ホーム > 特許ランキング > ジェンマブ エー／エス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024116279
(43)【公開日】2024-08-27
(54)【発明の名称】ＣＤ３０及びＣＤ３に結合する抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240820BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240820BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240820BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240820BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240820BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240820BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240820BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240820BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240820BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20240820BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/08
A61P35/00
A61K39/395 N
A61K47/28
A61K47/44
C07K16/46
【審査請求】未請求
【請求項の数】60
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024093206
(22)【出願日】2024-06-07
(62)【分割の表示】P 2023538860の分割
【原出願日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】21201712.3
(32)【優先日】2021-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507316398
【氏名又は名称】ジェンマブ エー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】サティン，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】エンゲルバーツ，パトリック
(72)【発明者】
【氏名】ケンパー，クリステル
(72)【発明者】
【氏名】ブレイ，エステル・シー・ダブリュー
(72)【発明者】
【氏名】オースティンディー，シモーネ
(72)【発明者】
【氏名】アレムデヒ，ファルシッド
(57)【要約】 （修正有）
【課題】有効性があり、安全で、良好な製造可能性を有し、かつ／又は長い貯蔵寿命を有するＣＤ３０標的化化合物を提供する。また、改善されたＣＤ３０標的化がん療法を提供する。
【解決手段】ＣＤ３及びＣＤ３０に結合する多重特異性抗体を提供する。前記抗体を含む薬学的組成物、抗体をコードする核酸、抗体を産生する宿主細胞、抗体を産生する方法、及び特にがん療法のための、抗体の使用を更に提供する。
【選択図】なし
【解決手段】ＣＤ３及びＣＤ３０に結合する多重特異性抗体を提供する。前記抗体を含む薬学的組成物、抗体をコードする核酸、抗体を産生する宿主細胞、抗体を産生する方法、及び特にがん療法のための、抗体の使用を更に提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣ
Ｄ３結合領域と、
を含む多重特異性抗体。
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣ
Ｄ３結合領域と、
を含む多重特異性抗体。
【請求項2】
前記第１の重鎖可変領域及び／又は前記第１の軽鎖可変領域が、ヒトである、請求項１
に記載の多重特異性抗体。
に記載の多重特異性抗体。
【請求項3】
前記第２の重鎖可変領域及び／又は前記第２の軽鎖可変領域が、ヒト化である、請求項
１又は２に記載の多重特異性抗体。
１又は２に記載の多重特異性抗体。
【請求項4】
配列番号９におけるＸが、Ｈである、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異
性抗体。
性抗体。
【請求項5】
配列番号９におけるＸが、Ｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性
抗体。
抗体。
【請求項6】
前記第１の重鎖可変領域が、配列番号１３に記載される配列を含み、前記第１の軽鎖可
変領域が、配列番号１４に記載される配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載
の多重特異性抗体。
変領域が、配列番号１４に記載される配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載
の多重特異性抗体。
【請求項7】
前記第２の重鎖可変領域が、配列番号１５に記載される配列を含み、前記第２の軽鎖可
変領域が、配列番号１６に記載される配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載
の多重特異性抗体。
変領域が、配列番号１６に記載される配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載
の多重特異性抗体。
【請求項8】
前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、先行する請求項のいずれか一項に記載
の多重特異性抗体。
の多重特異性抗体。
【請求項9】
前記多重特異性抗体が、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含む、先
行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項10】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請
求項９に記載の多重特異性抗体。
求項９に記載の多重特異性抗体。
【請求項11】
前記多重特異性抗体が、全長抗体である、請求項９又は１０に記載の多重特異性抗体。
【請求項12】
不活性Ｆｃ領域を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項13】
前記第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＬ２３４及
び／又はＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、ここで、前記置換が、
好ましくは、それぞれ、Ｆ及びＥへの置換であり、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナ
ンバリングによって定義されるとおりである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の多
重特異性抗体。
び／又はＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、ここで、前記置換が、
好ましくは、それぞれ、Ｆ及びＥへの置換であり、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナ
ンバリングによって定義されるとおりである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の多
重特異性抗体。
【請求項14】
前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び／
又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換であり、
ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求
項１２又は１３に記載の多重特異性抗体。
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び／
又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換であり、
ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求
項１２又は１３に記載の多重特異性抗体。
【請求項15】
前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第
２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応する前
記アミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換である、請
求項１４に記載の多重特異性抗体。
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第
２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応する前
記アミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換である、請
求項１４に記載の多重特異性抗体。
【請求項16】
前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び／
又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ａへの置換であり、
ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求
項１２又は１３に記載の多重特異性抗体。
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び／
又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ａへの置換であり、
ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求
項１２又は１３に記載の多重特異性抗体。
【請求項17】
前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第
２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する前
記アミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ａへの置換である、請
求項１６に記載の多重特異性抗体。
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第
２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する前
記アミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ａへの置換である、請
求項１６に記載の多重特異性抗体。
【請求項18】
前記第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方が、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５
、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み
、他方のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミ
ノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、前記アミノ酸
位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項１２～１４のいずれ
か一項に記載の多重特異性抗体。
、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み
、他方のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミ
ノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、前記アミノ酸
位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項１２～１４のいずれ
か一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項19】
前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に
含まれ、前記第２のＦｃポリペプチド及び前記第２の重鎖可変領域が、同じポリペプチド
鎖内に含まれる、請求項１８に記載の多重特異性抗体。
含まれ、前記第２のＦｃポリペプチド及び前記第２の重鎖可変領域が、同じポリペプチド
鎖内に含まれる、請求項１８に記載の多重特異性抗体。
【請求項20】
前記第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のア
ミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、第２のＦｃポリペプ
チドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応する前記ア
ミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリ
ングによって定義されるとおりである、請求項１９に記載の多重特異性抗体。
ミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、第２のＦｃポリペプ
チドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応する前記ア
ミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリ
ングによって定義されるとおりである、請求項１９に記載の多重特異性抗体。
【請求項21】
前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８
、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位
置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つが置換されており、前記第２の
Ｆｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、
Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する
位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つが置換されており、そしてここで、前記第１
及び第２のＦｃポリペプチドにおける前記置換が同じ位置にはなく、ここで、前記アミノ
酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項９～２０のいずれ
か一項に記載の多重特異性抗体。
、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位
置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つが置換されており、前記第２の
Ｆｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、
Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する
位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つが置換されており、そしてここで、前記第１
及び第２のＦｃポリペプチドにおける前記置換が同じ位置にはなく、ここで、前記アミノ
酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項９～２０のいずれ
か一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項22】
前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にある前記アミノ酸が
、Ｌであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記
アミノ酸が、Ｒであるか、又はその逆もまた同様である、請求項２１に記載の多重特異性
抗体。
、Ｌであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記
アミノ酸が、Ｒであるか、又はその逆もまた同様である、請求項２１に記載の多重特異性
抗体。
【請求項23】
前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記アミノ酸が
Ｒであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にある前記ア
ミノ酸がＬである、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
Ｒであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にある前記ア
ミノ酸がＬである、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
【請求項24】
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣ
Ｄ３結合領域と、を含み、
ここで、前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、第１及び第２のＦｃポリペプ
チドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチ
ド鎖内に含まれ、前記第２のＦｃポリペプチド及び前記第２の重鎖可変領域が、同じポリ
ペプチド鎖内に含まれ、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３
６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、そして、前
記第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、そしてここで、前記アミ
ノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりであり、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記ア
ミノ酸が、Ｒであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置に
ある前記アミノ酸がＬである、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣ
Ｄ３結合領域と、を含み、
ここで、前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、第１及び第２のＦｃポリペプ
チドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチ
ド鎖内に含まれ、前記第２のＦｃポリペプチド及び前記第２の重鎖可変領域が、同じポリ
ペプチド鎖内に含まれ、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３
６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、そして、前
記第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ
酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、そしてここで、前記アミ
ノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりであり、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記ア
ミノ酸が、Ｒであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置に
ある前記アミノ酸がＬである、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項25】
配列番号１７及び１９に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載され
る軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重
特異性抗体。
る軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重
特異性抗体。
【請求項26】
配列番号１７及び１９に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載され
る軽鎖配列を含むか、又はそれらからなり、前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体であ
る、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
る軽鎖配列を含むか、又はそれらからなり、前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体であ
る、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項27】
（ｉ）前記ＣＤ３０結合領域及び／若しくは前記ＣＤ３結合領域が、Ｆａｂであるか、
（ｉｉ）前記ＣＤ３０結合領域及び／若しくは前記ＣＤ３結合領域が、ｓｃＦｖである
か、
（ｉｉｉ）前記ＣＤ３０結合領域が、Ｆａｂであり、前記ＣＤ３結合領域が、ｓｃＦｖ
であるか、又は
（ｉｖ）前記ＣＤ３０結合領域が、ｓｃＦｖであり、前記ＣＤ３結合領域が、Ｆａｂで
ある、請求項１～８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
（ｉｉ）前記ＣＤ３０結合領域及び／若しくは前記ＣＤ３結合領域が、ｓｃＦｖである
か、
（ｉｉｉ）前記ＣＤ３０結合領域が、Ｆａｂであり、前記ＣＤ３結合領域が、ｓｃＦｖ
であるか、又は
（ｉｖ）前記ＣＤ３０結合領域が、ｓｃＦｖであり、前記ＣＤ３結合領域が、Ｆａｂで
ある、請求項１～８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項28】
先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、核酸構築物、又
は核酸構築物の組み合わせ。
は核酸構築物の組み合わせ。
【請求項29】
請求項２８に記載の核酸構築物を含む、発現ベクター、又は発現ベクターの組み合わせ
。
。
【請求項30】
請求項２８に記載の核酸構築物を含む、送達ビヒクル。
【請求項31】
前記送達ビヒクルが、粒子である、請求項３０に記載の送達ビヒクル。
【請求項32】
前記粒子が、脂質ナノ粒子である、請求項３１に記載の送達ビヒクル。
【請求項33】
前記脂質ナノ粒子が、脂質、イオン化可能なアミノ脂質、ＰＥＧ－脂質、コレステロー
ル、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３２に記載の送達ビヒクル。
ル、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３２に記載の送達ビヒクル。
【請求項34】
前記宿主細胞が、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする
１つ以上の核酸構築物を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を
産生することができる組換え宿主細胞。
１つ以上の核酸構築物を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を
産生することができる組換え宿主細胞。
【請求項35】
前記組換え宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項３４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項36】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体と
、を含む、薬学的組成物。
、を含む、薬学的組成物。
【請求項37】
医薬としての使用のための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、
請求項２８に記載の核酸構築物、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル
、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
請求項２８に記載の核酸構築物、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル
、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項38】
がんの治療における使用のための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性
抗体、請求項２８に記載の核酸構築物、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビ
ヒクル、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
抗体、請求項２８に記載の核酸構築物、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビ
ヒクル、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項39】
ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における使用のための、請
求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２８に記載の核酸構築物、
請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、又は請求項３６に記載の薬学的
組成物。
求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２８に記載の核酸構築物、
請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、又は請求項３６に記載の薬学的
組成物。
【請求項40】
非ホジキンリンパ腫が、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）である、請求項３９
に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物
。
に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物
。
【請求項41】
Ｔ－ＮＨＬが、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）又は末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）
である、請求項４０に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル
、又は薬学的組成物。
である、請求項４０に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル
、又は薬学的組成物。
【請求項42】
Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）が、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）であ
る、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築
物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物。
る、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築
物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物。
【請求項43】
非ホジキンリンパ腫が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）である、請求項３９
に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物
。
に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物
。
【請求項44】
前記多重特異性抗体、前記核酸構築物、前記送達ビヒクル、又は前記薬学的組成物が、
静脈内及び／又は皮下、好ましくは皮下投与されている、請求項３７～４３のいずれか一
項に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成
物。
静脈内及び／又は皮下、好ましくは皮下投与されている、請求項３７～４３のいずれか一
項に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成
物。
【請求項45】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を産生するための方法であって
、該方法は、
（ｉ）請求項３４又は３５に記載の組換え宿主細胞を、前記抗体が産生される条件下で
培養することと、
（ｉｉ）産生された前記多重特異性抗体を培養物から単離することと、
を含む、方法。
、該方法は、
（ｉ）請求項３４又は３５に記載の組換え宿主細胞を、前記抗体が産生される条件下で
培養することと、
（ｉｉ）産生された前記多重特異性抗体を培養物から単離することと、
を含む、方法。
【請求項46】
請求項９～２６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を産生するための方法であって
、該方法は；
ａ）請求項１に記載されるＣＤ３０結合領域を含む第１の抗体（ｉ）、及び請求項１に
記載されるＣＤ３結合領域を含む第２の抗体（ｉｉ）を提供し、ここで、前記抗体が、請
求項２～２６に記載される更なる特徴を任意に含有し、
ここで、前記第１及び第２の抗体が、Ｆｃ領域を含み、
ここで、前記第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひ
いては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２の
ＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システイ
ンがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキ
ュベートし；そして、
ｃ）前記第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、前
記第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む前記
多重特異性抗体を得る；
ことを含む、方法。
、該方法は；
ａ）請求項１に記載されるＣＤ３０結合領域を含む第１の抗体（ｉ）、及び請求項１に
記載されるＣＤ３結合領域を含む第２の抗体（ｉｉ）を提供し、ここで、前記抗体が、請
求項２～２６に記載される更なる特徴を任意に含有し、
ここで、前記第１及び第２の抗体が、Ｆｃ領域を含み、
ここで、前記第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひ
いては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２の
ＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システイ
ンがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキ
ュベートし；そして、
ｃ）前記第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、前
記第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む前記
多重特異性抗体を得る；
ことを含む、方法。
【請求項47】
請求項１～２７のいずれか一項に定義される抗体と、キットの使用説明書と、を含む、
コンパニオン診断薬としての／患者の集団内で請求項１～２７のいずれか一項に定義され
る抗体での治療に応答する傾向を有する患者を特定するための使用のためのキットのよう
な、キットオブパーツ。
コンパニオン診断薬としての／患者の集団内で請求項１～２７のいずれか一項に定義され
る抗体での治療に応答する傾向を有する患者を特定するための使用のためのキットのよう
な、キットオブパーツ。
【請求項48】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を含む、診断用組成物。
【請求項49】
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域と、
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記第
１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここて、前記第１及び第２のＦｃポリ
ペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換
を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換であり、ここで、前記アミノ
酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域と、
を含む抗体。
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域と、
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記第
１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここて、前記第１及び第２のＦｃポリ
ペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換
を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換であり、ここで、前記アミノ
酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域と、
を含む抗体。
【請求項50】
前記第１の重鎖可変領域が配列番号１３に記載される配列を含み、前記第１の軽鎖可変
領域が配列番号１４に記載される配列を含む、請求項４９に記載の抗体。
領域が配列番号１４に記載される配列を含む、請求項４９に記載の抗体。
【請求項51】
前記抗体が、配列番号１７に記載される重鎖配列及び配列番号１８に記載される軽鎖配
列を含むか、又はそれらからなる、請求項４９又は５０に記載の抗体。
列を含むか、又はそれらからなる、請求項４９又は５０に記載の抗体。
【請求項52】
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記第
１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第２のＦｃポリ
ペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換
を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、前記アミノ酸
位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域と、
を含む抗体。
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記第
１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応
するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第２のＦｃポリ
ペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換
を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、前記アミノ酸
位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域と、
を含む抗体。
【請求項53】
配列番号９におけるＸが、Ｈである、請求項５２に記載の抗体。
【請求項54】
配列番号９におけるＸが、Ｇである、請求項５２に記載の抗体。
【請求項55】
前記第２の重鎖可変領域が、配列番号１５に記載される配列を含み、前記第２の軽鎖可
変領域が、配列番号１６に記載される配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記
載の抗体。
変領域が、配列番号１６に記載される配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記
載の抗体。
【請求項56】
前記抗体が、全長抗体である、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項57】
ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ
４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のう
ちの少なくとも１つが置換されており、好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミ
ノ酸がＬであるか、又は、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲである、請求項４
９～５６のいずれか一項に記載の抗体。
４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のう
ちの少なくとも１つが置換されており、好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミ
ノ酸がＬであるか、又は、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲである、請求項４
９～５６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項58】
多重特異性抗体を産生するための方法であって、該方法は；
ａ）請求項４９～５１又は５５～５７のいずれか一項に記載される第１の抗体、並びに
、以下を含む第２の軽鎖可変領域を提供するか；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記
第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応す
るアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に
対応するアミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域；
又は
請求項５２～５７のいずれか一項に記載される第２の抗体、並びに、以下を含む第１の
抗体を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載され
るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０
結合領域、及び
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、前記第１及び
第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する
アミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域；
ここで、前記第１及び第２の抗体の前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、
ひいては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２
のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、前記第１の
ＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであり、前記第２のＣ
Ｈ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸が、Ｒであるか、又はその逆
もまた同様であり；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システイ
ンがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキ
ュベートし；そして、
ｃ）前記第１の抗体の前記第１の免疫グロブリン重鎖及び前記第１の免疫グロブリン軽
鎖と、前記第２の抗体の前記第２の免疫グロブリン重鎖及び前記第２の免疫グロブリン軽
鎖と、を含む前記多重特異性抗体を得る
ことを含む、方法。
ａ）請求項４９～５１又は５５～５７のいずれか一項に記載される第１の抗体、並びに
、以下を含む第２の軽鎖可変領域を提供するか；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記
第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応す
るアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に
対応するアミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域；
又は
請求項５２～５７のいずれか一項に記載される第２の抗体、並びに、以下を含む第１の
抗体を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載され
るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０
結合領域、及び
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、前記第１及び
第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する
アミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域；
ここで、前記第１及び第２の抗体の前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、
ひいては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２
のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、前記第１の
ＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであり、前記第２のＣ
Ｈ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸が、Ｒであるか、又はその逆
もまた同様であり；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システイ
ンがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキ
ュベートし；そして、
ｃ）前記第１の抗体の前記第１の免疫グロブリン重鎖及び前記第１の免疫グロブリン軽
鎖と、前記第２の抗体の前記第２の免疫グロブリン重鎖及び前記第２の免疫グロブリン軽
鎖と、を含む前記多重特異性抗体を得る
ことを含む、方法。
【請求項59】
請求項５８に記載の多重特異性抗体を産生するための方法であって、該方法は、
ａ）請求項４９～５１又は５５～５７のいずれか一項に記載される第１の抗体、並びに
、以下を含む第２の抗体を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣ
Ｄ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、前記第１及び
第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する
アミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域、
ここで、前記第１及び第２の抗体の前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、
ひいては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２
のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、前記第１の
ＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであり、そして、前記
第２のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬである；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システイ
ンがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキ
ュベートし；そして
ｃ）前記第１の抗体の前記第１の免疫グロブリン重鎖及び前記第１の免疫グロブリン軽
鎖と、前記第２の抗体の前記第２の免疫グロブリン重鎖及び前記第２の免疫グロブリン軽
鎖と、を含む、前記多重特異性抗体を得る、
ことを含む、方法。
ａ）請求項４９～５１又は５５～５７のいずれか一項に記載される第１の抗体、並びに
、以下を含む第２の抗体を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣ
ＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記
載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣ
Ｄ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、前記第１及び
第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する
アミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域、
ここで、前記第１及び第２の抗体の前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、
ひいては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２
のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、前記第１の
ＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであり、そして、前記
第２のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬである；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システイ
ンがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキ
ュベートし；そして
ｃ）前記第１の抗体の前記第１の免疫グロブリン重鎖及び前記第１の免疫グロブリン軽
鎖と、前記第２の抗体の前記第２の免疫グロブリン重鎖及び前記第２の免疫グロブリン軽
鎖と、を含む、前記多重特異性抗体を得る、
ことを含む、方法。
【請求項60】
請求項５８又は５９のいずれかに記載の方法によって得られる多重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＤ３０及びＣＤ３に結合する多重特異性抗体に関する。本発明は、抗体を
含む薬学的組成物、抗体をコードする核酸、抗体を産生する宿主細胞、抗体を産生する方
法、及び特にがん療法のための、抗体の使用を更に提供する。
含む薬学的組成物、抗体をコードする核酸、抗体を産生する宿主細胞、抗体を産生する方
法、及び特にがん療法のための、抗体の使用を更に提供する。
【背景技術】
【0002】
Ｋｉ－１又はＴＮＦＲＳＦ８としても知られる、ＣＤ３０は、１２０ｋＤの膜貫通糖タ
ンパク質受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバー
である（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：９５９－９６２）。Ｃ
Ｄ３０は、その細胞外ドメインに６つのシステインリッチ反復を有するシングルパスＩ型
膜タンパク質である（Ｄｕｒｋｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：４２１
－４２７）。加えて、可溶性形態のＣＤ３０（ｓＣＤ３０）が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）（
Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１
１１：５３２－５）を含む、炎症性疾患、及びＣＤ３０陽性血液悪性腫瘍（Ｊｏｓｉｍｏ
ｖｉｃ－Ａｌａｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）を
有する患者の血清中で検出されている。ｓＣＤ３０は、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びＡＤ
ＡＭ１０などの細胞膜係留性メタロプロテイナーゼによるＣＤ３０の細胞外部分の切断産
物を表す（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００５、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．，ＦＡＳＥＢ，２００４）。
ンパク質受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバー
である（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：９５９－９６２）。Ｃ
Ｄ３０は、その細胞外ドメインに６つのシステインリッチ反復を有するシングルパスＩ型
膜タンパク質である（Ｄｕｒｋｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：４２１
－４２７）。加えて、可溶性形態のＣＤ３０（ｓＣＤ３０）が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）（
Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１
１１：５３２－５）を含む、炎症性疾患、及びＣＤ３０陽性血液悪性腫瘍（Ｊｏｓｉｍｏ
ｖｉｃ－Ａｌａｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）を
有する患者の血清中で検出されている。ｓＣＤ３０は、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びＡＤ
ＡＭ１０などの細胞膜係留性メタロプロテイナーゼによるＣＤ３０の細胞外部分の切断産
物を表す（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００５、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．，ＦＡＳＥＢ，２００４）。
【0003】
正常組織では、ＣＤ３０発現は、主に活性化Ｔ及びＢリンパ球のサブセットに制限され
る（Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４４２－９、
Ｓｈａｎｅｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２
１４７－５３）。ＣＤ３０発現は、様々なリンパ系腫瘍において検出されている。古典的
ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）は、高いＣＤ３０発
現レベルを示す。特に、ｃＨＬに典型的に見られる、Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（Ｒ
Ｓ）細胞の大部分は、ＣＤ３０に対して陽性である（Ｆｒｉｚｚｅｒａ ｅｔ ａｌ．（
１９９２）Ｓｅｍｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｐａｔｈｏｌ．９：２９１－２９６）。
る（Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４４２－９、
Ｓｈａｎｅｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２
１４７－５３）。ＣＤ３０発現は、様々なリンパ系腫瘍において検出されている。古典的
ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）は、高いＣＤ３０発
現レベルを示す。特に、ｃＨＬに典型的に見られる、Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（Ｒ
Ｓ）細胞の大部分は、ＣＤ３０に対して陽性である（Ｆｒｉｚｚｅｒａ ｅｔ ａｌ．（
１９９２）Ｓｅｍｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｐａｔｈｏｌ．９：２９１－２９６）。
【0004】
例えば、ＣＤ３０標的化抗体－薬物複合体ブレンツキシマブベドチン（ＢＶ、ＳＧＮ－
３５）は、ｃＨＬ、ＡＬＣＬ、及びＣＴＣＬなどのがんを治療する際に使用されているか
又は使用することが推奨されている（Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ
ｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ２０；３０（１８）：２１８３－９、Ｐｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｂ
ｌｏｏｄ．２０１７ Ｄｅｃ ２１；１３０（２５）：２７０９－２７１７、Ｓｈｅａ
ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ．２０２０ Ｆｅｂ；１５
（１）：９－１９）。四価二重特異性ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ抗体ＡＦＭ１３は、ｃＨＬ及
びＣＤ３０陽性リンパ腫のためのＮＫ細胞媒介性免疫療法として開発されている（Ｒｏｔ
ｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５ Ｊｕｎ ２５；１２５（２６）：４０２４－
３１）。
３５）は、ｃＨＬ、ＡＬＣＬ、及びＣＴＣＬなどのがんを治療する際に使用されているか
又は使用することが推奨されている（Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ
ｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ２０；３０（１８）：２１８３－９、Ｐｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｂ
ｌｏｏｄ．２０１７ Ｄｅｃ ２１；１３０（２５）：２７０９－２７１７、Ｓｈｅａ
ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ．２０２０ Ｆｅｂ；１５
（１）：９－１９）。四価二重特異性ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ抗体ＡＦＭ１３は、ｃＨＬ及
びＣＤ３０陽性リンパ腫のためのＮＫ細胞媒介性免疫療法として開発されている（Ｒｏｔ
ｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５ Ｊｕｎ ２５；１２５（２６）：４０２４－
３１）。
【0005】
更に、ＣＤ３０標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ｃＨＬ及びＣＤ３０陽性リンパ腫のため
に開発されている。他のＣＤ３０抗体は、ＷＯ２００３０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）
、ＵＳ８２５７７０６（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＵＳ２０１０／０２３９
５７１（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＷＯ２００７／０４０６５３（米国政府
及び保健）、及びＷＯ２０１６／０１７７８４６（Ａｆｆｉｍｅｄ）に記載されている。
に開発されている。他のＣＤ３０抗体は、ＷＯ２００３０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）
、ＵＳ８２５７７０６（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＵＳ２０１０／０２３９
５７１（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＷＯ２００７／０４０６５３（米国政府
及び保健）、及びＷＯ２０１６／０１７７８４６（Ａｆｆｉｍｅｄ）に記載されている。
【0006】
Ｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４：８２０－８２
７）は、ＣＤ３０モノクローナル抗体ＨＲＳ－３産生ハイブリドーマ細胞とＣＤ３モノク
ローナル抗体ＯＫＴ－３産生ハイブリドーマ細胞との融合（ハイブリッドハイブリドーマ
技術）によって生成されたＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体ＯＫＴ－３／ＨＲＳ－３を記
載する。
７）は、ＣＤ３０モノクローナル抗体ＨＲＳ－３産生ハイブリドーマ細胞とＣＤ３モノク
ローナル抗体ＯＫＴ－３産生ハイブリドーマ細胞との融合（ハイブリッドハイブリドーマ
技術）によって生成されたＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体ＯＫＴ－３／ＨＲＳ－３を記
載する。
【0007】
ＷＯ２００８／１１９５６７は、ＣＤ３０及びＣＤ３種間特異的二重特異性一本鎖分子
の生成及び特徴分析を記載している。
の生成及び特徴分析を記載している。
【0008】
ＵＳ２０２０／００９５３３０は、２つの抗ＣＤ３０クローン（８Ｄ１０及び１０Ｃ２
と名付けられた）の抗ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ－３）への化学的ヘテロ抱合に起因
するＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体を記載している。
と名付けられた）の抗ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ－３）への化学的ヘテロ抱合に起因
するＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体を記載している。
【0009】
しかしながら、これらのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のいずれも、臨床環境で試験
されていない。
されていない。
【0010】
したがって、改善されたＣＤ３０標的化がん療法の必要性がある。有効性があり、安全
で、良好な製造可能性を有し、かつ／又は長い貯蔵寿命を有するＣＤ３０標的化化合物の
必要性がある。
で、良好な製造可能性を有し、かつ／又は長い貯蔵寿命を有するＣＤ３０標的化化合物の
必要性がある。
【発明の概要】
【0011】
本発明は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３０及びＣＤ３に結合するＴ細胞誘導抗体に関す
る。本発明者らは、いくつかのＣＤ３０結合抗体が、二価（モノクローナル）フォーマッ
トでＣＤ３０発現細胞に良好に結合するが、一価ＣＤ３０結合を有する二重特異性フォー
マットで強く低減した結合及び細胞傷害性を示すことを見出した。強力な一価ＣＤ３０結
合及び優れた腫瘍細胞殺滅を有する二重特異性抗体が特定された。更に、優れた安定性及
び溶解性のために、薬学的製品への開発に好適である、機能的に不活性なＦｃバックボー
ンを有する二重特異性抗体が特定された。
る。本発明者らは、いくつかのＣＤ３０結合抗体が、二価（モノクローナル）フォーマッ
トでＣＤ３０発現細胞に良好に結合するが、一価ＣＤ３０結合を有する二重特異性フォー
マットで強く低減した結合及び細胞傷害性を示すことを見出した。強力な一価ＣＤ３０結
合及び優れた腫瘍細胞殺滅を有する二重特異性抗体が特定された。更に、優れた安定性及
び溶解性のために、薬学的製品への開発に好適である、機能的に不活性なＦｃバックボー
ンを有する二重特異性抗体が特定された。
【0012】
一態様において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
【0013】
更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体をコードする、核酸構築
物、又は核酸構築物の組み合わせに関する。
物、又は核酸構築物の組み合わせに関する。
【0014】
更なる態様において、本発明は、本発明による核酸構築物を含む発現ベクター又は送達
ビヒクルに関する。
ビヒクルに関する。
【0015】
更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体を産生することができる
組換え宿主細胞に関し、宿主細胞は、本発明による多重特異性抗体をコードする１つ以上
の核酸構築物を含む。
組換え宿主細胞に関し、宿主細胞は、本発明による多重特異性抗体をコードする１つ以上
の核酸構築物を含む。
【0016】
更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体と、薬学的に許容される
担体と、を含む、薬学的組成物に関する。
担体と、を含む、薬学的組成物に関する。
【0017】
更なる態様において、本発明は、例えば、がんの治療において、医薬としての使用のた
めの、本発明による多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物に関
する。
めの、本発明による多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物に関
する。
【0018】
より更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体を産生するための方
法に関する。
法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】二重特異性ＣＤ３×ＣＤ３０抗体並びにそれらの単一特異性、二価ＣＤ３及びＣＤ３０対応物の、ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＨＤＭＬ－２細胞への結合である。（Ａ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、（Ｂ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、（Ｃ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、（Ｄ）ＢｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、（Ｅ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、（Ｆ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、（Ｇ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、並びに（Ｈ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲの、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞（左パネル）又はＨＤＬＭ－２細胞（右パネル）への用量依存的結合。（Ｉ）１．１１μｇ／ｍＬの濃度でのＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）又はＨＤＬＭ－２細胞（右パネル）へのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体及びＣＤ３０単一特異性抗体の結合。ＣＤ３０アームに使用される抗体クローンは、ｘ軸上に示される。示されるデータは、１つの代表的な実験についての、フローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【図2】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３ｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０のＨＬ及びＡＬＣＬ細胞株への結合である。（Ａ）ＨＤＬＭ－２（ＨＬ）、（Ｂ）Ｌ－４２８（ＨＬ）、（Ｃ）ＤＥＬ（ＡＬＣＬ）、又は（Ｄ）ＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３ｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０の結合を、フローサイトメトリーによって評価した。二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３ｘｂ１２及びｂｓＧ１－ｂ１２ｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０並びに単一特異性抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３、及びＩｇＧ１－１２を対照として含めた。全ての抗体は、ＦＥＡＬ及び／又はＦＥＲＲ Ｆｃサイレンシング並びにＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術変異を、示されるようにそれらのＦｃドメインに含有した。示されるデータは、１つの代表的な実験についての、フローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【図3】ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＨＤＭＬ－２細胞におけるＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体によるインビトロでの細胞傷害性の誘導である。ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞（左パネル）又はＨＤＬＭ－２細胞（右パネル）を標的細胞として、Ｔ細胞（ＣＤ３陽性ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞、Ｃｌｅａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）をエフェクター細胞として使用して、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。以下の抗体を試験した：（Ａ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、（Ｂ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、（Ｃ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、（Ｄ）ＢｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、（Ｅ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、（Ｆ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、（Ｇ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、又は（Ｈ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ。抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲを全ての実験に対照として含めた。示されるデータは、生存細胞パーセンテージであり、各グラフについてのデータは、１つの代表的な実験から得られた。
【図4】いくつかのＡＬＣＬ及びＨＬ細胞株におけるＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体によるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖の誘導である。（Ａ－Ｃ）ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、異なるＡＬＣＬ及びＨＬ細胞株を標的細胞として、精製されたＴ細胞（Ａ、Ｂ）又はＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞（Ｃ）をエフェクター細胞として使用するインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３についてより低い親和性を有する、ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ Ｆａｂアーム又はｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬバリアント、及びＣＤ３０特異的ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ Ｆａｂアームを含有した。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３及びＩｇＧ１－ｂ１２（Ａ、Ｂ）又はｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ｃ）を対照として含めた。示されるデータは、生存細胞パーセンテージであり、各グラフについてのデータは、１つの代表的な実験から得られた。（Ｄ）ＣＦＳＥ陽性細胞の数を、ＨＤＬＭ－２細胞（左パネル）又はＮＣＥＢ－１細胞（右パネル）を標的細胞として用いた細胞傷害性アッセイにおける絶対Ｔ細胞数の尺度として評価した。
【図5】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトされた全長ヒト及びカニクイザルＣＤ３０へのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の結合である。（Ａ－Ｃ）全長ヒトＣＤ３０（Ｂ）又はカニクイザルＣＤ３０（Ｃ）で一過性にトランスフェクトされた野生型Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ａ）又はＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への一価及び二価ＣＤ３０抗体の結合。細胞を増加する濃度の以下の抗体とインキュベートした：ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ。データは、２つの技術的複製のフローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として提示される。（Ｄ）ヒトＴ細胞又はカニクイザルＴ細胞への抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲの結合。データは、１つの代表的実験のフローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として提示される。
【図6】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトされた全長ヒト及びアカゲザルＣＤ３０へのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の結合である。一価及び二価ＣＤ３０抗体の、全長ヒトＣＤ３０（左パネル）又はアカゲザルＣＤ３０（右パネル）で一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。以下の抗体を評価した：（Ａ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、（Ｃ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、（Ｄ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、（Ｅ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、（Ｆ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、（Ｇ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、又は（Ｈ）ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ。抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲを全ての実験に陰性対照として含めた。示されるデータは、１つの代表的な実験についての、フローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【図7】示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）によって決定される、異なる非活性化変異を有する抗体の熱安定性である。増加する温度での立体構造タンパク質安定性を、ＤＳＦによって２通りに評価した。以下の抗体の融解曲線を示す：（Ａ）ｐＨ７．４のＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、（Ｂ）ｐＨ７．４のＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、（Ｃ）ｐＨ７．４のＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及び（Ｄ）ｐＨ７．４のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ。
【図8】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのＨＬ細胞株への結合である。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＬ細胞株Ｌ－５４０（Ａ）、ＫＭ－Ｈ２（Ｂ）、及びＬ－１２３６（Ｃ）への結合をフローサイトメトリーによって評価した。二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ並びに単一特異性抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－１２－ＦＥＡＬを対照として含めた。示されるデータは、１つの代表的な実験についての、フローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【図9】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのＡＬＣＬ細胞株への結合である。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのＡＬＣＬ細胞株ＳＵＰ－Ｍ２（Ａ）、ＤＬ－４０（Ｂ）、ＫＡＲＰＡＳ－２９９（Ｃ）、Ｌ－８２（Ｄ）、及びＳＲ－７８６（Ｅ）への結合をフローサイトメトリーによって評価した。二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ並びに単一特異性抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－１２－ＦＥＡＬを対照として含めた。示されるデータは、１つの代表的な実験についての、フローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【図10】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのＮＨＬ細胞株への結合である。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、（Ａ）ＳＵＰ－Ｔ１（ＴＬＬ）、（Ｂ）ＪＶＭ－２（ＭＣＬ）、（Ｃ）ＨＨ（ＣＴＣＬ）、及び（Ｄ）ＮＣＥＢ－１（ＭＣＬ）細胞株への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ並びに単一特異性抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－１２－ＦＥＡＬを対照として含めた。示されるデータは、１つの代表的な実験についての、フローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【図11】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた全長ヒト及びアカゲザルＣＤ３０への結合である。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、全長ヒトＣＤ３０（Ａ）又はアカゲザルＣＤ３０（Ｂ）で一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲを陰性対照として含めた。示されるデータは、１つの代表的な実験についての、フローサイトメトリーによって決定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【図12】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのＴ細胞及び腫瘍細胞への同時結合である。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、蛍光標識された腫瘍細胞及びナイーブＴ細胞への同時結合を、フローサイトメトリーによって研究した。（Ａ）二重陽性事象は、６ｘ１０－５～１０μｇ／ｍＬのｂｓＧ１ｈｕＣＤ３ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの存在下での全生存細胞のパーセンテージとして示される。抗体なしでインキュベートされた試料中の二重陽性事象のパーセンテージを点線で示す。（Ｂ）０．１２μｇ／ｍＬのｂｓＧ１ｈｕＣＤ３ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲでインキュベートされた試料中の二重陽性細胞のゲーティング戦略の例。
【図13】ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体によるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞活性化の誘導である。ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のパネルを、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｋａｒｐａｓ－２９９を標的細胞として、健常なヒトドナーバフィーコートから精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用したインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。これらのアッセイでは、ＣＤ２５発現をＴ細胞活性化の尺度としてＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞において評価した。以下の抗体を試験した：ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ＢｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ。（Ａ）ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体によるＫａｒｐａｓ－２９９細胞の細胞傷害性のＩＣ５０値。（Ｂ）試験抗体によるＫａｒｐａｓ－２９９細胞の最大細胞傷害性のパーセンテージ。（Ｃ－Ｆ）ＣＤ３×ＣＤ３０抗体によるＣＤ４＋（Ｃ、Ｅ）又はＣＤ８＋（Ｄ、Ｆ）Ｔ細胞におけるＣＤ２５（Ｃ－Ｄ）又はＰＤ－１（Ｅ－Ｆ）発現の誘導についてのＥＣ５０値。データは、６つの異なるドナーから得られたＴ細胞で行われた２つの独立した実験から得た。統計的値は、示されるクローンとｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲとの間のＷｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位和検定の結果を表す。ＮＳ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５。
【図14】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでの細胞株のＴ細胞媒介性細胞傷害性。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を、Ｌ－４２８（Ａ）、ＫＭ－Ｈ２（Ｂ）、ＳＵＰ－Ｍ２（Ｃ）、又はＫＩ－ＪＫ（Ｄ）腫瘍細胞株を標的細胞として、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として用いてインビトロで試験した。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、及びＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬを対照として含めた。示されるデータは、生存細胞パーセンテージであり、各グラフについてのデータは、１つの代表的な実験について得られた。
【図15】Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞株におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞増殖である。Ｔ細胞増殖を、Ｌ－４２８（Ａ、Ｂ）又はＫＩ－ＪＫ（Ｃ、Ｄ）を標的細胞として使用したＴ細胞媒介性細胞傷害性アッセイにおいて評価した。希釈されたＣｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色を有するＣＤ４＋（Ａ、Ｃ）又はＣＤ８＋（Ｂ、Ｄ）Ｔ細胞をゲーティングし、増殖指数を、Ｔ細胞増殖についての尺度として、ＦｌｏｗＪｏからの増殖モデリングツールを使用して計算した。
【図16】Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞株におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現である。Ｔ細胞活性化を、Ｌ－４２８（Ａ、Ｂ）又はＫＩ－ＪＫ（Ｃ、Ｄ）を標的細胞として使用したＴ細胞媒介性細胞傷害性アッセイにおいて評価した。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現を、ＣＤ４＋（Ａ、Ｃ）又はＣＤ８＋（Ｂ、Ｄ）Ｔ細胞において評価した。
【図17】Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞株におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５の発現である。Ｔ細胞活性化を、Ｌ－４２８（Ａ、Ｂ）又はＫＩ－ＪＫ（Ｃ、Ｄ）を標的細胞として使用したＴ細胞媒介性細胞傷害性アッセイにおいて評価した。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５の発現を、ＣＤ４＋（Ａ、Ｃ）又はＣＤ８＋（Ｂ、Ｄ）Ｔ細胞において評価した。
【図18】Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞株におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞活性化マーカーＰＤ－１の発現である。Ｔ細胞活性化を、Ｌ－４２８（Ａ、Ｂ）又はＫＩ－ＪＫ（Ｃ、Ｄ）を標的細胞として使用したＴ細胞媒介性細胞傷害性アッセイにおいて評価した。Ｔ細胞活性化マーカーＰＤ－１の発現を、ＣＤ４＋（Ａ、Ｃ）又はＣＤ８＋（Ｂ、Ｄ）Ｔ細胞において評価した。
【図19】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのサイトカイン及びグランザイムＢ産生である。１４の異なるサイトカイン（ＣＤ４０、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＰＤＬ－１、ＩＮＦα）及びグランザイムＢの濃度を、Ｌ－４２８を標的細胞として使用したインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害性実験中に収集された上清において評価した。サイトカイン及びグランザイムＢ濃度を、異なる濃度のｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬで処理された試料について示す。
【図20】変動するエフェクター対標的比でのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖である。（Ａ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を、Ｌ－４２８腫瘍細胞を標的細胞として、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として１：１、２：１、４：１、又は８：１のＥ：Ｔ比で使用して、インビトロで試験した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲを対照抗体として含めた。示されるデータは、１つの代表的な実験から得られた、生存細胞パーセンテージである。（Ｂ、Ｃ）希釈されたＣｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色を有するＣＤ４＋（Ｂ）又はＣＤ８＋（Ｃ）Ｔ細胞のパーセンテージを、増殖するＴ細胞の尺度として示す。
【図21】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖の動態である。（Ａ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性細胞傷害性の動態を、Ｌ－４２８腫瘍細胞を標的細胞として、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として４：１のＥ：Ｔ比で使用して、インビトロで試験した。細胞傷害性を、２４時間、４８時間、及び７２時間後に評価した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲを対照抗体として含めた。示されるデータは、１つの代表的な実験から得られた、生存細胞パーセンテージである。（Ｂ、Ｃ）希釈されたＣｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色を有するＣＤ４＋（Ｂ）又はＣＤ８＋（Ｃ）Ｔ細胞をゲーティングし、増殖指数を、細胞傷害性アッセイにおけるＴ細胞増殖についての尺度として、ＦｌｏｗＪｏからの増殖モデリングツールを使用して計算した。
【図22】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＣＤ３０発現レベルとの相関である。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる最大Ｔ細胞媒介性殺滅（Ａ）又はＴ細胞媒介性細胞傷害性のＩＣ５０濃度（Ｂ）対ＣＤ３０発現レベル間の相関を、８つの腫瘍細胞株において評価した。Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア）を使用して、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性（最大殺滅又はＩＣ５０）とＣＤ３０発現との間の相関度の統計的有意性を評価した。
【図23】ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる活性化されたＴ細胞のフラトリサイドである。単離された健常ドナーＴ細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８、及び０．０２５μｇ／ｍＬのＩＬ－１５で４日間刺激した。活性化（ＣＤ２５上方調節）の確認後、Ｔ細胞を、増加する濃度のｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＩｇＧ１－ｃｔｒｌｘＣＤ３０－ＭＤＸ－０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＩｇＧ１－ＣＤ３ｘｂ１２、又はＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬで４８時間インキュベートした。活性化されたＣＤ３０＋Ｔ細胞のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞フラトリサイドを、いずれの抗体も加えることのない条件における生存Ｔ細胞の数に対する各条件における生存Ｔ細胞のパーセンテージとして測定した。（Ａ－Ｂ）抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及びＩＬ－１５による刺激の７２時間後及び９６時間後の、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２５＋（Ａ）又はＣＤ３０＋（Ｂ）細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定した。（Ｃ）Ｔ細胞フラトリサイドは、いずれの抗体も加えることのない条件に対するＴ細胞生存パーセントとして示された。１つの代表的なＴ細胞ドナーについてのデータを示す。
【図24】ＣＤ３０＋細胞培養物の上清中の可溶性ＣＤ３０、及びＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの抗腫瘍活性へのその干渉である。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定される、異なる血液腫瘍細胞株の上清中の可溶性ＣＤ３０（ｓＣＤ３０）濃度を示す。（Ｂ）異なる血液腫瘍細胞株において、定量的フローサイトメトリー（ヒトＩｇＧキャリブレーターキット－Ｂｉｏｃｙｔｅｘ）を使用して決定される、ｓＣＤ３０濃度と細胞表面上のＣＤ３０分子の数との間の相関を、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア）によって評価した。（Ｃ）ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲを、ＣＤ３０陽性ＡＬＣＬ腫瘍細胞株ＤＥＬを標的細胞として、健常ドナー単離Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いたインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。以下の対照抗体が含まれた：ＢｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３０－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬ。示されるデータは、１つの代表的な実験から得られた、生存細胞パーセンテージである。
【図25】Ｌ－４２８腫瘍細胞におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるエクスビボでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖の誘導である。（Ａ）ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲを、Ｌ－４２８腫瘍細胞を標的細胞として、初代患者由来Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用したエクスビボ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｔ細胞の供給源として使用して、ＣＤ３依存的腫瘍細胞殺滅を評価した。ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬを対照として含めた。示されるデータは、生存標的細胞パーセンテージである。（Ｂ－Ｄ）Ｔ細胞活性化を、陽性細胞パーセンテージとして示される、ＰＢＭＣサブセット内のＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＣＤ６９（Ｂ）、ＣＤ２５（Ｃ）、及びＰＤ－１（Ｄ）マーカーの上方調節によって評価した。
【図26】ＳＣＩＤマウスにおける静脈内注射後のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの血漿濃度である。ＳＣＩＤマウスに、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）又は１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ用量のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲを注射した。（Ａ）総ヒトＩｇＧをＥＬＩＳＡによって決定し、平均ヒトＩｇＧ１濃度を経時的にプロットした。（Ｂ）平均クリアランス率を、０．５又は５ｍｇ／ｋｇ用量レベルについてプロットした。点線は、マウスにおける非結合通常ヒトＩｇＧ１の標準分布体積に基づく推定クリアランス率を示す。
【図27】膜結合ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合である。Ｃ１ｑのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ－オプソニン化、活性化ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はＣＤ３０＋ ＮＣＥＢ－１細胞への結合を、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗Ｃ１ｑ抗体を使用してフローサイトメトリーによって評価した。（Ａ）Ｃ１ｑの供給源としての正常ヒト血清の存在下での、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞への、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、又は陽性対照抗体ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇの結合。示されるデータは、１つの代表的な実験からの複製ウェルからの幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）±ＳＤである。（Ｂ）Ｃ１ｑの供給源としての正常ヒト血清の存在下での、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又は陽性対照抗体ＩｇＧ１－７Ｄ８－Ｅ４３０ＧのＣＤ３０＋ ＮＣＥＢ－１細胞への結合。示されるデータは、１つの代表的な実験からのｇＭＦＩである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも約３０分、少なくとも約４５
分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時
間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間以上、少なくとも約４８時間以上、少
なくとも約３、４、５、６、７日以上などの、重要な期間、又は任意の他の関連する機能
的に定義された期間（抗原に結合する抗体と関連した生理学的応答を誘導、促進、増強、
及び／若しくは調節するのに十分な時間、並びに／又は抗体が内在化されるのに十分な時
間など）の半減期を有する、典型的な生理学的及び／又は腫瘍特異的条件下で、抗原に特
異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子のフラグメント
、又はそれらのいずれかの誘導体を指すことを意図している。抗体は、抗原と相互作用す
ることができる結合領域（又は両方とも同じ意味を有する、本明細書において使用され得
る結合領域）、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含む結合領域など
を含む。抗体は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の成分、例え
ば、Ｃ１ｑ、補体活性化の古典的経路における第１の成分を含む、宿主組織又は因子への
免疫グロブリンの結合を媒介し得る抗体（Ａｂ）の定常領域を含み得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも約３０分、少なくとも約４５
分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時
間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間以上、少なくとも約４８時間以上、少
なくとも約３、４、５、６、７日以上などの、重要な期間、又は任意の他の関連する機能
的に定義された期間（抗原に結合する抗体と関連した生理学的応答を誘導、促進、増強、
及び／若しくは調節するのに十分な時間、並びに／又は抗体が内在化されるのに十分な時
間など）の半減期を有する、典型的な生理学的及び／又は腫瘍特異的条件下で、抗原に特
異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子のフラグメント
、又はそれらのいずれかの誘導体を指すことを意図している。抗体は、抗原と相互作用す
ることができる結合領域（又は両方とも同じ意味を有する、本明細書において使用され得
る結合領域）、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含む結合領域など
を含む。抗体は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の成分、例え
ば、Ｃ１ｑ、補体活性化の古典的経路における第１の成分を含む、宿主組織又は因子への
免疫グロブリンの結合を媒介し得る抗体（Ａｂ）の定常領域を含み得る。
【0021】
本発明の文脈において、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗体
様ポリペプチド、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、並びに酵素的切断、ペプチド合成
、及び組換えＤＮＡ技術などの、任意の既知の技法によって提供される抗原（抗原結合フ
ラグメント）に特異的に結合する能力を保持する「抗体フラグメント」又は「そのフラグ
メント」を含む。「抗体」という用語は、二重、三重、若しくは多重特異性抗体、及び／
又は更なる修飾を有する抗体、例えば、抗体－薬物複合体及び／又はＩｇＧ Ｆｃドメイ
ンに修飾を有する抗体を含む。本明細書における本開示が別途限定されない限り、本発明
に従って定義される抗体は、任意のアイソタイプを保有するか、又はアイソタイプを有さ
ない（例えば、ｓｃＦｖ抗体）ことができる。
様ポリペプチド、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、並びに酵素的切断、ペプチド合成
、及び組換えＤＮＡ技術などの、任意の既知の技法によって提供される抗原（抗原結合フ
ラグメント）に特異的に結合する能力を保持する「抗体フラグメント」又は「そのフラグ
メント」を含む。「抗体」という用語は、二重、三重、若しくは多重特異性抗体、及び／
又は更なる修飾を有する抗体、例えば、抗体－薬物複合体及び／又はＩｇＧ Ｆｃドメイ
ンに修飾を有する抗体を含む。本明細書における本開示が別途限定されない限り、本発明
に従って定義される抗体は、任意のアイソタイプを保有するか、又はアイソタイプを有さ
ない（例えば、ｓｃＦｖ抗体）ことができる。
【0022】
抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されてい
る。「抗体」という用語内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ’
若しくはＦａｂフラグメント、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
軽鎖定常領域（ＣＬ）、及び重鎖定常領域ドメイン１（ＣＨ１）ドメインからなる一価フ
ラグメント、又はＷＯ２００７／０５９７８２に記載される一価抗体、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ
’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂフラ
グメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから本質的になる
Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になる
Ｆｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれるＨ
ｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ－．２００３ Ｎｏｖ；２１
（１１）：４８４－９０、ｄＡｂフラグメントＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３４１，５４４５４６（１９８９）、（ｖｉ）ラクダ科動物又はナノボディＲｅｖｅｔｓ
ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５（
１）：１１１－２４、並びに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられ
る。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によって
コードされるが、それらは、組換え方法を使用して、それらが、ＶＬ及びＶＨ領域が一価
分子（一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成するために対合す
る単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合され
得、例えば、Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ
．２００５ Ｊａｎ；５（１）：１１１－２４及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４２，４２３４２６（１９８８）を参照されたい。そのような一本鎖抗体は、別
段に記載されない限り、又は文脈によって明確に示されない限り、抗体という用語内に包
含される。そのようなフラグメントは、一般に、抗体の意味内に含まれるが、それらは、
集合的に、及び各々独立して、本発明の独自の特徴であり、異なる生物学的特性及び有用
性を示す。本発明の文脈におけるこれらの及び他の有用な抗体フラグメントは、本明細書
において更に論じられる。
る。「抗体」という用語内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ’
若しくはＦａｂフラグメント、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
軽鎖定常領域（ＣＬ）、及び重鎖定常領域ドメイン１（ＣＨ１）ドメインからなる一価フ
ラグメント、又はＷＯ２００７／０５９７８２に記載される一価抗体、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ
’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂフラ
グメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから本質的になる
Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になる
Ｆｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれるＨ
ｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ－．２００３ Ｎｏｖ；２１
（１１）：４８４－９０、ｄＡｂフラグメントＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３４１，５４４５４６（１９８９）、（ｖｉ）ラクダ科動物又はナノボディＲｅｖｅｔｓ
ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５（
１）：１１１－２４、並びに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられ
る。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によって
コードされるが、それらは、組換え方法を使用して、それらが、ＶＬ及びＶＨ領域が一価
分子（一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成するために対合す
る単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合され
得、例えば、Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ
．２００５ Ｊａｎ；５（１）：１１１－２４及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４２，４２３４２６（１９８８）を参照されたい。そのような一本鎖抗体は、別
段に記載されない限り、又は文脈によって明確に示されない限り、抗体という用語内に包
含される。そのようなフラグメントは、一般に、抗体の意味内に含まれるが、それらは、
集合的に、及び各々独立して、本発明の独自の特徴であり、異なる生物学的特性及び有用
性を示す。本発明の文脈におけるこれらの及び他の有用な抗体フラグメントは、本明細書
において更に論じられる。
【0023】
最終産物として、又は例えば、二重特異性抗体を制御されたＦａｂ－アーム交換（ｃＦ
ＥＡ）を通して生成するための中間体としてのいずれかの、抗体は、異なるインビトロ又
はエクスビボ発現又は産生システムにおいて産生され、それらから、例えば、組換え修飾
宿主細胞から、抗体をコードする核酸配列のインビトロ転写及び／又は翻訳を支持する細
胞抽出物を使用するハイブリドーマ又はシステムから収集され得る。
ＥＡ）を通して生成するための中間体としてのいずれかの、抗体は、異なるインビトロ又
はエクスビボ発現又は産生システムにおいて産生され、それらから、例えば、組換え修飾
宿主細胞から、抗体をコードする核酸配列のインビトロ転写及び／又は翻訳を支持する細
胞抽出物を使用するハイブリドーマ又はシステムから収集され得る。
【0024】
本明細書で使用される「免疫グロブリン重鎖」又は「免疫グロブリンの重鎖」という用
語は、免疫グロブリンの重鎖のうちの１つを指すことが意図されている。重鎖は、典型的
には、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び免疫グロブリンのアイソタイプ
を定義する重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略される）からなる。ＩｇＧの重鎖定常領
域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。本明細
書で使用される「免疫グロブリン」という用語は、典型的には、２対のポリペプチド鎖、
１対の軽（Ｌ）低分子量鎖、及び１対の重（Ｈ）鎖からなる構造的に関連する糖タンパク
質のクラスを指すことが意図され、４つは全てジスルフィド結合によって潜在的に相互接
続される。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている（例えば、Ｆｕｎｄａｍ
ｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ
．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。免疫グロブリンの
構造内では、２つの重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」におけるジスルフィド結合を介して
相互接続されている。重鎖と同等に、各軽鎖は、典型的には、いくつかの領域、軽鎖可変
領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、
典型的には、１つのドメイン、ＣＬで構成される。更に、ＶＨ及びＶＬ領域は、フレーム
ワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在している、相補性決定領域（
ＣＤＲ）とも称される、超可変性の領域（又は配列及び／若しくは構造的に定義されたル
ープの形態において超可変性であり得る超可変領域）に更に細分化され得る。各ＶＨ及び
ＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置された、３つ
のＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、
ＣＤＲ３、ＦＲ４。
語は、免疫グロブリンの重鎖のうちの１つを指すことが意図されている。重鎖は、典型的
には、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び免疫グロブリンのアイソタイプ
を定義する重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略される）からなる。ＩｇＧの重鎖定常領
域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。本明細
書で使用される「免疫グロブリン」という用語は、典型的には、２対のポリペプチド鎖、
１対の軽（Ｌ）低分子量鎖、及び１対の重（Ｈ）鎖からなる構造的に関連する糖タンパク
質のクラスを指すことが意図され、４つは全てジスルフィド結合によって潜在的に相互接
続される。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている（例えば、Ｆｕｎｄａｍ
ｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ
．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。免疫グロブリンの
構造内では、２つの重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」におけるジスルフィド結合を介して
相互接続されている。重鎖と同等に、各軽鎖は、典型的には、いくつかの領域、軽鎖可変
領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、
典型的には、１つのドメイン、ＣＬで構成される。更に、ＶＨ及びＶＬ領域は、フレーム
ワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在している、相補性決定領域（
ＣＤＲ）とも称される、超可変性の領域（又は配列及び／若しくは構造的に定義されたル
ープの形態において超可変性であり得る超可変領域）に更に細分化され得る。各ＶＨ及び
ＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置された、３つ
のＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、
ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【0025】
本明細書で使用されるとき、「半分子」、「Ｆａｂ－アーム」、及び「アーム」という
用語は、１つの重鎖－軽鎖対を指す。二重特異性抗体が、第１の抗体「に由来する」半分
子抗体、及び第２の抗体「に由来する」半分子抗体を含むと記載されるとき、「～に由来
する」という用語は、二重特異性抗体が、任意の既知の方法によって、当該第１及び第２
の抗体の各々からの当該半分子を、得られる二重特異性抗体に組換えることによって生成
されたことを示す。この文脈において、「組換えること」は、任意の特定の組換え方法に
よって限定されることを意図するものではなく、よって、例えば、半分子交換によって組
換えること、並びに核酸レベルで、及び／又は同じ細胞における２つの半分子の共発現を
通して組換えることを含む、本明細書に記載される二重特異性抗体を産生するための方法
のうちの全てを含む。
用語は、１つの重鎖－軽鎖対を指す。二重特異性抗体が、第１の抗体「に由来する」半分
子抗体、及び第２の抗体「に由来する」半分子抗体を含むと記載されるとき、「～に由来
する」という用語は、二重特異性抗体が、任意の既知の方法によって、当該第１及び第２
の抗体の各々からの当該半分子を、得られる二重特異性抗体に組換えることによって生成
されたことを示す。この文脈において、「組換えること」は、任意の特定の組換え方法に
よって限定されることを意図するものではなく、よって、例えば、半分子交換によって組
換えること、並びに核酸レベルで、及び／又は同じ細胞における２つの半分子の共発現を
通して組換えることを含む、本明細書に記載される二重特異性抗体を産生するための方法
のうちの全てを含む。
【0026】
「第１」及び「第２」という用語は、抗体又はそのドメイン若しくは領域の文脈で本明
細書において使用されるとき、単に参照しやすいように意図されており、特定の相対位置
などを示すことは意図されない。
細書において使用されるとき、単に参照しやすいように意図されており、特定の相対位置
などを示すことは意図されない。
【0027】
本明細書で使用される「抗原結合領域」又は「結合領域」という用語は、抗原に結合す
ることができる抗体の領域を指す。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、多糖、又はそれ
らの組み合わせなどの、任意の分子であり得る。抗原は、例えば、細胞、細菌、又はビリ
オン上に提示され得る。「抗原」及び「標的」という用語は、文脈によって矛盾しない限
り、本発明の文脈において交換可能に使用され得る。「抗原結合領域」及び「抗原結合部
位」という用語は、文脈によって矛盾しない限り、本発明の文脈において交換可能に使用
され得る。
ることができる抗体の領域を指す。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、多糖、又はそれ
らの組み合わせなどの、任意の分子であり得る。抗原は、例えば、細胞、細菌、又はビリ
オン上に提示され得る。「抗原」及び「標的」という用語は、文脈によって矛盾しない限
り、本発明の文脈において交換可能に使用され得る。「抗原結合領域」及び「抗原結合部
位」という用語は、文脈によって矛盾しない限り、本発明の文脈において交換可能に使用
され得る。
【0028】
本明細書で使用される「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡
解離定数を指し、ｋｄをｋａで割ることによって得られる。ＫＤはまた、「結合親和性」
と称される。
解離定数を指し、ｋｄをｋａで割ることによって得られる。ＫＤはまた、「結合親和性」
と称される。
【0029】
本明細書で使用される「ｋｄ」（ｓｅｃ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互作
用の解離速度定数を指す。当該値は、ｋｏｆｆ値又はオフレートとも称される。
用の解離速度定数を指す。当該値は、ｋｏｆｆ値又はオフレートとも称される。
【0030】
本明細書で使用される「ｋａ」（Ｍ－１ｘｓｅｃ－１）という用語は、特定の抗体－抗
原相互作用の会合速度定数を指す。当該値は、ｋｏｎ値又はオンレートとも称される。
原相互作用の会合速度定数を指す。当該値は、ｋｏｎ値又はオンレートとも称される。
【0031】
本明細書で使用される「結合」という用語は、抗体の、所定の抗原又は標的への、典型
的には、抗体をリガンドとして、抗原を分析物として使用するバイオレイヤー干渉法によ
って決定されるとき、１Ｅ－６Ｍ以下、例えば、５Ｅ－７Ｍ以下、１Ｅ－７Ｍ以下、例え
ば、５Ｅ－８Ｍ以下、例えば、１Ｅ－８Ｍ以下、例えば、５Ｅ－９Ｍ以下、例えば、１Ｅ
－９Ｍ以下、例えば、１Ｅ－１０Ｍ以下、又は例えば、１Ｅ－１１Ｍ以下のＫＤに対応す
る結合親和性での結合を指し、所定の抗原に、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、
ＢＳＡ、カゼイン）又は密接に関連する抗原への結合についてのその親和性よりも少なく
とも１０倍低い、例えば、少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低
い、例えば、少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低い
ＫＤに対応する親和性で結合する。
的には、抗体をリガンドとして、抗原を分析物として使用するバイオレイヤー干渉法によ
って決定されるとき、１Ｅ－６Ｍ以下、例えば、５Ｅ－７Ｍ以下、１Ｅ－７Ｍ以下、例え
ば、５Ｅ－８Ｍ以下、例えば、１Ｅ－８Ｍ以下、例えば、５Ｅ－９Ｍ以下、例えば、１Ｅ
－９Ｍ以下、例えば、１Ｅ－１０Ｍ以下、又は例えば、１Ｅ－１１Ｍ以下のＫＤに対応す
る結合親和性での結合を指し、所定の抗原に、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、
ＢＳＡ、カゼイン）又は密接に関連する抗原への結合についてのその親和性よりも少なく
とも１０倍低い、例えば、少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低
い、例えば、少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低い
ＫＤに対応する親和性で結合する。
【0032】
本明細書で使用される「ＣＤ３０」という用語は、ＴＮＦＲＳＦ８（腫瘍壊死因子受容
体スーパーファミリーメンバー８）としても知られる、ヒト分化抗原群３０タンパク質を
指す。ＣＤ３０は、様々な種において見出され、よって、「ＣＤ３０」という用語は、文
脈によって矛盾しない限り、ヒトＣＤ３０に限定されない場合がある。ヒトＣＤ３０の配
列は、配列番号３９に記載されている。
体スーパーファミリーメンバー８）としても知られる、ヒト分化抗原群３０タンパク質を
指す。ＣＤ３０は、様々な種において見出され、よって、「ＣＤ３０」という用語は、文
脈によって矛盾しない限り、ヒトＣＤ３０に限定されない場合がある。ヒトＣＤ３０の配
列は、配列番号３９に記載されている。
【0033】
本明細書で使用される「ＣＤ３」という用語は、Ｔ細胞共受容体タンパク質複合体の一
部であり、４つの異なる鎖で構成されるヒト分化抗原群３タンパク質を指す。ＣＤ３は、
様々な種において見出され、よって、「ＣＤ３」という用語は、文脈によって矛盾しない
限り、ヒトＣＤ３に限定されない場合がある。哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ（
ガンマ）鎖（ヒトＣＤ３γ鎖ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０９
６９３、又はカニクイザルＣＤ３γ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ
Ｑ９５ＬＩ７）、ＣＤ３δ（デルタ）鎖（ヒトＣＤ３δ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉ
ｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０４２３４、又はカニクイザルＣＤ３δ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ
／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ９５ＬＩ８）、２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖（ヒ
トＣＤ３ε：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０７７６６、このう
ち本明細書における配列は配列番号４２として組み込まれ、カニクイザルＣＤ３ε Ｕｎ
ｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ９５ＬＩ５、又はアカゲザルＣＤ３ε
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｇ７ＮＣＢ９）、及びＣＤ３ζ鎖
（ゼータ）鎖（ヒトＣＤ３ζ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ２
０９６３、カニクイザルＣＤ３ζ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ
Ｑ０９ＴＫ０）を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と会
合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ及びＣＤ３分子は、一緒に
、ＴＣＲ複合体を含む。
部であり、４つの異なる鎖で構成されるヒト分化抗原群３タンパク質を指す。ＣＤ３は、
様々な種において見出され、よって、「ＣＤ３」という用語は、文脈によって矛盾しない
限り、ヒトＣＤ３に限定されない場合がある。哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ（
ガンマ）鎖（ヒトＣＤ３γ鎖ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０９
６９３、又はカニクイザルＣＤ３γ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ
Ｑ９５ＬＩ７）、ＣＤ３δ（デルタ）鎖（ヒトＣＤ３δ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉ
ｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０４２３４、又はカニクイザルＣＤ３δ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ
／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ９５ＬＩ８）、２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖（ヒ
トＣＤ３ε：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０７７６６、このう
ち本明細書における配列は配列番号４２として組み込まれ、カニクイザルＣＤ３ε Ｕｎ
ｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ９５ＬＩ５、又はアカゲザルＣＤ３ε
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｇ７ＮＣＢ９）、及びＣＤ３ζ鎖
（ゼータ）鎖（ヒトＣＤ３ζ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ２
０９６３、カニクイザルＣＤ３ζ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ
Ｑ０９ＴＫ０）を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と会
合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ及びＣＤ３分子は、一緒に
、ＴＣＲ複合体を含む。
【0034】
「抗体結合領域」という用語は、抗体が結合するエピトープを含む、抗原の領域を指す
。抗体結合領域は、バイオレイヤー干渉法を使用したエピトープビニングによって、アラ
ニンスキャンによって、又はドメインシャッフルアッセイ（抗原の領域が別の種の領域と
交換される抗原構築物を使用し、抗体が依然として抗原に結合するかどうかを決定する）
によって決定され得る。抗体との相互作用に関与する抗体結合領域内のアミノ酸は、水素
／重水素交換質量分析によって及び／又はその抗原に結合した抗体の結晶学によって決定
され得る。
。抗体結合領域は、バイオレイヤー干渉法を使用したエピトープビニングによって、アラ
ニンスキャンによって、又はドメインシャッフルアッセイ（抗原の領域が別の種の領域と
交換される抗原構築物を使用し、抗体が依然として抗原に結合するかどうかを決定する）
によって決定され得る。抗体との相互作用に関与する抗体結合領域内のアミノ酸は、水素
／重水素交換質量分析によって及び／又はその抗原に結合した抗体の結晶学によって決定
され得る。
【0035】
「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に結合した抗原決定基を意味する。
エピトープは、通常、アミノ酸、糖側鎖、又はそれらの組み合わせなどの分子の表面群化
からなり、通常、特異的三次元構造特徴、及び特異的電荷特徴を有する。立体構造及び非
立体構造エピトープは、前者への結合は、タンパク質又はその多量体の三次元構造を破壊
する変性溶媒又は他の薬剤の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で
区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、及び結合に直接関与しな
い他のアミノ酸残基、例えば、抗体が抗原に結合しているときに効果的にブロック又はカ
バーされるアミノ酸残基を含み得る。
エピトープは、通常、アミノ酸、糖側鎖、又はそれらの組み合わせなどの分子の表面群化
からなり、通常、特異的三次元構造特徴、及び特異的電荷特徴を有する。立体構造及び非
立体構造エピトープは、前者への結合は、タンパク質又はその多量体の三次元構造を破壊
する変性溶媒又は他の薬剤の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で
区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、及び結合に直接関与しな
い他のアミノ酸残基、例えば、抗体が抗原に結合しているときに効果的にブロック又はカ
バーされるアミノ酸残基を含み得る。
【0036】
「モノクローナル抗体」、「モノクローナルＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」、
「ｍＡｂ」などの用語は、本明細書で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物
を指し、典型的には、特定のエピトープについて単一の結合特異性及び親和性を示す。モ
ノクローナル抗体は、典型的には、例えば、ハイブリドーマ、安定細胞株などのような、
ユニークな親細胞の全てのクローンである同一の細胞によって作製され得る。したがって
、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来す
る可変及び定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体
は、不死化細胞に融合した、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有す
る、トランスジェニック又はトランス染色体非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマ
ウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。ヒトモノクローナ
ル抗体は、ヒトＢ細胞又は形質細胞に由来し得る。モノクローナル抗体はまた、組換え修
飾された宿主細胞、又は抗体をコードする核酸配列のインビトロ転写及び／若しくは翻訳
を支持する細胞抽出物を使用するシステムから産生され得る。
「ｍＡｂ」などの用語は、本明細書で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物
を指し、典型的には、特定のエピトープについて単一の結合特異性及び親和性を示す。モ
ノクローナル抗体は、典型的には、例えば、ハイブリドーマ、安定細胞株などのような、
ユニークな親細胞の全てのクローンである同一の細胞によって作製され得る。したがって
、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来す
る可変及び定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体
は、不死化細胞に融合した、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有す
る、トランスジェニック又はトランス染色体非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマ
ウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。ヒトモノクローナ
ル抗体は、ヒトＢ細胞又は形質細胞に由来し得る。モノクローナル抗体はまた、組換え修
飾された宿主細胞、又は抗体をコードする核酸配列のインビトロ転写及び／若しくは翻訳
を支持する細胞抽出物を使用するシステムから産生され得る。
【0037】
本明細書で使用される「アイソタイプ」という用語は、免疫グロブリンクラス（例えば
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＭ
）、又は重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＩｇＧ１ｍ（ｚａ）及びＩｇＧ１ｍ（
ｆ）などの、それらの任意のアロタイプを指す。更に、各重鎖アイソタイプは、カッパ（
κ）又はラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＭ
）、又は重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＩｇＧ１ｍ（ｚａ）及びＩｇＧ１ｍ（
ｆ）などの、それらの任意のアロタイプを指す。更に、各重鎖アイソタイプは、カッパ（
κ）又はラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。
【0038】
「全長抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、１対の重鎖及び軽鎖、又は２
対の重鎖及び軽鎖を含み、各対が、そのアイソタイプの野生型抗体の重鎖－軽鎖対に通常
見られるような重鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインを含む、抗体（例えば、親抗体又はバ
リアント抗体）を指す。よって、例えば、全長ＩｇＧ１抗体は、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、
ＣＨ３、ヒンジ、ＶＬ、及びＣＬドメインを含有する。全長バリアント抗体において、重
鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインは、特に、全長親又は野生型抗体と比較されるとき、抗
体の機能的特性を修飾及び／又は改善するアミノ酸置換を含有し得る。本発明による全長
抗体は、（ｉ）ＣＤＲ配列を、完全な重鎖及び軽鎖配列を含む１つ以上の好適なベクター
にクローニングするステップと、（ｉｉ）好適な発現系において重鎖及び軽鎖配列を有す
る得られた好適なベクターを発現するステップと、を含む方法によって産生され得る。Ｃ
ＤＲ配列又は完全可変領域配列のいずれかから開始するとき、全長抗体を産生することは
、当業者の知識の範囲内である。よって、当業者は、本発明による全長抗体を生成する方
法を知っている。
対の重鎖及び軽鎖を含み、各対が、そのアイソタイプの野生型抗体の重鎖－軽鎖対に通常
見られるような重鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインを含む、抗体（例えば、親抗体又はバ
リアント抗体）を指す。よって、例えば、全長ＩｇＧ１抗体は、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、
ＣＨ３、ヒンジ、ＶＬ、及びＣＬドメインを含有する。全長バリアント抗体において、重
鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインは、特に、全長親又は野生型抗体と比較されるとき、抗
体の機能的特性を修飾及び／又は改善するアミノ酸置換を含有し得る。本発明による全長
抗体は、（ｉ）ＣＤＲ配列を、完全な重鎖及び軽鎖配列を含む１つ以上の好適なベクター
にクローニングするステップと、（ｉｉ）好適な発現系において重鎖及び軽鎖配列を有す
る得られた好適なベクターを発現するステップと、を含む方法によって産生され得る。Ｃ
ＤＲ配列又は完全可変領域配列のいずれかから開始するとき、全長抗体を産生することは
、当業者の知識の範囲内である。よって、当業者は、本発明による全長抗体を生成する方
法を知っている。
【0039】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト可変ドメインに対する高レベ
ルの配列相同性を含有するように修飾されたヒト抗体定常ドメイン及び非ヒト可変ドメイ
ンを含有する、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒に抗原結合部位を形成
する、非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）の、相同ヒトアクセプターフレームワーク領
域（ＦＲ）上への移植によって達成することができる（とりわけ、ＷＯ９２／２２６５３
及びＥＰ０６２９２４０を参照されたい）。親抗体の結合親和性及び特異性を完全に再構
成するために、親抗体（すなわち、非ヒト抗体）からのフレームワーク残基のいくつかで
のヒトフレームワーク残基のいくつかの置換（逆変異）が必要とされ得る。構造的相同性
モデリングは、抗体の結合特性にとって重要なフレームワーク領域におけるアミノ酸残基
を特定するために役立ち得る。よって、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に非ヒトア
ミノ酸配列への１つ以上のアミノ酸逆変異を任意に含むヒトフレームワーク領域、及び完
全ヒト定常領域を含み得る。任意に、必ずしも逆変異ではない、追加のアミノ酸修飾は、
特に有用な親和性及び生化学的特性などの、好ましい特徴を有するヒト化抗体を得るため
に、例えば、脱アミド化を回避及び／又は製造を改善する修飾を含むために適用され得る
。更に、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域は、例えば、親和性成熟手順を介して、抗
原に対する親和性を改善するように修飾され得る。
ルの配列相同性を含有するように修飾されたヒト抗体定常ドメイン及び非ヒト可変ドメイ
ンを含有する、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒に抗原結合部位を形成
する、非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）の、相同ヒトアクセプターフレームワーク領
域（ＦＲ）上への移植によって達成することができる（とりわけ、ＷＯ９２／２２６５３
及びＥＰ０６２９２４０を参照されたい）。親抗体の結合親和性及び特異性を完全に再構
成するために、親抗体（すなわち、非ヒト抗体）からのフレームワーク残基のいくつかで
のヒトフレームワーク残基のいくつかの置換（逆変異）が必要とされ得る。構造的相同性
モデリングは、抗体の結合特性にとって重要なフレームワーク領域におけるアミノ酸残基
を特定するために役立ち得る。よって、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に非ヒトア
ミノ酸配列への１つ以上のアミノ酸逆変異を任意に含むヒトフレームワーク領域、及び完
全ヒト定常領域を含み得る。任意に、必ずしも逆変異ではない、追加のアミノ酸修飾は、
特に有用な親和性及び生化学的特性などの、好ましい特徴を有するヒト化抗体を得るため
に、例えば、脱アミド化を回避及び／又は製造を改善する修飾を含むために適用され得る
。更に、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域は、例えば、親和性成熟手順を介して、抗
原に対する親和性を改善するように修飾され得る。
【0040】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に
由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロ
ブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム
若しくは部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入される
変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マ
ウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上
に移植されている抗体を含むことを意図していない。本発明のヒトモノクローナル抗体は
、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法
を含む、様々な技法によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順
が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を産生するための他の技法、例えば、ヒ
ト抗体遺伝子のライブラリーを使用するＢリンパ球又はファージディスプレイ技法のウイ
ルス又はがん原性形質転換を用いることができる。ヒトモノクローナル抗体は、ＨＣｏ１
２マウス（例えば、ＷＯ０３／０５９２８２を参照されたい）などのような、マウス系で
はなく、ヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニック又はトランス染色体マウスを用
いて生成することができる。
由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロ
ブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム
若しくは部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入される
変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マ
ウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上
に移植されている抗体を含むことを意図していない。本発明のヒトモノクローナル抗体は
、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法
を含む、様々な技法によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順
が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を産生するための他の技法、例えば、ヒ
ト抗体遺伝子のライブラリーを使用するＢリンパ球又はファージディスプレイ技法のウイ
ルス又はがん原性形質転換を用いることができる。ヒトモノクローナル抗体は、ＨＣｏ１
２マウス（例えば、ＷＯ０３／０５９２８２を参照されたい）などのような、マウス系で
はなく、ヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニック又はトランス染色体マウスを用
いて生成することができる。
【0041】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体の２つの重鎖ポリペプチドのＮ
末端からＣ末端への方向で、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含む
領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、典型的には、グリコシル化される。抗体のＦｃ領域は
、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の成分を含む、宿主組織又は
因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。Ｆｃ領域は、典型的には、ＦｃＲｎ及びタ
ンパク質Ａにも結合する。
末端からＣ末端への方向で、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含む
領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、典型的には、グリコシル化される。抗体のＦｃ領域は
、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の成分を含む、宿主組織又は
因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。Ｆｃ領域は、典型的には、ＦｃＲｎ及びタ
ンパク質Ａにも結合する。
【0042】
本明細書で使用される、「…位のアミノ酸に対応するアミノ酸」などの語句は、ヒトＩ
ｇＧ１重鎖におけるアミノ酸位置番号を指す。他の免疫グロブリンにおける対応するアミ
ノ酸位置は、ヒトＩｇＧ１とのアラインメントによって見出され得る。別段の記載がない
限り、又は文脈によって矛盾しない限り、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書では、Ｅ
Ｕ－インデックスのナンバリングに従って番号付けされる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９に記載される）
。よって、別の配列におけるアミノ酸又はセグメント「に対応する」１つの配列における
アミノ酸又はセグメントは、他のアミノ酸又はセグメントと、ＡＬＩＧＮ、Ｃｌｕｓｔａ
ｌＷ、又は類似物などの標準配列アラインメントプログラムを、典型的にはデフォルト設
定で使用してアラインし、ヒトＩｇＧ１重鎖に対して少なくとも５０％、少なくとも８０
％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するものである。当該技術分
野では、配列又は配列中のセグメントをアラインし、それによって、本発明によるアミノ
酸位置に対する配列における対応する位置を決定する方法は、周知であると考えられてい
る。
ｇＧ１重鎖におけるアミノ酸位置番号を指す。他の免疫グロブリンにおける対応するアミ
ノ酸位置は、ヒトＩｇＧ１とのアラインメントによって見出され得る。別段の記載がない
限り、又は文脈によって矛盾しない限り、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書では、Ｅ
Ｕ－インデックスのナンバリングに従って番号付けされる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９に記載される）
。よって、別の配列におけるアミノ酸又はセグメント「に対応する」１つの配列における
アミノ酸又はセグメントは、他のアミノ酸又はセグメントと、ＡＬＩＧＮ、Ｃｌｕｓｔａ
ｌＷ、又は類似物などの標準配列アラインメントプログラムを、典型的にはデフォルト設
定で使用してアラインし、ヒトＩｇＧ１重鎖に対して少なくとも５０％、少なくとも８０
％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するものである。当該技術分
野では、配列又は配列中のセグメントをアラインし、それによって、本発明によるアミノ
酸位置に対する配列における対応する位置を決定する方法は、周知であると考えられてい
る。
【0043】
本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域
を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏ
ｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９（１９９１）に記載され
るＥｕナンバリングに従ってアミノ酸２１６－２３０に対応する。しかしながら、ヒンジ
領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであり得る。
を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏ
ｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９（１９９１）に記載され
るＥｕナンバリングに従ってアミノ酸２１６－２３０に対応する。しかしながら、ヒンジ
領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであり得る。
【0044】
本明細書で使用される「ＣＨ１領域」又は「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロ
ブリン重鎖のＣＨ１領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域は、Ｋ
ａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸１１８～２１５に対応
する。しかしながら、ＣＨ１領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれ
かであり得る。
ブリン重鎖のＣＨ１領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域は、Ｋ
ａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸１１８～２１５に対応
する。しかしながら、ＣＨ１領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれ
かであり得る。
【0045】
本明細書で使用される「ＣＨ２領域」又は「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロ
ブリン重鎖のＣＨ２領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、Ｋ
ａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸２３１～３４０に対応
する。しかしながら、ＣＨ２領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれ
かであり得る。
ブリン重鎖のＣＨ２領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、Ｋ
ａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸２３１～３４０に対応
する。しかしながら、ＣＨ２領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれ
かであり得る。
【0046】
本明細書で使用される「ＣＨ３領域」又は「ＣＨ３ドメイン」という用語は、免疫グロ
ブリン重鎖のＣＨ３領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、Ｋ
ａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸３４１～４４７に対応
する。しかしながら、ＣＨ３領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれ
かであり得る。
ブリン重鎖のＣＨ３領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、Ｋ
ａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸３４１～４４７に対応
する。しかしながら、ＣＨ３領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれ
かであり得る。
【0047】
本明細書で使用される、「Ｆｃ媒介性エフェクター機能」という用語は、Ｆｃ媒介性エ
フェクター機能がポリペプチド又は抗体のＦｃ領域に起因する、ポリペプチド又は抗体を
細胞膜上のその標的又は抗原に結合させた結果である機能を指すことが意図される。Ｆｃ
媒介性エフェクター機能の例としては、（ｉ）Ｃ１ｑ結合、（ｉｉ）補体活性化、（ｉｉ
ｉ）補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）、（ｉｖ）抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤ
ＣＣ）、（ｖ）Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃｇＲ）結合、（ｖｉ）抗体依存的、ＦｃγＲ媒
介性抗原架橋、（ｖｉｉ）抗体依存的細胞食作用（ＡＤＣＰ）、（ｖｉｉｉ）補体依存的
細胞傷害性（ＣＤＣＣ）、（ｉｘ）補体増強性細胞傷害性、（ｘ）抗体によって媒介され
るオプソニン化抗体の補体受容体への結合、（ｘｉ）オプソニン化、及び（ｘｉｉ）（ｉ
）～（ｘｉ）のいずれかの組み合わせが挙げられる。
フェクター機能がポリペプチド又は抗体のＦｃ領域に起因する、ポリペプチド又は抗体を
細胞膜上のその標的又は抗原に結合させた結果である機能を指すことが意図される。Ｆｃ
媒介性エフェクター機能の例としては、（ｉ）Ｃ１ｑ結合、（ｉｉ）補体活性化、（ｉｉ
ｉ）補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）、（ｉｖ）抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤ
ＣＣ）、（ｖ）Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃｇＲ）結合、（ｖｉ）抗体依存的、ＦｃγＲ媒
介性抗原架橋、（ｖｉｉ）抗体依存的細胞食作用（ＡＤＣＰ）、（ｖｉｉｉ）補体依存的
細胞傷害性（ＣＤＣＣ）、（ｉｘ）補体増強性細胞傷害性、（ｘ）抗体によって媒介され
るオプソニン化抗体の補体受容体への結合、（ｘｉ）オプソニン化、及び（ｘｉｉ）（ｉ
）～（ｘｉ）のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【0048】
本明細書で使用される、「不活性（ｉｎｅｒｔｎｅｓｓ）」、「不活性（ｉｎｅｒｔ）
」、又は「非活性化」という用語は、任意のＦｃγＲに結合することができないか、若し
くは任意のＦｃγＲに結合し、ＦｃγＲのＦｃ媒介性架橋を誘導し、ＡＤＣＣ及びＡＤＣ
ＰなどのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能を誘導し、個々の抗体の２つのＦｃ領域を介し
て標的抗原のＦｃγＲ媒介性架橋を誘導する最小限の能力を有し、かつ／又はＣ１ｑに結
合し、ＣＤＣ及びＣＤＣＣなどの補体媒介性エフェクター機能を誘導することができない
Ｆｃ領域を指す。抗体のＦｃ領域の不活性は、単一特異性又は二重特異性フォーマットで
抗体を使用して試験され得る。
」、又は「非活性化」という用語は、任意のＦｃγＲに結合することができないか、若し
くは任意のＦｃγＲに結合し、ＦｃγＲのＦｃ媒介性架橋を誘導し、ＡＤＣＣ及びＡＤＣ
ＰなどのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能を誘導し、個々の抗体の２つのＦｃ領域を介し
て標的抗原のＦｃγＲ媒介性架橋を誘導する最小限の能力を有し、かつ／又はＣ１ｑに結
合し、ＣＤＣ及びＣＤＣＣなどの補体媒介性エフェクター機能を誘導することができない
Ｆｃ領域を指す。抗体のＦｃ領域の不活性は、単一特異性又は二重特異性フォーマットで
抗体を使用して試験され得る。
【0049】
「一価抗体」という用語は、本発明の文脈において、１つの抗原結合ドメイン（例えば
、１つのＦａｂアーム）のみを有する、抗原と相互作用することができる抗体分子を指す
。二重特異性などの、多重特異性抗体の文脈では、「一価抗体結合」は、多重特異性抗体
の、１つの抗原結合ドメイン（例えば、１つのＦａｂアーム）のみを有する１つの抗原へ
の結合を指す。
、１つのＦａｂアーム）のみを有する、抗原と相互作用することができる抗体分子を指す
。二重特異性などの、多重特異性抗体の文脈では、「一価抗体結合」は、多重特異性抗体
の、１つの抗原結合ドメイン（例えば、１つのＦａｂアーム）のみを有する１つの抗原へ
の結合を指す。
【0050】
本発明の文脈における「単一特異性抗体」という用語は、１つの抗原、１つのエピトー
プのみに対する結合特異性を有する抗体を指す。抗体は、単一特異性、一価抗体（すなわ
ち、１つの抗原結合領域のみを保有する）、単一特異性、二価抗体（例えば、２つの同一
の抗原結合領域を有する抗体）、又は単一特異性、多価抗体（例えば、３つ以上の同一の
抗原結合領域を有する抗体）であり得る。
プのみに対する結合特異性を有する抗体を指す。抗体は、単一特異性、一価抗体（すなわ
ち、１つの抗原結合領域のみを保有する）、単一特異性、二価抗体（例えば、２つの同一
の抗原結合領域を有する抗体）、又は単一特異性、多価抗体（例えば、３つ以上の同一の
抗原結合領域を有する抗体）であり得る。
【0051】
「多重特異性抗体」という用語は、２つ以上の異なるエピトープに結合する２つ以上の
抗原結合ドメインを有する抗体を指す。「二重特異性抗体」という用語は、異なるエピト
ープに結合する２つの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨ及びＶＬ領域の２つの非同一対、
２つの非同一Ｆａｂアーム、又は非同一ＣＤＲ領域を有する２つのＦａｂアームを有する
抗体を指す。本発明の文脈において、二重特異性及び多重特異性抗体は、それぞれ、２つ
以上の異なるエピトープについての特異性を有する。そのようなエピトープは、同じ又は
異なる抗原又は標的上にあり得る。エピトープが異なる抗原上にある場合、そのような抗
原は、細胞外マトリックス又はベシクル及び可溶性タンパク質などの同じ細胞又は異なる
細胞、細胞型、又は構造上にあり得る。よって、多重特異性及び二重特異性抗体は、複数
の抗原、例えば、２つの異なる細胞を架橋することができる場合がある。
抗原結合ドメインを有する抗体を指す。「二重特異性抗体」という用語は、異なるエピト
ープに結合する２つの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨ及びＶＬ領域の２つの非同一対、
２つの非同一Ｆａｂアーム、又は非同一ＣＤＲ領域を有する２つのＦａｂアームを有する
抗体を指す。本発明の文脈において、二重特異性及び多重特異性抗体は、それぞれ、２つ
以上の異なるエピトープについての特異性を有する。そのようなエピトープは、同じ又は
異なる抗原又は標的上にあり得る。エピトープが異なる抗原上にある場合、そのような抗
原は、細胞外マトリックス又はベシクル及び可溶性タンパク質などの同じ細胞又は異なる
細胞、細胞型、又は構造上にあり得る。よって、多重特異性及び二重特異性抗体は、複数
の抗原、例えば、２つの異なる細胞を架橋することができる場合がある。
【0052】
「二価抗体」という用語は、２つの抗原結合領域を有する抗体を指し、当該抗原結合領
域は、同一であり、同じエピトープに結合し得るか、又はそれらは、非同一であり、同じ
若しくは異なる抗原上にあり得る異なるエピトープに結合し得る。したがって、二価抗体
は、単一特異性抗体又は二重特異性抗体であり得る。
域は、同一であり、同じエピトープに結合し得るか、又はそれらは、非同一であり、同じ
若しくは異なる抗原上にあり得る異なるエピトープに結合し得る。したがって、二価抗体
は、単一特異性抗体又は二重特異性抗体であり得る。
【0053】
本明細書では、「アミノ酸」及び「アミノ酸残基」という用語は、互換的に使用され得
、限定的に理解されるものではない。アミノ酸は、各アミノ酸に特異的な側鎖（Ｒ基）と
ともに、アミン（－ＮＨ２）及びカルボキシル（－ＣＯＯＨ）官能基を含有する有機化合
物である。本発明の文脈において、アミノ酸は、構造及び化学的特徴分析に基づいて分類
され得る。よって、アミノ酸のクラスは、以下の表の一方又は両方において反映され得る
：
、限定的に理解されるものではない。アミノ酸は、各アミノ酸に特異的な側鎖（Ｒ基）と
ともに、アミン（－ＮＨ２）及びカルボキシル（－ＣＯＯＨ）官能基を含有する有機化合
物である。本発明の文脈において、アミノ酸は、構造及び化学的特徴分析に基づいて分類
され得る。よって、アミノ酸のクラスは、以下の表の一方又は両方において反映され得る
：
【表1】
【表2】
【0054】
あるアミノ酸の別のアミノ酸への置換は、保存的置換又は非保存的置換として分類され
得る。本発明の文脈において、「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、類似の構造及び／
又は化学的特徴を有する別のアミノ酸での置換であり、１つのアミノ酸残基の、上記２つ
の表のいずれかで定義される同じクラスの別のアミノ酸残基についてのそのような置換：
例えば、保存的置換は、両方とも脂肪族、分岐疎水性であるため、ロイシンのイソロイシ
ンでの置換であり得る。同様に、保存的置換の一例は、両方とも小さい負荷電残基である
ため、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換である。
得る。本発明の文脈において、「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、類似の構造及び／
又は化学的特徴を有する別のアミノ酸での置換であり、１つのアミノ酸残基の、上記２つ
の表のいずれかで定義される同じクラスの別のアミノ酸残基についてのそのような置換：
例えば、保存的置換は、両方とも脂肪族、分岐疎水性であるため、ロイシンのイソロイシ
ンでの置換であり得る。同様に、保存的置換の一例は、両方とも小さい負荷電残基である
ため、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換である。
【0055】
本発明の文脈において、抗体における置換は、元のアミノ酸－位置の数－置換アミノ酸
として示される。
として示される。
【0056】
アミノ酸について周知の命名法を参照すると、任意のアミノ酸残基を示すために、コー
ド「Ｘａａ」又は「Ｘ」を含む、３文字コード、又は１文字コードが使用される。よって
、Ｘａａ又はＸは、典型的には、２０の天然に存在するアミノ酸のいずれかを表し得る。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、以下のアミノ酸残基：グリシン
、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニ
ン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン
、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、及びシステインのうちの
いずれか１つを指す。
ド「Ｘａａ」又は「Ｘ」を含む、３文字コード、又は１文字コードが使用される。よって
、Ｘａａ又はＸは、典型的には、２０の天然に存在するアミノ酸のいずれかを表し得る。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、以下のアミノ酸残基：グリシン
、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニ
ン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン
、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、及びシステインのうちの
いずれか１つを指す。
【0057】
したがって、「Ｋ４０９Ｒ」又は「Ｌｙｓ４０９Ａｒｇ」という表記は、抗体がアミノ
酸位置４０９にあるリジンのアルギニンでの置換を含むことを意味する。所与の位置にお
けるアミノ酸の、任意の他のアミノ酸への置換は、元のアミノ酸－位置、又は例えば、「
Ｋ４０９」と称される。元のアミノ酸及び／又は置換されたアミノ酸が２つ以上であるが
、全てではないアミノ酸を含み得る修飾について、２つ以上のアミノ酸は、「，」又は「
／」によって分離され得る。例えば、４０９位のリジンの、アルギニン、アラニン又はフ
ェニルアラニンでの置換は、「Ｌｙｓ４０９Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ」又は「Ｌｙｓ４０
９Ａｒｇ／Ａｌａ／Ｐｈｅ」又は「Ｋ４０９Ｒ、Ａ、Ｆ」又は「Ｋ４０９Ｒ／Ａ／Ｆ」又
は「Ｋ４０９～Ｒ、Ａ、若しくはＦ」である。そのような呼称は、本発明の文脈において
交換可能に使用され得るが、同じ意味及び目的を有し得る。
酸位置４０９にあるリジンのアルギニンでの置換を含むことを意味する。所与の位置にお
けるアミノ酸の、任意の他のアミノ酸への置換は、元のアミノ酸－位置、又は例えば、「
Ｋ４０９」と称される。元のアミノ酸及び／又は置換されたアミノ酸が２つ以上であるが
、全てではないアミノ酸を含み得る修飾について、２つ以上のアミノ酸は、「，」又は「
／」によって分離され得る。例えば、４０９位のリジンの、アルギニン、アラニン又はフ
ェニルアラニンでの置換は、「Ｌｙｓ４０９Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ」又は「Ｌｙｓ４０
９Ａｒｇ／Ａｌａ／Ｐｈｅ」又は「Ｋ４０９Ｒ、Ａ、Ｆ」又は「Ｋ４０９Ｒ／Ａ／Ｆ」又
は「Ｋ４０９～Ｒ、Ａ、若しくはＦ」である。そのような呼称は、本発明の文脈において
交換可能に使用され得るが、同じ意味及び目的を有し得る。
【0058】
更に、「置換」という用語は、任意の１個若しくは他の１９個の天然アミノ酸への、又
は非天然アミノ酸などの他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、４０９位のアミノ酸
Ｋの置換は、以下の置換の各々を含む：４０９Ａ、４０９Ｃ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４０
９Ｆ、４０９Ｇ、４０９Ｈ、４０９１、４０９Ｌ、４０９Ｍ、４０９Ｎ、４０９Ｑ、４０
９Ｒ、４０９Ｓ、４０９Ｔ、４０９Ｖ、４０９Ｗ、４０９Ｐ、及び４０９Ｙ。これらの置
換はまた、Ｋ４０９Ａ、Ｋ４０９Ｃなど、又はＫ４０９Ａ、Ｃなど、又はＫ４０９Ａ／Ｃ
／などと称され得る。同じことが本明細書で言及される各全ての位置への類推によって当
てはまり、本明細書ではそのような置換のいずれか１つを特異的に含む。
は非天然アミノ酸などの他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、４０９位のアミノ酸
Ｋの置換は、以下の置換の各々を含む：４０９Ａ、４０９Ｃ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４０
９Ｆ、４０９Ｇ、４０９Ｈ、４０９１、４０９Ｌ、４０９Ｍ、４０９Ｎ、４０９Ｑ、４０
９Ｒ、４０９Ｓ、４０９Ｔ、４０９Ｖ、４０９Ｗ、４０９Ｐ、及び４０９Ｙ。これらの置
換はまた、Ｋ４０９Ａ、Ｋ４０９Ｃなど、又はＫ４０９Ａ、Ｃなど、又はＫ４０９Ａ／Ｃ
／などと称され得る。同じことが本明細書で言及される各全ての位置への類推によって当
てはまり、本明細書ではそのような置換のいずれか１つを特異的に含む。
【0059】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、発現ベクターなどの核酸が導入され
た細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、
そのような細胞の子孫も含み得ることが意図されることが理解されるべきである。特定の
修飾は、変異又は環境の影響のいずれかによって後続世代で発生し得るため、そのような
子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用され
る「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞（すなわち、組換えタン
パク質の産生に使用される宿主細胞）としては、例えば、トランスフェクトーマ、例えば
、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０
細胞、及びリンパ球性細胞、並びにＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、並びに植物細胞及び真
菌などの他の真核生物宿主が挙げられる。
た細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、
そのような細胞の子孫も含み得ることが意図されることが理解されるべきである。特定の
修飾は、変異又は環境の影響のいずれかによって後続世代で発生し得るため、そのような
子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用され
る「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞（すなわち、組換えタン
パク質の産生に使用される宿主細胞）としては、例えば、トランスフェクトーマ、例えば
、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０
細胞、及びリンパ球性細胞、並びにＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、並びに植物細胞及び真
菌などの他の真核生物宿主が挙げられる。
【0060】
本明細書で使用される「トランスフェクトーマ」という用語は、抗体又は標的抗原を発
現する組換え真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥ
Ｋ－２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む、真菌を含む。
現する組換え真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥ
Ｋ－２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む、真菌を含む。
【0061】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、参照配列の長さにかけ
て、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ
ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅ
プログラム、好ましくはバージョン５．０．０以降で実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗ
ｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定される。使用されるパラメー
タは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ延長ペナルティ、及びＥＢ
ＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである
。「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）と標識されたＮｅ
ｅｄｌｅの出力は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントのギャップの総数）
。
て、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ
ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅ
プログラム、好ましくはバージョン５．０．０以降で実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗ
ｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定される。使用されるパラメー
タは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ延長ペナルティ、及びＥＢ
ＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである
。「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）と標識されたＮｅ
ｅｄｌｅの出力は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントのギャップの総数）
。
【0062】
類似の残基の保持はまた又は代替的に、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準設定ＢＬ
ＯＳＵＭ６２、オープンギャップ＝１１、及び延長ギャップ＝１を使用してＮＣＢＩを通
して利用可能なＢＬＡＳＴ ２．２．８）の使用によって決定されるように、類似性スコ
アによって測定され得る。好適なバリアントは、典型的には、親又は参照配列に対して少
なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少
なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上（例えば、約９９％）などの、少なくとも約
４５％の類似性を示す。
ＯＳＵＭ６２、オープンギャップ＝１１、及び延長ギャップ＝１を使用してＮＣＢＩを通
して利用可能なＢＬＡＳＴ ２．２．８）の使用によって決定されるように、類似性スコ
アによって測定され得る。好適なバリアントは、典型的には、親又は参照配列に対して少
なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少
なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上（例えば、約９９％）などの、少なくとも約
４５％の類似性を示す。
【表3】
【0063】
本発明の更なる態様及び実施形態
上記のように、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
上記のように、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
【0064】
一実施形態において、配列番号９におけるＸは、Ｈである。別の実施形態において、配
列番号９におけるＸはＧである。
列番号９におけるＸはＧである。
【0065】
一実施形態において、第１の重鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。別の実施形態に
おいて、第１の軽鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。一実施形態において、第２の重
鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。別の実施形態において、第２の軽鎖可変領域は、
ヒト又はヒト化である。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変
領域は、ヒトである。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領
域は、ヒト化である。別の実施形態において、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領
域は、ヒトである。別の実施形態において、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域
は、ヒト化である。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域
は、ヒトであり、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒトである。別の実施
形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域は、ヒトであり、第２の重鎖
可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒト化である。
おいて、第１の軽鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。一実施形態において、第２の重
鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。別の実施形態において、第２の軽鎖可変領域は、
ヒト又はヒト化である。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変
領域は、ヒトである。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領
域は、ヒト化である。別の実施形態において、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領
域は、ヒトである。別の実施形態において、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域
は、ヒト化である。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域
は、ヒトであり、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒトである。別の実施
形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域は、ヒトであり、第２の重鎖
可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒト化である。
【0066】
当業者に周知であるように、抗体の各抗原結合領域は、一般に、重鎖可変領域（ＶＨ）
及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、可変領域の各々は、それぞれ、３つのＣＤＲ配列、Ｃ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、それぞれ、４つのフレームワーク配列、ＦＲ１
、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含み得る。この構造は、好ましくは、本発明による抗体
にも見出される。一実施形態において、当該４つのフレームワーク配列のうちの１つ、２
つ、３つ、又は全ては、ヒトフレームワーク配列である。
及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、可変領域の各々は、それぞれ、３つのＣＤＲ配列、Ｃ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、それぞれ、４つのフレームワーク配列、ＦＲ１
、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含み得る。この構造は、好ましくは、本発明による抗体
にも見出される。一実施形態において、当該４つのフレームワーク配列のうちの１つ、２
つ、３つ、又は全ては、ヒトフレームワーク配列である。
【0067】
上記のように、本発明による多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３０に結合することができる
抗原結合領域を含み、その配列は、配列番号３９に記載される。特に、本発明による抗体
は、ヒトＣＤ３０に結合することができる当該抗原結合領域が、細胞、より好ましくは腫
瘍細胞に発現されるＣＤ３０分子などの、ヒトＣＤ３０の細胞外ドメインに結合すること
ができる、抗体である。
抗原結合領域を含み、その配列は、配列番号３９に記載される。特に、本発明による抗体
は、ヒトＣＤ３０に結合することができる当該抗原結合領域が、細胞、より好ましくは腫
瘍細胞に発現されるＣＤ３０分子などの、ヒトＣＤ３０の細胞外ドメインに結合すること
ができる、抗体である。
【0068】
記載されるように、抗体は、それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１
、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５
、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域
と、を含む、ＣＤ３０結合領域を含む。
、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５
、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域
と、を含む、ＣＤ３０結合領域を含む。
【0069】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、当該技術分野で既知の方法を使用して、可
変重鎖及び軽鎖領域から特定することができる。当該可変重鎖及び軽鎖領域からのＣＤＲ
領域は、ＩＭＧＴに従ってアノテーションされている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，Ｔ
ｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
，２７（１），５５－７７（２００３）を参照されたい）。
変重鎖及び軽鎖領域から特定することができる。当該可変重鎖及び軽鎖領域からのＣＤＲ
領域は、ＩＭＧＴに従ってアノテーションされている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，Ｔ
ｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
，２７（１），５５－７７（２００３）を参照されたい）。
【0070】
一実施形態において、ＣＤ３０に結合する抗原結合領域は、
・配列番号１３の配列、又は配列番号１３の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第１の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１４の配列、又は配列番号１４の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第１の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
・配列番号１３の配列、又は配列番号１３の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第１の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１４の配列、又は配列番号１４の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第１の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
【0071】
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３０に結合
する抗原結合領域の重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、配列は、配列番号１３と比較されると
き、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
する抗原結合領域の重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、配列は、配列番号１３と比較されると
き、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
【0072】
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３０に結合
する抗原結合領域の軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、配列は、配列番号１４と比較されると
き、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
する抗原結合領域の軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、配列は、配列番号１４と比較されると
き、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
【0073】
更なる実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号１３に記載される配列を含
み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載される配列を含む。
み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載される配列を含む。
【0074】
ヒトＣＤ３０に結合することができるそのような抗原結合領域は、とりわけ、参照によ
って本明細書に組み込まれる、ＷＯ０３０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）に記載されてい
る。
って本明細書に組み込まれる、ＷＯ０３０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）に記載されてい
る。
【0075】
本発明による当該抗体は、ヒトＣＤ３０に結合する抗原結合領域間の平衡解離定数ＫＤ
で結合し得、ヒトＣＤ３０は、０．１～２０ｎＭの範囲内、例えば、１．５～２ｎＭの範
囲（一価結合）などの、０．５～５ｎＭの範囲内である。当該結合親和性は、バイオレイ
ヤー干渉法によって決定することができる。
で結合し得、ヒトＣＤ３０は、０．１～２０ｎＭの範囲内、例えば、１．５～２ｎＭの範
囲（一価結合）などの、０．５～５ｎＭの範囲内である。当該結合親和性は、バイオレイ
ヤー干渉法によって決定することができる。
【0076】
一実施形態において、本発明の抗体はまた、カニクイザルＣＤ３０（配列番号４０）に
結合することができる。
結合することができる。
【0077】
上記のように、本発明による多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合することができる抗
原結合領域を含む。更に、本発明は、配列番号２２に特定されるヒトＣＤ３ε（イプシロ
ン）などの、ヒトＣＤ３ε（イプシロン）に結合することができる本発明による抗体を提
供する。そのような抗原結合領域は、初代ヒトＴ細胞などの、Ｔ細胞上に提示されるよう
に、ヒトＣＤ３ε（イプシロン）に結合することができる。
原結合領域を含む。更に、本発明は、配列番号２２に特定されるヒトＣＤ３ε（イプシロ
ン）などの、ヒトＣＤ３ε（イプシロン）に結合することができる本発明による抗体を提
供する。そのような抗原結合領域は、初代ヒトＴ細胞などの、Ｔ細胞上に提示されるよう
に、ヒトＣＤ３ε（イプシロン）に結合することができる。
【0078】
記載されるように、抗体は、それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１
、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、
１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可
変領域と、を含むＣＤ３結合領域を含む。
、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、
１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可
変領域と、を含むＣＤ３結合領域を含む。
【0079】
一実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合領域は、
・配列番号１５の配列、又は配列番号１５の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第２の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１６の配列、又は配列番号１６の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第２の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
・配列番号１５の配列、又は配列番号１５の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第２の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１６の配列、又は配列番号１６の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含
む（第２の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
【0080】
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３に結合す
る抗原結合領域の重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、配列は、配列番号１５と比較されるとき
、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
る抗原結合領域の重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、配列は、配列番号１５と比較されるとき
、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
【0081】
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３に結合す
る抗原結合領域の軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、配列は、配列番号１６と比較されるとき
、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
る抗原結合領域の軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、配列は、配列番号１６と比較されるとき
、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
【0082】
更なる実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番号１５に記載される配列を含
み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載される配列を含む。一実施形態において
、配列番号１５におけるＸは、Ｈである。別の実施形態において、配列番号１５における
Ｘは、Ｇである。
み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載される配列を含む。一実施形態において
、配列番号１５におけるＸは、Ｈである。別の実施形態において、配列番号１５における
Ｘは、Ｇである。
【0083】
ヒトＣＤ３に結合することができるそのような抗原結合領域は、とりわけ、参照によっ
て本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／００１０８５（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されて
いる。本明細書のバリアント、例えば、ＸがＧである、配列番号９に記載されるＶＨ Ｃ
ＤＲ３領域を含み、ＸがＨである、親抗体よりも低いヒトＣＤ３結合についての親和性を
有する、バリアントは、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／００９４
４２（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例２に記載されている。
て本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／００１０８５（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されて
いる。本明細書のバリアント、例えば、ＸがＧである、配列番号９に記載されるＶＨ Ｃ
ＤＲ３領域を含み、ＸがＨである、親抗体よりも低いヒトＣＤ３結合についての親和性を
有する、バリアントは、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／００９４
４２（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例２に記載されている。
【0084】
本発明による当該抗体は、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合領域間の平衡解離定数ＫＤで
結合し得、ヒトＣＤ３は、５～３０ｎＭ、例えば、１０～２０ｎＭ（一価結合の場合）の
範囲内である。
結合し得、ヒトＣＤ３は、５～３０ｎＭ、例えば、１０～２０ｎＭ（一価結合の場合）の
範囲内である。
【0085】
一実施形態において、本発明の抗体はまた、カニクイザルＣＤ３（配列番号４３）に結
合することができる。
合することができる。
【0086】
更なる実施形態において、多重特異性抗体は、
（ｉ）配列番号１３に記載される配列を含む第１の重鎖可変領域と、配列番号１４に記載
される配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）配列番号１５に記載される配列を含む第２の重鎖可変領域と、配列番号１６に記
載される配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む。
（ｉ）配列番号１３に記載される配列を含む第１の重鎖可変領域と、配列番号１４に記載
される配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）配列番号１５に記載される配列を含む第２の重鎖可変領域と、配列番号１６に記
載される配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む。
【0087】
抗体フォーマット
本発明の多重特異性抗体は、２つ以上の特異性、例えば、２つ又は３つ以上の特異性を
有し得る。更に、多重特異性抗体は、ＣＤ３及び／又はＣＤ３０について抗原結合領域の
２つ以上のコピーを有し得る。例えば、一実施形態において、抗体は、ＣＤ３に結合する
ことができる２つの抗原結合領域、例えば、ＣＤ３に結合する２つの同一の結合領域を有
する。例えば、別の実施形態において、抗体は、ＣＤ３０に結合する２つの抗原結合領域
、例えば、ＣＤ３０に結合する２つの同一の結合領域を有する。追加の抗原結合領域は、
例えば、定常領域に共有結合したｓｃＦｖの形態で存在し得る。
本発明の多重特異性抗体は、２つ以上の特異性、例えば、２つ又は３つ以上の特異性を
有し得る。更に、多重特異性抗体は、ＣＤ３及び／又はＣＤ３０について抗原結合領域の
２つ以上のコピーを有し得る。例えば、一実施形態において、抗体は、ＣＤ３に結合する
ことができる２つの抗原結合領域、例えば、ＣＤ３に結合する２つの同一の結合領域を有
する。例えば、別の実施形態において、抗体は、ＣＤ３０に結合する２つの抗原結合領域
、例えば、ＣＤ３０に結合する２つの同一の結合領域を有する。追加の抗原結合領域は、
例えば、定常領域に共有結合したｓｃＦｖの形態で存在し得る。
【0088】
好ましい実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。二重
特異性抗体の多くの異なるフォーマット及び使用が当該技術分野で既知であり、Ｋｏｎｔ
ｅｒｍａｎｎ；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２０１５ Ｊｕｌ；２０（７）：
８３８－４７及び；ＭＡｂｓ，２０１２ Ｍａｒ－Ａｐｒ；４（２）：１８２－９７によ
って、並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉ
ｓｃｏｖ １８（８）５８５－６０８によって概説された。本発明による二重特異性抗体
は、それを産生する任意の特定の二重特異性フォーマット又は方法に限定されない場合が
ある。
特異性抗体の多くの異なるフォーマット及び使用が当該技術分野で既知であり、Ｋｏｎｔ
ｅｒｍａｎｎ；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２０１５ Ｊｕｌ；２０（７）：
８３８－４７及び；ＭＡｂｓ，２０１２ Ｍａｒ－Ａｐｒ；４（２）：１８２－９７によ
って、並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉ
ｓｃｏｖ １８（８）５８５－６０８によって概説された。本発明による二重特異性抗体
は、それを産生する任意の特定の二重特異性フォーマット又は方法に限定されない場合が
ある。
【0089】
本発明で使用され得る二重特異性抗体分子の例は、（ｉ）異なる抗原結合領域を含む２
つのアームを有する単一抗体、（ｉｉ）例えば、追加のペプチドリンカーによってタンデ
ムに結合した２つのｓｃＦｖを介して、２つの異なる標的に特異性を有する一本鎖抗体、
（ｉｉｉ）各軽鎖及び重鎖が短いペプチド結合を通してタンデムに２つの可変ドメインを
含む二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌ
ｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉ（商標））Ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌ
ｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））、（ｉｖ）化学的に結合した二重特異性（Ｆ
ａｂ’）２フラグメント、（ｖ）標的抗原の各々について２つの結合部位を有する四価二
重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合体である、Ｔａｎｄａｂ、（ｖ
ｉ）多価分子をもたらすｓｃＦｖのダイアボディとの組み合わせである、フレキシボディ
、（ｖｉｉ）Ｆａｂに適用されるとき、異なるＦａｂフラグメントに結合した２つの同一
のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質をもたらすことができる、
プロテインキナーゼＡにおける「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる
「ドックアンドロック」分子、（ｖｉｉｉ）例えば、ヒトＦａｂアームの両方の末端に融
合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子、並びに（ｉｘ）ダイアボディ
を含む。
つのアームを有する単一抗体、（ｉｉ）例えば、追加のペプチドリンカーによってタンデ
ムに結合した２つのｓｃＦｖを介して、２つの異なる標的に特異性を有する一本鎖抗体、
（ｉｉｉ）各軽鎖及び重鎖が短いペプチド結合を通してタンデムに２つの可変ドメインを
含む二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌ
ｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉ（商標））Ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌ
ｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））、（ｉｖ）化学的に結合した二重特異性（Ｆ
ａｂ’）２フラグメント、（ｖ）標的抗原の各々について２つの結合部位を有する四価二
重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合体である、Ｔａｎｄａｂ、（ｖ
ｉ）多価分子をもたらすｓｃＦｖのダイアボディとの組み合わせである、フレキシボディ
、（ｖｉｉ）Ｆａｂに適用されるとき、異なるＦａｂフラグメントに結合した２つの同一
のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質をもたらすことができる、
プロテインキナーゼＡにおける「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる
「ドックアンドロック」分子、（ｖｉｉｉ）例えば、ヒトＦａｂアームの両方の末端に融
合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子、並びに（ｉｘ）ダイアボディ
を含む。
【0090】
異なるクラスの二重特異性抗体の更なる例としては、これらに限定されないが、（ｉ）
ヘテロ二量体化を強制する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、（ｉｉ）分子の
２つ側面が各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメ
ントの一部を含有する、組換えＩｇＧ様二重標的化分子、（ｉｉｉ）全長ＩｇＧ抗体が、
追加のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合している、ＩｇＧ融合分
子、（ｉｖ）一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、
又はその一部に融合している、Ｆｃ融合分子、（ｖ）異なるＦａｂフラグメントが、一緒
に融合している、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合している、Ｆａｂ融
合分子、並びに（ｖｉ）異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗
体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が、互いに又は重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、
若しくはその一部に融合した別のタンパク質若しくは担体分子に融合している、ｓｃＦｖ
及びダイアボディベースの重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が挙げられる
。
ヘテロ二量体化を強制する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、（ｉｉ）分子の
２つ側面が各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメ
ントの一部を含有する、組換えＩｇＧ様二重標的化分子、（ｉｉｉ）全長ＩｇＧ抗体が、
追加のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合している、ＩｇＧ融合分
子、（ｉｖ）一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、
又はその一部に融合している、Ｆｃ融合分子、（ｖ）異なるＦａｂフラグメントが、一緒
に融合している、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合している、Ｆａｂ融
合分子、並びに（ｖｉ）異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗
体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が、互いに又は重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、
若しくはその一部に融合した別のタンパク質若しくは担体分子に融合している、ｓｃＦｖ
及びダイアボディベースの重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が挙げられる
。
【0091】
相補的ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子の例としては、これらに限定されない
が、トリオマブ／クアドローマ分子（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ、ＷＯ２０１１／０６９１０４）、いわゆるノブ－イントゥ
－ホール分子（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＷＯ９８／５０４３１）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒ
ｏｃｈｅ、ＷＯ２０１１／１１７３２９）、及び静電適合分子（Ａｍｇｅｎ、ＥＰ１８７
０４５９及びＷＯ２００９／０８９００４、Ｃｈｕｇａｉ、ＵＳ２０１０／００１５５１
３３、Ｏｎｃｏｍｅｄ、ＷＯ２０１０／１２９３０４）、ＬＵＺ－Ｙ分子（Ｇｅｎｅｎｔ
ｅｃｈ、Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７（５２
）：４３３３１－９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３９７８６９．Ｅｐ
ｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １）、ＤＩＧ－ボディ及びＰＩＧ－ボディ分子（Ｐｈａｒｍａ
ｂｃｉｎｅ、ＷＯ２０１０／１３４６６６、ＷＯ２０１４／０８１２０２）、鎖交換操作
ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）分子（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、ＷＯ２００７／１１
０２０５）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ分子（Ｍｅｒｕｓ、ＷＯ２０１３／１５７９５３）、Ｆ
ｃΔＡｄｐ分子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、ＷＯ２０１０／１５７９２）、二重特異性ＩｇＧ
１及びＩｇＧ２分子（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ、ＷＯ１１／１４３５４５）、Ａｚｙｍ
ｅｔｒｉｃ足場分子（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ、ＷＯ２０１２／０５８７６８）
、ｍＡｂ－Ｆｖ分子（Ｘｅｎｃｏｒ、ＷＯ２０１１０２８９５２）、二価二重特異性抗体
（ＷＯ２００９／０８０２５４）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（Ｇｅｎｍａ
ｂ Ａ／Ｓ、ＷＯ２０１１／１３１７４６）が挙げられる。
が、トリオマブ／クアドローマ分子（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ、ＷＯ２０１１／０６９１０４）、いわゆるノブ－イントゥ
－ホール分子（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＷＯ９８／５０４３１）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒ
ｏｃｈｅ、ＷＯ２０１１／１１７３２９）、及び静電適合分子（Ａｍｇｅｎ、ＥＰ１８７
０４５９及びＷＯ２００９／０８９００４、Ｃｈｕｇａｉ、ＵＳ２０１０／００１５５１
３３、Ｏｎｃｏｍｅｄ、ＷＯ２０１０／１２９３０４）、ＬＵＺ－Ｙ分子（Ｇｅｎｅｎｔ
ｅｃｈ、Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７（５２
）：４３３３１－９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３９７８６９．Ｅｐ
ｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １）、ＤＩＧ－ボディ及びＰＩＧ－ボディ分子（Ｐｈａｒｍａ
ｂｃｉｎｅ、ＷＯ２０１０／１３４６６６、ＷＯ２０１４／０８１２０２）、鎖交換操作
ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）分子（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、ＷＯ２００７／１１
０２０５）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ分子（Ｍｅｒｕｓ、ＷＯ２０１３／１５７９５３）、Ｆ
ｃΔＡｄｐ分子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、ＷＯ２０１０／１５７９２）、二重特異性ＩｇＧ
１及びＩｇＧ２分子（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ、ＷＯ１１／１４３５４５）、Ａｚｙｍ
ｅｔｒｉｃ足場分子（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ、ＷＯ２０１２／０５８７６８）
、ｍＡｂ－Ｆｖ分子（Ｘｅｎｃｏｒ、ＷＯ２０１１０２８９５２）、二価二重特異性抗体
（ＷＯ２００９／０８０２５４）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（Ｇｅｎｍａ
ｂ Ａ／Ｓ、ＷＯ２０１１／１３１７４６）が挙げられる。
【0092】
組換えＩｇＧ様二重標的化分子の例としては、限定されないが、二重標的化（ＤＴ）－
Ｉｇ分子（ＷＯ２００９／０５８３８３）、ツーインワン抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂ
ｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３，１６１０－１６１４．
）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓ
ｔａｒ、ＷＯ２００８／００３１１６）、Ｚｙｂｏｄｙ分子（Ｚｙｎｇｅｎｉａ、ＬａＦ
ｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１３ Ｍａｒ－Ａｐｒ；５（２）：２０８－１８
）、共通の軽鎖でのアプローチ（Ｃｒｕｃｅｌｌ／Ｍｅｒｕｓ、ＵＳ７，２６２，０２８
）、カッパ／ラムダボディ（商標）分子（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ、ＷＯ２０１２／０２３０
５３）、及びＣｏｖＸ－ボディ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ，Ｖ
．Ｒ．，ｅｔ ａｌ ２００７．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７，５
０１－５０６．）が挙げられる。
Ｉｇ分子（ＷＯ２００９／０５８３８３）、ツーインワン抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂ
ｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３，１６１０－１６１４．
）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓ
ｔａｒ、ＷＯ２００８／００３１１６）、Ｚｙｂｏｄｙ分子（Ｚｙｎｇｅｎｉａ、ＬａＦ
ｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１３ Ｍａｒ－Ａｐｒ；５（２）：２０８－１８
）、共通の軽鎖でのアプローチ（Ｃｒｕｃｅｌｌ／Ｍｅｒｕｓ、ＵＳ７，２６２，０２８
）、カッパ／ラムダボディ（商標）分子（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ、ＷＯ２０１２／０２３０
５３）、及びＣｏｖＸ－ボディ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ，Ｖ
．Ｒ．，ｅｔ ａｌ ２００７．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７，５
０１－５０６．）が挙げられる。
【0093】
ＩｇＧ融合分子の例としては、これらに限定されないが、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）
－Ｉｇ分子（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳ７，６１２，１８１）、二重ドメインダブルヘッド抗体
（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ、ＷＯ２０１０／０２２６９２３）
、ＩｇＧ様二重特異性分子（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（２）：１９１－８）、
Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ．２００９ Ｏｃｔ ３０；３９３（３）：６７２－９２）、及びＢｓＡｂ分子（Ｚ
ｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＷＯ２０１０／１１１６２５）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ分子（Ｂｉ
ｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、ＵＳ００／７９５１９１８）、ｓｃＦｖ融合分子（Ｎｏｖａｒｔｉ
ｓ）、ｓｃＦｖ融合分子（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｄａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｃ
Ｎ／１０２２５０２４６）、並びにＴｖＡｂ分子（Ｒｏｃｈｅ、ＷＯ２０１２／０２５５
２５、ＷＯ２０１２／０２５５３０）が挙げられる。
－Ｉｇ分子（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳ７，６１２，１８１）、二重ドメインダブルヘッド抗体
（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ、ＷＯ２０１０／０２２６９２３）
、ＩｇＧ様二重特異性分子（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ
ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（２）：１９１－８）、
Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ．２００９ Ｏｃｔ ３０；３９３（３）：６７２－９２）、及びＢｓＡｂ分子（Ｚ
ｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＷＯ２０１０／１１１６２５）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ分子（Ｂｉ
ｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、ＵＳ００／７９５１９１８）、ｓｃＦｖ融合分子（Ｎｏｖａｒｔｉ
ｓ）、ｓｃＦｖ融合分子（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｄａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｃ
Ｎ／１０２２５０２４６）、並びにＴｖＡｂ分子（Ｒｏｃｈｅ、ＷＯ２０１２／０２５５
２５、ＷＯ２０１２／０２５５３０）が挙げられる。
【0094】
Ｆｃ融合分子の例としては、これらに限定されないが、ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合体（Ｐｅａ
ｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．１９９７ Ｓｅｐ
；４２（６）：１１７９－８８）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳ
ｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．ＡＡ
ＣＲ １００ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２００９（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃５
４６５）、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ、ＷＯ２０１０／１１１６２５）、二重親
和性再標的化技術（ＦｃベースＤＡＲＴ）分子（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、ＷＯ２００８
／１５７３７９、ＷＯ２０１０／０８０５３８）、及び二重（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂ分子
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ－Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
ｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．１９９７ Ｓｅｐ
；４２（６）：１１７９－８８）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳ
ｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．ＡＡ
ＣＲ １００ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２００９（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃５
４６５）、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ、ＷＯ２０１０／１１１６２５）、二重親
和性再標的化技術（ＦｃベースＤＡＲＴ）分子（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、ＷＯ２００８
／１５７３７９、ＷＯ２０１０／０８０５３８）、及び二重（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂ分子
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ－Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
【0095】
Ｆａｂ融合二重特異性抗体の例としては、これらに限定されないが、Ｆ（ａｂ）２分子
（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ、Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８
Ｆｅｂ １５；１６０（４）：１６７７－８６．）、二重作用又はＢｉｓ－Ｆａｂ分子（
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３
，１６１０－１６１４．）、ドック－アンド－ロック（ＤＮＬ）分子（ＩｍｍｕｎｏＭｅ
ｄｉｃｓ、ＷＯ２００３／０７４５６９、ＷＯ２００５／００４８０９）、二価二重特異
性分子（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ，Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００
Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７０５０－７．）、及びＦａｂ－Ｆｖ分子（ＵＣＢ－Ｃ
ｅｌｌｔｅｃｈ、ＷＯ ２００９／０４０５６２ Ａｌ）が挙げられる。
（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ、Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８
Ｆｅｂ １５；１６０（４）：１６７７－８６．）、二重作用又はＢｉｓ－Ｆａｂ分子（
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３
，１６１０－１６１４．）、ドック－アンド－ロック（ＤＮＬ）分子（ＩｍｍｕｎｏＭｅ
ｄｉｃｓ、ＷＯ２００３／０７４５６９、ＷＯ２００５／００４８０９）、二価二重特異
性分子（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ，Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００
Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７０５０－７．）、及びＦａｂ－Ｆｖ分子（ＵＣＢ－Ｃ
ｅｌｌｔｅｃｈ、ＷＯ ２００９／０４０５６２ Ａｌ）が挙げられる。
【0096】
ｓｃＦｖ－、ダイアボディ－ベース、及びドメイン抗体の例としては、これらに限定さ
れないが、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、ＷＯ
２００５／０６１５４７）、タンデムダイアボディ分子（ＴａｎｄＡｂ）（Ａｆｆｉｍｅ
ｄ）Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００
４ Ａｐｒ；１７（４）：３５７－６６．）、ＤＡＲＴ分子（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、
ＷＯ２００８／１５７３７９、ＷＯ２０１０／０８０５３８）、一本鎖ダイアボディ分子
（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ａｐｒ ３；４２５（３）：４７
９－８４）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブ
ミンｓｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＷＯ２０１０／０５９３１５）、及びＣＯＭ
ＢＯＤＹ分子（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ａｕｇ；８８（６）：６６７－７５．）、二重標的化ナ
ノボディ（Ａｂｌｙｎｘ、Ｈｍｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１０）、並
びに二重標的化重鎖単一ドメイン抗体が挙げられる。
れないが、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、ＷＯ
２００５／０６１５４７）、タンデムダイアボディ分子（ＴａｎｄＡｂ）（Ａｆｆｉｍｅ
ｄ）Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００
４ Ａｐｒ；１７（４）：３５７－６６．）、ＤＡＲＴ分子（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、
ＷＯ２００８／１５７３７９、ＷＯ２０１０／０８０５３８）、一本鎖ダイアボディ分子
（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ａｐｒ ３；４２５（３）：４７
９－８４）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブ
ミンｓｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＷＯ２０１０／０５９３１５）、及びＣＯＭ
ＢＯＤＹ分子（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ａｕｇ；８８（６）：６６７－７５．）、二重標的化ナ
ノボディ（Ａｂｌｙｎｘ、Ｈｍｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１０）、並
びに二重標的化重鎖単一ドメイン抗体が挙げられる。
【0097】
一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、制御されたＦａｂ－アーム交換（Ｗ
Ｏ２０１１／１３１７４６（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されるなど）を介して得られたダイア
ボディ、クロスボディ、又は二重特異性抗体である。
Ｏ２０１１／１３１７４６（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されるなど）を介して得られたダイア
ボディ、クロスボディ、又は二重特異性抗体である。
【0098】
一実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（
Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ、ＷＯ２０１１／１３１７４６）である。
Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ、ＷＯ２０１１／１３１７４６）である。
【0099】
本発明の二重特異性などの、多重特異性抗体は、任意のアイソタイプであり得る。例示
的なアイソタイプとしては、これらに限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ
３、及びＩｇＧ４アイソタイプのいずれかが挙げられる。好ましくは、抗体は、例に示さ
れるように、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであるように選択され得る。ヒト軽鎖定常領域、
カッパ若しくはラムダのいずれか、又は両方、例えば、配列番号５３及び５４に記載され
る配列が使用され得る。例えば、一実施形態において、ＣＤ３０結合に関与する軽鎖は、
カッパ定常領域を含み、ＣＤ３結合に関与する軽鎖は、ラムダ定常領域を含む。一実施形
態において、本発明の抗体の両方の重鎖は、ＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態に
おいて、二重特異性抗体の２つの重鎖は、それぞれ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４アイソタイプ
である。好ましくは、二重特異性抗体は、例に示されるように、ヒトＩｇＧ１アイソタイ
プであるように選択され得る。任意に、好ましくは、選択されたアイソタイプの重鎖及び
そのＦｃ領域配列は、好ましくはヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域において、二重
特異性抗体の生成を可能にするように、かつ／又は不活性を導入するように修飾され得る
。
的なアイソタイプとしては、これらに限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ
３、及びＩｇＧ４アイソタイプのいずれかが挙げられる。好ましくは、抗体は、例に示さ
れるように、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであるように選択され得る。ヒト軽鎖定常領域、
カッパ若しくはラムダのいずれか、又は両方、例えば、配列番号５３及び５４に記載され
る配列が使用され得る。例えば、一実施形態において、ＣＤ３０結合に関与する軽鎖は、
カッパ定常領域を含み、ＣＤ３結合に関与する軽鎖は、ラムダ定常領域を含む。一実施形
態において、本発明の抗体の両方の重鎖は、ＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態に
おいて、二重特異性抗体の２つの重鎖は、それぞれ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４アイソタイプ
である。好ましくは、二重特異性抗体は、例に示されるように、ヒトＩｇＧ１アイソタイ
プであるように選択され得る。任意に、好ましくは、選択されたアイソタイプの重鎖及び
そのＦｃ領域配列は、好ましくはヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域において、二重
特異性抗体の生成を可能にするように、かつ／又は不活性を導入するように修飾され得る
。
【0100】
一実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、第１及び第２のＦｃポリペプチドか
らなるＦｃ領域を含む。
らなるＦｃ領域を含む。
【0101】
一実施形態において、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域は、同じポリペ
プチド鎖内に含まれ、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域は、同じポリペプ
チド鎖内に含まれる。
プチド鎖内に含まれ、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域は、同じポリペプ
チド鎖内に含まれる。
【0102】
第１及び第２のＦｃポリペプチドは、各々、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４
、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、若しくはＩｇＡアイソタイプ、又は混合アイソタイプなどの
、任意のヒトアイソタイプを含む、任意のアイソタイプであり得る。好ましくは、Ｆｃ領
域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプ、又は混合アイソタイ
プである。一実施形態において、当該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、若しくはＩｇＡアイソタイプ、又は混合アイソタイプなどの
、任意のヒトアイソタイプを含む、任意のアイソタイプであり得る。好ましくは、Ｆｃ領
域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプ、又は混合アイソタイ
プである。一実施形態において、当該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
【0103】
更なる実施形態において、多重特異性抗体は、本明細書で定義される全長抗体である。
【0104】
本発明による抗体は、抗体を不活性、又は非活性化抗体にするＦｃ領域における修飾を
含み得る。したがって、本明細書に開示される抗体において、一方又は両方の重鎖は、抗
体が、当該修飾を含まないことを除いて、同一である抗体と比較してより低い程度でＦｃ
媒介性エフェクター機能を誘導するように修飾され得る。Ｆｃ媒介性エフェクター機能は
、Ｔ細胞上でのＦｃ媒介性ＣＤ６９発現（すなわち、例えば、ＷＯ２０１５／００１０８
５に記載される、ＣＤ３抗体媒介性、Ｆｃγ受容体依存的ＣＤ３架橋の結果としてのＣＤ
６９発現）を決定することによって、Ｆｃγ受容体に結合することによって、Ｃ１ｑに結
合することによって、又はＦｃγＲのＦｃ媒介性架橋の誘導によって測定され得る。特に
、重鎖定常配列は、Ｆｃ媒介性ＣＤ６９発現が、野生型（非修飾）抗体と比較されるとき
、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、少なくとも９９％、又は１００％低減するように修飾され得、当該Ｆｃ媒介
性ＣＤ６９発現は、ＰＢＭＣベースの機能アッセイにおいて、例えば、ＷＯ２０１５／０
０１０８５の実施例３に記載されるフローサイトメトリーによって決定される。重鎖及び
軽鎖定常配列の修飾はまた、当該抗体へのＣ１ｑの低減した結合をもたらし得る。非修飾
抗体と比較して、低減は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％であり得、Ｃ１ｑ結合は、ＥＬＩＳＡ
によって決定され得る。更に、Ｆｃ領域は、当該抗体が、例えば、曲線の線形部分におい
て、非修飾抗体と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％低減したＦｃ媒
介性Ｔ細胞増殖を媒介するように修飾され得、当該Ｔ細胞増殖は、ＰＢＭＣベースの機能
アッセイにおいて測定される。
含み得る。したがって、本明細書に開示される抗体において、一方又は両方の重鎖は、抗
体が、当該修飾を含まないことを除いて、同一である抗体と比較してより低い程度でＦｃ
媒介性エフェクター機能を誘導するように修飾され得る。Ｆｃ媒介性エフェクター機能は
、Ｔ細胞上でのＦｃ媒介性ＣＤ６９発現（すなわち、例えば、ＷＯ２０１５／００１０８
５に記載される、ＣＤ３抗体媒介性、Ｆｃγ受容体依存的ＣＤ３架橋の結果としてのＣＤ
６９発現）を決定することによって、Ｆｃγ受容体に結合することによって、Ｃ１ｑに結
合することによって、又はＦｃγＲのＦｃ媒介性架橋の誘導によって測定され得る。特に
、重鎖定常配列は、Ｆｃ媒介性ＣＤ６９発現が、野生型（非修飾）抗体と比較されるとき
、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、少なくとも９９％、又は１００％低減するように修飾され得、当該Ｆｃ媒介
性ＣＤ６９発現は、ＰＢＭＣベースの機能アッセイにおいて、例えば、ＷＯ２０１５／０
０１０８５の実施例３に記載されるフローサイトメトリーによって決定される。重鎖及び
軽鎖定常配列の修飾はまた、当該抗体へのＣ１ｑの低減した結合をもたらし得る。非修飾
抗体と比較して、低減は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％であり得、Ｃ１ｑ結合は、ＥＬＩＳＡ
によって決定され得る。更に、Ｆｃ領域は、当該抗体が、例えば、曲線の線形部分におい
て、非修飾抗体と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％低減したＦｃ媒
介性Ｔ細胞増殖を媒介するように修飾され得、当該Ｔ細胞増殖は、ＰＢＭＣベースの機能
アッセイにおいて測定される。
【0105】
Ｆｃ媒介性エフェクター機能を排除するために、アミノ酸置換、及びそれらの組み合わ
せが、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の定常重鎖領域に導入された、広範囲の異なる非活性化
抗体フォーマットが開発されている（例えば、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ２０１９ Ｄｅｃ；８（４）：５５、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ，２０２０ Ｎｏｖ １７；９（４）：６４；２９（１０）：４５７－６６、Ｓｈｉ
ｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９
）：６５９１－６０４）。
せが、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の定常重鎖領域に導入された、広範囲の異なる非活性化
抗体フォーマットが開発されている（例えば、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ２０１９ Ｄｅｃ；８（４）：５５、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ，２０２０ Ｎｏｖ １７；９（４）：６４；２９（１０）：４５７－６６、Ｓｈｉ
ｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９
）：６５９１－６０４）。
【0106】
例えば、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体において、修飾され得るアミノ酸位置の例としては
、Ｌ２３４及びＬ２３５位が挙げられる。一実施形態において、第１及び／又は第２のＦ
ｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＬ２３４及び／又はＬ２３５位のアミノ酸
に対応するアミノ酸の置換を含み、置換は、好ましくは、それぞれ、Ｆ及びＥへの置換で
あり、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである。
、Ｌ２３４及びＬ２３５位が挙げられる。一実施形態において、第１及び／又は第２のＦ
ｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＬ２３４及び／又はＬ２３５位のアミノ酸
に対応するアミノ酸の置換を含み、置換は、好ましくは、それぞれ、Ｆ及びＥへの置換で
あり、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである。
【0107】
アミノ酸位置Ｌ２３４及びＬ２３５の修飾に加えて、更なる位置が修飾され得ることが
理解される。よって、更なる実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、そ
れぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を
含み、第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＲへの置換である
。
理解される。よって、更なる実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、そ
れぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を
含み、第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＲへの置換である
。
【0108】
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４及び
Ｌ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＲへの置換である。
Ｌ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＲへの置換である。
【0109】
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４及び
Ｌ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び／又は
第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する
アミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＡへの置換である。
Ｌ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び／又は
第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する
アミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＡへの置換である。
【0110】
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４及び
Ｌ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＡへの置換である。
Ｌ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ
酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＡへの置換である。
【0111】
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方は、それぞれ、
Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲ
への置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ
２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含む。
Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲ
への置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ
２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含む。
【0112】
更なる実施形態において、第１のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５
、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、第
２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸
に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリ
ングによって定義されるとおりである。
、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、第
２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸
に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリ
ングによって定義されるとおりである。
【0113】
例えば、そのようなＦｃ領域置換を有する定常領域は、とりわけ、そのような置換を有
さない、配列番号４４と比較することができる、配列番号４５、４６、４９、５０、５１
、及び５２に提供される。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４５、４６、
４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列を含む。
さない、配列番号４４と比較することができる、配列番号４５、４６、４９、５０、５１
、及び５２に提供される。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４５、４６、
４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列を含む。
【0114】
一実施形態において、本発明の多重特異性又は二重特異性抗体は、異なる第１及び第２
のＣＨ３領域を含むＦｃ領域を含み、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ
二量体相互作用は、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強
い。これらの相互作用及びそれらを達成することができる方法についての詳細は、参照に
よって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０
８６７（Ｇｅｎｍａｂ）に提供される。安定、ヘテロ二量体抗体は、例えば、ＣＨ３領域
における少数のみの非対称的な変異を含有する２つのホモ二量体出発抗体に基づいて、Ｗ
Ｏ２００８／１１９３５３及びＷＯ２０１１／１３１７４６に提供される、いわゆるＦａ
ｂ－アーム交換によって高収率で得ることができる。
のＣＨ３領域を含むＦｃ領域を含み、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ
二量体相互作用は、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強
い。これらの相互作用及びそれらを達成することができる方法についての詳細は、参照に
よって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０
８６７（Ｇｅｎｍａｂ）に提供される。安定、ヘテロ二量体抗体は、例えば、ＣＨ３領域
における少数のみの非対称的な変異を含有する２つのホモ二量体出発抗体に基づいて、Ｗ
Ｏ２００８／１１９３５３及びＷＯ２０１１／１３１７４６に提供される、いわゆるＦａ
ｂ－アーム交換によって高収率で得ることができる。
【0115】
特定の実施形態において、本発明は、当該第１のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇ
Ｇ１重鎖におけるＫ４０９に対応する位置にあるアミノ酸が、Ｒであり、当該第２のＦｃ
ポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＦ４０５に対応する位置にあるアミノ
酸が、Ｌであるか、又はその逆も同様である、抗体を提供する。
Ｇ１重鎖におけるＫ４０９に対応する位置にあるアミノ酸が、Ｒであり、当該第２のＦｃ
ポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＦ４０５に対応する位置にあるアミノ
酸が、Ｌであるか、又はその逆も同様である、抗体を提供する。
【0116】
更なる実施形態において、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置
にあるアミノ酸はＲであり、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置
にあるアミノ酸はＬである。
にあるアミノ酸はＲであり、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置
にあるアミノ酸はＬである。
【0117】
したがって、一実施形態において、第１のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重
鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０
９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つ
は、置換されており、第２のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３
６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群か
ら選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つは、置換されて
おり、第１及び第２のＦｃポリペプチドにおける当該置換は、同じ位置にはなく、アミノ
酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである。例えば、そのようなＦｃ
領域置換を有する定常領域は、とりわけ、そのような置換を有さない、配列番号４４と比
較することができる、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５２に提供される。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５
２からなる群から選択される配列を含む。
鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０
９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つ
は、置換されており、第２のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３
６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群か
ら選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つは、置換されて
おり、第１及び第２のＦｃポリペプチドにおける当該置換は、同じ位置にはなく、アミノ
酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである。例えば、そのようなＦｃ
領域置換を有する定常領域は、とりわけ、そのような置換を有さない、配列番号４４と比
較することができる、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５２に提供される。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５
２からなる群から選択される配列を含む。
【0118】
好ましくは、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ
酸は、Ｌであり、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミ
ノ酸は、Ｒであるか、又はその逆もまた同様である。
酸は、Ｌであり、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミ
ノ酸は、Ｒであるか、又はその逆もまた同様である。
【0119】
よって、一実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方は、それ
ぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、及びＦ４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の
、Ｆ、Ｅ、Ｒ、及びＬへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４
、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５、及びＫ４０９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ａ
、及びＲへの置換を含む。
ぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、及びＦ４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の
、Ｆ、Ｅ、Ｒ、及びＬへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４
、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５、及びＫ４０９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ａ
、及びＲへの置換を含む。
【0120】
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方は、それぞれ、
Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、及びＫ４０９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、
Ｅ、Ｒ、及びＲへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２
３５Ｅ、Ｄ２６５、及びＦ４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ａ、及び
Ｌへの置換を含む。
Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、及びＫ４０９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、
Ｅ、Ｒ、及びＲへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２
３５Ｅ、Ｄ２６５、及びＦ４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ａ、及び
Ｌへの置換を含む。
【0121】
更なる実施形態において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、を含み、
ここで、多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、第１及び第２のＦｃポリペプチドか
らなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含
まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域が、同じポリペプ
チド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位の
アミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、そして、第２のＦｃポ
リペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりであり、そして
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲ
であり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬ
である。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、を含み、
ここで、多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、第１及び第２のＦｃポリペプチドか
らなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含
まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域が、同じポリペプ
チド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位の
アミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、そして、第２のＦｃポ
リペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりであり、そして
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲ
であり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬ
である。
【0122】
更なる実施形態において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、を含む多重特異性抗体に関し、
ここで、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり、そして、第１及び第２のＦｃポリペ
プチドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含
まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域は、同じポリペプ
チド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位の
アミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、そして、第２のＦｃポ
リペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりであり、そして、
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲ
であり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬ
である。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ
３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合
領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域と、を含む多重特異性抗体に関し、
ここで、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり、そして、第１及び第２のＦｃポリペ
プチドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含
まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域は、同じポリペプ
チド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位の
アミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、そして、第２のＦｃポ
リペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりであり、そして、
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲ
であり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬ
である。
【0123】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１７及び１９に記載される重鎖配列、
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
【0124】
更なる実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１７及び１９に記載される重鎖配
列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなり、
当該抗体は、二重特異性抗体である。
列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなり、
当該抗体は、二重特異性抗体である。
【0125】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１７及び３５に記載される重鎖配列、
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
【0126】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５５及び１９に記載される重鎖配列、
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
【0127】
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５５及び３５に記載される重鎖配列、
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
【0128】
なお更なる実施形態において、本発明の抗体は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣ
Ｄ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲである。より更なる実施形態において、本発明の抗体は、ｂｓＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲである。
Ｄ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲである。より更なる実施形態において、本発明の抗体は、ｂｓＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲである。
【0129】
配列番号４４～５２及び５５に列挙される定常領域配列は、Ｃ末端リジン（Ｋ）を含ま
ない。しかしながら、これらのＦｃ領域が由来するヒトにおいて見出される天然に存在す
る配列において、そのようなＣ末端リジンは、オープンリーディングフレームの一部とし
て存在し得る。組換え抗体の細胞培養物産生中に、この末端リジンは、内因性カルボキシ
ペプチダーゼによるタンパク質分解によって切断され得、同じ配列を有するがＣ末端リジ
ンを欠く定常領域をもたらす。抗体の製造目的のために、この末端リジンをコードするＤ
ＮＡは、抗体がリジンなしで産生されるように、配列から省略され得る。抗体をコードす
る配列からのＣ末端リジンの省略は、Ｃ末端リジンの存在に対して抗体の均質性を増加さ
せ得る。末端リジンをコードするか、又はコードしない核酸配列から産生される抗体は、
Ｃ末端リジンの処理の程度が、例えば、ＣＨＯベースの産生系で産生された抗体を使用す
るときに、典型的には高いため、配列において及び機能において実質的に同一である（Ｄ
ｉｃｋ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００８；１００
：１１３２－１１４３）。したがって、本発明による抗体は、本明細書に列挙されるよう
なＣ末端リジンをコードすることなく又は有することなく生成することができることが理
解される。よって、製造目的のために、Ｃ末端リジンを有することなく抗体を生成するこ
とができる。
ない。しかしながら、これらのＦｃ領域が由来するヒトにおいて見出される天然に存在す
る配列において、そのようなＣ末端リジンは、オープンリーディングフレームの一部とし
て存在し得る。組換え抗体の細胞培養物産生中に、この末端リジンは、内因性カルボキシ
ペプチダーゼによるタンパク質分解によって切断され得、同じ配列を有するがＣ末端リジ
ンを欠く定常領域をもたらす。抗体の製造目的のために、この末端リジンをコードするＤ
ＮＡは、抗体がリジンなしで産生されるように、配列から省略され得る。抗体をコードす
る配列からのＣ末端リジンの省略は、Ｃ末端リジンの存在に対して抗体の均質性を増加さ
せ得る。末端リジンをコードするか、又はコードしない核酸配列から産生される抗体は、
Ｃ末端リジンの処理の程度が、例えば、ＣＨＯベースの産生系で産生された抗体を使用す
るときに、典型的には高いため、配列において及び機能において実質的に同一である（Ｄ
ｉｃｋ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００８；１００
：１１３２－１１４３）。したがって、本発明による抗体は、本明細書に列挙されるよう
なＣ末端リジンをコードすることなく又は有することなく生成することができることが理
解される。よって、製造目的のために、Ｃ末端リジンを有することなく抗体を生成するこ
とができる。
【0130】
代替の実施形態において、本発明による多重特異性抗体は、Ｆｃ領域を含む古典的な全
長抗体ではない。例えば、一実施形態において、
（ｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、Ｆａｂであるか、
（ｉｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか、
（ｉｉｉ）ＣＤ３０結合領域は、Ｆａｂであり、ＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか
、又は
（ｉｖ）ＣＤ３０結合領域は、ｓｃＦｖであり、ＣＤ３結合領域は、Ｆａｂである。
長抗体ではない。例えば、一実施形態において、
（ｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、Ｆａｂであるか、
（ｉｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか、
（ｉｉｉ）ＣＤ３０結合領域は、Ｆａｂであり、ＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか
、又は
（ｉｖ）ＣＤ３０結合領域は、ｓｃＦｖであり、ＣＤ３結合領域は、Ｆａｂである。
【0131】
結合、細胞傷害性、及びＴ細胞活性化
ヒトＣＤ３及びヒトＣＤ３０に結合することができる本明細書に記載される、二重特異
性抗体などの、抗体は、ヒトＣＤ３０発現がん細胞にＴ細胞を有利に標的化し、それによ
って当該がん細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘導することができる。
ヒトＣＤ３及びヒトＣＤ３０に結合することができる本明細書に記載される、二重特異
性抗体などの、抗体は、ヒトＣＤ３０発現がん細胞にＴ細胞を有利に標的化し、それによ
って当該がん細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘導することができる。
【0132】
上述のように、好ましくは、本発明による抗体は、不活性であり、更に、抗体は、以下
の特徴のうちの１つ以上を含む：
ａ）例えば、本明細書における実施例に記載される例について、フローサイトメトリーを
使用して試験されるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＤＬ－４０細胞、
ＫＡＲＰＡＳ－２９９細胞、Ｌ－８２細胞、ＳＲ－７８６細胞、Ｌ－５４０細胞、ＫＭ－
Ｈ２細胞、Ｌ－１２３６細胞、ＪＶＭ－２細胞、ＨＨ細胞、ＮＣＥＢ－１細胞、及び／又
はＨＤＬＭ－２細胞などの、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞に結合することができ、
ｂ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製され
たＰＢＭＣ、ＡＤＣＣエフェクター細胞、又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用する
とき、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞の濃度依存的細胞傷害性を媒介することができ、
ｃ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製され
たＰＢＭＣ又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用するとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、
Ｌ－４２８細胞、ＫＭ－Ｈ２細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－
２細胞からなる群から選択される１つ以上のヒトＣＤ３０発現腫瘍細胞株の濃度依存的細
胞傷害性を媒介することができ、
ｄ）例えば、本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０
発現ヒト腫瘍細胞の存在下でインビトロでＴ細胞の増殖を誘導することができ、
ｅ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１
細胞、Ｌ－４２８細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－２細胞からなる群から選択され
る１つ以上のＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株の存在下でインビトロでＴ細胞を活性化するこ
とができ、
ｆ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、サイトカイン及びグラ
ンザイムＢのＴ細胞によるインビトロでの用量依存的産生を誘導することができ、
ｇ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０が活性化され
たＴ細胞の亜集団上で発現されても、Ｔ細胞のフラトリサイドをもたらさないことができ
、かつ／あるいは
ｈ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ｓＣＤ３０の存在下で
もＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することができる。
の特徴のうちの１つ以上を含む：
ａ）例えば、本明細書における実施例に記載される例について、フローサイトメトリーを
使用して試験されるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＤＬ－４０細胞、
ＫＡＲＰＡＳ－２９９細胞、Ｌ－８２細胞、ＳＲ－７８６細胞、Ｌ－５４０細胞、ＫＭ－
Ｈ２細胞、Ｌ－１２３６細胞、ＪＶＭ－２細胞、ＨＨ細胞、ＮＣＥＢ－１細胞、及び／又
はＨＤＬＭ－２細胞などの、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞に結合することができ、
ｂ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製され
たＰＢＭＣ、ＡＤＣＣエフェクター細胞、又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用する
とき、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞の濃度依存的細胞傷害性を媒介することができ、
ｃ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製され
たＰＢＭＣ又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用するとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、
Ｌ－４２８細胞、ＫＭ－Ｈ２細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－
２細胞からなる群から選択される１つ以上のヒトＣＤ３０発現腫瘍細胞株の濃度依存的細
胞傷害性を媒介することができ、
ｄ）例えば、本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０
発現ヒト腫瘍細胞の存在下でインビトロでＴ細胞の増殖を誘導することができ、
ｅ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１
細胞、Ｌ－４２８細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－２細胞からなる群から選択され
る１つ以上のＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株の存在下でインビトロでＴ細胞を活性化するこ
とができ、
ｆ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、サイトカイン及びグラ
ンザイムＢのＴ細胞によるインビトロでの用量依存的産生を誘導することができ、
ｇ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０が活性化され
たＴ細胞の亜集団上で発現されても、Ｔ細胞のフラトリサイドをもたらさないことができ
、かつ／あるいは
ｈ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ｓＣＤ３０の存在下で
もＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することができる。
【0133】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載さ
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．０２０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０２５μｇ／ｍｌ未
満などの、０．０３０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０３５μｇ／ｍｌ未満などの、０．
０４０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０４５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０５０μｇ／ｍ
ｌ未満のＥＣ５０濃度でＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する。
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．０２０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０２５μｇ／ｍｌ未
満などの、０．０３０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０３５μｇ／ｍｌ未満などの、０．
０４０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０４５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０５０μｇ／ｍ
ｌ未満のＥＣ５０濃度でＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する。
【0134】
更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記
載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって
測定してアッセイされるとき、９０％を超えるような、８５％を超えるなどの、８０％を
超えるＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する場合、最大の溶解を有する。
載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって
測定してアッセイされるとき、９０％を超えるような、８５％を超えるなどの、８０％を
超えるＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する場合、最大の溶解を有する。
【0135】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載さ
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．０３μｇ／ｍｌ未満のような、０．０３５μｇ／ｍｌ未満
などの、０．０４μｇ／ｍｌ未満のような、０．０４５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０５
μｇ／ｍｌ未満のＣＤ２５発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を誘導す
る。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に
記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによっ
て測定してアッセイされるとき、０．０００７μｇ／ｍｌ未満のような、０．０００８μ
ｇ／ｍｌ未満などの、０．０００９μｇ／ｍｌ未満のような、０．００１μｇ／ｍｌ未満
などの、０．００５μｇ／ｍｌ未満のＣＤ２５発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ８＋ Ｔ
細胞活性化を誘導する。
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．０３μｇ／ｍｌ未満のような、０．０３５μｇ／ｍｌ未満
などの、０．０４μｇ／ｍｌ未満のような、０．０４５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０５
μｇ／ｍｌ未満のＣＤ２５発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を誘導す
る。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に
記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによっ
て測定してアッセイされるとき、０．０００７μｇ／ｍｌ未満のような、０．０００８μ
ｇ／ｍｌ未満などの、０．０００９μｇ／ｍｌ未満のような、０．００１μｇ／ｍｌ未満
などの、０．００５μｇ／ｍｌ未満のＣＤ２５発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ８＋ Ｔ
細胞活性化を誘導する。
【0136】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載さ
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．０００９μｇ／ｍｌ未満のような、０．００１μｇ／ｍｌ
未満などの、０．００２μｇ／ｍｌ未満のような、０．００３μｇ／ｍｌ未満などの、０
．００４μｇ／ｍｌ未満のＣＤ６９発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化
を誘導する。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において
実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリ
ーによって測定してアッセイされるとき、０．００１５μｇ／ｍｌ未満のような、０．０
０２０μｇ／ｍｌ未満などの、０．００２５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００３０μｇ
／ｍｌ未満などの、０．００３５μｇ／ｍｌ未満のＣＤ６９発現のＥＣ５０濃度を有する
ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．０００９μｇ／ｍｌ未満のような、０．００１μｇ／ｍｌ
未満などの、０．００２μｇ／ｍｌ未満のような、０．００３μｇ／ｍｌ未満などの、０
．００４μｇ／ｍｌ未満のＣＤ６９発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化
を誘導する。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において
実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリ
ーによって測定してアッセイされるとき、０．００１５μｇ／ｍｌ未満のような、０．０
０２０μｇ／ｍｌ未満などの、０．００２５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００３０μｇ
／ｍｌ未満などの、０．００３５μｇ／ｍｌ未満のＣＤ６９発現のＥＣ５０濃度を有する
ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。
【0137】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載さ
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．００５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００６μｇ／ｍｌ未
満などの、０．００７μｇ／ｍｌ未満のような、０．００８μｇ／ｍｌ未満などの、０．
０１μｇ／ｍｌ未満のＰＤ－１発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を誘
導する。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施
例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーに
よって測定してアッセイされるとき、０．００３μｇ／ｍｌ未満のような、０．００４μ
ｇ／ｍｌ未満などの、０．００５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００６μｇ／ｍｌ未満な
どの、０．００７μｇ／ｍｌ未満のＰＤ－１発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ８＋ Ｔ細
胞活性化を誘導する。
れるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定
してアッセイされるとき、０．００５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００６μｇ／ｍｌ未
満などの、０．００７μｇ／ｍｌ未満のような、０．００８μｇ／ｍｌ未満などの、０．
０１μｇ／ｍｌ未満のＰＤ－１発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を誘
導する。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施
例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーに
よって測定してアッセイされるとき、０．００３μｇ／ｍｌ未満のような、０．００４μ
ｇ／ｍｌ未満などの、０．００５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００６μｇ／ｍｌ未満な
どの、０．００７μｇ／ｍｌ未満のＰＤ－１発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ８＋ Ｔ細
胞活性化を誘導する。
【0138】
アッセイは、当業者に一般的に知られるように行われ得、任意に、４：１のエフェクタ
ー細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比、及び／又は任意に、７２時間のインキュベーション期
間を含み得る。アッセイは、例えば、腫瘍細胞、好ましくは、標識された腫瘍細胞、例え
ば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を提供すること、本明細書に記載される抗体を、好ましくは段階
希釈で添加すること、Ｔ細胞、好ましくは標識されたＴ細胞を、４：１のＥ：Ｔであるエ
フェクター対標的の比で提供し、７２時間インキュベートすること、任意に、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及び／又はＰＤ－１などの関連パラメータについて染色する
こと、並びに最終的に、ＦＡＣＳのようなフローサイトメトリーを使用して細胞を分析す
ることによって実施することができる。生きた細胞及び／又はＴ細胞増殖／活性化％は、
当業者に公知の分析によって得られたデータから計算され得る。
ー細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比、及び／又は任意に、７２時間のインキュベーション期
間を含み得る。アッセイは、例えば、腫瘍細胞、好ましくは、標識された腫瘍細胞、例え
ば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を提供すること、本明細書に記載される抗体を、好ましくは段階
希釈で添加すること、Ｔ細胞、好ましくは標識されたＴ細胞を、４：１のＥ：Ｔであるエ
フェクター対標的の比で提供し、７２時間インキュベートすること、任意に、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及び／又はＰＤ－１などの関連パラメータについて染色する
こと、並びに最終的に、ＦＡＣＳのようなフローサイトメトリーを使用して細胞を分析す
ることによって実施することができる。生きた細胞及び／又はＴ細胞増殖／活性化％は、
当業者に公知の分析によって得られたデータから計算され得る。
【0139】
本発明の抗体の産生
ハイブリッドハイブリドーマ及び化学的複合化方法（Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ（
２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２６：６４９）などの従来の方法は
、本発明の二重特異性抗体などの、多重特異性の調製に使用することができる。異なる重
鎖及び軽鎖からなる、２つの抗体の宿主細胞における共発現は、所望の二重特異性抗体に
加えて、可能な抗体産物の混合物をもたらし、これは次いで、例えば、親和性クロマトグ
ラフィー又は類似の方法によって単離することができる。
ハイブリッドハイブリドーマ及び化学的複合化方法（Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ（
２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２６：６４９）などの従来の方法は
、本発明の二重特異性抗体などの、多重特異性の調製に使用することができる。異なる重
鎖及び軽鎖からなる、２つの抗体の宿主細胞における共発現は、所望の二重特異性抗体に
加えて、可能な抗体産物の混合物をもたらし、これは次いで、例えば、親和性クロマトグ
ラフィー又は類似の方法によって単離することができる。
【0140】
前述のように、異なる抗体構築物の共発現時に、機能的二重特異性産物の形成を優先す
る戦略、例えば、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
１５５：２１９）によって記載される方法も使用することができる。異なる抗体を産生す
るラット及びマウスヒドリドーマの融合は、優先的な種制限重鎖／軽鎖対合のために、限
られた数のヘテロ二量体タンパク質をもたらす。ホモ二量体に対してヘテロ二量体の形成
を促進する別の戦略は、第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチド中の対応す
る空洞に隆起が導入され、ひいては隆起をこれら２つの重鎖の界面で空洞内に配置して、
ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨げる「ノブ－イントゥ－ホール」戦略
である。「隆起」は、第１のポリペプチドの界面からより大きな側鎖で小さなアミノ酸側
鎖を置き換えることによって構築される。隆起と同一又は類似のサイズの補正的「空洞」
は、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖で置き換えることによって、第２のポリペプチ
ドの界面に作製される（米国特許第５，７３１，１６８号）。ＥＰ１８７０４５９（Ｃｈ
ｕｇａｉ）及びＷＯ２００９／０８９００４（Ａｍｇｅｎ）は、宿主細胞における異なる
抗体ドメインの共発現時にヘテロ二量体形成を優先するための他の戦略を記載する。これ
らの方法では、ホモ二量体形成が静電的に好ましくなく、ヘテロ二量体化が静電的に好ま
しいように、両方のＣＨ３ドメインにおいてＣＨ３－ＣＨ３界面を構成する１つ以上の残
基が、荷電アミノ酸で置き換えられる。ＷＯ２００７／１１０２０５（Ｍｅｒｃｋ）は、
ＩｇＡ及びＩｇＧ ＣＨ３ドメイン間の差異がヘテロ二量体化を促進するために利用され
る、更に別の戦略を記載する。
る戦略、例えば、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
１５５：２１９）によって記載される方法も使用することができる。異なる抗体を産生す
るラット及びマウスヒドリドーマの融合は、優先的な種制限重鎖／軽鎖対合のために、限
られた数のヘテロ二量体タンパク質をもたらす。ホモ二量体に対してヘテロ二量体の形成
を促進する別の戦略は、第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチド中の対応す
る空洞に隆起が導入され、ひいては隆起をこれら２つの重鎖の界面で空洞内に配置して、
ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨げる「ノブ－イントゥ－ホール」戦略
である。「隆起」は、第１のポリペプチドの界面からより大きな側鎖で小さなアミノ酸側
鎖を置き換えることによって構築される。隆起と同一又は類似のサイズの補正的「空洞」
は、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖で置き換えることによって、第２のポリペプチ
ドの界面に作製される（米国特許第５，７３１，１６８号）。ＥＰ１８７０４５９（Ｃｈ
ｕｇａｉ）及びＷＯ２００９／０８９００４（Ａｍｇｅｎ）は、宿主細胞における異なる
抗体ドメインの共発現時にヘテロ二量体形成を優先するための他の戦略を記載する。これ
らの方法では、ホモ二量体形成が静電的に好ましくなく、ヘテロ二量体化が静電的に好ま
しいように、両方のＣＨ３ドメインにおいてＣＨ３－ＣＨ３界面を構成する１つ以上の残
基が、荷電アミノ酸で置き換えられる。ＷＯ２００７／１１０２０５（Ｍｅｒｃｋ）は、
ＩｇＡ及びＩｇＧ ＣＨ３ドメイン間の差異がヘテロ二量体化を促進するために利用され
る、更に別の戦略を記載する。
【0141】
二重特異性抗体を産生するための別のインビトロ方法は、ＷＯ２００８／１１９３５３
（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されており、二重特異性抗体は、還元条件下でのインキュベーシ
ョン時に、２つの単一特異性ＩｇＧ４又はＩｇＧ４様抗体間での「Ｆａｂアーム」又は「
半分子」交換（重鎖及び結合した軽鎖の交換）によって形成される。得られる産物は、異
なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。
（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されており、二重特異性抗体は、還元条件下でのインキュベーシ
ョン時に、２つの単一特異性ＩｇＧ４又はＩｇＧ４様抗体間での「Ｆａｂアーム」又は「
半分子」交換（重鎖及び結合した軽鎖の交換）によって形成される。得られる産物は、異
なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。
【0142】
本発明の二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体を調製するための好ましい方法は、以下のス
テップを含む、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ
）に記載される方法を含む：
ａ）Ｆｃ領域を含む第１の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含み；
ｂ）第２のＦｃ領域を含む第２の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含
み、
ここで、第１の抗体が、ＣＤ３０抗体であり、そして、第２の抗体が、ＣＤ３抗体である
か、又はその逆もまた同様であり、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２の
ＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相
互作用の各々よりも強く；
ｃ）当該第１の抗体を当該第２の抗体と一緒に還元条件下でインキュベートし；そして
ｄ）当該二重特異性ＣＤ×ＣＤ３０抗体を得る。
テップを含む、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ
）に記載される方法を含む：
ａ）Ｆｃ領域を含む第１の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含み；
ｂ）第２のＦｃ領域を含む第２の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含
み、
ここで、第１の抗体が、ＣＤ３０抗体であり、そして、第２の抗体が、ＣＤ３抗体である
か、又はその逆もまた同様であり、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２の
ＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相
互作用の各々よりも強く；
ｃ）当該第１の抗体を当該第２の抗体と一緒に還元条件下でインキュベートし；そして
ｄ）当該二重特異性ＣＤ×ＣＤ３０抗体を得る。
【0143】
同様に、本発明は、本発明による多重特異性、例えば、二重特異性抗体を産生するため
の方法に関し、該方法は、
ａ）本明細書に記載されるＣＤ３０結合領域を含む第１のホモ二量体抗体と、本明細書に
記載されるＣＤ３結合領域を含む第２のホモ二量体抗体と、を提供し、ここで、当該抗体
が、Ｆｃ領域を含み、任意に本明細書に記載される更なる特徴を含み、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第
１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ
二量体相互作用の各々よりも強く；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結
合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗
体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む本発明のヘテロ
二量体多重特異性抗体を得る、
ことを含む。
の方法に関し、該方法は、
ａ）本明細書に記載されるＣＤ３０結合領域を含む第１のホモ二量体抗体と、本明細書に
記載されるＣＤ３結合領域を含む第２のホモ二量体抗体と、を提供し、ここで、当該抗体
が、Ｆｃ領域を含み、任意に本明細書に記載される更なる特徴を含み、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第
１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ
二量体相互作用の各々よりも強く；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結
合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗
体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む本発明のヘテロ
二量体多重特異性抗体を得る、
ことを含む。
【0144】
一実施形態において、当該第１の抗体は、当該第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけ
るシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件
下でインキュベートされ、得られるヘテロ二量体抗体における当該第１及び第２の抗体間
のヘテロ二量体相互作用は、３７℃で２４時間後に０．５ｍＭのＧＳＨでＦａｂアーム交
換が発生しないようなものである。
るシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件
下でインキュベートされ、得られるヘテロ二量体抗体における当該第１及び第２の抗体間
のヘテロ二量体相互作用は、３７℃で２４時間後に０．５ｍＭのＧＳＨでＦａｂアーム交
換が発生しないようなものである。
【0145】
理論に限定されることなく、ステップｃ）において、親抗体のヒンジ領域における重鎖
ジスルフィド結合は、低減され、得られるシステインは、次いで、別の親抗体分子のシス
テイン残基と重鎖間ジスルフィド結合を形成することができる（元々は異なる特異性を有
する）。この方法の一実施形態において、ステップｃ）における還元条件は、還元剤、例
えば、以下からなる群から選択される還元剤の添加を含む：２－メルカプトエチルアミン
（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グ
ルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン
、及びβ－メルカプト－エタノール、好ましくは２－メルカプトエチルアミン、ジチオス
レイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される
還元剤。好ましい実施形態において、還元剤は、２－メルカプトエチルアミンである。更
なる実施形態において、ステップｃ）は、例えば、還元剤の除去によって、例えば、脱塩
によって、非還元性又は低還元性になる条件を復元することを含む。
ジスルフィド結合は、低減され、得られるシステインは、次いで、別の親抗体分子のシス
テイン残基と重鎖間ジスルフィド結合を形成することができる（元々は異なる特異性を有
する）。この方法の一実施形態において、ステップｃ）における還元条件は、還元剤、例
えば、以下からなる群から選択される還元剤の添加を含む：２－メルカプトエチルアミン
（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グ
ルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン
、及びβ－メルカプト－エタノール、好ましくは２－メルカプトエチルアミン、ジチオス
レイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される
還元剤。好ましい実施形態において、還元剤は、２－メルカプトエチルアミンである。更
なる実施形態において、ステップｃ）は、例えば、還元剤の除去によって、例えば、脱塩
によって、非還元性又は低還元性になる条件を復元することを含む。
【0146】
更なる態様において、本発明は、以下を含む単一特異性抗体に関する；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒト
ＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここ
で、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載される
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結
合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒト
ＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここ
で、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
【0147】
一実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号１３に記載される配列を含み、
第１の軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載される配列を含む。
第１の軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載される配列を含む。
【0148】
更なる態様において、本発明は、以下を含む単一特異性抗体に関する；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒト
ＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここ
で、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤ
Ｒ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載
されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ
３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２の
Ｆｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒト
ＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここ
で、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリング
によって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
【0149】
一実施形態において、配列番号９におけるＸは、Ｈである。別の実施形態において、配
列番号９におけるＸは、Ｇである。一実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番
号１５に記載される配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載される配列
を含む。
列番号９におけるＸは、Ｇである。一実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番
号１５に記載される配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載される配列
を含む。
【0150】
一実施形態において、上記の単一特異性抗体は、全長抗体である。好ましくは、ヒトＩ
ｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及
びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なく
とも１つは置換されており、好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬで
あるか、又は、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲである。
ｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及
びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なく
とも１つは置換されており、好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬで
あるか、又は、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲである。
【0151】
更なる態様において、本発明は、多重特異性抗体を産生するための方法に関し、該方法
は、
ａ）本明細書における上記のような第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、及び、以下を含む
第２の抗体、を提供するか；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び
ＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に
記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む
ＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第
２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ａへの置換と、を含むＦｃ領域、
又は
本明細書における上記のような第２の単一特異性ＣＤ３抗体、及び、以下を含む第１の
抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び
ＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載さ
れるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む、ＣＤ
３０結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第
２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域；
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては
第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホ
モ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、
Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであり、そして、第２のＣＨ３領域において
、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであるか、又はその逆もまた同様であり；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド
結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そし
て
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の
抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗
体を得る、
ことを含む、方法。
は、
ａ）本明細書における上記のような第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、及び、以下を含む
第２の抗体、を提供するか；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び
ＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に
記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む
ＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第
２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ａへの置換と、を含むＦｃ領域、
又は
本明細書における上記のような第２の単一特異性ＣＤ３抗体、及び、以下を含む第１の
抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び
ＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載さ
れるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む、ＣＤ
３０結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第
２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域；
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては
第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホ
モ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、
Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであり、そして、第２のＣＨ３領域において
、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであるか、又はその逆もまた同様であり；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド
結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そし
て
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の
抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗
体を得る、
ことを含む、方法。
【0152】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される多重特異性抗体を産生するため
の方法に関し、該方法は、
ａ）本明細書に記載される第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、および、以下を含む第２の
抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び
ＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に
記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む
、ＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第
２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては
第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホ
モ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、
Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであり、そして、第２のＣＨ３領域において
、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬである；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド
結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そし
て
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の
抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗
体を得る、
ことを含む。
の方法に関し、該方法は、
ａ）本明細書に記載される第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、および、以下を含む第２の
抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び
ＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に
記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む
、ＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第
２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸
の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するア
ミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては
第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホ
モ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、
Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであり、そして、第２のＣＨ３領域において
、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬである；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド
結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そし
て
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の
抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗
体を得る、
ことを含む。
【0153】
本発明は、本明細書に記載される方法によって得られる多重特異性抗体に更に関する。
【0154】
上記の方法において、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３に結合することができる第１又は第２
のホモ二量体抗体を提供するステップは、以下のステップを含み得る；
－１以上の当該抗体を産生するための発現ベクターを含有する細胞を提供するステップ、
－細胞を１以上の当該抗体を産生させるステップ、その後、
－１又は複数の当該抗体を得て、それによって１以上の当該抗体を提供するステップ。
のホモ二量体抗体を提供するステップは、以下のステップを含み得る；
－１以上の当該抗体を産生するための発現ベクターを含有する細胞を提供するステップ、
－細胞を１以上の当該抗体を産生させるステップ、その後、
－１又は複数の当該抗体を得て、それによって１以上の当該抗体を提供するステップ。
【0155】
この方法の一実施形態において、当該第１及び／又は第２のホモ二量体抗体は、全長抗
体である。
体である。
【0156】
第１及び第２のホモ二量体抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩ
ｇＧ４を含むが、これらに限定されない、任意のアイソタイプであり得る。この方法の一
実施形態において、当該第１及び当該第２のホモ二量体抗体の両方のＦｃ領域は、ＩｇＧ
１アイソタイプである。別の実施形態において、当該ホモ二量体抗体のＦｃ領域の一方は
、ＩｇＧ１アイソタイプであり、他方は、ＩｇＧ４アイソタイプである。後者の実施形態
において、得られる二重特異性抗体は、ＩｇＧ１のＦｃ領域及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含
み、よって、エフェクター機能の活性化に関して興味深い中間体特性を有し得る。
ｇＧ４を含むが、これらに限定されない、任意のアイソタイプであり得る。この方法の一
実施形態において、当該第１及び当該第２のホモ二量体抗体の両方のＦｃ領域は、ＩｇＧ
１アイソタイプである。別の実施形態において、当該ホモ二量体抗体のＦｃ領域の一方は
、ＩｇＧ１アイソタイプであり、他方は、ＩｇＧ４アイソタイプである。後者の実施形態
において、得られる二重特異性抗体は、ＩｇＧ１のＦｃ領域及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含
み、よって、エフェクター機能の活性化に関して興味深い中間体特性を有し得る。
【0157】
更なる実施形態において、ホモ二量体出発抗体のうちの１つは、プロテインＡに結合し
ないように操作されており、よって産物をプロテインＡカラム上に通すことによってヘテ
ロ二量体抗体をホモ二量体出発抗体から分離することを可能にし、フロースルーを除去し
、ヘテロ二量体抗体をプロテインＡカラムから溶出させて、精製されたヘテロ二量体抗体
組成物を得る。
ないように操作されており、よって産物をプロテインＡカラム上に通すことによってヘテ
ロ二量体抗体をホモ二量体出発抗体から分離することを可能にし、フロースルーを除去し
、ヘテロ二量体抗体をプロテインＡカラムから溶出させて、精製されたヘテロ二量体抗体
組成物を得る。
【0158】
上述のように、ホモ二量体出発抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列は、異なり得、
ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、当該第１及び第２
のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強い。これらの相互作用及びそれらを達
成することができる方法についての詳細は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み
込まれる、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ
）に提供される。
ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、当該第１及び第２
のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強い。これらの相互作用及びそれらを達
成することができる方法についての詳細は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み
込まれる、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ
）に提供される。
【0159】
特に、安定な二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体は、それぞれ、ＣＤ３０及びＣＤ３に結
合し、ＣＨ３領域に少数のみの、かなり保存的な非対称変異を含有する２つのホモ二量体
出発抗体に基づいて、本発明の上記方法を使用して高収率で得ることができる。非対称変
異は、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が非同一位置でアミノ酸置換を含有すること
を意味する。
合し、ＣＨ３領域に少数のみの、かなり保存的な非対称変異を含有する２つのホモ二量体
出発抗体に基づいて、本発明の上記方法を使用して高収率で得ることができる。非対称変
異は、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が非同一位置でアミノ酸置換を含有すること
を意味する。
【0160】
本発明の多重特異性、例えば、二重特異性抗体はまた、単一細胞における第１及び第２
のポリペプチドをコードする構築物の共発現によって得られ得る。
のポリペプチドをコードする構築物の共発現によって得られ得る。
【0161】
よって、更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体をコードする核
酸構築物、又は核酸構築物の組み合わせに関し、そのような核酸構築物を含む発現ベクタ
ー、又は発現ベクターの組み合わせに関する。
酸構築物、又は核酸構築物の組み合わせに関し、そのような核酸構築物を含む発現ベクタ
ー、又は発現ベクターの組み合わせに関する。
【0162】
更に、本発明は、本発明による多重特異性抗体を産生することができる組換え宿主細胞
に関し、宿主細胞は、本発明による多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸構築物を
含む。
に関し、宿主細胞は、本発明による多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸構築物を
含む。
【0163】
したがって、本発明はまた、本発明による多重特異性抗体を産生するための方法に関し
、該方法は、
（ｉ）抗体が産生される条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養することと、
（ｉｉ）産生された多重特異性抗体を培養物から単離することと、を含む。
、該方法は、
（ｉ）抗体が産生される条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養することと、
（ｉｉ）産生された多重特異性抗体を培養物から単離することと、を含む。
【0164】
一実施形態において、当該方法は、以下のステップを含む：
ａ）第１の抗体重鎖の第１のＦｃ領域及び第１の抗原結合領域を含む第１のポリペプチド
をコードする第１の核酸構築物を提供し、当該第１のＦｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含
み、
ｂ）第２の抗体重鎖の第２のＦｃ領域及び第２の抗原結合領域を含む第２のポリペプチド
をコードする第２の核酸構築物を提供し、当該第２のＦｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含
み、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２の
ＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相
互作用の各々よりも強く、ここで、任意に、当該第１及び第２の核酸構築物が、当該第１
及び第２の抗体の軽鎖配列をコードし；
ｃ）当該第１及び第２の核酸構築物を宿主細胞において共発現させ；そして
ｄ）当該ヘテロ二量体タンパク質を細胞培養物から得る。
ａ）第１の抗体重鎖の第１のＦｃ領域及び第１の抗原結合領域を含む第１のポリペプチド
をコードする第１の核酸構築物を提供し、当該第１のＦｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含
み、
ｂ）第２の抗体重鎖の第２のＦｃ領域及び第２の抗原結合領域を含む第２のポリペプチド
をコードする第２の核酸構築物を提供し、当該第２のＦｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含
み、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２の
ＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相
互作用の各々よりも強く、ここで、任意に、当該第１及び第２の核酸構築物が、当該第１
及び第２の抗体の軽鎖配列をコードし；
ｃ）当該第１及び第２の核酸構築物を宿主細胞において共発現させ；そして
ｄ）当該ヘテロ二量体タンパク質を細胞培養物から得る。
【0165】
好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるコードされたアミノ酸は、第１のＣＨ３領
域にあるＬであり、Ｋ４０９に対応する位置にあるコードされたアミノ酸は、第２のＣＨ
３領域にあるＲであるか、又はその逆もまた同様である。
域にあるＬであり、Ｋ４０９に対応する位置にあるコードされたアミノ酸は、第２のＣＨ
３領域にあるＲであるか、又はその逆もまた同様である。
【0166】
プロモーター、エンハンサーなどを含む、好適な発現ベクター、及び抗体の産生に好適
な宿主細胞は、当該技術分野で周知である。宿主細胞の例としては、酵母、細菌、及び哺
乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト、例えば、ヒ
ト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞が挙げられる。
な宿主細胞は、当該技術分野で周知である。宿主細胞の例としては、酵母、細菌、及び哺
乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト、例えば、ヒ
ト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞が挙げられる。
【0167】
本明細書に定義される核酸、又は１つ以上の核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。本
明細書で定義される核酸、又は１つ以上の核酸は、哺乳動物細胞における発現における使
用のためのものであり得る。したがって、更に、本発明は、本明細書で定義される、核酸
又は核酸（複数）を含む、１以上の細胞を提供する。
明細書で定義される核酸、又は１つ以上の核酸は、哺乳動物細胞における発現における使
用のためのものであり得る。したがって、更に、本発明は、本明細書で定義される、核酸
又は核酸（複数）を含む、１以上の細胞を提供する。
【0168】
本発明の文脈における核酸は、染色体、非染色体、及び合成核酸ベクター（好適な発現
制御要素のセットを含む核酸配列）を含む、任意の好適なベクターであり得る、発現ベク
ターであり得る。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド
、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡ
の組み合わせに由来するベクター、並びにウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが
挙げられる。一実施形態において、ＣＤ３０又はＣＤ３抗体コード核酸は、例えば、直鎖
発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ
１７，３５５ ５９（１９９７）に記載される）、コンパクト核酸ベクター（例えば、Ｕ
Ｓ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載される）、ｐＢＲ３２２、
ｐＵＣ １９／１８、若しくはｐＵＣ １１８／１１９などのプラスミドベクター、「ミ
ッジ」最小サイズの核酸ベクター（例えば、Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌ Ｔｈｅｒ ３，７９３ ８００（２００１）に記載される）を含む、裸のＤＮＡ若し
くはＲＮＡベクターに、又はＣａＰ０４沈澱構築物（例えば、ＷＯ２０００／４６１４７
、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３，９５５１
５５（１９８６）、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４，７２５（１９７８）
、及びＣｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ７，６０３（１９８１）に記載される）などの、沈澱核酸ベクター構築物として
含まれる。そのような核酸ベクター及びその使用法は、当該技術分野で周知である（例え
ば、ＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。
制御要素のセットを含む核酸配列）を含む、任意の好適なベクターであり得る、発現ベク
ターであり得る。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド
、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡ
の組み合わせに由来するベクター、並びにウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが
挙げられる。一実施形態において、ＣＤ３０又はＣＤ３抗体コード核酸は、例えば、直鎖
発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ
１７，３５５ ５９（１９９７）に記載される）、コンパクト核酸ベクター（例えば、Ｕ
Ｓ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載される）、ｐＢＲ３２２、
ｐＵＣ １９／１８、若しくはｐＵＣ １１８／１１９などのプラスミドベクター、「ミ
ッジ」最小サイズの核酸ベクター（例えば、Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌ Ｔｈｅｒ ３，７９３ ８００（２００１）に記載される）を含む、裸のＤＮＡ若し
くはＲＮＡベクターに、又はＣａＰ０４沈澱構築物（例えば、ＷＯ２０００／４６１４７
、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３，９５５１
５５（１９８６）、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４，７２５（１９７８）
、及びＣｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ７，６０３（１９８１）に記載される）などの、沈澱核酸ベクター構築物として
含まれる。そのような核酸ベクター及びその使用法は、当該技術分野で周知である（例え
ば、ＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。
【0169】
一実施形態において、ベクターは、細菌細胞におけるＣＤ３０抗体及び／又はＣＤ３抗
体の発現に適している。そのようなベクターの例としては、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５５０３ ５５０９（１９８９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）などのような発現ベクターが挙げられる。
体の発現に適している。そのようなベクターの例としては、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５５０３ ５５０９（１９８９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）などのような発現ベクターが挙げられる。
【0170】
発現ベクターはまた、又は代替的に、酵母系における発現に好適なベクターであり得る
。酵母系における発現に好適な任意のベクターが使用され得る。好適なベクターとしては
、例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性
プロモーターを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ
ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）、及びＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６ ５４４（１９８７）において概説される）。
。酵母系における発現に好適な任意のベクターが使用され得る。好適なベクターとしては
、例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性
プロモーターを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ
ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）、及びＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６ ５４４（１９８７）において概説される）。
【0171】
核酸及び／又は発現ベクターはまた、分泌／局在化配列をコードする核酸配列を含み得
、これは、新生ポリペプチド鎖などの、ポリペプチドを、細胞周辺腔又は細胞培養培地に
標的化することができる。そのような配列は、当該技術分野で既知であり、分泌リーダー
又はシグナルペプチドを含む。核酸及び／又は発現ベクターは、（二重特異性）抗体の成
分が発現されるように、発現、すなわち、核酸の転写及び／又は翻訳を促進する任意の好
適な要素を含み得る。核酸及び／又はベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハン
サー、及び他の発現促進要素と会合する。そのような要素の例としては、強い発現プロモ
ーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー、並びにＲＳＶ、ＳＶ４
０、ＳＬ３ ３、ＭＭＴＶ、及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結
配列、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド産物の複製起点、選択可能なマーカーとしての抗
生物質耐性遺伝子、及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げ
られる。核酸は、ＣＭＶ ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的に、誘導性プロモー
ターも含み得る。
、これは、新生ポリペプチド鎖などの、ポリペプチドを、細胞周辺腔又は細胞培養培地に
標的化することができる。そのような配列は、当該技術分野で既知であり、分泌リーダー
又はシグナルペプチドを含む。核酸及び／又は発現ベクターは、（二重特異性）抗体の成
分が発現されるように、発現、すなわち、核酸の転写及び／又は翻訳を促進する任意の好
適な要素を含み得る。核酸及び／又はベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハン
サー、及び他の発現促進要素と会合する。そのような要素の例としては、強い発現プロモ
ーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー、並びにＲＳＶ、ＳＶ４
０、ＳＬ３ ３、ＭＭＴＶ、及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結
配列、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド産物の複製起点、選択可能なマーカーとしての抗
生物質耐性遺伝子、及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げ
られる。核酸は、ＣＭＶ ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的に、誘導性プロモー
ターも含み得る。
【0172】
組成物及び（医学的）使用
更に、本発明は、本明細書に定義される抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、そ
のような組成物は、薬学的組成物であり、すなわち、抗体は、薬学的に許容される担体に
含まれる。
更に、本発明は、本明細書に定義される抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、そ
のような組成物は、薬学的組成物であり、すなわち、抗体は、薬学的に許容される担体に
含まれる。
【0173】
薬学的組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．
，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示され
るものなどの従来の技法に従って製剤化され得る。本発明の薬学的組成物は、例えば、希
釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０又はＴｗｅｅｎ－８０など
の、非イオン性洗剤）、安定剤（例えば、糖又はタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐
剤、組織固定剤、可溶化剤、及び／又は薬学的組成物中の包含に好適な他の材料を含み得
る。
ｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．
，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示され
るものなどの従来の技法に従って製剤化され得る。本発明の薬学的組成物は、例えば、希
釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０又はＴｗｅｅｎ－８０など
の、非イオン性洗剤）、安定剤（例えば、糖又はタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐
剤、組織固定剤、可溶化剤、及び／又は薬学的組成物中の包含に好適な他の材料を含み得
る。
【0174】
薬学的組成物は、任意の好適な経路及びモードによって投与され得る。一実施形態にお
いて、薬学的組成物は、静脈内又は皮下注射又は注入によって投与される。
いて、薬学的組成物は、静脈内又は皮下注射又は注入によって投与される。
【0175】
本発明による抗体、組成物、又は薬学的組成物は、好ましくは、医薬としての使用のた
めのものである。
めのものである。
【0176】
本発明による抗体、組成物、又は薬学的組成物は、好ましくは、疾患の治療における使
用のためのものである。
用のためのものである。
【0177】
特に、本発明の二重特異性抗体は、様々な形態のがんの治療のために使用され得る。
【0178】
一態様において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法を提供し、その方
法は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体の投与を含む。更なる実施形態において、本
発明は、対象において、ＣＤ３０を発現する細胞を含む障害を治療するための方法を提供
し、その方法は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体の投与を含む。
法は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体の投与を含む。更なる実施形態において、本
発明は、対象において、ＣＤ３０を発現する細胞を含む障害を治療するための方法を提供
し、その方法は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体の投与を含む。
【0179】
前述のように、本発明による方法及び使用において企図することができる好適な疾患は
、がんである。当該がんは、最も好ましくは、ＣＤ３０の発現を特徴とする。がんにおけ
るＣＤ３０の発現は、ＰＣＲ、免疫染色、又はＦＡＣＳ分析などの、当該技術分野で既知
の方法を使用して、すなわち、ＣＤ３０転写物及び／又はタンパク質の発現の検出をして
、容易に決定することができる。ヒトＣＤ３０に結合することができる本明細書に記載さ
れる抗体は、例えば、免疫染色及び／又はＦＡＣＳ分析などにおいて使用され得る。
、がんである。当該がんは、最も好ましくは、ＣＤ３０の発現を特徴とする。がんにおけ
るＣＤ３０の発現は、ＰＣＲ、免疫染色、又はＦＡＣＳ分析などの、当該技術分野で既知
の方法を使用して、すなわち、ＣＤ３０転写物及び／又はタンパク質の発現の検出をして
、容易に決定することができる。ヒトＣＤ３０に結合することができる本明細書に記載さ
れる抗体は、例えば、免疫染色及び／又はＦＡＣＳ分析などにおいて使用され得る。
【0180】
一態様において、本発明は、ホジキンリンパ腫又は未分化大細胞リンパ腫の治療におけ
る使用のための、本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学的組成物に関する。
る使用のための、本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学的組成物に関する。
【0181】
更なる態様において、本発明は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）又は非ホジキンリンパ腫（
ＮＨＬ）の治療における使用のための、本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学
的組成物に関する。
ＮＨＬ）の治療における使用のための、本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学
的組成物に関する。
【0182】
一実施形態において、ホジキンリンパ腫は、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）である
。
。
【0183】
一実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ
）又はＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）である。更なる実施形態において、非ホ
ジキンリンパ腫は、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）である。
）又はＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）である。更なる実施形態において、非ホ
ジキンリンパ腫は、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）である。
【0184】
更なる実施形態において、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣ
Ｌ）又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である。なお更なる実施形態において、Ｔ細胞
非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。なお
更なる実施形態において、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、未分化大細胞リンパ腫（
ＡＬＣＬ）である。
Ｌ）又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である。なお更なる実施形態において、Ｔ細胞
非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。なお
更なる実施形態において、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、未分化大細胞リンパ腫（
ＡＬＣＬ）である。
【0185】
一実施形態において、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）は、マントル細胞リン
パ腫（ＭＣＬ）である。
パ腫（ＭＣＬ）である。
【0186】
より更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、再発性及び難治性ホジキ
ンリンパ腫である。更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、ＣＤ３０＋
ホジキンリンパ腫である。なお更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、
再発性及び難治性ＣＤ３０＋ホジキンリンパ腫である。より更なる実施形態において、ホ
ジキンリンパ腫（ＨＬ）は、再発性及び難治性ＣＤ３０＋古典的ホジキンリンパ腫である
。
ンリンパ腫である。更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、ＣＤ３０＋
ホジキンリンパ腫である。なお更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、
再発性及び難治性ＣＤ３０＋ホジキンリンパ腫である。より更なる実施形態において、ホ
ジキンリンパ腫（ＨＬ）は、再発性及び難治性ＣＤ３０＋古典的ホジキンリンパ腫である
。
【0187】
より更なる実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、再発性及び難治性非
ホジキンリンパ腫である。更なる実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、
ＣＤ３０＋非ホジキンリンパ腫である。なお更なる実施形態において、非ホジキンリンパ
腫（ＮＨＬ）は、再発性及び難治性ＣＤ３０＋非ホジキンリンパ腫である。
ホジキンリンパ腫である。更なる実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、
ＣＤ３０＋非ホジキンリンパ腫である。なお更なる実施形態において、非ホジキンリンパ
腫（ＮＨＬ）は、再発性及び難治性ＣＤ３０＋非ホジキンリンパ腫である。
【0188】
更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ
）の治療における使用のための本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学的組成物
は、静脈内及び／又は皮下、好ましくは皮下投与されているか、又は投与された。
）の治療における使用のための本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学的組成物
は、静脈内及び／又は皮下、好ましくは皮下投与されているか、又は投与された。
【0189】
更なる実施形態において、がんと診断されている患者は、がん細胞におけるＣＤ３０発
現の評価に供され得、ＣＤ３０が検出されるとき、これは低～高の範囲であり得、そのよ
うな患者は、本発明による抗体での治療に選択され得る。しかしながら、治療について患
者を選択する際にそのような評価を含めることが必ずしも要件ではない場合がある。
現の評価に供され得、ＣＤ３０が検出されるとき、これは低～高の範囲であり得、そのよ
うな患者は、本発明による抗体での治療に選択され得る。しかしながら、治療について患
者を選択する際にそのような評価を含めることが必ずしも要件ではない場合がある。
【0190】
本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ３０を発現する細胞を含む障害の診断及び治療を含む
多数のインビトロ及びインビボ診断及び治療有用性を有する。例えば、抗体は、様々な障
害を治療、予防、及び／又は診断するために、培養物中の細胞に、例えば、インビトロ若
しくはエクスビボで、又は対象に、例えば、インビボで投与することができる。本明細書
で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト個体を含むことが意図される
。
多数のインビトロ及びインビボ診断及び治療有用性を有する。例えば、抗体は、様々な障
害を治療、予防、及び／又は診断するために、培養物中の細胞に、例えば、インビトロ若
しくはエクスビボで、又は対象に、例えば、インビボで投与することができる。本明細書
で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト個体を含むことが意図される
。
【0191】
一態様において、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに記載の多
重特異性抗体を含む診断用組成物に関する。
重特異性抗体を含む診断用組成物に関する。
【0192】
一実施形態において、診断用組成物は、多重特異性抗体での治療から利益を得るであろ
う患者をスクリーニングし、選択するために使用されるコンパニオン診断薬である。
う患者をスクリーニングし、選択するために使用されるコンパニオン診断薬である。
【0193】
キット
本発明は、上記に開示される抗体を含むキットオブパーツ、例えば、コンパニオン診断
薬としての／患者の集団内で、本明細書において上記で定義される抗体での治療に応答す
る傾向を有する患者を特定するための、又は患者の治療に使用されるときの当該抗体の有
効性若しくは抗腫瘍活性を予想するための使用のためのキットであって、上記に定義され
る抗体と当該キットの使用説明書とを含む、キットを提供する。
本発明は、上記に開示される抗体を含むキットオブパーツ、例えば、コンパニオン診断
薬としての／患者の集団内で、本明細書において上記で定義される抗体での治療に応答す
る傾向を有する患者を特定するための、又は患者の治療に使用されるときの当該抗体の有
効性若しくは抗腫瘍活性を予想するための使用のためのキットであって、上記に定義され
る抗体と当該キットの使用説明書とを含む、キットを提供する。
【0194】
一実施形態において、本発明は、多重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体を含む容器と、ＣＤ
３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞の架橋を検出するための１つ以上の試薬と、を含む、が
んの診断のためのキットを提供する。試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、又は他の検
出可能なタグを含み得る。試薬はまた、酵素反応のための二次又は三次抗体又は試薬を含
み得、酵素反応は、視覚化され得る産物を産生する。
３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞の架橋を検出するための１つ以上の試薬と、を含む、が
んの診断のためのキットを提供する。試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、又は他の検
出可能なタグを含み得る。試薬はまた、酵素反応のための二次又は三次抗体又は試薬を含
み得、酵素反応は、視覚化され得る産物を産生する。
【0195】
更なる態様において、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる
多重特異性抗体の投与時に、患者に由来する試料においてＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発
現細胞間の架橋が生じるかを検出するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）試料を、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる多重特異性抗体と、
当該二重特異性抗体とＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞との間の複合体の形成を可能
にする条件下で接触させ、そして、
（ｉｉ）複合体が形成されたかを分析する、
ことを含む。
多重特異性抗体の投与時に、患者に由来する試料においてＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発
現細胞間の架橋が生じるかを検出するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）試料を、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる多重特異性抗体と、
当該二重特異性抗体とＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞との間の複合体の形成を可能
にする条件下で接触させ、そして、
（ｉｉ）複合体が形成されたかを分析する、
ことを含む。
【0196】
核酸構築物及び送達ビヒクルの送達
更なる態様において、本発明は、インビボ発現のための本発明の抗体をコードする核酸
構築物の投与に関する。抗体をコードする核酸のインビボ発現のために、当該核酸は、典
型的には、核酸が対象の細胞に入るために好適な形態で投与される。インビボ発現のため
の核酸を送達するための異なる方法が存在し、機械的手段及び化学的手段を含む方法の両
方を含む。例えば、そのような方法は、エレクトロポレーション又は核酸を皮膚上に入れ
墨することを含み得る（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ
ｓ ２５，１９８２－１９９３）。対象への核酸の投与に好適な他の方法は、好適な製剤
中の核酸の投与を伴う。
更なる態様において、本発明は、インビボ発現のための本発明の抗体をコードする核酸
構築物の投与に関する。抗体をコードする核酸のインビボ発現のために、当該核酸は、典
型的には、核酸が対象の細胞に入るために好適な形態で投与される。インビボ発現のため
の核酸を送達するための異なる方法が存在し、機械的手段及び化学的手段を含む方法の両
方を含む。例えば、そのような方法は、エレクトロポレーション又は核酸を皮膚上に入れ
墨することを含み得る（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ
ｓ ２５，１９８２－１９９３）。対象への核酸の投与に好適な他の方法は、好適な製剤
中の核酸の投与を伴う。
【0197】
よって、本発明はまた、本発明による核酸又は核酸の組み合わせを含む送達ビヒクルに
関する。いくつかの実施形態において、当該送達ビヒクルは、脂質製剤であり得る。製剤
の脂質は、粒子、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり得る。本発明の核酸又は核酸の
組み合わせは、当該粒子内、例えば、当該ＬＮＰ内にカプセル化され得る。インビボ発現
のための対象への核酸の投与に好適な異なる脂質製剤は、当業者に周知である。例えば、
当該脂質製剤は、典型的には、脂質、イオン化可能なアミノ脂質、ＰＥＧ脂質、コレステ
ロール、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
関する。いくつかの実施形態において、当該送達ビヒクルは、脂質製剤であり得る。製剤
の脂質は、粒子、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり得る。本発明の核酸又は核酸の
組み合わせは、当該粒子内、例えば、当該ＬＮＰ内にカプセル化され得る。インビボ発現
のための対象への核酸の投与に好適な異なる脂質製剤は、当業者に周知である。例えば、
当該脂質製剤は、典型的には、脂質、イオン化可能なアミノ脂質、ＰＥＧ脂質、コレステ
ロール、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【0198】
治療抗体の発現のための対象への核酸の投与に好適な脂質製剤の調製のための様々な形
態及び方法は、当該技術分野で周知である。そのような脂質製剤の例としては、ＵＳ２０
１８／０１７０８６６（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＥＰ２３９１３４３（Ａｒｂｕｔｕｓ）、
ＷＯ２０１８／００６０５２（Ｐｒｏｔｉｖａ）、ＷＯ２０１４／１５２７７４（Ｓｈｉ
ｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＥＰ２９７２３６０（Ｔｒａｎｓｌａｔｅ Ｂ
ｉｏ）、ＵＳ１０１９５１５６（Ｍｏｄｅｒｎａ）、及びＵＳ２０１９／００２２２４７
（Ａｃｕｉｔａｓ）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
態及び方法は、当該技術分野で周知である。そのような脂質製剤の例としては、ＵＳ２０
１８／０１７０８６６（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＥＰ２３９１３４３（Ａｒｂｕｔｕｓ）、
ＷＯ２０１８／００６０５２（Ｐｒｏｔｉｖａ）、ＷＯ２０１４／１５２７７４（Ｓｈｉ
ｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＥＰ２９７２３６０（Ｔｒａｎｓｌａｔｅ Ｂ
ｉｏ）、ＵＳ１０１９５１５６（Ｍｏｄｅｒｎａ）、及びＵＳ２０１９／００２２２４７
（Ａｃｕｉｔａｓ）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0199】
したがって、更なる態様において、本発明は、（ａ）医薬としての使用のための、好ま
しくはホジキンリンパ腫又は未分化大細胞リンパ腫の治療などの、がんの治療における使
用のための、本発明による核酸構築物又は本発明による送達ビヒクルに関する。
しくはホジキンリンパ腫又は未分化大細胞リンパ腫の治療などの、がんの治療における使
用のための、本発明による核酸構築物又は本発明による送達ビヒクルに関する。
【0200】
本発明は、以下の例によって更に例示され、これは、本発明の範囲を限定するものとし
て解釈されるべきではない。
て解釈されるべきではない。
【実施例0201】
実施例１ ２－ＭＥＡ誘導Ｆａｂ－アーム交換によるＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の
生成
以下の抗体を実施例に使用した：
生成
以下の抗体を実施例に使用した：
【0202】
ヒト化ＣＤ３抗体
ＷＯ２０１５／００１０８５（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例１に記載されるＩｇＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－Ｈ１Ｌ１である。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１は、本明細書において「Ｉｇ
Ｇ１－ｈｕＣＤ３」と称される。
ＷＯ２０１７／００９４４２（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例２に記載されるＩｇＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇである。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇは、
本明細書において「ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ」と称される。
ＷＯ２０１５／００１０８５（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例１に記載されるＩｇＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－Ｈ１Ｌ１である。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１は、本明細書において「Ｉｇ
Ｇ１－ｈｕＣＤ３」と称される。
ＷＯ２０１７／００９４４２（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例２に記載されるＩｇＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇである。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇは、
本明細書において「ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ」と称される。
【0203】
ＣＤ３０抗体
ＨｕＭａｂ ５Ｆ１１とも称される、ＭＤＸ－０６０は、ＷＯ２００３／０５９２８２
（Ｍｅｄａｒｅｘ）に開示されている。ｈＡＣ１０（又はＳＧＮ－３０）は、ＵＳ８２５
７７０６及びＵＳ２０１００２３９５７１（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に開示
されている。ＨＲＳ－３は、ＷＯ２０１６／０１７７８４６（Ａｆｆｉｍｅｄ）に開示さ
れている。ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ１０５、Ｔ４０８、及びＴ２１５は、ＷＯ２００
７／０４０６５３（米国政府及び保健）に開示されている。
ＨｕＭａｂ ５Ｆ１１とも称される、ＭＤＸ－０６０は、ＷＯ２００３／０５９２８２
（Ｍｅｄａｒｅｘ）に開示されている。ｈＡＣ１０（又はＳＧＮ－３０）は、ＵＳ８２５
７７０６及びＵＳ２０１００２３９５７１（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に開示
されている。ＨＲＳ－３は、ＷＯ２０１６／０１７７８４６（Ａｆｆｉｍｅｄ）に開示さ
れている。ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ１０５、Ｔ４０８、及びＴ２１５は、ＷＯ２００
７／０４０６５３（米国政府及び保健）に開示されている。
【0204】
抗体発現
抗体配列を、ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）にクロー
ニングし、ＦｃドメインにおいてＦｃサイレンシング及び／又はＤｕｏＢｏｄｙ（登録商
標）技術アミノ酸置換あり又はなしで、ＩｇＧ１、κ又はＩｇＧ１、λとして発現させた
（下記を参照されたい）。全ての抗体を、本質的に製造業者によって記載されるように、
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２５）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５
２７）において関連する重鎖及び軽鎖発現ベクターを共トランスフェクションすることに
よって、無血清条件下で産生した。
抗体配列を、ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）にクロー
ニングし、ＦｃドメインにおいてＦｃサイレンシング及び／又はＤｕｏＢｏｄｙ（登録商
標）技術アミノ酸置換あり又はなしで、ＩｇＧ１、κ又はＩｇＧ１、λとして発現させた
（下記を参照されたい）。全ての抗体を、本質的に製造業者によって記載されるように、
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２５）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５
２７）において関連する重鎖及び軽鎖発現ベクターを共トランスフェクションすることに
よって、無血清条件下で産生した。
【0205】
二重特異性抗体の生成
二重特異性抗体を、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）プラットフォーム技術、すなわち、Ｗ
Ｏ２０１１／１４７９８６、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６
７（Ｇｅｎｍａｂ）並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ
．，ＰＮＡＳ ２０１３，１１０：５１４５－５０、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡ
ｂｓ ２０１３，５：９６２－９７３）に記載される２－ＭＥＡ誘導された制御されたＦ
ａｂ－アーム交換（ｃＦＡＥ）を使用してインビトロで生成した。この方法によって二重
特異性抗体の生成を可能にするために、ＣＨ３ドメインにおける単一変異を保有するＩｇ
Ｇ１分子を生成した：１つの親ＩｇＧ１抗体においては、Ｆ４０５Ｌ変異（すなわち、Ｃ
Ｄ３抗体又は対照、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的、抗体）であり、他の親ＩｇＧ１抗体
においては、Ｋ４０９Ｒ変異（すなわち、ＣＤ３０又は対照抗体）である。これらの変異
に加えて、親ＩｇＧ１抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ受容体（Ｆｃガンマ受容体）及び／又は補体
因子、例えば、Ｃ１ｑ：Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ、ＵＳ２０１５／
０３３７０４９）若しくはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）と相互作用す
ることができないＦｃドメインをもたらす置換を含んだ。
二重特異性抗体を、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）プラットフォーム技術、すなわち、Ｗ
Ｏ２０１１／１４７９８６、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６
７（Ｇｅｎｍａｂ）並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ
．，ＰＮＡＳ ２０１３，１１０：５１４５－５０、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡ
ｂｓ ２０１３，５：９６２－９７３）に記載される２－ＭＥＡ誘導された制御されたＦ
ａｂ－アーム交換（ｃＦＡＥ）を使用してインビトロで生成した。この方法によって二重
特異性抗体の生成を可能にするために、ＣＨ３ドメインにおける単一変異を保有するＩｇ
Ｇ１分子を生成した：１つの親ＩｇＧ１抗体においては、Ｆ４０５Ｌ変異（すなわち、Ｃ
Ｄ３抗体又は対照、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的、抗体）であり、他の親ＩｇＧ１抗体
においては、Ｋ４０９Ｒ変異（すなわち、ＣＤ３０又は対照抗体）である。これらの変異
に加えて、親ＩｇＧ１抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ受容体（Ｆｃガンマ受容体）及び／又は補体
因子、例えば、Ｃ１ｑ：Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ、ＵＳ２０１５／
０３３７０４９）若しくはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）と相互作用す
ることができないＦｃドメインをもたらす置換を含んだ。
【0206】
Ｆｃサイレンシング及びＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術変異の組み合わせは、以下の
ように称された。
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＦ４０５Ｌ：ＦＥＡＬ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＡＲ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＲＲ
ように称された。
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＦ４０５Ｌ：ＦＥＡＬ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＡＲ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＲＲ
【0207】
親抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列は、以下の配列番号で記載される：
【表4】
【0208】
二重特異性抗体を生成するために、２つの親抗体を等モル比でＰＢＳ緩衝液（リン酸塩
緩衝生理食塩水、８．７ｍＭのＨＰＯ４ ２－、１．８ｍＭのＨ２ＰＯ４ －、１６３．９ｍ
ＭのＮａ＋、１４０．３ｍＭのＣｌ－、ｐＨ７．４）中で混合した。２－メルカプトエチ
ルアミン－ＨＣｌ（２－ＭＥＡ）を７５ｍＭの最終濃度に加え、反応混合物を３１℃で５
時間インキュベートした。２－ＭＥＡを、製造業者のプロトコルに従って１０ｋＤａの分
子量カットオフＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒキャリッジ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＢＳ緩衝液中への透析によって除去した。試料を４
℃で一晩保存して、ジスルフィド結合の再酸化及び無傷の二重特異性抗体の形成を可能に
した。ｃＦＡＥの有効性は、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＭＡｂｓ．２０１３ Ｎｏｖ
１；５（６）：９６２－９７３．）によって記載されるエレクトロスプレーイオン化質
量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって評価されるように、＞９５％であった。
緩衝生理食塩水、８．７ｍＭのＨＰＯ４ ２－、１．８ｍＭのＨ２ＰＯ４ －、１６３．９ｍ
ＭのＮａ＋、１４０．３ｍＭのＣｌ－、ｐＨ７．４）中で混合した。２－メルカプトエチ
ルアミン－ＨＣｌ（２－ＭＥＡ）を７５ｍＭの最終濃度に加え、反応混合物を３１℃で５
時間インキュベートした。２－ＭＥＡを、製造業者のプロトコルに従って１０ｋＤａの分
子量カットオフＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒキャリッジ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＢＳ緩衝液中への透析によって除去した。試料を４
℃で一晩保存して、ジスルフィド結合の再酸化及び無傷の二重特異性抗体の形成を可能に
した。ｃＦＡＥの有効性は、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＭＡｂｓ．２０１３ Ｎｏｖ
１；５（６）：９６２－９７３．）によって記載されるエレクトロスプレーイオン化質
量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって評価されるように、＞９５％であった。
【0209】
非結合対照抗体ｂ１２
ＩｇＧ１－ｂ１２は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的抗体（Ｂａｒｂａｓ，ＣＦ．Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９３ Ａｐｒ ５；２３０（３）：８１２－２３）であり、それ
は、例のいくつかにおいて陰性、非結合対照抗体として使用される。重鎖の配列及び軽鎖
の配列は、本明細書において、それぞれ、配列番号３６及び３７（ＦＥＡＬ）又はそれぞ
れ、配列番号３８及び３７（ＦＥＲＲ）として含まれる。
ＩｇＧ１－ｂ１２は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的抗体（Ｂａｒｂａｓ，ＣＦ．Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９３ Ａｐｒ ５；２３０（３）：８１２－２３）であり、それ
は、例のいくつかにおいて陰性、非結合対照抗体として使用される。重鎖の配列及び軽鎖
の配列は、本明細書において、それぞれ、配列番号３６及び３７（ＦＥＡＬ）又はそれぞ
れ、配列番号３８及び３７（ＦＥＲＲ）として含まれる。
【0210】
実施例２－ヒトホジキンリンパ腫（ＨＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、及びＴ
ＬＬ細胞株におけるＣＤ３０発現
ＣＤ３０表面発現レベルを、定量的フローサイトメトリー（ヒトＩｇＧキャリブレータ
ーキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）を使用して、ＨＬ、ＡＬＣＬ
、及びＴＬＬ細胞株（表４）のパネルにおいて評価した。細胞（５×１０４細胞／ウェル
）を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ
．ｎｏ．６５０１８０）において５０μＬの染色緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミン［
ＢＳＡ、画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ、ｎｏ．１０７３５０８６００１］及び０．０２％
ＮａＮ３［Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ ｎｏ．１３４１２］で補足されたＰＢ
Ｓ［Ｌｏｎｚａ，ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１７－５１７Ｑ］）中の１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ１
－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと４℃で３０分間インキュベートした。並行して、
ヒトＩｇＧキャリブレーターキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＰ０１０）を
、本質的に製造業者の指示に従って使用して標準曲線を生成した。ビーズ当たり十分に定
義された数のヒトＩｇＧモノクローナル抗体を含む較正ビーズを、同じＲ－ＰＥ複合化二
次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９
－１１６－０９８、１：５００希釈）と４℃で光から保護して３０分間インキュベートし
た。細胞及びビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメ
ーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）でフローサイトメトリーによって分析
した。ヒトＩｇＧキャリブレーターキットを使用して得られた標準曲線を使用して、Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、細胞当たりの結合したＩｇＧ
１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ抗体（ＡＢＣ）の数を補間し、細胞表面上で発現
したＣＤ３０分子の数の推定値を表した。
ＬＬ細胞株におけるＣＤ３０発現
ＣＤ３０表面発現レベルを、定量的フローサイトメトリー（ヒトＩｇＧキャリブレータ
ーキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）を使用して、ＨＬ、ＡＬＣＬ
、及びＴＬＬ細胞株（表４）のパネルにおいて評価した。細胞（５×１０４細胞／ウェル
）を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ
．ｎｏ．６５０１８０）において５０μＬの染色緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミン［
ＢＳＡ、画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ、ｎｏ．１０７３５０８６００１］及び０．０２％
ＮａＮ３［Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ ｎｏ．１３４１２］で補足されたＰＢ
Ｓ［Ｌｏｎｚａ，ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１７－５１７Ｑ］）中の１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ１
－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと４℃で３０分間インキュベートした。並行して、
ヒトＩｇＧキャリブレーターキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＰ０１０）を
、本質的に製造業者の指示に従って使用して標準曲線を生成した。ビーズ当たり十分に定
義された数のヒトＩｇＧモノクローナル抗体を含む較正ビーズを、同じＲ－ＰＥ複合化二
次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９
－１１６－０９８、１：５００希釈）と４℃で光から保護して３０分間インキュベートし
た。細胞及びビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメ
ーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）でフローサイトメトリーによって分析
した。ヒトＩｇＧキャリブレーターキットを使用して得られた標準曲線を使用して、Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、細胞当たりの結合したＩｇＧ
１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ抗体（ＡＢＣ）の数を補間し、細胞表面上で発現
したＣＤ３０分子の数の推定値を表した。
【0211】
表４及び５は、定量下限（ＬＬＯＱ）を上回るＣＤ３０発現がＳＵＰ－Ｔ１を除く全て
の細胞株において観察されたことを示す。
の細胞株において観察されたことを示す。
【表5】
【0212】
【表6】
【0213】
実施例３－未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）細胞などのヒトホジキンリンパ腫（ＨＬ）
及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）へのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の、２つのＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ
－１（ＡＬＣＬ、ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＡＣＣ ３５６）及びＨＤＬＭ－２（ＨＬ、
ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＲＬ－２９６５）への結合をフローサイトメトリーによって
分析した。
及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）へのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の、２つのＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ
－１（ＡＬＣＬ、ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＡＣＣ ３５６）及びＨＤＬＭ－２（ＨＬ、
ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＲＬ－２９６５）への結合をフローサイトメトリーによって
分析した。
【0214】
細胞（３ｘ１０４細胞／ウェル）を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉ
ｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において５０μＬの染色緩衝液
中の抗体の段階希釈液（３倍希釈ステップで０．００４６～１０μｇ／ｍＬの範囲）と４
℃で３０分間インキュベートした。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を５０μＬの二
次抗体と４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩衝液中で１：４０
０に希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ
ｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用した。次に、細胞を
染色緩衝液中で２回洗浄し、ＴＯ－ＰＲＯ－３ヨウ化物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５、１：８０００希釈）で補足された１
００μＬの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及びＴＯＰＲＯ－３染
色の不在に基づいて、生きた細胞をゲーティングした。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して対数変換データの非線形回帰（可変勾配でのシグ
モイド用量応答、４パラメータ）によって分析した。
ｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において５０μＬの染色緩衝液
中の抗体の段階希釈液（３倍希釈ステップで０．００４６～１０μｇ／ｍＬの範囲）と４
℃で３０分間インキュベートした。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を５０μＬの二
次抗体と４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩衝液中で１：４０
０に希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ
ｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用した。次に、細胞を
染色緩衝液中で２回洗浄し、ＴＯ－ＰＲＯ－３ヨウ化物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５、１：８０００希釈）で補足された１
００μＬの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及びＴＯＰＲＯ－３染
色の不在に基づいて、生きた細胞をゲーティングした。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して対数変換データの非線形回帰（可変勾配でのシグ
モイド用量応答、４パラメータ）によって分析した。
【0215】
結果
図１は、ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ
１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥ
ＡＲ（Ｃ）、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ
）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ｂｓＧ１
－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ＢｉｓＩｇＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ）の、ＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）及び
ＨＤＬＭ－２（右パネル）腫瘍細胞への用量応答結合曲線を示す。
図１は、ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ
１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥ
ＡＲ（Ｃ）、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ
）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ｂｓＧ１
－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ＢｉｓＩｇＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ）の、ＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）及び
ＨＤＬＭ－２（右パネル）腫瘍細胞への用量応答結合曲線を示す。
【0216】
１．１１μｇ／ｍＬの濃度で、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲは、単一特異性、二価ＣＤ３０親抗
体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－Ｆ
ＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０
５－ＦＥＡＲの結合を比較したときに同様の結合を示した（図１Ｉ）。
６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲは、単一特異性、二価ＣＤ３０親抗
体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－Ｆ
ＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０
５－ＦＥＡＲの結合を比較したときに同様の結合を示した（図１Ｉ）。
【0217】
対照的に、１．１１μｇ／ｍＬの濃度で、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡ
Ｒ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲの結合は、単
一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－Ｃ
Ｄ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲの、ＳＵ－
ＤＨＬ－１及びＨＤＬＭ－２細胞への結合よりも低かった（図１Ｉ）。
－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡ
Ｒ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲの結合は、単
一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－Ｃ
Ｄ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲの、ＳＵ－
ＤＨＬ－１及びＨＤＬＭ－２細胞への結合よりも低かった（図１Ｉ）。
【0218】
全体的に、１．１１μｇ／ｍＬの濃度でのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－
ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ＢｓＧ
１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲの結合は、同じ濃度でのｂｓＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２
１５－ＦＥＡＲの結合よりも高かった（図１Ｉ）。
－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－
ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ＢｓＧ
１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲの結合は、同じ濃度でのｂｓＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２
１５－ＦＥＡＲの結合よりも高かった（図１Ｉ）。
【0219】
これらの実験に含まれた陰性対照抗体ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥ
ＡＲは、ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＨＤＬＭ－２細胞への結合を示さず、ＳＵ－ＤＨＬ－１又
はＨＤＬＭ－２細胞のいずれもＣＤ３を発現しないことを示す。
ＡＲは、ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＨＤＬＭ－２細胞への結合を示さず、ＳＵ－ＤＨＬ－１又
はＨＤＬＭ－２細胞のいずれもＣＤ３を発現しないことを示す。
【0220】
結論として、ＣＤ３０抗体クローンＴ４０５、Ｔ４０８、及びＴ２１５は、二価フォー
マットと比較して一価において低減した結合を示し、一方でクローンＭＤＸ０６０、ｈＡ
Ｃ１０、ＨＲＳ－３、及びＴ１０５は、一価及び二価フォーマットの両方で、ＣＤ３０発
現腫瘍細胞への効率的な結合を示した。
マットと比較して一価において低減した結合を示し、一方でクローンＭＤＸ０６０、ｈＡ
Ｃ１０、ＨＲＳ－３、及びＴ１０５は、一価及び二価フォーマットの両方で、ＣＤ３０発
現腫瘍細胞への効率的な結合を示した。
【0221】
図２は、（Ａ）ＨＤＬＭ－２（ＨＬ）、（Ｂ）Ｌ－４２８（ＨＬ）、（Ｃ）ＤＥＬ（Ａ
ＬＣＬ）、及び（Ｄ）ＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ
ｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの用量応答結合曲線を示す。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、単一特異性、二価ＣＤ３０親抗体Ｉ
ｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較されるとき、同様の最大結合を示した
。陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの細胞株のいずれへの結合
も示さず、これらの細胞が細胞表面上でＣＤ３を発現しないことを示した。これらのデー
タは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＥＲのＨＬ及び
ＡＬＣＬ細胞株への効率的な結合を確認した。
ＬＣＬ）、及び（Ｄ）ＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ
ｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの用量応答結合曲線を示す。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、単一特異性、二価ＣＤ３０親抗体Ｉ
ｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較されるとき、同様の最大結合を示した
。陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの細胞株のいずれへの結合
も示さず、これらの細胞が細胞表面上でＣＤ３を発現しないことを示した。これらのデー
タは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＥＲのＨＬ及び
ＡＬＣＬ細胞株への効率的な結合を確認した。
【0222】
表６は、２つの独立した実験において評価される、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのＨＤＬＭ－２、Ｌ－４２８、ＤＥＬ、及びＫＩ－Ｊ
Ｋ細胞への結合についてのＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０値は、０．０５～０．３０μｇ／
ｍＬの範囲であった。
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのＨＤＬＭ－２、Ｌ－４２８、ＤＥＬ、及びＫＩ－Ｊ
Ｋ細胞への結合についてのＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０値は、０．０５～０．３０μｇ／
ｍＬの範囲であった。
【表7】
【0223】
図８、９、及び１０は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－
ＦＥＲＲの、ＣＤ３０発現ＨＬ細胞株（図８）、ＡＬＣＬ細胞株（図９）、及びＮＨＬ細
胞株（図１０）への用量応答結合曲線を示す。全ての細胞株において、ＢｓＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、一価対照抗体ＢｓＧ１－ｂ１２
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較して同様の最大結合を示した。単
一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、全ての
細胞株への用量依存的結合を示したが、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較してより低い最大結合を示した。陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ
１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの細胞株のいずれへの結合も示さず、これらの細胞が細
胞表面上でＣＤ３を発現しないことを示した。これらのデータは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＬ細胞株、ＡＬＣＬ及びＣＴＣＬ
細胞株などのＴ－ＮＨＬ、並びにＭＣＬ細胞株などのＢ－ＮＨＬへの効率的な結合を確認
した。
ＦＥＲＲの、ＣＤ３０発現ＨＬ細胞株（図８）、ＡＬＣＬ細胞株（図９）、及びＮＨＬ細
胞株（図１０）への用量応答結合曲線を示す。全ての細胞株において、ＢｓＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、一価対照抗体ＢｓＧ１－ｂ１２
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較して同様の最大結合を示した。単
一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、全ての
細胞株への用量依存的結合を示したが、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較してより低い最大結合を示した。陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ
１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの細胞株のいずれへの結合も示さず、これらの細胞が細
胞表面上でＣＤ３を発現しないことを示した。これらのデータは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＬ細胞株、ＡＬＣＬ及びＣＴＣＬ
細胞株などのＴ－ＮＨＬ、並びにＭＣＬ細胞株などのＢ－ＮＨＬへの効率的な結合を確認
した。
【0224】
表７は、２つ又は３つの独立した実験において評価される、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｆ
ＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＬ、Ｔ－ＮＨＬ、及びＢ－ＮＨＬ細胞
株への結合についてのＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０値は、０．１２～０．３５μｇ／ｍＬ
の範囲であった。
ＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＬ、Ｔ－ＮＨＬ、及びＢ－ＮＨＬ細胞
株への結合についてのＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０値は、０．１２～０．３５μｇ／ｍＬ
の範囲であった。
【表8】
【0225】
実施例４－ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体によるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害
性及びＴ細胞増殖の誘導
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、Ｔ細
胞をエフェクター細胞として使用して、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した
。Ｔ細胞の供給源として、ＣＤ３陽性ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型（Ｃｌｅａｎ Ｃ
ｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）又は精製されたＴ細胞（実施例５に記載さ
れる）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍細胞殺滅を評価した。
性及びＴ細胞増殖の誘導
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、Ｔ細
胞をエフェクター細胞として使用して、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した
。Ｔ細胞の供給源として、ＣＤ３陽性ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型（Ｃｌｅａｎ Ｃ
ｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）又は精製されたＴ細胞（実施例５に記載さ
れる）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍細胞殺滅を評価した。
【0226】
ＳＵ－ＤＨＬ－１（ＡＬＣＬ）、ＨｕＴ７８（ＡＬＣＬ）、ＨＤＬＭ－２（ＨＬ）、Ｎ
ＣＥＢ－１（ＭＣＬ）、又はＬ５４０（ＨＬ）細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度
でポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎ
ｏ．６５０１８０）に播種した。エフェクター細胞を、０．５μＭのＣＦＳＥ（カルボキ
シフルオレセインスクシンイミジルエステル、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５４）で３７℃で２０
分間標識し、腫瘍細胞にＥ：Ｔ比＝１０：１（ＡＤＣＣエフェクター細胞）又は７：１（
精製Ｔ細胞）で添加した。二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０、ｂ１２ｘＣＤ３０、又はＣＤ３
ｘｂ１２抗体、又は単一特異性二価ＣＤ３０抗体の段階希釈液を添加し（１０～０．０４
１μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、細胞を３７℃で７２時間インキュベート
した。いくつかの実験では、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
－ＦＥＡＲのバリアントを、ＣＤ３についての親和性が低減した、Ｈ１０１Ｇ変異を含有
するＣＤ３結合アームと使用した（ＷＯ２０１７／００９４４２、Ｇｅｎｍａｂ）。１０
０μＬの染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を、ＴＯ－ＰＲＯ－３ヨウ化物（Ｔｈｅｒ
ｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５、１：４０００
希釈）を含有する染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター
（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。
ＣＥＢ－１（ＭＣＬ）、又はＬ５４０（ＨＬ）細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度
でポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎ
ｏ．６５０１８０）に播種した。エフェクター細胞を、０．５μＭのＣＦＳＥ（カルボキ
シフルオレセインスクシンイミジルエステル、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５４）で３７℃で２０
分間標識し、腫瘍細胞にＥ：Ｔ比＝１０：１（ＡＤＣＣエフェクター細胞）又は７：１（
精製Ｔ細胞）で添加した。二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０、ｂ１２ｘＣＤ３０、又はＣＤ３
ｘｂ１２抗体、又は単一特異性二価ＣＤ３０抗体の段階希釈液を添加し（１０～０．０４
１μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、細胞を３７℃で７２時間インキュベート
した。いくつかの実験では、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
－ＦＥＡＲのバリアントを、ＣＤ３についての親和性が低減した、Ｈ１０１Ｇ変異を含有
するＣＤ３結合アームと使用した（ＷＯ２０１７／００９４４２、Ｇｅｎｍａｂ）。１０
０μＬの染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を、ＴＯ－ＰＲＯ－３ヨウ化物（Ｔｈｅｒ
ｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５、１：４０００
希釈）を含有する染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター
（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。
【0227】
５μＭのスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｓ６
９４２）で処理された腫瘍細胞試料の生存率を０％に設定し、未処理の腫瘍細胞試料の生
存率を１００％に設定した。
９４２）で処理された腫瘍細胞試料の生存率を０％に設定し、未処理の腫瘍細胞試料の生
存率を１００％に設定した。
【0228】
「生存細胞パーセンテージ」を次のように計算した：
生存細胞％＝（［細胞数試料－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］／［細胞数未処理
標的細胞－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］）×１００。ＣＦＳＥ陽性細胞を、Ｔ
細胞増殖を評価するためのＴ細胞の絶対数の尺度として計数した。
生存細胞％＝（［細胞数試料－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］／［細胞数未処理
標的細胞－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］）×１００。ＣＦＳＥ陽性細胞を、Ｔ
細胞増殖を評価するためのＴ細胞の絶対数の尺度として計数した。
【0229】
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａ
ｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可
変勾配でのシグモイド用量応答）によって分析した。
ｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可
変勾配でのシグモイド用量応答）によって分析した。
【0230】
結果
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞又
はＨＤＬＭ－２細胞を標的細胞として、ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞（Ｃｌｅａ
ｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）をエフェクター細胞として使用して
、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞又
はＨＤＬＭ－２細胞を標的細胞として、ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞（Ｃｌｅａ
ｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）をエフェクター細胞として使用して
、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。
【0231】
図３は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）
、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ｂｓＧ１
－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（Ｃ）、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３
０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８
－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡ
Ｒ（Ｈ）が、ＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）又はＨＤＬＭ－２（右パネル）細胞の用量依
存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性（生存細胞％の減少として示される）を誘導したことを示す
。
、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ｂｓＧ１
－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（Ｃ）、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３
０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８
－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡ
Ｒ（Ｈ）が、ＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）又はＨＤＬＭ－２（右パネル）細胞の用量依
存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性（生存細胞％の減少として示される）を誘導したことを示す
。
【0232】
単一特異性、二価ＣＤ３０抗体ＩｇＧ１－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）、ＩｇＧ１－
ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（
Ｃ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４
０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ＩｇＧ１－Ｃ
Ｄ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ
）は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導しなかった。対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲはまた、ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＨＤＬＭ－２細胞のＴ細胞媒介性
細胞傷害性を誘導しなかった。
ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（
Ｃ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４
０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ＩｇＧ１－Ｃ
Ｄ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ
）は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導しなかった。対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲはまた、ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＨＤＬＭ－２細胞のＴ細胞媒介性
細胞傷害性を誘導しなかった。
【0233】
加えて、ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、異なるＭＣＬ、ＡＬＣＬ、及びＨＬ細胞
株を標的細胞として、並びに精製されたＴ細胞又はＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞
をエフェクター細胞として使用するインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。図
４Ａ～Ｂは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによ
って誘導されたＳＵ－ＤＨＬ－１、ＨｕＴ７８、又はＮＣＥＢ－１細胞のＴ細胞媒介性細
胞傷害性が、低減した親和性を有するＣＤ３結合アームを有するこの抗体のバリアント（
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ）と
比較してより強力であることを示す。ＨＤＬＭ－２細胞の同様の最大Ｔ細胞媒介性細胞傷
害性は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及びｂｓ
Ｇ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによって
誘導された（図４Ｂ）。対照として含まれた、二価、単一特異性抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬ又はＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＲとのインキュベーションは、これらの細胞
株において細胞傷害性を誘導しなかった。Ｌ５４０細胞の強力な同様のＴ細胞媒介性細胞
傷害性は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及びｂ
ｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによっ
て試験された最も低い濃度（０．０１４μｇ／ｍＬ、図４Ｃ）で誘導された。対照抗体ｂ
ｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はＩｇＧ１－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＡＲは、Ｌ５４０細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導しなかった。
株を標的細胞として、並びに精製されたＴ細胞又はＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞
をエフェクター細胞として使用するインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。図
４Ａ～Ｂは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによ
って誘導されたＳＵ－ＤＨＬ－１、ＨｕＴ７８、又はＮＣＥＢ－１細胞のＴ細胞媒介性細
胞傷害性が、低減した親和性を有するＣＤ３結合アームを有するこの抗体のバリアント（
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ）と
比較してより強力であることを示す。ＨＤＬＭ－２細胞の同様の最大Ｔ細胞媒介性細胞傷
害性は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及びｂｓ
Ｇ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによって
誘導された（図４Ｂ）。対照として含まれた、二価、単一特異性抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬ又はＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＲとのインキュベーションは、これらの細胞
株において細胞傷害性を誘導しなかった。Ｌ５４０細胞の強力な同様のＴ細胞媒介性細胞
傷害性は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及びｂ
ｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによっ
て試験された最も低い濃度（０．０１４μｇ／ｍＬ、図４Ｃ）で誘導された。対照抗体ｂ
ｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はＩｇＧ１－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＡＲは、Ｌ５４０細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導しなかった。
【0234】
結論として、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは
、様々なＣＤ３０発現ＭＣＬ、ＡＬＣＬ、及びＨＬ腫瘍細胞株の強力な殺滅を誘導した。
ＣＤ３アームのＶＨ ＣＤＲ３の１０１位にＨを含有するＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡ
ＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、１０１位にＧを含有するより低親和性のＣＤ
３アームを有するバリアントと比較して、ＣＤ３０発現ＭＣＬ及びＡＬＣＬ腫瘍細胞を殺
滅することにおいてより強力である。
、様々なＣＤ３０発現ＭＣＬ、ＡＬＣＬ、及びＨＬ腫瘍細胞株の強力な殺滅を誘導した。
ＣＤ３アームのＶＨ ＣＤＲ３の１０１位にＨを含有するＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡ
ＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、１０１位にＧを含有するより低親和性のＣＤ
３アームを有するバリアントと比較して、ＣＤ３０発現ＭＣＬ及びＡＬＣＬ腫瘍細胞を殺
滅することにおいてより強力である。
【0235】
標的細胞としてＨＤＬＭ－２細胞（左パネル）又はＮＣＥＢ－１細胞（右パネル）を使
用する細胞傷害性アッセイでは、ＣＦＳＥ陽性細胞の数を絶対Ｔ細胞数の尺度として評価
した。図４Ｄは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ
又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ
によって誘導されたＨＤＬＭ－２及びＮＣＥＢ－１細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性（図４
Ｂを参照されたい）が、Ｔ細胞数における用量依存的増加と関連していたことを示す。一
般的には、同様のＴ細胞数は、このアッセイにおいてｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲとのインキュベーション後に計数した。１μｇ／ｍＬ
よりも高い濃度でｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ
とインキュベートされたＮＣＥＢ－１細胞との共培養物において、低減したＴ細胞数が観
察された。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの実験においてＴ細胞数に影
響を及ぼさなかった。
用する細胞傷害性アッセイでは、ＣＦＳＥ陽性細胞の数を絶対Ｔ細胞数の尺度として評価
した。図４Ｄは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ
又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ
によって誘導されたＨＤＬＭ－２及びＮＣＥＢ－１細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性（図４
Ｂを参照されたい）が、Ｔ細胞数における用量依存的増加と関連していたことを示す。一
般的には、同様のＴ細胞数は、このアッセイにおいてｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲとのインキュベーション後に計数した。１μｇ／ｍＬ
よりも高い濃度でｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ
とインキュベートされたＮＣＥＢ－１細胞との共培養物において、低減したＴ細胞数が観
察された。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの実験においてＴ細胞数に影
響を及ぼさなかった。
【0236】
結論として、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは
、様々なＣＤ３０発現ＡＬＣＬ、ＨＬ及びＭＣＬ腫瘍細胞株の存在下で、Ｔ細胞増殖を誘
導した。
、様々なＣＤ３０発現ＡＬＣＬ、ＨＬ及びＭＣＬ腫瘍細胞株の存在下で、Ｔ細胞増殖を誘
導した。
【0237】
実施例５－Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において発現されたヒト、カニクイザル、又はアカゲザ
ルＣＤ３０へのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の結合
ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０で一過性トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９
３細胞の形質膜への二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体及び単一特異性、二価ＣＤ３０抗体
の結合を、フローサイトメトリーによって分析した。
ルＣＤ３０へのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の結合
ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０で一過性トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９
３細胞の形質膜への二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体及び単一特異性、二価ＣＤ３０抗体
の結合を、フローサイトメトリーによって分析した。
【0238】
ＨＥＫ－２９３Ｆ又はＨＥＫ－２９３細胞におけるヒト、カニクイザル、又はアカゲザル
ＣＤ３０の一過性発現
様々な全長ＣＤ３０バリアントの発現のための以下のコドン最適化された構築物を生成
した：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３０（ｈｕＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアク
セッション番号Ｐ２８９０８）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉ
ｓ）ＣＤ３０（ｍｆＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＷ０７
）（配列番号４０）、及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＣＤ３０（ｍｍ
ＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ１Ｄ５ＲＫ０３）（配列番号４１）
。構築物は、クローニングに好適な制限部位及び最適なＫｏｚａｋ（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ
）配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ １９９９；２３４（２）：１８７－２０８）を含
有した。全長ヒトＣＤ３０、カニクイザル、及びアカゲザルＣＤ３０コドン最適化構築物
を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニ
ングし、本質的に製造業者によって記載されるようにＥｘｐｉ２９３Ｆ発現プラットフォ
ーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ
ＳＡ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２７）を使用して発現させた。実験の別のセットでは、全
長ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０構築物をＨＥＫ－２９３細胞において発現させ
た。
ＣＤ３０の一過性発現
様々な全長ＣＤ３０バリアントの発現のための以下のコドン最適化された構築物を生成
した：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３０（ｈｕＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアク
セッション番号Ｐ２８９０８）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉ
ｓ）ＣＤ３０（ｍｆＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＷ０７
）（配列番号４０）、及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＣＤ３０（ｍｍ
ＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ１Ｄ５ＲＫ０３）（配列番号４１）
。構築物は、クローニングに好適な制限部位及び最適なＫｏｚａｋ（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ
）配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ １９９９；２３４（２）：１８７－２０８）を含
有した。全長ヒトＣＤ３０、カニクイザル、及びアカゲザルＣＤ３０コドン最適化構築物
を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニ
ングし、本質的に製造業者によって記載されるようにＥｘｐｉ２９３Ｆ発現プラットフォ
ーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ
ＳＡ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２７）を使用して発現させた。実験の別のセットでは、全
長ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０構築物をＨＥＫ－２９３細胞において発現させ
た。
【0239】
Ｅｘｐｉ２９３細胞において発現されたヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＣＤ３０へ
のＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎ
ｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において、１００μＬ染色緩衝液
中の抗体（３倍希釈ステップで０．００５～１０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分間イ
ンキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を
、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩
衝液中で１：４００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用
した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、０．４％ＥＤＴＡを含む３０μＬの染色緩衝
液に再懸濁し、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、ＵＳＡ）で分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．
０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ
ＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
のＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎ
ｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において、１００μＬ染色緩衝液
中の抗体（３倍希釈ステップで０．００５～１０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分間イ
ンキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を
、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩
衝液中で１：４００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用
した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、０．４％ＥＤＴＡを含む３０μＬの染色緩衝
液に再懸濁し、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、ＵＳＡ）で分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．
０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ
ＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
【0240】
ＨＥＫ２９３細胞において発現されたヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＣＤ３０への
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．１６３３２０）において、５０μＬ染色緩衝
液中の抗体（４倍希釈ステップで０．０００２～５０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分
間インキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細
胞を、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染
色緩衝液中で１：２００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を
使用した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、１：１０，０００に希釈された０．４％
ＥＤＴＡ及びＴｏＰｒｏ－３生存性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ
３６０５）を含む３０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。細胞を、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎ
ｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）上で分析した。結合曲
線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾
配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．１６３３２０）において、５０μＬ染色緩衝
液中の抗体（４倍希釈ステップで０．０００２～５０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分
間インキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細
胞を、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染
色緩衝液中で１：２００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を
使用した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、１：１０，０００に希釈された０．４％
ＥＤＴＡ及びＴｏＰｒｏ－３生存性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ
３６０５）を含む３０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。細胞を、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎ
ｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）上で分析した。結合曲
線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾
配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
【0241】
ヒトＴ細胞又はカニクイザルＰＢＭＣへのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
カニクイザルＰＢＭＣ（Ｔｅｂｕ－Ｂｉｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ
．ｎｏ．ＰＢＭＣＭＦＡ－１０）又は精製されたヒトＴ細胞を、ポリスチレン９６ウェル
丸底プレートに播種した。Ｔ細胞は、ヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍ
ｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒ
トＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、
ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞（３×１
０４細胞／ウェル）を、３０分間４℃で５０μＬの染色緩衝液中の抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６
０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲの段階希釈（３
倍希釈ステップで０．０００１～１０μｇ／ｍＬの範囲）とインキュベートした。染色緩
衝液で２回洗浄した後、細胞を３０分間４℃で５０μＬの二次Ｒ－ＰＥ複合化ヤギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体中でインキュベートした（１：４００希釈）。染色緩衝液中で２回洗浄した後
、Ｔ細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ３（１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、ク
ローン１０Ｄ１２、ＡＰＣに複合化）、ＣＤ４（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ク
ローンＯＫＴ４、ＡＰＣ－Ｃｙ７に複合化）、ＣＤ８（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＡＦ７００に複合化）、並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９
（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＡＢ２４３９、ＦＩＴＣに複合化
）、ＣＤ２５（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＢＣ９６、ＰＥ－Ｃｙ７に
複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クロー
ンＡＥＨ１２．２Ｈ７、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビ
ーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一
染色試料を、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベ
ーション後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液中に再懸濁し、Ｆ
ＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。Ｆｌ
ｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
カニクイザルＰＢＭＣ（Ｔｅｂｕ－Ｂｉｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ
．ｎｏ．ＰＢＭＣＭＦＡ－１０）又は精製されたヒトＴ細胞を、ポリスチレン９６ウェル
丸底プレートに播種した。Ｔ細胞は、ヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍ
ｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒ
トＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、
ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞（３×１
０４細胞／ウェル）を、３０分間４℃で５０μＬの染色緩衝液中の抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６
０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲの段階希釈（３
倍希釈ステップで０．０００１～１０μｇ／ｍＬの範囲）とインキュベートした。染色緩
衝液で２回洗浄した後、細胞を３０分間４℃で５０μＬの二次Ｒ－ＰＥ複合化ヤギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体中でインキュベートした（１：４００希釈）。染色緩衝液中で２回洗浄した後
、Ｔ細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ３（１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、ク
ローン１０Ｄ１２、ＡＰＣに複合化）、ＣＤ４（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ク
ローンＯＫＴ４、ＡＰＣ－Ｃｙ７に複合化）、ＣＤ８（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＡＦ７００に複合化）、並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９
（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＡＢ２４３９、ＦＩＴＣに複合化
）、ＣＤ２５（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＢＣ９６、ＰＥ－Ｃｙ７に
複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クロー
ンＡＥＨ１２．２Ｈ７、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビ
ーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一
染色試料を、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベ
ーション後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液中に再懸濁し、Ｆ
ＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。Ｆｌ
ｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
【0242】
結果
ＣＤ３０標的化二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６
０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは
、野生型Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（図５Ａ）への結合を示さなかったが、ｈｕＣＤ３０（図
５Ｂ）又はｍｆＣＤ３０（図５Ｃ）でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への
用量依存的結合を示した。これらの二重特異性抗体の結合は、単一特異性、二価ＣＤ３０
抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲの結合と同等であった。予想どおり、
陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲは、野生型又はｈｕＣ
Ｄ３０若しくはｍｆＣＤ３０トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を示
さなかった。同様に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲは、ｈｕＣＤ３０（図１１Ａ）又はｍｆＣＤ３０（図１１Ｂ）でトランスフェクトさ
れたＨＥＫ２９３細胞への用量依存的結合を示し、陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲは、ｈｕＣＤ３０－又はｍｆＣＤ３０－トランスフェクトさ
れたＨＥＫ２９３細胞への結合を示さなかった。これは、ＣＤ３０標的化抗体ＭＤＸ０６
０が、ＨＥＫ細胞において発現されるヒト及びカニクイザルＣＤ３０の両方に、二価及び
一価フォーマットで効率的に結合することを示す。
ＣＤ３０標的化二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６
０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは
、野生型Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（図５Ａ）への結合を示さなかったが、ｈｕＣＤ３０（図
５Ｂ）又はｍｆＣＤ３０（図５Ｃ）でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への
用量依存的結合を示した。これらの二重特異性抗体の結合は、単一特異性、二価ＣＤ３０
抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲの結合と同等であった。予想どおり、
陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲは、野生型又はｈｕＣ
Ｄ３０若しくはｍｆＣＤ３０トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を示
さなかった。同様に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲは、ｈｕＣＤ３０（図１１Ａ）又はｍｆＣＤ３０（図１１Ｂ）でトランスフェクトさ
れたＨＥＫ２９３細胞への用量依存的結合を示し、陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲは、ｈｕＣＤ３０－又はｍｆＣＤ３０－トランスフェクトさ
れたＨＥＫ２９３細胞への結合を示さなかった。これは、ＣＤ３０標的化抗体ＭＤＸ０６
０が、ＨＥＫ細胞において発現されるヒト及びカニクイザルＣＤ３０の両方に、二価及び
一価フォーマットで効率的に結合することを示す。
【0243】
図５Ｄは、ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及び対照二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ｂ１２－ＦＥＡＲが、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞に効率的に結合したことを示す。
これは、これらのＣＤ３標的化二重特異性抗体が、Ｔ細胞上で内因的に発現されるヒト及
びカニクイザルＣＤ３の両方に効率的に結合することを示す。ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０二価、親抗体は、ヒト又はカニクイザルＴ細胞に結合せず、ＣＤ３０がこれらの
細胞上で発現されなかったことを示した。
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及び対照二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ｂ１２－ＦＥＡＲが、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞に効率的に結合したことを示す。
これは、これらのＣＤ３標的化二重特異性抗体が、Ｔ細胞上で内因的に発現されるヒト及
びカニクイザルＣＤ３の両方に効率的に結合することを示す。ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０二価、親抗体は、ヒト又はカニクイザルＴ細胞に結合せず、ＣＤ３０がこれらの
細胞上で発現されなかったことを示した。
【0244】
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体及び単一特異性親ＣＤ３０抗体のパネルの、ｈｕＣＤ
３０又はｍｍＣＤ３０でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を、フロ
ーサイトメトリーによって評価した。ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（図６Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（図６Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（図６Ｃ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（図６Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（図６Ｆ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０
８－ＦＥＡＲ（図６Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－
ＦＥＡＲ（図６Ｈ）は、ｈｕＣＤ３０又はｍｍＣＤ３０を発現する細胞への等しい結合を
示した。同様に、親、単一特異性ＣＤ３０抗体クローンは、ｈｕＣＤ３０又はｍｍＣＤ３
０を発現する細胞に等しい結合を示した。対照的に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ及び親、単一特異性ＣＤ３０抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０
－ＨｅＦｉ－Ｉ＿ＦＥＡＲは、ｈｕＣＤ３０への結合を示したが、ｍｍＣＤ３０への結合
は示さなかった（図６Ｄ）。
３０又はｍｍＣＤ３０でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を、フロ
ーサイトメトリーによって評価した。ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（図６Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（図６Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（図６Ｃ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（図６Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（図６Ｆ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０
８－ＦＥＡＲ（図６Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－
ＦＥＡＲ（図６Ｈ）は、ｈｕＣＤ３０又はｍｍＣＤ３０を発現する細胞への等しい結合を
示した。同様に、親、単一特異性ＣＤ３０抗体クローンは、ｈｕＣＤ３０又はｍｍＣＤ３
０を発現する細胞に等しい結合を示した。対照的に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ及び親、単一特異性ＣＤ３０抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０
－ＨｅＦｉ－Ｉ＿ＦＥＡＲは、ｈｕＣＤ３０への結合を示したが、ｍｍＣＤ３０への結合
は示さなかった（図６Ｄ）。
【0245】
実施例６－ＤＳＦ分析による単一特異性及び二重特異性非活性化抗体バリアントの立体構
造安定性の評価
定常重鎖領域に非活性化変異を保有する二価単一特異性ＣＤ３０、ＣＤ３、及び二重特
異性ＣＤ３ｘＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体バリアントのタンパク質安定性特徴を、示差走査蛍
光定量法（ＤＳＦ）を使用して評価した。
造安定性の評価
定常重鎖領域に非活性化変異を保有する二価単一特異性ＣＤ３０、ＣＤ３、及び二重特
異性ＣＤ３ｘＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体バリアントのタンパク質安定性特徴を、示差走査蛍
光定量法（ＤＳＦ）を使用して評価した。
【0246】
ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－
ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣ
Ｄ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの試料を、約１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４
で製剤化した。
ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣ
Ｄ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの試料を、約１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４
で製剤化した。
【0247】
立体構造安定性を評価するために、ＤＳＦを、ＩｇＧの展開時に露出した疎水性領域へ
の外因性染料Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ（ＤＭＳＯ中の５０００倍濃縮物、Ｃａｔ ＃
Ｓ５６９２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の結合によって引き起こされる蛍光強度の変
化を検出することができるｉＱ５多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ
）において行った。Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅを、ｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で３２０倍に希釈した。熱融解曲線は、分析されたＩ
ｇＧの制御された段階的な熱変性の間に増加する蛍光を測定することから導出することが
できる。したがって、５μＬの抗体溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）の重複試料を、ｉＱ
９６ウェルＰＣＲプレートにおいてｐＨ７．４のＰＢＳ中の２０μＬの希釈されたＳｙｐ
ｒｏ－Ｏｒａｎｇｅに添加した。蛍光は、増分当たり０．５℃の段階的増分及び１５秒の
持続時間と全てのウェルの蛍光を記録するのに必要な時間で、２５℃～９５℃の範囲の増
加する温度で記録した。データを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ ３．０を使用して分析し、融点を、ソフトウェアによって蛍光対温度グラフか
ら決定した。
の外因性染料Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ（ＤＭＳＯ中の５０００倍濃縮物、Ｃａｔ ＃
Ｓ５６９２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の結合によって引き起こされる蛍光強度の変
化を検出することができるｉＱ５多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ
）において行った。Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅを、ｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で３２０倍に希釈した。熱融解曲線は、分析されたＩ
ｇＧの制御された段階的な熱変性の間に増加する蛍光を測定することから導出することが
できる。したがって、５μＬの抗体溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）の重複試料を、ｉＱ
９６ウェルＰＣＲプレートにおいてｐＨ７．４のＰＢＳ中の２０μＬの希釈されたＳｙｐ
ｒｏ－Ｏｒａｎｇｅに添加した。蛍光は、増分当たり０．５℃の段階的増分及び１５秒の
持続時間と全てのウェルの蛍光を記録するのに必要な時間で、２５℃～９５℃の範囲の増
加する温度で記録した。データを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ ３．０を使用して分析し、融点を、ソフトウェアによって蛍光対温度グラフか
ら決定した。
【0248】
結果
図７及び表８は、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの融解温度（Ｔｍ）が
６９．０℃であることを示し、これは、ｐＨ７．４（６４．５℃）でのＩｇＧ１－ＣＤ３
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのＴｍよりも高い。これは、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＲＲが、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲよりも高い立体構造安
定性を有することを示し、ＦＥＲバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
が、ＦＥＡバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０よりも高い立体構造安
定性を有することを示す。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－
ＦＥＲＲの融解温度は、６４．５℃であることが決定され、これは、２つの親抗体ＩｇＧ
１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ（６２．５℃）及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲ（６９．０℃）について決定されたＴｍの間である。
図７及び表８は、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの融解温度（Ｔｍ）が
６９．０℃であることを示し、これは、ｐＨ７．４（６４．５℃）でのＩｇＧ１－ＣＤ３
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのＴｍよりも高い。これは、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＲＲが、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲよりも高い立体構造安
定性を有することを示し、ＦＥＲバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
が、ＦＥＡバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０よりも高い立体構造安
定性を有することを示す。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－
ＦＥＲＲの融解温度は、６４．５℃であることが決定され、これは、２つの親抗体ＩｇＧ
１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ（６２．５℃）及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲ（６９．０℃）について決定されたＴｍの間である。
【表9】
【0249】
実施例７－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのＴ細
胞及び腫瘍細胞への同時結合
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの腫瘍細胞及び
ナイーブＴ細胞への同時結合を研究した。
胞及び腫瘍細胞への同時結合
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの腫瘍細胞及び
ナイーブＴ細胞への同時結合を研究した。
【0250】
健常ドナーから単離された凍結Ｔ細胞を解凍し、０．２５ｍＭのＣｅｌｌｔｒａｃｅ
Ｖｉｏｌｅｔ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ ｎｏ．Ｃ３
４５５７Ａ）で３７℃で１５分間標識した。Ｌ－４２８腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ
ＦａｒＲｅｄ（ＡＰＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ）で３
７℃で１５分間標識し、Ｔ細胞に１：１のＥ：Ｔ比で添加した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、
若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液を添加し（６ｘ１０－５～１０μｇ／
ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、細胞を４℃で２時間インキュベートした。インキ
ュベーション後、生存性マーカー７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．ｎ
ｏ ５５９９２５）を添加し（１００倍最終希釈液）、細胞をＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ
フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
Ｖｉｏｌｅｔ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ ｎｏ．Ｃ３
４５５７Ａ）で３７℃で１５分間標識した。Ｌ－４２８腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ
ＦａｒＲｅｄ（ＡＰＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ）で３
７℃で１５分間標識し、Ｔ細胞に１：１のＥ：Ｔ比で添加した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、
若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液を添加し（６ｘ１０－５～１０μｇ／
ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、細胞を４℃で２時間インキュベートした。インキ
ュベーション後、生存性マーカー７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．ｎ
ｏ ５５９９２５）を添加し（１００倍最終希釈液）、細胞をＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ
フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
【0251】
結果
図１２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
腫瘍細胞のＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲ媒介性架橋（同時結合）の尺度としてＣＤ３＋ＣＤ３０＋二重陽性事象（フローサイ
トメトリー染色においてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ
Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞）の形成を誘導することを示す。二重陽性事象の増加
は、抗体濃度依存的であり、ベル形状の曲線を示した。対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲ
Ｒ、若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬとインキュベートされた試料、又は抗体なしで
インキュベートされた試料において、腫瘍細胞及びＴ細胞の架橋の増加は観察されなかっ
た（Ａ）。図１２Ｂは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ
Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞のパーセンテージによって検出される、腫瘍細胞及び
ナイーブＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲ
Ｒの同時結合を示す（Ｂ）。
図１２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
腫瘍細胞のＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲ媒介性架橋（同時結合）の尺度としてＣＤ３＋ＣＤ３０＋二重陽性事象（フローサイ
トメトリー染色においてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ
Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞）の形成を誘導することを示す。二重陽性事象の増加
は、抗体濃度依存的であり、ベル形状の曲線を示した。対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲ
Ｒ、若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬとインキュベートされた試料、又は抗体なしで
インキュベートされた試料において、腫瘍細胞及びＴ細胞の架橋の増加は観察されなかっ
た（Ａ）。図１２Ｂは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ
Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞のパーセンテージによって検出される、腫瘍細胞及び
ナイーブＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲ
Ｒの同時結合を示す（Ｂ）。
【0252】
これらのデータは、ｂｓＧｌｈｕＣＤ３ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ
が、ＣＤ３０＋腫瘍細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞を同時に結合及び架橋することができること
を示す。
が、ＣＤ３０＋腫瘍細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞を同時に結合及び架橋することができること
を示す。
【0253】
実施例８－ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体によるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害
性及びＴ細胞活性化の誘導
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のパネルによるＫａｒｐａｓ－２９９腫瘍細胞のＴ細
胞媒介性細胞傷害性及び関連するＴ細胞活性化を評価した。以下の抗体を評価した：ｂｓ
Ｇ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ
－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡ
Ｒ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－
Ｔ２１５－ＦＥＡＲ。
性及びＴ細胞活性化の誘導
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のパネルによるＫａｒｐａｓ－２９９腫瘍細胞のＴ細
胞媒介性細胞傷害性及び関連するＴ細胞活性化を評価した。以下の抗体を評価した：ｂｓ
Ｇ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ
－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡ
Ｒ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕ
ＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－
Ｔ２１５－ＦＥＡＲ。
【0254】
Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、
Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細
胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ
．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌ
ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５７Ａ、最
終濃度５μＭ）で１５分間３７℃で標識した。並行して、Ｋａｒｐａｓ－２９９腫瘍細胞
を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４
５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷Ｄ
ＢＳＩを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁
し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ
－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に
播種した。二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体の段階希釈液（１，０００～０．０５１ｎｇ
／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）を添加し、プレートを室温で１５分間インキュベ
ートした。Ｔ細胞を、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プ
レートを７２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％ア
ジド（染色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉ
ｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、
ＣＤ８（１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＩＴＣに複合化）、及びＴ細胞
活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１０９３４
、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ－１（１：５
０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複合化）について
染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．
０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に使
用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄し、
細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０分間染色した。ＦＡ
ＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析した。Ｆ
ｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細
胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ
．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌ
ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５７Ａ、最
終濃度５μＭ）で１５分間３７℃で標識した。並行して、Ｋａｒｐａｓ－２９９腫瘍細胞
を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４
５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷Ｄ
ＢＳＩを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁
し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ
－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に
播種した。二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体の段階希釈液（１，０００～０．０５１ｎｇ
／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）を添加し、プレートを室温で１５分間インキュベ
ートした。Ｔ細胞を、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プ
レートを７２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％ア
ジド（染色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉ
ｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、
ＣＤ８（１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＩＴＣに複合化）、及びＴ細胞
活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１０９３４
、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ－１（１：５
０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複合化）について
染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．
０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に使
用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄し、
細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０分間染色した。ＦＡ
ＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析した。Ｆ
ｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
【0255】
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（Ｇｒａｐ
ｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線形回
帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
ｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線形回
帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
【0256】
結果
図１３Ａ及びＢは、全てのＣＤ３×ＣＤ３０抗体が、Ｋａｒｐａｓ－２９９細胞のＴ細
胞媒介性細胞傷害性を誘導することを示す。ＣＤ３０クローンＭＤＸ０６０（ｂｓＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ）を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０
二重特異性抗体は、試験された全ての他のクローンと比較して、Ｋａｒｐａｓ－２９９細
胞を殺滅することにおいてより効果的であった。実際には、ＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３
ｘＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０クローンＨＲＳ－３、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ１０５、
Ｔ４０５、Ｔ４０８、又はＴ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗
体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ
４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、
及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ａ）より
も有意に低いＩＣ５０値を示した。更に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－
ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
－ＦＥＡＲは、ＣＤ３０クローンｈＡＣ１０、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ４０８、又は
Ｔ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ
３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５
－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂ
ｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ｂ）と比較して
より高い最大殺滅を誘導した。図１３Ｃ及びＤは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣ
Ｄ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＡＲが、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ｃ）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｄ）に
おけるＴ細胞活性化の尺度として、ＣＤ２５の発現を誘導することに、他のＣＤ３ｘＣＤ
３０二重特異性抗体のいずれかよりも有効（低いＥＣ５０値）であることを示す。ＰＤ－
１（図１３Ｅ及びＦ）及びＣＤ６９（データ図示せず）の発現について同様の結果が観察
された。ＦＥＡＲ又はＦＥＲＲ変異を含む２つのＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３×ＣＤ３０
二重特異性抗体間で、Ｔ細胞媒介性殺滅又はＴ細胞活性化における差は観察されなかった
。
図１３Ａ及びＢは、全てのＣＤ３×ＣＤ３０抗体が、Ｋａｒｐａｓ－２９９細胞のＴ細
胞媒介性細胞傷害性を誘導することを示す。ＣＤ３０クローンＭＤＸ０６０（ｂｓＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ）を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０
二重特異性抗体は、試験された全ての他のクローンと比較して、Ｋａｒｐａｓ－２９９細
胞を殺滅することにおいてより効果的であった。実際には、ＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３
ｘＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０クローンＨＲＳ－３、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ１０５、
Ｔ４０５、Ｔ４０８、又はＴ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗
体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥ
ＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ
４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、
及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ａ）より
も有意に低いＩＣ５０値を示した。更に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－
ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
－ＦＥＡＲは、ＣＤ３０クローンｈＡＣ１０、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ４０８、又は
Ｔ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ
３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５
－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂ
ｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ｂ）と比較して
より高い最大殺滅を誘導した。図１３Ｃ及びＤは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣ
Ｄ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＡＲが、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ｃ）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｄ）に
おけるＴ細胞活性化の尺度として、ＣＤ２５の発現を誘導することに、他のＣＤ３ｘＣＤ
３０二重特異性抗体のいずれかよりも有効（低いＥＣ５０値）であることを示す。ＰＤ－
１（図１３Ｅ及びＦ）及びＣＤ６９（データ図示せず）の発現について同様の結果が観察
された。ＦＥＡＲ又はＦＥＲＲ変異を含む２つのＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３×ＣＤ３０
二重特異性抗体間で、Ｔ細胞媒介性殺滅又はＴ細胞活性化における差は観察されなかった
。
【0257】
二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３ｘＣＤ３０－ＭＸ０６０はまた、試験された他の
パネルＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体と比較して、Ｌ－４２８細胞のＴ細胞媒介性細胞
傷害性を誘導することにより有効であった（データ図示せず）。
パネルＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体と比較して、Ｌ－４２８細胞のＴ細胞媒介性細胞
傷害性を誘導することにより有効であった（データ図示せず）。
【0258】
これらの実験において使用されたＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のパネルによって誘
導されたＴ細胞媒介性細胞傷害性の平均ＩＣ５０濃度及び最大溶解パーセント、並びにＴ
細胞活性化（ＣＤ２５発現）のＥＣ５０濃度を表９に要約する。
導されたＴ細胞媒介性細胞傷害性の平均ＩＣ５０濃度及び最大溶解パーセント、並びにＴ
細胞活性化（ＣＤ２５発現）のＥＣ５０濃度を表９に要約する。
【0259】
結論として、これらのデータは、ｂｓＧ１ｈｕＣＤ３×ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０が、Ｔ
細胞媒介性細胞傷害性を誘導することに評価された他のＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体
のいずれかよりも有効であったことを実証した。
実施例９－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる
インビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性、Ｔ細胞増殖、及びＴ細胞活性化の誘導
腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性並びにｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる関連するＴ細胞増殖及び活性化を、ＨＬ及びＡＬＣＬ細
胞株において評価した。Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳ
ｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した
。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．Ｃ３４５５７Ａ、最終濃度５μＭ）で１５分間３７℃で標識した。並行して、腫瘍細胞
Ｌ－４２８、ＫＩ－ＪＫ、ＫＭ－Ｈ２、又はＳＵＰ－Ｍ２を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｆａ
ｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で
１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを添加し、ＲＴで５分間
インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細
胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎ
ｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に播種した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－
ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液を添加し（１，０００～０．０５１ｎｇ
／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、プレートをＲＴで１５分間インキュベートした
。Ｔ細胞を、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを
７２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染
色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇ
ｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（
１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３４５７７２、ＦＩＴＣに
複合化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ
．ｎｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７
９／ＰＤ－１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０
５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメ
ーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色
緩衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１
０分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し
て細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処
理した。
細胞媒介性細胞傷害性を誘導することに評価された他のＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体
のいずれかよりも有効であったことを実証した。
【表10】
インビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性、Ｔ細胞増殖、及びＴ細胞活性化の誘導
腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性並びにｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０
－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる関連するＴ細胞増殖及び活性化を、ＨＬ及びＡＬＣＬ細
胞株において評価した。Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳ
ｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した
。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．Ｃ３４５５７Ａ、最終濃度５μＭ）で１５分間３７℃で標識した。並行して、腫瘍細胞
Ｌ－４２８、ＫＩ－ＪＫ、ＫＭ－Ｈ２、又はＳＵＰ－Ｍ２を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｆａ
ｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で
１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを添加し、ＲＴで５分間
インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細
胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎ
ｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に播種した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－
ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液を添加し（１，０００～０．０５１ｎｇ
／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、プレートをＲＴで１５分間インキュベートした
。Ｔ細胞を、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを
７２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染
色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇ
ｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（
１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３４５７７２、ＦＩＴＣに
複合化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ
．ｎｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７
９／ＰＤ－１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０
５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメ
ーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色
緩衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１
０分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し
て細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処
理した。
【0260】
生きた標的細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して計算した：－生きた標的細胞
％＝（各条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数
／いずれの抗体も加えることなく標的細胞及びＴ細胞のみを含む条件における生きた、単
一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数）×１００。
％＝（各条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数
／いずれの抗体も加えることなく標的細胞及びＴ細胞のみを含む条件における生きた、単
一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数）×１００。
【0261】
Ｔ細胞増殖を、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞を希釈されたＣｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉ
ｏｌｅｔ染色でゲーティングすることによって評価した。増殖指数を、ＦｌｏｗＪｏの増
殖モデリングツールを使用して計算した。生成ピークを自動的に適合させ、増殖指数値を
以下の式に従って計算した：
ｏｌｅｔ染色でゲーティングすることによって評価した。増殖指数を、ＦｌｏｗＪｏの増
殖モデリングツールを使用して計算した。生成ピークを自動的に適合させ、増殖指数値を
以下の式に従って計算した：
【0262】
増殖指数＝細胞の総量／培養の開始時の細胞の量＝（Ｇ０＋Ｇ１＋Ｇ２＋Ｇ３＋Ｇ４＋
Ｇ５＋Ｇ６）／（Ｇ０＋Ｇ１：２＋Ｇ２：４＋Ｇ３：８＋Ｇ４：１６＋Ｇ５：３２＋Ｇ６
：６４）。Ｇｎ＝生成ｎピークにおける細胞数（ｎ＝０～６）。
Ｇ５＋Ｇ６）／（Ｇ０＋Ｇ１：２＋Ｇ２：４＋Ｇ３：８＋Ｇ４：１６＋Ｇ５：３２＋Ｇ６
：６４）。Ｇｎ＝生成ｎピークにおける細胞数（ｎ＝０～６）。
【0263】
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（Ｇｒａｐ
ｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線形回
帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
ｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線形回
帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
【0264】
結果
図１４は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
インビトロでＬ－４２８（ＨＬ）、ＫＭ－Ｈ２（ＨＬ）、ＳＵＰ－Ｍ２（ＡＬＣＬ）、及
びＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞株において用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導した
ことを示す。Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるＴ細胞媒介性細胞傷害性の平均Ｉ
Ｃ５０濃度を表１０に要約する。対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲ
Ｒ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１
２－ＦＥＡＬとインキュベートされた細胞において、又は抗体なしでインキュベートされ
た試料において、細胞傷害性は観察されなかった。
図１４は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
インビトロでＬ－４２８（ＨＬ）、ＫＭ－Ｈ２（ＨＬ）、ＳＵＰ－Ｍ２（ＡＬＣＬ）、及
びＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞株において用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導した
ことを示す。Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるＴ細胞媒介性細胞傷害性の平均Ｉ
Ｃ５０濃度を表１０に要約する。対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲ
Ｒ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１
２－ＦＥＡＬとインキュベートされた細胞において、又は抗体なしでインキュベートされ
た試料において、細胞傷害性は観察されなかった。
【0265】
図１５、１６、１７、及び１８は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されたＬ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞のＴ細胞媒介性細
胞傷害性が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖（図１５）並びにＴ細胞活性化マーカー
ＣＤ６９（図１６）、ＣＤ２５（図１７）、及びＰＤ－１（図１８）の発現と関連してい
たことを示す。これらの実験におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるＴ細胞増殖及び活性化の平均ＥＣ５０濃度を表１
０に要約する。
Ｘ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されたＬ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞のＴ細胞媒介性細
胞傷害性が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖（図１５）並びにＴ細胞活性化マーカー
ＣＤ６９（図１６）、ＣＤ２５（図１７）、及びＰＤ－１（図１８）の発現と関連してい
たことを示す。これらの実験におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるＴ細胞増殖及び活性化の平均ＥＣ５０濃度を表１
０に要約する。
【0266】
したがって、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは
、インビトロでＨＬ及びＡＬＣＬ細胞株における用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導
し、これは、Ｔ細胞増殖及び活性化と関連していた。
、インビトロでＨＬ及びＡＬＣＬ細胞株における用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導
し、これは、Ｔ細胞増殖及び活性化と関連していた。
【0267】
【表11】
【0268】
実施例１０－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによ
るインビトロでのサイトカイン産生の誘導
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導さ
れるサイトカイン及びグランザイムＢ産生は、実施例９に記載されるように、Ｌ－４２８
標的細胞及び健常なドナーＴ細胞を用いたインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害性実験中に収
集された上清において評価した。上清は、－２０℃で保存し、分析のために解凍した。１
４の異なるサイトカイン（ＣＤ４０、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、
ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＰＤ
Ｌ－１、ＴＮＦα）及びグランザイムＢの濃度を、Ｒ＆Ｄシステムによってカスタムメイ
ドのビーズベースの多重免疫アッセイ（ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して測定した。
るインビトロでのサイトカイン産生の誘導
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導さ
れるサイトカイン及びグランザイムＢ産生は、実施例９に記載されるように、Ｌ－４２８
標的細胞及び健常なドナーＴ細胞を用いたインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害性実験中に収
集された上清において評価した。上清は、－２０℃で保存し、分析のために解凍した。１
４の異なるサイトカイン（ＣＤ４０、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、
ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＰＤ
Ｌ－１、ＴＮＦα）及びグランザイムＢの濃度を、Ｒ＆Ｄシステムによってカスタムメイ
ドのビーズベースの多重免疫アッセイ（ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して測定した。
【0269】
結果
増加した濃度は、主にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－Ｆ
ＥＲＲの存在下でのＬ－４２８細胞及びＴ細胞の共培養物からの上清中のグランザイムＢ
並びにサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ－１３、及びＴＮＦα（＞２０００ｐｇ／ｍＬ）につ
いて観察された。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較されるとき、ＣＤ４０、Ｉ
Ｌ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ６、及びＩＰ－１０サイ
トカイン濃度について中程度の増加が観察された。ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、及びＰＤＬ１
のレベルは、対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較して調節されなかった（図１９
）。
増加した濃度は、主にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－Ｆ
ＥＲＲの存在下でのＬ－４２８細胞及びＴ細胞の共培養物からの上清中のグランザイムＢ
並びにサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ－１３、及びＴＮＦα（＞２０００ｐｇ／ｍＬ）につ
いて観察された。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較されるとき、ＣＤ４０、Ｉ
Ｌ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ６、及びＩＰ－１０サイ
トカイン濃度について中程度の増加が観察された。ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、及びＰＤＬ１
のレベルは、対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較して調節されなかった（図１９
）。
【0270】
よって、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞活性化は、サイトカイン及びグランザイムＢの用量依
存的産生と関連していた。
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞活性化は、サイトカイン及びグランザイムＢの用量依
存的産生と関連していた。
【0271】
実施例１１－変動するエフェクター対標的比で精製されたＴ細胞をエフェクター細胞とし
て使用したｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる
インビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性の誘導
二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ
の存在下でのＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の最適なエフェクター対標的細胞比を決定するた
めに、インビトロ細胞傷害性アッセイを、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を標的細胞
として、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として変動するエフェクター対標的細胞（
Ｅ：Ｔ）比で使用して行った。
て使用したｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる
インビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性の誘導
二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ
の存在下でのＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の最適なエフェクター対標的細胞比を決定するた
めに、インビトロ細胞傷害性アッセイを、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を標的細胞
として、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として変動するエフェクター対標的細胞（
Ｅ：Ｔ）比で使用して行った。
【0272】
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を、Ｔ細胞が１：１、２：１、４：１、又は８：１の変動する
エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で腫瘍細胞に添加されたことを除いて、本質的に実
施例９に記載されるように評価した。
エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で腫瘍細胞に添加されたことを除いて、本質的に実
施例９に記載されるように評価した。
【0273】
結果
図２０Ａは、用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ
ｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって全てのＥ：Ｔ比で誘導され、最大の腫瘍細
胞殺滅（２０％未満の生存腫瘍細胞）が４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察されたことを
示す。これに沿って、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、全てのＥ：Ｔ細胞比で、最
も顕著には４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察された（図２０Ｂ－Ｃ）。試験されたＥ：
Ｔ比のいずれでも、対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲによっ
て特異的なＴ細胞媒介性細胞傷害性又はＴ細胞増殖は誘導されなかった。
図２０Ａは、用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ
ｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって全てのＥ：Ｔ比で誘導され、最大の腫瘍細
胞殺滅（２０％未満の生存腫瘍細胞）が４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察されたことを
示す。これに沿って、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、全てのＥ：Ｔ細胞比で、最
も顕著には４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察された（図２０Ｂ－Ｃ）。試験されたＥ：
Ｔ比のいずれでも、対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲによっ
て特異的なＴ細胞媒介性細胞傷害性又はＴ細胞増殖は誘導されなかった。
【0274】
併せると、これらのデータは、インビトロでのＬ－４２８腫瘍細胞のｂｓＧ１－ｈｕＣ
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が、
４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で最も効果的であったことを示す。
Ｄ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が、
４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で最も効果的であったことを示す。
【0275】
実施例１２－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによ
るインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖の動態
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ
細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の動態を評価するために、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を
標的細胞として精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用して、変動するインキュ
ベーション期間でインビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。
るインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖の動態
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ
細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の動態を評価するために、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を
標的細胞として精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用して、変動するインキュ
ベーション期間でインビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。
【0276】
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は、腫瘍細胞細胞傷害性及びＴ細胞増殖が２４時間、４８時間
及び７２時間後に評価されたことを除いて、本質的に実施例９に記載されるように評価し
た。
及び７２時間後に評価されたことを除いて、本質的に実施例９に記載されるように評価し
た。
【0277】
結果
図２１は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
４８時間及び７２時間後に用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したが、２４時間後
に有意なＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかったことを示す。用量依存的ＣＤ４＋及
びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、７２時間後にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－
ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されたが、２４時間又は４８時間後にＴ細胞増殖は
観察されなかった（図２１Ｂ及びＣ）。
図２１は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
４８時間及び７２時間後に用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したが、２４時間後
に有意なＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかったことを示す。用量依存的ＣＤ４＋及
びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、７２時間後にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－
ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されたが、２４時間又は４８時間後にＴ細胞増殖は
観察されなかった（図２１Ｂ及びＣ）。
【0278】
併せると、これらのデータは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＲＲが時間依存的な方法で腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖
を誘導したことを示す。
６０－ＦＥＲＲが時間依存的な方法で腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖
を誘導したことを示す。
【0279】
実施例１３－インビトロでのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性とのＣＤ３０発現レベルの相関
８つのＣＤ３０発現腫瘍細胞株のｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性殺滅を、実施例９に記載されるインビトロ細胞傷害
性アッセイにおいて、４：１のＥ：Ｔ比を使用して決定した。以下の細胞株を使用した：
Ｌ－４２８、ＫＭ－Ｈ２、ＤＥＬ、ＫＩ－ＪＫ、ＫＡＲＰＡＳ－２９９、ＳＵＰ－Ｍ２、
ＮＣＥＢ－１及びＪＶＭ－２。これらの腫瘍細胞株について、ＣＤ３０発現レベルを、実
施例２で詳述される定量的フローサイトメトリーによって評価した。
－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性とのＣＤ３０発現レベルの相関
８つのＣＤ３０発現腫瘍細胞株のｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性殺滅を、実施例９に記載されるインビトロ細胞傷害
性アッセイにおいて、４：１のＥ：Ｔ比を使用して決定した。以下の細胞株を使用した：
Ｌ－４２８、ＫＭ－Ｈ２、ＤＥＬ、ＫＩ－ＪＫ、ＫＡＲＰＡＳ－２９９、ＳＵＰ－Ｍ２、
ＮＣＥＢ－１及びＪＶＭ－２。これらの腫瘍細胞株について、ＣＤ３０発現レベルを、実
施例２で詳述される定量的フローサイトメトリーによって評価した。
【0280】
結果
図２２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
６８％～９８％の最大標的細胞殺滅でインビトロで全ての細胞株においてＴ細胞媒介性細
胞傷害性を誘導したことを示す。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＲＲによる最大Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅は、ＣＤ３０発現のレベルと有意に
相関していた（図２２Ａ）。
図２２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、
６８％～９８％の最大標的細胞殺滅でインビトロで全ての細胞株においてＴ細胞媒介性細
胞傷害性を誘導したことを示す。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＲＲによる最大Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅は、ＣＤ３０発現のレベルと有意に
相関していた（図２２Ａ）。
【0281】
図２２Ｂでは、各細胞株についてｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ細胞媒介性殺滅のＥＣ５０を、ＣＤ３０発現レベルに対
してプロットし、陰性であるが有意ではない傾向を示す。
０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ細胞媒介性殺滅のＥＣ５０を、ＣＤ３０発現レベルに対
してプロットし、陰性であるが有意ではない傾向を示す。
【0282】
よって、これらのデータは、インビトロでのＣＤ３０発現レベルとｂｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性最大Ｔ細胞媒介性細胞傷害性と
の間の正の相関を示す。
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性最大Ｔ細胞媒介性細胞傷害性と
の間の正の相関を示す。
【0283】
実施例１４－ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによ
る活性化されたＴ細胞のフラトリサイド
活性化されたＣＤ３０＋Ｔ細胞のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞フラトリサイドをインビトロで評価した。
る活性化されたＴ細胞のフラトリサイド
活性化されたＣＤ３０＋Ｔ細胞のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞フラトリサイドをインビトロで評価した。
【0284】
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ
ｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）を、１００μＬのＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ
３（クローンＯＫＴ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１６－００３７－８５）
の溶液でコーティングした。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。抗体溶液を
除去した後、１００μＬのＰＢＳでウェルを洗浄した。Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフ
ィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の
指示に従って使用して単離した。精製されたＴ細胞を、１０％の鉄を含む熱不活性化ドナ
ーウシ血清（ＤＢＳＩ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ．２０７３１－０３０）及びペニシリ
ン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＥ１７－
６０３Ｅ）で補足された、Ｔ細胞培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミン（Ｌｏ
ｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍ
ｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＲＰＭＩ］－１６４０培地）に２×１０６細胞／ｍＬ
の濃度で再懸濁し、１００μＬのＴ細胞懸濁液（２００，０００個のＴ細胞を含有する）
を、抗ＣＤ３コーティングされたプレートの各ウェルに添加した。更に、２μｇ／ｍＬの
抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１６－０２
８９－８５）及び０．０５μｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ
．ｎｏ．ＰＨＣ９１５１）で補足された１００μＬのＴ細胞培養培地を各ウェルに添加し
た。次いで、Ｔ細胞を３７℃で９６時間インキュベートした。
ｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）を、１００μＬのＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ
３（クローンＯＫＴ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１６－００３７－８５）
の溶液でコーティングした。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。抗体溶液を
除去した後、１００μＬのＰＢＳでウェルを洗浄した。Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフ
ィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の
指示に従って使用して単離した。精製されたＴ細胞を、１０％の鉄を含む熱不活性化ドナ
ーウシ血清（ＤＢＳＩ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ．２０７３１－０３０）及びペニシリ
ン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＥ１７－
６０３Ｅ）で補足された、Ｔ細胞培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミン（Ｌｏ
ｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍ
ｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＲＰＭＩ］－１６４０培地）に２×１０６細胞／ｍＬ
の濃度で再懸濁し、１００μＬのＴ細胞懸濁液（２００，０００個のＴ細胞を含有する）
を、抗ＣＤ３コーティングされたプレートの各ウェルに添加した。更に、２μｇ／ｍＬの
抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１６－０２
８９－８５）及び０．０５μｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ
．ｎｏ．ＰＨＣ９１５１）で補足された１００μＬのＴ細胞培養培地を各ウェルに添加し
た。次いで、Ｔ細胞を３７℃で９６時間インキュベートした。
【0285】
９６時間後、Ｔ細胞を収集し、２×１０６細胞／ｍＬの濃度でＴ細胞培地に再懸濁させ
た。フローサイトメトリー分析を行って、ＣＤ３０及びＴ細胞活性化マーカーの発現を測
定した。簡潔には、細胞のアリコートをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染
色緩衝液）で洗浄し、５０μＬの１０００倍希釈ＦＶＳ５１０生存性色素（ＢＤ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５６４４０６）で染色し、１５分間室温でインキュベ
ートした。次いで、細胞を染色緩衝液で洗浄し、ＣＤ３０（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎ
ｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３３３９０６、ＰＥに複合化）、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、
Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５０６、ＦＩＴＣに複合化）、ＣＤ８（１：
１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３０１０２８、ＡＦ７００に複合化）、及
びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１
０９１０、ＡＰＣに複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．
ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：
５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９２４、ＢＶ６０５に複合化）につい
て染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に
使用した。４℃で３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄した
。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析し、
ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを処理した。
た。フローサイトメトリー分析を行って、ＣＤ３０及びＴ細胞活性化マーカーの発現を測
定した。簡潔には、細胞のアリコートをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染
色緩衝液）で洗浄し、５０μＬの１０００倍希釈ＦＶＳ５１０生存性色素（ＢＤ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５６４４０６）で染色し、１５分間室温でインキュベ
ートした。次いで、細胞を染色緩衝液で洗浄し、ＣＤ３０（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎ
ｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３３３９０６、ＰＥに複合化）、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、
Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５０６、ＦＩＴＣに複合化）、ＣＤ８（１：
１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３０１０２８、ＡＦ７００に複合化）、及
びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１
０９１０、ＡＰＣに複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．
ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：
５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９２４、ＢＶ６０５に複合化）につい
て染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に
使用した。４℃で３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄した
。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析し、
ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを処理した。
【0286】
ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが活性化された
Ｔ細胞のフラトリサイドを誘導することができるかを評価するために、刺激されたＴ細胞
を、２００，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。その後、５０
μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又は、対
照抗体、すなわち、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、若しくはＩｇＧ１
－ｂ１２を、各ウェルに添加した（Ｔ細胞培地中での３倍希釈ステップにおける０．００
３～３．３μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度）。プレートを３７℃で４８時間インキュベート
した。
Ｔ細胞のフラトリサイドを誘導することができるかを評価するために、刺激されたＴ細胞
を、２００，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。その後、５０
μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又は、対
照抗体、すなわち、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、若しくはＩｇＧ１
－ｂ１２を、各ウェルに添加した（Ｔ細胞培地中での３倍希釈ステップにおける０．００
３～３．３μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度）。プレートを３７℃で４８時間インキュベート
した。
【0287】
染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、ＦＶＳ５１０生存性染料で染色し、結果として
Ｔ細胞マーカーＣＤ４及びＣＤ８、並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ２５、及
びＣＤ２７９／ＰＤ１について染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリー分析を行い、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
Ｔ細胞マーカーＣＤ４及びＣＤ８、並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ２５、及
びＣＤ２７９／ＰＤ１について染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリー分析を行い、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
【0288】
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（Ｇｒａｐ
ｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して生成した
。
ｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して生成した
。
【0289】
結果
図２３は、細胞マーカーＣＤ２５（Ｔ細胞活性化）（Ａ）及びＣＤ３０（Ｂ）が、イン
キュベーションの７２時間後にそれぞれ５４～６３％及び２１～２７％のＴ細胞において
発現したことを示す。ＣＤ２５及びＣＤ３０の発現は、９６時間のインキュベーション後
に更に誘導された（ＣＤ２５：８０～８３％及びＣＤ３０：２７～３３％）。図２３Ｃは
、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ
１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ
ｘｂ１２－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又はＩｇＧ１－ｂ１２の増加する用量が、活性化さ
れたＴ細胞の低減した生存率と関連していなかったことを示す。
図２３は、細胞マーカーＣＤ２５（Ｔ細胞活性化）（Ａ）及びＣＤ３０（Ｂ）が、イン
キュベーションの７２時間後にそれぞれ５４～６３％及び２１～２７％のＴ細胞において
発現したことを示す。ＣＤ２５及びＣＤ３０の発現は、９６時間のインキュベーション後
に更に誘導された（ＣＤ２５：８０～８３％及びＣＤ３０：２７～３３％）。図２３Ｃは
、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ
１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ
ｘｂ１２－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又はＩｇＧ１－ｂ１２の増加する用量が、活性化さ
れたＴ細胞の低減した生存率と関連していなかったことを示す。
【0290】
したがって、活性化されたＴ細胞の亜集団上でのＣＤ３０発現は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲとのインキュベーション時にＴ細胞の
フラトリサイドをもたらさなかった。
３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲとのインキュベーション時にＴ細胞の
フラトリサイドをもたらさなかった。
【0291】
実施例１５－ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの抗
腫瘍活性でのｓＣＤ３０の干渉
細胞表面ＣＤ３０の脱落及び可溶性ＣＤ３０（ｓＣＤ３０）の生成を、１７の異なる血
液学的ＣＤ３０＋腫瘍細胞株において評価した。
腫瘍活性でのｓＣＤ３０の干渉
細胞表面ＣＤ３０の脱落及び可溶性ＣＤ３０（ｓＣＤ３０）の生成を、１７の異なる血
液学的ＣＤ３０＋腫瘍細胞株において評価した。
【0292】
新鮮な培地中に細胞を播種してから３日後に細胞培養物から収集された２５μＬの未希
釈上清中のｓＣＤ３０の濃度を、「ヒトｓＣＤ３０ ＥＬＩＳＡキット」（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＭＳ２４０）を製造業者の指示に従って使用して、ヒトＣＤ
３０の定量的検出のためのＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
釈上清中のｓＣＤ３０の濃度を、「ヒトｓＣＤ３０ ＥＬＩＳＡキット」（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＭＳ２４０）を製造業者の指示に従って使用して、ヒトＣＤ
３０の定量的検出のためのＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【0293】
結果
図２４Ａは、細胞培養上清中のｓＣＤ３０の濃度を示す。示されるように、変動する濃
度のｓＣＤ３０が異なる細胞株由来の細胞培養上清中で検出された。図２４Ｂは、細胞培
養上清中のｓＣＤ３０の濃度が実施例２に前述された定量的フローサイトメトリー（ヒト
ＩｇＧキャリブレーターキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）によっ
て測定される場合、ＣＤ３０膜発現レベルと有意に相関したことを示す。
図２４Ａは、細胞培養上清中のｓＣＤ３０の濃度を示す。示されるように、変動する濃
度のｓＣＤ３０が異なる細胞株由来の細胞培養上清中で検出された。図２４Ｂは、細胞培
養上清中のｓＣＤ３０の濃度が実施例２に前述された定量的フローサイトメトリー（ヒト
ＩｇＧキャリブレーターキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）によっ
て測定される場合、ＣＤ３０膜発現レベルと有意に相関したことを示す。
【0294】
ｓＣＤ３０が強力なＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥ
ＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性をブロックすることができるかを評価するために、Ｂ
ｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性
細胞傷害性を、ＤＥＬ腫瘍細胞（ＡＬＣＬ）において評価し、これは上清（１２９ｎｇ／
ｍＬ）において高レベルのｓＣＤ３０を示した。Ｔ細胞媒介性細胞傷害性アッセイを、前
述のように行った（実施例８）。図２４Ｃは、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲがこの細胞株において強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導
したことを示し、８６％の最大腫瘍細胞殺滅は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ
３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、ｓＣＤ３０の存在下でインビトロで強力なＴ細胞媒介
性細胞傷害性を依然として誘導することができたことを示す。
ＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性をブロックすることができるかを評価するために、Ｂ
ｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性
細胞傷害性を、ＤＥＬ腫瘍細胞（ＡＬＣＬ）において評価し、これは上清（１２９ｎｇ／
ｍＬ）において高レベルのｓＣＤ３０を示した。Ｔ細胞媒介性細胞傷害性アッセイを、前
述のように行った（実施例８）。図２４Ｃは、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３
０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲがこの細胞株において強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導
したことを示し、８６％の最大腫瘍細胞殺滅は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ
３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、ｓＣＤ３０の存在下でインビトロで強力なＴ細胞媒介
性細胞傷害性を依然として誘導することができたことを示す。
【0295】
よって、ｓＣＤ３０濃度は、細胞型間で変動し、細胞表面上のＣＤ３０発現のレベルと
相関した。更に、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ
は、ｓＣＤ３０の存在下でインビトロでの強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を依然として誘
導することができた。
相関した。更に、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ
は、ｓＣＤ３０の存在下でインビトロでの強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を依然として誘
導することができた。
【0296】
実施例１６－患者由来の末梢血単核Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用したｂｓＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのエクスビボ細胞傷害性
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、初代
患者由来Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用してエクスビボ細胞傷害性アッセイにおい
て試験した。Ｔ細胞の供給源として、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（
ＮＨＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｄｉ
ｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、表１１）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍
細胞殺滅を評価した。
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのエクスビボ細胞傷害性
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、初代
患者由来Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用してエクスビボ細胞傷害性アッセイにおい
て試験した。Ｔ細胞の供給源として、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（
ＮＨＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｄｉ
ｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、表１１）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍
細胞殺滅を評価した。
【0297】
Ｌ－４２８腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、
ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後
、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを室温で５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、
培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇ
ｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５
５１８０）に播種した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－Ｆ
ＥＲＲ及び対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液（１，０００～０．０５１
ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）を添加し、プレートを室温で１５分間インキ
ュベートした。ＰＢＭＣを解凍し、計数し、培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ／１
％ペニシリン－ストレプトマイシン／１％グルタミン酸塩）に再懸濁した後、８：１のエ
フェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを３７℃で７２時間インキ
ュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染色緩衝液）で２回洗浄し
た後、細胞を染色して、ＣＤ３（Ｔ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．４８－００３
７）、ＣＤ１４（単球／マクロファージ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．３０１８３４）
、ＣＤ１９（Ｂ細胞、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．３０２２４６）、ＣＤ１６（単球／
マクロファージ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５５６６１８）、ＣＤ
５６（ＮＫ細胞、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５６４８４９）、及び
ＣＤ６６ｂ（顆粒球、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３０５１１６）を使用した異
なる細胞集団を区別した。細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎ
ｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（１：
１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３４５７７２、ＦＩＴＣに複合
化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎ
ｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／
ＰＤ１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複
合化）について更に染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメー
ターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩
衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０
分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して
細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理
した。用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線
形回帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後
、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを室温で５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、
培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇ
ｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５
５１８０）に播種した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－Ｆ
ＥＲＲ及び対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液（１，０００～０．０５１
ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）を添加し、プレートを室温で１５分間インキ
ュベートした。ＰＢＭＣを解凍し、計数し、培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ／１
％ペニシリン－ストレプトマイシン／１％グルタミン酸塩）に再懸濁した後、８：１のエ
フェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを３７℃で７２時間インキ
ュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染色緩衝液）で２回洗浄し
た後、細胞を染色して、ＣＤ３（Ｔ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．４８－００３
７）、ＣＤ１４（単球／マクロファージ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．３０１８３４）
、ＣＤ１９（Ｂ細胞、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．３０２２４６）、ＣＤ１６（単球／
マクロファージ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５５６６１８）、ＣＤ
５６（ＮＫ細胞、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５６４８４９）、及び
ＣＤ６６ｂ（顆粒球、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３０５１１６）を使用した異
なる細胞集団を区別した。細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎ
ｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（１：
１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３４５７７２、ＦＩＴＣに複合
化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎ
ｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／
ＰＤ１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複
合化）について更に染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメー
ターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩
衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０
分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して
細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理
した。用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線
形回帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
【0298】
生きた標的細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して計算した：－生きた標的細胞
％＝（各条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数
／いずれの抗体も加えることなく標的細胞及びＴ細胞のみを含む条件における生きた、単
一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数）×１００。
％＝（各条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数
／いずれの抗体も加えることなく標的細胞及びＴ細胞のみを含む条件における生きた、単
一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数）×１００。
【0299】
結果
図２５Ａは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが
、健常な対照ドナー並びに異なるＨＬ及びＮＨＬ患者ドナーの両方に由来するＴ細胞によ
って媒介される７２時間後のＬ－４２８腫瘍細胞の用量依存的細胞傷害性を誘導したこと
を示す。細胞傷害性は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＰＤ－１の上方調節によって例示され
るＴ細胞活性化及び増殖と関連していた（図２５Ｂ－Ｄ）。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－
ＦＥＡＬについて、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかった。ドナーＥ（ＡＭＬ）に
ついて、Ｌ－４２８腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されず、これはＰＢＭＣ試
料内のＴ細胞の低頻度に起因し得る（表１１）。
図２５Ａは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが
、健常な対照ドナー並びに異なるＨＬ及びＮＨＬ患者ドナーの両方に由来するＴ細胞によ
って媒介される７２時間後のＬ－４２８腫瘍細胞の用量依存的細胞傷害性を誘導したこと
を示す。細胞傷害性は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＰＤ－１の上方調節によって例示され
るＴ細胞活性化及び増殖と関連していた（図２５Ｂ－Ｄ）。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－
ＦＥＡＬについて、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかった。ドナーＥ（ＡＭＬ）に
ついて、Ｌ－４２８腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されず、これはＰＢＭＣ試
料内のＴ細胞の低頻度に起因し得る（表１１）。
【0300】
併せて、これらのデータは、ＨＬ及びＮＨＬ患者からの末梢血Ｔ細胞が、ｂｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下で腫瘍細胞株のＴ細胞
媒介性細胞傷害性を誘導することができることを例示する。
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下で腫瘍細胞株のＴ細胞
媒介性細胞傷害性を誘導することができることを例示する。
【0301】
【表12】
【0302】
実施例１７－ＳＣＩＤマウスにおけるＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲの薬物動態特性の評価
１１～１２週齢、雌の腫瘍を含まないＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨａｎ（
登録商標）Ｈｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウス、Ｅｎｖｉｇｏ）（群当たり３匹のマウス
）に、１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）又は１００μｇ（
５ｍｇ／ｋｇ）のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ
の単回用量を静脈内（ＩＶ）注射した。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲがマウスタンパク質と交差反応しないため、実験は、標的媒介性ク
リアランスの不在下で抗体クリアランスを研究するように設定した。
Ｘ０６０－ＦＥＲＲの薬物動態特性の評価
１１～１２週齢、雌の腫瘍を含まないＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨａｎ（
登録商標）Ｈｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウス、Ｅｎｖｉｇｏ）（群当たり３匹のマウス
）に、１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）又は１００μｇ（
５ｍｇ／ｋｇ）のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ
の単回用量を静脈内（ＩＶ）注射した。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲがマウスタンパク質と交差反応しないため、実験は、標的媒介性ク
リアランスの不在下で抗体クリアランスを研究するように設定した。
【0303】
４０μＬの血液試料を、抗体投与の１０分、４～６時間、２４時間、２日、７日、１４
日及び２１日後に、経頬静脈穿刺又は伏在静脈穿刺から収集した。血液を、Ｋ２－ＥＤＴ
Ａ含有バイアル（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００、ｃａｔ．Ｎｏ
．１６．４４４．１００）に収集し、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿上清
を、標識されたエッペンドルフバイアルに移し、血漿ＩｇＧ濃度決定まで－８０℃で保存
した。
日及び２１日後に、経頬静脈穿刺又は伏在静脈穿刺から収集した。血液を、Ｋ２－ＥＤＴ
Ａ含有バイアル（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００、ｃａｔ．Ｎｏ
．１６．４４４．１００）に収集し、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿上清
を、標識されたエッペンドルフバイアルに移し、血漿ＩｇＧ濃度決定まで－８０℃で保存
した。
【0304】
ヒトＩｇＧ濃度は、総ヒトＩｇＧ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して
決定した。２μｇ／ｍＬの濃度で一晩４℃で９６ウェルＭｉｃｒｏｌｏｎ ＥＬＩＳＡプ
レート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎ）にコーティングされた１００μＬのＰＢＳ（Ｂ
ｉｏＴｒａｄｉｎｇ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｋ６５４Ｆ５００ＰＰ）中のマウス抗ヒトＩｇＧ－
カッパクローンＭＨ１６（ＣＬＢ Ｓａｎｑｕｉｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、
ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ１２６８）を捕捉抗体として使用した。プレートをＰＢＳＡ（０．２％
ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含むＰＢＳ）で室温（ＲＴ）で１時間ブロックした後、
試料を添加し、ＰＢＳＡ中で段階希釈し、プレートシェーカー上で１時間ＲＴでインキュ
ベートした。プレートを、３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で補足さ
れたＰＢＳ）で３回洗浄し、その後ヤギ抗ヒトＩｇＧ免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ、
Ｗｅｓｔ Ｇｒａｃｅ、ＰＡ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－０３５－０９８、０．２％のＢＳ
Ａで補足されたＰＢＳＴ中の１：１０．０００）を用いて室温で１時間インキュベートし
た。光から保護された２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スル
ホン酸）（ＡＢＴＳ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１１１１２４２２００１及び１１１１
２５９７００１）とのインキュベーション前、プレートを３００μＬのＰＢＳＴで３回洗
浄した。１００μＬの２％シュウ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．３３
５０６）を添加することによって反応を停止させ、室温で１０分間インキュベートした。
吸光度は、ＥＬｘ８０８吸光度マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓ
ｋｉ、ＶＴ）で４０５ｎｍで測定した。
決定した。２μｇ／ｍＬの濃度で一晩４℃で９６ウェルＭｉｃｒｏｌｏｎ ＥＬＩＳＡプ
レート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎ）にコーティングされた１００μＬのＰＢＳ（Ｂ
ｉｏＴｒａｄｉｎｇ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｋ６５４Ｆ５００ＰＰ）中のマウス抗ヒトＩｇＧ－
カッパクローンＭＨ１６（ＣＬＢ Ｓａｎｑｕｉｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、
ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ１２６８）を捕捉抗体として使用した。プレートをＰＢＳＡ（０．２％
ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含むＰＢＳ）で室温（ＲＴ）で１時間ブロックした後、
試料を添加し、ＰＢＳＡ中で段階希釈し、プレートシェーカー上で１時間ＲＴでインキュ
ベートした。プレートを、３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で補足さ
れたＰＢＳ）で３回洗浄し、その後ヤギ抗ヒトＩｇＧ免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ、
Ｗｅｓｔ Ｇｒａｃｅ、ＰＡ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－０３５－０９８、０．２％のＢＳ
Ａで補足されたＰＢＳＴ中の１：１０．０００）を用いて室温で１時間インキュベートし
た。光から保護された２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スル
ホン酸）（ＡＢＴＳ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１１１１２４２２００１及び１１１１
２５９７００１）とのインキュベーション前、プレートを３００μＬのＰＢＳＴで３回洗
浄した。１００μＬの２％シュウ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．３３
５０６）を添加することによって反応を停止させ、室温で１０分間インキュベートした。
吸光度は、ＥＬｘ８０８吸光度マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓ
ｋｉ、ＶＴ）で４０５ｎｍで測定した。
【0305】
参照抗体ヒトＩｇＧ１λ（純粋なタンパク質３０Ｃ、ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ０７８）から
標準曲線を生成して（濃度範囲：１ｍｇ／ｍＬ［３μＬ］）、ＰＢＳＴＡ中の３倍希釈液
で更に希釈した。注射された材料を用いて第２の標準曲線を生成し、１ｍｇ／ｍＬ（３．
６μＬの抗体）の濃度で５ｍｇ／ｋｇの用量から調製し、ＰＢＳＴＡ中の３倍希釈液に更
に希釈した。
標準曲線を生成して（濃度範囲：１ｍｇ／ｍＬ［３μＬ］）、ＰＢＳＴＡ中の３倍希釈液
で更に希釈した。注射された材料を用いて第２の標準曲線を生成し、１ｍｇ／ｍＬ（３．
６μＬの抗体）の濃度で５ｍｇ／ｋｇの用量から調製し、ＰＢＳＴＡ中の３倍希釈液に更
に希釈した。
【0306】
結果
参照標準から、較正曲線を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの４パラメータロジステ
ィックフィット曲線を使用して未知の補間によって計算した。血漿試料中のヒトＩｇＧ１
濃度を、プロットされた較正曲線の方程式から計算し（図２６Ａ）、曲線下面積（ＡＵＣ
）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。血液サンプリン
グの最終日（２１日目）までのＩｇＧクリアランスを、式Ｄ＊１．０００／ＡＵＣによっ
て決定し、式中、Ｄは、注射の用量（１ｍｇ／ｋｇ）である（図２６Ｂ）。
参照標準から、較正曲線を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの４パラメータロジステ
ィックフィット曲線を使用して未知の補間によって計算した。血漿試料中のヒトＩｇＧ１
濃度を、プロットされた較正曲線の方程式から計算し（図２６Ａ）、曲線下面積（ＡＵＣ
）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。血液サンプリン
グの最終日（２１日目）までのＩｇＧクリアランスを、式Ｄ＊１．０００／ＡＵＣによっ
て決定し、式中、Ｄは、注射の用量（１ｍｇ／ｋｇ）である（図２６Ｂ）。
【0307】
ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、マウスタン
パク質と交差反応せず、薬物動態特性は、よって、他の非結合野生型ヒトＩｇＧ１分子と
同等であると予想されるであろう。全ての用量群について予想されたヒトＩｇＧ血漿濃度
は、約１００μｇ／ｍＬ（約５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ／ｍＬ（約０．５ｍｇ／ｋｇ）、
又は１μｇ／ｍＬ（約０．０５ｍｇ／ｋｇ）であると計算された。全ての時点について、
０．０５ｍｇ／ｋｇで処理された動物からの試料は測定可能ではなかった。ＢｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの血漿クリアランス率は、通常
のヒトＩｇＧ１の予測された血漿クリアランス率と同等であった。平均最大ヒトＩｇＧ血
漿濃度（Ｃｍａｘ）は、通常のヒトＩｇＧ１の予測されたＣｍａｘと同等であった。
パク質と交差反応せず、薬物動態特性は、よって、他の非結合野生型ヒトＩｇＧ１分子と
同等であると予想されるであろう。全ての用量群について予想されたヒトＩｇＧ血漿濃度
は、約１００μｇ／ｍＬ（約５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ／ｍＬ（約０．５ｍｇ／ｋｇ）、
又は１μｇ／ｍＬ（約０．０５ｍｇ／ｋｇ）であると計算された。全ての時点について、
０．０５ｍｇ／ｋｇで処理された動物からの試料は測定可能ではなかった。ＢｓＧ１－ｈ
ｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの血漿クリアランス率は、通常
のヒトＩｇＧ１の予測された血漿クリアランス率と同等であった。平均最大ヒトＩｇＧ血
漿濃度（Ｃｍａｘ）は、通常のヒトＩｇＧ１の予測されたＣｍａｘと同等であった。
【0308】
よって、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの薬物
動態プロファイルは、標的結合の不在下で非腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける通常のヒト
ＩｇＧ１について予測されるものと同等である。
動態プロファイルは、標的結合の不在下で非腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける通常のヒト
ＩｇＧ１について予測されるものと同等である。
【0309】
実施例１８－ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの
Ｃ１ｑ結合の評価
補体タンパク質Ｃ１ｑの、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ、又はＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－Ｆ
ＥＲＲが生成された親抗体、すなわち、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ及びＩｇＧ１－
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を、ＣＤ３又はＣＤ３０発現細胞のいずれか
を用いて評価した。
Ｃ１ｑ結合の評価
補体タンパク質Ｃ１ｑの、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ、又はＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－Ｆ
ＥＲＲが生成された親抗体、すなわち、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ及びＩｇＧ１－
ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を、ＣＤ３又はＣＤ３０発現細胞のいずれか
を用いて評価した。
【0310】
Ａ．ＣＤ３発現細胞に結合したＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６
０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合
補体タンパク質Ｃ１ｑの、ＣＤ３結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬへの結合を、刺激されたヒト
ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて試験した。ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇは、ＣＤ５２抗体Ｃ
ＡＭＰＡＴＨ－１Ｈに基づくＶＨ及びＶＬドメインを有し、細胞表面に結合したときにＣ
１ｑに効率的に結合することが知られているＦｃ増強バックボーンを有する、陽性対照と
して含まれた。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－
ｂ１２が含まれた。
０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合
補体タンパク質Ｃ１ｑの、ＣＤ３結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬへの結合を、刺激されたヒト
ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて試験した。ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇは、ＣＤ５２抗体Ｃ
ＡＭＰＡＴＨ－１Ｈに基づくＶＨ及びＶＬドメインを有し、細胞表面に結合したときにＣ
１ｑに効率的に結合することが知られているＦｃ増強バックボーンを有する、陽性対照と
して含まれた。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－
ｂ１２が含まれた。
【0311】
ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を、健常なボランティアから得られたバフィーコート（Ｓａｎｑ
ｕｉｎ）から陰性選択によってＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ
細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．Ｎｏ．１５
０２３Ｃ．２）を製造業者の指示に従って使用して精製（濃縮）した。精製されたＴ細胞
を、１０％の鉄を含む熱不活性化ドナーウシ血清（ＤＢＳＩ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ
．２０７３１－０３０）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌ
ｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＥ１７－６０３Ｅ）で補足された、Ｔ細胞培地（２５ｍＭの
ＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）を含
むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＲＰＭＩ］－１
６４０培地）に再懸濁した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈ
ｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．Ｎｏ．１１１３２Ｄ）をＰＢＳで洗浄し、Ｔ細胞培地に再
懸濁した。ビーズを、濃縮されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞に１：１比で添加し、３７℃、５
％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。次に、磁石を使用してビーズを除去し、細胞を
ＰＢＳ中で２回洗浄し、再度計数した。
ｕｉｎ）から陰性選択によってＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ
細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．Ｎｏ．１５
０２３Ｃ．２）を製造業者の指示に従って使用して精製（濃縮）した。精製されたＴ細胞
を、１０％の鉄を含む熱不活性化ドナーウシ血清（ＤＢＳＩ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ
．２０７３１－０３０）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌ
ｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＥ１７－６０３Ｅ）で補足された、Ｔ細胞培地（２５ｍＭの
ＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）を含
むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＲＰＭＩ］－１
６４０培地）に再懸濁した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈ
ｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．Ｎｏ．１１１３２Ｄ）をＰＢＳで洗浄し、Ｔ細胞培地に再
懸濁した。ビーズを、濃縮されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞に１：１比で添加し、３７℃、５
％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。次に、磁石を使用してビーズを除去し、細胞を
ＰＢＳ中で２回洗浄し、再度計数した。
【0312】
ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬの、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞への結合は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ（３
０μｇ／ｍＬ）、並びにＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａ
ｂ’）２（ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用して、フローサイ
トメトリーによって確認された。
ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬの、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞への結合は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－
ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ（３
０μｇ／ｍＬ）、並びにＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａ
ｂ’）２（ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用して、フローサイ
トメトリーによって確認された。
【0313】
活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、丸底９６ウェルプレート（３０，０００細胞／ウェル）に
おいて播種し、ペレット化し、３０μＬのアッセイ培地（０．１％［ｗ／ｖ］のウシ血清
アルブミン画分Ｖ（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１０７３５０８６００１）及び
ペニシリン／ストレプトマイシンで補足された、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミ
ンを含むＲＰＭＩ－１６４０）に再懸濁した。その後、５０μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、Ｉ
ｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇ、又はＩｇＧ１－ｂ１２（
アッセイ培地中で３倍希釈ステップでの１．７ｘ１０－４－３０μｇ／ｍＬの最終濃度）
を、ウェルの各々に添加し、３７℃で１５分間インキュベートして、抗体が細胞に結合す
ることを可能にした。
おいて播種し、ペレット化し、３０μＬのアッセイ培地（０．１％［ｗ／ｖ］のウシ血清
アルブミン画分Ｖ（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１０７３５０８６００１）及び
ペニシリン／ストレプトマイシンで補足された、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミ
ンを含むＲＰＭＩ－１６４０）に再懸濁した。その後、５０μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３
－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、Ｉ
ｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇ、又はＩｇＧ１－ｂ１２（
アッセイ培地中で３倍希釈ステップでの１．７ｘ１０－４－３０μｇ／ｍＬの最終濃度）
を、ウェルの各々に添加し、３７℃で１５分間インキュベートして、抗体が細胞に結合す
ることを可能にした。
【0314】
Ｃ１ｑの供給源として、ヒト血清（２０μＬ／ウェル、Ｓａｎｑｕｉｎ、ロット２０Ｌ
１５－０２）を２０％の最終濃度まで添加した。細胞を、氷上で４５分間インキュベート
し、続いて、低温ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μＬのフルオレセインイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）複合化ウサギ抗ヒトＣ１ｑ（２０μｇ／ｍＬの最終濃度（Ｄ
ＡＫＯ、ｃａｔ ｎｏ．Ｆ０２５４）、ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：７５に希釈）と
、アロフィコシアニン複合化マウス抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．
ｎｏ．５５５３６９、ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５０に希釈）の存在下又は不在下
で、４℃で３０分間、暗所でインキュベートした。細胞を、低温ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液
で２回洗浄し、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃ
ｈ、ｃａｔ．ｎｏ．０３６９０）、及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール
（ＤＡＰＩ）生存性色素（１：５，０００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．５６４９０７）で補足された２０μＬのＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。（ＤＡ
ＰＩ排除によって特定される）生存細胞へのＣ１ｑ結合を、ｉＱｕｅ３スクリーナー（Ｉ
ｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でフローサイトメトリーによって分析し
た。データを、ｉＱｕｅソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ
６．２［Ｒ３］、Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．６５２）を使用して分析した。結合曲線を、
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰分析（可変勾配でのシ
グモイド用量応答）を使用して分析した。
１５－０２）を２０％の最終濃度まで添加した。細胞を、氷上で４５分間インキュベート
し、続いて、低温ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μＬのフルオレセインイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）複合化ウサギ抗ヒトＣ１ｑ（２０μｇ／ｍＬの最終濃度（Ｄ
ＡＫＯ、ｃａｔ ｎｏ．Ｆ０２５４）、ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：７５に希釈）と
、アロフィコシアニン複合化マウス抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．
ｎｏ．５５５３６９、ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５０に希釈）の存在下又は不在下
で、４℃で３０分間、暗所でインキュベートした。細胞を、低温ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液
で２回洗浄し、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃ
ｈ、ｃａｔ．ｎｏ．０３６９０）、及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール
（ＤＡＰＩ）生存性色素（１：５，０００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ
．５６４９０７）で補足された２０μＬのＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。（ＤＡ
ＰＩ排除によって特定される）生存細胞へのＣ１ｑ結合を、ｉＱｕｅ３スクリーナー（Ｉ
ｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でフローサイトメトリーによって分析し
た。データを、ｉＱｕｅソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ
６．２［Ｒ３］、Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．６５２）を使用して分析した。結合曲線を、
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰分析（可変勾配でのシ
グモイド用量応答）を使用して分析した。
【0315】
結果
図２７Ａは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇに対して
観察されたが、Ｃ１ｑ結合が、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬに対して又は非結合対照抗
体に対して観察されなかったことを示す。
図２７Ａは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇに対して
観察されたが、Ｃ１ｑ結合が、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤ
Ｘ０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬに対して又は非結合対照抗
体に対して観察されなかったことを示す。
【0316】
Ｂ．ＣＤ３０発現細胞に結合したＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０
６０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合
補体タンパク質Ｃ１ｑのＣＤ３０結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を
、ＮＣＥＢ－１マントル細胞リンパ腫細胞を使用して試験した。陽性対照として、ＩｇＧ
１－７Ｄ８－Ｅ４３０Ｇ（抗ＣＤ２０）が含まれ、これは不活性変異を含まず、Ｃ１ｑへ
の結合能力を保持する。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲが含ま
れた。
６０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合
補体タンパク質Ｃ１ｑのＣＤ３０結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｍ
ＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を
、ＮＣＥＢ－１マントル細胞リンパ腫細胞を使用して試験した。陽性対照として、ＩｇＧ
１－７Ｄ８－Ｅ４３０Ｇ（抗ＣＤ２０）が含まれ、これは不活性変異を含まず、Ｃ１ｑへ
の結合能力を保持する。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲが含ま
れた。
【0317】
ＮＣＥＢ－１細胞を、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ、
ｃａｔ，ｎｏ．１０７３５０８６００１）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（
Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ．１５１４０－１２２）を含有するアッセイ培地（ＲＰＭＩ－
１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）
）中で２ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。腫瘍細胞（５０μＬ中１００，０００細
胞）を、９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ、ｃａｔ ｎｏ．６５０１８
０）に添加した。次に、３０μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体（アッセ
イ培地中で希釈された３倍希釈ステップでの５．６×１０－５－１０μｇ／ｍＬの最終濃
度）を、ウェルの各々に添加し、３７℃で１５分間インキュベートして、抗体が細胞に結
合することを可能にする。
ｃａｔ，ｎｏ．１０７３５０８６００１）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（
Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ．１５１４０－１２２）を含有するアッセイ培地（ＲＰＭＩ－
１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）
）中で２ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。腫瘍細胞（５０μＬ中１００，０００細
胞）を、９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ、ｃａｔ ｎｏ．６５０１８
０）に添加した。次に、３０μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体（アッセ
イ培地中で希釈された３倍希釈ステップでの５．６×１０－５－１０μｇ／ｍＬの最終濃
度）を、ウェルの各々に添加し、３７℃で１５分間インキュベートして、抗体が細胞に結
合することを可能にする。
【0318】
細胞の半分（４０μＬの抗体を含有する細胞懸濁液）を、抗体結合を確認するために異
なるプレートに播種した。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－
ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＮＣＥＢ－１細胞への結
合は、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（ＦＡＣ
Ｓ緩衝液中で１：５００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ｃａ
ｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用して、フローサイトメトリーによって確認さ
れた。
なるプレートに播種した。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－
ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＮＣＥＢ－１細胞への結
合は、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（ＦＡＣ
Ｓ緩衝液中で１：５００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ｃａ
ｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用して、フローサイトメトリーによって確認さ
れた。
【0319】
ヒト血清（１０μＬ／ウェル、Ｓａｎｑｕｉｎ、ロット２１Ｋ０４－０１）を、残りの
４０μＬの細胞懸濁液（最終濃度の２０％）に添加し、４５分間氷上でインキュベートし
、続いてＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２５μＬのＦＩＴＣ複合化ウサギ抗Ｃ１ｑ抗体（２０
μＬ／ｍＬの最終濃度（ＤＡＫＯ、ｃａｔ ｎｏ．Ｆ０２５４）、ＦＡＣＳ緩衝液中で希
釈）と暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、低温ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し
、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－３生存性染料（１：５０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃ
ａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５）で補足された３０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ｉＱｕ
ｅ３ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で測定し
た。データを、ｉＱｕｅソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ
６．２［Ｒ３］、Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．６５２）を使用して分析した。結合曲線を、
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰分析（可変勾配でのシ
グモイド用量応答）を使用して分析した。
４０μＬの細胞懸濁液（最終濃度の２０％）に添加し、４５分間氷上でインキュベートし
、続いてＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２５μＬのＦＩＴＣ複合化ウサギ抗Ｃ１ｑ抗体（２０
μＬ／ｍＬの最終濃度（ＤＡＫＯ、ｃａｔ ｎｏ．Ｆ０２５４）、ＦＡＣＳ緩衝液中で希
釈）と暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、低温ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し
、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－３生存性染料（１：５０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃ
ａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５）で補足された３０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ｉＱｕ
ｅ３ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で測定し
た。データを、ｉＱｕｅソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ
６．２［Ｒ３］、Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．６５２）を使用して分析した。結合曲線を、
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰分析（可変勾配でのシ
グモイド用量応答）を使用して分析した。
【0320】
結果
図２７Ｂは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｅ４３０Ｇに対して
観察されたが、Ｃ１ｑ結合が膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲに対して、又は
非結合対照抗体に対して観察されなかったことを示す。
図２７Ｂは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｅ４３０Ｇに対して
観察されたが、Ｃ１ｑ結合が膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ
０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲに対して、又は
非結合対照抗体に対して観察されなかったことを示す。
【0321】
よって、これらの結果は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０
－ＦＥＲＲがＣ１ｑに結合しないことを実証し、機能的に不活性なバックボーンを確認し
た。
－ＦＥＲＲがＣ１ｑに結合しないことを実証し、機能的に不活性なバックボーンを確認し
た。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図19-3】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25-1】
【図25-2】
【図26】
【図27】
【配列表】
【外国語明細書】