特開 2024-115126 ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法、およびそのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024115126

(43)【公開日】2024-08-26

(54)【発明の名称】ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法、およびそのキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/26 20060101AFI20240819BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240819BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240819BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/26

C12M1/34 A

C12M1/34 E

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023020619

(22)【出願日】2023-02-14

(71)【出願人】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100193725

【弁理士】

【氏名又は名称】小森 幸子

(74)【代理人】

【識別番号】100163038

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 武志

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】福原 裕司

(72)【発明者】

【氏名】小松 加代子

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 倫

(72)【発明者】

【氏名】川上 幸治

(72)【発明者】

【氏名】角 将一

(72)【発明者】

【氏名】小林 稔秀

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB11

4B029BB16

4B029FA12

4B029FA13

4B063QA05

4B063QQ08

4B063QQ22

4B063QR02

4B063QR58

4B063QR77

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法を提供する。
【解決手段】（１）ＩＥＣ－６細胞を含む培地にビタミンＤ３を添加して所定の期間にわたり培養する工程１と、（２）前記所定の期間内に、前記工程１の培地に前記被験物質を添加して再び培養する工程２と、（３）前記所定の期間が経過した後、前記工程１から取得したＩＥＣ－６細胞と、前記工程２から取得したＩＥＣ－６細胞のそれぞれの前記薬物代謝酵素の活性を比較して、前記酵素誘導または前記酵素阻害を評価する工程３と、を包含する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法であって、
（１）ＩＥＣ－６細胞を含む培地にビタミンＤ３を添加して所定の期間にわたり培養する工程１と、
（２）前記所定の期間内に、前記工程１の培地に前記被験物質を添加して再び培養する工程２と、
（３）前記工程１から取得したＩＥＣ－６細胞と、前記工程２から取得したＩＥＣ－６細胞のそれぞれの前記薬物代謝酵素の活性を比較して、前記酵素誘導または前記酵素阻害を評価する工程３と、
を包含する方法。

【請求項2】

前記酵素誘導を評価する場合、前記所定の期間は６日～２１日であり、
前記酵素阻害を評価する場合、前記所定の期間は１３日～２１日であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記工程１の前に、ＩＥＣ－６細胞を継代培養する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するためのキットであって、
（１）ＩＥＣ－６細胞を含む培地にビタミンＤ３を添加して所定の期間にわたり培養する手段１、
（２）前記所定の期間内に、前記手段１の培地に前記被験物質を添加して再び培養する手段２と、
（３）前記所定の期間が経過した後に、前記手段１から取得したＩＥＣ－６細胞と、前記手段２から取得したＩＥＣ－６細胞のそれぞれの前記薬物代謝酵素の活性を比較して、前記酵素誘導または前記酵素阻害を評価する評価手段と、
を備えるキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法、およびそのキットに関する。なお、本願において、ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素とは、薬物代謝酵素として機能しているＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０３Ａをさす。

【背景技術】

【0002】

薬物代謝は、薬物や毒物などの生体外物質の代謝反応であり、体を守る重要な反応である一方、医薬品の副作用の発現にも関わることが知られている。薬物代謝を行う酵素は薬物代謝酵素といい、主に肝細胞または腸管上皮細胞内の小胞体に発現している。経口薬は摂取後に腸に到達することから、薬物間相互作用または食薬相互作用の評価においては、腸における薬物代謝酵素への影響を評価することが重要である。

【0003】

例えば、特許文献１は被験物質が薬物代謝酵素へ与える影響を評価するため、肝細胞の小胞体に発現するミクロソームが有する薬物代謝酵素Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０（ＣＹＰ）を用いた評価法を開示する。具体的には、由来の明らかな肝臓をホモジナイズして得られる破砕物を遠心分離等してＣＹＰを取得し、被験物質の評価に用いる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００７－２３６３２７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、特許文献１による手法では、ミクロソームを取り出す際に肝細胞を破砕してしまう。そのため酵素阻害の評価はできても酵素誘導の評価を行うことはできない。

【0006】

また、生体ではミクロソームは肝細胞や小腸上皮細胞の細胞膜の内側に存在する。ところが特許文献１の評価系では、細胞膜は既に破壊されているため被験物質がミクロソームへ直接作用することとなり、ｉｎ ｖｉｖｏの試験系と比較してリスクを過剰に検出してしまうなど、被験物質の評価方法に関し更なる研究・開発を行う余地が残っていた。

【0007】

そこで、本発明は、ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法であって、ｉｎ ｖｉｖｏへの外挿性がより高い評価方法、およびそのキットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、鋭意研究を行った結果、意外にもラット小腸上皮由来細胞（ＩＥＣ－６細胞）にビタミンＤ３を添加して培養することにより、ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素における、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価する方法、及びそのキットを見出した。本発明の特徴については、以下の通りである。

【0009】

［１］ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法であって、
（１）ＩＥＣ－６細胞を含む培地にビタミンＤ３を添加して所定の期間にわたり培養する工程１と、
（２）前記所定の期間内に、前記工程１の培地に前記被験物質を添加して再び培養する工程２と、
（３）前記工程１から取得したＩＥＣ－６細胞と、前記工程２から取得したＩＥＣ－６細胞のそれぞれの前記薬物代謝酵素の活性を比較して、前記酵素誘導または前記酵素阻害を評価する工程３と、
を包含する方法。

【0010】

［２］前記酵素誘導を評価する場合は、前記所定の期間は６日～２１日であり、
前記酵素阻害を評価する場合は、前記所定の期間は１３日～２１日であることを特徴とする、上記［１］に記載の方法。

【0011】

［３］前記工程１の前に、ＩＥＣ－６細胞を継代培養する工程をさらに含む、上記［１］に記載の方法。

【0012】

［４］ＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価するためのキットであって、
（１）ＩＥＣ－６細胞を含む培地にビタミンＤ３を添加して所定の期間にわたり培養する手段１、
（２）前記所定の期間内に、前記手段１の培地に前記被験物質を添加して再び培養する手段２と、
（３）前記手段１から取得したＩＥＣ－６細胞と、前記手段２から取得したＩＥＣ－６細胞のそれぞれの前記薬物代謝酵素の活性を比較して、前記酵素誘導または前記酵素阻害を評価する評価手段と、
を備えるキット。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、特許文献１の評価系の様に評価試験中に細胞を破砕することがないため、被験物質の酵素阻害の評価だけでなく、酵素誘導の評価を行うこともできる。また、細胞を破砕せずに酵素阻害の評価を行うため、ｉｎ ｖｉｖｏへの外挿性がより高い方法を提供できる。また、本方法にて使用するキットを提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は本発明の方法を説明するフローチャートである。

【図2】図２はＩＥＣ－６細胞に関し、生残性の指標となるＡＴＰ活性の経時的推移を示すグラフである。

【図3】図３（ａ）はＩＥＣ－６細胞の培養１３日目の透過型電子顕微鏡像である。また、図３（ｂ）は、ＩＥＣ－６細胞の培養２７日目の透過型電子顕微鏡像である。

【図4】図４（ａ）は各種サプリメント添加後のＩＥＣ－６細胞におけるＣＹＰ３Ａ活性の経時的推移を示す棒グラフである。また、図４（ｂ）はビタミンＤ３添加によるＩＥＣ－６細胞の薬物応答性に対する影響を示す棒グラフである。図４（ｃ）はビタミンＤ３添加によるＩＥＣ－６細胞のＣＹＰ３Ａ遺伝子の発現変動をＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示す。

【図5】図５は、ＩＥＣ－６細胞を用いて、被験物質のＣＹＰ３Ａの酵素誘導を評価する用途に供することが可能であるかを検証したグラフである。

【図6】図６は、ＩＥＣ－６細胞を用いて、被験物質のＣＹＰ３Ａの酵素阻害を評価する用途に供することが可能であるかを検証したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の評価方法およびそのキットについて詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の一実施形態としての一例であり、これらの内容に特定されるものではない。

【0016】

本発明はＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素において、被験物質の酵素誘導または酵素阻害を評価する。評価系の培地にはＩＥＣ－６細胞に１α，２５－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３（ビタミンＤ３）を添加して培養を行う。

【0017】

ＣＹＰ３Ａは医薬品の５０％以上の代謝に関与する薬物代謝酵素であり、小腸および肝臓に発現する酵素として知られる。また、ＣＹＰ３Ａはグレープフルーツジュース（ＧＦＪ）によって活性が阻害されること、ハイパーフォーリン（ｈｙｐｅｒｆｏｒｉｎ）やリファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）によって活性が誘導されることで知られる。

【0018】

被験物質とは、薬物間相互作用または食薬相互作用の評価試験において対象となる化学的物質、生物学的物質、またはその製剤を指す。酵素誘導とは被験物質によって組織の酵素の量または活性が増加することをいう。また、酵素阻害とは被験物質によって組織の酵素の量または活性が減少することをいう。

【0019】

ここで、本発明の評価方法について図１のフローチャートを用いて簡単に説明する。操作を開始すると、ステップＳ１００１でＩＥＣ－６細胞を含む培地にビタミンＤ３を添加して所定の期間にわたり培養を行う。

【0020】

次に、ステップＳ１００２で、ステップＳ１００１の培地に被験物質を添加して再び培養を行う。

【0021】

次に、ステップＳ１００３で、ステップＳ１００１から取得したＩＥＣ－６細胞と、ステップＳ１００２で取得したＩＥＣ－６細胞のそれぞれのＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素の活性を比較して、酵素誘導または酵素阻害の評価を行い、操作を終える。

【0022】

上述したステップＳ１００１ないしＳ１００３の操作は、ステップＳ１００１に係る操作を行う手段１、ステップＳ１００２に係る操作を行う手段２、ステップＳ１００３に係る操作を行う手段３、を備えるキット、または評価システムを用いることにより操作を行う。

【0023】

本方法で用いる細胞は、ラット小腸由来の株化細胞で未分化な非腫瘍性細胞のＩＥＣ－６細胞である。ＩＥＣ－６細胞は、免疫学的および形態学的に未分化なクリプト細胞に類似した接着性の細胞である。ＩＥＣ－６細胞は培養中にリファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）等のＣＹＰ誘導剤を添加することでＣＹＰ３Ａ分子種のｍＲＮＡが誘導されることが知られている。しかし、ＩＥＣ－６細胞のＣＹＰ３Ａ分子種の活性は極めて少なく、リファンピシン等を添加しても活性は誘導されない。そのため、ＩＥＣ－６細胞をそのまま培養して腸管上皮様の細胞に分化させても、ＣＹＰ３Ａの活性および薬物応答性は認められない。

【0024】

ところが、ステップＳ１００１にて述べたようにＩＥＣ－６細胞を含む培地にビタミンＤ３を添加して所定の期間にわたり培養すると、ＣＹＰ３Ａは酵素活性および薬物応答性を示すようになることを本願発明者等は予期せず発見した。本発明は当該発見に基づいて構成される。

【0025】

ＩＥＣ－６細胞の培養期間について、下限として、好ましくは、培養開始から３日以上培養したものを各種評価に用いる。より好ましくは、培養開始から４日以上培養したものを各種評価に用いる。上記の下限よりも短い培養期間の細胞を評価試験で用いると、細胞の分化が不十分となり試験に適さないためである。

【0026】

また、上限として、好ましくは、培養開始から４週間以内のものを各種評価に用いる。より好ましくは、培養開始から３週間以内のものを各種評価に用いる。上記の上限よりも長い期間培養を行った細胞を評価試験で用いると、細胞の活性が低下して評価試験中に細胞死する可能性があるためである。

【0027】

また、被験物質の酵素誘導を評価する場合は、下限として、好ましくは、培養開始から６日以上培養したものを酵素誘導の評価に用いる。より好ましくは、培養開始から７日以上培養したものを酵素誘導の評価に用いる。上記の下限よりも培養期間の短い細胞を酵素誘導の評価に用いると、十分なＣＹＰ３Ａ活性を得られず試験に適さないためである。

【0028】

また、上限として、好ましくは培養開始から４週間以内のものを酵素誘導の評価に用いる。より好ましくは、培養開始から２１日（３週間）以内のものを酵素誘導の評価に用いる。上記の上限よりも長い期間培養を行った細胞を評価試験で用いると、細胞の活性が低下して評価試験中に細胞死する可能性があるためである。

【0029】

また、ＩＥＣ－６細胞を用いて被験物質の酵素阻害を評価する場合は、下限として、好ましくは、培養開始から１３日以上培養したものを酵素阻害の評価に用いる。より好ましくは、培養開始から１４日以上培養したものを酵素阻害の評価に用いる。ＣＹＰ３Ａ阻害試験では、ＣＹＰ活性が十分に上昇した状態のＩＥＣ－６細胞を用いる必要があるためである。

【0030】

なお、ＩＥＣ－６細胞を用いて被験物質の酵素阻害を評価する場合の上限に関しては酵素誘導を評価する場合と変わらない。すなわち、好ましくは培養開始から４週間以内のものを用いる。より好ましくは、培養開始から２１日（３週間）以内のものを用いる。

【0031】

また、ＩＥＣ－６細胞へのビタミンＤ３の添加時期は、好ましくは培養開始から３日目である。より好ましくは、培養開始から４日目である。上記の日数よりも若い細胞では細胞の分化が不十分となり試験に適さないためである。

【実施例0032】

（実施例１）
〈細胞・試薬・測定キット〉
細胞、試薬、測定キット等の調達に関し説明する。ＩＥＣ－６細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ細胞株）は、住商ファーマインターナショナルより購入した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ウシインシュリンは、Ｍｅｒｃｋ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）より購入した。ウシ胎児血清、０．２５％のｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡは、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Ｇｉｂｃｏ）より購入した。１α，２５－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ（ビタミンＤ３）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）より購入した。ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＡＭＰ）、ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｙｄｒａｔｅ（ＧＭＰ）、ｃｙｔｉｄｉｎｅ ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＣＭＰ）、ｕｒｉｄｉｎｅ ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＵＭＰ）およびｉｎｏｓｉｎｅ ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｙｄｒａｔｅ（ＩＭＰ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。イソフラボン混合物は、富士フイルム和光純薬より購入した。ＲＩＦ、イソプロピルアルコールおよびクロロホルムは、富士フイルム和光純薬より購入した。Ｈｙｐｅｒｆｏｒｉｎ．ＤＣＨＡは、Ａｄｉｐｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓより購入した。Ｄｏｌｅ（登録商標）グレープフルーツ１００％（ＧＦＪ）は、雪印メグミルクより購入した。ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_{１２－１８}Ｐｒｉｍｅｒ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、ＲＮａｓｅＯＵＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＤＴＴと５×Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｕｆｆｅｒを含む）およびｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入した。Ｐ４５０－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍはプロメガより購入した。

【0033】

（実施例２）
〈培養液、サプリメントおよびＣＹＰ誘導剤の調製〉
次に、培養液、サプリメントおよびＣＹＰ誘導剤の調製方法に関し説明する。ＩＥＣ－６細胞を培養する培養液はＤＭＥＭ培地に非働化したウシ胎児血清（１０％）と、ウシインシュリン（０．１Ｕ／ｍＬ）を添加したものを使用した。

【0034】

上述した様に、未分化なＩＥＣ－６細胞は、そのまま腸管上皮様の細胞へ分化しても、ＣＹＰ３Ａの活性および薬物応答性を示すことはないか、活性が極めて低い。そこで、本発明者等は後述するように比較試験を行い、どのようなサプリメントを添加することにより、ＣＹＰ３Ａの活性および薬物応答性を誘導することができるのか検討した。

【0035】

比較試験に用いられたサプリメントは、ビタミンＤ３、イソフラボン、およびヌクレオチドである。ビタミンＤ３は１ｍＭの試薬をそのまま使用した。イソフラボンはＤＭＳＯで希釈し、１０ｍＭに調製した溶液を使用した。ヌクレオチドはＣＭＰ：ＵＭＰ：ＡＭＰ：ＩＭＰ：ＧＭＰ＝１４３：１４．３：１４．３：１４．３：１４．３の比率となるように超純水で２０ｍｇ／ｍＬに調製したものを使用した。

【0036】

また、ＣＹＰ誘導剤のリファンピシン（ＲＩＦ）は、ＤＭＳＯで溶解し、１００ｍＭに調製したものを使用した。Ｓｔ． ｊｏｈｎ’ｓ ｗｏｒｔの有効成分であるハイパーフォーリン（ｈｙｐｅｒｆｏｒｉｎ）はＤＭＳＯで希釈し、１０ｍＭに調製した溶液を使用した。サプリメントおよびＣＹＰ誘導剤は、いずれも用時調製で使用した。

【0037】

（実施例３）
〈ＩＥＣ－６細胞の継代培養〉
ＩＥＣ－６細胞の継代培養について説明する。凍結されたＩＥＣ－６細胞を３７℃恒温水層にて急速に溶解し、細胞懸濁液の９倍量の培養液に添加した。室温にて８００ｒｐｍで７分間遠心し、上清を捨て得られたペレットに培養液を５ｍＬ加え、再懸濁した。再遠心後、得られたペレットに培養液を１０ｍＬ加えて懸濁し、その全量を、培養液１０ｍＬを入れた培養用フラスコ（コーニング、７５ｃｍ^２）に移して３７℃、５％のＣＯ_２条件下で３日間培養した。３日後にフラスコ内の細胞がコンフルエントになっていないことを確認し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ（ＰＢＳ）洗浄後に０．２５％のｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液で処理して細胞を剥離し、０．２５％のｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液と同量の培養液を添加して室温、８００ｒｐｍにて７分間遠心した。上清を捨て得られたペレットに培養液を５ｍＬ加えて再懸濁し、血球計算盤で細胞数をカウントした。細胞浮遊液中の濃度が８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう培養液を添加し、培養液を２０ｍＬ入れた培養用フラスコに１ｍＬずつ播種した。各実験にはｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ１６－２０の細胞を使用した。

【0038】

（実施例４）
〈９６ウェルプレートでの培養〉
９６ウェルプレートでのＩＥＣ－６細胞の培養について説明する。継代後３日目に培養用フラスコ内の細胞を０．２５％のｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液で処理し、細胞数が４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう培養液で調製した。調製した細胞懸濁液を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに１００μＬずつ充填し、３７℃、５％のＣＯ_２条件下で培養した。

【0039】

細胞を９６ウェルプレートに播種した日をｄａｙ０とし、３～４日おきに培養液を交換し、最大ｄａｙ２１まで培養を継続してＣＹＰ活性測定、および生存細胞数の測定に用いた。

【0040】

（実施例５）
〈６ウェルプレートでの培養〉
６ウェルプレートでのＩＥＣ－６細胞の培養について説明する。継代後３日目に培養用フラスコ内の細胞を０．２５％のｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液で処理し、細胞数が４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう培養液で調製した。調製した細胞懸濁液を６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに３ｍＬずつ充填し、３７℃、５％のＣＯ_２条件下で培養した。

【0041】

細胞を６ウェルプレートに播種した日をｄａｙ０とし、３～４日おきに培養液を交換して最大ｄａｙ２１まで培養を継続し、ｍＲＮＡ発現量の解析に用いた。

【0042】

（実施例６）
〈生存細胞数の測定〉
細胞を９６ウェルプレートに採種した日を０日目（Ｄａｙ０）として、Ｄａｙ４、８、１２、１６、２０および２４に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（プロメガ株式会社）を用いて各２ウェルずつ生存細胞数を測定した。測定は１回実施した（ｎ＝１）。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏは代謝活性を有する生存細胞に由来するＡＴＰを、ルシフェラーゼを利用することで定量するキットである。通常、培養条件下では、ＡＴＰ量は生存細胞数に比例することが広く知られているため、細胞数の測定に本キットを使用した。

【0043】

（実施例７）
〈電子顕微鏡的検査〉
また、実施例６において生存細胞数を測定する際、細胞を９６ウェルプレートに採種した日を０日目（Ｄａｙ０）として、Ｄａｙ１３および２７に電子顕微鏡的検査を行った。手順は以下の通りである。まず、培地を除去し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液で洗浄した。次に、氷上にて０．１Ｍカコジル酸緩衝液２．５％のグルタールアルデヒド液で培地を３０分間浸漬固定した。次に、０．１Ｍカコジル酸緩衝液で洗浄した後、氷上にて０．１Ｍカコジル酸緩衝液１％四酸化オスミウム液で３０分間浸漬固定した。次に、定法に従ってエポン樹脂包埋し、超薄切片を作成し、１％酢酸ウランおよびクエン酸鉛による二重染色を行って透過型電子顕微鏡で観察した。

【0044】

実施例６の結果を図２に、実施例７の透過型電子顕微鏡像を図３に示す。図２は、ＩＥＣ－６細胞に関し、生残性の指標となるＡＴＰ活性の経時的推移を示すグラフである。縦軸は発光量（ＲＬＵ）を用いてＡＴＰ活性を示し、横軸がサンプリングの日数を示す。図２から、ＩＥＣ－６細胞は培養開始から４日には既にＡＴＰ活性を示し始め、２０日（培養開始から約３週間）をピークとしてＡＴＰの値が低下に転じることが明らかになった。また、２４日目においても、ＡＴＰの値が低下するものの各種評価試験に供することは可能である。

【0045】

また、図３の電子顕微鏡を用いた細胞の観察では、培養１３日目にはＣＹＰの発現部位である滑面小胞体（図３ａの白矢印が指し示す部分）が豊富に観察されたが、培養開始から２７日目（培養開始から約４週間）には滑面小胞体の存在は不明瞭となり、オルガネラ（細胞内小器官）の残渣と考えられる構造物（図３ｂの黒矢印が指し示す部分）が観察された。なお、図３ｂのダイヤマークはミトコンドリアを示す。これらのデータから、培養開始から約４週間を過ぎると細胞の各種活性は低下し、細胞死に至ることが推察された。

【0046】

以上のことから、ＩＥＣ－６細胞の培養期間に関し、下限として、好ましくは、培養開始から３日以上培養したもの、より好ましくは、培養開始から４日以上培養したものを各種評価に用いることが望ましいことが明らかとなった。

【0047】

また、上限として、好ましくは、培養開始から４週間以内のもの、より好ましくは、培養開始から３週間以内のものを各種評価に用いることが望ましいことが明らかとなった。

【0048】

（実施例８）
〈サプリメントの添加〉
９６ウェルプレートおよび６ウェルプレートに播種したＩＥＣ－６細胞を、ｄａｙ４以降の培地交換時はサプリメント添加培養液を用いて材料採取日まで培養した。各サプリメントの培養液中の濃度は、ビタミンＤ３は２５０ｎＭ、ヌクレオチドは１００μｇ／ｍＬ（ＣＭＰ：ＵＭＰ：ＡＭＰ：ＩＭＰ：ＧＭＰ＝１４３：１４．３：１４．３：１４．３：１４．３）、イソフラボンは１００μＭとなるように調製した。

【0049】

（実施例９）
〈ＣＹＰ誘導剤の処置〉
ＲＩＦの濃度が１００μＭとなるように培養液で希釈し、材料採取日（ｄａｙ７、１４および２１）の前日に培地交換を行った。また、対照となる細胞は、ＣＹＰ誘導剤と同じ容量のＤＭＳＯを含む培養液を用いて、材料採取日の前日に培地交換を行った。

【0050】

（実施例１０）
〈総ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成〉
ＣＹＰ誘導剤処置から約２４時間経過後、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、洗浄液を除去した後にＴＲＩｚｏｌを１ｍＬ加えて細胞を溶解して、１．７ｍＬチューブに移して室温で５分間インキュベートした。クロロホルムを０．２ｍＬ加え、チューブを１５秒間強く振って混合した後、室温で２－３分間インキュベートした。４℃で１５分間、１２，０００ｇで遠心し、ＲＮＡが溶解する上部の水層（約０．６ｍＬ）を新しいチューブに移した後、イソプロピルアルコールを０．５ｍＬ加えて転倒混和し、室温で１０分間インキュベートした。その後、４℃で１０分間、１２，０００ｇで遠心し、上清を除去した後に残るＲＮＡペレットを７５％エタノールで１回洗浄した。チューブに７５％エタノールを１ｍＬ加えてボルテックス処理し、４℃で５分間、７，５００ｇで遠心した。上清を除去してＲＮＡペレットを乾かし、２０μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水を加えて溶解したものをＴｏｔａｌのＲＮＡ溶液とした。抽出したＲＮＡは分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ８００、ベックマンコールター株式会社）を用いて濃度と純度の確認を行った。次に、ｃＤＮＡを合成するため、ＰＣＲチューブにｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８（１μＬ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１μＬ）、およびＲＮＡ量が３μｇとなるようにＲＮＡ溶液と注射用水を合わせて１３μＬ加え、６５℃で５分間加熱し、氷上で１分間以上インキュベートした。チューブ内に０．１ＭのＤＴＴ（１μＬ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１μＬ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III ＲＴ（１μＬ）および５×Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｕｆｆｅｒ（４μＬ）を加え、サーマルサイクラー（ｉ Ｃｙｃｌｅｒ、日本バイオ・ラッドラボラトリーズ）にて逆転写（５０℃で４５分間、７０℃で１５分間）し、ｃＤＮＡ溶液としてＰＣＲ反応を行うまで－２０℃で保管した。

【0051】

（実施例１０）
〈ＲＴ－ＰＣＲ反応〉
プライマーはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃよりｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓを購入した。ｍＲＮＡの発現はｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを用いて、ＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。ＣＹＰ３Ａ９を標的遺伝子とし、ｍＲＮＡの発現はβ－ａｃｔｉｎを内在性コントロールとして補正し、比較定量法（ΔΔＣｔ法）によりＤＭＳＯ処置細胞に対するＣＹＰ誘導剤処置細胞の発現量の変化を解析した。

【0052】

（実施例１１）
〈ＣＹＰ活性の測定〉
ＣＹＰ活性はプロメガより購入したＰ４５０－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。まず、９６ウェルプレート中の培養液を除去し、ＣＹＰ誘導剤およびＤＭＳＯを添加していない培養液で１回洗浄した。次に、３ｍＭのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを基質としＤＭＥＭで希釈して基質の終濃度を３μＭとした基質溶液を５０μＬずつ添加し、３７℃で４時間インキュベートした。発光試薬を５０μＬ加え、細胞を融解させるためにシェーカーで２分間撹拌し、室温で２０分間インキュベートした。ルミノメーターを用いて得られた発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ； ＲＬＵ）をＣＹＰ代謝物濃度の代替値として解析を行った。

【0053】

（実施例１２）
〈食品または食品由来成分を用いたＣＹＰ３Ａ誘導および阻害試験〉
ビタミンＤ３添加培地で培養したＩＥＣ－６細胞にハイパーフォーリンまたはＧＦＪを処置した際のＣＹＰ３Ａ活性の変動を解析した。ハイパーフォーリンは最終濃度が３．３３μＭとなるように培養液で調製したものを最高濃度として、公比３で合計５段階の濃度に段階希釈した。各濃度のハイパーフォーリンを含む培養液を用いてＩＥＣ－６細胞を４８時間培養後、ｄａｙ２１に測定を実施した。ＧＦＪは培養液で１０倍希釈したものを最高濃度として、公比３で合計５段階の濃度に段階希釈した。各濃度のＧＦＪを含む培養液を用いてＩＥＣ－６細胞を４時間培養後、ｄａｙ２１に測定を実施した。ＣＹＰ活性の測定は実施例１１と同様に実施した。

【0054】

（実施例１３）
〈データ解析〉
対照との比較対象が１群である場合はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定、２群以上の場合はＤｕｎｎｅｔｔ法を実施した（有意水準５％）。統計処理は、Ｅａｓｙ Ｒを用いて行った。

【0055】

実施例８～１３の結果を、図４～６に示す。まず、図４（ａ）は各種サプリメント添加後のＩＥＣ－６細胞におけるＣＹＰ３Ａ活性の経時的推移を示す棒グラフである。縦軸は発光量（ＲＬＵ）を用いてＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素の活性を示し、横軸がサンプリングの日数を示す。データは各条件で培養した細胞（ｎ＝３）から得られた数値の平均値±標準偏差で示している。棒グラフのヒゲは発光量の最大値を示す。

【0056】

ＣＹＰ３Ａ活性は、サプリメント非添加の細胞、ヌクレオチドを添加した細胞、およびイソフラボンを添加した細胞ではいずれの解析時点においても検出限界値以下であった。一方、ビタミンＤ３を添加した細胞では、全ての解析時点で活性が検出され、さらに経時的な活性の増加が認められた。

【0057】

また、本発明者等はＣＹＰ３Ａ以外にも、ＣＹＰ１ＡおよびＣＹＰ２Ｂの活性についても比較試験を行ったが、ビタミンＤ３を添加して活性の増加が認められた薬物代謝酵素はＣＹＰ３Ａだけであった（データ非開示）。このため、ビタミンＤ３のサプリメントは、薬物代謝酵素の中でもＣＹＰ３Ａの活性に対してのみ特異的に作用することが明らかとなった。

【0058】

また、図４（ｃ）は、ビタミンＤ３添加によるＩＥＣ－６細胞のＣＹＰ３Ａ９遺伝子の発現変動をＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示す。縦軸はｍＲＮＡの相対発現量（ΔΔＣｔ）を示し、横軸はサンプリングの日数を示す。棒グラフのヒゲは相対発現量の最大値を示す。データは各条件で培養した細胞（ｎ＝３）から得られた数値の平均値±標準偏差で示している。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。

【0059】

図４（ｃ）から、サプリメント非添加細胞と比べて、ビタミンＤ３添加細胞では解析時点でのＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素の有意な発現増加が遺伝子レベルで確認できた。

【0060】

また、図４（ｂ）は、ビタミンＤ３添加によるＩＥＣ－６細胞の薬物応答性に対する影響を示す棒グラフである。縦軸は発光量（ＲＬＵ）を用いてＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素の活性を示し、横軸がサンプリングの日数を示す。データは各条件で培養した細胞（ｎ＝３）から得られた数値の平均値±標準偏差で示している。＃はｐ＜０．０５を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。ＤＭＳＯ処置細胞とＣＹＰ３Ａ誘導剤処置細胞の間の有意差は、Ｄｕｎｎｅｔ検定によって検定した。

【0061】

ビタミンＤ３を添加したＩＥＣ－６細胞にＣＹＰ３Ａ誘導剤のＲＩＦ処置し、対照（ＤＭＳＯ処置）と比較してＣＹＰ３Ａ活性が誘導されるか否か確認をした結果、ＣＹＰ３Ａ活性はビタミンＤ３非添加の細胞ではいずれの誘導剤を処置しても誘導は認められなかったが（データ非開示）、ビタミンＤ３を添加した細胞では、全ての解析時点でＲＩＦ処置によるＣＹＰ３Ａ活性の有意な増加が認められ、Ｄａｙ２１において最も強い誘導が認められた。

【0062】

図４（ｂ）から、ビタミンＤ３を添加したＩＥＣ－６細胞はＣＹＰ３Ａ誘導剤に対し薬物応答性を有することが確認できた。また、ＩＥＣ－６細胞の培養開始４日目からビタミンＤ３を添加して培養を行うと、培養開始７日目（ビタミンＤ３添加後４日目）からＣＹＰ３Ａ活性は上昇し、ＣＹＰ３Ａ誘導剤のＲＩＦによる誘導作用も検出された。

【0063】

このため、ＩＥＣ－６細胞を用いて被験物質の酵素誘導を評価する場合は、下限として、好ましくは、培養開始から６日以上、より好ましくは、培養開始から７日以上培養したものを酵素誘導の評価に用いるのが望ましい。

【0064】

また、上限として、好ましくは培養開始から４週間以内、より好ましくは、培養開始から２１日（３週間）以内のものを酵素誘導の評価に用いるのが望ましい。

【0065】

さらに、ＩＥＣ－６細胞を用いて被験物質の酵素阻害を評価する場合は、下限として、好ましくは、培養開始から１３日以上、より好ましくは、培養開始から１４日以上培養したものを酵素阻害の評価に用いるのが望ましい。

【0066】

なお、ＩＥＣ－６細胞を用いて被験物質の酵素阻害を評価する場合の上限に関しては酵素誘導を評価する場合と変わらない。

【0067】

次に、図５および図６は、ＩＥＣ－６細胞を用いて、被験物質のＣＹＰ３Ａの酵素誘導および酵素阻害を評価する用途に供することが可能であるかを検証したグラフである。図５および図６は、ビタミンＤ３添加条件下で培養したＩＥＣ－６細胞に対し、ハイパーフォーリン（図５）、グレープフルーツジュース（ＧＦＪ）を処置した時のＣＹＰ３Ａ活性の誘導または阻害を評価したグラフである。ＣＹＰ誘導試験のデータ（図５）は、ＤＭＳＯ、ハイパーフォーリン、またはＲＩＦを処置した細胞（ｎ＝３）から得られた数値の平均値±標準偏差を示したものである。縦軸は発光量、横軸は処置した被験物質の濃度をそれぞれ示す。さらにＣＹＰ阻害試験のデータ（図６）は、ＧＦＪを処置した細胞（ｎ＝３）から得られた数値の平均値±標準偏差を示したものである。縦軸は発光量、横軸は処置したＧＦＪの濃度をそれぞれ示す。

【0068】

図５および図６のいずれの結果からも、用量依存的なＣＹＰ３Ａ活性の誘導および阻害がそれぞれ確認できた。よって、本方法が被験物質に関するＣＹＰ３Ａの薬物代謝酵素の酵素誘導または酵素阻害を評価するための方法として適切であることが確認できた。また、本方法に基づくアッセイのキットとしても利用可能であることが確認できた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】