知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024115488
(43)【公開日】2024-08-26
(54)【発明の名称】γ－アミノ酪酸含有発酵液の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 13/00 20060101AFI20240819BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20240819BHJP
A23L 33/175 20160101ALI20240819BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20240819BHJP
【ＦＩ】
C12P13/00
A23L33/135
A23L33/175
C12N1/20 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】書面
(21)【出願番号】P 2023033191
(22)【出願日】2023-02-14
(71)【出願人】
【識別番号】591119370
【氏名又は名称】ヤマモリ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】小村 愛
(72)【発明者】
【氏名】宮村 かおり
(72)【発明者】
【氏名】松本 裕子
【テーマコード（参考）】
4B018
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LE03
4B018MD19
4B018MD86
4B018ME04
4B018ME14
4B018MF13
4B064AE01
4B064CA02
4B064CC03
4B064CC09
4B064CC10
4B064CE00
4B064DA10
4B065AA21X
4B065AC14
4B065BB03
4B065BB12
4B065BB26
4B065BD33
4B065CA42
(57)【要約】
【課題】
グルタミン酸及び／又はその塩類を含む発酵原料にグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌を作用させてγ－アミノ酪酸を製造する方法において、純粋培養設備を要することなく安価に高濃度のγ－アミノ酪酸を付与することができると共に、アレルゲン物質を含まず汎用性の高いγ－アミノ酪酸含有発酵液を提供する事。
【解決手段】
ナトリウム濃度５．０ｗ／ｖ％～６．２ｗ／ｖ％、且つ水分活性（Ａｗ）０．８８６～０．９１０となるようにグルタミン酸及び／又はその塩類と食塩を添加した、小麦及び／又は大豆由来窒素源を含まない発酵原料にて、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌を接種して、一般細菌の増殖を抑制しながら、高濃度のγ－アミノ酪酸を含有する発酵液を製造する方法。
グルタミン酸及び／又はその塩類を含む発酵原料にグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌を作用させてγ－アミノ酪酸を製造する方法において、純粋培養設備を要することなく安価に高濃度のγ－アミノ酪酸を付与することができると共に、アレルゲン物質を含まず汎用性の高いγ－アミノ酪酸含有発酵液を提供する事。
【解決手段】
ナトリウム濃度５．０ｗ／ｖ％～６．２ｗ／ｖ％、且つ水分活性（Ａｗ）０．８８６～０．９１０となるようにグルタミン酸及び／又はその塩類と食塩を添加した、小麦及び／又は大豆由来窒素源を含まない発酵原料にて、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌を接種して、一般細菌の増殖を抑制しながら、高濃度のγ－アミノ酪酸を含有する発酵液を製造する方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
小麦及び／又は大豆由来窒素源を含まない発酵原料に、ナトリウム濃度５．０ｗ／ｖ％～６．２ｗ／ｖ％、且つ水分活性（Ａｗ）０．８８６～０．９１０となるようにグルタミン酸及び／又はその塩類と、食塩を添加し、これを加熱滅菌することなく、添加したグルタミン酸の６９％以上をγ－アミノ酪酸に変換させる乳酸菌を接種し培養することによって、γ－アミノ酪酸を６ｗ／ｖ％以上含むことを特徴とするγ－アミノ酪酸含有発酵液を製造する方法。
【請求項2】
アレルゲン物質を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のγ－アミノ酪酸含有発酵液の製造方法。
【請求項3】
請求項１に記載の製造方法により得られるγ－アミノ酪酸含有発酵液を、ろ過及び濃縮して、γ－アミノ酪酸を高含有する高濃度γ－アミノ酪酸含有発酵液の製造方法。
【請求項4】
請求項２に記載の製造方法により得られるγ－アミノ酪酸含有発酵液を、ろ過及び濃縮して、γ－アミノ酪酸を高含有する高濃度γ－アミノ酪酸含有発酵液の製造方法。
【請求項5】
請求項２に記載の製造方法により得られるγ－アミノ酪酸含有発酵液を含むことを特徴とする、飲料又は加工食品。
【請求項6】
請求項３に記載の製造方法により得られる高濃度γ－アミノ酪酸含有発酵液を含むことを特徴とする、飲料又は加工食品。
【請求項7】
請求項４に記載の製造方法により得られる高濃度γ－アミノ酪酸含有発酵液を含むことを特徴とする、飲料又は加工食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、γ－アミノ酪酸（以下、「ＧＡＢＡ」という）を、無菌的な設備を要することなく、安価に、雑菌の増殖を抑えながら乳酸菌の働きにより製造する方法、及びこの方法により得られるＧＡＢＡ含有発酵液がアレルゲン性物質を含まず高い汎用性を有することに関する。
【背景技術】
【0002】
自然界に広く分布している非たんぱく質構成アミノ酸であるＧＡＢＡは、哺乳類の脳や脊髄に存在する抑制系の神経伝達物質であり、生体内で重要な働きをすることが分かっている。ＧＡＢＡは、自律神経のバランスを整える作用を有することが知られており、その作用により、血圧の低下、ストレス緩和、リラックス、疲労感の軽減、睡眠の質を改善する等の効果を有することが確認されている
【0003】
食品の成分としても、茶、野菜類、穀類などに普通に含まれているアミノ酸であるが、その含有量は極めて少ない。食品製造分野では、前記ＧＡＢＡの有する血圧降下作用やリラックス作用を期待して、ＧＡＢＡ含有量を増強した食品素材、該素材を用いた食品を製造する方法が数多く報告されている。
【0004】
一部の微生物がグルタミン酸からＧＡＢＡを生産する能力に優れていることが知られており、中でも乳酸菌はＧＡＢＡの生産効率が良く、例えばラクトバチルス・ヒルガルディー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）（特許文献１）が開示されている。しかし、無塩又は低塩分の培地や食品素材に作用させるためには、他の微生物の増殖を抑えなければならず、純粋培養に近い発酵設備を要し、作用させる前に培地又は食品素材の滅菌を行う必要があった。また、発酵物の貯蔵、流通環境における微生物による腐敗を抑制するために粉体化を行い、保存安定性を高める必要があるといった課題があった。
【0005】
また、純粋培養設備を要することなく、安価にＧＡＢＡを増加させた食品の製造方法として、塩分を含有した食品に乳酸菌の休止菌体を作用させる方法（特許文献２）、醤油、味噌等の塩分含有食品に、耐塩性、アルコール耐性の高い乳酸菌を作用させる方法（特許文献３）、塩分及び乳酸を含有する食品素材に特定の乳酸菌を作用させる方法（特許文献４）などが開示されている。しかしながら、これらは最終生成ＧＡＢＡ濃度が低い、もしくは味噌、醤油等を含有することによる二次製品への風味影響や、それらに由来するアレルゲン物質を含んでいることから汎用性に欠けるといった課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００３－７０４６２号公報
【特許文献2】特開２００８－１７７８５号公報
【特許文献3】特開２００６－２４６８４０号公報
【特許文献4】国際公開ＷＯ２００７／０９７３７４
【非特許文献1】矢野 未右紀，“食品の水分活性について”，［ｏｎｌｉｎｅ］，平２６年１１月２０日，あいち産業科学技術総合センターニュース，ｐ５，［令和４年１月２４日検索］，インターネット ＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｉｃｈｉ－ｉｎｓｔ．ｊｐ／ｏｔｈｅｒ／ａｉｓａｎｋｅｎ＿ｎｅｗｓ／２０１４／＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、グルタミン酸及び／又はその塩類を含む食品にグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌を作用させてＧＡＢＡを製造する方法において、純粋培養設備を要することなく安価に高濃度のＧＡＢＡを付与することができると共に、アレルゲン物質を含まず汎用性の高いＧＡＢＡ含有発酵液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
そこで本発明者らは上述した課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、醤油から単離されたグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する耐塩性乳酸菌において、小麦及び／又は大豆由来の窒素源を一切含まない環境下で良好に生育し、且つグルタミン酸及び／又はその塩類を含む食品に高濃度のＧＡＢＡを付与させることができる菌株を選別することにより、アレルゲン物質を一切含まない高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液を安価に製造する方法を見いだし、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【0009】
従来であれば、醤油等の醸造発酵物より単離されるグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する耐塩性乳酸菌は、小麦及び／又は大豆に由来する窒素源を含有する培地又は食品素材において、良好な生育とＧＡＢＡ産生を行っていたが、本発明の方法により選別した乳酸菌を用いることにより、小麦及び／又は大豆に由来する窒素源を含まない環境下において、高濃度のＧＡＢＡを産生することができる。これにより製造されたＧＡＢＡ含有発酵液は、アレルゲン物質を含むことなく、多様な食品の製造に利用することができる。また、耐熱性菌の増殖を抑制する濃度のナトリウムを含有する培地にて、上述した乳酸菌を作用させることにより、純粋培養設備や、発酵液の保存性確保の為の粉体化を要することなく、安価にＧＡＢＡ含有発酵液の製造を行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の乳酸菌は、醤油から単離された耐塩性及びグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌のうち、小麦及び／又は大豆由来窒素源を含まない発酵原料にて良好に生育し、ＧＡＢＡを生産する能力を有するものである。
【0011】
醤油から単離された乳酸菌は、耐塩性及びグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌であれば特に限定しない。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を挙げることができる。これらの中でもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属するものが好ましく、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｎｎｉｎｉ等を挙げることができる。耐塩性及びグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌の選抜については、一般的な乳酸菌用の培地（ＭＲＳ培地）にグルタミン酸又はその塩と、塩化ナトリウムを含有させた液体培地に、分離した乳酸菌を接種して２５℃～３５℃で数日間培養後、この培養液のＧＡＢＡ含量を測定し、ＧＡＢＡ量の多い乳酸菌株を選定すれば良い。
【0012】
耐塩性及びグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌より、小麦及び／又は大豆由来窒素源を含まない発酵原料にて良好にＧＡＢＡを生産する乳酸菌を選抜するのは、次のような方法による。分離した乳酸菌を７ｗ／ｖ％以上のグルタミン酸を含有したアレルゲン物質を含まない発酵原料で培養して、よりグルタミン酸の消化率が高い菌株を選抜した。ＧＡＢＡ含有発酵液中の残存グルタミン酸量が高くなると、最終的に得られる飲料又は加工食品に旨味が付与されるために望ましくないことから、グルタミン酸の消化率が６９％以上、より好ましくは８４％以上であることが望ましい。
【0013】
本発明のＧＡＢＡ含有発酵液を製造するのに用いられる発酵原料は、グルタミン酸を含有する必要があり、ここでのグルタミン酸は、化学的にアミノ酸の一種であるＬ－グルタミン酸を指し、グルタミン酸ナトリウム、その他のグルタミン酸塩、食品たんぱく質を酸や酵素で加水分解して得られるグルタミン酸、さらには食品中に含まれる遊離グルタミン酸のいずれを用いても構わない。グルタミン酸の初発濃度は、１～２０ｗ／ｖ％に設定することが好ましく、より好ましくは９～１２ｗ／ｖ％の範囲である。乳酸菌の発酵副産物は、添加した飲料や加工食品の味、風味を低下させるものを含んでおり、精製工程を経ることで除去可能であるが、コストがかかるという問題がある。グルタミン酸の初発濃度がこの範囲であると、発酵液に含まれるＧＡＢＡ濃度が高くなり、所定濃度のＧＡＢＡを飲料や加工食品に含有させる場合、ＧＡＢＡ発酵液の添加量が少なくなる。これにより、乳酸菌の発酵過程で生じた発酵副産物による味・風味の影響がなくなるとともに、発酵液の精製工程が不要となり、安価に製造することができる。
【0014】
また、耐塩性乳酸菌におけるグルタミン酸脱炭酸酵素活性の阻害が起きず、一般細菌の増殖を抑制しながら良好な発酵を実施するために、ナトリウム濃度５．０ｗ／ｖ％～６．２ｗ／ｖ％、且つ水分活性（Ａｗ）０．８８６～０．９１０となるように、グルタミン酸及び／又はその塩類と食塩を添加することが好ましい。
【0015】
本発明に用いられる発酵原料は、乳酸菌の生育を促進するために、上記したグルタミン酸及び／又はその塩類や食塩の他に、ブドウ糖、果糖などの糖質や、酵母エキス等のビタミンやミネラルを含む食品から１つ以上を含有することが好ましい。さらに、乳化剤や安定剤、ｐＨ調整剤などの食品添加物を用いても構わない。発酵原料に用いることができる窒素含有食品としては、小麦及び／又は大豆由来窒素源を含まないものが好ましい。より好ましくは、アレルゲン物質を一切含まないものが望ましい。ここでのアレルゲン物質とは、食品表示基準により定められている特定原材料７品目及び特定原材料に準ずるもの２１品目を示している。アレルゲン物質を含まない窒素含有食品として、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、そら豆タンパク加工品、エンドウ豆タンパク加工品等を使用することができる。
【0016】
発酵に使用される容器は、洗浄や加熱殺菌を行うことができて、食品の製造に使用可能である容器であれば、大きさや材質を問わない。蓋を閉めて、嫌気的な環境で培養できるものが好ましい。
【0017】
発酵の条件は、次の通りである。発酵温度は、好ましくは２５℃～４０℃、より好ましくは２８℃～３７℃で、初発ｐＨは、４．７～５．５が好ましい。発酵原料のｐＨは、乳酸菌の増殖に伴って上昇し、発酵を開始してから７～１４日経過した時点でｐＨ６～７に達して、グルタミン酸脱炭酸酵素活性が抑制される。そのため、グルタミン酸脱炭酸反応が開始してからｐＨ６．５に達する前に、発酵原料を再度ｐＨ４．７～５．５程度に調整してグルタミン酸脱炭酸反応を続けるようにする。培養期間は、添加したグルタミン酸源をＧＡＢＡ濃度６ｗ／ｖ％以上まで変換できる十分な期間として、２０～３０日が好ましい。
【0018】
上述したｐＨ調整工程に使用するｐＨ調整剤には、通常食品に使用される酸として、塩酸、酢酸、乳酸、クエン酸などが挙げられる。そのうち酢酸、乳酸を使用した場合、乳酸菌のグルタミン酸脱炭酸酵素活性の働きを緩慢にして残存グルタミン酸量が多くなることや、酢酸、乳酸のそのものの味、風味が強いことから、飲料又は加工食品へＧＡＢＡ含有発酵液を添加した際に味、風味への影響が大きくなることから望ましくない。
【0019】
乳酸菌を培養して得られたＧＡＢＡ含有発酵液は、そのまま各種の飲料や食品に添加して用いてもよく、また、濾過、濃縮などの処理工程によってＧＡＢＡ含有量をさらに高めてから利用してもよい。上記濾過工程としては、濾紙、濾布、膜濾過などを用いた通常の食品の濾過設備を使用することができ、珪藻土やセルロース、活性炭等の食品用濾過助剤を用いることができる。濃縮工程は、真空濃縮機、減圧濃縮機、凍結乾燥機などの設備を用いることができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。本発明の技術的範囲はこれらの例により何ら限定されるものではない。
【0020】
＜前培養と乳酸菌の保管＞
本発明で使用する乳酸菌は、醤油から単離、純化した後、変法ＭＲＳ寒天培地（表１）に穿刺培養して、４～１０℃で保管したものを使用する。この乳酸菌を、白金耳を用いて５ｍＬ～１００ｍＬの変法ＭＲＳ液体培地（表１に示した成分組成の変法ＭＲＳ寒天培地から標準寒天を抜いたもの）に接種し、３０℃の温度で約５日、静置して培養する。培養液の５５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が、接種前の値より０．５以上上昇していれば、その培養液を以後の発酵に使用することができる。乳酸菌の接種量は、発酵原料１ｍＬあたり、１０１～１０７ｃｅｌｌｓの範囲に設定することが好ましく、より好ましくは１０３～１０７ｃｅｌｌｓの範囲に設定する。この範囲であると、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌の生育も良く、乳酸菌以外の細菌やかび、酵母等の増殖を抑えることが容易である。
本発明で使用する乳酸菌は、醤油から単離、純化した後、変法ＭＲＳ寒天培地（表１）に穿刺培養して、４～１０℃で保管したものを使用する。この乳酸菌を、白金耳を用いて５ｍＬ～１００ｍＬの変法ＭＲＳ液体培地（表１に示した成分組成の変法ＭＲＳ寒天培地から標準寒天を抜いたもの）に接種し、３０℃の温度で約５日、静置して培養する。培養液の５５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が、接種前の値より０．５以上上昇していれば、その培養液を以後の発酵に使用することができる。乳酸菌の接種量は、発酵原料１ｍＬあたり、１０１～１０７ｃｅｌｌｓの範囲に設定することが好ましく、より好ましくは１０３～１０７ｃｅｌｌｓの範囲に設定する。この範囲であると、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する乳酸菌の生育も良く、乳酸菌以外の細菌やかび、酵母等の増殖を抑えることが容易である。
【0021】
【表1】
【0022】
＜グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する菌株の獲得＞
醤油麹に８～１０倍量の蒸留水を加え、４０℃で５～７時間自己消化させ、濾過することで得られる醤油麹消化液を作成した。醤油麹消化液を含有する培養液（培地組成：醤油麹消化液２０％、グルタミン酸ナトリウム一水和物１％、グルコース１％、塩化ナトリウム１２％、ペプトン５％、酵母エキス６％、ｐＨ６．０）を、ネジ付き試験管に分注し、ダーラム管を入れ、１２１℃２０分殺菌したものを乳酸菌発酵に使用した。醤油から単離した乳酸菌を接種し、３０℃の温度で１週間、静置培養した。そのうち、ダーラム管に気泡が発生し、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を示した乳酸菌４２株を得た。
醤油麹に８～１０倍量の蒸留水を加え、４０℃で５～７時間自己消化させ、濾過することで得られる醤油麹消化液を作成した。醤油麹消化液を含有する培養液（培地組成：醤油麹消化液２０％、グルタミン酸ナトリウム一水和物１％、グルコース１％、塩化ナトリウム１２％、ペプトン５％、酵母エキス６％、ｐＨ６．０）を、ネジ付き試験管に分注し、ダーラム管を入れ、１２１℃２０分殺菌したものを乳酸菌発酵に使用した。醤油から単離した乳酸菌を接種し、３０℃の温度で１週間、静置培養した。そのうち、ダーラム管に気泡が発生し、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を示した乳酸菌４２株を得た。
【0023】
＜試験例１ 醤油を含まないナトリウム高含有培地においてＧＡＢＡ生産能の高い菌株の選定＞
グルコース３ｗ／ｖ％、グルタミン酸７．６ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１２ｗ／ｖ％、酵母エキス２．４ｗ／ｖ％を含有する発酵原料のｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分湯浴中で殺菌した後、１００ｍＬ容ネジロメディウム瓶に１００ｍＬずつ分注し、乳酸菌発酵に使用した。グルタミン酸脱炭酸酵素活性を示した乳酸菌４２株の前培養液をそれぞれ接種して、３０℃で２５日間発酵させた後、８５℃１０分の殺菌を行い、Ｎｏ．２濾紙（アドバンテック社製）で濾過を行い、発酵が良好な１０株の濾液を実施例１－１～１－１０とし、ＧＡＢＡ生成量を測定した。初発グルタミン酸量および得られた濾液中に含まれるＧＡＢＡ量の測定は、ｐＨ３．２クエン酸緩衝液で希釈してアミノ酸分析システム（ＨＰＬＣ、島津製作所製）を用いて、オルトフタルアルデヒド法により定量した。
グルコース３ｗ／ｖ％、グルタミン酸７．６ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１２ｗ／ｖ％、酵母エキス２．４ｗ／ｖ％を含有する発酵原料のｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分湯浴中で殺菌した後、１００ｍＬ容ネジロメディウム瓶に１００ｍＬずつ分注し、乳酸菌発酵に使用した。グルタミン酸脱炭酸酵素活性を示した乳酸菌４２株の前培養液をそれぞれ接種して、３０℃で２５日間発酵させた後、８５℃１０分の殺菌を行い、Ｎｏ．２濾紙（アドバンテック社製）で濾過を行い、発酵が良好な１０株の濾液を実施例１－１～１－１０とし、ＧＡＢＡ生成量を測定した。初発グルタミン酸量および得られた濾液中に含まれるＧＡＢＡ量の測定は、ｐＨ３．２クエン酸緩衝液で希釈してアミノ酸分析システム（ＨＰＬＣ、島津製作所製）を用いて、オルトフタルアルデヒド法により定量した。
【0024】
実施例１－１～１－１０のＧＡＢＡ含有発酵液について、りんご風味酢飲料に添加して官能評価試験を実施した。ＧＡＢＡ含有発酵液の添加量は、りんご風味酢飲料を１５０ｍＬ喫食した際に、ＧＡＢＡ１００ｍｇを摂取することができるよう、適宜添加量を調整した。
【0025】
＜比較例１＞
初発グルタミン酸量が７．１ｗ／ｖ％になるようグルタミン酸ナトリウム一水和物を加えた醤油を準備し、醤油のｐＨを４８％ＮａＯＨ溶液で５．５に調整した後、試験例１と同様の方法で培地の殺菌、発酵、発酵後の殺菌・濾過したものを比較例１とする。なお、比較例１で使用した菌株は、実施例１－１で使用した菌株とする。比較例１のＧＡＢＡ含有発酵液についても、試験例１と同様にＧＡＢＡ生成量の測定、及び、りんご風味酢飲料への添加、官能評価を実施した。
初発グルタミン酸量が７．１ｗ／ｖ％になるようグルタミン酸ナトリウム一水和物を加えた醤油を準備し、醤油のｐＨを４８％ＮａＯＨ溶液で５．５に調整した後、試験例１と同様の方法で培地の殺菌、発酵、発酵後の殺菌・濾過したものを比較例１とする。なお、比較例１で使用した菌株は、実施例１－１で使用した菌株とする。比較例１のＧＡＢＡ含有発酵液についても、試験例１と同様にＧＡＢＡ生成量の測定、及び、りんご風味酢飲料への添加、官能評価を実施した。
【0026】
実施例１－１～１－１０、及び比較例１のＧＡＢＡ生成量及び官能評価の結果を、表２に示す。
【0027】
【表2】
【0028】
発酵期間中にグルタミン酸を消化した割合の高かった、実施例１－３及び実施例１－８は、ＧＡＢＡ生成量が多く、りんご風味酢飲料に添加した際の味、風味の影響が少なく、良好であった。比較例１は、乳酸菌によるグルタミン酸消化率が高く、ＧＡＢＡ生成量も多かったが、りんご風味酢飲料に添加した際に、醤油の味、風味が強く感じられたことから好ましくなかった。よって、ＧＡＢＡ含有発酵液に使用する乳酸菌は、小麦、大豆を含む醤油を培地成分として含まない培地で良好に生育し、且つグルタミン酸の消化率が６９％以上、より好ましくは８４％以上であることが望ましい。
【0029】
＜試験例２ 醤油を含まないナトリウム高含有培地におけるＧＡＢＡ生成量の増加＞
グルコース１ｗ／ｖ％、グルタミン酸１０ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１１ｗ／ｖ％、酵母エキス３．８ｗ／ｖ％を含有する発酵原料のｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分湯浴中で殺菌した後、１０００ｍＬ容ネジロメディウム瓶に９００ｍＬずつ分注し、乳酸菌発酵に使用した。実施例１－３、及び実施例１－８で使用した菌株の前培養液をそれぞれ接種して、３０℃で３０日間発酵させた。培養中は培地のｐＨを計測し、ｐＨ４．７～５．５になるように２０％ＨＣｌ溶液を添加した。試験例１と同様の方法で発酵後の殺菌・濾過したものを実施例２－３、及び実施例２－８とする。試験例１と同様にＧＡＢＡ生成量の測定、及び、りんご風味酢飲料への添加、官能評価を実施した。
グルコース１ｗ／ｖ％、グルタミン酸１０ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１１ｗ／ｖ％、酵母エキス３．８ｗ／ｖ％を含有する発酵原料のｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分湯浴中で殺菌した後、１０００ｍＬ容ネジロメディウム瓶に９００ｍＬずつ分注し、乳酸菌発酵に使用した。実施例１－３、及び実施例１－８で使用した菌株の前培養液をそれぞれ接種して、３０℃で３０日間発酵させた。培養中は培地のｐＨを計測し、ｐＨ４．７～５．５になるように２０％ＨＣｌ溶液を添加した。試験例１と同様の方法で発酵後の殺菌・濾過したものを実施例２－３、及び実施例２－８とする。試験例１と同様にＧＡＢＡ生成量の測定、及び、りんご風味酢飲料への添加、官能評価を実施した。
【0030】
実施例２－３、及び実施例２－８のＧＡＢＡ生成量の結果を、表３に示す。
【0031】
【表3】
【0032】
試験例２により得られたＧＡＢＡ含有発酵液のＧＡＢＡ生成量は、実施例２－３で６．１ｗ／ｖ％、実施例２－８で６．３ｗ／ｖ％であり、添加したグルタミン酸の９９％以上を消化していた。りんご風味酢飲料に添加した際には味、風味への影響がなく、良好であった。よって添加したグルタミン酸の６９％以上、より好ましくは８４％以上を消化し、ＧＡＢＡ６ｗ／ｖ％以上を生成する乳酸菌を、アレルゲン物質を含まない発酵原料に作用させることで、添加する飲料又は加工食品の味、風味への影響がないＧＡＢＡ含有発酵液を製造することができる。
【0033】
＜試験例３＞
グルコース１ｗ／ｖ％、酵母エキス２．４ｗ／ｖ％を含有する発酵原料に、塩化ナトリウムを３～１５ｗ／ｖ％、グルタミン酸ナトリウム一水和物を１２～１５ｗ／ｖ％の範囲で添加し、段階的にナトリウム濃度を上げた発酵原料を調整し、ｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分湯浴中で殺菌した後、１５ｍＬ容ネジ付き試験管に１３ｍＬずつ分注し、ダーラム管を入れ、乳酸菌発酵に使用した。実施例１－３で使用した菌株の前培養液を接種して、３０℃で１４日間発酵したものを実施例３－１～３－１７とする。乳酸菌の増殖は濁りの生成で、グルタミン酸脱炭酸酵素活性の有無はダーラム管への気泡の発生で確認した。
グルコース１ｗ／ｖ％、酵母エキス２．４ｗ／ｖ％を含有する発酵原料に、塩化ナトリウムを３～１５ｗ／ｖ％、グルタミン酸ナトリウム一水和物を１２～１５ｗ／ｖ％の範囲で添加し、段階的にナトリウム濃度を上げた発酵原料を調整し、ｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分湯浴中で殺菌した後、１５ｍＬ容ネジ付き試験管に１３ｍＬずつ分注し、ダーラム管を入れ、乳酸菌発酵に使用した。実施例１－３で使用した菌株の前培養液を接種して、３０℃で１４日間発酵したものを実施例３－１～３－１７とする。乳酸菌の増殖は濁りの生成で、グルタミン酸脱炭酸酵素活性の有無はダーラム管への気泡の発生で確認した。
【0034】
実施例３－１～３－１７における乳酸菌の増殖及びグルタミン酸脱炭酸酵素活性の有無を、表４に示す。
【0035】
【表4】
【0036】
ナトリウム濃度６．３ｗ／ｖ％以上、且つ水分活性０．８８３５以下の時、乳酸菌の増殖及びグルタミン酸脱炭酸酵素活性は抑制された。水分活性が０．９１００以上であると、一般細菌の増殖可能領域となり（非特許文献１）、培地滅菌を行わない培養条件には適さない。よって、ナトリウム濃度５．０～６．２ｗ／ｖ％、且つ水分活性０．８８６～０．９１０の範囲においては、一般細菌の増殖を抑制しながら、実施例１－３で使用した乳酸菌によるＧＡＢＡ生成が良好に行われる。なお、実施例１－８で使用した乳酸菌においても、同様の結果が得られた。
【0037】
＜試験例４＞
グルコース１ｗ／ｖ％、グルタミン酸１０ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１１ｗ／ｖ％、酵母エキス３．８ｗ／ｖ％を含有する発酵原料のｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分殺菌した後、１０００Ｌ容ステンレス製コンテナに９００Ｌ分注し、乳酸菌発酵に使用した。実施例１－３で使用した菌株の前培養液を、発酵原料１ｍＬあたり１０３ｃｅｌｌｓとなるように接種して、３０℃で３０日間発酵させた。培養中は培地のｐＨを計測し、ｐＨ４．７～５．５になるように２０％ＨＣｌ溶液を添加した。発酵開始から６日目、１１日目、１７日目、２４日目の発酵液に、耐塩性のカビ、酵母の増殖がないか、平板培地のコロニー計測試験により確認を行った。発酵後は、プレート式加熱殺菌装置を用いて８５℃１０分の加熱殺菌を行い、ＵＦ濾過膜を通過させたものを実施例４とする。試験例１と同様にＧＡＢＡ生成量の測定、及び、りんご風味酢飲料への添加、官能評価を実施した。
グルコース１ｗ／ｖ％、グルタミン酸１０ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１１ｗ／ｖ％、酵母エキス３．８ｗ／ｖ％を含有する発酵原料のｐＨを２０％ＨＣｌ溶液で５．０に調整した。調整した液は７０℃１分殺菌した後、１０００Ｌ容ステンレス製コンテナに９００Ｌ分注し、乳酸菌発酵に使用した。実施例１－３で使用した菌株の前培養液を、発酵原料１ｍＬあたり１０３ｃｅｌｌｓとなるように接種して、３０℃で３０日間発酵させた。培養中は培地のｐＨを計測し、ｐＨ４．７～５．５になるように２０％ＨＣｌ溶液を添加した。発酵開始から６日目、１１日目、１７日目、２４日目の発酵液に、耐塩性のカビ、酵母の増殖がないか、平板培地のコロニー計測試験により確認を行った。発酵後は、プレート式加熱殺菌装置を用いて８５℃１０分の加熱殺菌を行い、ＵＦ濾過膜を通過させたものを実施例４とする。試験例１と同様にＧＡＢＡ生成量の測定、及び、りんご風味酢飲料への添加、官能評価を実施した。
【0038】
実施例４のＧＡＢＡ生成量の結果を、表５に示す。
【0039】
【表5】
【0040】
実施例４のＧＡＢＡ含有発酵液は、ＧＡＢＡ６．３ｗ／ｖ％を生成していた。りんご風味酢飲料に添加した際には味、風味への影響がなく、良好であった。無菌的な環境下での発酵は行っていないが、発酵期間中のカビ、酵母等の雑菌の増殖は確認されなかった。よって発酵スケールを拡大した場合においても、環境中の雑菌に汚染されることなく、添加する飲料又は加工食品の味、風味への影響がないＧＡＢＡ含有発酵液を製造することができる。なお、実施例１－８で用いた乳酸菌においても、同様の結果が得られた。
【0041】
＜試験例５ 減圧濃縮法による高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液の製造＞
実施例４のＧＡＢＡ含有発酵液を、減圧濃縮装置を使用して重量として約２．４倍に濃縮した後、上澄み液を回収し、ＧＡＢＡ濃度が約１０～１３ｗ／ｖ％となるように水を加えたものを実施例５－１及び実施例５－２とする。試験例１と同様にＧＡＢＡ含有量の測定を行った。
実施例４のＧＡＢＡ含有発酵液を、減圧濃縮装置を使用して重量として約２．４倍に濃縮した後、上澄み液を回収し、ＧＡＢＡ濃度が約１０～１３ｗ／ｖ％となるように水を加えたものを実施例５－１及び実施例５－２とする。試験例１と同様にＧＡＢＡ含有量の測定を行った。
【0042】
実施例５－１、及び実施例５－２のＧＡＢＡ含有量の結果を、表６に示す。
【0043】
【表6】
【0044】
実施例５－１、及び実施例５－２の結果から、ＧＡＢＡ含有発酵液を高濃度化することで、飲料や加工食品へ添加した際の味、風味への影響をさらに緩和した高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液を製造することができる。
【0045】
＜試験例６ 飲料又は加工食品へのＧＡＢＡ富化＞
実施例５－２の高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液について、各飲料又は加工食品に添加して官能評価試験を実施した。りんご風味酢飲料に添加したものを実施例６－１、緑茶飲料に添加したものを実施例６－２、ヨーグルトに添加したものを実施例６－３として、表７に記載の通りに、各飲料又は食品の喫食量に対して、ＧＡＢＡ１００ｍｇを摂取することができるよう、高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液の添加量を調整した。
実施例５－２の高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液について、各飲料又は加工食品に添加して官能評価試験を実施した。りんご風味酢飲料に添加したものを実施例６－１、緑茶飲料に添加したものを実施例６－２、ヨーグルトに添加したものを実施例６－３として、表７に記載の通りに、各飲料又は食品の喫食量に対して、ＧＡＢＡ１００ｍｇを摂取することができるよう、高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液の添加量を調整した。
【0046】
【表7】
【0047】
実施例６－１～６－３は、何れも高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液を添加していないものと比較して、味、風味の差がなく、嗜好性に優れたものであった。なお、実施例５－１の高濃度ＧＡＢＡ含有発酵液においても、同様の結果が得られた。