特開 2024-114973 抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024114973

(43)【公開日】2024-08-23

(54)【発明の名称】抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240816BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240816BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240816BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240816BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240816BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20240816BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240816BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240816BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240816BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61K35/17

A61P35/00

C12N5/10

C07K16/28

C07K19/00

C07K14/725

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024106283

(22)【出願日】2024-07-01

(62)【分割の表示】P 2021560212の分割

【原出願日】2020-04-02

(31)【優先権主張番号】62/830,004

(32)【優先日】2019-04-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/944,485

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】521438515

【氏名又は名称】２セブンティ バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ケビン フリードマン

(72)【発明者】

【氏名】エリック スコット アロンゾ

(57)【要約】

【課題】抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造の提供。
【解決手段】本発明は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞治療薬の製造のための改善された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造するための改善された方法に関し、より強力で持続性があり、有効な養子Ｔ細胞免疫療法をもたらす。特定の実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から製造された。様々な実施形態では、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団が提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の定めのもと、２０１９年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／９４４，４８５号明細書、および２０１９年４月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８３０，００４号明細書の利益を主張するものであり、当該出願は、その全体で参照により本明細書に援用される。

【0002】

配列表に関する声明
本出願に関する配列表は紙媒体の代わりにテキストフォーマットで提出され、参照により本明細書に援用される。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿１１８＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは７ＫＢであり、２０２０年３月２７日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。

【0003】

本発明は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の製造のための改善された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造するための改善された方法に関し、より強力で持続性があり、有効な養子Ｔ細胞免疫療法をもたらす。

【0004】

関連分野に関する記載
養子免疫療法は、Ｔリンパ球を対象に移し、疾患に対する療法を提供するものである。養子免疫療法は、癌、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全を含む幅広い疾患を治療するための可能性をまだ実現していない。しかしながら、全ての養子免疫療法戦略が、臨床的に有効な治療用量のＴ細胞を生成するために、Ｔ細胞活性化および増殖工程を必要とするわけではないが、多くが必要としている。操作されたＴ細胞を含むＴ細胞の治療用量を生成するための現在の技術は、煩雑なＴ細胞の製造プロセスによって制限されている。例えば、Ｔ細胞増殖は、多くの場合、治療的に関連するＴ細胞数を達成するために、労働集約的で高価なクローニング、および／または複数回の活性化／増殖を必要とする。さらに、既存のＴ細胞活性化／増殖方法は、通常、実質的なＴ細胞分化と連結され、通常、短命生存および持続性の欠如、ならびに移行したＴ細胞のインビボ増殖の欠如を含む短命効果をもたらす。より最近の製造方法は、より強力かつ持続的なＴ細胞をもたらしたが、これらの細胞は依然としてエフェクター免疫細胞機能を使い果たし、喪失する傾向がある。

【0005】

Ｔ細胞製造およびより強力で持続的なＴ細胞療法の改善に対するアンメットニーズは依然として存在する。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、概して、改善された能力および持続性を有する養子Ｔ細胞免疫療法、ならびにそれを作製する方法を提供する。

【0007】

様々な実施形態では、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団が提供される。

【0008】

特定の実施形態では、当該集団は、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
Ｔ細胞を含む。

【0009】

特定の実施形態では、当該集団は、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
Ｔ細胞を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、当該集団は、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、当該集団は、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0012】

特定の実施形態では、ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＬＥＦ１^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0013】

追加的実施形態では、ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＬＥＦ１^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。様々な実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団は、少なくとも１０％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、集団は、少なくとも１５％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、集団は、少なくとも２０％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、集団は、少なくとも２５％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0017】

さらなる実施形態では、集団は、少なくとも３０％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0018】

追加的実施形態では、ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＬＥＦ１^＋ＣＣＲ７^＋ＴＣＦ１^＋ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0021】

特定の実施形態では、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0022】

特定の実施形態では、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0023】

特定の実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から製造された。

【0024】

特定の実施形態では、細胞は、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する対象から製造された。

【0025】

いくつかの実施形態では、細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスを含む。

【0026】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 １に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0027】

さらなる実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 ２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

【0028】

特定の実施形態では、細胞は自己である。

【0029】

特定の実施形態では、細胞は凍結保存される。

【0030】

特定の実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象への投与のために製剤化される。

【0031】

いくつかの実施形態では、約５～約７日間、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触されたヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞が提供され、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現は、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍または少なくとも２倍多い。

【0032】

特定の実施形態では、約５～約７日間、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触されたヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞が提供され、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または全ての遺伝子発現は、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない。

【0033】

さらなる実施形態では、約５～約７日間、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触されたヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞が提供され、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全てのそれぞれの遺伝子発現は、少なくとも１．５または少なくとも２倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または全ての遺伝子発現は、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない。

【0034】

特定の実施形態では、ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）様表現型を有する。

【0035】

さらなる実施形態では、ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）様表現型を有する。

【0036】

特定の実施形態では、ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＣＭ様表現型を有し、ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＳＣＭ様表現型を有する。

【0037】

いくつかの実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から製造された。

【0038】

特定の実施形態では、細胞は、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する対象から製造された。

【0039】

特定の実施形態では、細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスを含む。

【0040】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 １に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0041】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 ２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

【0042】

特定の実施形態では、細胞は自己である。

【0043】

特定の実施形態では、細胞は凍結保存される。

【0044】

特定の実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象への投与のために製剤化される。

【0045】

さらなる実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。

【0046】

特定の実施形態では、本明細書で企図される生理学的に許容可能な賦形剤および治療有効量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物が提供される。

【0047】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量は、少なくとも約５．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0048】

特定の実施形態では、治療有効量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも約１５．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0049】

特定の実施形態では、治療有効量は、少なくとも約４５．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0050】

特定の実施形態では、治療有効量は、少なくとも約８０．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0051】

さらなる実施形態では、組成物は、５０：５０のＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０に対するＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液中で製剤化される。

【0052】

特定の実施形態では、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象を、本明細書で企図される組成物で治療する方法が提供される。

【0053】

特定の実施形態では、対象は、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する。

【0054】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法が提供され、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約５～約７日間、形質導入されたＴ細胞を培養して増殖させることを含み、前述の工程はＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入され、約１０日間培養されて増殖したＴ細胞に比べて、培養されたＴ細胞において少なくとも１．５倍または少なくとも２倍多い。

【0055】

特定の実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法が提供され、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約５～約７日間、形質導入されたＴ細胞を培養して、増殖させることを含み、前述の工程はＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または全ての遺伝子発現は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入され、約１０日間培養されて、増殖したＴ細胞に比べて、培養されたＴ細胞において少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない。

【0056】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法が提供され、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約５～約７日間、形質導入されたＴ細胞を培養して、増殖させることを含み、前述の工程はＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入され、約１０日間培養されて、増殖したＴ細胞に比べて、培養されたＴ細胞において、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現は、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはすべての遺伝子発現は、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない。

【0057】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法が提供され、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させることと、配列番号 １に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約５～約７日間、形質導入されたＴ細胞を培養して、増殖させることを含み、前述の工程は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、増殖した細胞は、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋である。

【0058】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0059】

さらなる実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0062】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0063】

追加的実施形態では、ＣＤ２７^＋細胞は、ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋である。

【0064】

さらなる実施形態では、ＣＤ２７^＋細胞は、ＬＥＦ１^＋、ＣＣＲ７^＋、およびＴＣＦ１^＋である。

【0065】

特定の実施形態では、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0066】

特定の実施形態では、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
Ｔ細胞を含む。

【0067】

追加的実施形態では、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0068】

特定の実施形態では、Ｔ細胞は自己である。

【0069】

追加的実施形態において、方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴ細胞の供給源として単離することをさらに含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から単離される。

【0071】

特定の実施形態では、対象は、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する。

【0072】

特定の実施形態では、方法は、活性化及び刺激の前にＰＢＭＣを凍結保存することをさらに含む。

【0073】

さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、凍結保存された増殖培養物である。

【0074】

さらなる実施形態において、Ｔ細胞は活性化され、約１８～約２４時間増殖するようシミュレーションされる。

【0075】

特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む。

【0076】

特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、可溶性である。

【0077】

追加的実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、表面に結合する。

【0078】

いくつかの実施形態では、表面は、ビーズ、任意に常磁性ビーズである。

【0079】

さらなる実施形態では、Ｔ細胞を刺激することは、Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む。

【0080】

特定の実施形態では、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片は、可溶性である。

【0081】

追加的実施形態では、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片は、表面に結合する。

【0082】

いくつかの実施形態では、表面は、ビーズであり、任意に常磁性ビーズであり、任意に抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片に結合される常磁性ビーズである。

【0083】

特定の実施形態では、細胞は、ＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターで形質導入される。

【0084】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 ２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

【0085】

さらなる実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。

【0086】

様々な実施形態において、養子細胞療法において、ＣＤ４^＋ ＴＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を増加させる方法が提供され、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤にｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、ＣＤ４^＋ ＴＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数は、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも２倍多い。

【0087】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0088】

追加的実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0090】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0091】

さらなる実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む。

【0092】

特定の実施形態では、Ｔ細胞は自己である。

【0093】

特定の実施形態において、方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴ細胞の供給源として単離することをさらに含む。

【0094】

追加的実施形態において、ＰＢＭＣは、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から単離される。

【0095】

いくつかの実施形態では、対象は、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する。

【0096】

さらなる実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターを含む。

【0097】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 １に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0098】

追加的実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 ２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

【0099】

いくつかの実施形態では、本明細書で企図される薬学的に許容可能な賦形剤および治療有効量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物が提供される。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書で企図される薬学的に許容可能な賦形剤および治療有効量のＣＤ４^＋ ＴＣＭ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ 抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物が提供される。

【0101】

特定の実施形態では、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象を治療する方法は、本明細書で企図される組成物を投与することを含む。

【0102】

さらなる実施形態では、対象は、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する。

【0103】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞における（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの遺伝子発現を増加させる方法が提供され、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの遺伝子発現は、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍多い。

【0104】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞における（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現を減少させる方法が提供され、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現は、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍少ない。

【0105】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞における（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの遺伝子発現を増加させ、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現を減少させる方法が提供され、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの遺伝子発現は、少なくとも１．５倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ
２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現は、少なくとも１．５倍少ない。

【0106】

いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性を増加させる方法が提供され、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ
ｖｉｖｏで接触させることを含み、治療有効性の増加は、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現の増加が、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍多いことにより示される。

【0107】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性を増加させる方法が提供され、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、治療有効性の増加は、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２ およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現の減少が、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍少ないことにより示される。

【0108】

いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性を増加させる方法が提供され、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ
ｖｉｖｏで接触させることを含み、治療有効性の増加は、約１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現の増加が少なくとも１．５倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現の減少が少なくとも１．５倍少ないことにより示される。

【0109】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象に由来する。

【0110】

追加的実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する対象に由来する。

【0111】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターを含む。

【0112】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 １に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0113】

さらなる実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号 ２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

【0114】

いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は自己である。

【0115】

特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。

【図面の簡単な説明】

【0116】

【図1】図１は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を有するＴ細胞培養物の長さが、Ｔ細胞表現型を調節することを示す。ＰＩ３Ｋ阻害剤の非存在下で抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造するために五つの多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットを使用したか、または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入後７日または１０日間、ＰＩ３Ｋ阻害剤と培養した。７日目および１０日目に、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ４５ＲＡに対する抗ヒト抗体でＴ細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。各ドットプロットを、生存ＣＤ３^＋リンパ球上でゲーティングした。

【図2】図２は、１０日間の培養と比較して、ＰＩ３Ｋ阻害剤と７日間の培養後に、Ｔ細胞がより強力な表現型を示すことを示す。五つの多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を７日間または１０日間製造した。７日目および１０日目に、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、およびＴＩＭ３に対する抗ヒト抗体でＴ細胞を染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。各ドットプロットを、生存ＣＤ３^＋リンパ球上でゲーティングした。

【図3】図３は、ＰＩ３Ｋ阻害剤中で７日間製造されたＴ細胞が、ＣＤ２７^＋Ｔ細胞を富化していることを示す。五つの多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。７日目および１０日目に、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２７に対する抗ヒト抗体でＴ細胞を染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。ＶＩＳＮＥプロットは、異なる細胞集団におけるＣＤ２７ゲーティングされた発現を示す。

【図4A】図４Ａ～Ｂは、１０日間の培養と比較して、ＰＩ３Ｋ阻害剤と７日間の培養後に、Ｔ細胞がより強力な表現型を示すことを示す。五つの多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を７日間または１０日間製造した。７日目および１０日目に、（１）ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＴＩＭ３（図４Ａ）またはＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ７０、ＣＤ２４４、およびＰＤ－１（図４Ｂ）に対する抗ヒト抗体でＴ細胞を染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。ＶＩＳＮＥプロットは、７日間の培養（上段）および１０日間の培養（下段）における異なるＴ細胞表現型マーカーの発現を示す。ゲーティングされた集団は、ＣＤ２７^＋細胞を表す。

【図4B】同上。

【図5】図５は、ＰＩ３Ｋ阻害剤に１０日間製造されるＣＤ２７^＋Ｔ細胞が、ＰＩ３Ｋ阻害剤に７日間製造されるＴ細胞と比較して、活性化の減少および消耗の増加によって特徴付けられることを示す。五つの多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を７日間または１０日間製造した。ＶＩＳＮＥ分析によって特定されたＣＤ２７^＋Ｔ細胞を、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２５、およびＴＩＭ３に対する抗ヒト抗体で７日目および１０日目に染色し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（上）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（下）中のＣｙＴＯＦによって分析した。

【図6】図６は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞製造の持続時間の結果としての差示的遺伝子発現を示す。多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤の非存在下で、７日間（１）または１０日間（１３）、またはＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で７日間（１０）または１０日間（６）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。ＲＮＡをＴ細胞から抽出し、転写プロファイルをナノストリング免疫学パネルを使用して分析した。製造条件間の差次的に発現された上位５０個の遺伝子のヒートマップを示す。

【図7】図７は、ＰＩ３Ｋ阻害剤に１０日間製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＰＩ３Ｋ阻害剤に７日間製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の能力の増加を示す。健康なドナーのＰＢＭＣを活性化し、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ＩＬ－２およびＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で６日間（７日間のプロセス）または９日間（１０日間のプロセス）増殖させた。養子細胞療法の１０日前に、ＮＳＧマウスに、２×１０^６個のホタルルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞を静脈内注射した。マウスに２．５、５、または１０×１０^６個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ^＋ Ｔ細胞、またはビヒクルで形質導入されたＴ細胞を注射した。腫瘍負荷を発光によって監視した。

【図8】図８は、ＰＩ３Ｋの存在下で製造されたＴ細胞が、ＣＤ２７^＋ＣＤ４^＋ＴＣＭ様細胞およびＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋ＴＳＣＭ様細胞について富化されていることを示す。ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、約３６個のＴ細胞表現型抗体のパネルで染色し、ＣｙＴＯＦで分析した。ナイーブＴ細胞（Ｔｎａｉｖｅ）、中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）、エフェクターＴ細胞（ＴＥｆｆ）、および幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）を示す。提示されたデータは、Ｔ細胞サブセットに対するＣＤ２７^＋富化細胞の％の関数として分析された各ＤＰロットを示す。

【図9】図９は、ＦｌｏｗＳＯＭを用いて分析した図９からのＣＤ８^＋Ｔ細胞データを示す。ＦｌｏｗＳＯＭは、２０個の別個のＴ細胞クラスターを特定した。クラスター４（メモリーＴ細胞マーカーに富化された － 良好）およびクラスター５（エフェクターＴ細胞マーカーに富化された － 不良）に基づいて、Ｔ細胞の主要三つの群を特定した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療を受けた対象の％ＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、製造方法、および臨床応答が示されている。

【図10】図１０は、７日間または１０日間のＰＩ３Ｋ製造プロセスを使用して、多発性骨髄腫細胞ロットから製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の差示的遺伝子発現解析を示す。ＲＮＡを１２ロットの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞から抽出し、転写プロファイルをナノストリング免疫学パネルを使用して分析した。上位２５個の差次的に発現された遺伝子のうち７日～１０日の製造プロセス間のヒートマップを示す。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療を受けた対象の％ＣＤ２７^＋細胞、製造方法、および臨床応答が示されている。

【図11】図１１Ａは、非持続性の応答者と比較して、持続性の応答者における抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞医薬品中のｃｙＴＯＦ染色されたＴ細胞集団のｖｏｌｃａｎｏプロットを示す。このプロットは、持続性のある応答者および非持続性の応答者の間の細胞組成における最も顕著な差異が、ナイーブおよび幹細胞メモリーＴ細胞であることを示している。一般化線形モデル係数は、Ｘ軸上およびＹ軸上のｐ値上に示される。 図１１Ｂは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞医薬品中のＣＤ４ ＴＳＣＭ（上側パネル）およびＣＤ８ ＴＳＣＭ（下側パネル）の割合の、持続性のある応答者と非持続性の応答者とを比較した箱ひげ図を示す。ＴＳＣＭ細胞は、持続的な応答を有する患者の医薬品に富化された。

【図12】図１２Ａは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞医薬品中のＣＤ４（左上パネル）およびＣＤ８（上中央パネル）Ｔ細胞におけるＣｙＴＯＦによって決定されたＬＥＦ－１発現の割合の、持続性のある応答者と非持続性の応答者とを比較した箱ひげ図を示す。ＬＥＦ－１発現細胞の割合、ならびにＬＥＦ－１の遺伝子発現は、非持続性応答者と比較して持続性応答者において増加しており、これらの医薬品における初期メモリーＴ細胞の富化を示す。 図１２Ａは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療の２ヵ月後の患者ｓＢＣＭＡレベルと、医薬品におけるＬＥＦ－１遺伝子発現の相関を示す。これらのデータは、医薬品の早期記憶表現型と治療応答の深度との間の関連を示す。

【図13】図１３は、ＰＢＭＣ中および抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＤＰ）中のＣｙＴＯＦによって決定される、ＣＣＲ７（左上のパネル）、ＬＥＦ１（上中央パネル）、およびＣＤ５７（右上パネル）を発現するＣＤ３＋生細胞の割合を示す。図１３はさらに、ｘ軸上に抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を注入した後の様々な時点で全血から抽出されたＣＤ３＋細胞上のＰＣＲによって決定された最大ベクターコピー数（ＶＣＮ）に対して、ｙ軸上にＣＣＲ７（図１３、左下パネル）、ＬＥＦ－１（図１３、中央下パネル）、およびＣＤ５７（図１３、右下パネル）を発現するＣＤ３＋生細胞の割合を示す。

【図14】図１４は、ＣＤ５７（老化のマーカー）、クラスター化ヒートマップとして、ＬＥＦ－１、ＣＣＲ７、およびＣＤ２７（メモリー細胞）を発現するＣＤ３＋生細胞の割合を示す。データは、平均連鎖階層クラスタリングを使用してグループ化され、クラスターの樹状図によって決定される上位三つのクラスターは、６ヵ月時点で患者の臨床応答と関連していた。

【発明を実施するための形態】

【0117】

配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのアミノ酸配列を記載する。

【0118】

配列番号２は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を明記する。

【0119】

前述の配列において、Ｘは、存在する場合、任意のアミノ酸またはアミノ酸の非存在を指す。

【0120】

詳細な説明
Ａ．概要
本発明は概して、Ｔ細胞組成物を製造するための改善された方法に関する。Ｔ細胞療法は５年前よりも一般的であるが、これらの療法が直面する障害は依然として、特に、有効性が乏しいまたは最適以下の能力であることである。溶液は、細胞療法産物、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞産物の能力を著しく増加させる、本発明の製造方法によって提供される。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、発明者らは、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用したＴ細胞製造期間の短縮が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用したより長い期間の製造プロセスと比較して、細胞用量の減少および細胞能力および持続性の増加のさらなる改善を可能にすることを、予想外に発見した。驚くべきことに、より短いＰＩ３Ｋ阻害剤ベースのプロセスを使用して製造された改善された医薬品は、ＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）およびＣＤ２７^＋ＣＤ４^＋中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の富化集団を有する。特定の実施形態では、より短いＰＩ３Ｋ阻害剤ベースのプロセスを使用して製造される改善された医薬品は、ＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞の富化集団を有する。製造された細胞はその後、分化し、持続的な免疫エフェクター細胞機能を提供することができる。

【0121】

医薬品表現型解析および遺伝子発現解析はまた、臨床医が特定の医薬品がどのように機能するかの可能性を決定することを可能にする。富化されたＴ細胞はまた、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー２（ＮＲ４Ａ２）、ＣＤ２２９（ＬＹ９）、Ｌｉｎ－７相同体Ａ（ＬＩＮ７Ａ）、ウイングレス型ＭＭＴＶ統合部位ファミリー、メンバー５Ｂ（ＷＮＴ５Ｂ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫６（ＢＣＬ６）、早期増殖応答１（ＥＧＲ１）、早期増殖応答２（ＥＧＲ２）、活性化転写因子３（ＡＴＦ３）、およびＣ－Ｃモチーフケモカイン１（ＣＣＬ１）、インターロイキン１Ａ（ＩＬ－１Ａ）、およびＣ－Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）の一つ以上の遺伝子発現の増加を含み、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンデヒドロゲナーゼ１（ＮＱＯ１）、ＣｙｃｌｉｎＡ１（ＣＣＮＡ１）、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ１７Ｆ）、上皮膜タンパク質１（ＥＭＰ１）、Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ Ｈｏｓｔ Ｇｅｎｅ１９（ＳＮＨＧ１９）、プロリンリッチ２２（ＰＲＲ
２２）、免疫グロブリン様ドメイン含有受容体２（ＩＬＤＲ２）、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有 ３（ＡＴＡＤ３）、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）およびＷＤ リピートドメイン６２（ＷＤＲ６２）の一つ以上の遺伝子発現の減少を含む。

【0122】

特定の実施形態では、富化されたＴ細胞は、ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの一つ以上の遺伝子発現の増加を含み、ならびに ＮＱＯ１およびＮＫＤ２の一つ以上の遺伝子発現の減少を含む。

【0123】

様々な実施形態において、養子細胞療法の能力を増加させるＴ細胞を製造する方法が提供される。特に好ましい実施形態では、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞組成物は、操作された細胞の能力を増加させるのに十分な条件下で、ある期間、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤（例えば、ＺＳＴＫ４７４（ＣＡＳ ＮＯ．４７５１１０－９６－４）の存在下で製造される。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で活性化および刺激され（約２４時間、１８～２４時間）、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下でＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで形質導入され（約２４時間、１８～２４時間）、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で、形質導入後約４日間または約６日間（例えば、６日間または合計８日間）増殖される。

【0124】

様々な実施形態では、５日間のＴ細胞の製造プロセスは、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で、Ｔ細胞を活性化および刺激し（約２４時間、１８～２４時間）、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで細胞を形質導入し（約２４時間、１８～２４時間）、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で、約４日間（例えば、合計６日間）細胞を増殖する。

【0125】

様々な実施形態では、７日間のＴ細胞の製造プロセスは、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で、Ｔ細胞を活性化および刺激し（約２４時間、１８～２４時間）、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで細胞を形質導入し（約２４時間、１８～２４時間）、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で、約６日間（例えば、合計８日間）細胞を増殖する。

【0126】

特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化または能力のある遺伝子の発現を増加させる方法、および／またはＴ細胞分化または消耗遺伝子の発現を減少させる方法が企図される。本明細書で企図される製造されるＴ細胞組成物は、癌、例えば、血液悪性腫瘍の少なくとも一つの症状の治療、予防、または改善に有用である。

【0127】

様々な実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で製造されたＣＤ２７^＋富化抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ｃＧＭＰ）製造組成物が企図される。特定の実施形態では、より短い５日または７日の製造プロセスは、ＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、ＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の富化された集団を生成する。

【0128】

様々な実施形態では、ＣＤ２７^＋富化ＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ様Ｔ細胞およびＣＤ２７^＋富化ＣＤ４^＋ ＴＣＭ様Ｔ細胞の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞組成物が企図される。

【0129】

様々な実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で製造されたＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋富化抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ｃＧＭＰ）製造組成物が企図される。特定の実施形態では、富化された集団はまた、ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0130】

様々な実施形態では、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋富化ＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ様Ｔ細胞およびＣＤ２７^＋ および／またはＬＥＦ１^＋ および／またはＣＣＲ７^＋ および／またはＴＣＦ１^＋富化ＣＤ４^＋
ＴＣＭ様Ｔ細胞の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞組成物が企図される。

【0131】

したがって、本明細書において企図される方法および組成物は、既存の養子細胞療法と比較して、量的改善を表す。

【0132】

組み換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成、免疫アッセイ、組織培養、形質変換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製ならびに関連する技術および手法は、本明細書を通じて引用され、考察される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学における様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように一般的に行われてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ、１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ）；Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ、Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００９、Ｃａｉｓｔｅｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＵＫ；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ、Ｅｄ．、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｅｄ．、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ、２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ、Ｅｄ．、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ
Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ｅｄｓ．、１９８６）；Ｒｏｉｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、ｅｄｓ．、１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびに例えばＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの雑誌の研究論文を参照のこと。

【0133】

Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書で使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。

【0134】

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似した、または均等の方法および材料を、特定の実施形態の実施または検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法および材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。

【0135】

「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」といった冠詞は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の一つまたは複数（すなわち少なくとも一つ）を指すために使用される。例示として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、一つの要素、または一つもしくは複数の要素を意味する。

【0136】

本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに対し、３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。特定の実施形態では、数値に先行する場合の用語「約」または「およそ」は、１５％、１０％、５％、または１％の範囲を加減する値を示す。

【0137】

本明細書において使用される場合、「実質的に」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じである効果、例えば、生理学的効果を生じる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。

【0138】

本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」は、規定される工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群を含むことを暗示するが、任意の他の工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群を除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「～からなる」とは、語句「からなる」に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。ゆえに、「～からなる」という文言は、列記される要素が必要または義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、および列記される要素に関して本開示中に特定される活性もしくは作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。ゆえに、「本質的に～からなる」という文言は、列記される要素が必須または義務であり、しかし列記される要素の活性または作用に実質的に影響を与えるかどうかに依存して、他の要素が任意であり、存在するまたは存在し得ないことを示す。

【0139】

本明細書全体を通じて「一つの実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造または特徴が、少なくとも一つの本発明の実施形態に含まれることを意味する。ゆえに本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに特定の性質、構造または特徴は、一つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされ得る。

【0140】

本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞製造」または「Ｔ細胞の製造方法」または同等の用語は、Ｔ細胞の治療用組成物を作製するプロセスを指し、この製造方法は、採取、刺激、活性化、形質導入、および増殖の工程のうちの一つ以上、またはすべてを含んでもよい。好ましい実施形態では、増殖は、形質導入後、５日～７日以下である。５日間のＴ細胞製造プロセスは、０日目の活性化および刺激、１日目の形質導入、および５日目の終了時までの増殖を含む。７日間のＴ細胞製造プロセスは、０日目の活性化および刺激、１日目の形質導入、および７日目の終了時までの増殖を含む。１０日間のＴ細胞製造プロセスは、０日目の活性化および刺激、１日目の形質導入、および１０日目の終了時までの増殖を含む。好ましい実施形態では、Ｔ細胞製造方法は、製造プロセス全体を通してＰＩ３Ｋの使用を含む。

【0141】

本明細書で使用される場合、用語「ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、ＰＩ３Ｋの少なくとも一つの活性に結合し、かつ阻害する小さな有機分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、およびクラス３のＰＩ３Ｋの三つのクラスに分けることができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、四つのｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ）のうちの一つと、二つの制御サブユニットファミリーのうちの一つとからなるヘテロ二量体として存在する。特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の一つ以上のアイソフォームに対する選択性を示す（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γまたはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γの一つ以上に対する選択性）。特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はアイソフォーム選択性を示さず、“汎ＰＩ３Ｋ阻害剤”とみなされる。

【0142】

「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当分野において認識されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞などのＴヘルパー（Ｔｈ）細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞障害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞、または任意の他のサブセットのＴ細胞であり得る。好ましくは、製造されたＴ細胞は、ＣＤ２７^＋Ｔ細胞、ＣＤ２７^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞、および／またはＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞が富化されている。特定の好ましい実施形態では、製造されたＴ細胞は、ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞ならびに／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞ならびに／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が富化されている。特定の好ましい実施形態では、製造されたＴ細胞は、ＣＤ２７^＋ ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ２７^＋ ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ２７^＋ ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が富化されている。より好ましくは、製造されたＴ細胞は、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）および中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が富化されている。

【0143】

“強力なＴ細胞”および“若いＴ細胞”は、特定の実施形態では互換的に使用され、Ｔ細胞が増殖能力を有し、かつ同時に分化が減少するＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態では、若いＴ細胞は、ナイーブＴ細胞ＴＳＣＭまたはＴＣＭの表現型を有する。様々な実施形態において、本明細書に企図される製造方法は、より強力なＴ細胞、例えば、ナイーブＴ細胞、ＴＳＣＭ、またはＴＣＭを産生する。特定の実施形態では、若いＴ細胞は、以下の生物学的マーカーのうちの一つ以上、または全てについて富化される：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ３８。

【0144】

本明細書で使用される場合、用語「増殖」は、細胞の対称的または非対称的な分裂のいずれかである、細胞分裂の増加を指す。特定の実施形態では、“増殖”は、Ｔ細胞の対称または非対称の分裂を指す。“増殖の増加”は、未処理試料中の細胞と比較して、処理済み試料中の細胞数が増加する場合に起こる。

【0145】

本明細書で使用される場合、用語「分化」は、細胞の能力または増殖を減少させるか、または細胞をより発生的に制限された状態に移動する方法を指す。特定の実施形態では、分化されたＴ細胞は、免疫エフェクター細胞機能を取得する。

【0146】

「免疫エフェクター細胞」は、一つ以上のエフェクター機能（例えば細胞傷害性の細胞殺傷活性、サイトカイン分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導など）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書において企図される免疫エフェクター細胞の例示は、Ｔリンパ球であり、特に細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）である。

【0147】

「改変Ｔ細胞」は、本明細書で企図されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの導入によって改変されたＴ細胞を指す。改変Ｔ細胞には、遺伝子改変および非遺伝子改変（例えば、エピソームまたは染色体外）の両方が含まれる。

【0148】

本明細書において使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝的に改変された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の追加的な遺伝物質を、細胞中の総遺伝物質に加えることを指す。

【0149】

「遺伝的に改変された細胞」、「改変細胞」、および「再指向化細胞」という用語は、相互交換可能に使用される。

【0150】

本明細書で使用される、用語「遺伝子療法」は、遺伝子の発現を回復するか、修正するか、または改変する細胞において、または治療用ポリペプチド、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲおよび／または一つ以上のサイトカインを発現させる目的で、余剰な遺伝物質を総遺伝物質に導入することを指す。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲを細胞に発現するエピソームベクターを細胞内に導入することによって、細胞のゲノムを改変することなく、ＣＡＲを発現するように改変される。

【0151】

用語「生体外での」は、一般的に、生物の外側の、好ましくは、自然条件の最小限の変化を伴う、人工環境で行われる実験もしくは測定または生きている組織での実験もしくは測定などの、生物の外側の場所で生じる活動を指す。特定の実施形態では、「生体外での」手法は、生物から採取され、実験装置で、通常、無菌条件下で、典型的には、数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８時間または７２時間培養されるか、または調節される生きた細胞または組織を含む。ある特定の実施形態では、このような組織または細胞は、収集され、凍結され、その後、生体外での処置のため融解することができる。生きた細胞または組織を使用して数日以上継続する組織培養実験または手法は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、生体外と互換的に使用され得る。

【0152】

用語「インビボ」は、一般的に、自己再生および細胞の増殖等の生物の内部で生じる活動を指す。一実施形態では、用語「インビボ増殖」は、インビボで数を増加させる細胞集団の能力を指す。

【0153】

用語「刺激」は、その同族リガンドとの刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）の結合によって誘導される一次応答を指し、それによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達を含むがこれに限定されないシグナル伝達イベントを媒介する。

【0154】

“刺激分子”は、同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。

【0155】

本明細書で使用される場合、「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在するとき、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称される）と特異的に結合することができ、それによって、Ｔ細胞による一次応答を媒介し、限定されるものではないが、活性化、免疫反応の開始、増殖等を含む。刺激リガンドには、ＣＤ３リガンド、例えば抗ＣＤ３抗体およびＣＤ２リガンド、例えば、抗ＣＤ２抗体、およびペプチド、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

【0156】

用語「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。特定の実施形態では、活性化はまた、誘発サイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能と関連し得る。用語「活性化Ｔ細胞」は、とりわけ、増殖しているＴ細胞を指す。ＴＣＲのみを通じて生じたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不充分であること、および一つ以上の二次シグナルまたは共刺激性シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体による一次刺激シグナルおよび一つ以上の二次共刺激シグナルを含む。共刺激は、ＣＤＣＤ３／ＴＣＲ複合体またはＣＤ２を介した刺激など、一次活性化シグナルを受けているＴ細胞による増殖および／またはサイトカイン産生によって証明され得る。

【0157】

「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせたシグナルを指し、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および／または特定の分子（例えば、ＣＤ２８）の上方制御または下方制御をもたらす。

【0158】

「共刺激リガンド」は、共刺激分子に結合する分子を指す。共刺激性リガンドは、可溶性であってもよく、または表面に提供されてもよい。「共刺激分子」は、共刺激リガンド（例えば、抗ＣＤ２８抗体）と特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。

【0159】

本明細書において使用される場合、「自己」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書において使用される場合、「同種」とは、比較した細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書において使用される場合、「同系」とは、比較した細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書において使用される場合、「異種」とは、比較した細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本明細書に企図される方法によって製造される細胞は自己である。

【0160】

本明細書において使用される場合、「個体」および「対象」という用語はしばしば相互交換可能に使用され、本明細書において他の場所で開示される遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および方法で治療され得る癌の症状を呈する任意の動物を指す。適切な対象（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ、ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者も含まれる。典型的な対象としては、癌もしくは癌と診断された、またはそのリスクのある、または癌を有するヒト患者が挙げられる。

【0161】

本明細書で使用される場合、用語「患者」は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および本明細書の他の場所で開示される方法を用いて治療され得る特定の適応症と診断された対象を指す。

【0162】

本明細書において使用される場合、「治療」または「治療すること」には、疾患の症状もしくは病理、または病的状態に対する何らかの有益な効果または望ましい効果が含まれ、治療される疾患もしくは病態、例えば癌の一つ以上の測定可能なマーカーの最小の減少であっても含まれ得る。治療には、任意で、疾患もしくは病態の症状の減少または緩和、または疾患もしくは病態の進行の遅延のいずれかが含まれてもよい。「治療」は必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な排除または治癒を示すものではない。

【0163】

本明細書において使用される場合、「予防する」、および例えば「予防される」、「予防すること」といった類似の文言は、疾患もしくは病態、例えば癌の予防、阻害、または発生もしくは再発の可能性の低下を目的としたアプローチを示す。さらに、疾患もしくは状態の発生または再発の遅延、または疾患もしくは状態の症状の発生または再発の遅延も指す。本明細書において使用される場合、「予防」およびその類似文言も、疾患もしくは症状の発生または再発の前の、疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および／または負荷量の低下を含む。

【0164】

本明細書において使用される場合、「癌」という用語は概して、異常な細胞が制御されずに分裂し、近傍組織へと浸潤し得る、ある種の疾患または状態に関連する。

【0165】

本明細書において使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞群が制御不能な増殖（すなわち正常限界を超える分裂）、浸潤（すなわち隣接組織への侵入と破壊）、および転移（すなわちリンパまたは血液を介して身体の他の場所へ拡散）のうちの一つ以上を呈する癌を指す。本明細書において使用される場合、「転移する」という用語は、身体の一部分から、別の部分へと癌が拡散することを指す。拡散された細胞により形成された腫瘍は、「転移腫瘍」または「転移癌」と呼ばれる。転移腫瘍は、元の腫瘍（原発腫瘍）の細胞と似た細胞を含有する。

【0166】

本明細書において使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長し得るが、身体の他の部分に拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、多くの場合、浸潤せず、または転移しない。

【0167】

「癌細胞」または「腫瘍細胞」とは、癌性増殖または癌性組織の個々の細胞を指す。「腫瘍」は概して、細胞の異常な増殖による膨張、または細胞の異常な増殖により形成された病変を指し、良性、前癌性、または悪性であり得る。殆どの癌は腫瘍を形成するが、なかには必ずしも腫瘍を形成するわけではない。腫瘍を形成する癌について、癌（細胞）という用語、および腫瘍（細胞）という用語は相互交換可能に使用される。個体中の腫瘍の量は、「全身腫瘍組織量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）」であり、腫瘍の数、体積または重量として測定することができる。

【0168】

「強化する」、または「促進する」、または「増加する」、または「拡張する」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクルまたは対照の分子／組成物による反応と比較して、大きな生理学的反応（すなわち下流効果）をもたらす、惹起させる、または発生させる能力を指す。測定可能な生理学的反応としては特にＴ細胞の拡張、活性化、持続性、および／または癌細胞死殺傷能力の増加が挙げられ、当分野および本明細書の記載の理解から明白である。「増加した」または「強化された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる反応の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０またはそれ以上（例えば５００倍、１０００倍）（その間および１を超えるすべての整数および小数点を含む、例えば１．５、１．６、１．７、１．８など）である増加を含む場合がある。

【0169】

「減少する」、または「下げる」、または「低める」、または「低下する」、または「弱める」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクルまたは対照の分子／組成物による反応と比較して、小さな生理学的反応（すなわち下流効果）をもたらす、惹起させる、または発生させる能力を指す。「減少」または「低減した」量は、典型的には、「統計上有意な」量であり、ビヒクル、または対照組成物により生じる応答（参照の応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（中間の全ての整数および小数点、１以上、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含み得る。

【0170】

「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化がない」、または「実質的な変化がない」、または「実質的な減少が無い」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクル、または対照の分子／組成物のいずれかにより生じた反応と比較して、細胞において類似した生理学的反応（すなわち、下流効果）をもたらす、惹起させる、または生じさせる能力を指す。同等の反応は、基準反応と実質的に違わない、または測定可能な程度に違わない反応である。

【0171】

「抗原（Ａｇ）」とは、動物へ注射される、または動物に吸収される組成物（例えば腫瘍特異的タンパク質を含む組成物など）を含む、動物において抗体産生またはＴ細胞反応を刺激し得る化合物、組成物または物質を指す。抗原は、例えば本開示抗原などの異種抗原により誘導される産物を含む、特異的な液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。「標的抗原」または「標的抗原または対象」は、本明細書に予期されるＣＡＲの結合ドメインが結合するよう設計された抗原である。

【0172】

「エピトープ」または「抗原性決定基」とは、結合物質が結合する抗原の領域を指す。

【0173】

「ポリペプチド」「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、反対であることが明記されない限り、従来的な意味、すなわちアミノ酸配列として相互交換可能に使用される。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えばポリペプチドは、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含有してもよく、ポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの翻訳後修飾を含んでもよく、ならびに当分野に公知の天然および非天然の他の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、様々な公知の組み換え技術および／または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。本明細書で企図されるポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書に開示されるＣＡＲの一つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を有する配列を特異的に包含する。特定の実施形態では、用語「ポリペプチド」は、バリアント、断片、および融合ポリペプチドをさらに含む。

【0174】

本明細書において使用される場合、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチド分子またはポリペプチド分子のインビトロでの単離および／または精製を指す。すなわち、インビボでの物質と実質的に関連づけられていない。同様に、「単離細胞」は、インビボ組織または臓器から取得され、細胞外基質を実質的に含まない細胞を指す。

【0175】

ポリペプチドバリアントは、一つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入により、天然ポリペプチドとは異なっている場合がある。そうしたバリアントは、天然であってもよく、または例えば上述のポリペプチド配列の一つ以上を改変することにより合成的に生成されてもよい。例えば特定の実施形態では、一つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を結合ドメイン、ヒンジ、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインまたはＣＡＲポリペプチドの一次シグナル伝達ドメインに導入することにより、ＣＡＲの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。本発明のポリペプチドは、それに対する少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むことが好ましい。

【0176】

ポリペプチドには「ポリペプチド断片」が含まれる。ポリペプチド断片は、単量体または多量体であってもよく、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または自然発生的または組み換えにより産生されたポリペプチドの内部欠失または置換を有する、生物学的に活性なポリペプチドの断片を指す。ある実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約５００アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を含有し得る。ある実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０それ以上のアミノ酸の長さである。

【0177】

融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。

【0178】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される参照配列（例えば、配列表を参照のこと）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントが含まれ、典型的には、バリアントは、参照配列の少なくとも一つの生物学的活性を維持する。様々な例示的な実施形態において、本発明は、部分的に、発現ベクター、ウイルスベクター、およびトランスフェクトプラスミド、並びに組成物、並びにそれらを含む細胞を含むポリヌクレオチドを企図する。

【0179】

本明細書において使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」とは、自然状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを指し、例えば、通常では当該断片と隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。「単離ポリヌクレオチド」はさらに、自然界では存在せず、ヒトの手により作製された相補的ＤＡＮ（ｃＤＮＡ）、組み換えＤＮＡ、または他のポリヌクレオチドも指す。

【0180】

発現ベクター中に存在する「制御要素」、「制御配列」は、ベクターの非翻訳領域であり、複製起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’の非翻訳領域が挙げられ、宿主の細胞タンパク質と相互作用して、転写と翻訳を実行する。そうした因子は、その強度および特異性を変化させてもよい。利用するベクターシステムおよび宿主に応じて、ユビキタスプロモーターおよび誘導性プロモーターをはじめとする任意の数の適切な転写因子および翻訳因子を使用してもよい。

【0181】

「内因性」制御配列は、ゲノム中で所与の遺伝子と自然に連結される配列である。「外因性」制御配列は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。

【0182】

本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を開始させる。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で動作するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴ－リッチ領域、および／または転写開始部位から７０～８０塩基上流に存在する別の配列であるＣＮＣＡＡＴ領域を含有し、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。

【0183】

「エンハンサー」という用語は、転写の強化を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指し、一部の場合では、別の制御配列に対する方向性に関係なく機能することができる。エンハンサーは、プロモーター因子および／または他のエンハンサー因子と協働して、または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。

【0184】

「操作可能に連結した」という用語は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。一実施形態では、用語は、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第二のポリヌクレオチド配列、例えば、対象のポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。

【0185】

「ベクター」という用語は、本明細書において、もう一つの核酸分子を移送または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。

【0186】

追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。

【0187】

Ｃ．Ｔ細胞製造方法
本明細書に企図される方法によって製造されるＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物を提供する。本発明は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した既存の１０日間のＴ細胞製造プロセスと比較して、より強力なＴ細胞を生成する、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した５日～７日のＴ細胞製造プロセスを企図する。任意の特定の理論に束ねられることを意図するものではないが、本明細書に企図される方法によって製造されたＴ細胞組成物、例えば抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、より強力な（富化された）Ｔ細胞集団の数の増加を含むと考えられる。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日～７日の製造方法は、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日～７日の製造方法は、ＣＤ２７^＋およびＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日～７日の製造方法は、ＣＤ２７^＋およびＬＥＦ１^＋およびＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日～７日の製造方法は、ＣＤ２７^＋およびＬＥＦ１^＋およびＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日間～７日間の製造方法は、ＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）およびＣＤ２７^＋ＣＤ４^＋中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日間～７日間の製造方法は、ＬＥＦ１^＋ＣＤ８^＋幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）およびＬＥＦ１^＋ＣＤ４^＋中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日間～７日間の製造方法は、ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＣＤ８^＋幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）およびＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＣＤ４^＋中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日間～７日間の製造方法は、ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＣＣＲ７^＋ＣＤ８^＋幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）およびＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＣＣＲ７^＋ＣＤ４^＋中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日間～７日間の製造方法は、ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋ＣＤ８^＋幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）およびＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ ＴＣＦ１^＋ＣＤ４^＋中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の富化された集団をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で企図される５日間～７日間の製造方法は、ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＣＣＲ７^＋ＴＣＦ１^＋ＣＤ８^＋幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）およびＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＣＣＲ７^＋ＴＣＦ１^＋ＣＤ４^＋中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の富化された集団をもたらす。さらに、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した５日間～７日間のＴ細胞製造プロセスは、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した１０日間のプロセスで製造されたＴ細胞と比較して、差次的な遺伝子発現シグネチャーを含む。養子細胞療法、例えば、これらの富化された細胞集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法は、治療の有効性を含むことなく、臨床医が細胞用量を減少させ、細胞効力および持続性を増加させることを可能にする。

【0188】

様々な実施形態において、Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化すること、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、および形質導入したＴ細胞を培養して約４日～約６日間増殖させることを含み、全ての方法ステップは、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施される。

【0189】

本明細書に企図されるＴ細胞製造方法の特定の実施形態での使用に適したＰＩ３Ｋ阻害剤の例には、限定されるものではないが、ＢＫＭ１２０（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、ノバルティス社）、ＸＬ１４７（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、エキセリキシス社）、（汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、グラクソスミスクライン社）、およびＰＸ－８６６（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γアイソフォーム、オンコセリオン社）が含まれる。選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤のその他の例示的な例としては、限定されるものではないが、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ－２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ－１０１、ＺＳＴＫ４７４、およびＩＰＩ－１４５が挙げられる。汎ＰＩ３Ｋ阻害剤のさらなる例示的な例としては、限定されるものではないが、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、およびＧＤＣ－０９４１が挙げられる。

【0190】

本明細書で企図される最も好ましい実施形態では、製造方法は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４（ＣＡＳ ＮＯ．４７５１１０－９６－４）を使用する。

【0191】

様々な実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、製造プロセス全体を通して、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、または少なくとも１Ｍの濃度で使用される。

【0192】

好ましい実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、製造プロセス全体を通して約１μＭの濃度で使用される。

【0193】

Ｔ細胞は、限定されないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含むいくつかの源から取得することができる。ある実施形態では、Ｔ細胞は、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの沈殿作用といった当業者に公知の任意の数の技術を使用して対象から採取された血液ユニットから取得されることができる。

【0194】

特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、本明細書で企図されるＴ細胞製造方法においてＴ細胞の供給源として使用される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、またはＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋であり得るＴリンパ球の異種の集団を形成し、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞などの他の単核細胞を含み得る。

【0195】

好ましい実施形態では、Ｔ細胞製造プロセスは、個体の循環血液からＰＢＭＣの供給源をアフェレーシスにより得ることから始まる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一つの実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理のために細胞を適切な緩衝液または培地に定置してもよい。細胞は、ＰＢＳ、またはカルシウム、マグネシウム、および他の全ての二価カチオンではないにしてもほとんどの二価カチオンを欠く別の適切な溶液で洗浄することができる。当業者であれば理解するように、洗浄工程は、半自動フロースルー遠心分離器を使用することなど、当業者に周知の方法によって達成され得る。例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、または類似のものが挙げられる。洗浄後、細胞は、緩衝液と共に、または緩衝液なしで、様々な生体適合性緩衝液または他の生理食塩水中に再懸濁されてもよい。特定の実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分は、細胞中で直接再懸濁培地中で除去されてもよい。Ｔ細胞製造の方法は、２０１６年１０月２５日に出願された“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ”と題する米国特許出願第１５／３０６，７２９号、米国特許出願 ２０１６年１２月６日出願の“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”と題する米国特許出願第１５／３１６，７９２号、２０１８年６月７日に出願された“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ”と題する米国特許出願第１６／０６０，１８４号に開示され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、Ｔ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含む細胞の集団が、本明細書で企図される製造方法で使用される。他の実施形態では、単離された、または精製されたＴ細胞集団が本明細書で企図される製造方法に使用される。

【0196】

ＰＢＭＣは、Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、その中に含まれるＴ細胞集団を活性化および刺激するように処理されてもよい。特定の実施形態では、Ｔ細胞は一般的に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、および第６，８６７，０４１号に記載される方法を使用して活性化および拡張され得る。それら特許はその全体で参照により本明細書に援用される。

【0197】

好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、ＺＳＴＫ４７４の存在下で活性化され、刺激される。本明細書で意図される方法は、活性化および刺激の単一のラウンドのみが実施されるという点で既存の方法とは異なり、当分野の方法は、通常、活性化および増殖のラウンドを２回、３回、４回、または５回以上使用する。

【0198】

Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって、またはＣＤ２表面タンパク質を刺激することによって、一次共刺激シグナルを提供することによって達成され得る。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞を、適切なＣＤ３結合剤、例えばＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体に接触させることにより刺激されてもよい。ＣＤ３抗体の例示としては限定されないが、ＯＫＴ３、Ｇ１９－４、ＢＣ３および６４．１が挙げられる。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して提供される一次刺激シグナルに加えて、またはＣＤ２を介して、Ｔ細胞反応の誘導には二次的な共刺激性シグナルを必要とする。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤を使用して、共刺激性シグナルを提供してもよい。ＣＤ２８結合物質の例示としては限定されないが、天然ＣＤ２８リガンド、例えばＣＤ２８に対する天然リガンド（例えばタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー、例えばＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）；および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、またはＣＤ２８分子と交差結合することができるその断片、例えばモノクローナル抗体の９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、およびＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられる。

【0199】

好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、可溶性抗ＣＤ３抗体で活性化され、抗ＣＤ２８抗体で増殖するように刺激される。特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ８抗体は、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄなどの常磁性ビーズなどのビーズに固定、係留、または結合される。

【0200】

特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ８抗体は、細胞の表面に局在している。好ましい実施形態では、一次リガンドおよび共刺激性リガンド、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、ＰＢＭＣ画分に存在する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に提示される。

【0201】

特定の実施形態では、Ｔ細胞は、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、または約３０時間、活性化および刺激される。特定の実施形態では、約２４時間、Ｔ細胞は活性化され、刺激される。

【0202】

特定の実施形態では、Ｔ細胞は、約１６時間～約３０時間、約１６時間～約２４時間、約１８時間～約２４時間、または約２０時間～約２４時間にわたって活性化および刺激される。

【0203】

好ましい実施形態では、活性化および刺激工程に供される細胞は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、ＺＳＴＫ４７４の存在下で形質導入される。プロセスのこの工程の目的は、免疫エフェクター細胞を形質導入することであるが、他の細胞が存在し、形質導入されてもよく、例えば、ＰＢＭＣを出発物質として使用する場合、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、またはＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋は、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞などの他の単核細胞と同様に形質導入される。好ましい実施形態では、活性化および刺激されたＴ細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターで形質導入される。特定の実施形態において企図される特定の実施形態での使用に適したウイルスベクター系の例示としては限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターが挙げられる。

【0204】

好ましい実施形態では、細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで形質導入される。本明細書において使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合的なレトロウイルスの群（または属）を指す。レンチウイルスの例としては限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ－マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一つの実施形態では、ＨＩＶ－１をベースとしたベクター骨格（すなわちＨＩＶシス作用性配列因子）が好ましい。

【0205】

様々な実施形態では、本明細書に企図されるレンチウイルスベクターは、キメラ５’長末端リピート（ＬＴＲ）、例えば、キメラＣＭＶ／５’ＬＴＲプロモーター、および以下のアクセサリ要素の１つ以上または全て：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ（Ｚｅｎｎｏｕら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１：１７３）、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル（Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６９、Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１－２１０９）、排出要素、例えば、ＲＲＥ（Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎら、１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３）、ポリ（Ａ）配列、任意にＷＰＲＥ（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：２８８６）またはＨＰＲＥ（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３８６４）、絶縁体要素、選択マーカー、または細胞自殺遺伝子、および改変自己不活化（ＳＩＮ）３’ＬＴＲを含む。「自己不活性化型」（ＳＩＮ）ベクターとは、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー・プロモーター領域が１回目のウイルス複製以降のウイルス転写を防止するように（例えば欠失または置換によって）修飾されている、複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、小胞性口内炎ウイルスＧ－タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイプ化され、ベクターが広範囲の細胞に感染することを可能にする。ある実施形態では、レンチウイルスベクターは、公知の方法により産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－９－１０；Ｋｕｔｎｅｒら Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５－５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照のこと。

【0206】

特定の実施形態では、活性化および刺激の後、細胞は、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、または約３０時間、形質導入される。特定の実施形態では、細胞は約２４時間形質導入される。

【0207】

特定の実施形態では、活性化および刺激の後、細胞は、約１６時間～約３０時間、約１６時間～約２４時間、約１８時間～約２４時間、または約２０時間～約２４時間形質導入される。

【0208】

好ましい実施形態では、形質導入後、細胞は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばＺＳＴＫ４７４の存在下で、例えば、Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、または抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞、増殖を促進する条件下で培養される。予想外に、発明者らは、（形質導入後）１日、２日、３日、４日、５日、または６日の極端に短い増殖または増殖期間で、ＣＤ２７^＋細胞、ＴＣＭ、およびＴＳＣＭが富化された非常に強力な細胞療法産物が産生されることを発見した。

【0209】

特定の実施形態では、Ｔ細胞培養に適した条件または増殖培地には、適切な培地（例えばＭｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＭｅｄｉａまたはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ社））、および増殖と活性に必要な一つ以上の因子が含まれ、当該因子としては限定されないが血清（例えばウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ－αまたは当業者に公知の細胞増殖に適した任意の他の添加物が挙げられる。細胞培養培地のさらなる例示としては限定されないが、ＲＰＭＩ １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １ ５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ、それらにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミン類が添加され、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは所定のホルモンの組み合わせ、および／またはＴ細胞の増殖と拡張に充分な量のサイトカインが補充される。Ｔ細胞増殖のための他の添加剤の例には、限定されるものではないが、界面活性剤、血漿タンパク質分画、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝剤、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれる。

【0210】

好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中で、１、２、３、４、５、または６日間、増殖のために培養され、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、および５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ－ＶＩＶＯ １５で調製した。好ましい実施形態では、製造プロセスは、一つ以上のサイトカイン、好ましくはＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５、より好ましくはＩＬ－２の存在下で実施される。

【0211】

特定の実施形態では、細胞増殖または増殖期は、約１日～約６日、約２日～約６日、約３日～約６日、または約４日～約６日の間実施される。好ましい実施形態では、細胞増殖または増殖期は、約４日間～約６日間実施される。

【0212】

特定の実施形態では、細胞増殖または増殖期は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、または約６日間実施される。好ましい実施形態では、細胞増殖または増殖期は、約４日間実施される。特に好ましい実施形態では、細胞増殖または増殖期は、約６日間実施される。

【0213】

様々な実施形態において、Ｔ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ経路の一つ以上の阻害剤の存在下で製造される。阻害剤は、経路内の一つまたは複数の活性または単一の活性を標的としうる。いかなる特定の理論にも束ねられることを意図するものではないが、製造プロセスの刺激、活性化、および／または増殖期の間に、Ｔ細胞を、ＰＩ３Ｋ経路の一つまたは複数の阻害剤と処置または接触させることは、若いＴ細胞を優先的に増加させ、それによって優れた治療用Ｔ細胞組成物を産生することになる。

【0214】

様々な実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化すること、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、および形質導入したＴ細胞を培養して約４日～約６日間増殖させることを含み、全ての方法ステップは、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、増殖されたＣＡＲ Ｔ細胞は、形質導入細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤において、約９日間培養する製造プロセスに比べて、ＴＣＭおよびＴＳＣＭ細胞が富化している。

【0215】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、約４日～約６日の増殖または増殖培養することを含み、形質導入細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤において約９日間培養する製造プロセスに比べて、ＴＣＭ表現型を有するＣＤ４^＋ Ｔ細胞が約１．５倍、約２．０、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化し、ＴＳＣＭ表現型を有するＣＤ８^＋ Ｔ細胞が約１．５倍、約２．０、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化している。

【0216】

様々な実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化すること、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、ＣＡＲ、例えば、配列番号１（例えば配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約４日～約６日間、形質導入したＴ細胞を培養して増殖させることを含み、全ての方法ステップは、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、増殖されたＣＡＲ Ｔ細胞は、形質導入細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤において約９日間培養する製造プロセスに比べて、ＣＤ２７^＋細胞が富化している。

【0217】

特定の実施形態では、約４日～約６日間の増殖または増殖培養を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、形質導入細胞がＰＩ３Ｋ阻害剤で約９日間培養される製造プロセスと比較して、ＣＤ２７^＋ Ｔ細胞が約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化される。

【0218】

特定の実施形態では、約４日～約６日間の増殖または増殖培養を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、形質導入細胞がＰＩ３Ｋ阻害剤で約９日間培養される製造プロセスと比較して、１つ以上のＣＤ２７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＴＣＦ１、ＬＥＦ１、ＣＤ２８、および／またはＣＣＲ７発現Ｔ細胞の数が約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化または増加する。特定の実施形態では、約４日～約６日間の増殖または増殖培養を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、形質導入細胞がＰＩ３Ｋ阻害剤で約９日間培養される製造プロセスと比較して、１つ以上のＣＤ２７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＴＣＦ１、および／またはＬＥＦ１、および／またはＣＣＲ７発現Ｔ細胞の数が約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化または増加する。特定の実施形態では、約４日～約６日間の増殖または増殖培養を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、形質導入細胞がＰＩ３Ｋ阻害剤で約９日間培養される製造プロセスと比較して、１つ以上のグランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン、Ｔ－ｂｅｔ、およびＥＯＭＥＳを発現するＴ細胞の数が約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍減少する。

【0219】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号１（例えば配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約４日～約６日間、形質導入したＴ細胞を培養して増殖させることを含み、全ての方法の工程は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、増殖されたＴ細胞は、形質導入細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤において約９日間培養する製造プロセスに比べて、ＣＤ２７^＋ＣＤ４^＋ ＴＣＭおよびＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ細胞が富化している。

【0220】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、約４日～約６日の増殖または増殖培養することを含み、形質導入細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤において約９日間培養する製造プロセスに比べて、ＴＣＭ表現型を有するＣＤ２７^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞が約１．５倍、約２．０、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化し、ＴＳＣＭ表現型を有するＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が約１．５倍、約２．０、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化している。

【0221】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号１（例えば配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約４日～約６日間、形質導入したＴ細胞を培養して増殖させることを含み、全ての方法ステップは、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、増殖されたＴ細胞は、形質導入細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤において約９日間培養する製造プロセスに比べて、ＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋ および／またはＣＣＲ７^＋ および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＤ４^＋ ＴＣＭ およびＣＤ２７^＋ および／またはＬＥＦ１^＋ および／またはＣＣＲ７^＋ および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ細胞が富化している。

【0222】

特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、約４日～約６日の増殖または増殖培養することを含み、形質導入細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤において約９日間培養する製造プロセスに比べて、ＴＣＭ表現型を有するＣＤ２７^＋ および／またはＬＥＦ１^＋ および／またはＣＣＲ７^＋ および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＤ４^＋ Ｔ細胞が約１．５倍、約２．０、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化し、ＴＳＣＭ表現型を有するＣＤ２７^＋ および／または ＬＥＦ１^＋ および／または ＣＣＲ７^＋ および／または ＴＣＦ１^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が約１．５倍、約２．０、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍富化している。

【0223】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号 １（例えば、配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、形質導入されたＴ細胞を培養して、約４日～約６日間増殖させることを含み、方法の工程のすべてが、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、増殖Ｔ細胞の遺伝子発現シグネチャーが、核受容体サブファミリー４グループＡメンバー２（ＮＲ４Ａ２）、ＣＤ２２９（ＬＹ９）、Ｌｉｎ－７ホモログＡ（ＬＩＮ７Ａ）、ウィングレスタイプのＭＭＴＶ統合サイトファミリー、メンバー５Ｂ（ＷＮＴ５Ｂ）、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫６（ＢＣＬ６）、早期成長応答１（ＥＧＲ１）、早期成長応答２（ＥＧＲ２）、活性化転写因子３（ＡＴＦ３）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン１（ＣＣＬ１）、インターロイキン１Ａ（ＩＬ－１Ａ）、およびＣ－Ｃモチーフケモカイン５（ＣＣＬ５）の１つ以上またはすべての発現を富化または増加させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンデヒドロゲナーゼ１（ＮＱＯ１）、サイクリンＡ１（ＣＣＮＡ１）、インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ１７Ｆ）、上皮膜タンパク質１（ＥＭＰ１）、Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ Ｈｏｓｔ Ｇｅｎｅ １９（ＳＮＨＧ１９）、プロリンリッチ２２（ＰＲＲ２２）、免疫グロブリン様ドメイン含有受容体２（ＩＬＤＲ２）、ＡＴＰａｓｅファミリー、ＡＡＡドメイン含有３（ＡＴＡＤ３）、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）およびＷＤリピートドメイン６２（ＷＤＲ６２）の１つ以上またはすべての発現を減少させた。

【0224】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号１（例えば配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約４日～約６日間、形質導入したＴ細胞を培養して増殖させることを含み、方法の工程の全ては、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、増殖されたＴ細胞の遺伝子発現シグネチャーが、ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの発現を富化または増加させ、ＮＫＤ２ およびＮＱＯ１の発現を減少させた。

【0225】

「遺伝子発現」は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下または非存在下で製造され、またはＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で異なる長さの時間に製造される、生体試料、Ｔ細胞集団、例えば、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の遺伝子の相対的発現レベルおよび／または発現パターンを指す。遺伝子発現は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの組み合わせのレベルで測定されてもよい。遺伝子発現を測定する方法には、定量的リアルタイム、ＰＣＲ、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、ナノストリングトランスクリプトームプロファイリング、またはＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0226】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した７日間の製造プロセスを使用して製造されたＣＡＲ Ｔ細胞、例えば抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含むＴ細胞は、本明細書に企図される１０日間の製造プロセスを使用して製造されたＴ細胞に比べて、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３， ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの発現が少なくとも１．５倍または少なくとも２倍増加することを特徴とする。ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した７日間のプロセスを使用して製造されたＴ細胞は、固有の遺伝子発現シグネチャーによってさらに特徴付けられ、以下：ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のシグネチャー遺伝子の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用して１０日間のプロセスを使用して製造されたＴ細胞と比較して、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍に増加する。

【0227】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した７日間の製造プロセスを使用して製造されたＣＡＲ Ｔ細胞、例えば抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含むＴ細胞は、本明細書に企図される１０日間の製造プロセスを使用して製造されたＴ細胞に比べて、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の発現が少なくとも１．５倍または少なくとも２倍減少することを特徴とする。ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した７日間のプロセスを使用して製造されたＴ細胞は、固有の遺伝子発現シグネチャーによってさらに特徴付けられ、以下：ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２、およびＷＤＲ６２からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個すべてのシグネチャー遺伝子の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した１０日間のプロセスを使用して製造されたＴ細胞と比較して、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍減少する。

【0228】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した７日間の製造プロセスを使用して製造されたＣＡＲ Ｔ細胞、例えば抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含むＴ細胞は、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの発現を少なくとも１．５倍または少なくとも２倍増加させることを特徴とし、本明細書に企図される１０日間の製造プロセスを使用して製造されたＴ細胞に比べて、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の発現が少なくとも１．５倍または少なくとも２倍減少することを特徴とする。ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した７日間のプロセスを使用して製造されたＴ細胞は、固有の遺伝子発現シグネチャーによってさらに特徴付けられ、以下：ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個すべてのシグネチャー遺伝子の発現が、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍増加し、以下：ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２、およびＷＤＲ６２からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個すべてのシグネチャー遺伝子の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用した１０日間のプロセスを使用して製造されたＴ細胞と比較して、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍減少する。

【0229】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させることと、配列番号１（例えば配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、形質導入されたＴ細胞を培養して、約４～約６日間増殖させることを含み、方法のすべての工程は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、増殖されたＴ細胞は、ＴＣＭおよびＴＳＣＭ細胞が富化され、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはすべての遺伝子発現は、約９日間培養されて増殖したＴ細胞に比べて、約４～約６日間培養されて増殖した培養されたＴ細胞において少なくとも１．５倍多い。

【0230】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させることと、配列番号１（例えば配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約４～約６日間、形質導入されたＴ細胞を培養して、増殖させることを含み、方法のすべての工程は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、増殖されたＴ細胞は、ＴＣＭ、ＴＳＣＭ細胞を富化し、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９またはすべての遺伝子発現は、約９日間培養されて増殖したＴ細胞に比べて、約４～約６日間培養されて増殖した培養されたＴ細胞において少なくとも１．５倍少ない。

【0231】

様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、配列番号１（例えば配列番号２）に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入すること、約４～約６日間、形質導入されたＴ細胞を培養して、増殖させることを含み、方法のすべての工程は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で行われ、増殖されたＴ細胞は、ＴＣＭおよびＴＳＣＭ細胞を富化し、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはすべての遺伝子発現は、少なくとも１．５倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９またはすべての遺伝子発現は、約９日間培養されて増殖したＴ細胞に比べて、約４～約６日間培養されて増殖した培養されたＴ細胞において、少なくとも１．５倍少ない。

【0232】

本明細書で企図される製造方法は、製造プロセスの開始前のＰＢＭＣの凍結保存および／または製造されたＴ細胞組成物の凍結保存をさらに含みうる。養子細胞療法の凍結保存は、ヒト対象における使用のための治療薬の保存、試験、輸送、および放出を可能にする。Ｔ細胞は、解凍時に細胞が生存し続けるように凍結保存される。必要に応じて、凍結保存された細胞を解凍し、増殖させ、より多くのそのような細胞に対して増殖させることができる。本明細書で使用される場合、「凍結保存」とは、（典型的には）７７Ｋまたは－１９６℃（液体窒素の沸点）など、ゼロ以下の温度に冷却することによって細胞を保存することを指す。凍結保存剤は、保存されている細胞を低温での凍結または室温への加熱により損傷しないように、ゼロ以下の温度で使用されることが多い。凍結保存剤および最適な冷却速度は、細胞損傷から保護することができる。使用するできる凍結保護剤としては、以下に限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ、Ｎａｔｕｒｅ、１９５９；１８３：１３９４－１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ－Ｓｍｉｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ、１９６１；１９０：１２０４－１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Ｒｉｎｆｒｅｔ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９６０；８５：５７６）、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｖｄｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９６２；１９６：４８）、ならびにＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２を含む。好ましい実施形態では、製造されたＴ細胞は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ ＡとＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む溶液中で製剤化される。好ましい冷却速度は、１°～３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、－８０℃の温度に達し、長期低温貯蔵容器など、永久保存のために液体窒素（－１９６℃）に直接配置することができる。

【0233】

Ｄ．キメラ抗原受容体
本明細書で企図される方法は、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を標的抗原を発現する癌細胞に再指示する、より強力な養子細胞療法を製造するために使用される。好ましい実施形態では、本明細書に企図される製造方法は、活性化および刺激されたＴ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするウイルスベクターで形質導入して、免疫エフェクター細胞を再指示することを含む。

【0234】

ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性を、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書に企図されるＣＡＲは、シグナルペプチド、特異的標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合ドメイン、または抗原特異的結合ドメインとも呼称される）、膜貫通ドメイン、および一つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインに結合する細胞外ドメインを含む。

【0235】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、標的ポリペプチドに特異的に結合する細胞外結合ドメインを含有する。特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含有する。一つの好ましい実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。別の好ましい実施形態では、結合ドメインは、一つ以上のラクダＶＨＨ抗体またはシングルドメイン抗体を含む。

【0236】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、α_ｖβ_６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ型レシチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリン型Ａ受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１０Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパー、癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、メラノーマ抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１により認識されるメラノーマ抗原（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、メラノーマにおいて優先的に発現する抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘ切断ポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、栄養膜糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＵＬ１６－結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、およびウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。

【0237】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原に結合する細胞外ドメインを含む。

【0238】

特定の実施形態では、ＣＡＲはヒンジドメインを含む。ヒンジドメインの例示としては、限定されないが、ＣＤ８αおよびＣＤ４といった１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これらの分子の野生型ヒンジ領域であってもよく、または改変されてもよい。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。

【0239】

ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインを結合させ、ＣＡＲを、免疫エフェクター細胞の細胞膜に固定する。ＴＭドメインは、天然源、合成源、半合成源、または組み換え源のいずれかから誘導されてもよい。例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、ガンマ、またはデルタ鎖の少なくとも膜貫通領域（複数可）、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤＣＤ１に由来し得る（すなわち、それらを含む。

【0240】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８α由来のＴＭドメインを含有する。別の実施形態では、本明細書において予期されるＣＡＲは、ＣＤ８α由来のＴＭドメインと、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の長さの短オリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーを含有し、当該リンカーは、ＣＡＲのＴＭドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結させる。グリシン－セリンリンカーが、特に適切なリンカーを提供する。

【0241】

好ましい実施形態において、ＣＡＲは、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインおよび主要シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0242】

刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ）またはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有してもよい。

【0243】

特定の実施形態で予期されるＣＡＲにおける使用に適したＩＴＡＭ含有一次シグナル伝達ドメインの例示としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特に好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインと一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内主要シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結され得る。

【0244】

特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および拡大を強化するための一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0245】

特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおいて使用するのに好適なかかる共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ９４、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、ＴＲＡＴ１、ＴＮＦＲ２、およびＺＡＰ７０が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。

【0246】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＢＣＭＡに結合する細胞外ドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ１３７、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。より好ましい実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、さらに好ましい実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号２に記載されるポリヌクレオチド配列を含む。

【0247】

Ｅ．組成物および製剤
本明細書で企図される組成物は、治療有効量のＣＡＲ Ｔ細胞を含む。好ましい実施形態では、本明細書で企図される組成物は、治療有効量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。組成物としては限定されないが、医薬組成物が挙げられる。「医薬組成物」とは、細胞または動物への投与に対し、薬学的に許容可能な溶液または生理学的に許容可能な溶液中で、単独で、または一つ以上の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。所望の場合には、組成物は、例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモン、低分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、または他の様々な薬学的に活性な剤などの他の剤も同様に併用されて投与され得ることも理解されたい。事実上、組成物に含有され得る他の構成要素に制限はないが、追加される剤は、意図される療法を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。

【0248】

好ましい実施形態では、本明細書で企図される組成物は、細胞表面上でＣＤ２７、ＬＥＦ１、およびＴＣＦ１のうちの一つ以上を発現するＴ細胞が富化されたＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団を含む。好ましい実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で５日～７日のプロセスを使用して製造されたＣＡＲ Ｔ細胞が富化された集団は、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋、少なくとも３５％のＣＤ２７^＋、少なくとも４０％のＣＤ２７^＋、少なくとも４５％のＣＤ２７^＋、または少なくとも５０％のＣＤ２７^＋ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で５日～７日のプロセスを使用して製造されたＣＡＲ Ｔ細胞が富化された集団は、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋を含み、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、少なくとも３５％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、少なくとも４０％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、少なくとも４５％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋、または少なくとも５０％のＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で５日～７日のプロセスを使用して製造されたＣＡＲ Ｔ細胞が富化された集団は、少なくとも１０％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、少なくとも１５％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、少なくとも２０％
ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、少なくとも２５％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、少なくとも３０％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、少なくとも３５％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、少なくとも４０％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、少なくとも４５％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋、または少なくとも５０％ ＣＤ２７^＋ＬＥＦ１^＋ＴＣＦ１^＋ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＣＲ７^＋でもある。

【0249】

本明細書において、「薬学的に許容可能」という文言は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物および／または剤型を指すために採用される。

【0250】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、限定されないが、ヒトまたは家畜での使用に許容されるものとして米国食品医薬品局によって承認されている、アジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、香味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、これらに限定されないが、ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等のデンプン、セルロース、および誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；トラガカンス；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブオイル、トウモロコシ油および大豆油等の油、プロピレングリコール等のグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤、アルギン酸、パイロジェンを含まない水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール；リン酸緩衝液、および医薬製剤に採用されるその他の適合性物質が挙げられる。

【0251】

特定の実施形態では、組成物は、ある量の、より好ましくは、治療有効量の本明細書に企図されるＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む。

【0252】

本明細書で使用される場合、用語「量」または「用量」は、臨床結果を含む、有益または所望の予防または治療結果を達成するのに十分なＣＡＲ Ｔ細胞の「有効な量」、「有効な用量」、「有効な量」、または「有効な用量」を指す。

【0253】

ＣＡＲ Ｔ細胞の「治療有効量」または「治療有効用量「はまた、治療上有益な効果がＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、ＣＲＳの任意の毒性または有害効果に優る量である。用語「治療有効量」は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。一実施形態では、治療有効用量は、対象における多発性骨髄腫を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞の最小有効量（ＭＥＤ）である。一実施形態では、治療有効用量は、対象において解決不可能なＣＲＳをもたらさない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の最大耐量（ＭＴＤ）である。好ましい実施形態では、治療有効量のＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で５日または７日の製造プロセスを使用して製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、対象に投与され、細胞の量は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使用して１０日の製造プロセスを使用して製造されたＣＡＲ Ｔ細胞から同等の結果を達成するために必要な細胞量よりも少ない。

【0254】

特定の実施形態では、組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）投与のために製剤化されることが好ましい。好ましい実施形態では、本明細書で意図される組成物は、単回用量で対象に静脈内注入される。

【0255】

一実施形態では、対象に投与される組成物中のＣＡＲ^＋ Ｔ細胞の量は、少なくとも約５．０×１０^７細胞、少なくとも約１５．０×１０^７細胞、少なくとも約４５．０×１０^７細胞、少なくとも約８０．０×１０^７細胞、または少なくとも約１２．０×１０^８細胞である。

【0256】

一実施形態では、対象に投与される組成物中のＣＡＲ^＋ Ｔ細胞の量は、約５．０×１０^７細胞超、約１５．０×１０^７細胞超、約４５．０×１０^７細胞超、約８０．０×１０^７細胞超、または約１２．０×１０^８細胞超である。

【0257】

一実施形態では、対象に投与される組成物中のＣＡＲ^＋ Ｔ細胞の量は、約５．０×１０^７細胞～約１５．０×１０^７細胞、約５．０×１０^７細胞～約４５．０×１０^７細胞、約５．０×１０^７細胞～約８０．０×１０^７細胞、または約５．０×１０^７細胞～約１２．０×１０^８細胞である。

【0258】

本明細書において提示される用途に関し、細胞は一般的に、リットル以下の量であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。

【0259】

特定の実施形態では、医薬組成物は、一つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組合わせて、治療有効量のＣＡＲ Ｔ細胞を含む。

【0260】

治療有効用量のＣＡＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化物質、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含みうる。

【0261】

液体医薬組成物、溶液、懸濁液またはその他の同様の形態であっても、以下のうちの一つ以上を含み得る：注射用水などの滅菌希釈剤、生理食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として提供され得る合成モノまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された複数回用量バイアルに封入され得る。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。

【0262】

特定実施形態では、本明細書に企図されるＣＡＲ Ｔ細胞組成物は、薬学的に許容可能な細胞培養培地中で製剤化される。そうした組成物は、ヒト対象への投与に適している。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な細胞培養培地は、無血清培地である。

【0263】

無血清培地は、血清含有培地を超える利点をいくつか有しており、シンプルでより明白な組成、汚染物質量の低下、感染性実体の源となる可能性の排除、およびコスト低下が挙げられる。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意で無タンパク質であってもよい。任意で培地はバイオ医薬品的に受容可能な組み換えタンパク質を含有してもよい。「動物質を含まない」培地とは、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組み換えタンパク質は、動物質を含まない培地中で天然動物性タンパク質を置き換え、その栄養素は合成、植物または微生物の源から取得される。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、実質的にタンパク質を含まないと規定される。

【0264】

特定の組成物において使用される無血清培地の例示としては限定されないが、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられる。

【0265】

好ましい一実施形態では、本明細書に企図されるＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液中で製剤化される。

【0266】

別の好ましい実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物は、凍結保存媒体を含む溶液中で製剤化される。例えば凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、融解後の高い細胞活性成績を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示としては限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられる。

【0267】

より好ましい実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０に対してＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを５０：５０で含む溶液中で製剤化される。

【0268】

Ｆ．治療方法
本明細書で企図される方法によって製造される改変Ｔ細胞は、癌、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全を含むがこれらに限定されない様々な状態の治療に使用するための改善された養子免疫療法を提供する。特定の実施形態では、一次Ｔ細胞の特異性は、本明細書に企図されるＣＡＲで一次Ｔ細胞を遺伝子改変することによって、腫瘍または癌細胞に再指示される。

【0269】

特定の実施形態では、本明細書において企図される方法で製造されたＣＡＲ Ｔ細胞組成物は、限定されないが、肝癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、骨癌、甲状腺癌、腎癌または皮膚癌を含む固形腫瘍または癌の治療に使用される。

【0270】

特定の実施形態では、本明細書に企図される方法を用いて製造されたＣＡＲ Ｔ細胞組成物は、急性白血病（例えば、ＡＬＬ、ＡＭＬ、および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、ＣＬＬ、ＳＬＬ、ＣＭＬ、ＨＣＬ）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および重鎖病の治療に使用される。

【0271】

特定の実施形態では、本明細書で企図される方法を用いて製造されたＣＡＲ Ｔ細胞組成物は、限定されるものではないが、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用される。

【0272】

多発性骨髄腫は、これらのタイプの細胞の単一クローンの腫瘍性形質転換を特徴とする成熟形質細胞形態のＢ細胞悪性腫瘍である。これらの形質細胞はＢＭで増殖し、隣接する骨、時には血液に侵入する場合がある。多発性骨髄腫のバリアント形態としては、明白な多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外形質細胞腫が挙げられる（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら（ｅｄｓ）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ ２００１）を参照のこと）。

【0273】

非ホジキンリンパ腫は、リンパ球（白血球）の癌の大きな群を包含する。非ホジキンリンパ腫は、どの年齢でも発生する可能性があり、通常よりも大きなリンパ節、発熱、および体重減少によって特徴付けられることが多い。非ホジキンリンパ腫には多くの異なるタイプがある。例えば、非ホジキンリンパ腫は、攻撃的（急速に成長する）型と緩徐な（緩徐に成長する）型に分けることができる。非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞およびＴ細胞に由来し得るが、本明細書で使用される場合、用語「非ホジキンリンパ腫」および「Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫」は互換的に使用される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）には、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂ細胞性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫が含まれる。骨髄移植または幹細胞移植後に発生するリンパ腫は通常、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫である。

【0274】

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂリンパ球またはＢ細胞と呼ばれる未成熟の白血球のゆっくりとした増加を引き起こす、緩徐な（成長の遅い）癌である。癌細胞は、血液および骨髄を通して広がり、リンパ節または肝臓および脾臓などの他の器官にも影響し得る。ＣＬＬは最終的に骨髄を機能不全に陥れる。疾患の後期では、疾患は小リンパ球性リンパ腫と呼ばれることがある。

【0275】

特定の実施形態では、治療有効量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物は、多発性骨髄腫またはリンパ腫を治療するために対象に投与される。

【0276】

特定の実施形態では、治療有効量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物は、再発性／難治性多発性骨髄腫を治療するために対象に投与される。「再発」は、ある期間の改善または寛解の後に、癌の復活の診断、または癌の復活の徴候および症状の診断がされたことを指す。「難治性」とは、特定の治療剤を用いた療法に抵抗性である、または非反応性である癌を指す。癌は、治療の開始時から難治性である場合（すなわち治療剤の初回暴露に非反応性）、または最初の治療期間、もしくはその後の治療期間のいずれかのうちに治療剤に対して抵抗性を発現した結果として難治性となる場合がある。

【0277】

特定の実施形態では、本明細書に企図される組成物は、少なくとも一つのプロテアソーム阻害剤および／または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、一つ、二つ、三つ、またはそれ以上の治療で治療に成功しなかった再発性／難治性多発性骨髄腫の対象に投与される。一実施形態では、対象の多発性骨髄腫は、少なくとも一つのプロテアソーム阻害剤およびＩＭｉＤを含む三つの治療レジメンに対して難治性である。一実施形態では、対象の多発性骨髄腫は、一つ以上の治療レジメンに対して二重不応性である。

【0278】

対象の多発性骨髄腫が難治性であるプロテアソーム阻害剤の例には、限定されるものではないが、ボルテゾミブおよびカルフィルゾミブが含まれる。

【0279】

対象の多発性骨髄腫が難治性であるＩＭｉＤの例には、サリドマイド、レナリドミド、およびポマリドマイドが含まれるが、これらに限定されない。

【0280】

多発性骨髄腫が難治性である可能性のある他の治療の例には、以下に限定されないが、デキサメタゾン、およびエロツズマブ、ダラツムマブ、ＭＯＲ０３０８７、イサツキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、エルシリモマブ、アジントレル、リツキシマブ、トシツマブ、ミラツズマブ、ルカツズマブ、ダセツズマブ、フィギツムマブ、ダロツズマブ、ＡＶＥ１６４２、タバルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブおよびニボルマブからなる群から選択される抗体に基づく療法が挙げられる。

【0281】

一実施形態では、対象の多発性骨髄腫は、ダラツムマブによる治療に対して難治性である。

【0282】

特定の実施形態では、対象の多発性骨髄腫は、ＩＭｉＤ、プロテアソーム阻害剤、およびデキサメタゾンを用いた治療に難治性である。

【0283】

本明細書で企図される方法は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞組成物の投与前に、再発性／難治性の多発性骨髄腫の対象を自己造血幹細胞移植で治療することをさらに含んでもよい。

【0284】

本明細書に企図される方法は、本明細書に企図される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞組成物の投与前に対象をリンパ球枯渇させること、例えば、リンパ球枯渇化学療法は、投与前に１～４日（例えば、１、２、３、または４日）で終了することをさらに含みうる。特定の実施形態では、リンパ球枯渇は、メルファラン、サイトキサン、シクロホスファミド、およびフルダラビンのうちの一つ以上を投与することを含む。一実施形態では、対象は、本明細書に企図される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞組成物の投与前にシクロホスファミド３００ｍｇ／ｍ２およびフルダラビン３０ｍｇ／ｍ２でリンパ球枯渇される。

【0285】

本明細書に引用されるすべての公表文献、特許出願および登録特許が、個々の公表文献、特許出願または登録特許のそれぞれが具体的に、および個々に参照により援用されることが示されているように、参照により本明細書に援用される。

【0286】

前述の発明は、明確性および理解を目的として、図および実施例により詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし、特定の変化および改変が、添付の請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的のみで提供され、限定の目的で提供されるものではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更または修正され得る様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。

【実施例0287】

実施例１
製造プロセスの改善
白血球アフェレーシスにより多発性骨髄腫ドナーから細胞を採取し、Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ Ｅｌｉｔｅ上で密度勾配を使用してＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを洗浄し、次いでＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に２５０ＩＵ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２で再懸濁した。洗浄前および洗浄後の細胞数、生存率、およびＰＢＭＣ ＦＡＣＳ分析を実施した。洗浄されたＰＢＭＣを、活性化まで凍結保存するか、または新鮮に使用した。０日目に、Ｔ細胞を、培養物に対して、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１ μｍのＺＳＴＫ４７４（ＣＡＳ
ＮＯ．４７５１１０－９６－４）、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体、および５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を用いてＴＣＧＭ中で培養することによって活性化および刺激し、約１８～２４時間培養した。ＰＢＭＣ培養物を、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（例えば、配列番号１、配列番号２）をコードするレンチウイルスで約１８～約２４時間形質導入した。次いで、ＰＢＭＣ培養物を、４日間、６日間、または９日間（それぞれ５日間、７日間、１０日間の製造プロセス）、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および１μｍ ＺＳＴＫ４７４を含有するＴＣＧＭ中でＴ細胞増殖のために培養した。増殖の１日以上の各々で、細胞のアリコートを任意に採取し、ＦＡＣＳ分析を使用してＰＢＭＣについて細胞を計数し、生存率を決定し、凍結保存し、特徴解析した。増殖した細胞を回収し、洗浄し、少なくとも－８０℃の温度で制御された速度冷凍庫中で凍結保存し、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存した。

【0288】

実施例２
改善された製造プロセスはＴ細胞表現型を調節する
五つの多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の存在下または非存在下で、実施例１に記載される７日または１０日の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。Ｔ細胞増殖培養の終了時に、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ４５ＲＡに対する抗ヒト抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。各ドットプロットを、生存ＣＤ３^＋リンパ球上でゲーティングした。ＺＳＴＫ４７４の存在下で７日間製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞医薬品（ＤＰ）は、ＺＳＴＫ４７４の存在下で１０日間製造されるか、またはＰＩ３Ｋ阻害剤の非存在下で製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰと比較して、より強力なＴ細胞表現型に対するマーカー発現を増加させた。図１。

【0289】

実施例３
改善された製造プロセスはＴ細胞の分化を調節する
五つの多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の存在下で、実施例１に記載される７日または１０日の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。Ｔ細胞増殖培養の終了時に、細胞を、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、およびＴＩＭ３に対する金属標識抗ヒト抗体で染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。各ドットプロットを、生存ＣＤ３^＋リンパ球上でゲーティングした。ＺＳＴＫ４７４の存在下で７日間製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰは、ＺＳＴＫ４７４の存在下で１０日間製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰと比較して、より分化の少ないＴ細胞表現型に対するマーカー発現を増加させ、より分化したＴ細胞表現型に対するマーカー発現を減少させた。図２。

【0290】

実施例４
改善された製造プロセスはＣＤ２７^＋Ｔ細胞を富化する
五つの多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の存在下または非存在下で、実施例１に記載される７日または１０日の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。Ｔ細胞増殖培養の終了時に、細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２７に対する金属標識抗ヒト抗体で染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。ＶＩＳＮＥプロットは、異なる細胞集団におけるＣＤ２７発現を示す。ゲーティングされた集団は、ＣＤ２７^＋が富化されたＴ細胞を表す。ＺＳＴＫ４７４の存在下で７日間製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰは、ＺＳＴＫ４７４の存在下で１０日間またはＰＩ３Ｋ阻害剤の非存在下で製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰと比較して、ＣＤ２７^＋、ＬＥＦ１^＋、および／またはＴＣＦ１^＋が富化されたＴ細胞の予想外の劇的な増加を有する。図３。

【0291】

実施例５
富化されたＣＤ２７^＋Ｔ細胞集団は、強力なＴ細胞表現型を有する
五つの多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の存在下で、実施例１に記載される７日または１０日の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。Ｔ細胞増殖培養の終了時に、細胞を、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＴＩＭ３（図４Ａ）、ならびにＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ７０、ＣＤ２４４、およびＰＤ－１（図４Ｂ）に対する金属標識抗ヒト抗体で染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。ＶＩＳＮＥプロットは、異なる細胞集団におけるマーカー発現を示す。ゲーティングされた集団は、ＣＤ２７^＋が富化されたＴ細胞を表す。ＺＳＴＫ４７４の存在下で７日間製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰは、ＺＳＴＫ４７４の存在下で１０日間製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰと比較して、より分化の少ないＴ細胞表現型に対するマーカー発現を増加させ、より分化したＴ細胞表現型に対するマーカー発現を減少させた。図４Ａ～４Ｂ。

【0292】

実施例６
改善された製造プロセスはＣＤ２７^＋ Ｔ細胞活性化プロファイルを調節する
五つの多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の存在下で、実施例１に記載される７日または１０日の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。Ｔ細胞増殖培養の終了時に、細胞を、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２５、およびＴＩＭ３に対する金属標識抗ヒト抗体で染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。ＶＩＳＮＥによって特定されたＣＤ２７^＋富化細胞のＴ細胞表現型を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（図５、上）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（図５、下）におけるマーカー発現について分析した。ＺＳＴＫ４７４の存在下で１０日間製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰは、ＺＳＴＫ４７４の存在下で７日間製造される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰと比較して、活性化プロファイルの減少と消耗プロファイルの増加を有する。

【0293】

実施例７
改善された製造プロセスはＴ細胞遺伝子発現を調節する
多発性骨髄腫ＰＢＭＣロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の非存在下で７日間（ｎ＝１）または１０日間（ｎ＝１３）、またはＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で７日間（ｎ＝１０）または１０日間（ｎ＝６）、実施例１に記載される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。約１００ｎｇの総ＲＮＡを、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰから抽出し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ社のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖ２プローブキットで混合し、転写プロファイルを分析した。製造条件間の差次的に発現された上位５０個の遺伝子のヒートマップを図６に示す。７日間製造された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰは、概して、１０日間製造されるＤＰと比較して、Ｔ細胞活性化および増殖に関連するＴ細胞メモリー表現型遺伝子および遺伝子の発現の増加、ならびに細胞死に関連する遺伝子の発現の減少を示す。

【0294】

実施例８
Ｄａｕｄｉ腫瘍マウスモデルにおける抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞
Ｄａｕｄｉ腫瘍マウスモデルを確立して、７日のプロセスで製造された医薬品の有効性と１０日のプロセスで製造された医薬品の有効性とを比較した。健康なドナーＰＢＭＣを活性化および刺激し、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ＩＬ－２およびＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で７日間または１０日間増殖させた（実施例１を参照）。養子細胞療法の１０日前に、ＮＳＧマウスに、２×１０^６個のホタルルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ腫瘍細胞を静脈内注射した。マウスに２．５、５、または１０×１０^６個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ^＋ Ｔ細胞、またはビヒクルで形質導入されたＴ細胞を注射した。腫瘍負荷を発光によって監視した。７日間のプロセスで製造された抗ＢＣＭＡ
ＣＡＲ Ｔ細胞は、１０日間のプロセスで製造された細胞よりも、より低いＣＡＲ^＋用量で腫瘍の増殖を制御する能力の増加によって実証される、より良い有効性を示す。図７。

【0295】

実施例９
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞表現型
１５個の多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の存在下で、実施例１に記載される７日または１０日の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。Ｔ細胞増殖培養の終了時に、約３６個のＴ細胞表現型金属標識抗ヒト抗体のパネルで細胞を染色し、ＣｙＴＯＦで分析した。表現型抗体は、以下のＴ細胞表現型間の識別を可能にする：ナイーブＴ細胞（Ｔｎａｉｖｅ）、中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）、エフェクターＴ細胞（ＴＥｆｆ）、および幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）。Ｔ幹細胞メモリーサブセットは、ナイーブＴ細胞四分円（ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＯ^－）におけるＣＤ９５発現によって特定される。提示されたデータは、Ｔ細胞サブセットに対するＣＤ２７^＋富化細胞の％の関数として分析された各ＤＰロットを示す。ＣＤ２７^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＴＣＭ様表現型と正に相関するのに対し、ＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＴＳＣＭ様表現型と正に相関する。図８。

【0296】

実施例１０
ＣＤ８^＋ 抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞表現型
実施例９で生成されたＣＤ８^＋ Ｔ細胞データを、ＦｌｏｗＳＯＭを使用して分析した。ＦｌｏｗＳＯＭは、２０個の別個のＴ細胞クラスターを特定した。Ｔ細胞の三つの主要群を、クラスター４（メモリーＴ細胞マーカー、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＴＣＦ１、ＬＥＦ１、ＣＤ２８、ＣＣＲ７に富化された）およびクラスター５（エフェクターＴ細胞マーカー、例えば、グランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン、Ｔ－ｂｅｔ、ＥＯＭＥＳに富化された）に基づいて特定した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療を受けた対象について、％ＣＤ２７^＋ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞製造方法、および臨床応答を解析した。７日間の製造プロセスは、概して、１０日間の製造プロセスと比較して、Ｔ細胞メモリーマーカーの発現の増加およびＣＤ２７^＋濃縮細胞集団の増加を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をもたらした。図９。

【0297】

実施例１１
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞遺伝子発現解析
１２個の多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットを使用して、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４７４の存在下で、実施例１に記載される７日（ｎ＝８）または１０日（ｎ＝４）の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。約１００ｎｇの総ＲＮＡを、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰから抽出し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ社のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖ２プローブキットで混合した。データはＮＳｏｌｖｅｒソフトウェア（ナノストリング）でＱＣされ、差次的遺伝子発現 解析が実施された。７日の製造プロセスと１０日の製造プロセスとの間で、上位２５個の差次的に発現された遺伝子（ｐ値０．０５）のヒートマップを生成した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療を受けた対象について、％ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞製造方法、および臨床応答を解析した。７日間の製造プロセスは、概して、１０日間の製造プロセスと比較して、Ｔ細胞メモリーマーカーの発現の増加およびＣＤ２７^＋濃縮細胞集団の増加を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をもたらした。図１０。

【0298】

実施例１２
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞遺伝子発現解析
五つの多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットをそれぞれ二つの群に分割し、一つの群を使用して７日間の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造し、他方の群を使用して１０日間の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、実施例１に記載されるように、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４の存在下で製造された。

【0299】

約１００ｎｇの総ＲＮＡを、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰから抽出し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ社のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖ２プローブキットで混合した。データはＮＳｏｌｖｅｒソフトウェア（ナノストリング）でＱＣされ、差次的遺伝子発現 解析が実施された。

【0300】

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰ総ＲＮＡのアリコートを使用して、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）も行った。細胞を解凍／洗浄／計数し、生存率（＞７０％の生存率が必要）を試験した。２～３×１０^６個の細胞からの総ＲＮＡを、ＴＲＩＡＺＯＬを使用して抽出した。総ＲＮＡについて、フェノール／クロロホルム抽出およびＱｉａｇｅｎ
ｍｉＲＮＡ－ｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを採取した。ＲＮＡを、ポリＡビーズ捕捉戦略を使用して単離した。ＲＮＡの品質／量を、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００によって決定した（ＲＩＮ値＞７が必要）。配列決定ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡによって調製した。Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００（ＤＮＡキット）によりライブラリーの品質チェックを行い、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０機器を使用して配列決定した。データは、ＱＣ／アライメント方法を使用して分析された。

【0301】

７日目の製造プロセスに対する倍率変化（ＦＣ）による上位１１個の上方制御された遺伝子と、上位９個の下方制御された遺伝子を表１に示す。

【表1】

【0302】

実施例１３
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞遺伝子発現解析
五つの多発性骨髄腫ドナーのＰＢＭＣ細胞ロットをそれぞれ二つの群に分割し、一つの群を使用して７日間の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造し、他方の群を使用して１０日間の製造プロセスを使用して抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、実施例１に記載されるように、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＺＳＴＫ４の存在下で製造された。

【0303】

抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞ＤＰ総ＲＮＡのアリコートを使用して、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を実施した。細胞を解凍／洗浄／計数し、生存率（＞７０％の生存率が必要）を試験した。２～３×１０^６個の細胞からの総ＲＮＡを、ＴＲＩＡＺＯＬを使用して抽出した。総ＲＮＡについて、フェノール／クロロホルム抽出およびＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮＡ－ｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを採取した。ｒＲＮＡ枯渇にＲｉｂｏＥｒａｓｅを使用した。ＲＮＡの品質／量を、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００によって決定する（ＲＩＮ値＞７が必要）。ＲＮＡの品質／量を、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００によって決定した（ＲＩＮ値＞７が必要）。配列決定ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡによって調製した。Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００（ＤＮＡキット）によりライブラリーの品質チェックを行い、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０機器を使用して配列決定した。データは、ＱＣ／アライメント方法を使用して分析された。

【0304】

ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂは、上方制御された上位２５個の遺伝子であり、ＮＫＤ２およびＮＱＯ１は、７日目の製造プロセスと比較して、倍率変化（ＦＣ）による下方制御された上位１０個の遺伝子であった。

【0305】

実施例１４
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞療法
多発性骨髄腫の患者からＰＢＭＣを採取し、洗浄し、Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に２５０ＩＵ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２で再懸濁した。洗浄前および洗浄後の細胞数、生存率、およびＰＢＭＣフローサイトメトリー分析を実施した。洗浄されたＰＢＭＣを、活性化まで凍結保存するか、または新鮮に使用した。０日目に、ＴＣＧＭ中に２５０ＩＵ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２、５０ ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体、および５０ ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体でＰＢＭＣを培養することによって、Ｔ細胞を活性化し、刺激し、約１８～２４時間培養した。ＰＢＭＣ培養物を、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（例えば、配列番号１、配列番号２）をコードするレンチウイルスで約１８～約２４時間形質導入した。次いで、ＰＢＭＣ培養物を、９日間（１０日間の製造プロセス）、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有するＴＣＧＭ中でＴ細胞増殖のために培養した。増殖した細胞を回収し、洗浄し、少なくとも－８０℃の温度で制御された速度冷凍庫中で凍結保存し、続いて、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存した。

【0306】

凍結した細胞を続いて解凍／洗浄／計数し、生存率（＞７０％の生存率が必要）を試験した。次いで、細胞をＣｙＴＯＦ実験に使用したか、または後のＲＮＡ抽出および遺伝子発現解析のためにＴＲＩｚｏｌに保存された細胞ペレットとして凍結させた。

【0307】

ＥＸＰＴ．１．細胞を、Ｔ細胞マーカーに対する金属標識抗ヒト抗体で染色し、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＣｙＴＯＦ Ｈｅｌｉｏｓ Ｍａｓｓ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して分析した。タンパク質マーカー発現は、抗体染色前に各サンプルにスパイクされた参照試料中の確立された陰性集団と比較して、単一マーカーベースでゲーティングされた。細胞は、マーカーの組み合わせを使用してメモリー細胞タイプに分類され、シルエット法によって陽性マーカー発現でゲーティングされた。ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のメモリー集団をそれぞれ、以下のマーカーの組み合わせを使用してゲーティングした：Ｔ_{Ｎａｉｖｅ}（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ９５－）、Ｔ_ＳＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ９５＋）、Ｔ_ＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ９５＋）、Ｔ_ＥＭ（ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ９５＋）、Ｔ_ＥＦ（ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ９５＋）。主要な免疫集団を、以下のマーカーの組み合わせを使用してゲーティングした：ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ１４－ＣＤ１９－ＣＤ５６－）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋ＣＤ１４－ＣＤ１９－ＣＤ５６－）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ１４－ＣＤ５６＋）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＣＤ１９－ＣＤ１４－）、Ｂ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９＋ＣＤ１４－ＣＤ５６－）および単球（ＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ１４＋ＣＤ５６－）。細胞比率の差異存在量を、性別に対して調整された準二項式一般化線形モデルを使用して推測した。各細胞型における個々のマーカーの割合の差を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して推定した。ＣＡＲ Ｔ細胞組成物は、１８か月未満の奏功期間を有する全患者（非持続的応答者）に比べて、１８か月よりも優れた奏功期間を有する患者（持続的応答者）の間で比較された。図１１Ａおよび図１１Ｂ。

【0308】

ＥＸＰＴ ２．細胞を、ＬＥＦ－１を含むＴ細胞マーカーに対する金属標識抗ヒト抗体で染色し、ＣｙＴＯＦにより分析した。ＣｙＴＯＦデータを品質チェックし、分析して、ＣＤ４およびＣＤ８免疫細胞集団に対する個々のマーカーの発現をもたらした。各細胞型における個々のマーカーの割合の差を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して推定した。製剤試料からの遺伝子レベルの計数の分析は、非持続的応答者と比較して、男性対女性で、持続的応答者において差示的発現分析を使用して実施された。図１２Ａ。

【0309】

総ＲＮＡについて、フェノール／クロロホルム抽出およびＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮＡ－ｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを抽出し、ＲｉｂｏＥｒａｓｅを有するＫａｐａ ＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットを用いてｒＲＮＡを枯渇させた。ＲＮＡの品質／量を、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００によって決定した（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ＮｕｍｂｅｒまたはＲＩＮ値＞７が必要）。配列決定ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して調製した。ライブラリーの品質および量は、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００（ＤＮＡキット）により決定され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５５０機器を使用して配列決定された。シーケンシングデータを解析した。血清ＢＣＭＡ（ｓＢＣＭＡ）レベルとのＬＥＦ１遺伝子発現の相関を、スピアマンの順位相関を使用して決定した。図１２Ｂ。

【0310】

実施例１５
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞療法
多発性骨髄腫の患者からＰＢＭＣを採取し、洗浄し、Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に２５０ＩＵ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２で再懸濁した。洗浄前および洗浄後の細胞数、生存率、およびＰＢＭＣフローサイトメトリー分析を実施した。洗浄されたＰＢＭＣを、活性化まで凍結保存するか、または新鮮に使用した。０日目に、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を用いてＴＣＧＭ中でＰＢＭＣを培養することによって、Ｔ細胞を活性化および刺激し、１ＭのＺＳＴＫ４７４（ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＣＡＳ ＮＯ．４７５１１０－９６－４）の存在下で、約１８～２４時間、培養した。ＰＢＭＣ培養物を、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（例えば、配列番号１、配列番号２）をコードするレンチウイルスで約１８～約２４時間形質導入した。次いで、ＰＢＭＣ培養物を、９日間（１０日間の製造プロセス）、２５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および １ μＭのＺＳＴＫ４７４を含有するＴＣＧＭ中でＴ細胞増殖のために培養した。増殖した細胞を回収して洗浄し、少なくとも－８０℃の温度で制御された速度冷凍庫中で凍結保存し、続いて、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存した。

【0311】

凍結保存した試料を解凍し、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、およびＣＤ５７を含むＴ細胞マーカーに対する金属標識抗ヒト抗体で染色した。標識細胞を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＣｙＴＯＦ Ｈｅｌｉｏｓ Ｍａｓｓ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して、ＣｙＴＯＦ表現型の手動解析を実施した。タンパク質マーカーの発現は、抗体染色前に各対象の試料にスパイクされた参照試料中の確立された陰性集団に基づいて、単一マーカーベースでゲーティングされた。ＣＣＲ７（図１３、左上パネル）、ＬＥＦ１（図１３、上中央パネル）、およびＣＤ５７（図１３、右上パネル）を発現するＣＤ３＋生細胞の割合が、ＰＢＭＣとＤＰの間に示される。これは、ＰＩ３－Ｋ阻害剤ベースの製造プロセスが、早期メモリー、低分化細胞について富化することを示した。

【0312】

ＣＣＲ７を発現するＣＤ３＋生細胞の割合（図１３、左下パネル）、ＬＥＦ－１（図１３、左下中央パネル）、およびＣＤ５７（図１３、右下パネル）がｙ軸上に示される。注入後の様々な時点で全血から抽出されたＣＤ３＋細胞上のＰＣＲによって決定される最大ベクターコピー数（ＶＣＮ）は、ｘ軸上に示される。これらのグラフは、注入後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋細胞の最大の増殖における正の相関、およびＬＥＦ－１を発現するＣＤ３＋ ＤＰ細胞のパーセンテージ、ならびにＣＤ５７を発現するＣＤ３＋ ＤＰのパーセンテージとの負の相関を示す。これは、ＤＰにおけるＣＣＲ７およびＬＥＦ－２の富化が、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのより堅牢な増殖をもたらすことを示す。

【0313】

ＣＤ５７（老化のマーカー）、ＬＥＦ－１、ＣＣＲ７、およびＣＤ２７（メモリー細胞）を発現するＣＤ３＋生細胞の割合を、クラスターヒートマップとして示す。図１４．赤色は、マーカーの他の飼料と比較して、試料中の細胞の割合が比較的高いことを示す。青色は、マーカーの他の飼料と比較して、試料中の細胞の割合が比較的低いことを示す。データは、平均連結法階層クラスタリング（ａｖｅｒａｇｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を使用してグループ化され、クラスターの樹状図によって決定される上位３つのクラスターは、６ヵ月時点での患者の臨床応答と関連した（進行性疾患または非進行性疾患）。６ヵ月時点での応答の臨床評価を行うための利用可能な追跡データを有する患者のみが、この解析に含まれた。教師なしクラスタリングは、６か月（４／６進行）で進行者を有する高ＣＤ５７発現、低ＬＥＦ－１／ＣＣＲ７／ＣＤ２７発現群との関連を示す一方、高ＬＥＦ－１／ＣＣＲ７／ＣＤ２７発現および低ＣＤ５７発現を有する群は、主に非進行者（１／７進行）である。中間体群は、１／５の進行者を有する。これは、医薬品中のメモリーマーカーと老化マーカーとの間の相関関係と持続的な臨床応答を示すものである。

【0314】

全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
少なくとも１０％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２）
前記集団が、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目３）
前記集団が、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目４）
前記集団が、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目５）
前記集団が、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目６）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目１～５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目７）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＬＥＦ１^＋およびＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目１～５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目８）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目９）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１０）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１１）
少なくとも１０％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１２）
前記集団が、少なくとも１５％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１３）
前記集団が、少なくとも２０％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１４）
前記集団が、少なくとも２５％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１５）
前記集団が、少なくとも３０％のＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１１に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１６）
前記ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目１１～１５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１７）
前記ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＬＥＦ１^＋ＣＣＲ７^＋ＴＣＦ１^＋ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目１１～１５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１８）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１１～１５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目１９）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１１～１５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２０）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目１１～１５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２１）
前記細胞が、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から製造された、項目１～２０のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２２）
前記細胞が、再発／難治性多発性骨髄腫を有する対象から製造された、項目１～２１のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２３）
前記細胞が、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスを含む、項目１～２２のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２４）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１～２３のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２５）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、項目１～２４のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２６）
前記細胞が自己である、項目１～２５のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２７）
前記細胞が凍結保存される、項目１～２６のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２８）
前記細胞が、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象への投与のために製剤化される、項目１～２７のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のｃＧＭＰ製造集団。
（項目２９）
約５～約７日間、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触されたヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、ＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現が、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍または少なくとも２倍多い、ヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。
（項目３０）
約５～約７日間、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触されたヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または全ての遺伝子発現が、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない、ヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。
（項目３１）
約５～約７日間、ホスファチジル－イノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触されたヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全てのそれぞれの遺伝子発現が、少なくとも１．５または少なくとも２倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または全ての遺伝子発現は、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない、ヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。
（項目３２）
ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、中央メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）様表現型を有する、項目２９～３１のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目３３）
ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）様表現型を有する、項目２９～３１のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目３４）
ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＴＣＭ様表現型を有し、ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ
ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＴＳＣＭ様表現型を有する、項目２９～３１のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目３５）
前記細胞が、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から製造された、項目２９～３４のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目３６）
対象から製造された前記細胞が、再発性／難治性多発性骨髄腫を有する、項目２９～３５のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目３７）
前記細胞が、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスを含む、項目２９～３６のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目３８）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが配列番号 １に記載されるアミノ酸配列を含む、項目２９～３７のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目３９）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが配列番号 ２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、項目２９～３８のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目４０）
前記細胞が自己である、項目２９～３９のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目４１）
前記細胞が凍結保存される、項目２９～４０のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ
ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目４２）
前記細胞が、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象への投与のために製剤化される、項目２９～４１のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目４３）
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＺＳＴＫ４７４である、項目２９～４２のいずれか一項に記載のヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞。
（項目４４）
生理学的に許容可能な賦形剤と、項目２９～４３のいずれか一項に記載の抗ＢＣＭＡ
ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量とを含む、医薬組成物。
（項目４５）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の前記治療有効量が、少なくとも約５．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目４４に記載の組成物。
（項目４６）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の前記治療有効量が、少なくとも約１５．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目４４に記載の組成物。
（項目４７）
前記治療有効量が、少なくとも約４５．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目４４に記載の組成物。
（項目４８）
前記治療有効量が、少なくとも約８０．０×１０^７個の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞である、項目４４に記載の組成物。
（項目４９）
５０：５０のＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０に対するＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液中で製剤化される、項目４４～４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５０）
多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象を、項目４４～４９のいずれか一項に記載の組成物で治療する方法。
（項目５１）
前記対象が、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞集団を活性化し、前記Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで前記Ｔ細胞を形質導入すること、
（ｃ）約５～約７日間、前記形質導入Ｔ細胞を培養して増殖させることを含み、
工程（ａ）～（ｃ）が、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現が、約１０日間、工程（ｂ）に従って形質導入され、培養されて増殖されたＴ細胞に比べて、工程（ｃ）の前記培養されたＴ細胞において、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍多い、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法。
（項目５３）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞集団を活性化し、前記Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで前記Ｔ細胞を形質導入すること、
（ｃ）約５～約７日間、前記形質導入Ｔ細胞を培養して増殖させることを含み、
工程（ａ）～（ｃ）が、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９または全ての遺伝子発現が、約１０日間、工程（ｂ）に従って形質導入され、培養されて増殖されたＴ細胞に比べて、工程（ｃ）の前記培養されたＴ細胞において、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法。
（項目５４）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞集団を活性化し、前記Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで前記Ｔ細胞を形質導入すること、
（ｃ）約５～約７日間、前記形質導入Ｔ細胞を培養して増殖させることを含み、
工程（ａ）～（ｃ）が、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、
約１０日間、工程（ｂ）に従って形質導入され、培養されて増殖されたＴ細胞に比べて、工程（ｃ）の前記培養されたＴ細胞において、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または全ての遺伝子発現が少なくとも１．５倍または少なくとも２倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または全ての遺伝子発現が、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍少ない、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
Ｔ細胞を製造する方法。
（項目５５）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞集団を活性化し、前記Ｔ細胞集団を刺激して増殖させること、
（ｂ）配列番号 １に記載のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで前記Ｔ細胞を形質導入すること、
（ｃ）約５～約７日間、前記形質導入Ｔ細胞を培養して増殖させることを含み、
工程（ａ）～（ｃ）が、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で実施され、前記増殖細胞がＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋である、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法。
（項目５６）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋ Ｔ細胞を含む、項目５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋、および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋細胞および／またはＬＥＦ１^＋細胞および／またはＣＣＲ７^＋細胞および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記ＣＤ２７^＋細胞が、ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋である、項目５２～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記ＣＤ２７^＋細胞が、ＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋およびＴＣＦ１^＋である、項目５２～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ４^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目５２～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目５２～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記ＣＤ２７^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、項目５２～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記Ｔ細胞が自己である、項目５２～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記方法が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記Ｔ細胞源として単離することをさらに含む、項目５２～６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記ＰＢＭＣが、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から単離される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記対象が、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記方法が、工程（ａ）の前に前記ＰＢＭＣを凍結保存することをさらに含む、項目５２～６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記Ｔ細胞が、工程（ｃ）後に凍結保存される、項目５２～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記Ｔ細胞が活性化され、約１８～約２４時間、刺激して増殖される、項目５２～７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記Ｔ細胞の活性化が、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、項目５２～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片が、可溶性である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片が、表面に結合される、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
前記表面が、ビーズ、任意に常磁性ビーズである、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記Ｔ細胞の刺激が、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、項目５２～７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片が、可溶性である、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片が、表面に結合される、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記表面がビーズ、任意に常磁性ビーズであり、任意に、前記抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片に結合される前記常磁性ビーズである、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記細胞が、ＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターで形質導入される、項目５２～８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、項目５２～８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＺＳＴＫ４７４である、項目５２～８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
養子細胞療法において、ＣＤ４^＋ ＴＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を増加させる方法であって、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、ＣＤ４^＋ ＴＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ様抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数は、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも２倍多い、方法。
（項目８５）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも１０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも１５％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目８４または項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも２０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目８４～８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも２５％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目８４～８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、少なくとも３０％のＣＤ２７^＋および／またはＬＥＦ１^＋および／またはＣＣＲ７^＋および／またはＴＣＦ１^＋Ｔ細胞を含む、項目８４～８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記Ｔ細胞が自己である、項目８４～８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記方法が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記Ｔ細胞源として単離することをさらに含む、項目８４～９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記ＰＢＭＣが、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象から単離される、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記対象が、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターを含む、項目８４～９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、項目８４～９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、項目８４～９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
薬学的に許容可能な賦形剤および項目５２～８３のいずれか一項に記載の方法による前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量を含む、医薬組成物。
（項目９８）
薬学的に許容可能な賦形剤および項目８４～９６のいずれか一項に記載のＣＤ４^＋ ＴＣＭ 抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ８^＋ ＴＳＣＭ 抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量を含む、医薬組成物。
（項目９９）
多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象を、項目９７または項目９８に記載の組成物で治療する方法。
（項目１００）
前記対象が、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞における（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの遺伝子発現を増加させる方法であって、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの前記遺伝子発現が、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍多い、方法。
（項目１０２）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞における（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現を減少させる方法であって、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの前記遺伝子発現が、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍少ない、方法。
（項目１０３）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞における（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの遺伝子発現を増加させ、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現を減少させる方法であって、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂのそれぞれの前記遺伝子発現は、少なくとも１．５倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの前記遺伝子発現は、少なくとも１．５倍少ない、方法。
（項目１０４）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性を増加させる方法であって、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、治療有効性の前記増加は、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または
（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはすべてのそれぞれの遺伝子発現の増加が、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍多いことにより示される、方法。
（項目１０５）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性を増加させる方法であって、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、治療有効性の前記増加は、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現の減少が、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において少なくとも１．５倍少ないことにより示される、方法。
（項目１０６）
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性を増加させる方法であって、約５～約７日間、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含み、治療有効性の前記増加は、約１０日間、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞において、（ｉ）ＮＲ４Ａ２、ＬＹ９、ＬＩＮ７Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＢＣＬ６、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ１、ＩＬ－１Ａ、およびＣＣＬ５または（ｉｉ）ＣＣＬ１、ＮＲ４Ａ２、ＡＴＦ３、ＣＣＬ５、およびＷＮＴ５Ｂの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはすべてのそれぞれの遺伝子発現の増加が少なくとも１．５倍多く、（ｉ）ＮＱＯ１、ＣＣＮＡ１、ＩＬ１７Ｆ、ＥＭＰ１、ＳＮＨＧ１９、ＰＲＲ２２、ＩＬＤＲ２、ＡＴＡＤ３、ＮＫＤ２およびＷＤＲ６２または（ｉｉ）ＮＫＤ２およびＮＱＯ１のそれぞれの遺伝子発現の減少が１．５倍少ないことにより示される、方法。
（項目１０７）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、多発性骨髄腫またはリンパ腫を有する対象からのものである、項目１０１～１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、再発性／難治性の多発性骨髄腫を有する対象からのものである、項目１０１～１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が、前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターを含む、項目１０１～１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが配列番号 １に記載されるアミノ酸配列を含む、項目１０１～１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号 ２に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、項目１０１～１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞が自己である、項目１０１～１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＺＳＴＫ４７４である、項目１０１～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【外国語明細書】