、組織表面、または手術創が開いている外科的部位への浸潤によるものを含む）によって投与され得る。

【0148】

動物およびヒトにおける長時間の麻酔の場合、被験体の体重が、適切な投与量を決定するための指針として使用できる（下記の表８を参照のこと）。種々の臨床的状況が、局所麻酔剤の安全性および有効性に対する種々の要求を突きつける。全身安全性が、ＴＴＸまたは開示される他の活性な剤の総用量（ｍｇまたはｍｇ／ｋｇ）の上限を決定する。取り込みの時間経過、血管分布などに基づいた許容できる総用量の差は小さいが、全部の局所麻酔剤はそれぞれ、許容できる総用量の最大値を有する。

【0149】

身体の任意の局部領域において、求心性伝達を遮断するためには、局所麻酔剤の十分な局所組織濃度が必要である。疼痛緩和を提供するのに十分な、所与の位置における１つまたはそれを超える薬物の最低局所濃度は、「最小有効濃度」（ＭＥＣ）と呼ばれる。

【0150】

したがって、容積が大きい組織への浸潤を必要とする臨床的状況では、容積がより小さい組織が関わる臨床的状況よりも大きな総体積の局所麻酔剤が、ＭＥＣにおいてまたはＭＥＣを超えて必要である。異なる位置におけるＭＥＣが似ている場合、より容積が大きい組織は、容積が小さい組織よりも大きな総用量を必要とする。

【0151】

麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲート内の麻酔薬の用量は、投与される麻酔薬、ならびに局所麻酔剤が投与される部位に依存する。通常、投与単位は、約０．１ｍｌ～約１２０ｍｌの範囲の体積で使用するように調製される。ある特定の実施形態において、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧコンジュゲート内の麻酔剤は、０．０１％（重量／体積）～５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で存在し、１つまたはそれを超えるアルファ－２－アドレナリンアゴニストは、０．０１％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で存在する。通常、総全身用量は、成体においてわずかおよそ１ｍｇ／ｋｇ体重～およそ２００ｍｇ／ｋｇ体重である。例えば、局所麻酔剤が局部ブロック（例えば、くるぶしブロック）を介して投与される実施形態では、麻酔薬の用量は、０．５％（ｗ／ｖ）溶液の約１ｍｌから約３０ｍｌまでの範囲である。他の実施形態では、３ｍｇ／ｋｇ用量（最大値２００ｍｇ）の２％（ｗ／ｖ）溶液が、関節内浸潤によって投与され得る。他の実施形態において、局所麻酔剤の用量は、０．５ｍｌ～約６０ｍｌの０．２５％～５％（ｗ／ｖ）溶液の範囲であり得る。

【0152】

好ましい実施形態において、麻酔剤は、ＴＴＸである。コンジュゲート内のＴＴＸは、０．０１ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは、０．１ｍＭ～０．３ｍＭの範囲、最も好ましくは、０．２１ｍＭの濃度で存在し得る。いくつかの実施形態において、単回適用で投与されるコンジュゲートの投与量は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１０時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月または６ヶ月超のある期間にわたって感覚機能および／または運動機能を低下させるまたは阻害するのに十分な量である。特定の実施形態において、ＴＴＸ－ＰＧＳ－ＰＥＧは、最大７２時間にわたって被験体の投与部位または投与部位周辺における疼痛を低減するのに十分な量で、注射製剤として投与される。例示的な方法では、被験体への、１．０μｇのＴＴＸを含むＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸおよび／またはＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸを含む製剤の注射が、その被験体において１時間～６時間のある期間にわたって神経遮断をもたらすのに有効である。動物データに基づいて実験によって決定された量を下記の表１．２に示す。

【表1-2】

^ａ実験に使用されたラットの質量＝０．３５ｋｇ
^ｂＰＧＭ＝ポリ（グリセロールマロン酸）

【0153】

２．処置される疼痛
サイト１ナトリウムチャネル遮断薬および／または他の麻酔薬を含む麻酔剤のコンジュゲートは、多くの症状を処置するために使用され得、ここで、その麻酔製剤は、有痛性の領域にまたは有痛性の領域の近くに投与され得、その処置としては、急性疼痛または慢性疼痛、侵害受容性疼痛および神経因性疼痛、術前痛および術後痛、癌疼痛、神経伝達物質調節不全症候群および整形外科的障害に関連する疼痛、スポーツ関連傷害、急性外傷痛、侵害受容性疼痛、ならびに神経伝達物質調節不全症候群の処置が挙げられるが、これらに限定されない。

【0154】

ｉ．手術
本開示の製剤は、外科手技に関連する疼痛を予防するためまたは低減させるために使用され得る。いくつかの実施形態において、投与単位は、全長開放開腹術（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｏｐｅｎ ｌａｐａｒｏｔｏｍｙ）、胸腹部切開または側腹切開のための複数層の大きな手術創に関連する疼痛の処置または予防；帝王切開術、開放子宮摘出術、食道胃切除術、腎摘出術または大きな腹部癌の手術（例えば、結腸切除術）；人工股関節全置換術（股関節形成術）または人工膝関節全置換術（膝関節形成術）のための創傷浸潤；末梢神経ブロックまたは神経叢ブロック（神経周囲注射）；浸潤（創傷の層に沿った注射）；肩、手もしくは腕の手術、鼡径ヘルニア修復術のための浸潤または腸骨鼡径／腸骨下腹ブロック、尿道下裂修復のための陰茎ブロック、人工膝関節全置換術または前十字靱帯修復のための大腿ブロック、開胸術のための肋間神経ブロック、または脚切断または足および足首の手術のための大腿および坐骨神経ブロック；脚の複合性局所性疼痛症候群／反射性交感神経性ジストロフィもしくは血行不全に対する腰部交感神経遮断、または膵炎もしくは膵臓癌に対する腹腔神経叢ブロックの提供；人工関節置換術のために股関節または膝関節に対する神経ブロック（大腿および坐骨、腰部神経叢および坐骨神経ブロック）；または下肢切断のように迅速な運動回復が必要ない場合に長い持続時間の坐骨神経遮断の提供に有効な量の、ＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧにコンジュゲート化された１つまたはそれを超えるサイト１ナトリウムチャネル遮断薬を含む。

【0155】

眼または眼窩に長い持続時間の麻酔を提供するための、ＰＧＳおよび／またはＰＧＳ－ＰＥＧにコンジュゲート化されたある量の１つまたはそれを超えるサイト１ナトリウムチャネル遮断薬を含む投与単位も提供される。他の実施形態において、眼の角膜における感覚機能および／または運動機能を妨げる、低下させるまたは阻害するのに有効な量で投与単位が調製され得る。

【0156】

いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える末梢神経における感覚機能および／または運動機能を妨げる、低下させるまたは阻害するのに有効な量で投与単位が調製され得る。

【0157】

他の実施形態において、投与単位は、坐骨神経または坐骨神経付近における麻酔剤の送達または放出を延長するために、１つまたはそれを超えるポリマーに共有結合的にコンジュゲート化されたある量の１つまたはそれを超える麻酔剤を含む。

【0158】

ｉｉ．慢性疼痛
いくつかの実施形態において、本開示の製剤は、長期間にわたる疼痛の処置または予防において使用され得る。上記方法は、長時間にわたる投与部位における麻酔剤の制御放出または遅延放出のために、１つまたはそれを超えるポリマーに共有結合的にコンジュゲート化された１つまたはそれを超える麻酔剤を含む製剤を被験体に投与する工程を含み得る。例えば、長時間にわたる投与部位または投与部位付近におけるＴＴＸの制御放出または遅延放出のために、ＴＴＸ－ＰＥＧ－ＰＧＳを含む製剤を被験体に投与する工程を含む方法が、提供される。１つまたはそれを超えるサイト１ナトリウムチャネル遮断薬および１つまたはそれを超える他の麻酔薬または他の作用物質を含む麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートを、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１０時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月または６ヶ月超のある期間にわたって、感覚機能および／または運動機能を低下させるまたは阻害するのに有効な量で、被験体の有痛性の構造または有痛性の構造付近に投与する工程を含む方法が、提供される。

【0159】

ある特定の実施形態において、上記方法は、慢性疼痛、例えば、疾患または障害に伴う慢性疼痛の処置または減弱のために使用され得る。例えば、慢性疼痛に苦しんでいる患者において、ＴＴＸ－ＰＧＳおよび／またはＴＴＸ－ＰＧＳ－ＰＥＧから放出されるＴＴＸの用量は、最大１００μｇ／時、最大１０μｇ／時、最大１μｇ／時、最大μｇ／日または最大１μｇ／週などである。最初の投与において被験体に投与される麻酔薬の量は、所望の１時間量または１日量を考慮して計算され得る。総投与量および放出速度は、血清濃度が、毒性および／または副作用が生じる血清濃度を超えないように、麻酔薬の血清半減期を考慮して計算され得る。通常、総投与量は、当該疾患もしくは障害のすぐ近くの部位もしくはすぐ近くの部位付近に、または有痛性の構造の周囲の領域に、一度に投与される。

【0160】

ＩＶ．製剤および作製方法
ヒトの処置に有効な投与量および体積を決定するために、動物およびヒトでの研究が必要である。例えば、インビトロでの生理学実験から得られたサイト１ナトリウムチャネル遮断薬の効力の順位は、インビボにおけるそれらの化合物の効力の順位を予測しなかった（Ｋｏｈａｎｅら、Ｒｅｇ．Ａｎｅｓｔｈ．Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．，２５：５２－９（２０００））。

【0161】

種々の臨床的状況が、局所麻酔剤の安全性および有効性に種々の要求を突きつける。全身安全性が、ＴＴＸまたは他の局所麻酔剤の総用量（ｍｇまたはｍｇ／ｋｇ）の上限を決定する。取り込みの時間経過、血管分布などに基づいた許容できる総用量の差は小さいが、全部の局所麻酔剤がそれぞれ、許容できる総用量の最大値を有する。本明細書中に記載されるように、ＴＴＸを共有結合性のコンジュゲートとしてＰＧＳまたはＰＧＳ－ＰＥＧポリマー骨格に含めることにより、インビボにおけるエステル結合の加水分解を介してＴＴＸの遅延放出が可能になる。遅延放出は、長時間の神経遮断、高い有効性および全身安全性を可能にし、より多くの用量またはより多くを可能にする。

【0162】

いくつかの臨床的状況において、局所麻酔剤の効果が望ましくないまたは危険でさえある他の身体箇所にしびれまたは脱力が広がるのを防ぐために、大きな体積の（すなわち、２０ｍｌを超える）局所麻酔剤を投与しないことが重要である。記載される麻酔薬－ポリマー共有結合性コンジュゲートは、用量、放出速度およびレシピエントが所望する他のパラメータに従って、所望の体積で、例えば、１ｍｌ～５００ｍｌで投与され得る。

【0163】

実施例（下記）に記載されるように、Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応を介して、ジカルボン酸（ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｄ ａｃｉｄ）のカルボキシル基とトリオールおよびＰＥＧのヒドロキシル基との間にエステル結合を形成することによって、ポリ（トリオールジカルボン酸）－ｃｏ－ポリ（エチレングリコール）（ＴＤＰ）ポリマーを合成した。ＴＤＰポリマーは、エステル結合の加水分解によって分解可能であり、細胞傷害性を最小限に抑えつつ、良好な生体適合性を示した。様々なｆ_ｐｈｉｌを有するＴＤＰポリマーのファミリーを合成した。表面と容積の両方の特徴付けから、それらのポリマーのｆ_ｐｈｉｌが、ポリマーネットワークのエステル結合の加水分解速度を決定したことが示唆される。ＴＤＰポリマーは、薬物が共有結合的にコンジュゲート化できる複数の活性な末端基（ヒドロキシル基およびカルボキシル基）を有する。これらの特徴は、ＴＤＰポリマーが、広範囲の治療的薬物の制御放出のためのユニバーサルプラットフォームとして働く潜在能力を有することを示唆している。

【0164】

Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応を介して、ＴＤＰポリマーのカルボキシル基とＴＴＸのヒドロキシル基との間にエステル結合を形成することによって、ＴＴＸとＴＤＰポリマーとの共有結合性のコンジュゲート化が達成された。Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化合成は、薬物の分解を回避するために室温において行われた。合成されたＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、徐々に分解して、より小さいポリマー－ＴＴＸフラグメントになり、最終的には、エステル結合の加水分解によって天然の形態のＴＴＸに分解して、ＴＴＸの制御放出が達成された。ＴＴＸの放出速度は、ＴＤＰポリマーのｆ_ｐｈｉｌに反比例した。３７．８％未満のｆ_ｐｈｉｌでは、ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、インビトロにおいて１ヶ月を超える長期間のＴＴＸ放出が達成された。

【0165】

Ａ．ポリマー－麻酔薬共有結合性コンジュゲートを作製する方法
通常、ポリ（トリオールジカルボン酸）－ｃｏ－ポリ（エチレングリコール）（ＴＤＰ）ポリマーの合成は、３段階の反応で行われる。その反応は、通常、麻酔薬の破壊または変性を最小限に抑える条件下で行われる。

【0166】

例示的な方法において、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸの合成は、薬物の変性を回避するために室温において３段階の反応で行われる。第１の工程は、ＰＥＧおよびセバシン酸のＳｔｅｇｌｉｃｈエステル化であり、これにより、いかなる架橋も有しない直鎖状のプレ－ポリマー鎖が形成される。この反応の模式図を図１Ａ～１Ｂに示す。最終的な共重合体の親水性は、ＰＥＧの付加によって調整される。例示的な方法は、種々の分子量のＰＥＧ（例えば、２００Ｄａ、１，０００Ｄａおよび２，０００Ｄａ）を使用する。

【0167】

第２の工程は、グリセロールの付加であり、これにより、ＰＧＳ－ＰＥＧのブロック共重合体が得られる。実施例に示されるように、ＰＧＳ－ＰＥＧ共重合体合成の場合、－ＣＯＯＨ基と－ＯＨ基とのモル比は、８：７であり、余分な－ＣＯＯＨ基が、薬物のコンジュゲート化に使用された（表１および２）。

【0168】

第３の工程では、ＰＧＳ－ＰＥＧ共重合体の残りの－ＣＯＯＨ基とＴＴＸの－ＯＨ基との間のＳｔｅｇｌｉｃｈエステル化を介して、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートが得られる（図１Ａ、１Ｂ）。

【0169】

Ｂ．シリンジによって注射可能な製剤を作製する方法
いくつかの実施形態において、上記方法は、シリンジによって注射可能な製剤を作製する工程を含む。ある例示的な実施形態では、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸおよび／またはＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートをＤＣＭに十分溶解させた後、ＰＥＧ２００を加える。ＰＥＧ２００は、ＤＣＭと十分に混和性であるので、混合物をボルテックスした後、均一な溶液が得られる。回転蒸発および凍結乾燥によってＤＣＭを徐々に除去する。好ましくは、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸおよび／またはＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートならびにＰＥＧ２００を含む均一な溶液が形成される。

【0170】

以下の非限定的な例を参照することにより、本発明がさらに理解される。

【実施例0171】

実施例１：麻酔薬と両親媒性ポリマーおよびＰＥＧとのコンジュゲート
ポリ（セバシン酸グリセロール）（ＰＧＳ）、ＰＥＧおよびＴＴＸの両親媒性で生分解性のコンジュゲートを、以下の方法に従って設計し、生成し、アッセイした。

【0172】

方法
材料
セバシン酸（９９％）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、２００、１０００、２０００ｋＤａ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、９９％）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、９９％）、無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、９９．８％）、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９９．９％）、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ、９９．８％）、グリセロール（９９％）、デキサメタゾン（９８％）、フルオレセインイソチオシアネート異性体Ｉ（ＦＩＴＣ、９０％）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）、クロロホルム－ｄ（１００％、９９．９６原子％Ｄ）、ヘキサメチレンジイソシアナート（９９．０％）およびジブチルスズジラウレート（９５．０％）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。シアニン５．５カルボン酸（Ｃｙ５．５，９５％）をＬｕｍｉｐｒｏｂｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈａｌｌａｎｄａｌｅ Ｂｅａｃｈ，ＦＬ）から購入した。テトロドトキシン（ＴＴＸ）をＡｂｃａｍ ｐｌｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手し；テトロドトキシンＥＬＩＳＡキットをＲｅａｇｅｎ ＬＬＣ（Ｍｏｏｒｅｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。

【0173】

ＴＤＰポリマーの合成
ポリ（トリオールジカルボン酸）－ｃｏ－ポリ（エチレングリコール）（ＴＤＰ）ポリマーを、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）をカップリング試薬としておよび４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として使用するＳｔｅｇｌｉｃｈエステル化を介して合成した。簡潔には、乾燥ＰＥＧ（０．００５ｍｏｌ）およびセバシン酸（２．０２ｇ，０．０１ｍｏｌ）を丸底フラスコに加え、残っている水を蒸発させた後、そのフラスコを窒素下に置いた。無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、８ｍＬ）および無水ジクロロメタン（ＤＣＭ、４ｍＬ）を加えた後、その混合物を数分間、超音波処理し、ＤＩＣ（４．３３６ｍＬ，０．０２８ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．４８９ｇ，０．００４ｍｏｌ）を加えた。その混合物を室温で２４時間放置した。グリセロール（１８４μｌ，０．００２５ｍｏｌ）を加え、その混合物を室温で２４時間放置した。反応後、その反応混合物中のＤＣＭを回転蒸発によって除去し、次いで、残渣を３０ｍＬのＤＩ水で２回洗浄し、３０ｍＬの１０％エタノールで２回洗浄した。ポリマーが水から沈殿し、２００００ｒｐｍで５分間遠心した。乾燥させると、ＴＤＰポリマーが８８～９６％収率で得られた。その乾燥したＴＤＰポリマーを、さらに使用するまでデシケーター内に保存した。

【0174】

ＴＤＰ－薬物コンジュゲートの合成
同様のＳｔｅｇｌｉｃｈエステル化を介して、ＴＤＰ－薬物コンジュゲートを合成した。簡潔には、乾燥ＰＥＧ（０．００５ｍｏｌ）およびセバシン酸（２．０２ｇ，０．０１ｍｏｌ）を丸底フラスコに加え、残っている水を蒸発させた後、そのフラスコを窒素下に置いた。無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、８ｍＬ）および無水ジクロロメタン（ＤＣＭ、４ｍＬ）を加えた後、その混合物を数分間、超音波処理し、ＤＩＣ（４．３３６ｍＬ，０．０２８ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．４８９ｇ，０．００４ｍｏｌ）を加えた。その混合物を室温で２４時間放置した。グリセロール（１８４μｌ，０．００２５ｍｏｌ）を加え、その混合物を室温で２４時間放置した。ＴＴＸ（１ｍｇ，０．００３ｍｍｏｌ）および／またはデキサメタゾン（１０ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ）および／またはＦＩＴＣ（１ｍｇ，０．００３ｍｍｏｌ）および／またはＣｙ５．５（１．６ｍｇ，０．００３ｍｍｏｌ）を含む無水ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）溶液を加え、その混合物を室温において７日間放置した。反応後、その反応混合物中のＤＣＭを回転蒸発によって除去した。未結合の薬物を排除するためおよび純粋なポリマーコンジュゲートを単離するために、残渣を３０ｍＬのＤＩ水で２回洗浄し、３０ｍＬの１０％エタノールで２回洗浄した。ＴＤＰ－薬物コンジュゲートが水から沈殿し、２００００ｒｐｍで５分間遠心した。乾燥させると、ＴＤＰ薬物コンジュゲートが８８～９６％収率で得られた。その乾燥したＴＤＰ－薬物コンジュゲートを、さらに使用するまでデシケーター内に保存した。

【0175】

Ｔ_ｇＤ_８－イソシアネートの合成
代表的には、０．２４０ｇのＴ_ｇＤ_８（Ｍｎ＝６０１１、０．４×１０^－３ｍｏｌ）を、高真空下の１００ｍＬフラスコ内で一晩乾燥させた。次いで、そのフラスコに５ｍＬの無水ＤＭＳＯを加え、１．１３ｇのＨＭＤＩ（２４０μｌ，１．５×１０^－３ｍｏｌ）および２滴のジブチルスズジラウレート（８×１０^－３ｇ）を連続的に加えた。その反応混合物を６０℃の窒素雰囲気下において一晩撹拌した。反応の終わりに、生じたポリマーをジエチルエーテルから沈殿させ、１，２－ジクロロエタンに再度溶解させることによってさらに精製した後、メタノールとジエチルエーテルとの混合物（５／９５、ｖ／ｖ）中で沈殿させることにより、残りのジブチルスズジラウレートを除去した。乾燥させると、Ｔ_ｇＤ_８－イソシアネートが８０～９５％収率で得られた。

【0176】

Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸウレタンの合成
代表的には、０．３２５ｇのＴ_ｇＤ_８－イソシアネートを、高真空下の１００ｍＬフラスコ内で一晩乾燥させた。次いで、そのフラスコに５ｍＬの無水ＤＭＳＯを加え、１滴のジブチルスズジラウレート（４×１０^－３ｇ）および０．１ｍｇのＴＴＸを連続的に加えた。その反応混合物を６０℃の窒素雰囲気下において一晩撹拌した。反応の終わりに、生じたポリマーをジエチルエーテルから沈殿させ、１，２－ジクロロエタンに再度溶解させることによってさらに精製した後、メタノールとジエチルエーテルとの混合物（５／９５、ｖ／ｖ）中で沈殿させることにより、残りのジブチルスズジラウレートを除去した。乾燥させると、Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸウレタンが９０～９５％収率で得られた。

【0177】

接触角の手順
シリコンウエハ基材上にスピンコートされたポリマーフィルムに対する水接触角の計測を、自動ディスペンサーが備え付けられたゴニオメーター（Ｒａｍｅ－Ｈａｒｔ，モデル５００）を用いて行った。静滴法を適用した。１μＬの体積の水を、サンプル表面に垂らし、高解像度画像に基づいて接触角を決定した。

【0178】

^１Ｈ ＮＭＲの計測
ポリマーおよびポリマー－薬物コンジュゲートを、核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）分光法（５ｍｍ ＡｕｔｏＸ ＯｎｅＰｒｏｂｅおよびＶａｒｉａｎ ７６００オートサンプラーが備え付けられたＶａｒｉａｎ ４００ＭＨｚ）を用いて解析した。ポリマーをＣＤＣｌ_３に溶解させ、４００ＭＨｚにおいてスペクトルを記録した。以下のポリマーのリストにおける斜体で表記された水素に対応するピークの化学シフト（δ，単位はｐｐｍ）を提供する。ｓ／ｄ／ｍは、ピークの形状を示す（すなわち、シングレット、ダブレット、トリプレット）。^１Ｈ ＮＭＲ（Ｔ_ｇＤ_８）（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ：１．３０（２Ｈ，ｍ，－ＣＨ_２－），１．６２（２Ｈ，ｄ，－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（ＣＯ）－），２．３５（２Ｈ，ｍ，－ＣＨ_２Ｏ（ＣＯ）－），３．５０－３．８５（２Ｈ，ｍ，ＯＨＣＨ_２ＣＨＯ－），３．９４（１Ｈ，ｍ，－ＯＣＨ_２ＣＨＯＨ），４．０５－４．３５（２Ｈ，ｍ，－ＯＣＨ_２ＣＨＯ－），５．０９（１Ｈ，ｓ，ＯＨＣＨ２ＣＨＯ－），５．２６（１Ｈ，ｓ，－ＯＣＨ_２ＣＨＯ－）．^１Ｈ ＮＭＲ（Ｔ_ｇＤ_８Ｐ_１ｋ）（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ：１．３０（２Ｈ，ｍ，－ＣＨ_２－），１．６２（２Ｈ，ｄ，－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（ＣＯ）－），２．３５（２Ｈ，ｍ，－ＣＨ_２Ｏ（ＣＯ）－），３．６４（２Ｈ，ｍ，－ＯＣＨ_２－），３．９４（１Ｈ，ｍ，－ＯＣＨ_２ＣＨＯＨ），４．０５－４．３５（２Ｈ，ｍ，－ＯＣＨ_２ＣＨＯ－），５．０９（１Ｈ，ｓ，ＯＨＣＨ２ＣＨＯ－），５．２６（１Ｈ，ｓ，－ＯＣＨ_２ＣＨＯ－）。すべてのＴＤＰポリマーの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、重要な構造要素を割り当てて図１ａに示す。いくつかのピークは、シグナルが重なっているために割り当てることができなかった。

【0179】

ＦＴＩＲの計測
サンプルのフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）スペクトルを、Ａｌｐｈａ Ｂｒｕｋｅｒ分光計を用いて記録した。４ｃｍ^－１の分解能での４８回のスキャンの平均値を各サンプルに対して収集した。

【0180】

分子量の計測
Ｗａｔｅｒｓゲル浸透クロマトグラフ（ＧＰＣ）モデル４４０を用いて、分子量を計測した。ＴＨＦを、１．０ｍＬ／分という流速の移動相として使用した。マクロモノマーおよび共重合体の分子量および多分散性を、ポリスチレン標準で較正した。

【0181】

ポリマーのインビトロ分解
ポリマーを、１０，０００ＭＷカットオフを有するＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）にかけ、１４ｍＬのＰＢＳでさらに透析し、プラットフォーム振盪機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａ ４０、６０ｒｐｍ）上において３７℃でインキュベートすることによって、質量損失研究を行った。各時点において、透析溶液を、予め加温しておいた新しいＰＢＳと交換した。１４ｍＬの透析溶液を凍結し、凍結乾燥し、質量損失解析のために、残留分の質量を計量した。すべての実験を３つ組で行った。

【0182】

細胞培養
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ－１７７２）およびＰＣ１２ラット副腎褐色細胞腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１７７２）の細胞培養を、報告されているとおりに^２行った。手短に言えば、Ｃ２Ｃ１２細胞を、２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を２４ウェルプレートに５０，０００細胞／ｍＬで播種し、２％ウマ血清および１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で１０～１４日間インキュベートして、筋小管に分化させた。ＰＣ１２細胞は、１２．５％ウマ血清、２．５％ＦＢＳおよび１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で生育した。細胞を２４ウェルプレートに播種し、播種の２４時間後に５０ｎｇ／ｍＬの神経成長因子を加えた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

【0183】

細胞生存度
細胞（１×１０^４／ウェル）を、様々な濃度のポリマー－ＴＴＸコンジュゲートとともに２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで最大５回洗浄して、ポリマーを除去し、ＭＴＴによって細胞生存度を決定した。簡潔には、コントロールウェルおよびポリマー含有ウェルからの培養上清を回収し、細胞をＭＴＴとともにインキュベートした（０．５ｍｇ／ｍＬ；３時間）。ホルマザン（ｆｏｒｍａｚｏｎ）を２００μｌのＤＭＳＯに溶解させ、５５０ｎｍにおいて光学濃度を計測した。コントロールウェルの吸光度を１００％と仮定し、処置ウェルの細胞生存度を、コントロールウェルを基準にして測定した。

【0184】

平衡溶解度法^１
ＴＴＸの溶解度研究を、過剰量のＴＴＸを有機溶媒中で平衡させることによって行った。２ｍＬの容量のプラスチックフラスコにおいてアッセイを行った。各フラスコに、１ｍＬの有機溶媒および１ｍｇのＴＴＸを加えた。このＴＴＸの量は、各溶媒を飽和させるのに十分な量であり、このことは、未溶解のＴＴＸの析出によって特徴付けられた。恒温器振盪機を用いて、試験中、７２時間にわたって（サンプルが平衡条件に達するまで）１５０ｒｐｍで振盪しながらサンプルを２５℃で維持した。この期間の後、直ちにサンプルを０．４５μｍポアサイズの使い捨てカプセルフィルターで濾過した（Ｄｅｚａｎｉら、Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４９，８５３－８６３（２０１３））。

【0185】

ＤＭＳＯおよびＤＭＦにおけるＴＴＸの溶解度
５０μｌの濾液を４５０μｌのＰＢＳで希釈した。その混合物中のＴＴＸの濃度を、ＴＴＸ Ｅｌｉｓａキットを用いて計測した。ＴＴＸの定量プロセスのために、ＴＴＸ ＥＬＩＳＡキットを、各溶媒の最大吸光度波長で使用し、各物質に対して求めた検量線を用いて、溶解度値を計算した。同一の比のＤＭＳＯまたはＤＭＦを、ＴＴＸ Ｅｌｉｓａキット内の標準液に加え、検量線を作成した。その濃度は、ＴＴＸの飽和溶解度または平衡溶解度と見なされる。

【0186】

ＤＣＭにおけるＴＴＸの溶解度
１ｍｌの濾液を丸底フラスコに移し、回転蒸発によってＤＣＭを除去した。その丸底フラスコに０．１ｍｌのクエン酸緩衝液を加えて、すべてのＴＴＸを溶解させた。５０μｌの溶液を４５０μｌのＰＢＳで希釈した。その混合物中のＴＴＸ濃度を、ＴＴＸ Ｅｌｉｓａキットを用いて計測した。

【0187】

薬物結合の程度の計測。
エステル化反応が完了した後、反応混合物中のＤＣＭを回転蒸発によって除去し、次いで、その反応混合物を３０ｍＬのＤＩ水で洗浄した。ポリマー－薬物コンジュゲートを２００００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を上清＃１として回収した。ポリマー－薬物コンジュゲートを４０ｍＬのＤＩ水で洗浄し、再度遠心した。上清を上清＃２として回収した。回収した上清のＴＴＸ濃度をＥＬＩＳＡによって計測した。回収した上清のデキサメタゾン濃度をＨＰＬＣによって決定した。

【0188】

薬物結合の程度を、以下のとおり計算した：

【数70】

【0189】

インビトロ薬物放出
ポリマー－薬物コンジュゲートを、１０，０００ＭＷカットオフを有するＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）にかけ、１４ｍＬのＰＢＳでさらに透析し、プラットフォーム振盪機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｉｎｎｏｖａ ４０、６０ｒｐｍ）上において３７℃でインキュベートすることによって、薬物放出研究および質量損失研究を行った。各時点において、透析溶液を、予め加温しておいた新しいＰＢＳと交換した。０．５ｍＬの透析溶液を薬物解析のために取っておいた。ＴＴＸの濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。デキサメタゾンの濃度を、Ｃ１８カラム（Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８，４．６×１００ｍｍ，ｉ．ｄ．２．７μｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびアセトニトリル／水（７０：３０）の移動相および０．５ｍＬ／分の流速を用いるＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｃｏ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって決定した。デキサメタゾンは、λ＝２５４ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって検出した。

【0190】

ＬＣ－ＭＳの計測装置および条件
Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）Ｘｅｖｏ（商標）ＴＱ ＭＳ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）装置において解析を行った。インラインフィルターアセンブリ（Ｗａｔｅｒｓ）および移動相Ａとして０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸の水溶液および移動相Ｂとして０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸のメタノール溶液とともにＫｉｎｅｔｅｘ Ｈｉｌｉｃカラム（１００×２．１ｍｍ，１００Å，２．６μｍ粒子；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いてクロマトグラフィー分離を行った。０～２．２分における１０％～３０％Ｂによる勾配溶出の後、９５％Ｂへの上昇（２．２～２．５分）および１０％Ｂへの平衡化（２．５～３．０分）を用いた。移動相の流速は、５００μｌ／分であり、カラム温度は、２５℃であり、サンプルマネージャーの温度は、１０℃であった。注入量は、５μｌであり；注入間の時間は、４分間であった。

【0191】

溶媒蒸発法
シリンジによって注射可能なＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤を調製するために、所定の量のＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートを過剰量のＤＣＭに完全に溶解させた後、所定の量のＰＥＧ２００を加えた。得られた混合物を１分間ボルテックスして、均一な溶液を得た。ＤＣＭを回転蒸発によって蒸発させた後、室温で一晩真空にした。

【0192】

レオロジー試験
ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤のレオロジー特性を、温度調節器が備え付けられたＡＲ２０００レオメーター（ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いてモニターした。直径２０ｍｍの平行プレートをすべての試験に使用した。プレート間の間隙の距離は、０．３ｍｍであった。０．１～１００ｒａｄ／ｓの範囲の周波数掃引を室温において行った。一定の０．１Ｐａ応力を使用した。

【0193】

動物試験
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ
ｏｆ Ｐａｉｎのガイドラインに準拠し、Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが承認したプロトコルに従って、動物試験を行った。体重が３５０～４００ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、６：００ＡＭに照明を点灯する１２時間／１２時間明暗サイクルにおいて群ごとに収容した。

【0194】

イソフルラン－酸素で麻酔した後、左の坐骨神経に注射を行った。２３Ｇの針を用いて薬物／キャリアをそれらの動物に注射した。その針は、大転子に対して後内側から挿入し、前内側方向に向け、骨に接触したら、製剤を坐骨神経に注射した。

【0195】

神経遮断の試験を、坐骨神経に神経支配されている皮板（すなわち、左足の足底）の遠位部位で行い、右脚（未注射）を、全身副作用に関する反対側のブロックの証拠を示し得る未処置コントロールとした。感覚神経遮断を評価するために、後足を順に（左の次に右）５６℃のホットプレートに曝露し、熱潜時を計測した。熱潜時は、動物が足をホットプレート上に置いたままにできた時間として定義した。２秒という熱潜時は、神経遮断がないことを示し（ベースライン）、１２秒という熱潜時は、強い神経遮断を示した。神経遮断の成功は、７秒を超える熱潜時として定義した。熱傷を防ぐために、１２秒後にホットプレートから後足を離した。

【0196】

ラットの後足の運動強度を決定する体重負荷試験によって、運動神経ブロックを評価した。手短に言えば、ラットをデジタル天秤の上で１本の後足で立たせ、自身の体重をかけさせた。ラットが足首をその天秤に接触させずに耐えられた最大重量を記録し、以前に記載されたように、運動強度が最大半量未満になったとき、運動ブロックが達成されたと見なした。

【0197】

２秒をベースラインとして、また、１２秒を完全な感覚ブロックとして用いて、熱潜時が７秒に戻るのに必要な時間によって、感覚ブロックの持続時間を計算した。運動ブロックの持続時間は、体重負荷が最大ブロックから正常の半分に戻るのに要する時間として定義した。

【0198】

共焦点イメージング
イソフルラン－酸素麻酔下において、ラットに０．５ｍＬの試験製剤（ＰＥＧ２００中の２５ｍｇのＦＩＴＣ－Ｔ_ｇＤ_８コンジュゲート、ＰＥＧ２００中の０．２５ｍｇのフルオレセインナトリウム、ＰＢＳ中の０．２５ｍｇのフルオレセインナトリウム）を注射し、坐骨神経注射後に所定の間隔で安楽死させた。坐骨神経を周囲組織とともに収集し、ＯＣＴ化合物に包埋し、次いで凍結し、－２０℃で保存した。切片（１０μｍ）を、クライオスタットミクロトームを用いて調製し、スライドガラスにのせた。その後、スライドを、予め冷却しておいた４％パラホルムアルデヒドで室温において２０分間固定し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。最後に、スライドにＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）およびカバーガラスをのせた。すべてのイメージングを、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０多光子共焦点顕微鏡を用いて行った。

【0199】

ＩＶＩＳイメージング
イソフルラン－酸素麻酔下において、ラットを剪毛し、０．５ｍＬの試験製剤（ＰＥＧ２００中の２５ｍｇのＣｙ５．５－Ｔ_ｇＤ_８コンジュゲート）を注射した。注射後の種々の時点においてＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、インビボ蛍光像を捕捉し、蛍光強度を評価した。動物の全身像を非侵襲的に記録した。エキソビボ組織分布研究に向けて、注射の１日後にラットを安楽死させた。像を記録するために、動物を各計測の前にイソフルランで麻酔し、計測後に回復させた。６７５ｎｍの励起フィルターおよび７００ｎｍの発光フィルターをイメージングに使用した。

【0200】

組織の収集および組織学的検査
ラットを注射の４および１４日後に屠殺し（これらの時点は、炎症と筋毒性の両方の評価において有用である）、坐骨神経を周囲組織とともに取り出した。解剖者は、どの溶液を各ラットに注射したかを知らなかった。神経および周囲組織を１０％ホルマリンに入れ、組織学的検査（ヘマトキシリン－エオシン染色スライド）に向けて、標準的な手法を用いて処理した。個々のサンプルの性質について知らない観察者（ＲＰ）がスライドを解析した。この研究における筋毒性の主要な形態学的指標は、再生中の線維（顕著な核小体を含む中心核を有する好塩基性の小径線維）の存在であり、偶然の筋線維だけが、進行中の変性変化を示した。

【0201】

筋肉サンプルを、炎症（０～４点）および筋毒性（０～６点）についてスコアリングした（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．５０ ９７９（１９７８））。炎症スコアは、重症度の主観評価であった（０：炎症なし、１：末梢の炎症、２：深部の炎症、３：筋神経束片側の炎症、４：筋神経束全体の炎症）。筋毒性スコアは、局所麻酔剤の筋毒性の２つの特徴的な特長：核内部移行および再生を反映した。核内部移行は、筋細胞のサイズおよびクロミシティ（ｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）が正常であるが、核が通常の位置から離れて細胞の周縁部に位置することによって特徴付けられる（Ｇｅｗｅｒｔ，Ｂ．，Ｐｌａｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｍ．＆ ＭａｃＬｅｏｄ，Ｍ．Ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ＆ Ｉｍｐａｃｔｓ １７，１５１３－１５２１（２０１５））。再生は、好塩基性の細胞質を有する縮んだ筋細胞によって特徴付けられる。スコアリングは、以下のとおりであった：０．正常；１．線維束周囲の内部移行；２．深部の内部移行（＞５細胞層）、３．線維束周囲の再生、４．深部の再生、５．線維束片側の再生、６．線維束全体の再生。サンプルに対するグレードは、スライド上に存在する最も悪い領域（最も重篤な損傷）を表す。

【0202】

統計。データは、平均値±ＳＤとして提示する（放出動態、細胞機能および神経行動学的研究においてｎ＝４）。多重比較を考慮するために、すべての統計比較を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用してチューキー・クレーマー検定によって行った。Ｐ＜０．０５を、統計的有意性を意味するとみなした。

【0203】

結果
ＴＤＰポリマーの合成
ＴＤＰポリマーの合成を、室温（図１Ａ）でのトリオール、ジカルボン酸およびＰＥＧのＳｔｅｇｌｉｃｈエステル化を介して行った。それらのポリマーの親水性は、親水性トリオール（グリセロール）または疎水性トリオール（ＰＣＬトリオール）を使用すること、ジカルボン酸の脂肪族鎖における炭素数を変化させること（１、５または８）、およびＰＥＧの分子量を変えることによって、改変することができた。本明細書中では、合成されたＴＤＰポリマーの命名は、Ｔ_ｘＤ_ｙＰ_ｚであり、ここで、「ｘ」は、トリオールのタイプを表し（ｇはグリセロールであり、ｃはＰＣＬトリオールである）、「ｙ」は、ジカルボン酸の脂肪族鎖における炭素数を表し、「ｚ」は、ＰＥＧの分子量（２００、１０００、２０００ｋＤａ）を表す（表１）。ＴＤＰポリマー内のグリセロールおよびＰＥＧの存在は、それらのポリマーの親水性の割合（ｆ_ｐｈｉｌ）を高めることを目的としており、その割合は、ＴＤＰポリマー内のグリセロールおよびＰＥＧの重量パーセントとして定義される。

【表1-3】

^ａポリマーの名称は、本文に記載されているように省略または簡略化されている。
^ｂポリマーの親水性の割合（ｆ_ｐｈｉｌ）：ポリマー内のＰＥＧおよびグリセロールの重量百分率。
^ｃＧＰＣによって決定。
^ｄＰＣＬトリオール＝ポリカプロラクトントリオール。

【0204】

ＴＤＰポリマーの特徴付け
ＴＤＰポリマーの構造を、^１Ｈ ＮＭＲ分光法によって調べた。ＴＤＰポリマーの^１Ｈ
ＮＭＲにおいて、ジカルボン酸のメチレンピークは、１．３０、１．６２および２．３５ｐｐｍに検出され、トリオールのメチレンピークは、４．０５～４．３５ｐｐｍに検出された。Ｔ_ｇＤ_８Ｐ_２００、Ｔ_ｇＤ_８Ｐ_１０００およびＴ_ｇＤ_８Ｐ_２０００では、３．４５～３．６０ｐｐｍのさらなるメチレンピークが観察されたことから、ＰＥＧセグメントの存在が示唆された。ＴＤＰポリマーの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定した（表１）。ＴＤＰポリマーのＭｎは、４，０００～７，０００の範囲内であった。

【0205】

ＴＤＰポリマーの親水性を、表面と容積の両方の特徴付けを評価することによって調べた。ポリマー薄膜の表面の特徴を、光学的な張力測定法（ゴニオメトリー（ｇｅｎｉｏｍｅｔｒｙ））によって計測した。この手法では、ポリマー表面と水滴表面の接線との間の角度（接触角）を測定した。接触角は、親水性と相関する。ポリマーのｆ_ｐｈｉｌの上昇は、接触角と逆の相関があった（図２Ａ）：ｆ_ｐｈｉｌが、０から８３．５％に上昇するにつれて、ポリマー薄膜の接触角は、７３．９±１．３から３１．３±２．１°に減少した。ポリマーの容積の特徴を、ポリマーの水溶解度を比較することによって調べた。ｆ_ｐｈｉｌの上昇は、水への溶解を誘導した。

【0206】

インビトロにおけるポリマーの分解速度は、生理学的条件下（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃）においてｆ_ｐｈｉｌが上昇するにつれて高まった（図２Ｂ）。これはおそらくｆ_ｐｈｉｌが高くなるほど、水の取り込みが多くなり、エステル結合の加水分解が加速するためである。ｆ_ｐｈｉｌが、３７．８％未満であったとき（Ｔ_ｇＤ_８およびＴ_ｇＤ_８Ｐ_２００）、ポリマーは、ほぼ線形の質量損失に従った（図２Ｃ）。
細胞傷害性

【0207】

ＴＤＰポリマーの細胞傷害性を、潜在的な筋毒性を評価するために筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２由来の筋管、および神経毒性のアッセイにおいて通常使用される褐色細胞腫細胞株ＰＣ１２由来の筋管において評価した。ＴＤＰポリマーを、ＰＥＧ２００（５０ｍｇ／ｍｌ）中に分散させ、細胞培養物に加え、２４時間後にＭＴＴアッセイによって細胞生存度を評価した（図３Ａおよび３Ｂ）。どちらの細胞株のいずれの群においても、細胞生存度は低下しなかった。

【0208】

ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートの合成
Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応は、反応が室温において進むことを可能にして薬物分解を回避するので、ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートの合成を、Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応を介して行った（図１Ｂ）。ＴＴＸコンジュゲート化の難点は、有機溶媒に対するＴＴＸの溶解度が低いことに起因するが、ＴＴＸは、非常に極性であり、酸性化された水にだけ難溶性である。Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応は、乾燥した非水溶媒中で行われなければならないので、ＴＴＸに適した有機溶媒が、ＴＴＸとコンジュゲートとの結合を促進するために必要であった。３つの無水溶媒、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびＤＭＳＯを、Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応に使用した。ＤＭＦは、ジカルボン酸にとって良い溶媒であり、ＤＣＭは、触媒（ＤＭＡＰ）、カップリング剤（ＤＩＣ）、グリセロール、ＰＥＧおよび得られるポリマーにとって良い溶媒である。ＴＴＸは、試験された有機溶媒のうち、ＤＭＳＯに最も高い溶解度を有した（１０μｇ／ｍＬ）ので、ＴＴＸに対する溶媒としてＤＭＳＯを選択した（表２）。詳細には、１ｍｇのＴＴＸを反応混合物に加えた（方法を参照のこと）。ＤＭＳＯへの溶解度が低いことに起因して、当初は、ほんの少量のＴＴＸしか、ＤＭＳＯに溶解せず、反応に参加しなかった。しかしながら、Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応が進むにつれて、溶解したＴＴＸが、ＴＤＰポリマーにコンジュゲート化され、それにより、ＤＭＳＯにおけるＴＴＸの溶液平衡が崩れ、続いて、より多くのＴＴＸがＤＭＳＯに溶解して、反応に参加した。ＴＴＸとＴＤＰとの結合程度（供給された総ＴＴＸを基準とした、ポリマーにコンジュゲート化したＴＴＸの質量分率）を高めるために、その反応を室温で７日間行わせた。反応後、ＥＬＩＳＡによって反応混合物中の未結合のＴＴＸを計測することによって、結合の程度を決定した。＞９９．０％のＴＴＸが、ＴＤＰポリマーにコンジュゲート化された（表３、表４、表５）。

【表2】

【0209】

溶解度を測定するための平衡溶解度法の説明については、方法を参照のこと。

【表3】

^ａＥＬＩＳＡによって決定。
^ｂ結合の程度：供給された総ＴＴＸを基準とした、ポリマーにコンジュゲート化されたＴＴＸの質量分率。

【表4】

薬物結合の程度の計測の説明については、方法を参照のこと。
^ａｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応後、反応混合物中のＤＣＭを回転蒸発によって除去し、次いで、１０ｍＬのＤＭＳＯ、ポリマー－ＴＴＸコンジュゲートおよび未結合ＴＴＸを含む反応混合物を３０ｍＬのＤＩ水で洗浄した。ポリマー－ＴＴＸコンジュゲートを２００００ｒｐｍで５分間遠心し、３０ｍＬのＤＩ水、１０ｍＬのＤＭＳＯおよび未結合ＴＴＸを含む上清を上清＃１として回収した。ポリマー－ＴＴＸコンジュゲートを４０ｍＬのＤＩ水で洗浄し、再度遠心した。４０ｍＬのＤＩ水および未結合ＴＴＸを含む上清を上清＃２として回収した。
^ｂ上清のＴＴＸ濃度を、ＴＴＸ Ｅｌｉｓａキットを用いて計測した。上清＃１中に有機溶媒が存在するので、上清＃１を、ＰＢＳで１０倍希釈して、ＥＬＩＳＡ計測に対する有機溶媒の影響を回避した。

【0210】

ＴＴＸ結合の程度を、以下のとおり計算した：

【数71】

【表5】

^ａＰＥＧ濃度を、ＰＥＧ内のメチレン水素とセバシン酸内のメチレン水素のＮＭＲ比に従って計算した。
^ｂ反応後、反応混合物を４０ｍＬのＤＩ水で２回洗浄した。２０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ポリマー－ＴＴＸコンジュゲートを回収し、その後、液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。ポリマー－ＴＴＸコンジュゲートの実際の収率を、乾燥したポリマー－ＴＴＸコンジュゲートおよびすべての反応体を計量することによって計算した。ポリマー－ＴＴＸコンジュゲートのパーセント収率（％）を、以下のとおり計算した：

【数72】

【0211】

ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートの特徴付け
ＴＤＰポリマーとＴＴＸとのコンジュゲート化を、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）によって直接確かめた。３０００～３６００ｃｍ^－１の範囲内の吸収ピークは、ＴＴＸのグアニジウム基およびＴＤＰポリマーのヒドロキシル基に特徴的である。ＴＤＰ－ＴＴＸは、３，０００～３，６００ｃｍ^－１の範囲において、未改変のＴＤＰポリマーよりも強い吸収を示したことから、ＴＴＸの存在が示唆される。

【0212】

実施例２：ＴＴＸ－ＰＧＳ／ＰＥＧは、細胞傷害性なしに、持続時間の長いインビトロ薬物放出を提供する
結果
ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートが持続的な神経遮断をもたらす可能性を評価するために、生理学的条件下のインビトロにおいて放出動態を調べた（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃）。放出サンプルのＨＰＬＣは、約５．０分におけるピークを明らかにした。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）から、その画分中の分子の分子量が、ＴＴＸの分子量に対応する（ｍ／ｚ３２０．１は［ＴＴＸ＋Ｈ］^＋である）ことが確かめられ、これにより、ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートからＴＴＸが天然の形態で放出されたことが確かめられた。ロードされたＴＴＸの半量を放出するのにかかる時間である、ＴＴＸの放出半減期を調べた。すべてのＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートが、遊離ＴＴＸと比べて、ＴＴＸ放出の持続時間を有意に延長した（図４Ａおよび４Ｂ）。

【0213】

ＴＤＰポリマーのｆ_ｐｈｉｌが、ＴＴＸの放出速度を決定した。ｆ_ｐｈｉｌが、８３．５から０％に低下するにつれて、ＴＴＸの放出半減期は、２５±５時間から７２３±７５時間に延長した。さらに、ＴＴＸ放出は、より低い値のｆ_ｐｈｉｌにおいてはほぼ線形のプロファイルに従ったことから（Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸおよびＴ_ｇＤ_８Ｐ_２００－ＴＴＸ）、全身毒性を最小限に抑えつつ、長い局所麻酔の持続時間にわたって一定速度でＴＴＸを放出する可能性が示唆される。

【0214】

ＴＴＸ放出がエステル結合の切断に依存したことを実証するために、エステル結合よりもかなり遅い速度ではあるが加水分解され得るウレタン結合（Ｃｈａｆｆｉｎ，Ｋ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ＭｃＮａｍａｒａ，Ｌ．，Ｂａｔｅｓ，Ｆ．Ｓ．＆ Ｈｉｌｌｍｙｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ Ｕｒｅｔｈａｎｅ Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｆｔｅｒ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ Ｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ Ｗａｔｅｒ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４７，５２２０－５２２６，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍａ５００９０４ｄ（２０１４））を介してＴＴＸをＴＤＰに共有結合的にコンジュゲート化した（図５Ａ）。インビトロでは、生理学的条件（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３７℃）における２８日間のインキュベーションの後、ＥＬＩＳＡで検出可能なＴＴＸは、１０μｇのＴＴＸを含む２５ｍｇのＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸウレタンコンジュゲートから放出されなかった（図６）。

【0215】

ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートおよびＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートからのインビトロ薬物放出
ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートおよびＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートのインビトロにおける薬物放出および分解を、生理学的条件下（ＰＢＳ、３７℃）において２８日間にわたって調べた。ＬＣ－ＭＳ分析から、ＴＴＸが天然の形態でポリマー－ＴＴＸコンジュゲートから放出されたことが確かめられた。すべてのポリマー－ＴＴＸコンジュゲート製剤が、遊離ＴＴＸと比べてＴＴＸ放出の持続時間を有意に延長した（図６Ｂ、６Ｃ）。ＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートへのＰＥＧの付加は、ポリマー骨格の親水性を決定し、ポリマー骨格の親水性は、エステル結合の加水分解速度およびＴＴＸ放出速度を決定した。したがって、ポリマー－ＴＴＸコンジュゲートにおけるＰＥＧセグメントのパーセンテージを調整することによって、ＴＴＸ放出速度を調節できる。ＴＴＸの放出は、組み込まれたＰＥＧの量に比例して増加した。２８日後、ＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸは、９９．７％のＴＴＸ放出を示したのに対して、ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸ、ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＴＴＸは、それぞれ８９．５、６２．５および４３．７％のＴＴＸ放出を示した。ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸコンジュゲートおよびＰＧＳ－ＴＴＸコンジュゲートの場合、表面侵食機構の下でのＰＧＳ系共重合体の分解に起因するゼロ次の放出プロファイルに従ってＴＴＸが放出された。ＰＥＧ濃度の増加に伴うＴＴＸ放出の増加は、共重合体の骨格の親水性の増大に起因し得る。そのような親水性の増大は、水の取り込みを増加させ、それにより、エステル結合の加水分解が加速する。

【0216】

ＴＴＸのコンジュゲート化において使用されるのと同じエステル結合を介してＰＧＳ－ＰＥＧに共有結合させることができるヒドロキシル基を有する薬物－デキサメタゾンについても同様の傾向が示された。デキサメタゾンの濃度を、ＨＰＬＣを用いて計測した。ＴＴＸおよびデキサメタゾンの薬物放出プロファイルは、調べたすべてのＰＧＳ－ＰＥＧ－薬物コンジュゲートで一貫していた（表６を参照のこと）。質量損失は、ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートの薬物放出の傾向と同様の傾向に従った（図６Ａ～６Ｅ）。２８日後、ＰＧＳ－ＴＴＸの質量損失は、２７．３％であったのに対して、ＰＧＳ－ＰＥＧ２００－ＴＴＸ、ＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－ＴＴＸおよびＰＧＳ－ＰＥＧ２０００－ＴＴＸの質量損失は、それぞれ３０．４、７０．４および９４．７％であった。これらの結果から、エステル結合の加水分解に起因して薬物放出が生じたことが確かめられた。数週間にわたる目的の化合物の調整可能な徐放は、コンジュゲートが持続時間の長い局所麻酔を提供する可能性を裏付けた。

【0217】

上記データから、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含む任意の薬物を、加水分解性のエステル結合を介してＴＤＰポリマーに共有結合的にコンジュゲート化できることが実証された。ＴＤＰポリマーは、デキサメタゾンなどの広範囲の治療的薬物の制御放出のためのユニバーサルなプラットフォームとして働く可能性を有する（図５Ｂ、表６、図６Ａ～６Ｅ）。

【表6】

^ａＤｅｘ＝デキサメタゾン。
^ｂＨＰＬＣによって決定。

【0218】

実施例３：シリンジによって注射可能な製剤の製作
結果
注射可能な溶液および懸濁液は、任意の投与経路によって身体に注射される可能性を有する（Ｍａｓｔｒｏｐｉｅｔｒｏ，Ｄ．，Ｎｉｍｒｏｏｚｉ，Ｒ．＆ Ｏｍｉｄｉａｎ，Ｈ．Ｒｈｅｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ－Ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｊ Ｄｅｖ Ｄｒｕｇｓ ２，１０８（２０１３））。しかしながら、８３．５％という高いｆ_ｐｈｉｌを有するＴ_ｇＤ_８Ｐ_２０００は、ＰＢＳに均一に懸濁させられて、注射製剤を生成することができたが、ｆ_ｐｈｉｌが低い他のＴＤＰポリマーは、ＰＢＳに均一に懸濁できなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。注射によって患者にＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートを投与するために、均一なＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤を溶媒蒸発によって作製した（図７）。手短に言えば、ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートをＤＣＭに溶解させて、均一な溶液を生成した後、ＤＣＭと混和性であるＰＥＧ２００を加えた。ＤＣＭを回転蒸発および凍結乾燥によって除去することにより、ＰＥＧ２００中のＴＤＰ－ＴＴＸの均一な懸濁液が得られた。

【0219】

ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤の動的貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）および複素粘度を、ある範囲の角振動数において特徴付けた（図８Ａ～８Ｃ）。シリンジ通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）および注射性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）を考慮するとき、粘度が重要である。５０ｍｇ／ｍＬでは、試験された角振動数の範囲において、すべてのＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤が、１０Ｐａ・ｓ未満の粘度を有した。Ｇ”がＧ’より高かったことから、複素弾性率の粘稠性の成分がその材料の挙動を支配したこと、すなわち、それらが液体として挙動したことが示唆された（図８Ｃ）。ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤の粘稠性の挙動および低い粘度は、それらがシリンジによって注射可能であることを示唆する。

【0220】

上記ポリマーのｆ_ｐｈｉｌは、ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤の粘度と逆相関した（図８Ａ）。これはおそらく、親水性の低下が、ＰＥＧ２００との混和性の低下を意味したからである。Ｔ_ｃＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００の粘度は、Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００の粘度より低く、これは、ＰＥＧ２００に対するＰＣＬ－トリオールの混和性が、グリセロールの混和性よりも良いことに起因し得る。

【0221】

実施例４：ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、インビボにおいて坐骨神経遮断を誘導する
結果
神経遮断に対するＴＴＸ用量の影響
ラット（１群につき４匹）の左坐骨神経に、遊離ＴＴＸを含む０．５ｍＬのＰＢＳもしくはＰＥＧ２００、またはＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートを含む０．５ｍＬのＰＥＧ２００を注射した。次いで、それらのラットに神経行動試験を受けさせて、両後足における機能障害（すなわち、神経遮断）の持続時間を測定した。注射した（左）側の障害の持続時間は、神経ブロックの持続時間を反映した。注射していない（右、反対側）側における障害は、ＴＴＸの全身分布を反映した。

【0222】

ＰＥＧ２００を伴うおよび伴わない遊離ＴＴＸ
遊離ＴＴＸの坐骨神経注射を受けたラットの群は、神経ブロックの成功頻度および神経ブロックの持続時間の中央値の用量依存的な増加を示した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＰＢＳ中の低用量のＴＴＸ（１または２μｇ；それぞれ６または１２μＭ）は、検出可能な神経ブロックまたは毒性を引き起こさなかった。ＰＢＳ中の４μｇ（２４μＭ）の遊離ＴＴＸからのブロックは、１００％の動物において成功し、１．９±１．０時間という感覚神経ブロックの持続時間の中央値をもたらした。これは、臨床で通常使用される麻酔薬である０．５％ブピバカインの効果に匹敵する。しかしながら、ＰＢＳ中の４μｇのＴＴＸによるブロックは、注射されていない（反対側の）脚における感覚消失によって証明される、顕著な全身毒性を伴った（図９Ｃおよび図１０Ａ～１０Ｅ）。ＰＢＳ中の５μｇ（３０μＭ）の遊離ＴＴＸの注射は、すべての動物において反対側に障害を引き起こし、一様に致死的であった（図９Ｄ）。ＰＢＳ中のいずれの用量の遊離ＴＴＸにおいても感覚神経遮断の持続時間と運動神経遮断の持続時間との間に統計学的に有意な差は無かった（図１１）。

【0223】

０．５ｍＬのＰＥＧ２００中の遊離ＴＴＸは、ＰＢＳ中のＴＴＸよりもかなり速い速度での神経遮断成功および長い持続時間の神経ブロックをもたらした（図９Ａ、９Ｂ）。ＰＥＧ２００中の１μｇ（６μＭ）および３μｇ（１８μＭ）の遊離ＴＴＸは、それぞれ３．６±０．３時間および５．３±０．３時間という持続時間で１００％遮断をもたらした。ＰＥＧ２００は、全身毒性の発生率に影響しなかった（図９Ｃ、９Ｄ）。ＰＥＧ２００による神経ブロックの成功率および持続時間の改善は、化学的浸透促進剤またはナノカプセル封入の効果と一致する。

【0224】

Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００
神経ブロックの持続時間は、Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００中の製剤によって有意に延長された（図９Ａ、９Ｂ）。１μｇ（６μＭ）のＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００としてのコンジュゲート化ＴＴＸは、５０％のブロック成功をもたらし、１．６±１．１時間という持続時間の中央値であった。感覚ブロックの成功および持続時間は、コンジュゲート化ＴＴＸの用量が増加するにつれて増大した。８０μｇ（４８０μＭ）のＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００としてのコンジュゲート化ＴＴＸによる感覚神経ブロックは、７１．５±６．９時間続き（図９Ｂ）、動物は死亡せず、反対側の障害を起こさなかった（図９Ｃ、９Ｄおよび図１０Ａ～１０Ｅ）。重要なことに、この動物モデルでは、毒性が限定的であることに起因して、徐放（Ｒｗｅｉ，Ａ．Ｙ．ら、Ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ ａｎｄ ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ ｏｎ－ｄｅｍａｎｄ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｂｌｏｃｋ
ｗｉｔｈ ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１１２，１５７１９－１５７２４，（２０１５））、化学的浸透促進剤（Ｌａｈａｙｅ，Ｌ．Ａ．＆ Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｉ．Ｖ．Ｊ．Ｆ．Ｓｉｔｅ－１ Ｓｏｄｉｕｍ
Ｃｈａｎｎｅｌ Ｂｌｏｃｋｅｒｓ ａｓ Ｌｏｃａｌ ＡｎｅｓｔｈｅｔｉｃｓＷｉｌｌ Ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ Ｓｕｐｐｌａｎｔ ｔｈｅ Ｎｅｅｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｎｅｒｖｅ Ｂｌｏｃｋｓ？ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ １２３，７４１－７４２（２０１５））、またはＳ１ＳＣＢの効果を高める薬物（Ｒａｉ，Ｒ．，Ｔａｌｌａｗｉ，Ｍ．，Ｇｒｉｇｏｒｅ，Ａ．＆ Ｂｏｃｃａｃｃｉｎｉ，Ａ．Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｅｂａｃａｔｅ）（ＰＧＳ）：Ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，１０５１－１０７８，（２０１２））の非存在下においては、ＴＴＸによるそのような長い神経ブロックを達成することができない。運動ブロックは、コンジュゲート化ＴＴＸのすべての用量において、感覚ブロックよりも長かった。例えば、Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００としての８０μｇ（４８０μＭ）のコンジュゲート化ＴＴＸによる運動ブロックは、８３．５±１０．５時間続いた（図１１）。

【0225】

Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００における低用量のＴＴＸ（例えば、１～３μｇ）は、ＰＢＳ中の遊離ＴＴＸより高いブロック成功率を有したという事実は、その製剤における賦形剤のＣＰＥ様効果と一致した。そうでなければ一般に、薬物の遊離画分がより多いために、遊離薬物がより高いブロック成功率を有すると予想され得る。ＰＥＧ２００またはＴ_ｇＤ_８がＣＰＥ様効果に関与したかを判定するために、０．５ｍＬのＰＥＧ２００中の２５ｍｇのＴ_ｇＤ_８ポリマーとともに（しかしそれにコンジュゲート化されていない）３μｇ（１８μＭ）の遊離ＴＴＸを、坐骨神経に注射したところ、３．５±１．１時間という持続時間で１００％遮断がもたらされた。これは、遊離ＴＴＸからのブロックの持続時間よりも長かった（ｐ＜０．０５）が、ＰＥＧ２００中のＴＴＸよりも長くなかったことから、Ｔ_ｇＤ_８ではなくＰＥＧ２００がＣＰＥ様効果に関与することが示唆された。ＴＴＸの非存在下では、０．５ｍＬのＰＥＧ２００中のＴ_ｇＤ_８ポリマーは、神経ブロックを引き起こさなかった（表７）。

【表7】

神経ブロックの持続時間に対するデータは、平均値±ＳＤである。

【0226】

４６０ｎｍの励起波長および５１５ｎｍの発光波長を有する蛍光色素であるフルオレセインナトリウムとＴＴＸの両方ともが非常に親水性であるので、ＰＥＧ２００が神経へのＴＴＸ流入を増加させるＣＰＥ分子として働くことができる可能性を調べるために、フルオレセインナトリウムをＴＴＸの代わりとして用いた。０．５ｍＬのＰＥＧ２００またはＰＢＳ中の０．２５ｍｇのフルオレセインナトリウムをラットの坐骨神経に注射した。１時間後および４時間後、動物を安楽死させ、坐骨神経および周囲組織を収集した。それらの組織の凍結切片を作製し、蛍光像を撮影した。坐骨神経および周囲組織の切片の蛍光像は、０．５ｍｌのＰＥＧまたはＰＢＳ中の０．２５ｍｇのフルオレセインナトリウムの注射の１および４時間後に捕捉した。

【0227】

ＰＥＧ２００中のフルオレセインナトリウムを注射された動物では、注射の１時間後に、神経全体にわたって蛍光が観察されたが、注射の４時間後には、観察されなかった。同じ用量のフルオレセインナトリウムを含むＰＢＳを注射された動物の神経ではいずれの時点においても、または注射されていない肢において、蛍光は観察されなかった。これらの結果から、ＰＥＧ２００は、分子が神経に浸透するのを助ける化学的浸透促進剤として作用できることが実証された。

【0228】

この研究の基礎をなす重大な仮説は、ポリマーに結合したＴＴＸが不活性であり得ること、およびそれは放出されると活性になり得るということであった。この仮説を検証するために、ウレタン結合を介したＴ_ｇＤ_８に対する１０．０μｇのコンジュゲート化ＴＴＸを、坐骨神経に注射した。試験されたいずれの動物においても、感覚神経遮断はもたらされなかった。これらの結果から、ＴＴＸは、ポリマー骨格に共有結合的にコンジュゲート化されると、生物学的活性を有しないことが示唆された。

【0229】

ＰＢＳで希釈したＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００
ＰＥＧ２００によって誘導されるＣＰＥ効果を排除するため、および神経ブロックに対するＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸ自体からのＴＴＸの徐放の効果を調査するために。遊離ＴＴＸ／ＰＥＧ２００およびＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００溶液を、１０ｗｔ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで４倍希釈した。ＢＳＡは、界面活性物質として働くことにより、その溶液からのＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸの沈殿を回避した。０．５ｍｌのその希釈溶液中の１μｇ（６μＭ）の遊離ＴＴＸは、検出可能な神経ブロックまたは毒性を引き起こさなかったことから、純粋なＰＥＧ２００のＣＰＥ効果の排除が示唆された（表８）。０．５ｍｌの希釈溶液中に４０μｇ（２４０μＭ）のＴＴＸを含む２５ｍｇのＴ_ｇＤ_８－ＴＴＸは、検出可能な神経ブロックまたは毒性を引き起こさなかったことから、Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸからのＴＴＸのゆっくりとした放出は、神経ブロックをもたらす治療用量のＴＴＸを達成しなかったことが示唆される。これらの結果から、Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤におけるＰＥＧ２００のＣＰＥ様の機能がさらに確かめられた。

【表8】

神経ブロックの持続時間に対するデータは、平均値±ＳＤである。

【0230】

実施例５：ｆ_ｐｈｉｌは、コンジュゲート化ＴＴＸの毒性および有効性に影響する（Ｅｆｆｅｃｔｓ）
ＴＤＰポリマーのｆ_ｐｈｉｌが、インビトロにおいてＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートからのＴＴＸ放出速度を決定したという事実から着想を得て、本発明者らは、ＴＤＰポリマーのｆ_ｐｈｉｌがインビボにおいて特定の用量のコンジュゲート化ＴＴＸの毒性および有効性も決定するという仮説を立てた：より高いｆ_ｐｈｉｌは、天然の形態でのより速いＴＴＸの放出を誘導したので、特定の高用量のコンジュゲート化ＴＴＸの毒性を高めたが、一方で特定の低用量のコンジュゲート化ＴＴＸの有効性を高めた。

【0231】

本発明者らの仮説を検証するために、ラットの左坐骨神経に、２つの用量のコンジュゲート化ＴＴＸ：１０μｇ（６０μＭ）および１μｇ（６μＭ）を含むＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートを注射した。コンジュゲート化ＴＴＸの毒性および有効性に対するｆ_ｐｈｉｌの効果を調べた。ＴＤＰポリマーのｆ_ｐｈｉｌの上昇は、死亡率の上昇によって証明されるように、１０μｇ（６０μＭ）のコンジュゲート化ＴＴＸの全身毒性を高めた（図１２Ａ～１２Ｄ）。他方で、ＴＤＰポリマーのｆ_ｐｈｉｌの上昇は、ブロックの成功率およびブロックの持続時間の増加によって証明されるように、１μｇ（６μＭ）のコンジュゲート化ＴＴＸの有効性を高めた。

【0232】

実施例６：ＴＤＰポリマーはインビボにおいて神経に生体内分布した
結果
坐骨神経注射後のＴＤＰポリマーの局所分布を調べるために、色素が単独で拡散できないようにフルオレセインイソチオシアネート（４８８ｎｍの励起波長および５１９ｎｍの発光波長を有する蛍光色素）に共有結合的にコンジュゲート化されたＴ_ｇＤ_８（０．５ｍＬのＰＥＧ２００中）を動物に注射した。そのポリマーは、ＦＩＴＣ－Ｔ_ｇＤ_８と表示される。注射後の所定の時点において、動物を安楽死させ、神経および周囲組織を組織学的検査のために処理した。共焦点による蛍光イメージングは、注射の２４、４８および１６８時間後に、筋肉と神経との間の結合組織にＦＩＴＣ蛍光を示した。注射されていない肢において、ＦＩＴＣ蛍光は観察されなかった。

【0233】

組織におけるＴＤＰの局所保持の時間経過を評価するために、Ｃｙ５．５（生きている動物における蛍光計測にとって理想的な近赤外シグナルを発する蛍光色素）に共有結合的にコンジュゲート化されたＴ_ｇＤ_８（０．５ｍＬのＰＥＧ２００中）を動物に注射した。そのポリマーは、Ｃｙ５．５－Ｔ_ｇＤ_８と表示される。インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）によって蛍光イメージングを撮影して、組織におけるＣｙ５．５－Ｔ_ｇＤ_８の位置を経時的に評価した。蛍光シグナルは、すべての動物の坐骨神経で見られ、その他の箇所で検出可能な蛍光は見られなかった。４週間かけて蛍光シグナルは低下したことから、ＴＤＰがインビボにおいて徐々に分解されたことが示唆される（図１３）。注射の２４時間後の剖検において、目に見える沈着物が坐骨神経に位置した。これらは、蛍光性であったことから、ＴＤＰを含んでいることが確かめられた。

【0234】

実施例７：ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、組織反応を誘発（ｉｌｌｉｃｉｔ）しない 結果
遊離ＴＴＸおよび様々なｆ_ｐｈｉｌを有するＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートを注射された動物を、坐骨神経注射の４および１４日後に安楽死させた。Ｔ_ｇＤ_８－ＴＴＸコンジュゲートに対する代表的な組織反応を図８に示した。解剖時に、共焦点およびＩＶＩＳによって検出される残留材料がいくらかあった。それらの組織は、浮腫性であるかまたは変色しているようには見えず、組織損傷の他の肉眼的徴候も有しなかった。坐骨神経および周囲組織を切断し、組織学的評価のために収集した。筋組織をヘマトキシリン－エオシン染色で処理し、神経組織をトルイジンブルー染色で処理した。

【0235】

鏡検では、注射の４および１４日後に、遊離ＴＴＸおよびＴＤＰ－ＴＴＸを注射された動物において有意な筋毒性および炎症は明らかにされなかった。筋毒性および炎症を、スコアリングシステムを用いて定量した（表３）（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｍ．＆ Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｅｂａｃａｔｅ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔ Ａ ６６Ａ，１９２－１９７，（２００３））。遊離ＴＴＸに対するスコアと様々なｆ_ｐｈｉｌを有するＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートに対するスコアとの間に統計学的に有意な差は無かった。

【0236】

Ｈ＆Ｅ染色は、神経損傷の特定に対して比較的感受性でないので、ＴＤＰ－ＴＴＸを注射された動物の坐骨神経のトルイジンブルー染色Ｅｐｏｎ包埋切片を得た。神経の組織学的検査および顕微鏡像は、注射されたすべてのラットにおいて正常な軸索の分布およびミエリン構造を示した。注射の４および１４日後における神経の鏡検から、正常な無髄線維が明らかにされ、損傷（例えば、腫脹、崩壊または濃く染色される軸索原形質）の証拠は無かった。すべての群において、有髄線維が、軸索内に沈着物を有するかまたはミエリン鞘内に円形の切れ目を有することが時折見られたが、これらは、正常な末梢神経線維の一般的な所見である。

【表9】

^ａ０．５ｍＬのＰＢＳ中の３μｇの遊離ＴＴＸ、^ｂＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートを、０．５ｍＬのＰＥＧ２００中で製剤化した。データは、２５および７５パーセンタイルによる中央値である（ｎ＝４）。炎症スコアは、０～４の範囲であり；筋毒性スコアは、０～６の範囲である（ＭｃＡｌｖｉｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｒｅｚｎｏｒ，Ｇ．，Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａ，Ｓ．Ａ．，Ｓｔｅｆａｎｅｓｃｕ，Ｃ．Ｆ．＆ Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｓ．Ｌｏｃａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｌｏｃａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ ａｎａｌｇｅｓｉａ １１６，７９４－８０３，（２０１３）；Ｆ Ｐａｄｅｒａ，Ｒ．，Ｔｓｅ，Ｊ．，Ｂｅｌｌａｓ，Ｅ．＆ Ｓ Ｋｏｈａｎｅ，Ｄ．Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ｆｏｒ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｌｏｃａｌ ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｖｏｌ．３４（２００６））。

【0237】

実施例８：ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートは、すべてのアルコール性薬物またはカルボン酸薬物に対してユニバーサルな治療的薬物プラットフォームを提供する
結果
ＰＧＳ－ＰＥＧ共重合体は、調節可能な親水性を有するので、すべてのアルコール性薬物またはカルボン酸薬物に対してユニバーサルな治療的薬物プラットフォームとして働き得る。１つのヒドロキシル基を含む従来の局所麻酔剤であるカプサイシンを、エステル結合を介してＰＧＳ－ＰＥＧ共重合体にコンジュゲート化した（図１４）。ラットモデルにおいて神経遮断をもたらすために、カプサイシンの最小有効量は、およそ５０μｇであり、これは、ＴＴＸ２７－２８の最小有効量よりかなり多い。したがって、カプサイシンの最小有効量を達成するためには、ＴＴＸの注射用量および放出速度よりも高いカプサイシンの注射用量およびより速いカプサイシンの放出速度が望まれる。この概念を証明するために、ＰＧＳ－カプサイシンコンジュゲートおよびＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシンコンジュゲートを合成した。それらの各々は、２つのグラフト密度を有する：ＰＧＳ－カプサイシンおよびＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシンは、４４．４μｇ／ｍｇというグラフト密度を有し、ＰＧＳ－カプサイシン－２およびＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシン－２は、１８２．９μｇ／ｍｇというグラフト密度を有する（表１０）。

【表10】

【0238】

ＴＴＸおよびデキサメタゾンの放出傾向と一致して、カプサイシンは、ＰＧＳ－カプサイシンコンジュゲートよりもかなり速くＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシンコンジュゲートから放出された。ＰＢＳ中での１日間のインキュベーションの後、７０．８μｇのカプサイシンが２５ｍｇのＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシン－２コンジュゲートから放出されたのに対して、２５ｍｇのＰＧＳ－カプサイシン、ＰＧＳ－カプサイシン－２およびＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシンからは、それぞれたった５．３、２１．２および１５．２μｇのカプサイシンしか放出されなかった（図１０）。インビボでは、２５ｍｇのＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシン－２の注射によって、試験されたすべての動物において神経遮断がもたらされ、それは１日間から２７日間継続した。他方で、２５ｍｇのＰＧＳ－ＰＥＧ１０００－カプサイシン、ＰＧＳ－カプサイシンおよびＰＧＳ－カプサイシン－２の注射は、試験されたすべての動物において神経遮断をもたらさなかったことから（表１１）、最小有効量のカプサイシンに到達しなかったことが示唆される。これらの結果から、ＰＧＳは、ＴＴＸに最も適したプラットフォームであるが、神経遮断をもたらすカプサイシンの制御放出のためのプラットフォームとしては、ＰＧＳよりもＰＧＳ－ＰＥＧ１０００が適していることが実証された。

【表11】

^ａ０．５ｍｌのＰＥＧ２００中で製剤化された

【0239】

ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸコンジュゲートは、ヒトなどの大型動物に適用される可能性を有する。局所麻酔剤（ＴＴＸを含む）の毒性用量の中央値は、レシピエント２の質量（分布容積）に正比例するので、所与の量の調製物の毒性は、より大きな動物で使用されると、大幅に低下し得る。神経を遮断する用量は、身体サイズに比例するので、ＴＴＸの注射用量と放出速度の両方が、動物が大きくなるほど増加するはずである。ＰＧＳ－ＰＥＧ－ＴＴＸは、ＴＴＸの放出速度が速いので、より大きな動物ではＰＧＳ－ＴＴＸよりも適している可能性がある。

【0240】

要約
Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応を介して、ジカルボン酸のカルボキシル基およびトリオールのヒドロキシル基およびＰＥＧの間にエステル結合を形成することによって、ＴＤＰポリマーを合成した。ＴＤＰポリマーは、エステル結合の加水分解によって分解可能であり、細胞傷害性を最小限に抑えつつ、良好な生体適合性を示した。様々なｆ_ｐｈｉｌを有するＴＤＰポリマーのファミリーを合成した。表面と容積の両方の特徴付けから、そのポリマーのｆ_ｐｈｉｌが、ポリマーネットワークのエステル結合の加水分解速度を決定したことが示唆された。ＴＤＰポリマーは、薬物が共有結合的にコンジュゲート化できる複数の活性な末端基（ヒドロキシル基およびカルボキシル基）を有する。これらの特徴は、ＴＤＰポリマーが、広範囲の治療的薬物の制御放出のためのユニバーサルプラットフォームとして働く潜在能力を有することを示唆している。

【0241】

Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化反応を介して、ＴＤＰポリマーのカルボキシル基とＴＴＸのヒドロキシル基との間にエステル結合を形成することによって、ＴＴＸとＴＤＰポリマーとの共有結合性のコンジュゲート化が達成された。Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化合成は、薬物の分解を回避するために室温において行われた。合成されたＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、徐々に分解して、より小さいポリマー－ＴＴＸフラグメントになり、最終的には、エステル結合の加水分解によって天然の形態のＴＴＸに分解して、ＴＴＸの制御放出が達成された。ＴＴＸの放出速度は、ＴＤＰポリマーのｆ_ｐｈｉｌに反比例した。３７．８％未満のｆ_ｐｈｉｌでは、ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、インビトロにおいて１ヶ月を超える長期間のＴＴＸ放出が達成された。

【0242】

ＰＥＧ２００のＣＰＥ機能が初めて確かめられた。ＰＥＧ２００は、神経周膜バリアを通り抜けて神経への薬物流入を増大させることができ、これは、ＰＥＧ２００の両親媒性の性質に起因し得る。０．５ｍＬのＰＥＧ２００中の１～３μｇの用量の遊離ＴＴＸは、最大５．３±０．３時間というブロックの持続時間で１００％遮断をもたらした。これは、臨床において通常使用される麻酔薬である０．５％ブピバカインの効果よりも３倍長い。ＰＥＧ２００は、低毒性であること、および種々の薬学的製剤においてすでに広く使用されていることから（Ｄ’ｓｏｕｚａ，Ａ．Ａ．＆ Ｓｈｅｇｏｋａｒ，Ｒ．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １３，１２５７－１２７５，ｄｏｉ：１０．１０８０／１７４２５２４７．２０１６．１１８２４８５（２０１６））、臨床での局所麻酔用のＴＴＸ送達媒体として働く大きな可能性を有する。

【0243】

ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、混和性が良いことから、ＰＥＧ２００中に容易に分散させられ、シリンジで注射可能な均一なＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤が形成された。調製されたすべてのＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤が、１０Ｐａ・ｓ未満の粘度を有する液体として挙動したことから、シリンジ注射による患者への投与の可能性が示唆された。

【0244】

インビボ動物試験から、ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤が、ＴＴＸの持続放出を達成し、局所麻酔に対するＴＴＸの治療指数を大幅に拡大できることが確証された。（ｉ）ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００は、最大８０μｇという用量のＴＴＸの注射を、その全身毒性を増大させることなく、可能にした。さらに、ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、神経周辺の神経上膜組織において長時間保持され、それは最大４週間続き、これにより、長期間にわたる治療的なＴＴＸ濃度が維持され、局所麻酔の持続時間の延長が可能になった。（ｉｉ）ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤は、ＴＴＸの有効性を高めることができた。ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤は、１μｇもの少ないＴＴＸの有効性を有意に高め、神経遮断をもたらす。全体的に見て、１．０～８０．０μｇという広範囲のＴＴＸ注射用量において、ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤は、数時間から３日間という調節可能な神経ブロックの持続時間を提供した。

【0245】

ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、ヒトなどの大型動物に適用できる。局所麻酔剤（ＴＴＸを含む）の毒性用量の中央値は、レシピエント^２の質量（分布容積）に正比例するので、所与の量の本発明者らの調製物の毒性は、より大きな動物で使用されると、大幅に低下し得る。神経を遮断する用量は、身体サイズに比例するので、ＴＴＸの注射用量と放出速度の両方が、動物が大きくなるほど増加するはずである。より高いｆ_ｐｈｉｌを有するＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートは、ＴＴＸの放出速度が速いので、より大きな動物ではより適している可能性がある。

【0246】

ＴＴＸを診療に導入することを目的として、ＴＴＸの治療指数を拡大する送達系を合理的に設計した。ＴＴＸを、加水分解性のエステル結合を介して、生分解性かつ生体適合性のＴＤＰ骨格に共有結合的にコンジュゲート化した。上記データから、ＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートが、調整可能なＴＴＸ放出を提供し得ることが実証された。ＴＴＸは、エステル結合の加水分解によって天然の形態で放出され得、放出速度は、ＴＤＰ骨格の親水性を制御することによって調整可能であり得る。ＰＥＧ２００は、ＣＰＥ分子として働くことにより、神経周膜バリアを通り抜けて神経への薬物流入を増大させることができる。ＰＥＧ２００は、神経遮断をもたらすＴＴＸの有効性を有意に高め得る。ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００は、ＰＥＧ２００のＣＰＥ機能とともにＴＤＰ－ＴＴＸコンジュゲートからの持続的なＴＴＸ放出を備えている、シリンジによって注射可能な製剤であり、ＴＴＸの治療濃度域を有意に拡大すると立証された。ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤は、インビボ実験において、１．０～８０．０μｇという広範囲のＴＴＸ注射用量において、数時間から３日間という調節可能な持続時間の神経ブロックを提供した。さらに、神経遮断は、最小限の全身毒性、ならびに筋肉および末梢神経に対する実質的に無い局所毒性を伴った。ＴＤＰ－ＴＴＸ／ＰＥＧ２００製剤は、持続時間が長く調節可能な局所麻酔のための首尾よい安全なアプローチを提供する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【図14】

【外国語明細書】