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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024115643
(43)【公開日】2024-08-27
(54)【発明の名称】ゲル化剤、ゲル組成物、細胞足場材料、及び医療材料
(51)【国際特許分類】
C12N 11/04 20060101AFI20240820BHJP
A61L 24/10 20060101ALI20240820BHJP
A61L 24/00 20060101ALI20240820BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20240820BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240820BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20240820BHJP
C08G 81/00 20060101ALI20240820BHJP
C12N 5/09 20100101ALN20240820BHJP
C12N 5/0775 20100101ALN20240820BHJP
【ＦＩ】
C12N11/04
A61L24/10
A61L24/00 240
A61L24/00 260
C12M3/00 A
C12M1/00 A
C07K14/78
C08G81/00
C12N5/09
C12N5/0775
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023021379
(22)【出願日】2023-02-15
(71)【出願人】
【識別番号】301023238
【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構
(72)【発明者】
【氏名】西口 昭広
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
4B065
4C081
4H045
4J031
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA03
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC02
4B029CC10
4B033NA16
4B033NB57
4B033NB68
4B033NB69
4B065AA93X
4B065BC46
4C081AC04
4C081BA16
4C081BB04
4C081CD151
4C081DA12
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045EA50
4J031AA04
4J031AB06
4J031AC11
4J031AE03
4J031AF03
(57)【要約】
【課題】 生体適合性、生分解性、細胞接着性を有するゲル組成物を形成可能なゲル化剤を提供する。
【解決手段】 ゲル化剤であって、チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチンのアミノ基に導入されている第１修飾ゼラチンと、ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチンのアミノ基に導入されている第２修飾ゼラチンと、を含む。
【選択図】 図１
【解決手段】 ゲル化剤であって、チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチンのアミノ基に導入されている第１修飾ゼラチンと、ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチンのアミノ基に導入されている第２修飾ゼラチンと、を含む。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲル化剤であって、
チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチンのアミノ基に導入されている第１修飾ゼラチンと、
ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチンのアミノ基に導入されている第２修飾ゼラチンと、を含むゲル化剤。
チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチンのアミノ基に導入されている第１修飾ゼラチンと、
ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチンのアミノ基に導入されている第２修飾ゼラチンと、を含むゲル化剤。
【請求項2】
第１修飾ゼラチンが、下記式（１）で表される構造を有し、
第２修飾ゼラチンが、下記式（２）で表される構造を有する、請求項１に記載のゲル化剤。
式（１）において、Ｇｌｔｎ１は第１ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ１は２価の基である第１スペーサーであり、
式（２）において、Ｇｌｔｎ２は第２ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ２は２価の基である第２スペーサーである。
第２修飾ゼラチンが、下記式（２）で表される構造を有する、請求項１に記載のゲル化剤。
【化1】
【化2】
式（１）において、Ｇｌｔｎ１は第１ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ１は２価の基である第１スペーサーであり、
式（２）において、Ｇｌｔｎ２は第２ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ２は２価の基である第２スペーサーである。
【請求項3】
式（１）及び式（２）において、Ｌ１及びＬ２が、それぞれ、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｏ－及び炭素数２～１８のアルキレン基からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２に記載のゲル化剤。
【請求項4】
第１修飾ゼラチンが、下記式（３）で表される構造を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のゲル化剤。
式（３）において、Ｇｌｔｎ１は第１ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ３は炭素数２～１８のアルキレン基である。
【化3】
式（３）において、Ｇｌｔｎ１は第１ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ３は炭素数２～１８のアルキレン基である。
【請求項5】
第２修飾ゼラチンが、下記式（４）で表される構造を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のゲル化剤。
式（４）において、Ｇｌｔｎ２は第２ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ４は２価の基である。
【化4】
式（４）において、Ｇｌｔｎ２は第２ゼラチンのゼラチン残基であり、Ｌ４は２価の基である。
【請求項6】
式（４）において、Ｌ４が下記式（５）で表される基であり、式（５）において、Ｒ５１は炭素数２～１８のアルキレン基であり、Ｘは硫黄原子（Ｓ）又は酸素原子（Ｏ）であり、Ｒ５２はエチレン基である、請求項５に記載のゲル化剤。
【化5】
【請求項7】
第１修飾ゼラチンにおけるチオール基導入率が、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、請求項１～６のいずれか一項に記載のゲル化剤。
【請求項8】
第１修飾ゼラチンにおけるチオール基導入率が、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、請求項１～７のいずれか一項に記載のゲル化剤。
【請求項9】
第２修飾ゼラチンにおけるビニルスルホン基導入率が、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、請求項１～８のいずれか一項に記載のゲル化剤。
【請求項10】
第２修飾ゼラチンにおけるビニルスルホン基導入率が、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、請求項１～９のいずれか一項に記載のゲル化剤。
【請求項11】
第１修飾ゼラチンが有するチオール基１モル当量に対して、第２修飾ゼラチンが有するビニルスルホン基が０．２モル当量～５モル当量である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のゲル化剤。
【請求項12】
第１ゼラチン、及び第２ゼラチンが、それぞれ、ブタ腱ゼラチン、又はブタ皮膚ゼラチンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のゲル化剤。
【請求項13】
下記式（６）で表される基が、第１修飾ゼラチン及び第２修飾ゼラチンからなる群から選択される少なくとも一方が有するアミノ基に、更に導入されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載のゲル化剤。
式（６）において、Ｒ１は、水素原子、又は炭素数１～１０のアルキル基であり、Ｌ６は単結合、又は２価の基であり、＊は連結位置を表す。
【化6】
式（６）において、Ｒ１は、水素原子、又は炭素数１～１０のアルキル基であり、Ｌ６は単結合、又は２価の基であり、＊は連結位置を表す。
【請求項14】
第１修飾ゼラチンが、第１収容部に収容されており、
第２修飾ゼラチンが、第１収容部とは異なる第２収容部に収容されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載のゲル化剤。
第２修飾ゼラチンが、第１収容部とは異なる第２収容部に収容されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載のゲル化剤。
【請求項15】
ゲル組成物であって、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の前記ゲル化剤と、
水を含有する溶媒と、を含み、
第１修飾ゼラチンと、第２修飾ゼラチンとが架橋している、ゲル組成物。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の前記ゲル化剤と、
水を含有する溶媒と、を含み、
第１修飾ゼラチンと、第２修飾ゼラチンとが架橋している、ゲル組成物。
【請求項16】
前記溶媒が緩衝液である、請求項１５に記載のゲル組成物。
【請求項17】
前記ゲル組成物中の前記ゲル化剤の濃度が、２．５重量％～２０重量％である、請求項１５又は１６に記載のゲル組成物。
【請求項18】
前記ゲル組成物中の前記ゲル化剤の濃度が、５重量％～１５重量％である、請求項１７に記載のゲル組成物。
【請求項19】
請求項１５～１８のいずれか一項に記載のゲル組成物を含む、細胞足場材料。
【請求項20】
請求項１５～１８のいずれか一項に記載のゲル組成物を含む、医療材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲル化剤、ゲル組成物、細胞足場材料、及び医療材料に関する。
【背景技術】
【0002】
ハイドロゲルは、高分子が三次元的に架橋されたネットワーク構造を有する物質であり、その内部に大量の水を含んでいることを特徴とする。ハイドロゲルは、細胞足場材料やドラッグデリバリーシステム、医療用接着剤など様々な応用が期待されている。ハイドロゲルは、化学反応によって架橋構造を形成する化学ゲルと、物理的な相互作用によって高分子が架橋した物理ゲルに分類される。一般的に、物理ゲルは力学強度が低いため、安定性の高いハイドロゲルを作製するには化学反応を用いる必要がある。ハイドロゲルを形成する手法としては、例えば、アルデヒド基とアミノ基間のシッフ塩基形成、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドとアミノ基のカップリング反応、及びラジカル重合による架橋形成等が挙げられる。しかし、これらの化学反応は、細胞にダメージを与えるため、細胞足場材料の製造に用いることは困難であった。
【0003】
このような状況下において、ハイドロゲルの製造方法として、近年、クリックケミストリーが注目されている。
【0004】
例えば、アジド基とアルキン基を用いた付加環化反応は高い生体直行性を示す。その一方で、銅触媒が必要などの問題があった。これに対し、触媒や外部からのエネルギーを必要としないクリック反応の研究が進められており、非特許文献１では、ノルボルネンとテトラジンを修飾したゼラチンを用いたハイドロゲルが報告されている。
【0005】
また、チオール基とビニルスルホン基を用いたクリック反応はより安価であり、水溶性も高いため扱いが容易である。例えば、非特許文献２では、ポリエチレングリコールにチオール基とビニルスルホン基を修飾したハイドロゲルが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Koshy, S. T., Desai, R. M., Joly, P., Li, J., Bagrodia, R. K., Lewin, S. A., Joshi, N. S., Mooney, D. J., Click-Crosslinked Injectable Gelatin Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. 2016, 5, 541-547.
【非特許文献2】Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A., Cell-Responsive Synthetic Hydrogels. Adv. Mater. 2003, 15, 888-892.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかし、非特許文献１で報告されているハイドロゲルは、使用されている分子が高価であること、反応中に窒素ガスが生成すること、複雑かつ疎水的な構造を有しているため溶解性や安全性が懸念されること等の課題がある。また、非特許文献１では、マウス皮下に埋植したハイドロゲルが１２０日後にも完全に分解されておらず、架橋構造および生分解性の制御が困難であった。
【0008】
また、非特許文献２で報告されているハイドロゲルに含まれるポリエチレングリコールには生分解性や細胞接着性がないため、細胞足場材料と使用するにはペプチドなどの生理活性因子での修飾が必須である。また、ポリエチレングリコールは非常に水溶性の高い高分子であるため、ハイドロゲルの膨潤も問題となる。
【0009】
本発明は、上記課題を解決するものである。即ち、本発明は、生体適合性、生分解性、細胞接着性を有するゲル（例えば、ハイドロゲル）を形成可能なゲル化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
【0011】
［１］ ゲル化剤であって、
チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチンのアミノ基に導入されている第１修飾ゼラチンと、
ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチンのアミノ基に導入されている第２修飾ゼラチンと、を含むゲル化剤。
［２］ 第１修飾ゼラチンが、後述する式（１）で表される構造を有し、
第２修飾ゼラチンが、後述する式（２）で表される構造を有する、［１］に記載のゲル化剤。
［３］ 式（１）及び式（２）において、Ｌ１及びＬ２が、それぞれ、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｏ－及び炭素数２～１８のアルキレン基からなる群から選択される少なくとも１つを含む、［２］に記載のゲル化剤。
［４］ 第１修飾ゼラチンが、後述する式（３）で表される構造を有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［５］ 第２修飾ゼラチンが、後述する式（４）で表される構造を有する、［１］～［４］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［６］ 式（４）において、Ｌ４が後述する式（５）で表される基である、［５］に記載のゲル化剤。
［７］ 第１修飾ゼラチンにおけるチオール基導入率が、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［６］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［８］ 第１修飾ゼラチンにおけるチオール基導入率が、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［７］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［９］ 第２修飾ゼラチンにおけるビニルスルホン基導入率が、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［８］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１０］ 第２修飾ゼラチンにおけるビニルスルホン基導入率が、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［９］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１１］ 第１修飾ゼラチンが有するチオール基１モル当量に対して、第２修飾ゼラチンが有するビニルスルホン基が０．２モル当量～５モル当量である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１２］ 第１ゼラチン、及び第２ゼラチンが、それぞれ、ブタ腱ゼラチン、又はブタ皮膚ゼラチンである、［１］～［１１］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１３］ 後述する式（６）で表される基が、第１修飾ゼラチン及び第２修飾ゼラチンからなる群から選択される少なくとも一方が有するアミノ基に、更に導入されている、［１］～［１２］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１４］ 第１修飾ゼラチンが、第１収容部に収容されており、
第２修飾ゼラチンが、第１収容部とは異なる第２収容部に収容されている、［１］～［１３］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１５］ ゲル組成物であって、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の前記ゲル化剤と、水を含有する溶媒と、を含み、第１修飾ゼラチンと、第２修飾ゼラチンとが架橋している、ゲル組成物。
［１６］ 前記溶媒が緩衝液である、［１５］に記載のゲル組成物。
［１７］ 前記ゲル組成物中の前記ゲル化剤の濃度が、２．５重量％～２０重量％である、［１５］又は［１６］に記載のゲル組成物。
［１８］ 前記ゲル組成物中の前記ゲル化剤の濃度が、５重量％～１５重量％である、［１７］に記載のゲル組成物。
［１９］ ［１５］～［１８］のいずれか１つに記載のゲル組成物を含む、細胞足場材料。
［２０］ ［１５］～［１８］のいずれか１つに記載のゲル組成物を含む、医療材料。
チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチンのアミノ基に導入されている第１修飾ゼラチンと、
ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチンのアミノ基に導入されている第２修飾ゼラチンと、を含むゲル化剤。
［２］ 第１修飾ゼラチンが、後述する式（１）で表される構造を有し、
第２修飾ゼラチンが、後述する式（２）で表される構造を有する、［１］に記載のゲル化剤。
［３］ 式（１）及び式（２）において、Ｌ１及びＬ２が、それぞれ、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｏ－及び炭素数２～１８のアルキレン基からなる群から選択される少なくとも１つを含む、［２］に記載のゲル化剤。
［４］ 第１修飾ゼラチンが、後述する式（３）で表される構造を有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［５］ 第２修飾ゼラチンが、後述する式（４）で表される構造を有する、［１］～［４］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［６］ 式（４）において、Ｌ４が後述する式（５）で表される基である、［５］に記載のゲル化剤。
［７］ 第１修飾ゼラチンにおけるチオール基導入率が、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［６］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［８］ 第１修飾ゼラチンにおけるチオール基導入率が、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［７］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［９］ 第２修飾ゼラチンにおけるビニルスルホン基導入率が、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［８］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１０］ 第２修飾ゼラチンにおけるビニルスルホン基導入率が、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％である、［１］～［９］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１１］ 第１修飾ゼラチンが有するチオール基１モル当量に対して、第２修飾ゼラチンが有するビニルスルホン基が０．２モル当量～５モル当量である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１２］ 第１ゼラチン、及び第２ゼラチンが、それぞれ、ブタ腱ゼラチン、又はブタ皮膚ゼラチンである、［１］～［１１］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１３］ 後述する式（６）で表される基が、第１修飾ゼラチン及び第２修飾ゼラチンからなる群から選択される少なくとも一方が有するアミノ基に、更に導入されている、［１］～［１２］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１４］ 第１修飾ゼラチンが、第１収容部に収容されており、
第２修飾ゼラチンが、第１収容部とは異なる第２収容部に収容されている、［１］～［１３］のいずれか１つに記載のゲル化剤。
［１５］ ゲル組成物であって、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の前記ゲル化剤と、水を含有する溶媒と、を含み、第１修飾ゼラチンと、第２修飾ゼラチンとが架橋している、ゲル組成物。
［１６］ 前記溶媒が緩衝液である、［１５］に記載のゲル組成物。
［１７］ 前記ゲル組成物中の前記ゲル化剤の濃度が、２．５重量％～２０重量％である、［１５］又は［１６］に記載のゲル組成物。
［１８］ 前記ゲル組成物中の前記ゲル化剤の濃度が、５重量％～１５重量％である、［１７］に記載のゲル組成物。
［１９］ ［１５］～［１８］のいずれか１つに記載のゲル組成物を含む、細胞足場材料。
［２０］ ［１５］～［１８］のいずれか１つに記載のゲル組成物を含む、医療材料。
【発明の効果】
【0012】
本発明のゲル化剤は、生体適合性、生分解性、細胞接着性を有するゲル組成物（例えば、ハイドロゲル）を形成可能である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本実施形態のゲル化剤を用いたゲル化反応、即ち、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）とビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）との架橋反応（クリック反応）を説明する図である。
【図2】チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）の合成反応を説明する図である。
【図3】ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の合成反応を説明する図である。
【図4】ウレイドピリミジノン基同士の水素結合による架橋構造を示す図である。
【図5】ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンの合成反応を説明する図である。
【図6】実施例で合成した試料１－１～１－５（チオール化ゼラチン、第１修飾ゼラチン）の詳細を示す表である。
【図7】実施例で合成した試料２－１～２－３、及び２－５（ビニルスルホン化ゼラチン、第２修飾ゼラチン）の詳細を示す表である。
【図8】実施例で合成した、試料１－３（ＳＧ－ＳＨ６４）、及び試料２－３（ＳＧ－ＶＳ６０）の１Ｈ-ＮＭＲ測定結果を示す図である。原料ゼラチン（ＳＧ）、γ-Thiobutyrolactone、Divinyl sulfoneの測定結果も併せて示す。
【図9】実施例で作製したゲル組成物３－１～３－３の粘弾性の時間依存性を示す図である。
【図10】実施例で作製したゲル組成物１－３、２－３及び３－３の粘弾性の時間依存性を示す図である。
【図11】実施例で作製したゲル組成物３－３の引張試験結果を示す図である。
【図12】実施例で作製したゲル組成物１－３、２－３及び３－３の接着強度を示す図である。
【図13】実施例で作製したチオール化ゼラチン（試料１－１～１－３）、及びビニルスルホン化ゼラチン（試料２－１～２－３）の細胞毒性試験結果を示す図である。
【図14】実施例で作製した、細胞を内包するゲル組成物３－３の蛍光顕微鏡写真である。尚、写真はグレースケール変換している。
【図15】実施例で作製した、がん細胞を内包するゲル組成物３－３の蛍光顕微鏡写真（左側）と、がん細胞を内包するゲル組成物３－４の蛍光顕微鏡写真（右側）である。尚、写真はグレースケール変換している。
【図16】実施例で作製したゲル組成物３－３の生分解性試験結果を示す蛍光顕微鏡写真である。尚、写真はグレースケール変換している。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【0015】
本明細書における基（原子群）の表記において、置換及び無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。
【0016】
［第１実施形態］
本実施形態のゲル化剤は、チオール基を有するチオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）、及びビニルスルホン基を有するビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の２種類の修飾ゼラチンを含む。チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとは、別々に収容されて供されることが好ましい。使用時に、水を含有する溶媒（例えば、緩衝液）下で、チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとを混合することで、チオール基とビニルスルホン基とのクリック反応（架橋反応）が生じてハイドロゲル（クリックハイドロゲル）を形成できる（図１参照）。
本実施形態のゲル化剤は、チオール基を有するチオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）、及びビニルスルホン基を有するビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の２種類の修飾ゼラチンを含む。チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとは、別々に収容されて供されることが好ましい。使用時に、水を含有する溶媒（例えば、緩衝液）下で、チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとを混合することで、チオール基とビニルスルホン基とのクリック反応（架橋反応）が生じてハイドロゲル（クリックハイドロゲル）を形成できる（図１参照）。
【0017】
チオール化ゼラチンのみでもゲルを形成できる。しかし、チオール基間の架橋反応には酸化剤が必要であり、また、反応速度が非常に遅く実用的ではない。また、チオール化ゼラチンに、架橋剤として、例えば、低分子のジビニルスルホンを加えれば、チオール基とビニルスルホン基とを反応させてゲルを形成することはできる。しかし、ジビニルスルホンは低分子であるため、少量では十分なゲル強度が得られない。使用量を増やせば、ゲル強度をある程度、高めることはできるが、ジビニルスルホンは細胞毒性を有する。このため、得られるゲルは十分な生体適合性が得られない。
【0018】
これに対して、本実施形態のゲル化剤は、チオール化ゼラチンに加えて、新規な修飾ゼラチンであるビニルスルホン化ゼラチンを含有する。本実施形態のゲル化剤では、チオール基と、ビニルスルホン基との間で、クリック反応による架橋が生じてゲル（典型的には、ハイドロゲル）を生じる。この反応は、水系環境下で速やかに進み、生体直交性も高い。また、本実施形態のゲル化剤は、生体高分子であるゼラチンの誘導体であるため、得られるゲルは生体適合性、生分解性、細胞接着性が高く、例えば、細胞足場材料として優れている。更に、本実施形態のゲル化剤は、高分子同士（チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチン）を架橋するため、高強度のゲルを容易に得ることができる。
【0019】
ゲル化剤における、チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとの含有比率は特に限定されないが、ゲル強度を高める観点から、例えば、チオール化ゼラチンが有するチオール基１モル当量に対して、ビニルスルホン化ゼラチンが有するビニルスルホン基を０．２モル当量～５モル当量含むことが好ましく、０．５モル当量～２モル当量含むことがより好ましい。
以下に、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）と、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の詳細について説明する。
以下に、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）と、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の詳細について説明する。
【0020】
＜チオール化ゼラチン＞
チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）は、例えば、チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチン（原料ゼラチン）のアミノ基に導入されている構造を有する。例えば、チオール化ゼラチンは、下記式（１）で表される構造を有する。
チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）は、例えば、チオール基が、第１スペーサーを介して、第１ゼラチン（原料ゼラチン）のアミノ基に導入されている構造を有する。例えば、チオール化ゼラチンは、下記式（１）で表される構造を有する。
【0021】
【化1】
式（１）において、Ｇｌｔｎ１は第１ゼラチン（原料ゼラチン）のゼラチン残基であり、Ｌ１は２価の基である第１スペーサーである。第１スペーサーＬ１は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｏ－及び炭素数２～１８のアルキレン基からなる群から選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。アルキレン基は、直鎖であってもよく、分岐鎖であってもよく、また、好ましくは、炭素数２～５のアルキレン基である。
【0022】
チオール化ゼラチンを効率的に合成できるという観点からは、チオール化ゼラチンは、下記式（３）で表される構造を有してもよい。即ち、チオール化ゼラチンは、アミド基（－ＮＨＣ（Ｏ）－）を有してもよい。
【0023】
【化2】
式（３）において、Ｇｌｔｎ１は第１ゼラチン（原料ゼラチン）のゼラチン残基であり、Ｌ３は炭素数２～１８のアルキレン基であり、直鎖であってもよく、分岐鎖であってもよく、好ましくは、炭素数２～５のアルキレン基である。
【0024】
第１ゼラチン（原料ゼラチン）は、典型的には、チオール基等が導入されていない（誘導体化されていない）ゼラチンである。本実施形態のゲル化剤は、生体高分子であるゼラチンの誘導体（チオール化ゼラチン、ビニルスルホン化ゼラチン）を用いることで、優れた生体適合性、生分解性、及び細胞接着性を有するゲル組成物が得られる。
【0025】
第１ゼラチンは、天然由来、化学合成、発酵法、及び、遺伝子組換え等により得られるゼラチンのいずれであっても特に制限なく使用できる。なかでも、天然由来のゼラチンが好ましい。天然由来のゼラチンとしては、例えば、例えばウシ、及び、ブタ、ヒト等の哺乳動物由来のもの、及び、タイ、チョウザメ、サケ、及び、タラ等魚由来のものが挙げられる。中でも、ブタゼラチンが好ましく、ブタ皮膚ゼラチン、ブタ腱ゼラチンがより好ましい。
【0026】
第１ゼラチンの分子量は、特に制限されず、一般に、重量平均分子量で１０，０００～５００，０００が好ましい。上限としては特に制限されないが、溶解性の観点から、３５０,０００以下がより好ましい。下限としては特に制限されないが、得られるゲルがより優れた機械強度を有する点で、５０,０００以上がより好ましい。
【0027】
上述の式（１）及び（３）において、第１ゼラチン残基Ｇｌｔｎ１に直接結合している窒素原子（Ｎ）は、第１ゼラチン中の主としてリジン（Ｌｙｓ）のε－アミノ基由来である。
【0028】
ここで、原料ゼラチン（第１ゼラチン）中のアミノ基（第１級アミノ基、－ＮＨ２）の含有量（モル濃度）に対する、修飾ゼラチン（チオール化ゼラチン）中のチオール基の含有量（モル濃度）の比率を「チオール基導入率（チオール基置換率）（ｍｏｌ％）」と定義する。チオール基導入率の求め方は特に限定されず、例えば、ＴＮＢＳ法（２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法、アミノ基の定量）、エルマン法（チオール基の定量）等を用いて直接的、又は間接的に求めた値から計算してよい。例えば、後述する実施例に記載する方法により求めてもよい。
【0029】
チオール化ゼラチンにおいて、チオール基導入率は特に制限されない。チオール基導入率を変化させることで、得られるゲルの力学特性を制御できる。また、チオール基導入率が高過ぎると、水溶性が低下しゲル（ハイドロゲル）を形成し難くなる。ゲルを形成し易く、且つ、ゲル強度、及び／又は生体組織への接着力を高める観点から、チオール基導入率は、例えば、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％、又は、５０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％としてよい。
【0030】
また、ゲル強度、及び／又は生体組織への接着力を高める観点から、チオール化ゼラチンにおいて、第１級アミノ基に対する、チオール基のモル比（ＳＨ）／（Ａ）は、例えば、２０／８０～８０／２０、４０／６０～８０／２０、又は、５０／５０～７０／３０としてよい。
【0031】
第１ゼラチン（原料ゼラチン）の第１級アミノ基濃度、チオール化ゼラチンのチオール基濃度は、特に限定されない。第１ゼラチン（原料ゼラチン）の第１級アミノ基濃度は、例えば、２００μｍｏｌ／ｇ～５００μｍｏｌ／ｇ、又は２５０μｍｏｌ／ｇ～４００μｍｏｌ／ｇであってよい。チオール化ゼラチンのチオール基濃度は、例えば、３０μｍｏｌ／ｇ～５００μｍｏｌ／ｇ、又は５０μｍｏｌ／ｇ～３５０μｍｏｌ／ｇであってよい。第１ゼラチン（原料ゼラチン）の第１級アミノ基濃度、チオール化ゼラチンのチオール基濃度が上記範囲内であれば、十分な強度、及び／又は生体組織への接着力を有するゲルが得られ易い。
【0032】
チオール化ゼラチンの分子量は特に限定されず、第１ゼラチン（原料ゼラチン）の分子量と導入された基の種類と量（数）によって決定される。したがって、修飾ゼラチンの重量平均分子量（Ｍｗ）の取り得る範囲は、上述した原料ゼラチンの重量平均分子量（Ｍｗ）の取り得る範囲とほぼ同じである。
【0033】
本実施形態のゲル化剤は、１種類のチオール化ゼラチンのみを含有してもよいし、２種類以上のチオール化ゼラチンを含有してもよい。
【0034】
チオール化ゼラチンの製造方法（合成方法）は、特に限定されず、公知の方法によって合成できる。原料ゼラチンのアミノ基、好ましくはリジンのアミノ基に第１スペーサーを介してチオール基を結合させる方法としては、例えば、いわゆる還元（的）アミノ化反応（アルデヒド、又はケトンを用いる方法）、及びショッテン・バウマン（Ｓｃｈｏｔｔｅｎ－Ｂａｕｍａｎｎ）反応（酸クロライドを用いる方法）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドを用いた反応等が挙げられる。例えば、図２に示すように、原料ゼラチン（第１ゼラチン）の第１級アミンに、チオラクトン化合物（例えば、γ-Thiobutyrolactone）を反応させてチオール基を導入してもよい。合成に用いるラクトン化合物の有する炭素数は、合成するチオール化ゼラチンの第１スペーサーの種類に応じて適宜選択してよい。
【0035】
チオール化ゼラチンの製造方法は上述の方法に限定されず、例えば、チオラクトン化合物に代えて、チオール基を有するカルボン酸化合物、及び／又はチオール基を有するアルデヒド化合物を用いて合成してもよい（図２参照）。
【0036】
尚、チオール化ゼラチンにおいては、第１ゼラチン（原料ゼラチン）のアミノ基に、第１スペーサーを介したチオール基（－Ｌ1－ＳＨ）のみが導入されていてもよいし、本発明の効果を奏する範囲であれば、その他の官能基が導入されていてもよい。その他の官能基としては、例えば、第２実施形態において後述するウレイドピリミジノン基が挙げられる。
【0037】
＜ビニルスルホン化ゼラチン＞
ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）は、例えば、ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチン（原料ゼラチン）のアミノ基に導入されている構造を有する。例えば、ビニルスルホン化ゼラチンは、下記式（２）で表される構造を有する。
ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）は、例えば、ビニルスルホン基が、第２スペーサーを介して、第２ゼラチン（原料ゼラチン）のアミノ基に導入されている構造を有する。例えば、ビニルスルホン化ゼラチンは、下記式（２）で表される構造を有する。
【0038】
【化3】
式（２）において、Ｇｌｔｎ２は第２ゼラチン（原料ゼラチン）のゼラチン残基であり、Ｌ２は２価の基である第２スペーサーである。第２スペーサーＬ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｏ－及び炭素数２～１８のアルキレン基からなる群から選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。アルキレン基は、直鎖であってもよく、分岐鎖であってもよく、また、好ましくは、炭素数２～５のアルキレン基である。
【0039】
ビニルスルホン化ゼラチンを効率的に合成できるという観点から、ビニルスルホン化ゼラチンは、下記式（４）で表される構造を有してもよい。即ち、ビニルスルホン化ゼラチンは、アミド基（－ＮＨＣ（Ｏ）－）を有してもよい。
【0040】
【化4】
式（４）において、Ｇｌｔｎ２は第２ゼラチン（原料ゼラチン）のゼラチン残基であり、Ｌ４は２価の基である。２価の基としては、第２スペーサーＬ２と同様の官能基を挙げることができる。第２修飾ゼラチンをより効率的に合成できるという観点から、Ｌ４は下記式（５）で表される基であってよい。式（５）において、Ｒ５１は炭素数２～１８のアルキレン基であり、Ｘは硫黄原子（Ｓ）又は酸素原子（Ｏ）であり、Ｒ５２はエチレン基である。より好ましくは、式（５）において、Ｘは硫黄原子（Ｓ）であり、Ｒ５１は炭素数２～５のアルキレン基である。
【0041】
【化5】
【0042】
第２ゼラチン（原料ゼラチン）は、第１ゼラチンと同様のものが挙げられ、好適態様も同様である。第２ゼラチンは、第１ゼラチンと同一種類のゼラチンであってもよいし、異なる種類のゼラチンであってもよい。原料管理、修飾ゼラチン合成の効率化等の観点から、第１ゼラチンと第２ゼラチンとは、同一種類のゼラチン（原料ゼラチン）であることが好ましい。
【0043】
上述の式（２）及び（４）において、第２ゼラチン残基Ｇｌｔｎ２に直接結合している窒素原子（Ｎ）は、第２ゼラチン中の主としてリジン（Ｌｙｓ）のε－アミノ基由来である。
【0044】
ここで、原料ゼラチン（第２ゼラチン）中のアミノ基（第１級アミノ基、－ＮＨ２）の含有量（モル濃度）に対する、修飾ゼラチン（ビニルスルホン化ゼラチン）中のビニルスルホン基の含有量（モル濃度）の比率を「ビニルスルホン基導入率（ビニルスルホン基置換率）（ｍｏｌ％）」と定義する。ビニルスルホン基導入率の求め方は特に限定されず、例えば、ＴＮＢＳ法（２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法、アミノ基の定量）、エルマン法（チオール基の定量）等を用いて直接的、又は間接的に求めた値から計算してよい。例えば、後述する実施例に記載する方法により求めてもよい。
【0045】
ビニルスルホン化ゼラチンにおいて、ビニルスルホン基導入率は特に制限されず、ビニルスルホン基導入率を変化させることで、得られるゲルの力学特性を制御できる。また、ビニルスルホン基導入率が高過ぎると、水溶性が低下しゲル（ハイドロゲル）を形成し難くなる。ゲルを形成し易く、且つ、ゲル強度、及び／又は生体組織への接着力を高める観点から、ビニルスルホン基導入率は、例えば、２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％、又は、５０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％としてよい。
【0046】
また、ゲル強度、及び／又は生体組織への接着力を高める観点から、ビニルスルホン化ゼラチンにおいて、第１級アミノ基に対する、ビニルスルホン基のモル比（ＶＳ）／（Ａ）は、例えば、２０／８０～８０／２０、４０／６０～８０／２０、又は、５０／５０～７０／３０としてよい。
【0047】
第２ゼラチン（原料ゼラチン）の第１級アミノ基濃度、ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基濃度は、特に限定されない。第２ゼラチン（原料ゼラチン）の第１級アミノ基濃度は、例えば、２００μｍｏｌ／ｇ～５００μｍｏｌ／ｇ、又は２５０μｍｏｌ／ｇ～４００μｍｏｌ／ｇであってよい。ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基濃度は、例えば、３０μｍｏｌ／ｇ～５００μｍｏｌ／ｇ、５０μｍｏｌ／ｇ～３５０μｍｏｌ／ｇであってよい。第２ゼラチン（原料ゼラチン）の第１級アミノ基濃度、ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基濃度が上記範囲内であれば、十分な強度、及び／又は生体組織への接着力を有するゲルが得られ易い。
【0048】
ビニルスルホン化ゼラチンの分子量は特に限定されず、第２ゼラチン（原料ゼラチン）の分子量と導入された基の種類と量（数）によって決定される。したがって、ビニルスルホン化ゼラチンの重量平均分子量（Ｍｗ）の取り得る範囲は、上述した原料ゼラチンの重量平均分子量（Ｍｗ）の取り得る範囲とほぼ同じである。
【0049】
本実施形態のゲル化剤は、１種類のビニルスルホン化ゼラチンのみを含有してもよいし、２種類以上のビニルスルホン化ゼラチンを含有してもよい。
【0050】
ビニルスルホン化ゼラチンの製造方法（合成方法）は、特に限定されず、公知の方法によって合成できる。例えば、図３に示すように、まず、チオール化ゼラチンを合成し、チオール化ゼラチンのチオール基にジビニルスルホンを反応させてビニルスルホン基を導入してもよい。チオール化ゼラチンは、上述した方法により合成してよい。チオール基へのビニルスルホン基の導入方法は特に限定されないが、例えば、溶媒中で、チオール化ゼラチンのチオール基、１００ｍｏｌ％に対して、ジビニルスルホンを１５０ｍｏｌ％～３００ｍｏｌ％、好ましくは、１８０ｍｏｌ％～２５０ｍｏｌ％混合し、２０℃～７０℃で、１０時間～３０時間反応させてよい。反応後、必要に応じて、還元、再沈殿、濾過、透析、減圧乾燥等を行い、ビニルスルホン化ゼラチンの粉末を得てもよい。
【0051】
ビニルスルホン化ゼラチンの製造方法は上述の方法に限定されず、例えば、チオール化ゼラチンの代わり、原料ゼラチンのアミノ基にヒドロキシ基を導入したヒドロキシ化ゼラチンを用いてもよい（図３参照）。まず、ヒドロキシ化ゼラチンを合成し、ヒドロキシ化ゼラチンの水酸基にジビニルスルホンを反応させてビニルスルホン基を導入してよい。ヒドロキシ化ゼラチンは、公知の方法（例えば、還元（的）アミノ化反応、及びショッテン・バウマン（Ｓｃｈｏｔｔｅｎ－Ｂａｕｍａｎｎ）反応）を利用して合成してよい。
【0052】
ビニルスルホン化ゼラチンの合成においては、上述のように、チオール化ゼラチンのチオール基（又は、ヒドロキシ化ゼラチンのヒドロキシ基）に対して、ジビニルスルホンを過剰当量（１５０ｍｏｌ％以上、好ましくは、１８０ｍｏｌ％以上）混合して反応させることが好ましい。これにより、ジビニルスルホンの２つのビニル基の両方とチオール基（又は、ヒドロキシ基）とが反応するという副反応を抑制でき、効率よく、チオール基にビニルスルホン基を導入できる。一方で、ジビニルスルホンは細胞毒性を有するため、使用量は少ない方が好ましい。チオール基（又は、ヒドロキシ基）に対する、ジビニルスルホンの混合割合を３００ｍｏｌ％以下、好ましくは、２５０ｍｏｌ％以下とすることで、得られるゲル中のジビニルスルホン濃度を低く抑えることができる。ゲル中のジビニルスルホン濃度を更に抑制するために、ビニルスルホン化ゼラチンは、合成後、透析により精製することが好ましい。
【0053】
チオール化ゼラチンを経由してビニルスルホン化ゼラチンを合成する場合、全てのチオール基にビニルスルホン基を導入してもよいし、一部のチオール基のみにビニルスルホン基を導入してもよい。但し、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）にチオール基が残存する場合、チオール基導入率は、例えば、１０ｍｏｌ％以下、又は、５ｍｏｌ％以下が好ましい。チオール基導入率を低く抑えることで、ゲル化剤使用前の不要な反応（分子内架橋）を抑制できる。
【0054】
ビニルスルホン化ゼラチンにおいては、原料ゼラチン（第２ゼラチン）のアミノ基に、ビニルスルホン基（ＶＳ）のみが導入されていてもよいし、上述のように更にチオール基（ＳＨ）が導入されてもよい。更に、本発明の効果を奏する範囲であれば、その他の官能基が導入されていてもよい。その他の官能基としては、例えば、第２実施形態において後述するウレイドピリミジノン基が挙げられる。
【0055】
以上説明した本実施形態のゲル化剤において、より優れた本発明の効果を得る観点から、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）と、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）との合計含有量は、９０重量％以上、９８重量％以上、または、１００重量％（即ち、チオール化ゼラチン及びビニルスルホン化ゼラチンのみから構成される）が好ましい。
【0056】
＜ゲル化剤の保管方法＞
本実施形態のゲル化剤は、チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとが、別々に収容されて供されることが好ましい。例えば、ゲル化剤は、使用前の不要な反応（例えば、チオール基同士の反応、ゼラチン残基中の水酸基とビニルスルホン基との反応等）を抑制するために、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）を第１収容部に収容し、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）を第１収容部とは異なる第２収容部に収容して、保管することが好ましい。使用前のゲル化剤は、不要な反応を抑制するために、シリカゲル等の乾燥剤と共に保管してもよいし、また、減圧下（真空下）、低温状態（冷凍状態）で保管することが好ましい。
本実施形態のゲル化剤は、チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとが、別々に収容されて供されることが好ましい。例えば、ゲル化剤は、使用前の不要な反応（例えば、チオール基同士の反応、ゼラチン残基中の水酸基とビニルスルホン基との反応等）を抑制するために、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）を第１収容部に収容し、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）を第１収容部とは異なる第２収容部に収容して、保管することが好ましい。使用前のゲル化剤は、不要な反応を抑制するために、シリカゲル等の乾燥剤と共に保管してもよいし、また、減圧下（真空下）、低温状態（冷凍状態）で保管することが好ましい。
【0057】
＜ゲル化剤の使用方法（ゲル組成物の製造方法）＞
本実施形態のゲル化剤の使用方法は、特に限定されず、チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンと、水を含有する溶媒と、を混合すればよい。これにより、チオール化ゼラチンとビニルスルホン化ゼラチンが架橋してゲル（典型的には、ハイドロゲル）が生じる。また、本実施形態のゲル化剤の使用方法は、以下の工程を含んでもよい。
工程Ｓ１：チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）を第１溶媒に溶解し、第１剤を調製する、
工程Ｓ２：ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）を第２溶媒に溶解し、第２剤を調製する、及び
工程Ｓ３：第１剤と、第２剤とを混合する。
本実施形態のゲル化剤の使用方法は、特に限定されず、チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンと、水を含有する溶媒と、を混合すればよい。これにより、チオール化ゼラチンとビニルスルホン化ゼラチンが架橋してゲル（典型的には、ハイドロゲル）が生じる。また、本実施形態のゲル化剤の使用方法は、以下の工程を含んでもよい。
工程Ｓ１：チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）を第１溶媒に溶解し、第１剤を調製する、
工程Ｓ２：ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）を第２溶媒に溶解し、第２剤を調製する、及び
工程Ｓ３：第１剤と、第２剤とを混合する。
【0058】
工程Ｓ１：
第１溶媒は、水を含む溶媒（水性溶媒）である。水性溶媒としては、超純水、生理食塩水、ホウ酸、リン酸、炭酸等各種無機塩の緩衝液、又はこれらの混合物が挙げられる。得られたゲルを細胞培養等に利用することを想定する場合、緩衝液が好ましい。
第１溶媒は、水を含む溶媒（水性溶媒）である。水性溶媒としては、超純水、生理食塩水、ホウ酸、リン酸、炭酸等各種無機塩の緩衝液、又はこれらの混合物が挙げられる。得られたゲルを細胞培養等に利用することを想定する場合、緩衝液が好ましい。
【0059】
第１剤中のチオール化ゼラチンの濃度は特に限定されないが、得られるゲルの強度を高める観点から、例えば、２．５重量％～２０重量％であり、５重量％～１５重量％が好ましい。また、第１剤のｐＨ及び温度は、例えば、ｐＨ＝６.０～８.５、温度：３０℃～６０℃としてよい。
【0060】
第１剤は、チオール化ゼラチン、及び第１溶媒（水性溶媒）のみから構成されてもよいし、また、本実施形態の効果を奏する範囲において、それ以外の添加剤を含有してもよい。添加剤としては、着色料、ｐＨ調整剤、及び、保存剤等が挙げられる。例えば、ゲルを後述する医療材料として用いた場合に、患部等への適用箇所が分かり易いように、着色料（例えばブリリアントブルー）を添加してもよい。添加量は、例えば１０～１００μｇ／ｍＬであってよい。
【0061】
第１剤の調製方法は特に限定されず、チオール化ゼラチン、第１溶媒、そして、必要により、各種添加剤を公知の方法により混合することで調製できる。
【0062】
工程Ｓ２：
第２溶媒は、第１溶媒として挙げたものを用いることができ、好適態様も同様である。第１溶媒と第２溶媒とは、同一の種類の溶媒であることが好ましい。第２剤中のビニルスルホン化ゼラチンの濃度は特に限定されないが、得られるゲルの強度を高める観点から、例えば、２．５重量％～２０重量％であり、５重量％～１５重量％が好ましい。また、均一なゲルを形成し易いという観点からは、第１剤中のチオール化ゼラチンの濃度（Ｃ１）と、第２剤中のビニルスルホン化ゼラチンの濃度（Ｃ２）は近い値であることが好ましい。例えば、比率（Ｃ１）／（Ｃ２）＝０．８～１．２であってよい。また、第２剤のｐＨ及び温度は、上述した第１剤と同等の値をとることができる。
第２溶媒は、第１溶媒として挙げたものを用いることができ、好適態様も同様である。第１溶媒と第２溶媒とは、同一の種類の溶媒であることが好ましい。第２剤中のビニルスルホン化ゼラチンの濃度は特に限定されないが、得られるゲルの強度を高める観点から、例えば、２．５重量％～２０重量％であり、５重量％～１５重量％が好ましい。また、均一なゲルを形成し易いという観点からは、第１剤中のチオール化ゼラチンの濃度（Ｃ１）と、第２剤中のビニルスルホン化ゼラチンの濃度（Ｃ２）は近い値であることが好ましい。例えば、比率（Ｃ１）／（Ｃ２）＝０．８～１．２であってよい。また、第２剤のｐＨ及び温度は、上述した第１剤と同等の値をとることができる。
【0063】
第２剤は、ビニルスルホン化ゼラチン、及び第２溶媒（水性溶媒）のみから構成されてもよいし、また、本実施形態の効果を奏する範囲において、それ以外の添加剤を含有してもよい。添加剤としては、上述した第１剤の添加剤と同様のものが挙げられ、好適態様も同様である。
【0064】
第２剤の調製方法は特に限定されず、ビニルスルホン化ゼラチン、第２溶媒、そして、必要により、各種添加剤を公知の方法により混合することで調製できる。
【0065】
工程Ｓ３：
第１剤と、第２剤とを混合すると、混合液（プレゲル）において直ちに架橋反応（チオール基とビニルスルホン基とのクリック反応）が生じ、ゲル組成物が生成する（図１参照）。本実施形態における架橋反応は、反応速度が速く、触媒や外部からのエネルギーは不要である。また、生理的条件下（水中、緩衝液、等）でも反応が進行し、生体直交性も高い。このため、本実施形態のゲル化剤は、細胞足場材料、医療材料等として使用するゲル組成物の製造に適している。
第１剤と、第２剤とを混合すると、混合液（プレゲル）において直ちに架橋反応（チオール基とビニルスルホン基とのクリック反応）が生じ、ゲル組成物が生成する（図１参照）。本実施形態における架橋反応は、反応速度が速く、触媒や外部からのエネルギーは不要である。また、生理的条件下（水中、緩衝液、等）でも反応が進行し、生体直交性も高い。このため、本実施形態のゲル化剤は、細胞足場材料、医療材料等として使用するゲル組成物の製造に適している。
【0066】
第１剤と第２剤との混合割合は、第１剤中におけるチオール基の含有量、及び第２剤中におけるビニルスルホン基の含有量に応じて適宜調整してよいが、均一なゲルを形成し易いという観点からは、第１剤の量（重量Ｗ１）と、第２剤との量（重量Ｗ２）は、近い値であることが好ましい。例えば、比率（Ｗ１）／（Ｗ２）＝０．８～１．２であってよい。また、混合液（プレゲル）における、第１修飾ゼラチンと第２修飾ゼラチンとの合計含有量（即ち、ゲル化剤濃度）は、ゲル強度を高める観点から、例えば、２．５重量％～２０重量％であり、５重量％～１５重量％が好ましい。
【0067】
ゲル化反応の際の混合液（プレゲル）の温度、ｐＨは特に限定されないが、例えば、温度：１０℃～６０℃、ｐＨ＝６.０～８.５としてよい。また、混合液（プレゲル）は、混合してから、例えば、１分～３０分静置することが好ましい。硬化時間は、ｐＨが高い程、短くなる傾向があるため、得られるゲルの用途に応じて、ｐＨにより硬化時間の調整が可能である。
【0068】
第１剤と、第２剤との混合方法は特に限定されない。例えば、先端部で両剤を混合することができるダブルシリンジ型のディスペンサ、スプレー等を用いてもよい。１方のシリンジに第１剤を充填し、他方のシリンジに第２剤を充填し、先端部で調製された混合液（プレゲル）を、所定部分（例えば、生体組織）に付与し、そこでゲル組成物が得られる。
【0069】
形成されるゲル組成物は、その用途に応じて、細胞、薬剤、タンパク質、ワクチン、脱細胞化マトリックス等の種々の添加剤を含有してもよい。これら添加剤は、得られたゲル組成物に添加してもよいし、ゲル化前又はゲル化途中の第１剤と第２剤との混合液（プレゲル）に添加してもよいし、混合前の第１剤、及び／又は、第２剤に添加していてもよい。これら添加剤の詳細については、後述する。
【0070】
＜ゲル組成物＞
本実施形態のゲル組成物（典型的には、ハイドロゲル）は、上述したゲル化剤と、水を含有する溶媒と、を含む。ゲル組成物において、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）と、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）とは架橋し、架橋物（硬化物）を形成している（図１参照）。水を含有する溶媒は、上述した第１溶媒、第２溶媒と同様のものが挙げられ、好適態様も同様である。
本実施形態のゲル組成物（典型的には、ハイドロゲル）は、上述したゲル化剤と、水を含有する溶媒と、を含む。ゲル組成物において、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）と、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）とは架橋し、架橋物（硬化物）を形成している（図１参照）。水を含有する溶媒は、上述した第１溶媒、第２溶媒と同様のものが挙げられ、好適態様も同様である。
【0071】
ゲル組成物中のゲル化剤濃度（即ち、硬化物の含有量）は、特に限定されず、濃度を変化させることでゲル組成物の力学的特性を制御できる。ゲル組成物の強度を高める観点から、ゲル組成物中のゲル化剤の含有量は、例えば、２．５重量％～２０重量％であり、好ましくは、５重量％～１５重量％である。
【0072】
生体適合性、生分解性、及び細胞接着性が高い本実施形態のゲル組成物は、細胞足場材料として優れている。例えば、細胞を内包した本実施形態のゲルを疾患部位や組織欠損部位に塗布することで、患部の欠損の組織再生を促進できる。このため、本実施形態のゲル組成物（細胞足場材料）は、創傷被覆、筋組織再生、骨再生、神経再生、虚血治療、糖尿病治療、心疾患治療等のための医療材料として用いることができる。更に、本実施形態のゲル組成物を用いて、がん細胞を培養することで、がん組織モデルの構築が可能となり、創薬スクリーニングへの応用も期待できる。
【0073】
本実施形態のゲル組成物は、用途に応じて、様々な添加剤を含有してもよい。例えば、薬剤やタンパク質を含有することで、ゲル組成物は、薬物送達担体（局所デリバリー担体、徐放性デリバリー担体）、ワクチンキャリア等の医療材料として用いることができる。薬剤及びタンパク質としては、例えば、抗がん剤、抗炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、生物学的製剤、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子等の成長因子、ウイルスや癌（がん）の抗原タンパク質（ワクチン）等が挙げられる。
【0074】
また、本実施形態のゲル組成物は、添加剤として、生体組織のマトリックス構造である脱細胞化マトリックスを含有してもよい。ブタやウシなどの動物の臓器や組織から細胞成分を取り除いた後に残る細胞外マトリックス成分を含有することで、ゲル組成物に生物学的機能を付与できる。脱細胞化マトリックスとしては、例えば、膀胱や心臓、肝臓、すい臓、小腸などの臓器から作製した脱細胞化マトリックスを使用できる。当然に、このような脱細胞化マトリックス等の添加剤を含有するゲル組成物を細胞足場材料、医療材料等として用いてよい。
【0075】
［第２実施形態］
本実施形態（第２実施形態）のゲル化剤は、上述した第１実施形態のゲル化剤と同様に、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）、及びビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の２種類の修飾ゼラチンを含む。そして、本実施形態では、チオール化ゼラチン、及びビニルスルホン化ゼラチンの少なくとも一方が有するアミノ基に、ウレイドピリミジノン基が更に導入されている。ここで、「ウレイドピリミジノン基」とは、ウレイドピリミジノン、又はその誘導体から、１個の水素原子を取り除いた一価の基を意味する。図４に示すように、ウレイドピリミジノン基同士は、ゲル組成物中において、水素結合による架橋構造を形成でき、これにより、ゲル組成物の強度を高めることができる。
本実施形態（第２実施形態）のゲル化剤は、上述した第１実施形態のゲル化剤と同様に、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）、及びビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の２種類の修飾ゼラチンを含む。そして、本実施形態では、チオール化ゼラチン、及びビニルスルホン化ゼラチンの少なくとも一方が有するアミノ基に、ウレイドピリミジノン基が更に導入されている。ここで、「ウレイドピリミジノン基」とは、ウレイドピリミジノン、又はその誘導体から、１個の水素原子を取り除いた一価の基を意味する。図４に示すように、ウレイドピリミジノン基同士は、ゲル組成物中において、水素結合による架橋構造を形成でき、これにより、ゲル組成物の強度を高めることができる。
【0076】
チオール化ゼラチンのみがウレイドピリミジノン基を有してもよいし、ビニルスルホン化ゼラチンのみがウレイドピリミジノン基を有してもよいし、また、チオール化ゼラチン、及びビニルスルホン化ゼラチンの両方がウレイドピリミジノン基を有してもよい。
【0077】
チオール化ゼラチン、及び／又は、ビニルスルホン化ゼラチンがウレイドピリミジノン基を有すること以外は、本実施形態のゲル化剤、及びそれを用いて形成されたゲル組成物の態様は、第１実施形態のゲル化剤、及びゲル組成物の態様と同様である。第１実施形態と同様の構成については、説明を省略する。
【0078】
ウレイドピリミジノン基は、間接的に（即ち、２価の基であるスペーサーを介して）、アミノ基に導入されていることが好ましい。例えば、チオール化ゼラチン、及び／又は、ビニルスルホン化ゼラチンのアミノ基には、下記式（６）で表される基が導入されている。
【0079】
【化6】
式（６）において、Ｒ１は、水素原子、又は炭素数１～１０のアルキル基であり、Ｌ６は単結合、又は２価の基であり、＊は連結位置を表す。
【0080】
Ｒ１は、炭素数１～３のアルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。Ｌ６としての２価の基は、例えば、炭素数１～２０の炭化水素鎖を含む。炭化水素鎖は、例えば、アルキル基やエチレンオキシド鎖などであってよく、炭素数が２～１２であることが好ましい。
【0081】
ここで、原料ゼラチン（第１ゼラチン、又は第２ゼラチン）中のアミノ基（第１級アミノ基、－ＮＨ２）の含有量（モル濃度）に対する、修飾ゼラチン（チオール化ゼラチン、又はビニルスルホン化ゼラチン）中のウレイドピリミジノン基の含有量（モル濃度）の比率を「ウレイドピリミジノン基導入率（ウレイドピリミジノン基置換率）（ｍｏｌ％）」と定義する。ウレイドピリミジノン基導入率の求め方は特に限定されず、例えば、ＴＮＢＳ法（２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法、アミノ基の定量）、エルマン法（チオール基の定量）等を用いて直接的、又は間接的に求めた値から計算してよい。例えば、後述する実施例に記載する方法により求めてもよい。
【0082】
チオール化ゼラチン、及びビニルスルホン化ゼラチンにおいて、ウレイドピリミジノン基導入率は特に制限されないが、ゲル強度、及び／又は生体組織への接着力を高める観点から、ウレイドピリミジノン基導入率は、例えば、３０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％であり、好ましくは３５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％である。
【0083】
チオール化ゼラチンがウレイドピリミジノン基を有する場合、ゲル組成物の強度を高める観点から、チオール基（ＳＨ）、ウレイドピリミジノン基（ＵＰｙ）、及び第１級アミノ基（Ａ）のモル比は、例えば、（ＳＨ）／（ＵＰｙ）／（Ａ）＝（４０～６０）／（３５～５５）／（５～２０）としてよい。
【0084】
ビニルスルホン化ゼラチンがウレイドピリミジノン基を有する場合、ゲル組成物の強度を高める観点から、ビニルスルホン基（ＶＳ）、ウレイドピリミジノン基（ＵＰｙ）、及び第１級アミノ基（Ａ）のモル比は、例えば、（ＶＳ）／（ＵＰｙ）／（Ａ）＝（４０～６０）／（３５～５５）／（５～２０）としてよい。
【0085】
ウレイドピリミジノン基を含む、チオール化ゼラチン及びビニルスルホン化ゼラチンの製造方法（合成方法）は特に限定されず、公知の方法によって合成できる。例えば、まず、原料ゼラチン（第１ゼラチン、第２ゼラチン）のアミノ基にウレイドピリミジノン基を導入して、ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンを合成する。ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンに、第１実施形態で説明した方法によりチオール基を導入することにより、チオール化ゼラチンが得られる。また、ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンに、第１実施形態で説明した方法によりビニルスルホン基を導入することにより、ビニルスルホン化ゼラチンが得られる。
【0086】
ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンは、公知の方法によって合成することができ、その方法は特に限定されない。例えば、先ず、ゼラチン（原料ゼラチン）をジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解する。次に、末端にイソシアネート基を有するウレイドピリミジノン誘導体を用意し（図５参照）、それをジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解する。ウレイドピリミジノン誘導体は市販品でもよいし、公知の方法により合成してもよい。ゼラチン液と、ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチン液とを、ゼラチン中のアミノ基の量（ｎ）を１００モル％としたときに、ウレイドピリミジノン基が３０～２００モル％となるように混合し、撹拌する。２０～３０℃で１６～２４時間撹拌することによって、ウレイドピリミジノン修飾ゼラチンが合成できる（図５参照）。反応終了後、冷エタノール・酢酸エチル混合溶媒で再沈殿処理をし、冷クロロホルムおよび冷エタノールで洗浄後に、減圧乾燥をすることでウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンの粉末を得ることができる。
【0087】
本実施形態において、ゲル化剤の保管方法、及びゲル化剤の使用方法（ゲル組成物の製造方法）は、第１実施形態と同様である。但し、ウレイドピリミジノン基の水素結合を促進する観点からは、ゲル化反応の際の温度（ゲル化温度）は４０℃未満、又は、１０℃～３７℃とすることが好ましい。
【0088】
本実施形態のゲル化剤、及びそれを用いて形成されたゲル組成物は、第１実施形態と同様に、チオール化ゼラチン、及びビニルスルホン化ゼラチンの２種類の修飾ゼラチンを含む。このため、本実施形態のゲル化剤、及びゲル組成物は、第１実施形態のそれらと同等の効果を奏する。更に、本実施形態のゲル化剤、及びゲル組成物は、修飾ゼラチンがウレイドピリミジノン基を有する。これにより、更に高い強度を有するゲル組成物を形成し易い。
【実施例0089】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0090】
１.チオール化ゼラチンの合成
［試料１－１］～［試料１－４］
原料ゼラチン（第１ゼラチン、ブタ皮膚由来、Skin-derived gelatin、ＳＧ、新田ゼラチン株式会社）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に６０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、５０℃で加温した。その溶液にγ-Thiobutyrolactone（γ-チオブチロラクトン、Sigma-aldrich社）を所定量添加して混合し、５０℃で１６～２４時間撹拌して反応させた（図２参照）。尚、原料ゼラチンと、γ-Thiobutyrolactoneとの混合比率は、図６の表に示すように、原料ゼラチンのアミノ基量（３５０μｍｏｌ／ｇ、ＴＮＢＳ法により定量）１モル当量に対して、γ-Thiobutyrolactoneが０．５モル当量～４モル当量となるように、各試料において調整した。
［試料１－１］～［試料１－４］
原料ゼラチン（第１ゼラチン、ブタ皮膚由来、Skin-derived gelatin、ＳＧ、新田ゼラチン株式会社）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に６０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、５０℃で加温した。その溶液にγ-Thiobutyrolactone（γ-チオブチロラクトン、Sigma-aldrich社）を所定量添加して混合し、５０℃で１６～２４時間撹拌して反応させた（図２参照）。尚、原料ゼラチンと、γ-Thiobutyrolactoneとの混合比率は、図６の表に示すように、原料ゼラチンのアミノ基量（３５０μｍｏｌ／ｇ、ＴＮＢＳ法により定量）１モル当量に対して、γ-Thiobutyrolactoneが０．５モル当量～４モル当量となるように、各試料において調整した。
【0091】
反応後の溶液を室温まで冷却し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、３０分間撹拌し還元した。その後、溶液を２０倍量の冷エタノール／冷酢酸エチル（体積比で１:１）の混合溶媒に撹拌しながら、ゆっくりと滴下し再沈殿させた。ガラスフィルターを用いて濾過し、クロロホルム及びエタノールで洗浄し、減圧乾燥することにより、チオール化ゼラチンの白色粉末を回収した。
【0092】
＜チオール基導入率の測定＞
原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度（ｍｏｌ／ｇ）を２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮＢＳ法）によって定量し、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）のチオール基濃度（ｍｏｌ／ｇ）をエルマン法で定量し、得られた値から、以下の式によりチオール基導入率を算出した。
チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）のチオール基導入率（ｍｏｌ％）
＝（第１修飾ゼラチンのチオール基濃度）／（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）×１００
原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度（ｍｏｌ／ｇ）を２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮＢＳ法）によって定量し、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）のチオール基濃度（ｍｏｌ／ｇ）をエルマン法で定量し、得られた値から、以下の式によりチオール基導入率を算出した。
チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）のチオール基導入率（ｍｏｌ％）
＝（第１修飾ゼラチンのチオール基濃度）／（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）×１００
【0093】
計算結果（Ｄ．Ｓ．）を図６の表に示す。試料１－１～試料１－４のチオール基導入率は、それぞれ、２５．４ｍｏｌ％、３８．９ｍｏｌ％、６４．３ｍｏｌ％、９６．０ｍｏｌ％であった。尚、これ以降、試料１－１～試料１－４を、それぞれ、適宜、ＳＧ－ＳＨ２５、ＳＧ－ＳＨ３９、ＳＧ－ＳＨ６４、ＳＧ－ＳＨ９６と表記する場合がある。
尚、合成した４種類のチオール化ゼラチンは、チオール基導入率が高い程、水溶性が低下する傾向にあった。後述するゲル化実験は、十分な水溶性を有しゲルを形成し易い試料１－１～１－３を用いて行った（表１参照）。
尚、合成した４種類のチオール化ゼラチンは、チオール基導入率が高い程、水溶性が低下する傾向にあった。後述するゲル化実験は、十分な水溶性を有しゲルを形成し易い試料１－１～１－３を用いて行った（表１参照）。
【0094】
［試料１－５］
＜ウレイドピリミジノン基（Ｕｐｙ基）修飾ゼラチンの合成＞
先ず、図５に示す、末端にイソシアネート基を有するウレイドピリミジノン誘導体を合成した。２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－メチルピリミジン（１７．４ｍｍｏｌ，２．１７８ｇ，Sigma-Aldrich社）を１，６－ジイソシアナトヘキサン（７８．３ｍｍｏｌ，１３．１６３ｇ，東京化成工業株式会社）に分散させ、１００℃に加熱して反応させ、１６時間撹拌し続けた。２５℃まで冷却した後、１０倍量のｎ－ヘキサンを加えて生成物を沈殿させた。得られた沈殿物をろ過して回収し、ｎ－ヘキサンで３回洗浄した。生成物を５０℃で減圧乾燥し、末端にイソシアネート基を有するウレイドピリミジノン誘導体（分子量２９３）を白色粉末として得た。
＜ウレイドピリミジノン基（Ｕｐｙ基）修飾ゼラチンの合成＞
先ず、図５に示す、末端にイソシアネート基を有するウレイドピリミジノン誘導体を合成した。２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－メチルピリミジン（１７．４ｍｍｏｌ，２．１７８ｇ，Sigma-Aldrich社）を１，６－ジイソシアナトヘキサン（７８．３ｍｍｏｌ，１３．１６３ｇ，東京化成工業株式会社）に分散させ、１００℃に加熱して反応させ、１６時間撹拌し続けた。２５℃まで冷却した後、１０倍量のｎ－ヘキサンを加えて生成物を沈殿させた。得られた沈殿物をろ過して回収し、ｎ－ヘキサンで３回洗浄した。生成物を５０℃で減圧乾燥し、末端にイソシアネート基を有するウレイドピリミジノン誘導体（分子量２９３）を白色粉末として得た。
【0095】
次に、原料ゼラチン（第１ゼラチン、ブタ腱ゼラチン、Tendon gelatin、ＴＧ、新田ゼラチン株式会社）をジメチルスルホキシドに５０℃で溶解し、室温まで冷却した。また、合成したウレイドピリミジノン誘導体をジメチルスルホキシドに溶解した。ゼラチン液に、ウレイドピリミジノン誘導体液を所定量（原料ゼラチンのアミノ基量（２９３μｍｏｌ／ｇ、ＴＮＢＳ法により測定）１モル当量に対して、Ｕｐｙ基が０．４５モル当量）添加して混合し、撹拌した。２０～３０℃で１６～２４時間撹拌することによって、Ｕｐｙ基修飾ゼラチンを合成した（図５参照）。反応終了後、エタノール・酢酸エチル混合溶媒で再沈殿処理をし、冷クロロホルムおよび冷エタノールで洗浄後に、減圧乾燥をすることで目的物の粉末を得た。
【0096】
＜ウレイドピリミジノン基導入率の測定＞
ウレイドピリミジノン基導入率は、原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度（ｍｏｌ／ｇ）と、ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンの第１級アミノ基（残存アミノ基）濃度（ｍｏｌ／ｇ）を、ＴＮＢＳ法によって定量し、得られた値から、以下の式により算出した。ウレイドピリミジノン基導入率は、４２ｍｏｌ％であった。
ウレイドピリミジノン基導入率は、原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度（ｍｏｌ／ｇ）と、ウレイドピリミジノン基修飾ゼラチンの第１級アミノ基（残存アミノ基）濃度（ｍｏｌ／ｇ）を、ＴＮＢＳ法によって定量し、得られた値から、以下の式により算出した。ウレイドピリミジノン基導入率は、４２ｍｏｌ％であった。
【0097】
Ｕｐｙ基導入率（ｍｏｌ％）
＝［（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）－（Ｕｐｙ基修飾ゼラチンの第１級アミノ基濃度）］／（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）×１００
＝［（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）－（Ｕｐｙ基修飾ゼラチンの第１級アミノ基濃度）］／（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）×１００
【0098】
＜チオール基導入、及びチオール基導入率の測定＞
合成したＵｐｙ基修飾ゼラチンの第１級アミノ基に対して、上述した試料１－１と同様の方法により、チオール基を導入し、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）を合成した。尚、Ｕｐｙ基修飾ゼラチンと、γ-Thiobutyrolactoneとの混合比率は、図６の表に示すように、Ｕｐｙ基修飾ゼラチンのアミノ基量１モル当量に対して、γ-Thiobutyrolactoneが２モル当量となるように調整した。また、試料１－１と同様の方法により、チオール基導入率を測定した。結果を図６の表に示す。試料１－５のチオール基導入率は、５０．２ｍｏｌ％であった。尚、これ以降、試料１－５を、適宜、ＴＧＵＰｙ－ＳＨ５０と表記する場合がある。
合成したＵｐｙ基修飾ゼラチンの第１級アミノ基に対して、上述した試料１－１と同様の方法により、チオール基を導入し、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）を合成した。尚、Ｕｐｙ基修飾ゼラチンと、γ-Thiobutyrolactoneとの混合比率は、図６の表に示すように、Ｕｐｙ基修飾ゼラチンのアミノ基量１モル当量に対して、γ-Thiobutyrolactoneが２モル当量となるように調整した。また、試料１－１と同様の方法により、チオール基導入率を測定した。結果を図６の表に示す。試料１－５のチオール基導入率は、５０．２ｍｏｌ％であった。尚、これ以降、試料１－５を、適宜、ＴＧＵＰｙ－ＳＨ５０と表記する場合がある。
【0099】
２.ビニルスルホン化ゼラチンの合成
［試料２－１］～［試料２－３］及び［試料２－５］
合成した試料１－１～１－３及び１－５（チオール化ゼラチン、ＳＧ－ＳＨ２５、ＳＧ－ＳＨ３９、ＳＧ－ＳＨ６４、ＴＧＵＰｙ－ＳＨ５０）それぞれを超純水に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、５０℃で加温した。その溶液にDivinyl sulfone（ジビニルスルホン、東京化成工業株式会社）を所定量（チオール基１モル当量に対して、ジビニルスルホンを２モル当量）添加して混合し、５０℃で１６～２４時間撹拌して反応させた（図３参照）。反応後の溶液を室温まで冷却し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、３０分間撹拌し還元した。その後、溶液を透析膜（分子量分画１２０００～１５０００）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥することにより、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の白色粉末を回収した。
［試料２－１］～［試料２－３］及び［試料２－５］
合成した試料１－１～１－３及び１－５（チオール化ゼラチン、ＳＧ－ＳＨ２５、ＳＧ－ＳＨ３９、ＳＧ－ＳＨ６４、ＴＧＵＰｙ－ＳＨ５０）それぞれを超純水に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、５０℃で加温した。その溶液にDivinyl sulfone（ジビニルスルホン、東京化成工業株式会社）を所定量（チオール基１モル当量に対して、ジビニルスルホンを２モル当量）添加して混合し、５０℃で１６～２４時間撹拌して反応させた（図３参照）。反応後の溶液を室温まで冷却し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、３０分間撹拌し還元した。その後、溶液を透析膜（分子量分画１２０００～１５０００）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥することにより、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）の白色粉末を回収した。
【0100】
＜ビニルスルホン基導入率の測定＞
原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度（ｍｏｌ／ｇ）をＴＮＢＳ法によって定量し、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）のチオール基濃度（ｍｏｌ／ｇ）、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）のチオール基濃度（ｍｏｌ／ｇ）をエルマン法によって定量し、得られた値から、以下の式によりビニルスルホン基導入率を算出した。
ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基導入率（ｍｏｌ％）
＝［（第１修飾ゼラチンのチオール基濃度）－（第２修飾ゼラチンのチオール基濃度）］／（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）×１００
原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度（ｍｏｌ／ｇ）をＴＮＢＳ法によって定量し、チオール化ゼラチン（第１修飾ゼラチン）のチオール基濃度（ｍｏｌ／ｇ）、ビニルスルホン化ゼラチン（第２修飾ゼラチン）のチオール基濃度（ｍｏｌ／ｇ）をエルマン法によって定量し、得られた値から、以下の式によりビニルスルホン基導入率を算出した。
ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基導入率（ｍｏｌ％）
＝［（第１修飾ゼラチンのチオール基濃度）－（第２修飾ゼラチンのチオール基濃度）］／（原料ゼラチンの第１級アミノ基濃度）×１００
【0101】
計算結果（Ｄ．Ｓ．）を図７の表に示す。試料２－１～２－３及び２－５のビニルスルホン基導入率は、それぞれ、２５ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％であった。尚、これ以降、試料２－１～２－３及び２－５を、それぞれ、適宜、ＳＧ－ＶＳ２５、ＳＧ－ＶＳ３５、ＳＧ－ＶＳ６０、ＴＧＵＰｙ－ＶＳ４８と表記する場合がある。
【0102】
３.修飾ゼラチンの１Ｈ-ＮＭＲ測定
合成した修飾ゼラチンのうち、代表して、試料１－３（ＳＧ－ＳＨ６４）、及び試料２－３（ＳＧ－ＶＳ６０）の１Ｈ-ＮＭＲ測定を行った（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）。結果を図８に示す。参考のため、原料ゼラチン（ＳＧ）、γ-Thiobutyrolactone、Divinyl sulfoneの測定結果も併せて図８に示す。図８に示すように、１Ｈ-ＮＭＲ測定から、修飾ゼラチンにおいてチオール基、及びビニルスルホン基の導入が確認できた。
合成した修飾ゼラチンのうち、代表して、試料１－３（ＳＧ－ＳＨ６４）、及び試料２－３（ＳＧ－ＶＳ６０）の１Ｈ-ＮＭＲ測定を行った（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）。結果を図８に示す。参考のため、原料ゼラチン（ＳＧ）、γ-Thiobutyrolactone、Divinyl sulfoneの測定結果も併せて図８に示す。図８に示すように、１Ｈ-ＮＭＲ測定から、修飾ゼラチンにおいてチオール基、及びビニルスルホン基の導入が確認できた。
【0103】
４.ゲル組成物の作製、及び評価
（１）ゲル化剤
チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとを表１のように組み合わせて、４種類のゲル化剤１～４とした。各ゲル化剤において、チオール化ゼラチンとビニルスルホン化ゼラチンは、等重量で用いた。したがって、ゲル化剤１～４において、チオール化ゼラチンが有するチオール基１モル当量に対する、ビニルスルホン化ゼラチンが有するビニルスルホン基のモル当量（ＶＳ／ＳＨ）は、（２５／２５）＝１．００、（３５／３９）＝０．９０、（６０／６４）＝０．９４、（４８／５０）＝０．９６である。
（１）ゲル化剤
チオール化ゼラチンと、ビニルスルホン化ゼラチンとを表１のように組み合わせて、４種類のゲル化剤１～４とした。各ゲル化剤において、チオール化ゼラチンとビニルスルホン化ゼラチンは、等重量で用いた。したがって、ゲル化剤１～４において、チオール化ゼラチンが有するチオール基１モル当量に対する、ビニルスルホン化ゼラチンが有するビニルスルホン基のモル当量（ＶＳ／ＳＨ）は、（２５／２５）＝１．００、（３５／３９）＝０．９０、（６０／６４）＝０．９４、（４８／５０）＝０．９６である。
【0104】
【表1】
【0105】
（２）粘弾性の時間依存性評価
＜ゲル組成物３－１～３－３＞
ゲル化剤３（ＳＧ－ＳＨ６４、ＳＧ－ＶＳ６０）を用いて、以下に説明する方法により、ゲル化剤濃度の異なるゲル組成物３－１～３－３を作製し、粘弾性の時間依存性を評価した。各ゲル組成物中のゲル化剤濃度（チオール化ゼラチンとビニルスルホン化ゼラチンとの硬化物の含有量）は、ゲル組成物３－１：２．５重量％、ゲル組成物３－２：５重量％、ゲル組成物３－３：１０重量％とした。
＜ゲル組成物３－１～３－３＞
ゲル化剤３（ＳＧ－ＳＨ６４、ＳＧ－ＶＳ６０）を用いて、以下に説明する方法により、ゲル化剤濃度の異なるゲル組成物３－１～３－３を作製し、粘弾性の時間依存性を評価した。各ゲル組成物中のゲル化剤濃度（チオール化ゼラチンとビニルスルホン化ゼラチンとの硬化物の含有量）は、ゲル組成物３－１：２．５重量％、ゲル組成物３－２：５重量％、ゲル組成物３－３：１０重量％とした。
【0106】
まず、チオール化ゼラチンをリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に２５ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬで溶解し、５０℃で加温後、ｐＨを７．５～８．２に調整した（第１剤：チオール化ゼラチン溶液）。ビニルスルホン化ゼラチンはＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に２５ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬで溶解し、５０℃で加温後、ｐＨを６．０～７．０に調整した（第２剤：ビニルスルホン化ゼラチン溶液）。第１剤と第２剤とを３７℃で３０分間加温し、等量混合することによって混合液（プレゲル溶液）とた。
【0107】
調製した混合液（プレゲル溶液）１００μＬを基板に滴下し、それを粘弾性測定装置（Ｒｈｅｏｐｌｕｓ、アントンパール社）のステージにのせて直径１０ｍｍの治具で挟み込み、３７℃、１％ひずみ、１０ｒａｄ／ｓの条件で、プレゲルから生成するゲル組成物の弾性率の時間依存性（１～３０分間）を測定した。結果を図９に示す。
【0108】
図９に示すように、いずれのゲル化剤濃度においても貯蔵弾性率（Ｇ’）が損失弾性率（Ｇ”）を上回っており、ハイドロゲルを製造できたことが確認できた。また、貯蔵弾性率（Ｇ’）は、ゲル化剤濃度の増加に伴って増加し、ゲル化剤濃度１０重量％（ゲル組成物３－３）で最も高い値を得た。この結果から、例えば、ゲル化剤濃度を５重量％～１５重量％とすると、より強度の強いゲル組成物を製造し易くなると推測される。
【0109】
＜ゲル組成物１－３、２－３、及び３－３＞
次に、チオール基導入率及びビニルスルホン基導入率の異なるゲル化剤１～３を用いて、上記のゲル組成物３－１等と同様の方法により、ゲル組成物１－３、２－３、及び３－３(ゲル化剤濃度：１０重量％)を作製し、粘弾性の時間依存性を評価した。結果を図１０に示す。
次に、チオール基導入率及びビニルスルホン基導入率の異なるゲル化剤１～３を用いて、上記のゲル組成物３－１等と同様の方法により、ゲル組成物１－３、２－３、及び３－３(ゲル化剤濃度：１０重量％)を作製し、粘弾性の時間依存性を評価した。結果を図１０に示す。
【0110】
図１０に示すように、いずれのゲル化剤を用いた場合も、貯蔵弾性率（Ｇ’）が損失弾性率（Ｇ”）を上回っており、ハイドロゲルが製造できたことが確認できた。また、測定開始から２０分経過後においては、貯蔵弾性率（Ｇ’）は、チオール基導入率、及びビニルスルホン基導入率が高い程、高かった。ゲル組成物３－３（ＳＧ－ＳＨ６４、ＳＧ－ＶＳ６０）は、測定開始から２０分経過後の貯蔵弾性率（Ｇ’）が２．６ｋＰａと最も高い値であった。この結果から、例えば、チオール化ゼラチンのチオール基導入率、及び／又は、ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基導入率を４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％、好ましくは、５０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％とすると、より強度の強いゲル組成物を製造し易いと推測される。
【0111】
図９及び図１０に示す結果から、ゲル組成物の力学的特定は、ゲル組成物中のゲル化剤濃度、ゲル化剤に含まれるチオール化ゼラチンのチオール基導入率、ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基導入率を調整することで、制御できることがわかった。
【0112】
（３）引張試験による力学強度測定
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）の引張試験を以下に説明する方法により行った。
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）の引張試験を以下に説明する方法により行った。
【0113】
まず、上述と同様の方法により、ゲル化剤３を用いて、チオール化ゼラチンとビニルスルホン化ゼラチンとの混合液（プレゲル溶液）を調整し、ＩＳＯ３７-２のサイズのシリコンモールドに注ぎ、３７℃で６０分間保持してゲル化させ、ゲル組成物３－３を得た。テクスチャ―アナライザーを用いて、２５℃でゲル組成物３－３の引張試験を行った。結果を図１１に示す。図１１に示すように、ゲル組成物３－３は、高い延び率と応力を示した（ひずみ：２２９％、応力：３０．９ｋＰａ）。
【0114】
（４）接着試験
ゲル組成物１－３、２－３、及び３－３について、ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、組織接着性を評価するためのモデル組織として、コラーゲンケーシングを用いた接着性評価を行った。
ゲル組成物１－３、２－３、及び３－３について、ＡＳＴＭ－Ｆ２３９２－０４Ｒに準拠して、組織接着性を評価するためのモデル組織として、コラーゲンケーシングを用いた接着性評価を行った。
【0115】
まず、直径３５ｍｍのコラーゲンケーシングに直径３ｍｍのピンホールを形成した。ゲル組成物１－３、２－３、及び３－３のプレゲル溶液を上述と同様の方法により調製し、３００μＬのプレゲル溶液をコラーゲンケーシング上に滴下した。これを３７℃で６０分間静置した後、耐圧強度を測定した。結果を図１２に示す。図１２に示すように、組織への接着強度は、チオール基導入率、及びビニルスルホン基導入率が高い程高く、ゲル組成物３－３（ＳＧ－ＳＨ６４、ＳＧ－ＶＳ６０）は、接着強度は４．７ｋＰａであった。この結果から、例えば、チオール化ゼラチンのチオール基導入率、及び／又は、ビニルスルホン化ゼラチンのビニルスルホン基導入率を４０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％、好ましくは、５０ｍｏｌ％～７０ｍｏｌ％とすることで、より組織への接着強度の高いゲル組成物が製造し易いと推測される。
【0116】
（５）細胞毒性試験
チオール化ゼラチン（試料１－１～１－３）、及びビニルスルホン化ゼラチン（試料２－１～２－３）の細胞毒性試験を以下の方法で行った。
チオール化ゼラチン（試料１－１～１－３）、及びビニルスルホン化ゼラチン（試料２－１～２－３）の細胞毒性試験を以下の方法で行った。
【0117】
チオール化ゼラチン（試料１－１～１－３）、及びビニルスルホン化ゼラチン（試料２－１～２－３）を、それぞれ、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）に溶解し、修飾ゼラチン溶液を調製した。評価細胞として、マウス線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）を用いた。Ｌ９２９細胞はＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。２×１０４個のＬ９２９細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間予備培養した。各修飾ゼラチン溶液を１００μＬずつウェルに添加し、さらに２４時間培養した。培養完了後、細胞数カウンティングキット（ＷＳＴ－８、ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて細胞数を定量した。結果を図１３に示す。
【0118】
図１３に示すように、いずれの修飾ゼラチン（試料１－１～１－３、及び２－１～２－３）においても高い細胞生存率を有し、高い細胞適合性を有することが確認された。したがって、これらの修飾ゼラチンから構成されるゲル化剤も高い細胞適合性を有する。また、ゲル組成物では、チオール基とビニルスルホン基とが反応して、フリーのチオール基及びビニルスルホン基の数がゲル化剤よりも減少しているため、ゲル化剤よりも細胞毒性が低くなる。したがって、ゲル組成物は、更に細胞毒性が低下し、より高い細胞適合性を有すると推測される。
【0119】
（６）細胞内包試験
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）を用いて、以下に説明する方法により細胞内包試験を行った。評価細胞として、ヒト間葉系幹細胞を用いた。
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）を用いて、以下に説明する方法により細胞内包試験を行った。評価細胞として、ヒト間葉系幹細胞を用いた。
【0120】
まず、上述と同様の方法により、ゲル化剤３を用いて、プレゲル溶液（ゲル化剤濃度：１０重量％）を調整し、４×１０４個のヒト間葉系幹細胞に対して、プレゲル溶液を２０μＬ添加し、２４ウェルプレートに播種した。２０分後にＤＭＥＭ培地（１５％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を５００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。培養後にサンプルをホルマリン固定し、アクチン染色と核染色を行い、蛍光顕微鏡観察を行った。図１４に蛍光顕微鏡写真（グレースケール変換済）を示す。
【0121】
図１４の蛍光顕微鏡写真に示すように、ヒト間葉系幹細胞（染色されたアクチンと核の部分）がハイドロゲルに接着し、伸展している様子が確認された。この結果より、ゲル組成物３－３は、化学架橋性のハイドロゲルでありながら、高い細胞生存率を保ったまま細胞を内包可能であり、さらに細胞接着性も有していることが明らかとなった。
【0122】
（７）がん細胞の内包試験
＜ゲル組成物３－３＞
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）を用いて、以下に説明する方法により、がん細胞の内包試験を行った。評価細胞として、マウス膵がん細胞を用いた。
＜ゲル組成物３－３＞
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）を用いて、以下に説明する方法により、がん細胞の内包試験を行った。評価細胞として、マウス膵がん細胞を用いた。
【0123】
まず、上述と同様の方法により、ゲル化剤３を用いて、プレゲル溶液（ゲル化剤濃度：１０重量％）を調整し、４×１０４個のマウス膵がん細胞に対して、プレゲル溶液を２０μＬ添加し、２４ウェルプレートに播種した。２０分後にＤＭＥＭ培地（１５％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を５００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。培養後にサンプルをホルマリン固定し、アクチン染色、コラーゲン染色、核染色を行い、蛍光顕微鏡観察を行った。図１５に蛍光顕微鏡写真（グレースケール変換済）を示す。
【0124】
＜ゲル組成物３－４＞
ゲル組成物３－４として、ブタ由来膀胱マトリックス（ＵＢＭ：Urinary bladder matrix）を含有するゲル組成物を調製し、がん細胞の内包試験を行った。プレゲル溶液にＵＢＭを添加し、ＵＢＭ含有プレゲル溶液を２４ウェルプレートに播種したこと以外は、上述のゲル組成物３－３のがん細胞の内包試験と同様に試験を行った。したがって、ゲル組成物３－４の組成は、ＵＢＭを含有すること以外、ゲル組成物３－３の組成と同様である。尚、ＵＢＭは、プレゲル溶液２０μＬに対して、２ｍｇ添加した。図１５に蛍光顕微鏡写真（グレースケール変換済）を示す。
ゲル組成物３－４として、ブタ由来膀胱マトリックス（ＵＢＭ：Urinary bladder matrix）を含有するゲル組成物を調製し、がん細胞の内包試験を行った。プレゲル溶液にＵＢＭを添加し、ＵＢＭ含有プレゲル溶液を２４ウェルプレートに播種したこと以外は、上述のゲル組成物３－３のがん細胞の内包試験と同様に試験を行った。したがって、ゲル組成物３－４の組成は、ＵＢＭを含有すること以外、ゲル組成物３－３の組成と同様である。尚、ＵＢＭは、プレゲル溶液２０μＬに対して、２ｍｇ添加した。図１５に蛍光顕微鏡写真（グレースケール変換済）を示す。
【0125】
図１５に示すように、ゲル組成物３－３及び３－４中において、マウス膵がん細胞（染色されたアクチンと核の部分）同士が強く結合してスフェロイドを形成している様子が観察された。また、ゲル組成物３－４の写真には、細胞のスフェロイドに加えて、全体にＵＢＭ（染色されたコラーゲン部分）が分散している様子が確認できた。これらの結果から、ＵＢＭの有無によらず、ゲル組成物が細胞足場材料（細胞培養材料）として有用であることが確認できた。また、ＵＢＭを含むゲル組成物３－４では、ＵＢＭを含まないゲル組成物３－３と比較して、細胞がより伸展している様子が観察された。この結果から、ＵＢＭを含むゲル組成物３－４に、より強く細胞が接着していると理解できる。
【0126】
以上の結果から、ゲル組成物は、がん細胞の培養に使用することができ、更に、ＵＢＭ等の添加剤を加えることで様々な細胞特性が評価でき、がんモデルへの応用が可能であることが理解できる。
【0127】
（８）生分解性試験
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週齢、メス）へ埋入することで、生体適合性と生分解性を評価した。
ゲル組成物３－３（ゲル化剤３使用、ゲル化剤濃度：１０重量％）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週齢、メス）へ埋入することで、生体適合性と生分解性を評価した。
【0128】
まず、上述と同様の方法により、ゲル化剤３を用いてプレゲル溶液（ゲル化剤濃度：１０重量％）を調製し、プレゲル溶液を厚さ１ｍｍのシリコンモールドに入れ、２５℃で６０分間ゲル化させた。得られたゲル組成物３－３はＵＶ照射によって滅菌した。イソフルランの吸入麻酔下において、背部の毛を剃り、７０％エタノールで消毒した後に、メスで皮膚を切開し、皮下にゲル組成物３－３を埋植した。１、３、７、１４、２８日後にマウスを安楽死させ、ゲル組成物３－３と組織を摘出し、組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色後、蛍光顕微鏡観察を行った。図１６に蛍光顕微鏡写真（グレースケール変換済）を示す。
【0129】
図１６に示すように、ゲル組成物周囲での強い炎症反応は確認されなかった。また、７日後には多くの細胞のゲル組成物への浸潤が確認され、１４日後には、細胞浸潤がゲル組成物全体に広がっていた。１４日後まで、ゲル組成物の厚みの変化は確認されなかったが、２８日後には、ゲル組成物は完全に分解されて消失していた。この結果より、ゲル組成物は、生分解性と生体適合性を兼ね備えることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【0130】
以上説明した本実施形態のゲル化剤は、クリック反応により、ゲル組成物（クリックハイドロゲル）を生成可能である。得られたゲル組成物は、高い生体適合性・生分解性・細胞接着性を有し、医療材料、細胞足場材料等として、例えば、医療用途に大変有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
