特開 2024-116283 ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に結合する二重特異性結合剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024116283

(43)【公開日】2024-08-27

(54)【発明の名称】ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に結合する二重特異性結合剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240820BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240820BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240820BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240820BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240820BHJP

   A61K 35/66 20150101ALI20240820BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240820BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240820BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240820BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240820BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/28 ZNA

C07K16/30

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K35/12

A61K35/66

A61K39/395 T

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/04

A61K31/7088

A61K35/76

A61K39/395 E

C07K16/28

C07K16/46 ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】130

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024093451

(22)【出願日】2024-06-10

(62)【分割の表示】P 2023577405の分割

【原出願日】2022-06-15

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/066141

(32)【優先日】2021-06-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】523468172

【氏名又は名称】アステラス・ファーマ・ヨーロッパ・ベスローデン・フェンノートシャップ

(71)【出願人】

【識別番号】510089100

【氏名又は名称】ゼンコア インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】ベネット，マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ニスタル，アレックス

(72)【発明者】

【氏名】ムーア，グレゴリー

(57)【要約】      （修正有）

【課題】がん疾患の治療のための新規の薬剤及び方法を提供する。
【解決手段】本発明は、少なくとも２つの結合ドメインを含む結合剤であって、第１の結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有しており、第２の結合ドメインは、ＣＤ３に対する特異性を有する、結合剤、及びがんを処置するためにこの結合剤又はそれをコードする核酸を使用する方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、
結合剤は、少なくとも３本のポリペプチド鎖を含み、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリン由来の重鎖（ＶＨ）の可変領域（ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２））を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリン由来のＶＨ（ＶＨ（ＣＤ３））と、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリン由来の軽鎖（ＶＬ）の可変領域（ＶＬ（ＣＤ３））とを含み、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリン由来のＶＬ（ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２））を含む、
結合剤。

【請求項2】

第１のポリペプチド鎖が、免疫グロブリンに由来する重鎖の定常領域１（ＣＨ１）又はその機能的バリアントを含む、請求項１に記載の結合剤。

【請求項3】

第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖が、免疫グロブリンに由来する重鎖の定常領域２（ＣＨ２）又はその機能的バリアントと、免疫グロブリンに由来する重鎖の定常領域３（ＣＨ３）又はその機能的バリアントとを含む、請求項１又は２に記載の結合剤。

【請求項4】

第３のポリペプチド鎖が、免疫グロブリンに由来する軽鎖の定常領域（ＣＬ）又はその機能的バリアントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項5】

免疫グロブリンが、ＩｇＧ１である、請求項１～４のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項6】

ＩｇＧ１が、ヒトＩｇＧ１である、請求項５に記載の結合剤。

【請求項7】

第１のポリペプチド鎖のＶＨ、並びにＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３が、Ｎ末端からＣ末端へと、下記の順序：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
で配置されている、請求項３～６のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項8】

第２のポリペプチド鎖のＶＨ、ＶＬ、並びにＣＨ２、及びＣＨ３が、Ｎ末端からＣ末端へと、下記の順序：
ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３、又は
ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３
で配置されている、請求項３～７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項9】

第１のポリペプチド鎖が、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用する、請求項１～８のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項10】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインを形成し、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）が、相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインを形成する、請求項１～９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項11】

第１のポリペプチド鎖のＣＨ２が、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２と相互作用し、及び／又は第１のポリペプチド鎖のＣＨ３が、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３と相互作用する
、請求項３～１０のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項12】

第１のポリペプチド鎖のＣＨ１が、第３のポリペプチド鎖のＣＬと相互作用する、請求項４～１１のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項13】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有するさらなる結合ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖が、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）をさらに含み、結合剤が、第３のポリペプチド鎖と同一の第４のポリペプチド鎖を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項14】

第２のポリペプチド鎖が、免疫グロブリンに由来するＣＨ１又はその機能的バリアントをさらに含む、請求項１３に記載の結合剤。

【請求項15】

免疫グロブリンが、ＩｇＧ１である、請求項１４に記載の結合剤。

【請求項16】

ＩｇＧ１が、ヒトＩｇＧ１である、請求項１５に記載の結合剤。

【請求項17】

第２のポリペプチド鎖のＶＨ、ＶＬ、並びにＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３が、Ｎ末端からＣ末端へと、下記の順序：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３、又は
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３
で配置されている、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項18】

第２のポリペプチド鎖が、第４のポリペプチド鎖と相互作用する、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項19】

第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、第４のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）と相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有するさらなる結合ドメインを形成する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項20】

第２のポリペプチド鎖のＣＨ１が、第４のポリペプチド鎖のＣＬと相互作用する、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項21】

ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号５４、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項22】

ＶＨ（ＣＤ３）が、
（ｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＡＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５０）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号４５）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含むか、
（ｉｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４４）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＥＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号５１）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含むか、又は
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４４）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳ
ＷＦＡＹ（配列番号４５）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む、
請求項１～２１のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項23】

ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項24】

ＶＬ（ＣＤ３）が、アミノ酸配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４６）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号４７）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号４８）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項25】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項26】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、アミノ酸配列ＳＹＷＩＮ（配列番号３２）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号３３）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＳＷＲＧＮＳＦＤＹ（配列番号３４）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項27】

ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項28】

ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号３５）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３６）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＮＤＹＳＹＰＦＴ（配列番号３７）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項29】

（ｉ）ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むか、
（ｉｉ）ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号６１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むか、又は
（ｉｉｉ）ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号５４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項30】

ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号５８で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、
ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９で表されるアミノ酸配列若しくはその機能
的バリアントを含むか、若しくはからなり、及び／又は
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなる、
請求項１～２９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項31】

ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号６１で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、
ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、及び／又は
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなる、
請求項１～２９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項32】

ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号５４で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、
ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、及び／又は
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなる、
請求項１～２９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項33】

第１のポリペプチド鎖において、ＣＨ１が、ペプチドリンカーによりＣＨ２に結合している、請求項３～３２のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項34】

ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２７）又はその機能的バリアントを含む、請求項３３に記載の結合剤。

【請求項35】

ＶＨ（ＣＤ３）又はＶＬ（ＣＤ３）が、ペプチドリンカーによりＣＨ２に結合している、請求項３～３４のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項36】

ＶＨ（ＣＤ３）又はＶＬ（ＣＤ３）が、ペプチドリンカーによりＣＨ１に結合している、請求項１４～３５のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項37】

ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_ｘ又はその機能的バリアントを含み、式中、Ｘは、２、３、４、５、又は６である、請求項３５又は３６に記載の結合剤。

【請求項38】

ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号２６）又はその機能的バリアントを含む、請求項３７に記載の結合剤。

【請求項39】

ＶＨ（ＣＤ３）又はＶＬ（ＣＤ３）とＣＨ２とを結合させるペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２１）又はその機能的バリアントを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項40】

ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_２ＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２３）又はその機能的バリアントを含む、請求項３９に記載の結合剤。

【請求項41】

ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２２）又はその機能的バリアントを含む、請求項３９に記載の結合剤。

【請求項42】

ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）が、ペプチドリンカーにより互いに結合している、請求項１～４１のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項43】

ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_ｘ又はその機能的バリアントを含み、式中、ｘは、２、３、４、５、又は６である、請求項４２に記載の結合剤。

【請求項44】

ペプチドリンカーが、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_４（配列番号１１）又はその機能的バリアントを含む、請求項４３に記載の結合剤。

【請求項45】

ＣＨ１が、ＥＵナンバリングに従って２０８位でアスパラギン酸残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項２～４４のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項46】

第１のポリペプチド鎖のＣＨ１が、ＥＵナンバリングに従って２０８位でアスパラギン酸残基を含むアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖のＣＨ１が、ＥＵナンバリングに従って２０８位でアスパラギン残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項１４～４５のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項47】

ヒトＦｃγＲＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、及び／又はＩＩＩａに実質的に結合しない請求項１～４６のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項48】

第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ２が、下記：ＥＵナンバリングに従って２３３位でのプロリン残基、２３４位でのバリン残基、２３５位でのアラニン残基、２３６位での欠失、２６７位でのリシン残基、及び２９５位でのグルタミン酸残基の内の１つ又は複数を含むアミノ酸配列を含む、請求項３～４７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項49】

第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖のＣＨ２が、ＥＵナンバリングに従って２３３位でのプロリン残基、２３４位でのバリン残基、２３５位でのアラニン残基、２３６位での欠失、及び２６７位でのリシン残基を含むアミノ酸配列を含み、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２が、ＥＵナンバリングに従って２９５位でのグルタミン酸残基をさらに含み、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２が、ＥＵナンバリングに従って２９５位でのグルタミン残基をさらに含む、請求項４８に記載の結合剤。

【請求項50】

第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ３が、下記：ＥＵナンバリングに従って３５７位でのグルタミン残基、３６４位でのリシン残基、３６８位でのアスパラギン酸残基、３７０位でのセリン残基、３８４位でのアスパラギン酸残基、４１８位でのグルタミン酸残基、及び４２１位でのアスパラギン酸残基の内の１つ又は複数を含むアミノ酸配列を含む、請求項３～４９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項51】

第１のポリペプチド鎖のＣＨ３が、ＥＵナンバリングに従って３５７位でのグルタミン酸残基、３６４位でのセリン残基、３６８位でのアスパラギン酸残基、３７０位でのセリン残基、３８４位でのアスパラギン酸残基、４１８位でのグルタミン酸残基、及び４２１位でのアスパラギン酸残基を含むアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３が、ＥＵナンバリングに従って３５７位でのグルタミン残基、３６４位でのリシン残基、３６８位でのロイシン残基、３７０位でのリシン残基、３８４位でのアスパラギン残基、４１８位でのグルタミン残基、及び４２１位でのアスパラギン残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の結合剤。

【請求項52】

第１のポリペプチド鎖が、配列番号２８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項53】

第２のポリペプチド鎖が、配列番号３０で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項54】

第３のポリペプチド鎖が、配列番号３１で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項55】

第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、請求項１～５４のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項56】

第２のポリペプチド鎖が、配列番号７４、７５、７６、及び７７からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、請求項１～５５のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項57】

第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、請求項１～５６のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項58】

（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、
請求項１～１２、２１～２９、３２～３５、３９、４１～４５、及び４７～５７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項59】

（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７４で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、
請求項１～３０、３３～４０、及び４２～５７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項60】

（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７６で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、
請求項１～３０、３３～４０、及び４２～５７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項61】

（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７７で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機
能的バリアントを含むか、又はからなる、
請求項１～２９、３１、３３～３９、及び４１～５７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項62】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＶＨ（ＣＤ３）、及び／又はＶＬ（ＣＤ３）が、ヒト化されている、請求項１～６１のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項63】

ＣＤ３が、Ｔ細胞の表面上で発現されている、請求項１～６２のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項64】

Ｔ細胞上のＣＤ３への結合剤の結合により、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化が生じる、請求項６３に記載の結合剤。

【請求項65】

ＣＬＤＮ１８．２が、がん細胞中で発現されている、請求項１～６４のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項66】

ＣＬＤＮ１８．２が、がん細胞の表面上で発現されている、請求項６５に記載の結合剤。

【請求項67】

結合剤が、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外部分に結合する、請求項６５又は６６に記載の結合剤。

【請求項68】

結合剤が、ＣＬＤＮ１８．２を発現しているがん細胞に対してＴ細胞媒介性細胞傷害を誘発する、請求項１～６７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項69】

がん細胞が、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択されるがんに由来する、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項70】

請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤のポリペプチド鎖をコードする核酸。

【請求項71】

請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤をコードする核酸。

【請求項72】

請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤を一緒にコードする核酸のセット。

【請求項73】

請求項７０に記載の核酸を含むベクター。

【請求項74】

請求項７１に記載の核酸又は請求項７２に記載の核酸のセットを含むベクター。

【請求項75】

請求項７２に記載の核酸のセットを含むベクターのセット。

【請求項76】

結合剤を発現することが可能な、請求項７４に記載のベクター又は請求項７５に記載のベクターのセット。

【請求項77】

請求項７１に記載の核酸、請求項７２に記載の核酸のセット、請求項７４若しくは７６に記載のベクター、又は請求項７５若しくは７６に記載のベクターのセットを含む宿主細胞。

【請求項78】

請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤、請求項７１に記載の核酸、請求項７２
に記載の核酸のセット、請求項７４若しくは７６に記載のベクター、請求項７５若しくは７６に記載のベクターのセット、又は請求項７７に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。

【請求項79】

治療での使用のための、請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤、請求項７１に記載の核酸、請求項７２に記載の核酸のセット、請求項７４若しくは７６に記載のベクター、請求項７５若しくは７６に記載のベクターのセット、請求項７７に記載の宿主細胞、又は請求項７８に記載の医薬組成物。

【請求項80】

ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞が関与するがんの処置又は予防での使用のための、請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤、請求項７１に記載の核酸、請求項７２に記載の核酸のセット、請求項７４若しくは７６に記載のベクター、請求項７５若しくは７６に記載のベクターのセット、請求項７７に記載の宿主細胞、又は請求項７８に記載の医薬組成物。

【請求項81】

がんが、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択される、請求項８０に記載の使用のための結合剤、核酸、核酸のセット、ベクター、ベクターのセット、宿主細胞、又は医薬組成物。

【請求項82】

ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞が関与するがんの処置又は予防のための医薬品の調製のための、請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤、請求項７１に記載の核酸、請求項７２に記載の核酸のセット、請求項７４若しくは７６に記載のベクター、請求項７５若しくは７６に記載のベクターのセット、請求項７７に記載の宿主細胞、又は請求項７８に記載の医薬組成物の使用。

【請求項83】

がんが、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択される、請求項８２に記載の使用。

【請求項84】

ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞が関与するがんを処置するか又は予防する方法であって、がんを有する対象に、請求項１～６９のいずれか一項に記載の結合剤、請求項７１に記載の核酸、請求項７２に記載の核酸のセット、請求項７４若しくは７６に記載のベクター、請求項７５若しくは７６に記載のベクターのセット、請求項７７に記載の宿主細胞、又は請求項７８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。

【請求項85】

がんが、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリン由来の重鎖（ＶＨ）の可変領域（ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２））と、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリン由来の軽鎖（ＶＬ）の可変領域（ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２））とを含む、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインを含む結合剤であって、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、アミノ酸配列ＳＹＷＩＮ（配列番号３２）を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号３３）を含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＳＷＲＧＮＳＦＤＹ（配列番号３４）を含むＣＤＲ３を含み、
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配
列番号３５）を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３６）を含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＮＤＹＳＹＰＦＴ（配列番号３７）を含むＣＤＲ３を含む、
結合剤。

【請求項87】

ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインをさらに含む請求項８６に記載の結合剤。

【請求項88】

ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリン由来のＶＨ（ＶＨ（ＣＤ３））と、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリン由来のＶＬ（ＶＬ（ＣＤ３））とを含み、
ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号５４、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、
ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、
請求項８７に記載の結合剤。

【請求項89】

ＶＨ（ＣＤ３）が、
（ｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＡＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５０）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号４５）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含むか、
（ｉｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４４）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＥＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号５１）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含むか、又は
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４４）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号４５）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含み、
ＶＬ（ＣＤ３）が、アミノ酸配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４６）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号４７）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号４８）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む、
請求項８８に記載の結合剤。

【請求項90】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号３９で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、及び／又は
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が、配列番号４２で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなる、
請求項８６～８９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項91】

ＶＨ（ＣＤ３）が、配列番号５４、５８、又は６１からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
ＶＬ（ＣＤ３）が、配列番号５５で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、
請求項８８～９０のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項92】

結合剤が、完全長抗体又は抗体断片の形態である、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項93】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片の形態である、請求項８６～９２の
いずれか一項に記載の結合剤。

【請求項94】

ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片の形態である、請求項８７～９３のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項95】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが、Ｆａｂ断片の形態であり、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが、ｓｃＦｖ断片の形態である、請求項８７～９４のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項96】

結合剤が、二重特異性分子である、請求項８６～９５のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項97】

二重特異性分子が、二重特異性抗体である、請求項９６に記載の結合剤。

【請求項98】

結合剤が、ＣＬＤＮ１８．２に１価又は２価で結合可能である、請求項８６～９７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項99】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＶＨ（ＣＤ３）、及び／又はＶＬ（ＣＤ３）が、ヒト化されている、請求項８６～９８のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項100】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）が、ペプチドリンカーによりＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）に結合しており、及び／又はＶＨ（ＣＤ３）が、ペプチドリンカーによりＶＬ（ＣＤ３）に結合している、請求項８６～９９のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項101】

ペプチドリンカーが、配列番号２～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１００に記載の結合剤。

【請求項102】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、
結合剤が、４本のポリペプチド鎖を含み、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｖ）第４のポリペプチド鎖が、第３のポリペプチド鎖と同一であり、
第１のポリペプチド鎖が、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用し、第２のポリペプチド鎖が、第４のポリペプチド鎖と相互作用する、
結合剤。

【請求項103】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、
結合剤が、３本のポリペプチド鎖を含み、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むか、
又はからなり、
第１のポリペプチド鎖が、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用する、
結合剤。

【請求項104】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、
結合剤が、４本のポリペプチド鎖を含み、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｖ）第４のポリペプチド鎖が、第３のポリペプチド鎖と同一であり、
第１のポリペプチド鎖が、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用し、第２のポリペプチド鎖が、第４のポリペプチド鎖と相互作用する、
結合剤。

【請求項105】

ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、
結合剤が、４本のポリペプチド鎖を含み、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖が、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むか、又はからなり、
（ｉｖ）第４のポリペプチド鎖が、第３のポリペプチド鎖と同一であり、
第１のポリペプチド鎖が、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用し、第２のポリペプチド鎖が、第４のポリペプチド鎖と相互作用する、
結合剤。

【請求項106】

ＣＤ３が、Ｔ細胞の表面上で発現されている、請求項８７～１０５のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項107】

Ｔ細胞上のＣＤ３への結合剤の結合により、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化が生じる、請求項１０６に記載の結合剤。

【請求項108】

ＣＬＤＮ１８．２が、がん細胞中で発現されている、請求項８６～１０７のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項109】

ＣＬＤＮ１８．２が、がん細胞の表面上で発現されている、請求項１０８に記載の結合剤。

【請求項110】

結合剤が、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外部分に結合する、請求項１０８又は１０９に記載の結合剤。

【請求項111】

結合剤が、ＣＬＤＮ１８．２を発現しているがん細胞に対してＴ細胞媒介性細胞傷害を誘発する、請求項８６～１１０のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項112】

がん細胞が、胃がん、食道がん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択されるがんに由来する、請求項１０８～１１１のいずれか一項に記載の結合剤。

【請求項113】

請求項１０２～１１２のいずれか一項に記載の結合剤のポリペプチド鎖をコードする核酸。

【請求項114】

請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤をコードする核酸。

【請求項115】

請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤を一緒にコードする核酸のセット。

【請求項116】

請求項１１３に記載の核酸を含むベクター。

【請求項117】

請求項１１４に記載の核酸又は請求項１１５に記載の核酸のセットを含むベクター。

【請求項118】

請求項１１５に記載の核酸のセットを含むベクターのセット。

【請求項119】

結合剤を発現することが可能な、請求項１１７に記載のベクター又は請求項１１８に記載のベクターのセット。

【請求項120】

請求項１１４に記載の核酸、請求項１１５に記載の核酸のセット、請求項１１７若しくは１１９に記載のベクター、又は請求項１１８若しくは１１９に記載のベクターのセットを含む宿主細胞。

【請求項121】

請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤、請求項１１４に記載の核酸、請求項１１５に記載の核酸のセット、請求項１１７若しくは１１９に記載のベクター、請求項１１８若しくは１１９に記載のベクターのセット、又は請求項１２０に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。

【請求項122】

治療での使用のための、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤、請求項１１４に記載の核酸、請求項１１５に記載の核酸のセット、請求項１１７若しくは１１９に記載のベクター、請求項１１８若しくは１１９に記載のベクターのセット、請求項１２０に記載の宿主細胞、又は請求項１２１に記載の医薬組成物。

【請求項123】

ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞が関与するがんの処置又は予防での使用のための、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤、請求項１１４に記載の核酸、請求項１１５に記載の核酸のセット、請求項１１７若しくは１１９に記載のベクター、請求項１１８若しくは１１９に記載のベクターのセット、請求項１２０に記載の宿主細胞、又は請求項１２１に記載の医薬組成物。

【請求項124】

がんが、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択される、請求項１２３に記載の使用のための結合剤、核酸、核酸のセット、ベクター、ベクターのセット、宿主細胞、又は医薬組成物。

【請求項125】

ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞が関与するがんの処置又は予防のための医薬品の
調製のための、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤、請求項１１４に記載の核酸、請求項１１５に記載の核酸のセット、請求項１１７若しくは１１９に記載のベクター、請求項１１８若しくは１１９に記載のベクターのセット、請求項１２０に記載の宿主細胞、又は請求項１２１に記載の医薬組成物の使用。

【請求項126】

がんが、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択される、請求項１２５に記載の使用。

【請求項127】

ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞が関与するがんを処置するか又は予防する方法であって、がんを有する対象に、請求項８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤、請求項１１４に記載の核酸、請求項１１５に記載の核酸のセット、請求項１１７若しくは１１９に記載のベクター、請求項１１８若しくは１１９に記載のベクターのセット、請求項１２０に記載の宿主細胞、又は請求項１２１に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。

【請求項128】

がんが、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

請求項１～６９及び８６～１１２のいずれか一項に記載の結合剤を製造する方法。

【請求項130】

請求項７１若しくは１１４に記載の核酸、請求項７２若しくは１１５に記載の核酸のセット、請求項７４、７６、１１７、若しくは１１９のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項７５、７６、１１８、若しくは１１９のいずれか一項に記載のベクターのセットで宿主細胞をトランスフェクトする工程を含む請求項１２９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

胃及び食道（胃食道；ＧＥ）のがんは、満たされていない医療ニーズが最も高い悪性腫瘍の一つである。胃がんは、世界のがん死因の第３位である（Ｐｒｚ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１９；１４（１）：２６－３８）。食道がんの発生率は、ここ数十年で増加しており、このことは、組織型及び原発腫瘍の位置の変化と一致している。食道腺癌は、現在、米国及び西欧では扁平上皮癌よりも蔓延しており、ほとんどの腫瘍は、食道遠位部に位置している。かなりの副作用を伴う確立された標準的処置の積極性にもかかわらず、ＧＥがんの全体的な５年生存率は、２０～２５％である。

【0002】

患者の大部分は、局所進行性又は転移性の疾患を患っており、第一選択の化学療法を受けなければならない。処置レジメンは、白金及びフルオロピリミジン誘導体を骨格とし、多くは第３の化合物（例えば、タキサン又はアントラサイクリン）を併用することに基づく。それでも、無増悪生存期間中央値５～７ヵ月、及び全生存期間中央値９～１１ヵ月が、期待し得る最良である。

【0003】

これらのがんに対する様々な新世代の化学療法併用レジメンで大きな効果が得られないことから、標的薬剤の使用に関する研究が刺激されている。最近、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性の胃食道がんに対して、トラスツズマブが承認された。しかしながら、この標的を発現し、この処置の適応となる患者はわずか２０％程度であることから、医療ニーズは依然として高い。

【0004】

タイトジャンクション分子クローディン１８（ＣＬＤＮ１８）は、４つの膜貫通疎水性領域と、２つの細胞外ループ（ループ１は、疎水性領域１及び疎水性領域２に囲まれており、ループ２は、疎水性領域３及び４に囲まれている）を有する完全膜貫通タンパク質（テトラスパニン）である。ＣＬＤＮ１８は、マウス及びヒトで説明されている２つの異なるスプライスバリアントで存在している（Ｎｉｉｍｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：７３８０－９０，２００１）。スプライスバリアント（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：スプライスバリアント１（ＣＬＤＮ１８．１）：ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ＿０１６３６９、及びスプライスバリアント２（ＣＬＤＮ１８．２）：ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）は、分子量が約２７．９／２７．７２ｋＤである。スプライスバリアントＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２は、第１の膜貫通（ＴＭ）領域とループ１とを含むＮ末端部分で異なるが、Ｃ末端の主要なタンパク質配列は、同一である。

【0005】

正常組織では、ＣＬＤＮ１８．２が短命の分化した胃上皮細胞上でのみ発現されている胃を除いて、ＣＬＤＮ１８．２の検出可能な発現は存在していない。ＣＬＤＮ１８．２は、悪性化の過程で維持され、そのためヒト胃がん細胞の表面上で頻繁に提示される。さらに、この汎腫瘍性抗原は、食道、膵臓、肺の腺癌において有意なレベルで異所的に活性化される。ＣＬＤＮ１８．２タンパク質はまた、胃がん腺癌のリンパ節転移、及び特に卵巣への遠隔転移（いわゆるクルケンベルグ腫瘍）にも局在している。

【0006】

がん細胞と正常細胞の間でのＣＬＤＮ１８．２等のクローディンの異なる発現、これらの膜局在性、及び毒性に関連する正常組織の大部分にはクローディンが存在しないことから、これらの分子は、がん免疫療法にとって魅力的な標的となっており、がん治療においてＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体ベースの治療の使用は、高レベルの治療特異性を約束する。

【0007】

ＣＬＤＮ１８．２に対するキメラＩｇＧ１抗体ＩＭＡＢ３６２（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ（旧名Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ））は、Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧにより開発された。ＩＭＡＢ３６２は、高い親和性及び特異性で、ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ１）を認識する。ＩＭＡＢ３６２は、クローディン１８の近縁のスプライスバリアント１（ＣＬＤＮ１８．１）を含む任意の他のクローディンファミリのメンバーには結合しない。ＩＭＡＢ３６２は正確な腫瘍細胞特異性を示し、２つの独立した非常に強力な作用機序を束ねる。標的との結合時に、ＩＭＡＢ３６２は、主にＡＤＣＣ及びＣＤＣによる細胞死滅を媒介する。そのため、ＩＭＡＢ３６２は、インビトロ及びインビボで、ヒト胃がん細胞株を含むＣＬＤＮ１８．２陽性細胞を効率的に溶解する。ＣＬＤＮ１８．２陽性がん細胞株を接種した異種移植腫瘍を持つマウスにおいて、ＩＭＡＢ３６２の抗腫瘍効果が実証された。

【0008】

ＩｇＧ１抗体は、典型的には、Ｆｃドメインと、ＡＤＣＣの主因子であるナチュラルキラー細胞を含む様々な免疫細胞上で発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を介して、細胞性免疫系に関与する。しかしながら、ＡＤＣＣを誘発するＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、集団における低親和性Ｆｃ受容体バリアントの広範な分布（最大８０％）、及びインビボでのＩｇＧ１改変によるｍＡｂ効力の低下等のいくつかの制限に直面している（Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１５７（２）：２２０－２３３）。治療用抗体はまた、患者のＩｇＧと競合しなければならず、その結果、インビボでは高用量のｍＡｂｓが必要となる。さらに、治療用抗体は、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球により発現される抑制性ＦｃγＲ）と相互作用し得、その結果、有効性を低下させる負のシグナル伝達が生じる。

【発明の概要】

【0009】

本発明の目的は、がん疾患の治療のための新規の薬剤及び方法を提供することである。

【0010】

本発明の基礎となるこの問題の解決策は、ＣＬＤＮ１８．２（即ちがん細胞）に特異的な少なくとも１つの結合ドメインを含む結合剤を生成するという概念に基づいている。この結合剤はまた、Ｔ細胞に結合してＴ細胞を複合体中に引き込むことを可能にする、Ｔ細胞特異的抗原ＣＤ３に特異的な結合ドメインも含み、そのため、Ｔ細胞の細胞傷害効果をがん細胞に標的化することが可能となる。この複合体の形成により、細胞傷害性Ｔ細胞において、単独で又はアクセサリー細胞との組み合わせでシグナル伝達が誘導され得、細胞傷害性メディエーターが放出される。

【0011】

本発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２を標的とするＦａｂフォーマットの少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３等のＴ細胞特異的抗原を標的とするｓｃＦｖフォーマットの別の結合ドメインとを含む結合剤が、強力なＴ細胞媒介性溶解を誘導し得、腫瘍疾患の処置に有効であることを初めて報告する。

【0012】

本発明は、全体として、ＣＬＤＮ１８．２に結合する結合剤を提供し、特に、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に結合する二重特異性結合剤を提供する。

【0013】

本発明は、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、この結合剤は、少なくとも３本のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリン由来の重鎖（ＶＨ）の可変領域（ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２））を含み、第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリン由来のＶＨの可変領域（ＶＨ（ＣＤ３））と、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリン由来の軽鎖（ＶＬ）の可変領域（ＶＬ（ＣＤ３））とを含み、第３のポリペプチド鎖は、ＣＬＤＮ
１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリン由来のＶＬ（ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２））を含む、結合剤を提供する。

【0014】

一実施形態において、本発明の結合剤は、二重特異性三量体結合剤である。

【0015】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンに由来する重鎖の定常領域１（ＣＨ１）又はその機能的バリアントを含む。

【0016】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンに由来する重鎖の定常領域２（ＣＨ２）又はその機能的バリアントと、免疫グロブリンに由来する重鎖の定常領域３（ＣＨ３）又はその機能的バリアントとを含む。

【0017】

一実施形態において、第３のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンに由来する軽鎖の定常領域（ＣＬ）又はその機能的バリアントを含む。

【0018】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＨ、並びにＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記の順序：ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３で配置されている。

【0019】

一実施形態において、第２のポリペプチド鎖のＶＨ、ＶＬ、並びにＣＨ２、及びＣＨ３は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記の順序：ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３で配置されている。

【0020】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用する。一実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインを形成し、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）は、相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインを形成する。

【0021】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２は、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２と相互作用し、及び／又は第１のポリペプチド鎖のＣＨ３は、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３と相互作用する。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１は、第３のポリペプチド鎖のＣＬと相互作用する。

【0022】

一実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有するさらなる結合ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖は、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）をさらに含み、結合剤は、第３のポリペプチド鎖と同一の第４のポリペプチド鎖を含む。

【0023】

一実施形態において、本発明の結合剤は、二重特異性三量体結合剤である。

【0024】

一実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンに由来するＣＨ１又はその機能的バリアントをさらに含む。

【0025】

一実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１であり、好ましくは、ヒトＩｇＧ１である。一実施形態において、本明細書で説明されている結合剤において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及び／若しくはＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、ＩｇＧ１に由来しており、ＶＨ（ＣＤ３）及び／若しくはＶＬ（ＣＤ３）は、ＩｇＧ１に由来しており、並びに／又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／若しくはＣＬは、ＩｇＧ１に由来しており、ＩｇＧ１は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１である。

【0026】

一実施形態において、第２のポリペプチド鎖のＶＨ、ＶＬ、並びにＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記の順序：ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３で配置されている。

【0027】

一実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、第４のポリペプチド鎖と相互作用する。

【0028】

一実施形態において、第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、第４のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）と相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有するさらなる結合ドメインを形成する。

【0029】

一実施形態において、第２のポリペプチド鎖のＣＨ１は、第４のポリペプチド鎖のＣＬと相互作用する。

【0030】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号５４、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0031】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）は、
（ｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＡＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５０）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号４５）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含むか、
（ｉｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４４）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＥＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号５１）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含むか、又は
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＴＹＡＭＮ（配列番号４３）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４４）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号４５）若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む。

【0032】

一実施形態において、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0033】

一実施形態において、ＶＬ（ＣＤ３）は、アミノ酸配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４６）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号４７）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号４８）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む。

【0034】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0035】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、アミノ酸配列ＳＹＷＩＮ（配列番号３２）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号３３）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＳＷＲＧＮＳＦＤＹ（配列番号３４）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む。

【0036】

一実施形態において、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ
２、及びＣＤＲ３を含む。

【0037】

一実施形態において、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号３５）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３６）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＮＤＹＳＹＰＦＴ（配列番号３７）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む。

【0038】

一実施形態において、
（ｉ）ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むか、
（ｉｉ）ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号６１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むか、又は
（ｉｉｉ）ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号５４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0039】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号５８で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、及び／又はＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなる。

【0040】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号６１で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、及び／又はＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなる。

【0041】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号５４で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなり、及び／又はＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列若しくはその機能的バリアントを含むか、若しくはからなる。

【0042】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖において、ＣＨ１は、ペプチドリンカーによりＣＨ２に結合している。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２７）又はその機能的バリアントを含む。

【0043】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）又はＶＬ（ＣＤ３）は、ペプチドリンカーによりＣＨ２に結合している。一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）又はＶＬ（ＣＤ３）は、ペプチドリンカーによりＣＨ１に結合している。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_ｘ又はその機能的バリアントを含み、式中、Ｘは、２、３、４、５、又は６である。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号２６）又はその機能的バリアントを含む。一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）又はＶＬ（ＣＤ３）とＣＨ２とを結合させるペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２１）又はその機能的バリアントを含む。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_２ＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２３）又はその機能的バリアントを含む。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２２）又はその機能的バリアントを含む。

【0044】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）は、ペプチドリンカーにより互いに結合している。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_ｘ又はその機能的バリアントを含み、式中、ｘは、２、３、４、５、又は６である。一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_４（配列番号１１）又はその機能的バリアントを含む。

【0045】

ある特定の実施形態において、本発明の結合剤のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及び／又はＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングに従ってヒトＩｇＧ１の位置に対応する位置で、１つ又は複数のアミノ酸改変を含み、具体的には、置換及び／又は欠失を含む。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ１は、ＥＵナンバリングに従って２０８位でアスパラギン酸残基を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１は、ＥＵナンバリングに従って２０８位でアスパラギン酸残基を含むアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖のＣＨ１は、ＥＵナンバリングに従って２０８位でアスパラギン残基を含むアミノ酸配列を含む。

【0046】

さらに、ある特定の実施形態において、本発明の結合剤は、ヒトＦｃγＲＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、及び／又はＩＩＩａに実質的に結合せず、例えば、検出可能に結合しない。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ２は、下記：ＥＵナンバリングに従って２３３位でのプロリン残基、２３４位でのバリン残基、２３５位でのアラニン残基、２３６位での欠失、２６７位でのリシン残基、及び２９５位でのグルタミン酸残基の内の１つ又は複数を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖のＣＨ２は、ＥＵナンバリングに従って２３３位でのプロリン残基、２３４位でのバリン残基、２３５位でのアラニン残基、２３６位での欠失、及び２６７位でのリシン残基を含むアミノ酸配列を含み、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２は、ＥＵナンバリングに従って２９５位でグルタミン鎖残基をさらに含み、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２は、ＥＵナンバリングに従って２９５位でグルタミン残基をさらに含む。

【0047】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ３は、下記：ＥＵナンバリングに従って３５７位でのグルタミン残基、３６４位でのリシン残基、３６８位でのアスパラギン酸残基、３７０位でのセリン残基、３８４位でのアスパラギン酸残基、４１８位でのグルタミン酸残基、及び４２１位でのアスパラギン酸残基の内の１つ又は複数を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＣＨ３は、ＥＵナンバリングに従って３５７位でのグルタミン酸残基、３６４位でのセリン残基、３６８位でのアスパラギン酸残基、３７０位でのセリン残基、３８４位でのアスパラギン酸残基、４１８位でのグルタミン酸残基、及び４２１位でのアスパラギン酸
残基を含むアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３は、ＥＵナンバリングに従って３５７位でのグルタミン残基、３６４位でのリシン残基、３６８位でのロイシン残基、３７０位でのリシン残基、３８４位でのアスパラギン残基、４１８位でのグルタミン残基、及び４２１位でのアスパラギン残基を含むアミノ酸配列を含む。

【0048】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。一実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。一実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２９で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。一実施形態において、第３のポリペプチド鎖は、配列番号３１で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。

【0049】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。一実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、配列番号７４、７５、７６、及び７７からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。一実施形態において、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。

【0050】

好ましくは、一実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。

【0051】

好ましくは、一実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号７４で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。

【0052】

好ましくは、一実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号７６で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。

【0053】

好ましくは、一実施形態において、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、配列番号７７で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。

【0054】

本発明はまた、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリンに由来する重鎖（ＶＨ）の可変領域（ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２））と、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する免疫グロブリンに由来する軽鎖（ＶＬ）の可変領域（ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２））とを含む、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインを含む結合剤であって、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、アミノ酸配列ＳＹＷＩＮ（配列番号３２）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号３３）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＳＷＲＧＮＳＦＤＹ（配列番号３４）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、アミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号３５）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号３６）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＮＤＹＳＹＰＦＴ（配列番号３７）又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む、結合剤も提供する。一実施形態において、結合剤は、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインをさらに含む。一実施形態において、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリンに由来するＶＨ（ＶＨ（ＣＤ３））と、ＣＤ３に対する特異性を有する免疫グロブリンに由来するＶＬ（ＶＬ（ＣＤ３））とを含み、ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号５４、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0055】

一実施形態において、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号３３）の機能的バリアントは、アミノ酸残基ＱＧを含むか、又は保持する。

【0056】

一実施形態において、結合剤は、完全長抗体又は抗体断片の形態である。一実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片の形態である。一実施形態において、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片の形態である。

【0057】

一実施形態において、結合剤は、二重特異性抗体等の二重特異性分子である。一実施形態において、結合剤は、二重特異性一本鎖抗体である。一実施形態において、結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に１価又は２価で結合可能である。一実施形態において、結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する２つの結合ドメインを含む。一実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、Ｆａｂ断片の形態であり、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、ｓｃＦｃＶ断片の形態である。一実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、ペプチドリンカーによりＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）に結合しており、及び／又はＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号２～２０からなる群から選択されるペプチドリンカー等のペプチドリンカーによりＶＬ（ＣＤ３）に結合している。

【0058】

本発明はまた、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、この結合剤は、少なくとも４本のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第２のポリペプチド鎖は、配列番号７４で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第４のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と同一である、結合剤も提供する。一実施形態において、結合剤のポリペプチド鎖及び／又は結合剤のポリペプチド鎖のドメインは、本明細書で説明されているように、互いに相互作用
する。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用し、第２のポリペプチド鎖は、第４のポリペプチド鎖と相互作用する。

【0059】

本発明はまた、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、この結合剤は、少なくとも３本のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる、結合剤も提供する。一実施形態において、結合剤のポリペプチド鎖及び／又は結合剤のポリペプチド鎖のドメインは、本明細書で説明されているように、互いに相互作用する。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用する。

【0060】

本発明はまた、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、この結合剤は、少なくとも４本のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第２のポリペプチド鎖は、配列番号７６で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第４のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と同一である、結合剤も提供する。一実施形態において、結合剤のポリペプチド鎖及び／又は結合剤のポリペプチド鎖のドメインは、本明細書で説明されているように、互いに相互作用する。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用し、第２のポリペプチド鎖は、第４のポリペプチド鎖と相互作用する。

【0061】

本発明はまた、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインとを含む結合剤であって、この結合剤は、少なくとも４本のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第２のポリペプチド鎖は、配列番号７７で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、第４のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と同一である、結合剤も提供する。一実施形態において、結合剤のポリペプチド鎖及び／又は結合剤のポリペプチド鎖のドメインは、本明細書で説明されているように、互いに相互作用する。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖と相互作用し、第２のポリペプチド鎖は、第４のポリペプチド鎖と相互作用する。

【0062】

一実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＶＨ（ＣＤ３）、及び／又はＶＬ（ＣＤ３）は、ヒト化されている。

【0063】

一実施形態において、ＣＤ３は、Ｔ細胞の表面上で発現されている。一実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＤ３のイプシロン鎖に結合する。一実施形態において、Ｔ細胞上のＣＤ３への結合剤の結合により、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化が生じる。一実施形態において、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化により、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞（好ましくは、ＣＤ１０７ａ＋ Ｔ細胞）の増殖及び／又は活性化が誘発される。一実施形態において、前記増殖した及び／又は活性化されたＴ細胞は、脱顆粒可能である
。一実施形態において、前記活性化されたＴ細胞は、細胞傷害性因子（例えば、パーフォリン及びグランザイム）を放出し、がん細胞の細胞溶解及び／又はアポトーシスを開始する。

【0064】

一実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２は、がん細胞中で発現されている。一実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２は、がん細胞の表面上で発現されている。一実施形態において、結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外部分に結合する。一実施形態において、結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２を発現しているがん細胞に対してＴ細胞媒介性細胞傷害を誘発する。

【0065】

一実施形態において、がん細胞は、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択されるがんに由来する。

【0066】

いくつかの実施形態において、本発明の結合剤、又は本発明の結合剤のポリペプチド鎖の内の１本又は複数本は、分泌シグナル（例えば、Ｎ末端分泌シグナル、特に、ＩｇＧ分泌シグナル等の免疫グロブリン、例えば、配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）を含むか、若しくは含まず、及び／又はタグ（特に、Ｃ末端タグ、例えば、Ｈｉｓタグ、特に、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（Ｈｉｓ）_６若しくは（Ｈｉｓ）_６、又はＳｔｒｅｐタグ）を含むか、若しくは含まない。

【0067】

いくつかの実施形態において、本発明の結合剤は、１つ又は複数の翻訳後改変を含む。本発明はまた、本明細書で説明されている結合剤の１つ又は複数の翻訳後改変に由来する結合剤も提供する。一実施形態において、１つ又は複数の翻訳後改変は、１つ又は複数のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）のＮ末端でのピログルタミン化、ＶＨ（ＣＤ３）のＮ末端でのピログルタミン化、第１のポリペプチド鎖のＣ末端でのリシンの欠失、及び第２のポリペプチド鎖のＣ末端でのリシンの欠失から選択される。

【0068】

本発明はまた、本発明の結合剤のポリペプチド鎖をコードする核酸も提供する。本発明はまた、本発明の結合剤をコードする核酸も提供する。本発明はまた、本発明の結合剤を一緒にコードする核酸のセットも提供する。

【0069】

本発明はまた、本発明の核酸又は核酸のセットを含むベクターも提供する。本発明はまた、本発明の核酸のセットを含むベクターのセットも提供する。一実施形態において、核酸のセットの各核酸は、ベクターのセットのベクターに含まれている。一実施形態において、ベクター又はベクターのセットは、本結合剤を発現可能である。

【0070】

一実施形態において、核酸は、任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム結合部位、誘導因子等）に作動可能に連結されている。ベクターは、発現ベクターであり得、染色体外ベクター又は組込みベクターであり得る。いくつかの実施形態において、本発明の結合剤のポリペプチド鎖をコードする核酸は、それぞれ、単一の発現ベクターに含まれる。これらの核酸は、異なるプロモーター又は同一のプロモーターの制御下であり得る。そのような実施形態において、様々なベクター比を使用して、本発明に結合剤の形成を駆動させ得る。

【0071】

本発明はまた、前記核酸、核酸のセット、ベクター、又はベクターのセットを含む宿主細胞も提供する。一実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３
Ｔ細胞、及び同類のものからなる群から選択される哺乳動物細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、又は昆虫細胞である。

【0072】

本発明はまた、本発明の結合剤、本発明の核酸、本発明の核酸のセット、本発明のベクター、本発明のベクターのセット、又は本発明の宿主細胞を含む医薬組成物も提供する。一実施形態において、この医薬組成物は、薬学的に受容される単体及び／又は賦形剤をさらに含む。

【0073】

本発明はまた、治療での使用のための、本発明の結合剤、本発明の核酸、本発明の核酸のセット、本発明のベクター、本発明のベクターのセット、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物も提供する。

【0074】

本発明はまた、がんの処置又は予防での使用のための、本発明の結合剤、本発明の核酸、本発明の核酸セット、本発明のベクター、本発明のベクターのセット、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物も提供する。

【0075】

本発明はまた、がんを処置するか又は予防する方法であって、本発明の結合剤、本発明の核酸、本発明の核酸のセット、本発明のベクター、本発明のベクターのセット、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物を、必要な対象に投与する工程を含む方法も提供する。一実施形態において、がんは、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞を伴う。

【0076】

本発明はまた、医薬品の調製のための、本発明の結合剤、本発明の核酸、本発明の核酸のセット、本発明のベクター、本発明のベクターのセット、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。一実施態様において、医薬品は、がんの処置又は予防のためのものである。一実施形態において、がんは、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞を伴う。

【0077】

一実施形態において、前記がんは、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん及びその転移、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、並びに／又はリンパ節転移からなる群から選択される。

【0078】

本発明はまた、本明細書で説明されている処置方法での使用のための、本明細書で説明されている結合剤、核酸、核酸のセット、ベクター、ベクターのセット、宿主細胞、又は医薬組成物も提供する。一実施形態において、提供されるのは、がん等の疾患を処置するか又は予防する方法であって、がんを有する対象等の疾患を有する対象に、本発明の結合剤、本発明の核酸、本発明の核酸のセット、本発明のベクター、本発明のベクターのセット、本発明の宿主細胞、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む方法である。好ましくは、この疾患は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する疾患細胞等の細胞を伴う。好ましくは、この疾患は、がんであり、このがんは、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞を伴う。

【0079】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、好ましくは、配列番号１に係るアミノ酸配列を有する。

【0080】

いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含まない。いくつかの実施形態において、第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）を含まない。

【0081】

いくつかの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合剤の結合ドメインは、Ｆａｂ断片の形態である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対する特
異性を有する本発明の結合剤の結合ドメインは、ｓｃＦｖ部分の形態である。

【0082】

いくつかの実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＬＤＮ１８．１に結合しない。好ましくは、この結合剤は、ヒト、マウス、又はカニクイザルのＣＬＤＮ１８．１に結合しない。いくつかの実施形態において、本発明の結合剤は、ヒトＣＬＤＮ９等のＣＬＤＮ９に結合しない。

【0083】

いくつかの実施形態において、本発明の結合剤は、ヒト、マウス、及びカニクイザルのＣＬＤＮ１８．２等の複数の種のＣＬＤＮ１８．２に結合する。

【0084】

いくつかの実施形態において、本明細書で説明されている結合剤で患者を処置することにより、前記患者の生存期間が延長される。いくつかの実施形態において、本明細書で説明されている結合剤は、１つ又は複数の免疫エフェクター機能を示す。いくつかの実施形態において、前記１つ又は複数の免疫エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、アポトーシスの誘発、及び増殖の阻害からなる群から選択される。本明細書で説明されている結合剤はまた、好ましくは、がん細胞を攻撃するようにＴ細胞をリダイレクト可能であり、そのため、リダイレクトＴ細胞細胞傷害（ＲＴＣＣ）を介して作用する。いくつかの実施形態において、結合剤は、ＡＤＣＣを誘発し得ないか、又は実質的にし得ない。いくつかの実施形態において、結合剤は、ＣＤＣを誘発し得ないか、又は実質的にし得ない。いくつかの実施形態において、結合剤は、ＡＤＣＰを誘発し得ないか、又は実質的にし得ない。いくつかの実施形態において、結合剤は、患者等の対象の腫瘍の増殖及び／又は体積を減少可能であり、好ましくは顕著に減少可能である。

【0085】

本発明はまた、本発明の結合剤を製造する方法も提供する。一実施形態において、本発明の結合剤を製造する方法は、本発明の核酸、本発明の核酸のセット、本発明のベクター、又は本発明のベクターのセットで宿主細胞をトランスフェクトする工程を含む。一実施形態において、宿主細胞は、本発明の結合剤をコードする核酸を発現する。一実施形態において、宿主細胞は、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖をコードする核酸と、本発明の結合剤の第２のポリペプチド鎖をコードする核酸とを共発現する。一実施形態において、宿主細胞は、本発明の結合剤の第３のポリペプチド鎖をコードする核酸をさらに発現する。一実施形態において、宿主細胞は、本発明の結合剤の第４のポリペプチド鎖をコードする核酸をさらに発現する。一実施形態において、前記核酸は、ベクター又はベクターのセットに含まれている。一実施形態において、宿主細胞は、本発明の結合剤の全てのポリペプチド鎖を発現する。一実施形態において、トランスフェクション後の宿主細胞は、好ましくは、本明細書で説明されているか又は当該技術分野で公知のもの等の結合剤産生に適切な条件下で増殖させた場合に、本発明の結合剤を産生する。一実施形態において、本発明の結合剤を、この宿主細胞から得ることができる。

【0086】

そのため、一実施形態において、本発明の結合剤を製造する方法は、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖をコードする核酸、本発明の結合剤の第２のポリペプチド鎖をコードする核酸、本発明の結合剤の第３のポリペプチド鎖をコードする核酸、及び任意選択的な、本発明の結合剤の第４のポリペプチド鎖をコードする核酸で、宿主細胞をトランスフェクトする工程、この宿主細胞中で前記核酸を発現させる工程、並びに本発明の結合剤を得る工程を含む。一実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３
Ｔ細胞、及び同類ものからなる群から選択される哺乳動物細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、又は昆虫細胞である。一実施形態において、結合剤は、インビトロで産生される。一実施形態において、結合剤は、インビボで産生され、例えば、疾患（特に、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞と関連す
る疾患、例えば、がん）を有する対象等の処置される対象中で産生される。一実施形態において、本発明の結合剤の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖は、例えば、ある宿主細胞中で産生され、第３のポリペプチド鎖は、例えば、別の宿主細胞中で産生される。一実施形態において、本発明の結合剤の全てのポリペプチド鎖は、同一の宿主細胞中で産生される。

【0087】

一実施形態において、本発明の結合剤のポリペプチド鎖は、互いに連結されており、例えば、共有結合的に連結されている。一実施形態において、結合剤のポリペプチド鎖は、結合剤の全てのポリペプチド鎖を含む１つのポリペプチドとして産生される。一実施形態において、結合剤の少なくとも２本のポリペプチド鎖は、一緒に連結されており、１つのポリペプチドとして産生される。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、一緒に連結されており、１つのポリペプチドとして産生され、第３のポリペプチド鎖は、別個のポリペプチドとして産生される。一実施形態において、第３のポリペプチド鎖及び第１のポリペプチド鎖は、一緒に連結されており、１つのポリペプチドとして産生され、第２のポリペプチド鎖は、別個のポリペプチドとして産生される。一実施形態において、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖は、一緒に連結されており、１つのポリペプチドとして産生され、第１のポリペプチド鎖は、別個のポリペプチドとして産生されるか、又は第４のポリペプチド鎖に連結されており、両方とも、１つのポリペプチドとして一緒に産生される。好ましくは、本発明の結合剤のポリペプチド鎖は、別々に産生され、即ち、別個のポリペプチドとして産生され、例えば、同一の又は異なる細胞中で産生され、産生時に又は産生後に相互作用して、例えば細胞内で又は細胞外で結合剤を形成する。好ましくは、ポリペプチド鎖は、別個のポリペプチドとして産生され、即ち、第１のポリペプチド鎖は、１つのポリペプチドとして産生され、第２のポリペプチド鎖は、１つのポリペプチドとして産生され、第３のポリペプチド鎖は、１つのポリペプチドとして産生され、及び任意選択的に、第４のポリペプチド鎖は、１つのポリペプチドとして産生され、本発明のこれらのポリペプチド鎖は、相互作用して、本発明の結合剤を形成する。一実施形態において、本発明の結合剤を投与することは、脂質ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス等の担体で製剤化された第１、第２、第３、及び任意選択的な第４のポリペプチド鎖を投与することを含む。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖が、一緒に投与され、例えば、同一の又は異なる担体で製剤化され、第３のポリペプチド鎖が投与され、例えば担体で別個に製剤化される。一実施形態において、第４のポリペプチド鎖がさらに投与され、例えば担体で別個に製剤化される。一実施形態において、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖が、一緒に投与され、例えば、同一の又は異なる担体で製剤化される。一実施形態において、本発明の結合剤の全てのペプチド鎖は、同一の担体で一緒に製剤化される。一実施形態において、本発明の結合剤の各ポリペプチド鎖は、別個の担体で製剤化されており、ここで、この担体は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。

【0088】

本発明の他の特徴及び利点は、下記で詳述されている説明及び特許請求の範囲から明らかであるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0089】

【図1】図１Ａは、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側に組換えにより融合したＶＨ（本明細書で説明されている第１のポリペプチド鎖）、ヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に組換えにより融合した一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）（本明細書で説明されている第２のポリペプチド鎖）、及び第１のポリペプチド鎖のＶＨと共にＦａｂドメインを形成するように別々にトランスフェクトされた軽鎖（ＬＣ；本明細書で説明されている第３のポリペプチド鎖）を含む「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットである。図１Ｂは、ヘテロ二量体Ｆｃの一方の側に組換えにより融合したＶＨ（本明細書で説明されている第１のポリペプチド鎖）、ヘテロ二量体Ｆｃの他方の側に融合したｓｃＦｖに組換えにより融合したＶＨ（本明細書で説明されている第２のポリペプチド鎖）、並びに第１のポリペプチド鎖のＶＨ及び第２のポリペプチド鎖の付加的なＶＨと共にＦａｂドメインを形成するように別々にトランスフェクトされたＬＣ（本明細書で説明されている第３及び第４のポリペプチド鎖）を含む「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットを示す。

【図2A】マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＡ）ＫＰ－４細胞及びＢ）ＮＵＧＣ－４細胞への結合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂ、細胞のみ、及び二次抗体のみを含んでいた。このデータから、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂは、用量依存的にＮＵＧＣ－４細胞に結合しており、試験した全ての濃度ではＫＰ－４細胞にはほとんど結合しなかったことが分かる。特に、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４７、ＸＥＮＰ２４６４８、及びＸＥＮＰ２４６４９）は、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４５、及びＸＥＮＰ２４６４６）と比較して、ＮＵＧＣ－４細胞にはるかに強力に結合しており、このことはおそらく、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットにより伝えられる特別な結合活性に起因している。

【図2B】マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＡ）ＫＰ－４細胞及びＢ）ＮＵＧＣ－４細胞への結合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂ、細胞のみ、及び二次抗体のみを含んでいた。このデータから、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂは、用量依存的にＮＵＧＣ－４細胞に結合しており、試験した全ての濃度ではＫＰ－４細胞にはほとんど結合しなかったことが分かる。特に、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４７、ＸＥＮＰ２４６４８、及びＸＥＮＰ２４６４９）は、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４５、及びＸＥＮＰ２４６４６）と比較して、ＮＵＧＣ－４細胞にはるかに強力に結合しており、このことはおそらく、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットにより伝えられる特別な結合活性に起因している。

【図3A】マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂによるＡ）ＫＰ－４細胞及びＢ）ＮＵＧＣ－４細胞へのＲＴＣＣの誘導を示す。このデータから、プロトタイプの抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂは、ＮＵＧＣ－４に用量依存的にＲＴＣＣを誘導したが、ＫＰ－４細胞にはＲＴＣＣを誘導しなかったことが分かる。

【図3B】マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂによるＡ）ＫＰ－４細胞及びＢ）ＮＵＧＣ－４細胞へのＲＴＣＣの誘導を示す。このデータから、プロトタイプの抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂは、ＮＵＧＣ－４に用量依存的にＲＴＣＣを誘導したが、ＫＰ－４細胞にはＲＴＣＣを誘導しなかったことが分かる。

【図4A】フローサイトメトリーにより決定した場合の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞での発現レベルを示す。このデータは、ＳＮＵ－６０１がＮＵＧＣ－４と比べてＣＬＤＮ１８．２を多く発現することを示す。

【図4B】フローサイトメトリーにより決定した場合の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞での発現レベルを示す。このデータは、ＳＮＵ－６０１がＮＵＧＣ－４と比べてＣＬＤＮ１８．２を多く発現することを示す。

【図5A】マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＡ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞への結合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、細胞のみ、及び二次抗体のみを含んでいた。このデータから、二重特異性抗体のそれぞれは、ＮＵＧＣ－４及びＳＮＵ－６０１の両方に用量依存的に結合しており、ＳＮＵ－６０１細胞への最大結合はＮＵＧＣ－４と比べて高く、このことは、各細胞株でのそれぞれのＣＬＤＮ１８．２発現レベルと一致していることが分かる。

【図5B】マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体のＡ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞への結合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、細胞のみ、及び二次抗体のみを含んでいた。このデータから、二重特異性抗体のそれぞれは、ＮＵＧＣ－４及びＳＮＵ－６０１の両方に用量依存的に結合しており、ＳＮＵ－６０１細胞への最大結合はＮＵＧＣ－４と比べて高く、このことは、各細胞株でのそれぞれのＣＬＤＮ１８．２発現レベルと一致していることが分かる。

【図6】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりインキュベートした後の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞でのＲＴＣＣの誘導（生きている標的細胞の減少により示される）を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、生細胞の減少により示されるように、二重特異性抗体が標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することが分かる。

【図7A】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりインキュベートした後の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞でのＲＴＣＣの誘導（死滅した標的細胞の増加により示される）を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、死滅した／瀕死の細胞の増加により示されるように、二重特異性抗体が標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することが分かる。

【図7B】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりインキュベートした後の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞でのＲＴＣＣの誘導（死滅した標的細胞の増加により示される）を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、死滅した／瀕死の細胞の増加により示されるように、二重特異性抗体が標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することが分かる。

【図8A】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりインキュベートした後の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞でのＲＴＣＣの誘導（生きている標的細胞の減少により示される）を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、生細胞の減少により示されるように、二重特異性抗体が標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することが分かる。

【図8B】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりインキュベートした後の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞でのＲＴＣＣの誘導（生きている標的細胞の減少により示される）を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、生細胞の減少により示されるように、二重特異性抗体が標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することが分かる。

【図9A】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりインキュベートした後の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞でのＲＴＣＣの誘導（死滅した標的細胞の増加により示される）を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、死滅した／瀕死の細胞の増加により示されるように、二重特異性抗体が標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することが分かる。

【図9B】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりインキュベートした後の、Ａ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１細胞でのＲＴＣＣの誘導（死滅した標的細胞の増加により示される）を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、死滅した／瀕死の細胞の増加により示されるように、二重特異性抗体が標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することが分かる。

【図10A】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＮＵＧＣ－４細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図10B】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＮＵＧＣ－４細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図10C】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＮＵＧＣ－４細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図11A】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＮＵＧＣ－４細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図11B】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＮＵＧＣ－４細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図11C】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＮＵＧＣ－４細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図12A】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＳＮＵ－６０１細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図12B】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＳＮＵ－６０１細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図12C】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＳＮＵ－６０１細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図13A】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＳＮＵ－６０１細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図13B】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＳＮＵ－６０１細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図13C】ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びマウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に４８時間にわたりＳＮＵ－６０１細胞をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ６９、Ｂ）ＣＤ２５、及びＣ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を示す。コントロールは、抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体、標的細胞のみ、並びに標的細胞及びエフェクター細胞のみを含んでいた。このデータから、ＲＴＣＣと一致する傾向が分かり、即ち、例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【図14】フローサイトメトリーにより決定した場合での、Ａ）ＳＮＵ－６０１細胞及びＢ）ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞（ＣＬＤＮ１８．２発現集団が富化されている）での発現レベルを示す。このデータから、ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）は、ＣＬＤＮ１８．２＋細胞の実質的に高い集団を含むことが分かる。本セクションの実験を、ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞を使用して実施した。

【図15】ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞への結合を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４４（Ｈ０Ｌ０ ＣＬＤＮ１８．２；２価ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２９４７０（Ｈ１Ｌ１ ＣＬＤＮ１８．２；２価ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２９４７１（Ｈ２Ｌ１ ＣＬＤＮ１８．２；２価ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、二次抗体のみであった。このデータから、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する二重特異性抗体は、マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する二重特異性抗体と同様にＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞に結合したことが分かり、このことは、ヒト化により抗体の結合効力が維持されたことを示す。特に、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットの二重特異性抗体は、２価の抗ＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂと同様の結合を示した。加えて、Ｈ１Ｌ１ヒト化バリアントに基づく二重特異性抗体（例えば、ＸＥＮＰ２９４７２、ＸＥＮＰ２９４７４、ＸＥＮＰ２９４７６、及びＸＥＮＰ２９４７８）は、Ｈ２Ｌ１ヒト化バリアントに基づく二重特異性抗体（例えば、ＸＥＮＰ２９４７３、ＸＥＮＰ２９４７５、ＸＥＮＰ２９４７７、及びＸＥＮＰ２９４７９）と比べて結合を良好に維持した。

【図16A】ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞への、ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＣＦＳＥ標識ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）の数の減少により示される、Ｂ）Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色されたＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞の割合により示される、及びＣ）ＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞でのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ＭＦＩにより示されるＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＲＴＣＣの誘導を維持した。

【図16B】ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞への、ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＣＦＳＥ標識ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）の数の減少により示される、Ｂ）Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色されたＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞の割合により示される、及びＣ）ＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞でのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ＭＦＩにより示されるＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＲＴＣＣの誘導を維持した。

【図16C】ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞への、ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＣＦＳＥ標識ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）の数の減少により示される、Ｂ）Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで染色されたＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞の割合により示される、及びＣ）ＣＦＳＥ＋ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞でのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ＭＦＩにより示されるＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＲＴＣＣの誘導を維持した。

【図17A】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＣＤ６９ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ６９を発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合により示される活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＴ細胞の活性化を維持した。

【図17B】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＣＤ６９ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ６９を発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合により示される活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＴ細胞の活性化を維持した。

【図18A】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合で示されるＣＤ４＋ Ｔ細胞の脱顆粒を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。

【図18B】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞でのＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合で示されるＣＤ４＋ Ｔ細胞の脱顆粒を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。

【図19A】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＣＤ６９ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ６９を発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合で示される活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＴ細胞の活性化を維持した。

【図19B】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＣＤ６９ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ６９を発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合で示される活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＴ細胞の活性化を維持した。

【図20A】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合で示されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の脱顆粒を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。

【図20B】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ａ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＣＤ１０７ａ ＭＦＩ、及びＢ）ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合で示されるＣＤ８＋ Ｔ細胞の脱顆粒を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）、細胞のみ、及び二次抗体のみであった。

【図21A】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ｔ細胞によるＡ）ＩＦＮγ及びＢ）ＴＮＦαの分泌を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）であった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるサイトカイン分泌の誘導を維持した。

【図21B】ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に２４時間にわたりＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）をインキュベートした後の、Ｔ細胞によるＡ）ＩＦＮγ及びＢ）ＴＮＦαの分泌を示す。使用したコントロールは、ＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）であった。結合データと一致するように、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるサイトカイン分泌の誘導を維持した。

【図22】マウス及びヒト化（バリアントＨ１Ｌ１）ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体の、Ａ）ヒトＣＬＤＮ１８．２、Ｂ）カニクイザルＣＬＤＮ１８．２、及びＣ）マウスＣＬＤＮ１８．２を発現するように一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合を示す。このデータから、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＣＬＤＮ１８．２、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２、及びマウスＣＬＤＮ１８．２のそれぞれでトランスフェクトされた細胞に用量依存的に結合したことが分かる。特に、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットの二重特異性抗体（即ち、ＸＥＮＰ２４６４７及びＸＥＮＰ２９４７６）は、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットの二重特異性抗体（即ち、ＸＥＮＰ２４６４５及びＸＥＮＰ２９４７２）と比較して、ＣＬＤＮ１８．２トランスフェクト細胞にはるかに強力な２価のｍＡｂフォーマット（即ち、ＸＥＮＰ２４６４４）と同様の効力で結合する。

【図23】ヒトＣＬＤＮ１８．２、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２、及びマウスＣＬＤＮ１８．２を発現するように一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への、マウス及びヒト化（バリアントＨ１Ｌ１）ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体の結合のＥＣ５０を示す。

【図24】Ａ）ヒトＣＬＤＮ１８．１、Ｂ）カニクイザルＣＬＤＮ１８．１、Ｃ）マウスＣＬＤＮ１８．１、及びＤ）ヒトＣＬＤＮ９を発現するように一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への、マウス及びヒト化（バリアントＨ１Ｌ１）ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体の結合を示す。このデータから、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体のいずれもオフターゲット結合を示さなかったことが分かる。

【図25】Ａ）第１のドナー及びＢ）第２のドナーからのＰＢＭＣを使用する、二重特異性抗体と比較対象の抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＡＭＧ ９１０）によるＮＵＧＣ－４細胞でのＲＴＣＣの誘導を示す。このデータから、ＸＥＮＰ３２４６１は、比較対象の二重特異性抗体と同様の効力でＲＴＣＣを誘導しており、ＸＥＮＰ３１７２６は、比較対象の二重特異性抗体と比較して増強された効力でＲＴＣＣを誘導したことが分かる。

【図26】１０：１のＥ：Ｔ比でのＢｘＰＣ３細胞（６００ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＲＴＣＣの誘導、Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）、及びＣ）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）を示す。

【図27】１０：１のＥ：Ｔ比でのＢｘＰＣ３細胞（６００ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＴＮＦα、及びＣ）ＩＬ２の分泌の誘導を示す。

【図28】１０：１のＥ：Ｔ比でのＧＳＵ細胞（７０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＲＴＣＣの誘導、Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）、及びＣ）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）を示す。

【図29】１０：１のＥ：Ｔ比でのＧＳＵ細胞（７０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＴＮＦα、及びＣ）ＩＬ２の分泌の誘導を示す。

【図30】１０：１のＥ：Ｔ比でのＮＵＧＣ４細胞（５０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＲＴＣＣの誘導、Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）、及びＣ）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）を示す。

【図31】１０：１のＥ：Ｔ比でのＮＵＧＣ４細胞（５０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＴＮＦα、及びＣ）ＩＬ２の分泌の誘導を示す。

【図32】１０：１のＥ：Ｔ比でのＫａｔｏＩＩＩ細胞（３０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＲＴＣＣの誘導、Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）、及びＣ）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）を示す。

【図33】１０：１のＥ：Ｔ比でのＫａｔｏＩＩＩ細胞（３０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＴＮＦα及びＢ）ＩＬ２の分泌の誘導を示す。

【図34】３：１のＥ：Ｔ比でのＫａｔｏＩＩＩ細胞（３０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＲＴＣＣの誘導、Ｂ）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）、及びＣ）ＴＮＦα分泌の誘導を示す。

【図35】３：１のＥ：Ｔ比でのＨＧＣ２７細胞（２０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＲＴＣＣの誘導、Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）、及びＣ）ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の誘導（ＣＤ１０７ａを発現する細胞の割合で示される）を示す。

【図36】３：１のＥ：Ｔ比でのＨＧＣ２７細胞（２０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＴＮＦα、及びＣ）ＩＬ２の分泌の誘導を示す。

【図37】１：１のＥ：Ｔ比でのＫａｔｏＩＩＩ細胞（３０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位を有する）とエフェクター細胞との存在下での、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体によるＡ）ＲＴＣＣの誘導、及びＢ）ＴＮＦα分泌の誘導を示す。

【図38A】ＡＳＰ２１３８（ＸＥＮＰ３１７２６）を投与したＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０腫瘍担持ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける腫瘍体積の変化及び体重の変化を示す。ヒトＰＢＭＣを、５×１０^６個の細胞で静脈内注射した。ヒトＰＢＭＣ注射の１週間後、－８日目に、ＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０細胞を、１×１０^６個の細胞でマウスの脇腹に皮下接種した。ＮＯＧマウスに、０日目及び７日目にＰＢＳ又はＡＳＰ２１３８を週１回腹腔内投与した。Ａ）各群の腫瘍体積及びＢ）体重を、平均±ＳＥＭとして各時点でプロットした（ｎ＝１０）。Ｃ）プロット図は、１４日目の個々の腫瘍体積を示しており、平均±ＳＥＭを、短い横線及びエラーバーで表した。統計解析を、１４日目の値で実施した。ｎｓ：有意ではない、＊＊：ＰＢＳ群の値と比較してｐは０．０１未満（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。

【図38B】ＡＳＰ２１３８（ＸＥＮＰ３１７２６）を投与したＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０腫瘍担持ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける腫瘍体積の変化及び体重の変化を示す。ヒトＰＢＭＣを、５×１０^６個の細胞で静脈内注射した。ヒトＰＢＭＣ注射の１週間後、－８日目に、ＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０細胞を、１×１０^６個の細胞でマウスの脇腹に皮下接種した。ＮＯＧマウスに、０日目及び７日目にＰＢＳ又はＡＳＰ２１３８を週１回腹腔内投与した。Ａ）各群の腫瘍体積及びＢ）体重を、平均±ＳＥＭとして各時点でプロットした（ｎ＝１０）。Ｃ）プロット図は、１４日目の個々の腫瘍体積を示しており、平均±ＳＥＭを、短い横線及びエラーバーで表した。統計解析を、１４日目の値で実施した。ｎｓ：有意ではない、＊＊：ＰＢＳ群の値と比較してｐは０．０１未満（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。

【図38C】ＡＳＰ２１３８（ＸＥＮＰ３１７２６）を投与したＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０腫瘍担持ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスにおける腫瘍体積の変化及び体重の変化を示す。ヒトＰＢＭＣを、５×１０^６個の細胞で静脈内注射した。ヒトＰＢＭＣ注射の１週間後、－８日目に、ＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０細胞を、１×１０^６個の細胞でマウスの脇腹に皮下接種した。ＮＯＧマウスに、０日目及び７日目にＰＢＳ又はＡＳＰ２１３８を週１回腹腔内投与した。Ａ）各群の腫瘍体積及びＢ）体重を、平均±ＳＥＭとして各時点でプロットした（ｎ＝１０）。Ｃ）プロット図は、１４日目の個々の腫瘍体積を示しており、平均±ＳＥＭを、短い横線及びエラーバーで表した。統計解析を、１４日目の値で実施した。ｎｓ：有意ではない、＊＊：ＰＢＳ群の値と比較してｐは０．０１未満（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。

【発明を実施するための形態】

【0090】

本発明を下記で詳細に説明するが、本発明は、本明細書で説明されている特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されるものではなく、これらは変更され得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することを目的とするのみであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。

【0091】

下記では、本発明の要素を説明する。この要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、追加の実施形態を作成するために、任意の方法及び任意の数で組み合わされ得ること
を理解すべきである。様々に説明されている例及び好ましい実施形態は、本発明を、明示的に説明された実施形態にのみに限定すると解釈されるべきではない。本説明は、明示的に説明されている実施形態と、開示された及び／又は好ましい要素の任意の数と組み合わせる実施形態を支持しており、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願で説明されている全ての要素の任意の順列及び組み合わせは、別途文脈が示さない限り、本出願の説明により開示されているとみなされるべきである。

【0092】

好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｂ． Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｅｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）で説明されているように定義されている。

【0093】

本発明の実施は、別途示されない限り、当該技術分野の文献で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９を参照されたい）。

【0094】

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、別途文脈が求めない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、述べられたメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群を含むことを意味しており、あらゆる他のメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群を排除することを意味しないと理解されるであろうが、いくつかの実施形態において、そのような他のメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群は排除され得、即ち、主題は、述べられたメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群で構成されている。しかしながら、本開示の具体的な実施形態として、「含んでいる」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが企図されており、即ち、この実施形態の目的のために、「含んでいる」は、「からなる」又は「から本質的になる」の意味を有すると理解されるべきである。

【0095】

本発明を説明する文脈（特に特許請求の範囲の文脈で）で使用される「１つの（ａ）」、及び「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という用語、並びに同様の参照は、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈が明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈される。本明細書における値の範囲の記載は、単に、この範囲内に入る各個別の値を個別に参照するための略記法としての役割を果たすことが意図されている。別途本明細書で指示されない限り、個々の値は、あたかも本明細書に個別に列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明されている全ての方法は、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈が明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な表現（例えば、「等」）の使用は、単に、本発明をより良く説明することが意図されており、別途特許請求されている本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

【0096】

「約」という用語は、約又はほぼを意味しており、一実施形態において本明細書に記載されている数値又は範囲との関連では、列挙されているか又は特許請求されている数値又
は範囲の±２０％、±１０％、±５％、又は±３％を意味する。

【0097】

本明細書の文章全体を通して、いくつかの文書が引用されている。本明細書で引用されている文書（例えば、全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書等を含む）のそれぞれは、上述又は下述にかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる部分も、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるものではない。

【0098】

本発明は、二重特異性結合剤に関し、この結合剤は、単一の抗原結合ドメインを介して１価で標的分子に結合するか、又はそれぞれ独立して抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを介して２価で標的分子に結合する。

【0099】

本明細書で説明されている結合剤の第１の標的分子は、ＣＬＤＮ１８．２である。

【0100】

クローディンは、タイトジャンクションの最も重要な構成要素であるタンパク質のファミリであり、このタイトジャンクションでは、上皮の細胞間の細胞間隙での分子の流れを制御する傍細胞バリアが構築されている。クローディンは膜を４回またぐ膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端及びＣ末端は共に、細胞質中に位置している。ＥＣ１又はＥＣＬ１と呼ばれる第１の細胞外ループは、平均５３個のアミノ酸からなり、ＥＣ２又はＥＣＬ２と呼ばれる第２の細胞外ループは、約２４個のアミノ酸からなる。ＣＬＤＮ１８．２等のクローディンファミリの細胞表面タンパク質は、様々な起源の腫瘍中で発現されており、その選択的発現（毒性に関連する正常組織では発現されない）と、細胞膜への局在性とに起因して、抗体媒介性がん免疫療法に関連する標的構造として特に適している。

【0101】

ＣＬＤＮ１８．２は、腫瘍組織中で差次的に発現されると特定されており、ＣＬＤＮ１８．２を発現している正常組織は、胃のみである。ＣＬＤＮ１８．２は、正常組織では胃粘膜の分化した上皮細胞中で選択的に発現されている。ＣＬＤＮ１８．２は、膵癌、食道癌、胃がん、気管支癌、乳癌、及びＥＮＴ腫瘍等の様々な起源の癌で発現されている。ＣＬＤＮ１８．２は、胃がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、膵がん、肺がん、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肝がん、頭頸部がん、胆嚢がん等の原発性腫瘍、並びにこれらの転移、特に、胃がん転移、例えば、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、及びリンパ節転移の予防及び／又は処置のための有用な標的である。「クローディン１８」又は「ＣＬＤＮ１８」という用語は、クローディン１８に関するものであり、クローディン１８スプライスバリアント１（クローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１））及びクローディン１８スプライスバリアント２（クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２））を含むあらゆるバリアントを含む。

【0102】

「クローディン１８．２」又は「ＣＬＤＮ１８．２」という用語は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に関するものであり、具体的には、配列表の配列番号１に係るアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列のバリアントを含み、好ましくはからなるタンパク質に関する。ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ループは、好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸２７～８１を含み、より好ましくはアミノ酸２９～７８を含む。ＣＬＤＮ１８．２の第２の細胞外ループは、好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸１４０～１８０又は１４４～１６７を含む。前記第１の細胞外ループ及び第２の細胞外ループは、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外部分を形成する。

【0103】

本明細書で説明されている結合剤の第２の標的分子は、ＣＤ３（表面抗原分類３）である。ＣＤ３複合体は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一部として、成熟ヒトＴ細胞、胸腺細胞、及びナチュラルキラー細胞のサブセットで発現される抗原を示す。Ｔ細胞共受容体は、タンパク質複合体であり、４つの異なる鎖で構成されている。哺乳類では、
この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２本のＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖として公知の分子と会合し、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生じる。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は、一緒に、ＴＣＲ複合体を構成する。

【0104】

ヒトＣＤ３εは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３３で示される。ヒトＣＤ３γは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００００７３で示される。ヒトＣＤ３δは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３２で示される。ＣＤ３は、ＴＣＲのシグナル伝達に関与する。Ｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１４，２４３－２４４（２００１）で説明されているように、ＭＨＣ提示型特異的抗原エピトープの結合によるＴＣＲ複合体の活性化は、Ｓｒｃファミリキナーゼによる免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をもたらし、さらなるキナーゼの動員を誘発し、Ｃａ^２＋放出を含むＴ細胞の活性化をもたらす。例えば固定化抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞上のＣＤ３のクラスター化は、Ｔ細胞受容体の関与に類似したＴ細胞活性化をもたらすが、そのクローンの典型的な特異性とは無関係である。

【0105】

本明細書で使用される場合、「ＣＤ３」は、ヒトＣＤ３を含み、多分子Ｔ細胞受容体複合体の一部としてヒトＴ細胞上で発現される抗原を示す。ＣＤ３に関して、本発明の結合剤は、好ましくは、ＣＤ３のイプシロン鎖を認識する。いくつかの実施形態において、ＣＤイプシロンの最初の２７個のＮ末端アミノ酸に対応するエピトープ又はこの２７個のアミノ酸ストレッチの機能的断片を認識する。

【0106】

本発明に係る「バリアント」という用語は、特に、変異体、スプライスバリアント、コンフォメーション、アイソフォーム、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び種相同体、特に天然に存在するものを指す。対立遺伝子バリアントは、遺伝子の正常な配列の変化に関するものであり、この意義は不明であることが多い。完全な遺伝子配列決定により、所与の遺伝子に関して多数の対立遺伝子バリアントが同定されることが多い。種相同体とは、所与の核酸又はアミノ酸配列の起源とは異なる起源の様々な種を有する核酸又はアミノ酸配列のことである。「バリアント」という用語は、あらゆる翻訳後改変バリアント及びコンフォメーションバリアントを包含するものとする。

【0107】

本発明によれば、「ＣＬＤＮ１８．２陽性がん」という用語又は類似の用語は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞（好ましくは表面上で発現するがん細胞）を伴うがんを意味する。

【0108】

「細胞表面」は、当該技術分野における通常の意味に従って使用されており、そのため、タンパク質及び他の分子による結合に利用され得る細胞の外側を含む。

【0109】

ＣＬＤＮ１８．２は、細胞の表面に位置しており、細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合が可能な場合には、前記細胞の表面で発現されている。

【0110】

ＣＤ３は、細胞の表面に位置しており、細胞に添加されたＣＤ３特異的抗体による結合が可能な場合には、前記細胞の表面で発現されている。

【0111】

本発明に関連する「細胞外部分」という用語は、細胞の細胞外腔に面しており、好ましくは、前記細胞の外部から（例えば、細胞外に位置する抗体等の抗原結合分子により）アクセス可能な、タンパク質等の分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、１つ又は複数の細胞外ループ若しくはドメイン、又はその断片を指す。

【0112】

「部分」又は「断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、連続的な要素を指
す。例えば、アミノ酸配列又はタンパク質等の構造の一部は、前記構造の連続的な要素を指す。構造の一部、部分、又は断片は、好ましくは、前記構造の１つ又は複数の機能特性を含む。例えば、エピトープ又はペプチドの一部、部分、又は断片は、好ましくは、由来するエピトープ又はペプチドと免疫学的に同等である。アミノ酸配列の一部又は断片は、好ましくは、タンパク質配列の少なくとも４個、具体的には、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、又は少なくとも１００個の連続したアミノ酸の配列を含む。

【0113】

アミノ酸配列（ペプチド又はタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部に関するものであり、即ち、Ｎ末端及び／又はＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）を、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠く短縮型オープンリーディングフレームの翻訳により得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）を、例えば、オープンリーディングフレームの５’末端を欠く短縮型オープンリーディングフレームが、翻訳を開始するのに役立つ開始コドンを含む限りにおいて、この短縮型オープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。

【0114】

本明細書におけるアミノ酸配列の「バリアント」又は同様の表現は、少なくとも１つのアミノ酸改変により親アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然に存在するか又は野生型（ＷＴ）のアミノ酸配列であってもよいし、野生型アミノ酸配列の改変バージョンであってもよい。好ましくは、バリアントアミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有しており、例えば、親と比較して１～約２０個のアミノ酸改変、好ましくは、１～約１０個又は１～約５個のアミノ酸改変を有する。

【0115】

本明細書においてアミノ酸配列に関して使用される「野生型」、又は「ＷＴ」、又は「ネイティブ」は、対立遺伝子変異を含む、自然界で見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型のアミノ酸配列、ペプチド、又はタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列を有する。

【0116】

本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質、又はポリペプチド）の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアント、及び／又はアミノ酸置換バリアントを含む。「バリアント」という用語は、全ての変異体、スプライスバリアント、翻訳後改変バリアント、コンフォメーション、アイソフォーム、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び種相同体、特に天然に存在するものを含む。「バリアント」という用語は、特に、アミノ酸配列の断片を含む。

【0117】

アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列における１つ、２つ、又はそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合には、１つ又は複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られた生成物を適切にスクリーニングしつつランダム挿入も可能である。

【0118】

アミノ酸付加バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、又はより多くのアミノ酸等の１つ又は複数のアミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合体を含む。

【0119】

アミノ酸欠失バリアントは、配列からの１つ又は複数のアミノ酸の除去（例えば、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、又はより多くのアミノ酸の除去）を特徴とする
。欠失は、タンパク質の任意の位置であり得る。タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端での欠失を含むアミノ酸欠失バリアントはまた、Ｎ末端及び／又はＣ末端短縮バリアントとも呼ばれる。

【0120】

アミノ酸置換バリアントは、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されることを特徴とする。優先されるのは、相同タンパク質又はペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置で改変されること、及び／又はアミノ酸を類似の特性を有する他のアミノ酸に置き換えることである。好ましくは、ペプチドバリアント及びタンパク質バリアントにおけるアミノ酸の変化は、保存的なアミノ酸変化であり、即ち、同様に荷電したアミノ酸又は荷電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリの内の１つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は、一般に、下記の４つのファミリに分類される：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。

【0121】

本発明に関連して、保存的置換は、下記の表で示されるアミノ酸のクラス内の置換により定義され得る。

【0122】

【表A】

【0123】

好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性（好ましくは同一性）の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。類似性又は同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は約１００％であるアミノ酸領域に関して付与される。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合には、類似性又は同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、又は約２００個のアミノ酸、いくつかの実施形態では連続アミノ酸に関して付与される。いくつかの実施形態において、類似性又は同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に関して付与される。配列類似性（好ましくは配列同一性）を決定するためのアライメントを、当該技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良の配列アライメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定を使用
して、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用して、行ない得る。

【0124】

「配列類似性」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるヌクレオチドの割合を示す。

【0125】

「同一％」、「同一性％」という用語、又は類似の用語は、特に、比較される配列間の最適アラインメントにおいて同一であるヌクレオチド又はアミノ酸の割合を指すことが意図されている。前記割合は、純粋に統計的なものであり、２つの配列間の差違は、比較される配列の全長にわたりランダムに分布し得るが、必ずしもそうではない。２つの配列の比較を、通常、対応する配列の局所領域を特定するために、最適なアラインメントを行った後に、あるセグメント又は「比較の窓」に関して配列を比較することにより実行する。比較に最適なアライメントを、手動で実行してもよいし、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所的相同性アルゴリズムの助けを借りて実行してもよいし、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所的相同性アルゴリズムの助けを借りて実行してもよいし、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４による類似性検索アルゴリズムの助けを借りて実行してもよいし、前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、及びＴＦＡＳＴＡ）の助けを借りて実行してもよい。いくつかの実施形態において、２つの配列の同一性パーセントは、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑ）上で利用可能なＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。いくつかの実施形態において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムで使用されているアルゴリズムパラメータは、下記を含む：（ｉ）１０に設定されたＥｘｐｅｃｔ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；（ｉｉ）２８に設定されたＷｏｒｄ Ｓｉｚｅ；（ｉｉｉ）０に設定されたＭａｘ
ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ；（ｉｖ）１、－２に設定されたＭａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ；（ｖ）Ｌｉｎｅａｒに設定されたＧａｐ
Ｃｏｓｔｓ；及び（ｖｉ）Ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎのフィルタの使用。いくつかの実施形態において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、下記を含む：（ｉ）１０に設定されたＥｘｐｅｃｔ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；（ｉｉ）３に設定されたＷｏｒｄ Ｓｉｚｅ；（ｉｉｉ）０に設定されたＭａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたＭａｔｒｉｘ；（ｖ）Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅに設定されたＧａｐ Ｃｏｓｔｓ：１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１；及び（ｖｉ）条件付き組成マトリックス調整（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）。

【0126】

同一性の割合は、比較される配列が対応する同一位置の数を決定し、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列での位置の数）で除算し、この結果に１００を乗算することにより得られる。

【0127】

いくつかの実施形態において、類似性又は同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は約１００％の領域に関して付与される。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合には、同一性の程度は、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、又は約２００個のヌクレオチド、いくつかの実施形態では連続ヌクレオチドに関して付与される。いくつかの実施形態において、類似性又は同一性の程度は、参照配列の全長に関して付与される。

【0128】

相同アミノ酸配列は、本開示に従って、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を示す。

【0129】

本明細書で説明されているアミノ酸配列バリアントは、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者により容易に調製され得る。置換、付加、挿入、又は欠失を有するペプチド又はタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）で詳述されている。さらに、本明細書で説明されているペプチドバリアント及びアミノ酸バリアントは、公知のペプチド合成技術の助けを借りて、例えば固相合成及び類似の方法により、容易に調製され得る。

【0130】

一実施形態において、アミノ酸配列（ペプチド又はタンパク質）の断片又はバリアントは、好ましくは、「機能的断片」又は「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的断片」又は「機能的バリアント」という用語は、それが由来するアミノ酸配列と同一又は類似の１つ又は複数の機能的特性を示す（即ち、機能的に同等である）あらゆる断片又はバリアントに関する。機能的なＶＨバリアント及びＶＬバリアントを構成する抗原結合ドメインに関して、１つの特定の機能は、前記結合ドメインの結合を保持することである。「機能的断片」又は「機能的バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、親分子又は親配列のアミノ酸配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸が変更されたアミノ酸配列を含み、親分子又は親配列の機能（例えば、特定の抗原に対する特異性を有する結合ドメインを形成する）の内の１つ若しくは複数、又は全てを依然として発揮し得るバリアント分子又はバリアント配列を指す。例えば、機能的なＶＨバリアント及びＶＬバリアント、又は機能的ＣＤＲバリアント配列を構成する結合ドメインは、親分子と比較して、同一の又は類似の結合特性を有する。一実施形態において、親分子又は親配列のアミノ酸配列での改変は、この分子又は配列の特性に有意な影響を及ぼさないか、又は変化を与えない。別の実施形態において、機能的断片又は機能的バリアントを構成する分子の特性（例えば，結合ドメインの結合強度等の結合特性）は、減少し得るが依然として有意に存在し、例えば、機能的バリアントを構成する結合ドメインの結合強度等の結合特性は、親分子又は親配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％であり得る。例えば、機能的バリアントは、親分子と比較して１、２、３、４、５個、又はより多くのアミノ酸挿入、アミノ酸付加、アミノ酸置換、及び／又はアミノ酸欠失を含み得る。しかしながら、他の実施形態において、機能的バリアント又は機能的断片を構成する分子の特性（例えば、機能的断片又は機能的バリアントを構成する結合ドメインの結合特性）は、親分子と比較して増強され得る。いくつかの実施形態において、「機能的バリアント」は、「機能的断片」であり、例えば、親分子と比較してＮ末端及び／又はＣ末端で短縮されているが、上記のように親分子の機能の内の１つ若しくは複数、又は全てを保持しているか又は本質的に保持しており、特に、親分子と機能的に同等であるアミノ酸配列である。

【0131】

アミノ酸配列の「機能的バリアント」という用語は、前記アミノ酸配列の「機能的」断
片を含む。

【0132】

機能的バリアントの特性（例えば、結合特性）を、公知の方法で分析し得、例えば、互いに競合する結合剤に関して本明細書で説明されているＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析し得る。

【0133】

指定のアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質、又はポリペプチド、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質、又はポリペプチド、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３）とは、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、この特定の配列又はその断片と同一の、本質的に同一の、又は相同なアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、この特定の配列のバリアント又はその断片であり得、好ましくは、本明細書で説明されている機能的バリアント（例えば、機能的断片）であり得る。例えば、本明細書での使用に好適なアミノ酸配列は、ネイティブ配列の望ましい活性を保持するか本質的に保持しつつ、このアミノ酸配列が由来する天然に存在する配列又はネイティブ配列とは配列が異なるように変更（例えば、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、及び／又はアミノ酸置換）され得ることが、当業者には理解されるであろう。例えば、本発明の結合剤のペプチド鎖上のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、免疫グロブリンのＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列に由来するが、これらが由来するドメインと比較して変更されていてもよい。例えば、本発明によれば、免疫グロブリンに由来するＶＨ又はＶＬは、それぞれの親ＶＨ若しくはＶＬの配列に由来する、又はそれぞれの親ＶＨ若しくはＶＬの配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸位置において異なっていてもよいそれぞれＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列と同一であってもよいアミノ酸配列を含む。例えば、本発明の結合剤のＶＨドメインは、これが由来するＶＨドメインのアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸挿入、アミノ酸付加、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。例えば、本発明の結合剤のＶＬドメインは、これが由来するＶＬドメインのアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸挿入、アミノ酸付加、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、親ＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列の機能的バリアントであるアミノ酸配列を有するＶＨ又はＶＬは、例えば結合特異性、結合強度等に関して、親ＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列と同一又は本質的に同一の機能を提供する。しかしながら、当業者が認識するように、いくつかの実施形態において、親分子のアミノ酸配列と比較して特性が変更されているアミノ酸配列（例えば、ＶＨ又はＶＬ）の機能的バリアントを提供することが好ましい場合もある。同じ考察が、例えばＣＤＲのアミノ酸配列、及び他のアミノ酸配列（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／又はＣＬドメインのアミノ酸配列）にも当てはまる。

【0134】

二重特異性結合剤が、免疫グロブリンに「由来する」ＶＨと、同一の又は異なる免疫グロブリンに「由来する」ＶＬとを含むと説明されている場合には、「由来する」という用語は、この二重特異性結合剤が、任意の公知の方法により、前記免疫グロブリンからの前記ＶＨ及びＶＬを、結果として得られる二重特異性結合剤に組み換えることにより生成されたことを示す。この文脈において、「組み換える」は、任意の特定の組換え法により限定されることを意図するものではなく、そのため、例えば、核酸レベルでの組換え及び／又は同一細胞内での異なる分子の共発現による組換えを含む、本明細書の下記で説明されている二重特異性結合剤を製造する方法、又は当該技術分野で公知の方法の全てを含む。
「二重特異性抗体」又は「ｂｓＡｂ」という用語は、異なるアミノ酸配列により定義される２つの異なる抗原結合ドメインを有する結合剤を指す。いくつかの実施形態において、前記異なる抗原結合ドメインは、同一抗原上の異なるエピトープと結合する。しかしながら、好ましい実施形態において、前記異なる抗原結合ドメインは、異なる標的抗原に結
合する。二重特異性結合剤は、本明細書で説明されている二重特異性フォーマットの内のいずれかを含む任意のフォーマットであり得る。結合剤は、１、２個、又はより多くの結合ドメインで、異なる抗原又は異なるエピトープのそれぞれと結合し得、即ち、１価、２価（ｄｉｖａｌｅｎｔｌｙ）（又は２価（ｂｉｖａｌｅｎｔｌｙ））、３価、４価、さらに高次の価数で、異なる抗原又は異なるエピトープのそれぞれに結合し得る。

【0135】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが胃細胞又は胃組織中での発現と比較して低い場合には、細胞中では実質的に発現されていない。好ましくは、この発現レベルは、胃細胞又は胃組織中での発現の１０％未満であり、好ましくは、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、又は０．０５％未満であるか、又はさらに低い。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが、胃以外の非癌組織中での発現レベルを、２倍以下で超えており、好ましくは１．５倍で超えており、好ましくは前記非癌組織中での発現レベルを超えない場合には、細胞中で実質的に発現されていない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが検出限界を下回る場合には、及び／又は発現レベルが過剰に低くて細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体が結合し得ない場合には、細胞中で実質的に発現されていない。

【0136】

本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが胃以外の非癌組織中での発現レベルを、好ましくは２倍超、好ましくは１０倍、１００倍、１０００倍、又は１００００倍で超える場合には、細胞中で発現されている。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが検出限界を上回る場合には、及び／又は発現レベルが十分に高くて細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体が結合し得る場合には、細胞中で発現されている。好ましくは、細胞中で発現されているＣＬＤＮ１８．２は、前記細胞の表面上で発現されているか、又は露出している。

【0137】

本発明によれば、「疾患」という用語は、がん（特に、本明細書で説明されているがんの形態）を含む、あらゆる病理学的状態を指す。本明細書におけるがん又はがんの特定の形態へのあらゆる言及はまた、この癌の転移も含む。好ましい実施形態では、本教示に従って処置される疾患は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を伴う。

【0138】

「ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞と関連する疾患」又は同様の表現は、本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２が、罹患した組織又は臓器の細胞中で発現されていることを意味する。一実施形態において、罹患した組織又は臓器の細胞中でのＣＬＤＮ１８．２の発現は、健康な組織又は臓器での状態と比較して増加している。増加は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％、又はさらに多い増加を指す。一実施形態において、発現は、罹患組織でのみ見出されており、健康な組織での発現は抑制されている。本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞と関連する疾患として、がん疾患が挙げられる。本発明によれば、がん疾患は、好ましくは、がん細胞がＣＬＤＮ１８．２を発現する疾患である。

【0139】

本明細書で使用される場合、「がん疾患」又は「がん」は、異常に制御された細胞の成長、増殖、分化、接着、及び／又は移動を特徴とする疾患を含む。「がん細胞」は、急激で制御不能な細胞増殖により成長し、新たな成長を開始した刺激が停止した後も成長し続ける異常な細胞を意味する。好ましくは、「がん疾患」は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を特徴とし、がん細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現する。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、好ましくは、がん細胞であり、好ましくは、本明細書で説明されているがんのがん細胞である。

【0140】

本発明に係る「癌」という用語は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神
経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、胃がん、腸がん（ｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）のがん、結腸直腸がん、膵がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、及び肺がん、並びにこれらの転移を含む。この例は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、子宮頸癌、又は上記のがん種若しくは腫瘍の転移である。本発明に係るがんという用語はまた、がん転移も含む。

【0141】

本発明によれば、「癌腫」とは、上皮細胞に由来する悪性腫瘍のことである。このグループは、乳がん、前立腺がん、肺がん、及び結腸がんの一般的な形態を含む最も一般的ながんを代表する。

【0142】

「腺癌」とは、腺組織に発生するがんのことである。この組織はまた、上皮組織として公知のより大きな組織カテゴリの一部でもある。上皮組織として、皮膚、腺、並びに身体の空洞及び器官を裏打ちする様々な他の組織が挙げられる。上皮は、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉に発生学的に由来する。腺癌として分類されるために、細胞は、分泌特性を有する限り、必ずしも腺の一部である必要はない。この型の癌腫は、ヒトを含む一部の高等哺乳類で発生し得る。高分化腺癌は、それが由来する腺組織に類似する傾向があるが、低分化腺癌は類似し得ない。生検からの細胞を染色することにより、病理医は、その腫瘍が腺癌であるか他のタイプのがんであるかを決定する。腺癌は、身体内に腺が偏在していることから、身体の多くの組織で発生する可能性がある。それぞれの腺が同じ物質を分泌し得ないが、細胞に外分泌機能がある限り、それは腺性とみなされ、従って、その悪性型は腺癌と命名される。悪性腺癌は、他の組織に浸潤し、十分な時間があれば転移することが多い。卵巣腺癌は、最も一般的なタイプの卵巣癌である。これには、漿液性腺癌、粘液性腺癌、透明細胞腺癌、及び類内膜腺癌が含まれる。

【0143】

「転移」は、がん細胞の元の部位からの身体の別の部位への広がりを意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の剥離、細胞外マトリックスへの浸潤、内皮基底膜を貫通して体腔及び血管への侵入、次いで血液により運ばれた後の標的臓器への浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の増殖は、血管新生に依存する。腫瘍転移は原発腫瘍の摘出後であっても起こることが多く、なぜならば、腫瘍の細胞又は構成成分が残存して転移能を発現する場合があるからである。一実施形態において、本発明に係る「転移」という用語は、原発腫瘍及び所属リンパ節系から離れた転移を指す「遠隔転移」に関する。一実施形態において、本発明に係る「転移」という用語は、リンパ節転移に関する。本発明の治療又は処置方法を使用して処置可能な転移の１つの特定の形態は、原発部位として胃がんに由来する転移である。好ましい実施形態において、そのような胃がんの転移は、クルケンベルグ腫瘍、腹膜転移、及び／又はリンパ節転移である。

【0144】

クルケンベルグ腫瘍は、卵巣腫瘍全体の１％～２％を占める珍しい卵巣の転移性腫瘍である。クルケンベルグ腫瘍の予後は依然として非常に悪く、クルケンベルグ腫瘍の確立された処置はない。クルケンベルグ腫瘍は、卵巣の転移性印環細胞腺癌である。ほとんどのクルケンベルグ腫瘍症例（７０％）では、胃が原発部位である。結腸、虫垂、及び乳房の癌腫（主に浸潤性小葉癌）が、次に多い原発部位である。胆嚢、胆道、膵臓、小腸、ファーター膨大部、頸部、及び膀胱／尿膜管の癌腫から発生するクルケンベルグ腫瘍のまれな症例が報告されている。

【0145】

「処置する」は、疾患を予防するか若しくは除去するために（例えば、対象における腫瘍のサイズ若しくは腫瘍の数を減少させるために）；対象における疾患を停止させるか若
しくは遅延させるために；対象における新たな疾患の発生を阻害するか若しくは遅延させるために；疾患に現在罹患しているか若しくは過去に罹患していた対象における症状及び／若しくは再発の頻度若しくは重症度を減少させるために；並びに／又は対象の寿命を延長させるために、即ち増加させるために、対象に化合物若しくは組成物、又は化合物若しくは組成物の組み合わせを投与することを意味する。

【0146】

具体的には、「疾患の処置」という用語は、疾患又はその症状の治癒、持続期間の短縮、改善、予防、進行若しくは悪化の遅延若しくは阻害、又は発症の予防若しくは遅延を含む。

【0147】

本発明に関連して、「保護する」、「予防する」、「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」、「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）」、又は「保護的」等の用語は、対象における疾患の発生及び／又は伝播の予防若しくは処置、又はその両方に関するものであり、特に、対象が疾患を発症する可能性を最小化すること、又は疾患の発症を遅延させることに関するものである。例えば、がんのリスクがある者は、がんを予防するための治療の候補となるだろう。

【0148】

「リスクがある」とは、一般集団と比較して、ある疾患（特に癌）を発症する機会が通常より高いと特定されている対象を意味する。加えて、疾患（特に癌）に罹患したことがあるか又は現在罹患している対象は、疾患を発症するリスクが高い対象であり、従って、対象は、疾患を発症し続ける場合がある。がんに現在罹患しているか罹患していた対象は、がん転移のリスクも高い。

【0149】

「個体」及び「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、ある疾患又は障害（例えば癌）に罹患し得るか又は罹患しやすいが、この疾患又は障害に罹患していてもよいし罹患していなくてもよいヒト又は別の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、若しくは霊長類）を指す。多くの実施形態において、個体は、ヒトである。別途述べない限り、「個体」及び「対象」という用語は、特定の年齢を示すものではなく、従って、成人、高齢者、小児、及び新生児を包含する。本開示の実施形態において、「個体」又は「対象」は、「患者」である。

【0150】

「患者」という用語は、本発明によれば、処置の対象（特に罹患対象）を意味しており、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、又は別の動物、特に哺乳類、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、又は齧歯類、例えばマウス及びラットを意味する。特に好ましい実施形態において、患者は、ヒトである。

【0151】

「標的細胞」は、がん細胞等のあらゆる望ましくない細胞を意味するとする。好ましい実施形態において、標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する。

【0152】

「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列等の免疫学的に等価な分子が、例えば免疫学的効果の種類に関して、同一の若しくは本質的に同一の免疫学的特性を示すこと、及び／又は同一の若しくは本質的に同一の免疫学的効果を発揮することを意味する。本開示に関連して、「免疫学的に等価」という用語は、免疫化に使用される抗原又は抗原バリアントの免疫学的な効果又は特性に関して好ましくは使用される。例えば、あるアミノ酸配列が、対象の免疫系に曝露された際に、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応（特に、Ｔ細胞の刺激、プライミング、及び／又は拡張）を誘導する場合には、このアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。そのため、抗原と免疫学的に等価な分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミング、及び／又は拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じ若しくは本質的に同じ特性を示しており、並びに／又は同じ若しくは本質的に同じ効果を発揮する。

【0153】

「活性化」又は「刺激」は、本明細書で使用される場合、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されているＴ細胞等の免疫エフェクター細胞の状態を指す。活性化はまた、シグナル伝達経路の開始、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能とも関連付けられ得る。「活性化された免疫エフェクター細胞」という用語は、特に、細胞分裂が進行している免疫エフェクター細胞を指す。

【0154】

「プライミング」という用語は、Ｔ細胞等の免疫エフェクター細胞がその特異的抗原と初めて接触し、エフェクターＴ細胞等のエフェクター細胞へと分化するプロセスを指す。

【0155】

「クローン性増殖」又は「増殖」という用語は、特定の実体が増殖するプロセスを指す。本開示に関連して、この用語は、好ましくは、免疫エフェクター細胞が抗原により刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特異的免疫エフェクター細胞が増幅される免疫学的反応に関連して使用される。好ましくは、クローン性増殖は、免疫エフェクター細胞の分化につながる。

【0156】

「抗原」という用語は、好ましくは免疫反応を誘導するために、薬剤が指向される及び／又は指向されるべきエピトープを含むタンパク質又はペプチド等の分子に関する。Ｔ細胞エピトープ等の抗原又はそのプロセシング産物は、一実施形態において、Ｔ細胞受容体若しくはＢ細胞受容体と結合するか、又は抗体等の免疫グロブリン分子と結合する。従って、抗原又はそのプロセシング産物は、抗体又はＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応し得る。好ましい実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原、例えばＣＬＤＮ１８．２（即ち、細胞質、細胞表面、及び細胞核に由来し得るがん細胞の構成成分）であり、特に、好ましくは細胞内で又はがん細胞の表面抗原として大量に産生される抗原である。

【0157】

本発明に関連して、「腫瘍関連抗原」又は「がん関連抗原」という用語は、好ましくは、タンパク質であって、正常な条件下では、限られた数の組織及び／若しくは器官において又は特定の発生段階において特異的に発現され、１つ又は複数の腫瘍組織又はがん組織において発現されるか又は異常に発現されるタンパク質に関する。本発明に関連して、腫瘍関連抗原は、好ましくは、がん細胞の細胞表面に関連し、好ましくは、正常組織では発現されないか、又はほとんど発現されない。

【0158】

「エピトープ」という用語は、分子中の抗原決定基を指しており、例えば、免疫系により認識される分子中の部分（例えば、抗体により認識される部分）を指す。例えば、エピトープとは、免疫系により認識される、抗原上の個別の立体的な部位のことである。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖等の化学的に活性な分子の表面グループからなり、通常、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。コンフォメーション型エピトープ及び非コンフォメーション型エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。タンパク質のエピトープは、好ましくは、前記タンパク質の連続部分又は不連続部分を含み、好ましくは５～１００個、好ましくは５～５０個、より好ましくは８～３０個、最も好ましくは１０～２５個のアミノ酸の長さであり、例えば、エピトープは、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のアミノ酸の長さであり得る。

【0159】

「結合剤」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の抗原に結合可能なあらゆる薬剤を指す。本発明のある特定の実施形態において、結合剤は、抗体、抗体断片、又はこれらの構築物である。結合剤はまた、合成、改変、又は非天然起源の部位、特に非ペプチド部位も含み得る。そのような部位は、例えば、抗体又は抗体断片等の所望の抗原結合官能性又は領域を連結し得る。一実施形態において、結合剤は、抗原結合ＣＤＲ又は可変
領域を含む合成構築物である。

【0160】

「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリのタンパク質に関するものであり、好ましくは、抗体又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）等の抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン（即ち、免疫グロブリンドメイン）を特徴とする。この用語は、膜結合型免疫グロブリン及び可溶性免疫グロブリンを包含する。可溶性免疫グロブリンは、一般に抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは、一般に、数本の鎖（典型的には、ジスルフィド結合を介して結合した２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖）を含む。これらの鎖は、主に、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ＶＨ（可変重鎖）ドメイン、及びＣＨ（定常重鎖）ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４等の免疫グロブリンドメインで構成されている。哺乳類の免疫グロブリン重鎖には、α、δ、ε、γ、及びμの５つのタイプが存在しており、様々なクラスの免疫グロブリン（即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）を構成している。免疫グロブリンのクラスはまた、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる免疫グロブリンのクラスを指す「アイソタイプ」（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ）とも称される。特定のアイソタイプ（例えばＩｇＧ１）が本明細書で言及される場合には、この用語は、特定のアイソタイプ配列（例えば、特定のＩｇＧ１配列）に限定されるものではなく、抗体が他のアイソタイプよりもこのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１）に近い配列であることを示すために使用される。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜又は表面免疫グロブリンの重鎖は、カルボキシ末端で膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインを含む。哺乳類では、２種類の軽鎖（即ち、ラムダ及びカッパ）が存在している。免疫グロブリン鎖は、可変領域及び定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの様々なアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部分は、高度に多様化しており、抗原認識を担っている。

【0161】

「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン、又はその抗原結合部分を指す。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体を含む。各重鎖は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）並びに重鎖定常領域（ＥＵナンバリングに従ってヒトＩｇＧ１のアミノ酸残基１１８～４４７）で構成されており、ＣＨ１は、典型的には、ペプチドリンカー（「ヒンジ」とも呼ばれる）によりＣＨ２－ＣＨ３に連結されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域（本明細書ではＣＬと略される）で構成されている。「領域」という用語、及び「ドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性が高い領域が点在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと下記の順序で配置されている３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７（１９８７）も参照されたい）。別途述べない限り、又は文脈と矛盾しない限り、本明細書におけるＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って特定され、本発明における定常領域のアミノ酸位置への言及は、ＥＵナンバリングに従っている（Ｅｄｅｌｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８－８５；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔ．１９９１ ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織
又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0162】

「．．．の位置に対応するアミノ酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるアミノ酸位置の番号を指す。他の免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸位置は、ヒトＩｇＧ１とのアラインメントにより見出され得る。そのため、別の配列中のアミノ酸又はセグメントに「対応する」ある配列中のアミノ酸又はセグメントは、典型的にはデフォルト設定でＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、又は同様のもの等の標準配列アラインメントプログラムを使用して、他のアミノ酸又はセグメントと整列し、ヒトＩｇＧ１重鎖と少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するものである。配列、又は配列中のセグメントを整列させ、それにより配列中の対応する位置を本発明に係るアミノ酸位置に決定する方法は、当該技術分野で公知であるとみなされる。

【0163】

「ＩｇＧ Ｆｃリガンド」という用語は、本明細書で使用される場合、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する分子（好ましくはポリペプチド）を指す。Ｆｃリガンドとして、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、及びウイルスＦｃγＲが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドとして、ＦｃγＲに相同なＦｃ受容体のファミリであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）も挙げられる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９０：１２３－１３６）。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎ及びＦｃガンマ受容体である。「Ｆｃリガンド」は、本明細書で使用される場合、マウス、ヒト、及びカニクイザル等の任意の生物由来であり得る。

【0164】

「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、又は「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によりコードされるタンパク質のファミリの任意のメンバーを指す。ヒトでは、このファミリとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、例えば、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃ；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、例えば、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、並びにＦｃγＲＩＩｃ；並びにＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、例えば、アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）、並びにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８２：５７－６５）。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが挙げられるがこれらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲとして、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0165】

「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」は、本明細書で使用される場合、ＩｇＧ Ｆｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子により少なくとも部分的にコードされるタンパク質に関する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが挙げられるがこれらに限定されない任意の生物由来であり得る。機能的ＦｃＲｎタンパク質は、重鎖（ＦｃＲｎ遺伝子によりコードされる）及び軽鎖（ベータ２－ミクログロブリン）と称されることが多い２つのポリペプチドを含む。別途規定しない限り、「ＦｃＲｎ」又は「ＦｃＲｎタンパク質」は、ＦｃＲｎ重鎖とベータ－２－ミクログロブリンとの複合体を指す。「ＦｃＲｎバリアント」は、本明細書で使用される場合、ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させ、血清中半減期も増加し得るものである。

【0166】

「Ｆｃ」、又は「Ｆｃ領域」、又は「Ｆｃドメイン」は、本明細書で使用される場合、
ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択的にヒンジ等のペプチドリンカーも含むポリペプチドを指す。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵナンバリングに従って、アミノ酸２３１～４４７位を含み、ヒンジは２１６～２３０位を含む。そのため、ＩｇＧに関して、「Ｆｃドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸２３１～４４７位（ＣＨ２－ＣＨ３）及び２１６～４４７位（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、並びに機能的断片を含むその機能的バリアントを含む。「Ｆｃ断片」は、より少ないアミノ酸（例えば、Ｎ末端又はＣ末端切断バリアント）を含み得るが、標準的な方法（例えば、サイズに基づく方法（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等）を使用して検出され得るように、別のＦｃドメイン又はＦｃ断片と二量体を形成する能力を依然として保持しており、そのため機能的バリアントである。本発明によれば、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４からのＦｃドメイン等のヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。

【0167】

「ヒンジ」、「ヒンジ領域」、「抗体ヒンジ領域」、又は「ヒンジドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）のＣＨ１とＣＨ２との間のアミノ酸を含むペプチドリンカーを指す。構造的に、天然に存在するＩｇＧ（例えばＩｇＧ１）分子では、ＣＨ１は、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸２１５位で終わり、ＣＨ２は、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸２３１位で始まる。そのため、ＩｇＧの場合、ヒンジは、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸２１６～２３０位を含む。

【0168】

「バリアントＦｃドメイン」は、親Ｆｃドメインと比較してアミノ酸改変を含む。そのため、「バリアントＩｇＧ１ Ｆｃドメイン」（例えばバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン）は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（例えばヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン）の位置に対応する位置でアミノ酸改変（例えば、アミノ酸の置換及び／又は欠失）を含み、好ましくは、親Ｆｃドメインの機能的バリアントである。そのようなバリアントＩｇＧ Ｆｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインに対する少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を保持する。任意選択的に、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸改変を有し得る。任意選択的に、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較して、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸改変を有し得る。好ましくは、本明細書で説明されている技術又は当該技術分野で公知の技術（例えば、非変性ゲル電気泳動）を使用して測定した場合に、バリアントＦｃドメインは、別のＦｃドメインと二量体を形成する能力を保持する。

【0169】

Ｆｃ改変
本明細書で説明されている結合剤は、少なくとも３本の異なるポリペプチド鎖を含み、２本のポリペプチド鎖（例えば、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖）は、好ましくはＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、特にヒトＩｇＧ１）に由来するＣＨ２－ＣＨ３領域を含む。好ましくは、ＣＨ２－ＣＨ３領域を含む前記第１及び第２のポリペプチド鎖は、相互作用し得、例えば二量体化し得、それにより、本明細書で説明されている結合剤の前記第１及び第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体が形成される。好ましくは、本発明の結合剤のＣＨ２－ＣＨ３領域は、ＩｇＧ１（より好ましくはヒトＩｇＧ１）に由来しているが、他の血清型由来のＣＨ２及びＣＨ３も、本明細書で説明されているように使用し得る。さらに、本明細書で論じるように、本発明の結合剤は、例えば産生宿主細胞内で、自己組織化する。例えば、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２は、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２と相互作用し、及び／又は第１のポリペプチド鎖のＣＨ３は、第２のポリペプチド鎖
のＣＨ３と相互作用し、それによりＦｃ断片が形成されることが想定される。このＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１に関して本明細書で論じられている１つ又は複数のアミノ酸改変又は「Ｆｃ改変」を含んで、第１及び第２のポリペプチド鎖のＣＨ２間並びに／若しくは第１及び第２のポリペプチド鎖のＣＨ３間の相互作用を促進し得、並びに／又は１種類のポリペプチド鎖のみを含むホモ多量体よりも互いに相互作用する第１及び第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ多量体（例えばヘテロ二量体）の精製を容易にし得、並びに／又は本明細書で論じられているさらなる有益な機能性を付与し得る。本明細書で論じられているアミノ酸改変はまた、ＣＨ１ドメインにも含まれ得、例えば、本発明の結合剤の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖内にも含まれ得る。加えて、ペプチドリンカー、例えば、ｓｃＦｖ部分内のペプチドリンカー、又は結合剤のさらなるドメインを接続するペプチドリンカー、例えば、ＣＨ１及びｓｃＦｖ、又はＣＨ２及びｓｃＦｖ、又はＣＨ１及びＣＨ２は、本明細書で説明されている１つ又は複数のアミノ酸改変を含み得る。例えば、ＣＨ２－ＣＨ３領域を別の領域又はドメイン（例えば、ＶＨ（ＣＤ３）、ＶＬ（ＣＤ３）、又はＣＨ１）に連結するペプチドリンカーは、天然に存在するＩｇＧ１のＥＵナンバリングに従って２２０位（通常、システインが見出され得る）に対応するアミノ酸位置でセリンを有し得る。ヒトＩｇＧ１の２２０位に対応する前記位置でセリンを含むペプチドリンカーを使用することにより、ＣＨ２－ＣＨ３領域を含む２本の鎖間のジスルフィド形成が減少する。

【0170】

そのため、本発明の結合剤の形成は、好ましくは、ホモ二量体から離れたヘテロ二量体の単純な精製を可能にする「ｐＩ改変」と併せて、及び任意選択的に、本明細書で論じられている「アブレーション改変（ａｂｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」及びさらなるＦｃ改変を組み合わせて、本明細書で説明されているホモ二量体よりも前記単量体により形成されるヘテロ二量体の形成を「偏らせる」もの等のＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３を含むアミノ酸置換を含む様々な単量体（例えば、本明細書で説明されている第１及び第２のポリペプチド鎖）の使用に基づいている。当業者は、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメイン、並びにペプチドリンカーに関して本明細書で論じられているアミノ酸改変の内のいずれか（例えばヒンジバリアント）を、本明細書で論じられているか又は当該技術分野で公知のさらなるアミノ酸改変と組み合わせ得ることを理解するだろう。例えば、非対称（ｓｋｅｗ）改変及びｐＩ改変の内のいずれかを、独立して、アブレーション改変及び他のＦｃ改変と組み合わせ得る。本発明に係るＦｃ改変は、アミノ酸の挿入、付加、欠失、又は置換であり得る。

【0171】

本明細書で論じられているＦｃ改変は、これを構成するアミノ酸改変に従って定義される。例えば、Ｎ４３４Ｓは、親ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドに対する及びＥＵナンバリングに従って４３４位のセリンのアスパラギンへの置換を有するＦｃ改変である。親アミノ酸の同一性は特定され得ず、その場合、前記バリアントは４３４Ｓと称され、即ち、前記Ｆｃ改変を構成するＣＨ２－ＣＨ３領域は、ＥＵナンバリングに従ってヒトＩｇＧ１の４３４位に対応するアミノ酸位置でセリンを含む。

【0172】

ｐＩ改変
ｐＩ改変により、単量体間の等電点（ｐＩ）の差違が増加し、ホモ多量体タンパク質及びヘテロ多量体タンパク質の等電点精製が可能となる。一般に、ｐＩ改変により、ポリペプチド鎖のｐＩが増加するか（塩基性変化）、又はポリペプチド鎖のｐＩが減少する（酸性変化）。

【0173】

本明細書で論じるように、２本のポリペプチド鎖間の少なくとも０．１、例えば０．２、０．３、０．４、又は０．５のｐＩ差により、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動、又は当該技術分野で公知の等電点に敏感な他の方法による分離が可能となり得る。従って、互いに相互作用するポリペプチド鎖のそれぞれ（例えば、本明細書で
説明されている第１及び第２のポリペプチド鎖）のｐＩを変更するｐＩ改変の含有により、前記ポリペプチド鎖のそれぞれが異なるｐＩを有し、前記ポリペプチド鎖により形成されるヘテロ多量体もまた、異なるｐＩを有し、前記ヘテロ多量体を含む結合剤の等電点精製が容易となる。これらの置換はまた、任意の汚染された不要なホモ多量体又はヘテロ多量体の形成の決定及びモニタリングにも役立つ。

【0174】

ｐＩ改変は、重鎖定常領域を含むヘテロ多量体の一方又は両方の鎖（例えば、本発明の結合剤の第１及び第２のポリペプチド鎖）内、並びにＣＨ１、ＣＨ２、及び／若しくはＣＨ３内、並びに／又はｓｃＦｖ部分のＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結するリンカー等のペプチドリンカー内に含まれ得る。例えば、ｐＩバリアントは、ホモ多量体形成を減少させるか又は防止するために、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖に含まれ得る。典型的には、第１及び第２のポリペプチド鎖の両方に含まれる場合には、一方のポリペプチド鎖のｐＩが増加し、第２のポリペプチド鎖のｐＩが減少するようなｐＩバリアントが使用される。このことを、例えば、本明細書で論じるように、中性アミノ酸残基を正又は負に荷電したアミノ酸残基で置き換えることにより若しくはその逆により、又は荷電したアミノ酸残基を正電荷から負電荷に変化させることにより若しくはその逆により、行ない得る。従って、本発明のある特定の実施形態において、本明細書で説明されている結合剤のポリペプチド鎖の少なくとも１つにおけるｐＩの十分な変化は、例えば第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ多量体がホモ多量体から離れて精製され得るように提供される。ある特定の実施形態において、本発明では、ｐＨ単位でわずか０．１、０．２、０．３、０．４、若しくは０．５、又はより高いｐＩ差が使用される。当業者により理解されるように、良好な分離を得るために本発明の結合剤の内の１つ又は複数のポリペプチド鎖に含まれるｐＩ改変の量は、ポリペプチド鎖の開始ｐＩ、ＣＨ領域のｐＩ、Ｆｖ足場領域等に部分的に依存するであろう。ｐＩの変化を、当該技術分野で公知の任意の方法により算出し得、例えば、Ｓｉｌｌｅｒｏ及びＭａｌｄｏｎａｄｏにより説明されている方法を使用して（Ｓｉｌｌｅｒｏ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，（２００６）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６（２）：１５７－１６６）、例えばＣＨ領域に基づいて算出し得る。或いは、各ポリペプチド鎖のｐＩを比較し得る。加えて、ヘテロ多量体を、そのサイズに従って分離し得る。

【0175】

ある特定の実施形態において、ｐＩ改変、非対称改変、さらなるＦｃ改変、又はアブレーション改変等は、本発明の結合剤の可変領域には含まれない。

【0176】

ある特定の実施形態において、ｐＩ改変は、異なるＩｇＧアイソタイプに由来し、そのため、それぞれのポリペプチド鎖のｐＩは、免疫原性を導入することなく変化する（米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号明細書を参照されたい）。好ましくは、ｐＩ改変は、ヒトＩｇＧアイソタイプに由来し、そのため免疫原性を導入するリスクが低減される。本明細書で論じられている改変は、ヒトＩｇＧ１に関連して説明されているが、全てのＩｇＧアイソタイプは、アイソタイプハイブリッドと同様に、このように変更され得る。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２－４由来である場合には、Ｒ１３３Ｅ及びＲ１３３Ｑも使用し得る。

【0177】

ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能等の様々な理由のために、治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１のＣＨ領域は、ＩｇＧ２のＣＨ領域と比べてｐＩが高い。特定の位置でＩｇＧ２由来残基をＩｇＧ１骨格に導入することにより、得られる単量体のｐＩが低下するか又は上昇し、加えて、血清中半減期が増加し得る。例えば、ヒトＩｇＧ１は、ＥＵナンバリングに従って１３７位でグリシン（ｐＩ約５．９７）を有しており、ヒトＩｇＧ２は、対応する位置でグルタミン酸（ｐＩ約３．２２）を有しており；グルタミン酸残基をグリシン残基に置換することにより、得られるポリペプチドのｐＩが影響を受ける。抗体定常領域のｐＩの低下により、インビボでの血清中半減期も増
加し得る（米国特許出願第１３／１９４，９０４号明細書；Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２－５９８を参照されたい）。同様に、ｐＩが低い可変領域は、血清中半減期を延長し得る（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＥＤＳ ２３（５）：３８５－３９２を参照されたい）。

【0178】

ｐＩ改変の好ましい組み合わせにおいて、あるポリペプチド鎖（例えば、例えばＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖）は、ＥＵナンバリングに従って２０８位のアスパラギン酸残基、２９５位のグルタミン酸残基、３８４位のアスパラギン酸残基、４１８位のグルタミン酸残基、及び４２１位のアスパラギン酸残基（即ち、ヒトＩｇＧ１に関するＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含み、並びに別のポリペプチド鎖（例えば、例えばＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）、ＣＨ２及びＣＨ３、並びに任意選択的なＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＨ１を含む前記結合剤の第２のポリペプチド鎖）は、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）を連結する正荷電ペプチドリンカー（「ｓｃＦｖリンカー」）を含み、例えば、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_４又はその機能的バリアントを含むか又はからなるポリペプチドリンカーを含む。

【0179】

ＣＨ１を含まず、そのためＥＵナンバリングに従って２０８位に対応するアミノ酸位置を含まないポリペプチド鎖において、下記の負ｐＩ改変を使用し得る：ＥＵナンバリングに従って２９５位のグルタミン酸残基、３８４位のアスパラギン酸残基、４１８位のグルタミン酸残基、及び４２１位のアスパラギン酸残基（ヒトＩｇＧ１：Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）。

【0180】

いくつかの実施形態において、あるポリペプチド鎖（例えば第１のポリペプチド鎖）は、本明細書で論じられているバリアントのセットを含み、これと相互作用するポリペプチド鎖（例えば、第２のポリペプチド鎖）は、荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、例えば、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２からなる群から選択される正荷電ｓｃＦｖリンカー若しくはその機能的バリアント、又は配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択される負荷電ｓｃＦｖリンカー若しくはその機能的バリアントを含む。

【0181】

非対称改変
「非対称改変」とは、立体的改変であって、そのような改変を含むポリペプチド鎖の相互作用を促進する立体的改変のことである。立体的改変を使用するする１つの戦略は、当該技術分野では、アミノ酸操作を指す「ノブ及びホール」と称されており、典型的にはＦｃ領域（ＣＨ２－ＣＨ３）中の第１の重鎖ポリペプチドに突起が導入されており、典型的にはＦｃ領域（ＣＨ２－ＣＨ３）中の第２の重鎖ポリペプチドに対応する空洞が導入されており、その結果、この突起は、これら２つの重鎖の界面で空洞中に配置されて、ヘテロ二量体形成を促進してホモ二量体形成を妨げ得る（米国特許出願第６１／５９６，８４６号明細書，Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６；米国特許第８，２１６，８０５号明細書を参照されたい）。「突起」は、第１の重鎖ポリペプチドの界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖に置き換えることにより構築されている。第２の重鎖ポリペプチドの界面では、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖に置き換えることにより、突起と同一サイズか又は類似サイズの補償的「空洞」が形成される（米国特許第５，７３１，１６８号明細書）。「ノブ及びホール」改変をジスルフィド結合と組み合わせて、前記第１及び第２の重鎖ポリペプチドのヘテロ多量体化、例えば、ヘテロ二量体化へ形成を偏らせ得る（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７を参照されたい）。

【0182】

有用な非対称改変として下記の二重改変の対が挙げられるが、これらに限定されず、二重改変の各対の一部は、本発明の結合剤の一方のポリペプチド鎖（例えば、本明細書で説明されている第１のポリペプチド鎖）に存在しており、別の部分は、本発明の結合剤の別のポリペプチド鎖（例えば、本明細書で説明されている第２のポリペプチド鎖）に存在している：ＥＵナンバリングに従い、ヒトＩｇＧ１に関するＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ；Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ。好ましくは、本発明の結合剤では、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑが使用される。

【0183】

本明細書で説明されている非対称改変はまた、ｐＩにも影響を及ぼし得（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７を参照されたい）、そのため精製にも影響を及ぼし得、従って、ｐＩバリアントとも考えられる可能性がある。

【0184】

アブレーション改変
「アブレーション」は、本明細書では、活性の減少又は除去を意味する。「ＦｃγＲ結合を消失させる」とは、１つ又は複数のアブレーション改変を含むＦｃ領域が、この特定の改変を含まないＦｃ領域と比較してＦｃγＲ結合活性が５０％を超えて消失していることを意味する。好ましくは、１つ又は複数のアブレーション改変を含むＦｃ領域は、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％を超えるか又はさらに多いＦｃγＲ結合活性の消失を有する。好ましくは、この特定の改変を含まないＦｃ領域と比較して１つ又は複数のアブレーション改変を含むＦｃ領域のＦｃγＲ結合活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ、又はＢＬＩアッセイにおいて検出可能な結合のレベルを下回る。

【0185】

公知であるように、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体と最も高い結合を有しており、そのため、結合剤の定常ドメインがＩｇＧ１に由来する場合には、アブレーション改変を使用し得る。或いは、又はアブレーション改変に加えて、グリコシル化位置２９７の変異（一般にＡ又はＳへの変異）は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を著しく除去し得る。ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体への結合が当然低く（Ｐａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１５３７－１５４６；Ｂｒｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ １１３：３７１６－３７２５）、そのため、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来するＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを、本発明の結合剤におけるアブレーション改変の有無にかかわらず使用し得る。ＦｃγＲ結合を除去するアミノ酸改変は、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（２）：１１２９－１１３８（２００６）及びＨｅｚａｒｅｈ Ｍ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．；７５（２４）：１２１６１－１２１６８（２００１）で説明されている。

【0186】

そのため、本発明の結合剤のＦｃ部分は、１つ又は複数の「ＦｃγＲアブレーション改変」又は「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ若しくはＫＯ）改変」を含み得る。ある特定の実施形態において、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）の１つ又は複数又は全てに対するＦｃドメインの結合を低減させるか又は除去することが望ましい。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ活性を消失させるか又は著しく低減させるために、本発明の結合剤等のＣＤ３と１価で結合する結合剤のＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去することが望ましい。そのため、本発明の結合剤において
、本発明の結合剤のポリペプチド鎖（例えば、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖）の内の１つ又は複数は、１つ又は複数のＦｃγＲアブレーションバリアントを構成する。好ましい実施形態において、１つ又は複数のアブレーションバリアントは、ＥＵナンバリングに従い、ヒトＩｇＧ１に関するＧ２３６Ｒ、Ｓ２３９Ｇ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｒ、Ｖ２６６Ｄ、Ｓ２６７Ｋ、Ｓ２６７Ｒ、Ｈ２６８Ｋ、Ｅ２６９Ｒ、２９９Ｒ、２９９Ｋ、Ｋ３２２Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｑ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｈ、Ｐ３２９Ｋ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｋ、Ｉ３３２Ｒ、Ｖ２６６Ｄ／Ａ３２７Ｑ、Ｖ２６６Ｄ／Ｐ３２９Ｋ、Ｓ２６７Ｒ／Ａ３２７Ｑ、Ｓ２６７Ｒ／Ｐ３２９Ｋ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋ、２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択され、「ｄｅｌ」は、示された位置でのアミノ酸欠失を表す。好ましくは、本発明の結合剤の第１及び第２のポリペプチド鎖の両方において、ＥＵナンバリングに従い、ヒトＩｇＧ１に関する改変Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋが使用される。本明細書で開示されているアブレーション改変は、ＦｃγＲ結合を除去するが、一般にＦｃＲｎ結合は除去しないことに留意すべきである。しかしながら、結合剤の血清中半減期を減少させるか又は増加させるためにＦｃＲｎへの結合を減少させるか又は増加させる技術が公知であり、使用され得る（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：２３５１４－２４；Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６：３４６－５６；及びＺａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８：１５７－９を参照されたい）。

【0187】

例えば、本発明の結合剤において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２８に従うアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号３０に従うアミノ酸配列を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖は、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑセットの非対称改変を含み、第１のポリペプチド鎖は、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤセットのｐＩ改変をさらに含み、第１及び第２のポリペプチド鎖は、両方とも、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋセットのアブレーション改変をさらに含み、例えば、第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＨ１を含み、第２のポリペプチド鎖は、ｓｃＦｖ（ＣＤ３）を含み、任意選択的にＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＨ１を含む。当然のことながら、さらなる改変が、それぞれの結合剤のアミノ酸配列に含まれ得、例えば、結合剤は、上記で論じた改変に加えて、置換等のさらなるアミノ酸改変を含み得る。

【0188】

さらなるＦｃ改変
ｐＩ改変、非対称改変、及びアブレーション改変等の、本明細書で説明されている他の改変に加えて、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体の結合を変化させる、ＦｃＲｎ受容体への結合を変化させる等の多くの有用な改変を使用し得る。

【0189】

従って、本発明の結合剤の１種又は複数種のＦｃγＲ受容体への結合を変更するために行なわれ得る多くの有用なアミノ酸置換が存在している。結合を増加させる置換、及び結合を減少させる置換も有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合が増加するとＡＤＣＣが増加することが知られている。同様に、ＦｃγＲＩＩｂへの結合の減少も有益であり得る。本発明で使用され得るアミノ酸置換として、米国特許出願第１１／１２４，
６２０号明細書、同第１１／１７４，２８７号明細書、同第１１／３９６，４９５号明細書、同第１１／５３８，４０６号明細書（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で列挙されているものが挙げられる。本発明の結合剤に組み込まれ得る特に有用なアミノ酸置換として、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、及び２９９Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。

【0190】

加えて、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／３４１，７６９号明細書で開示されているように、ＦｃＲｎへの結合を増加させ、血清中半減期を増加させるのに有用なさらなる改変が存在しており、これとして、ＥＵナンバリングに従って４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。

【0191】

加えて、Ｆｃヘテロ二量体を形成する一方又は両方のポリペプチド鎖（好ましくは、両方のポリペプチド鎖）のＣＨ３は、より長い血清中半減期をもたらす改変Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み得る。

【0192】

当業者に理解されるように、本明細書で論じられている改変を、独立して他の改変と組み合わせ得る。一実施形態において、本発明の結合剤のあるポリペプチド鎖（例えば、第１のポリペプチド鎖）は、ＥＵナンバリングに従ってＮ２０８Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｎ３８４Ｄ、Ｑ４１８Ｅ、及びＮ４８１Ｄを含み、この結合剤の別のポリペプチド鎖（例えば、第２のポリペプチド鎖）は、本明細書で説明されている正荷電ｓｃＦｖリンカーを含む。好ましくは、結合剤の第１のポリペプチド鎖は、ＥＵナンバリングに従ってＫ３７０Ｓ及びＬ３６８Ｄをさらに含み、この結合剤の第２のポリペプチド鎖は、ＥＵナンバリングに従ってＥ３５７Ｑ及びＳ３６４Ｋをさらに含む。加えて、好ましい実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、両方とも、ＥＵナンバリングに従ってＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、及びＳ２６７Ｋをさらに含む。最も好ましくは、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ２０８Ｄ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｓ２６７Ｋ、Ｑ２９５Ｅ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３８４Ｄ、Ｑ４１８Ｅ、及びＮ４８１Ｄを含み、この結合剤の第２のポリペプチド鎖は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｓ２６７Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、及びＳ３６４Ｋを含み、任意選択的に、典型的には軽鎖と対形成するシステインを除去するためにＣ２２０Ｓを含む。

【0193】

「モノクローナル結合剤」という用語は、本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」を含み、単一分子組成の結合剤分子の調製物を指す。モノクローナル結合剤組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。従って、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する、単一の結合特異性を示す結合剤を指す。ヒトモノクローナル結合剤を、不死化細胞と融合した、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物又はトランス染色体非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得られたハイブリドーマ（例えばＢ細胞）により生成し得る。

【0194】

「組換え結合剤」という用語は、本明細書で使用される場合、「組換え抗体」を含み、組換え手段により調製されるか、発現されるか、作製されるか、又は単離された全ての結合剤を含み、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるか若しくはトランス染色体である動物（例えば、マウス）又はこれから調製されたハイブリ
ドーマから単離された結合剤、（ｂ）結合剤を発現するように形質転換された宿主細胞（例えば、トランスフェクトーマ）から単離された結合剤、（ｃ）組換え、コンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された結合剤、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段により調製されるか、発現されるか、作製されるか、又は単離された結合剤を含む。

【0195】

「ヒト結合剤」という用語は、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」を含み、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する結合剤を含むことが意図されている。ヒト結合剤は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発により導入された変異、又はインビボでの体細胞変異により導入された変異）を含み得る。

【0196】

「ヒト化結合剤」という用語は、本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」を含み、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指しており、この分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づいている。このことは、例えば、抗原結合部位を一緒に形成する６つの非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を、相同なヒトアクセプターフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することで達成され得る（国際公開第９２／２２６５３号パンフレット及び欧州特許第０６２９２４０号明細書を参照されたい）。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメインを含み得るか、又は可変ドメインの適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含み得る。親結合剤の結合親和性及び特異性を完全に再構成するために、この親結合剤（即ち、非ヒト結合剤、例えばマウス抗体）のフレームワーク残基のヒトフレームワーク領域への置換（逆変異）が必要な場合がある。構造的に相同なモデリングは、結合剤の結合特性に重要なフレームワーク領域中のアミノ酸残基を特定することに役立ち得る。抗原結合部位は、野生型であってもよいし、１つ又は複数のアミノ酸置換により改変されてもよく、例えば、ヒト免疫グロブリンにより密接に似るように改変されてもよい。ヒト化結合剤の一部の形態は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体の６つのＣＤＲ全てを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の結合剤（例えば抗体）に関して変更された１つ又は複数のＣＤＲを有する。そのため、ヒト化結合剤は、非ヒトＣＤＲ配列、主として、非ヒトアミノ酸配列に対する１つ又は複数のアミノ酸逆変異を任意選択的に含むヒトフレームワーク領域、及び完全ヒト定常領域を含み得る。

【0197】

「キメラ結合剤」という用語は、本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」を含み、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部が、特定の種に由来するか又は特定のクラスに属する結合剤（例えば抗体）の対応する配列と相同であり、この鎖の残りのセグメントが、別のものの対応する配列と相同である結合剤を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳類のある種に由来する抗体の可変領域を模倣しており、定常部分は、別の種に由来する抗体の配列と相同である。そのようなキメラ形態に対する１つの明確な利点は、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なＢ細胞又はハイブリドーマを使用して、現在公知の供給源から可変領域を簡便に得ることができることである。可変領域は、調製が容易であり、特異性が供給源による影響を受けないという利点を有しているが、定常領域はヒトであり、非ヒト供給源からの定常領域と比べて、結合剤を注射した場合にヒト対象から免疫反応を誘発する可能性が低い。しかしながら、この定義は、この特定の例には限定されない。

【0198】

結合剤又はその断片、例えば、可変領域及び／又は定常領域は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、及びヒトが挙げられるがこれらに限定されない様々な種に由来し得る。

【0199】

本明細書で説明されている免疫グロブリンは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＧ１（例えば、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸３５６位（Ｄ又はＥ）及び３５８位（Ｌ又はＭ）で多型を有するアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、並びにＩｇＤ抗体を含む。様々な実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１抗体、より具体的には、ＩｇＧ１、カッパ、又はＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（即ち、ＩｇＧ１、κ、λ）ＩｇＧ２抗体（例えば、ＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えば、ＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えば、ＩｇＧ３、κ、λ）、又はＩｇＧ４抗体（例えば、ＩｇＧ４、κ、λ）である。ＩｇＧ１アロタイプ３５６Ｄ／３５８Ｍに関して本明細書で説明されているアミノ酸配列はまた、アロタイプ３５６Ｅ／３５８Ｌも含む。

【0200】

「ＩｇＧサブクラス改変」又は「アイソタイプ改変」という用語は、あるＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、アラインされた異なるＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、ＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むことから、ＥＵナンバリングに従ってアミノ酸２９６位でのフェニルアラニンであるＩｇＧ２でのＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス改変とみなされる。

【0201】

本明細書で使用される場合、「異種結合剤」は、「異種抗体」を含み、そのような結合剤を産生するトランスジェニック生物に関連して定義される。この用語は、トランスジェニック生物からならない生物で見出されるものに対応するアミノ酸配列又はコードする核酸配列を有し、一般にトランスジェニック生物以外の種に由来する結合剤を指す。

【0202】

本明細書で使用される場合、「ヘテロハイブリッド結合剤」は、「ヘテロハイブリッド抗体」を含み、様々な生物起源の軽鎖及び重鎖を有する結合剤を指す。例えば、マウス軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。

【0203】

本明細書で説明されている抗体等の結合剤は、好ましくは単離されている。「単離されている」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性が異なる他の薬剤を実質的に含まない結合剤を指すことが意図されている（例えば、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に特異的に結合する単離された結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３以外の抗原に特異的に結合する結合剤を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＬＤＮ１８．２のエピトープ、アイソフォーム、又はバリアントに特異的に結合する単離された結合剤は、他の関連抗原、例えば、他の種由来の関連抗原（例えば、ＣＬＤＮ１８．２種の相同体）に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された結合剤は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。

【0204】

抗体等の結合剤の「抗原結合部分」（若しくは単に「結合部分」）、又は抗体等の結合剤の「抗原結合断片」（若しくは単に「結合断片」）という用語、又は類似の用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する結合剤の１つ又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実施され得ることが分かっている。抗体等の結合剤の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例として、下記が挙げられる：（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨドメインからなる１価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片に由来し、アルキル化され得るか又は酵素、毒素、若しくは目的の他のタンパク質とのコンジュゲーションで利用され得る遊離スルフヒドリル基を含むＦａｂ’断片であって、このＦａｂ’は、Ｆｃのごく一部を含み得る、Ｆａｂ’断片；（ｉｖ）ＶＨドメイン及びＣＨドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８
９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉｉ）任意選択的に合成リンカーにより連結され得る２つ以上の単離ＣＤＲの組み合わせ。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、これらは、組換え法を使用して、ＶＬドメイン及びＶＨドメインが対合して１価分子を形成する１本のタンパク質鎖として生成されることを可能にする合成リンカーにより連結され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても公知である；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体等の結合剤の「抗原結合断片」という用語に包含されることも意図されている。さらなる例は、下記を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である：（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号明細書及び同第２００３／０１３３９３９号明細書で開示されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片は、インタクトな抗体と同様の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。

【0205】

一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、例えば配列番号２～２０で表されるｓｃＦｖリンカー等の通常１０～約３０個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。このリンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが富化されており、溶解性のためにセリン又はスレオニンが富化されており、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを連結し得るか、又はその逆である。２価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（又は２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））の一本鎖可変断片（ジ－ｓｃＦｖｓ、ビ－ｓｃＦｖｓ）を、２つのｓｃＦｖｓを連結することにより操作し得る。このことを、２つのＶＨドメイン及び２つのＶＬドメインを有する単一ペプチド鎖を作製することにより行ない得、タンデムｓｃＦｖが得られる。本発明はまた、複数のｓｃＦｖｓ結合ドメインを含む多重特異性分子も含む。一般的な一柔軟連結ペプチドは、（Ｇ４Ｓ）_ｘであり、式中、ｘは、２、３、４、５、又は６であり得る。好ましくは、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結するリンカーは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_ｘ又はその機能的バリアントを含み、好ましくはからなり、式中、ｘは、２、３、４、５、又は６であり得る。任意選択的に、ＶＨ及びＶＬの会合を、１つ又は複数の分子間ジスルフィド結合により安定化させ得る。

【0206】

別の可能性は、２つの可変領域が一緒に折り畳むには短すぎる（約５個のアミノ酸）リンカーペプチドを有するｓｃＦｖの作成であり、ｓｃＦｖは二量体化される。このタイプは、ダイアボディとして公知である。さらに短いリンカー（１又は２個のアミノ酸）は、三量体（いわゆるトリアボディ又はトリボディ）を形成する。テトラボディも、生成されている。これらは、ダイアボディと比べて、標的に対してさらに高い親和性を示す。

【0207】

「特異性」という用語は、本明細書で使用される場合、文脈が矛盾しない限り、下記の意味を有することが意図されている。２種の結合剤が同一の抗原及び同一のエピトープに結合する場合には、これらの結合剤は、「同じ特異性」を有する。

【0208】

本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」又は「抗原結合ドメイン」という用語は、例えば抗体等の結合剤の抗原に結合する部位を指しており、結合剤の抗原結合部分を含む。結合ドメインは、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）で構成され得、これらのそれぞれは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つのＣＤＲを含む
。ＣＤＲは、配列が異なっており、特定の抗原に対する特異性を決定する。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、一緒に、特定の抗原に特異的に結合する部位を形成し得る。抗原に対する「特異性を有する結合ドメイン」は、前記結合ドメインを含む結合剤が、例えば、約１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄで、標準的なアッセイにおいて前記結合ドメインを介して前記抗原に結合するが、標準的なアッセイにおいて、前記結合ドメインが特異的である示された抗原とは異なる抗原に対して前記結合ドメインを介して有意に結合しない（特に検出可能に結合しない）場合には、前記抗原に対して特異的である。当然のことながら、結合剤が、特異性が異なる複数の結合ドメインを含む場合には、本明細書で説明されているように、特異性を有する複数の抗原に結合する。抗原に対する結合剤の結合を、例えば、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ；ＢＬＩ）を使用して決定し得るか、或いは、例えば、リガンドとして抗原を使用し、分析物として結合剤を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定し得る。

【0209】

Ｆａｂ（断片抗原結合）抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）部分からなるポリペプチドと、軽鎖可変領域（ＶＬ）並びに軽鎖定常領域（ＣＬ及びＣＨ１部分が、例えばＣｙｓ残基間のジスルフィド結合により互いに結合している）からなるポリペプチドとで構成されている抗体の１価抗原結合ドメインを含む免疫反応性ポリペプチドである。好ましくは、本明細書で説明されているＦａｂ断片において、ＣＨ１及びＣＬは、ヒト起源のものである。一実施形態において、ＣＬは、カッパ型ＣＬである。一実施形態において、ＣＨ１は、ＩｇＧ１に由来しており、好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。

【0210】

本発明の目的のために本明細書で説明されている全ての抗体及び抗体の誘導体（例えば抗体断片）は、「抗体」という用語に包含される。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の改変形態を指しており、例えば、抗体と別の薬剤若しくは抗体とのコンジュゲート、又は抗体断片を指す。さらに、本明細書で説明されている抗体及び抗体の誘導体は、本発明の結合剤の製造に有用である。

【0211】

天然に存在する抗体は、一般に単一特異的であり、即ち、単一抗原に結合する。本発明は、（ＣＤ３受容体に結合することにより）Ｔ細胞等の細胞傷害性細胞に結合し、（ＣＬＤＮ１８．２に結合することにより）がん細胞等の標的細胞と結合する結合剤を提供する。本発明の結合剤は、少なくとも２つの異なるタイプの抗原に結合し、少なくとも二重特異性であるか、又は三重特異性、四重特異性等の多重特異性である。

【0212】

本発明の結合剤は、少なくとも２価であり得る。一実施形態において、本発明の結合剤は、少なくとも３価である。本明細書で使用される場合、「価」、「価数（ｖａｌｅｎｃｅ）」、「価数（ｖａｌｅｎｃｉｅｓ）」、又はこれらの他の文法的変形は、結合剤中の抗原結合部位又は結合ドメインの数を意味する。同一の抗原に結合する抗原結合部位は、異なるエピトープを認識してもよいし、好ましくは同一のエピトープを認識してもよい。３価の二重特異性抗体及び４価の二重特異性抗体は、当該技術分野で公知である。本発明の結合剤はまた、４を超える価数も有し得る。

【0213】

本明細書で説明されている結合剤は、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗体の断片（少なくとも２つの異なる結合ドメインを形成する前記少なくとも２つの異なる抗体の断片）で構成され得、その結果、少なくとも２つの異なるタイプの抗原に結合する人工タンパク質（タンパク質複合体を含む）である。本発明に係る結合剤は、（例えばＣＤ３に結合することにより）免疫細胞（例えば免疫エフェクター細胞、特に、細胞傷害性細胞等のＴ細胞）と、（腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ１８．２に結合することにより）破壊されるがん細胞のような標的細胞とに同時に結合するように操作されている。

【0214】

数種の２価抗体及び３価抗体が開発されており、全てのタイプが、本発明の範囲内である。二重特異性完全長抗体は、２つのモノクローナル抗体を共有結合的に連結させることにより得ることができるか、又は従来のハイブリッドハイブリドーマ技術により得ることができる。２つのモノクローナル抗体の共有結合的連結は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂｌｏｏｄ ８０（１９９２），２８２６－３４で説明されている。二重特異性抗体断片の別の例は、小さい２価の二重特異性抗体断片であるダイアボディ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７（１９９８），７６３－７７２）である。ダイアボディは、同一鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるペプチドリンカーにより接続された同一のポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。これにより、別の鎖の相補的ドメインとの対形成が強制され、２つの機能的抗原結合部位を有する二量体分子の構築が促進される。

【0215】

２つのＦａｂ断片を含む二重特異性分子において、個々のＦａｂ断片のそれぞれは、一本鎖で配置され得（好ましくは、ＶＬ－ＣＬ－ＣＨ－ＶＨ）、個々の可変ドメイン及び定常ドメインは、本明細書で論じられているペプチドリンカー等のペプチドリンカーで連結され得る。一般に、個々の一本鎖及びＦａｂ断片は、ジスルフィド結合、付着ドメイン、化学的連結、及び／又はペプチドリンカーを介して連結され得る。二重特異性分子はまた、２個を超えるＦａｂ断片も含み得、特に、この分子は、Ｆａｂ３、Ｆａｂ４であってもよいし、２、３、４種、又はより多い異なる抗原に対する特異性を有する多量体Ｆａｂ複合体であってもよい。本発明はまた、化学的に連結されたＦａｂも含む。

【0216】

三重抗体又は一本鎖三重抗体（ｓｃｔｂ）は、リンカー配列により連結された３つの異なるｓｃＦｖ領域で構成されている。同様に、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）の自然なインビボでのヘテロ二量化を使用して、複数のｓｃＦｖが付加され得る足場を形成し得る。例えば、ある抗原に特異的なｓｃＦｖは、ＣＨ１に連結され得、ＣＨ１もまた、別の抗原に特異的なｓｃＦｖに連結されており、この鎖は、ＣＬに連結されたいずれかの抗原に特異的なｓｃＦｖを含む別の鎖と相互作用し得る（ｓｃＦｖ３－ＣＨ１／ＣＬ）。３価構造の別の例は、各鎖上に１つずつ、別のエピトープに特異的な２つのｓｃＦｖにＣ末端連結された、あるエピトープに特異的なＦａｂ断片の使用を含む（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ２）。３価構築物のさらに別の例は、ある抗原又はエピトープに特異的な２つのＦａｂ断片の使用を含み、ここで、これらのＦａｂ断片の内の１つは、別の抗原又はエピトープに特異的な１つのｓｃＦｖにＣ末端連結されている（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ）。３価（又は４価）分子のさらに別の例として、抗体のＮ末端又はＣ末端に付着したさらなる結合体を含む様々なフォーマットが挙げられる。例えば、１つのフォーマットは、１種の抗原に特異的なインタクトな抗体分子であって、この分子のＣ末端に一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）が連結されている、抗体分子からなる（ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ）。３価抗体（ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）３）の生成には、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）アプローチも使用されている（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．－Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ：Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ Ｌｏｎｄｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１９９－２１６（２０１１））。上述の抗体のそれぞれは、本発明の範囲内である。

【0217】

４価抗体も構築されており、全てのタイプが、本発明の範囲内である。４価抗体の例として、ｓｃＦｖ２－Ｆｃ分子、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２分子、ｓｃＦｖ２－Ｈ／Ｌ分子、及びｓｃＦｖ－ｄｈｌｘ－ｓｃＦｖ分子が挙げられるが、これらに限定されない。二重特異性ｓｃＦｖ２－Ｆｃ構築物は、Ｆｃ鎖のＮ末端に連結されたある分子に特異的な２つのｓｃＦｖと、Ｆｃ鎖のＣ末端に連結された別の分子に特異的な別の２つのｓｃＦｖとを有するＦｃドメインを有する。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２構築物は、Ｆ（ａｂ’）２断片のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ断片を含む。ｓｃＦｖ２－Ｈ／Ｌ構築物は
、重鎖に連結されたある分子に特異的なｓｃＦｖを有しており、軽鎖には、別の分子に特異的なｓｃＦｖが連結されている。最後に、ｓｃＦｖ－ｄｈｌｘ－ｓｃＦｖ構築物は、らせん状二量体化ドメインに連結されたあるタイプのｓｃＦｖと、それに続く別のタイプのｓｃＦｖとを含む。このタイプの２本の鎖は、二量体化し得、４価抗体が生成される。

【0218】

本発明の結合剤は、抗体分子、又は抗体様分子、又は抗体様特性を有するタンパク質足場、又は少なくとも２つの結合特異性を有する環状ペプチドのフォーマットであり得る。そのため、結合剤は、本明細書で説明されている１種若しくは複数種の抗体、又はその機能的断片を含み得る。

【0219】

一実施形態において、本発明の結合剤は、相互作用可能であり、さらなる結合機能又は結合ドメインを組み込み得る、Ｆａｂ断片の重鎖（Ｆｄ断片）及び軽鎖（Ｌ）を含む。そのようなさらなる結合ドメインは、独立して、ｓｃＦｖ結合ドメイン等の２つの抗体可変領域（即ち、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）を含む結合ドメインと、ＶＨ結合ドメイン及びＶＨＨ結合ドメイン等の１つの抗体可変領域を含む結合ドメインとからなる群から選択され得る。

【0220】

一実施形態において、本発明の結合剤は、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ構築物のフォーマットであり、即ち、Ｆａｂ断片（あるポリペプチド鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、別のポリペプチド鎖の対応するＶＬ及びＣＬドメインとを含み、抗原結合ドメインが、前記ポリペプチド鎖の相互作用により形成されている）と、ｓｃＦｖ部分（同一のポリペプチド鎖のポリペプチドリンカーにより互いに連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬが相互作用して抗原結合ドメインが形成される）とを含む構築物の形態である。一実施形態において、本発明の結合剤は、３本のポリペプチド鎖で構成された三量体であり、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン（例えば、第１の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＨを含み、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン（例えば、第２の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＨを含むｓｃＦｖ部分、及び免疫グロブリン（例えば、第２の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＬを含み、第３のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン（例えば、第１の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＬを含む。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン由来のＣＨ１をさらに含み、第３のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン由来のＣＬをさらに含む。一実施形態において、第１及び第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン由来のＣＨ２及びＣＨ３（ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン（例えば、それぞれＦａｂ断片及びｓｃＦｖ部分に対するＣ末端）をさらに含む。そのため、一実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＨ２－ＣＨ３に連結されたＶＨ－ＣＨ１を含む第１のポリペプチド鎖、ＣＨ２－ＣＨ３に連結されたｓｃＦｖ部分（ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）を含む第２のポリペプチド鎖、及びＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖と相互作用する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と相互作用する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖が相互作用し、第１のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖とさらに相互作用する。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２は、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２と相互作用し、及び／又は第１のポリペプチド鎖のＣＨ３は、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３と相互作用する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＨと第３のポリペプチド鎖のＶＬとが相互作用して、結合ドメインが形成され、及び／又は第１のポリペプチド鎖のＣＨ１と第３のポリペプチド鎖のＣＬとが相互作用する。いくつかの実施形態において、ＣＬ中のシステイン残基とＣＨ１中のシステイン残基との間に、ジスルフィド架橋が形成されている。ＣＨ２－ＣＨ３を含む一方又は両方のポリペプチド鎖は、例えば、ポリペプチド鎖の相互作用を促進するために、本明細書で説明されている１つ又は複数のアミノ酸改変（例えばＦｃ改変、例えば、ｐＩ改変、非対称改変、さらなるＦｃ改変、及びアブレーション改変）を含み得る。
本発明によれば、ｓｃＦｖ部分のＶＨ及びＶＬは、好ましくは、ペプチドリンカー（「ｓｃＦｖリンカー」）により連結されている。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１は、ペプチドリンカーにより同一のポリペプチド鎖のＣＨ２に連結されている。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによりＣＨ２に連結されている。

【0221】

一実施形態において、本発明の結合剤は、Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ構築物のフォーマットであり、即ち、２つのＦａｂ断片（それぞれが、あるポリペプチド鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、別のポリペプチド鎖の対応するＶＬドメイン及びＣＬドメインとを含み、抗原結合ドメインが、前記一連のポリペプチド鎖のそれぞれの相互作用により形成されている）と、ｓｃＦｖ部分（同一のポリペプチド鎖のポリペプチドリンカーにより互いに連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬが相互作用して抗原結合ドメインが形成される）とを含む構築物の形態である。一実施形態において、本発明の結合剤は、４本のポリペプチド鎖で構成された四量体であり、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン（例えば、第１の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＨを含み、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン（例えば、第１の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＨ、及び免疫グロブリン（例えば、第２の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＨを含むｓｃＦｖ部分、及び免疫グロブリン（例えば、第２の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＬを含み、第３のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン（例えば、第１の特異性を有する免疫グロブリン）由来のＶＬを含み、第４のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と同一である。一実施形態において、第１及び第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン由来のＣＨ１（例えば、第１の特異性を有する免疫グロブリン由来のＶＨに対するＣ末端）をさらに含み、第３及び第４のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン由来のＣＬをさらに含む。一実施形態において、第１及び第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン由来のＣＨ２及びＣＨ３（ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン（例えば、それぞれＦａｂ断片及びｓｃＦｖ部分に対するＣ末端）をさらに含む。そのため、一実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＨ２－ＣＨ３に連結されたＶＨ－ＣＨ１を含む第１のポリペプチド鎖、ＣＨ２－ＣＨ３に連結されたｓｃＦｖ部分（ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）に連結されたＶＨ－ＣＨ１を含む第２のポリペプチド鎖、並びにそれぞれＶＬ－ＣＬを含む第３及び第４のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖と相互作用する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と相互作用する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、第４のポリペプチド鎖と相互作用する。一実施形態において、第１及び第２のポリペプチド鎖は相互作用し、第１のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖とさらに相互作用し、第２のポリペプチド鎖は、第４のポリペプチド鎖とさらに相互作用する。一実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２は、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２と相互作用し、及び／又は第１のポリペプチド鎖のＣＨ３は、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３と相互作用する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＨと第３のポリペプチド鎖のＶＬとが相互作用して、結合ドメインが形成され、及び／又は第１のポリペプチド鎖のＣＨ１と第３のポリペプチド鎖のＣＬとが相互作用する。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ｓｃＦｖ部分の一部ではない）と、第４のポリペプチド鎖のＶＬとが相互作用して、結合ドメインが形成され、及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ１と第４のポリペプチド鎖のＣＬとが相互作用する。いくつかの実施形態において、ＣＬ中のシステイン残基とＣＨ１中のシステイン残基との間に、ジスルフィド架橋が形成されている。ＣＨ２－ＣＨ３を含む一方又は両方のポリペプチド鎖は、例えば、ポリペプチド鎖の相互作用を促進するために、本明細書で説明されている１つ又は複数のアミノ酸改変（例えばＦｃ改変、例えば、ｐＩ改変、非対称改変、さらなるＦｃ改変、及びアブレーション改変）を含み得る。本発明によれば、ｓｃＦｖ部分のＶＨ及びＶＬは、好ましくは、ペプチドリンカー（「ｓｃＦｖリンカー」）により連結されている。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ１は、ペプ
チドリンカーにより同一のポリペプチド鎖のＣＨ２に連結されている。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによりＣＨ２に連結されている。

【0222】

好ましい実施形態において、本発明の２価結合剤（Ｆａｂ－ｓｃＦｖフォーマット）の内、第１のポリペプチド鎖のＶＨと第３のポリペプチド鎖のＶＬとが相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、第２のポリペプチド鎖のｓｃＦｖのＶＨとＶＬとが相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが形成される。しかしながら、いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＨと第３のポリペプチド鎖のＶＬとにより形成された結合ドメインは、ＣＤ３に対する特異性を有しており、第２のポリペプチド鎖のｓｃＦｖのＶＨとＶＬとにより形成された結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する。別の好ましい実施形態において、本発明の３価結合剤（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ形態で）の内、ｓｃＦｖの一部ではない第２のポリペプチド鎖のさらなるＶＨと、第４のポリペプチド鎖のＶＬとが好ましくは相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成される。しかしながら、同様に、結合剤であって、第２のポリペプチド鎖のｓｃＦｖにより形成された結合ドメイン、並びに第１及び第３のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬにより形成された結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有しており、ｓｃＦｖの一部ではない第２のポリペプチド鎖のＶＨにより形成された結合ドメイン、及び第４のポリペプチド鎖のＶＬにより形成された結合ドメインは、ＣＤ３に対する特異性を有する、結合剤も、本出願の範囲内である。

【0223】

「リンカー」という用語は、２つの異なる機能単位（例えば、ポリペプチド鎖のドメイン又は領域）を連結する役割を果たすあらゆる手段を指す。リンカーの種類として、化学的リンカー、ペプチドリンカー、及びポリペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドリンカー及びポリペプチドリンカーの配列は、限定されない。ペプチドリンカーは、好ましくは、非免疫原性であり、柔軟性であり、例えば、セリン及びグリシン配列を含むものである。特定の構築物に応じて、リンカーは、長くてもよいし、短くてもよい。

【0224】

好ましい実施形態において、ｓｃＦｖリンカー（即ち、ｓｃＦｖ部分を形成するＶＨ及びＶＬを連結するリンカー）は、本明細書で説明されている柔軟ペプチドリンカー（好ましくは、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_ｘ又はその機能的バリアント（式中、ｘは、２、３、４、５、又は６である））を好ましくは含み、好ましくはからなる。さらにより好ましい実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、アミン酸配列（ＧＫＰＧＳ）_４（配列番号１１）又はその機能的バリアントを含み、好ましくはからなる。好ましくは、ｓｃＦｖ部分は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２７）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２２）、及び（Ｇ_４Ｓ）_２ＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号２３）、又はこれらの機能的バリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーにより、第２のポリペプチド鎖のＣＨ２に連結されている。他の有用なリンカーとして、配列番号２４及び２５に従うアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

【0225】

本発明によれば、好ましくはＣＨ１のＣ末端でｓｃＦｖ及びＣＨ１を連結するリンカーは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_ｘ又はその機能的バリアント（式中、ｘは、２、３、４、５、又は６である）、好ましくは（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号２６）又はその機能的バリアントを好ましくは含み、好ましくはからなる。本発明によれば、好ましくはＣＨ２のＮ末端でＣＨ２及びｓｃＦｖを連結するリンカーは、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２７）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２２）、及び（Ｇ_４Ｓ）_２ＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号２３）、又はこれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を好ましくは含み、好ましくはからなる。本発明によれば、ＣＨ１及びＣＨ２を連結するリンカーは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＰＰＣＰ又はその機能的バリアント
を好ましくは含み、好ましくはからなる。本発明によれば、例えば第２のポリペプチド鎖のＣＨ１及びｓｃＦｖは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号２６）又はその機能的バリアントを好ましくは含み、好ましくはからなるペプチドリンカーにより連結されている。しかしながら、当該技術分野で公知であるように、他のリンカーを使用し得る。

【0226】

一実施形態において、本発明の結合剤は、第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含み、
ｉ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記のドメイン：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記のドメイン：
ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記のドメイン：
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＬ
を含み、
好ましくは、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）が相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ポリペプチド鎖のドメインは、好ましくは、本明細書で説明されているペプチドリンカーにより互いに連結されている。

【0227】

別の実施形態において、本発明の結合剤は、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、
ｉ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記のドメイン：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉ）第２のポリエペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記のドメイン：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉｉ）第３のポリエペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記のドメイン：
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＬ
を含み、
ｉｖ）第４のポリエペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と同一であり、
好ましくは、第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）と第３のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）とが相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）と第４のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）とが相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）が相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ポリペプチド鎖のドメインは、好ましくは、本明細書で説明されているペプチドリンカーにより互いに連結されている。

【0228】

一実施形態において、本発明の結合剤は、下記を含む：ａ）ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、並びにＥＵナンバリングに従って２０８位でのアスパラギン酸残基、２３３位でのプロリン残基、２３４位でのバリン残基、２３５位でのアラニン残基、２３６位での欠失、２６７位でのリシン残基、２９５位でのグルタミン酸残基、３６８位でのアスパラギン酸残
基、３７０位でのセリン残基、３８４位でのアスパラギン酸残基、４１８位でのグルタミン酸残基、及び４２１位でのアスパラギン酸残基を含むＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む第１のポリペプチド鎖；ｂ）アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_４（配列番号１１）を有する荷電ｓｃＦｖリンカーを介して互いに連結されたＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）、並びにＥＵナンバリングに従って２３３位でのプロリン残基、２３４位でのバリン残基、２３５位でのアラニン残基、２３６位での欠失、２６７位でのリシン残基、３５７位でのグルタミン残基、及び３６４位でのリシン残基を含むＣＨ２及びＣＨ３を含む第２のポリペプチド鎖；並びにｃ）ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＬを含む第３のポリペプチド鎖。一実施形態において、第２のポリペプチド鎖は、本明細書で説明されているＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＨ１をさらに含み、結合剤は、第３のポリペプチド鎖と同一の第４のポリペプチド鎖をさらに含む。

【0229】

他の実施形態は、下記を含むＦａｂ２－ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、並びに非対称改変Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ改変Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、アブレーション改変Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、さらなるＦｃ改変Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含むＣＨ１及びＣＨ２及びＣＨ３を含む第１のポリペプチド鎖；ｂ）ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）、並びに非対称改変Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、アブレーション改変Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、さらなるＦｃ改変Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含むＣＨ２及びＣＨ３、並びにＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む第２のポリペプチド鎖；並びにｃ）ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＬを含む第３のポリペプチド鎖；並びにｄ）第３のポリペプチド鎖と同一の第４のポリペプチド鎖。

【0230】

一実施形態において、本発明の結合剤は、第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含み、
ｉ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉ）第２のポリエペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー－ＶＬ（ＣＤ３）－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＬ（ＣＤ３）－リンカー－ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＬ
を含み、
好ましくは、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）が相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが形成される。

【0231】

一実施形態において、本発明の結合剤は、第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含み、
ｉ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー１－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー３－ＶＬ（ＣＤ３）－リンカー４－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＬ（ＣＤ３）－リンカー３－ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー４－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＬ
を含み、
リンカー１は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ又はその機能的バリアントを含み、リンカー３は、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_ｘ又はその機能的バリアント（式中、ｘは、２、３、４、５、又は６であり、好ましくは、ｘは、４である）を含み、リンカー４は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、及び（Ｇ_４Ｓ）_２ＫＴＨＴＣＰＰＣＰからなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含み、
好ましくは、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）が相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）が相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが形成される。

【0232】

一実施形態において、本発明の結合剤は、第１、第２，第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、
ｉ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３，
を含み、
ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー－ＶＬ（ＣＤ３）－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ（ＣＤ３）－リンカー－ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、下記のドメイン
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＬ
を含み、
ｉｖ）第４のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と同一であり、
好ましくは、第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）と第３のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）とが相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）と第４のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）とが相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ＶＨ（ＣＤ３）とＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが形成される。

【0233】

一実施形態において、本発明の結合剤は、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、
ｉ）第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー１－ＣＨ２－ＣＨ３
を含み、
ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー２－ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー３－ＶＬ（ＣＤ３）－リンカー４－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＨ１－リンカー２－ＶＬ（ＣＤ３）－リンカー３－ＶＨ（ＣＤ３）－リンカー４－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、
ｉｉｉ）第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、
ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）－ＣＬ
を含み、
ｉｖ）第４のポリペプチド鎖は、第３のポリペプチド鎖と同一であり、
リンカー１は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＰＰＣＰ又はその機能的バリアントを含み、リンカー２は、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_ｘ又はその機能的バリアント（式中、ｘ
は、２、３、４、５、又は６であり、好ましくは、ｘは、２である）を含み、リンカー３は、アミノ酸配列（ＧＫＰＧＳ）_ｘ又はその機能的バリアント（式中、ｘは、２、３、４、５、又は６であり、好ましくは、ｘは、４である）を含み、リンカー４は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、及び（Ｇ_４Ｓ）_２ＫＴＨＴＣＰＰＣＰからなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含み、
好ましくは、第１のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）と第３のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）とが相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、第２のポリペプチド鎖のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）と第４のポリペプチド鎖のＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）とが相互作用して、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインが形成され、ＶＨ（ＣＤ３）とＶＬ（ＣＤ３）とが相互作用して、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインが形成される。

【0234】

本明細書で説明されている結合剤、及び／又は本明細書で説明されている前記結合剤の第１、第２、及び第３（及び任意選択的な第４）のポリペプチド鎖はまた、この結合剤若しくはポリペプチド鎖の分泌を促進するためのアミノ酸配列（例えばＮ末端分泌シグナル）、及び／又はこの分子の結合、精製、若しくは検出を促進する１つ又は複数のエピトープタグも含み得る。好ましくは、分泌シグナルは、分泌経路の十分な通過、及び／又は結合剤若しくはそのポリペプチド鎖の細胞外環境への分泌を可能にするシグナル配列（例えばアミノ酸配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）である。好ましくは、分泌シグナル配列は開裂可能であり、成熟結合剤又はポリペプチド鎖から除去される。分泌シグナル配列は、好ましくは、結合剤又はポリペプチド鎖が産生される細胞又は生物につき選択される。

【0235】

エピトープタグのアミノ酸配列は、結合剤又はポリペプチド鎖のアミノ酸配列内の任意の位置に導入され得、コードされたタンパク質構造内でループの形状を取り得るか、又は結合剤若しくはポリペプチド鎖にＮ末端若しくはＣ末端で融合し得る。好ましくは、エピトープタグは、結合剤又はポリペプチド鎖にＣ末端で融合している。エピトープタグは、結合剤又はポリペプチド鎖からのタグの除去を可能にする開裂部位を含み得る。前記エピトープタグは、天然条件下及び／又は変性条件下で機能する任意の種類のエピトープタグであり得、好ましくはヒスチジンタグであり得、最も好ましくは、６個のヒスチジンを含むタグであり得る。

【0236】

本発明の結合剤は、前記第１、第２、及び任意選択的な第３の結合ドメインに加えて、例えば腫瘍細胞に対する選択性を増強するのに役立つ１つ又は複数のさらなる結合ドメインを含み得る。このことは、例えば、腫瘍細胞上で発現される他の抗原に結合する結合ドメインを設けることにより達成され得る。

【0237】

「翻訳後改変」という用語又は類似の用語は、タンパク質の生合成後に起こるタンパク質の可変（例えば、共有結合的改変及び酵素的改変）を指す。当該技術分野で一般的に公知であるように、細胞内で発現される抗体等の結合剤は、翻訳後に改変されることが多い。例えば、抗体等の結合剤の翻訳後改変は、重鎖又は軽鎖（例えば、本明細書で説明されている第１及び／又は第２のポリペプチド鎖）のアミノ酸側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端で起こり得る。本明細書で説明されている結合剤中で起こり得る翻訳後改変の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：例えばカルボキシペプチダーゼによる、例えば第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の重鎖のＣ末端でのリシンの開裂；ピログルタミル化による、例えば第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の重鎖のＮ末端でのグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミン酸への改変；ピログルタミル化による、例えば第３及び第４のポリペプチド鎖の軽鎖のＮ末端でのグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミン酸への改変；グリコシル化；酸化；脱アミド化；並びに糖化。そのような翻訳後改変が様々な結合剤中で起こることが知られている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．９７（７）：２４２６－２４４７）。Ｎ末端でのピログルタミル化及びＣ末端のリシンの欠失に起因する翻訳後改変は、一般的に、結合剤の活性にはいかなる影響も及ぼさない（Ｌｙｕｂａｒｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４８（１）：２４－３９）。

【0238】

そのため、一実施形態において、本明細書で説明されている結合剤は、１つ又は複数の翻訳後改変を含み得る。一実施形態において、１つ又は複数の翻訳後改変は、結合剤の１本又は複数本のポリペプチド鎖のＮ末端でのピログルタミル化を含む。一実施形態において、１つ又は複数の翻訳後改変は、１つ又は複数のＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）のＮ末端でのピログルタミル化を含む。一実施形態において、１つ又は複数の翻訳後改変は、ＶＨ（ＣＤ３）のＮ末端でのピログルタミル化を含む。一実施形態において、１つ又は複数の翻訳後改変は、第１のポリペプチド鎖のＣ末端でのリシンの欠失を含む。一実施形態において、１つ又は複数の翻訳後改変は、第２のポリペプチド鎖のＣ末端でのリシンの欠失を含む。

【0239】

本発明に関連して、生成される結合剤は、好ましくは、本明細書で説明されている１つ又は複数の免疫エフェクター機能を惹起し得る。好ましくは、前記免疫エフェクター機能は、表面上でがん関連抗原ＣＬＤＮ１８．２を持つ細胞を対象とする。

【0240】

本発明に関連する「免疫エフェクター機能」という用語は、例えば、がん増殖の阻害及び／又はがん発生の阻害（がんの播種及び転移の阻害を含む）をもたらす、免疫系の構成要素により媒介されるあらゆる機能を含む。好ましくは、免疫エフェクター機能は、がん細胞の死滅をもたらす。免疫エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、がん関連抗原を有する細胞におけるアポトーシスの誘導、がん関連抗原を有する細胞の細胞溶解、及び／又はがん関連抗原を有する細胞の増殖の阻害を含む。本明細書で説明されている結合剤は、好ましくは、ＣＤ４及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞（特にＣＤ１０７ａ＋

【0241】

Ｔ細胞）等のＴ細胞を動員して、がん細胞等の疾患関連細胞へと再指向させ得、そのため、再指向されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を介して作用し、即ち、再指向時のＴ細胞は、好ましくは、疾患関連細胞（例えばがん細胞）を死滅させる。ＣＤ１０７ａ発現は、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の細胞溶解能と関連していることが知られている。好ましくは、前記ＣＤ１０７ａ＋ Ｔ細胞は、脱顆粒し得、即ち、パーフォリン、グランザイム等の細胞傷害性分子を放出し得、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン－２（ＩＬ２）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）等の内の１つ又は複数等のサイトカインも放出し得、それにより、Ｔ細胞が本発明の結合剤により再指向される標的細胞（例えばがん細胞）が死滅する。結合剤はまた、がん細胞表面上でがん関連抗原に結合するだけで、効果を発揮する。例えば、結合剤は、がん細胞の表面上のがん関連抗原に結合するだけで、がん関連抗原の機能をブロックし得るか、又はアポトーシスを誘導し得る。

【0242】

本発明に関連する「免疫エフェクター細胞」又は「エフェクター細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用されており、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）、及び細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）を含む。「ＭＨＣ依存性Ｔ細胞」という用語、又は類似の用語は、ＭＨＣに関連して提示される場合に抗原を認識し、好ましくは、Ｔ細胞のエフェクター機能（例えば、抗原を発現する標的細胞の死滅）を発揮するＴ細胞に関する。

【0243】

Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の一群に属しており、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。これは、細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる特殊な受容体が存在することにより、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞等の他のリンパ球タイプと区別され得る。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。Ｔ細胞にはいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが明確な機能を有する。

【0244】

Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも、Ｂ細胞の形質細胞への成熟、細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化等の免疫学的プロセスにおいて、他の白血球を補助する。この細胞は、表面上でＣＤ４糖タンパク質を発現していることから、ＣＤ４＋ Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されているＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原を提示された場合に、活性化される。活性化されると、この細胞は急速に分裂し、サイトカインと呼ばれる小さいタンパク質を分泌し、活発な免疫反応を制御するか、又は補助する。

【0245】

細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及びがん細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与している。この細胞は、表面上でＣＤ８糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８＋ Ｔ細胞としても知られている。この細胞は、通常、身体のほぼ全ての細胞の表面上で存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原と結合することにより、標的を認識する。

【0246】

全てのＴ細胞は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。Ｔ細胞のＴＣＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、標的細胞の表面に提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）とも相互作用し得る。ＴＣＲの特異的結合は、Ｔ細胞内のシグナルカスケードを引き起こし、増殖、及び成熟したエフェクターＴ細胞への分化を導く。Ｔ細胞の大部分では、実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－ＴＣＲ鎖及びβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれている２本の別々のペプチド鎖で構成されている。あまり一般的ではない（Ｔ細胞全体の２％）グループのＴ細胞であるγδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面上に、１本のγ鎖及び１本のδ鎖からなる独特なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つ。

【0247】

全てのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は、胸腺に存在しており、細胞分裂により増殖して未熟な胸腺細胞を大量に生成する。最初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、従って、二重陰性（ＣＤ４－ＣＤ８－）細胞と分類される。発育が進むにつれて、二重陽性の胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）となり、最終的には、単一陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８－又はＣＤ４－ＣＤ８＋）の胸腺細胞へと成熟し、次いで胸腺から末梢組織へと放出される。

【0248】

本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現とＴ細胞受容体の非存在とにより定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。

【0249】

ヒトのＭＨＣ分子は、通常、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子と称される。ＭＨＣ分子には、クラスＩ及びクラスＩＩという２つの主要なクラスが存在している。ＭＨＣクラスＩ抗原は、身体内のほぼ全ての有核細胞で見出される。このクラスのＭＨＣ分子の主な機能は、細胞内タンパク質のペプチド断片をＣＴＬに表示（又は提示）することである。この表示に基づいて、ＣＴＬは、がん抗原等の疾患関連ペプチド（抗原）を含む、ＭＨＣ結合ペプチドを提示するものを攻撃する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、通常、細胞傷害性であり（そのため、細胞傷害性Ｔ細胞＝ＣＴＬと命名されている）、あらゆる細胞内局在のタンパク質から細胞内でプロセシングされ、ＭＨＣクラスＩ分子により細胞表面に提示される９～
１０個のアミノ酸のペプチドを認識する。そのため、ＭＨＣクラスＩ分子の表面発現は、標的細胞のＣＴＬに対する感受性の決定で重要な役割を果たす。

【0250】

本明細書で説明されている結合剤を、治療部位又は薬剤（例えば、細胞毒素、薬物（例えば免疫抑制剤）、又は放射性同位元素）に共役させ得る。細胞毒素又は細胞傷害剤には、細胞に対して有害であり、特に細胞を死滅させるあらゆる薬剤を含む。例として、下記が挙げられる：タキソール、シトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又は相同体。コンジュゲートを形成するのに適した治療薬として下記が挙げられるが、これらに限定されない：抗代謝剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、及びロムスチン（ＣＣＮＵ））、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、並びにアントラマイシン（ＡＭＣ）、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）。好ましい実施形態において、治療薬は、細胞傷害剤又は放射線毒性剤である。別の実施形態において、治療薬は、免疫抑制剤である。さらに別の実施形態において、治療薬は、ＧＭ－ＣＳＦである。好ましい実施形態において、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、又はリシンＡである。

【0251】

結合剤をまた、放射性同位元素（例えば、ヨウ素１３１、イットリウム９０、又はインジウム１１１）にコンジュゲートさせて、細胞傷害性放射性医薬品も生成し得る。

【0252】

そのような治療用部位を結合剤にコンジュゲートさせるための技術は、公知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”、ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄＥｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３－１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５），及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８（１９８２）を参照されたい。

【0253】

本発明に係る「結合」という用語は、好ましくは、特異的結合に関する。

【0254】

本発明によれば、抗体等の薬剤は、所定の標的に対する有意な親和性を有しおり、標準的なアッセイにおいて前記所定の標的に結合する場合には、前記所定の標的に結合し得る。「親和性」又は「結合親和性」は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）により測定されることが多い。好ましくは、「有意な親和性」という用語は、１０^－５Ｍ以下、１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、又は１０^－１２Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）での所定の標的への結合を指す。

【0255】

ある薬剤は、この薬剤が標的に対する有意な親和性を有しておらず、標準的なアッセイにおいて前記標的に対して有意に結合しない（特に、検出可能に結合しない）場合には、この薬剤は、前記標的に（実質的に）結合し得ない。好ましくは、この薬剤は、最大２、好ましくは１０、より好ましくは２０、特に５０、又は１００μｇ／ｍｌ以上の高い濃度で存在する場合には、前記標的に検出可能に結合しない。好ましくは、ある薬剤は、この薬剤が結合し得る所定の標的への結合に関するＫ_Ｄと比べて少なくとも１０倍、１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、又は１０^６倍高いＫ_Ｄで前記標的に結合する場合には、この薬剤は、標的に対する有意な親和性を有しない。例えば、薬剤が結合し得る標的へのこの薬剤の結合に関するＫ_Ｄが、１０^－７Ｍである場合には、この薬剤が有意な親和性を有していない標的への結合に関するＫ_Ｄは、少なくとも１０^－６Ｍ、１０^－５Ｍ、１０^－４Ｍ、１０^－３Ｍ、１０^－２Ｍ、又は１０^－１Ｍであることになる。
抗体等の結合剤は、他の標的には結合し得ないが所定の標的には結合し得る場合には、即ち、他の標的に対する有意な親和性を有しておらず、標準的なアッセイにおいて他の標的に有意に結合しない場合には、前記所定の標的に対して特異的である。本発明によれば、結合剤がＣＬＤＮ１８．２に結合し得るが他の標的には（実質的に）結合し得ない場合には、この結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に対して特異的である。好ましくは、そのような他の標的に対する親和性及び結合が、ＣＬＤＮ１８．２非関連タンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、又は非クローディン膜貫通タンパク質（例えば、ＭＨＣ分子若しくはトランスフェリン受容体）、又は任意の他の特定のポリペプチドに対する親和性又は結合を有意に超えない場合には、結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に対して特異的である。好ましくは、結合剤は、特異的ではない標的への結合に関するＫ_Ｄと比べて少なくとも１０倍、１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、又は１０^６倍低いＫ_Ｄで所定の標的に結合する場合には、前記標的に対して特異的である。例えば、特異的な標的への結合剤の結合に関するＫ_Ｄが１０^－７Ｍである場合には、特異的ではない標的への結合に関するＫ_Ｄは、少なくとも１０^－６Ｍ、１０^－５Ｍ、１０^－４Ｍ、１０^－３Ｍ、１０^－２Ｍ、又は１０^－１Ｍであることになる。

【0256】

「ｋｄ」（秒^－１）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋ_ｏｆｆ値とも称される。

【0257】

「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。

【0258】

標的への結合剤の結合を、任意の適切な方法を使用して実験的に決定し得；例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ” Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４），Ｋｕ
ｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書で説明されている方法を参照されたい。親和性を、平衡透析等の従来の技術を使用して；製造業者により概説された一般的手順を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００機器を使用することにより；放射性標識標的抗原を使用するラジオイムノアッセイにより；又は当業者に公知の別の方法により、容易に決定し得る。親和性データを、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ． ＳｃＬ，５１：６６０（１９４９）の方法により分析し得る。結合剤と抗原との間の特定の相互作用の測定された親和性は、様々な条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定された場合に変動し得る。そのため、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、Ｋ_Ｄ、ＩＣ_５０）の測定を、好ましくは、結合剤及び抗原の標準化された溶液と、標準化された緩衝液とで行なう。

【0259】

「競合する」という用語は、標的抗原への結合に関する抗体等の２種の結合剤間の競合を意味する。２種の結合剤が標的抗原への結合を互いにブロックしない場合には、そのような結合剤は、非競合的であり、このことは、前記結合剤が標的抗原の同一部分（即ちエピトープ）に結合しないことを示す。標的抗原への結合に関する結合剤の競合を試験する方法は、当業者には公知である。そのような方法の一例は、いわゆる交差競合アッセイであり、このアッセイを、例えば、ＥＬＩＳＡとして実施し得るか、又はフローサイトメトリーで実施し得る。

【0260】

例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイは、ＥＬＩＳＡプレートウェルを各結合剤でコーティングし；競合する結合剤、及び抗原／標的のＨｉｓタグ付き細胞外ドメインを添加してインキュベートすることにより実施し得、添加した結合剤がコーティングした結合剤へのＨｉｓタグ付きタンパク質の結合を阻害したかどうかを検出することを、ビオチン化抗Ｈｉｓ抗体を添加し、続いてストレプトアビジン－ポリ－ＨＲＰを添加し、ＡＢＴＳで反応をさらに現像し、４０５ｎｍでの吸光度を測定することにより実施し得る。例えば、フローサイトメトリーアッセイを、抗原／標的を発現する細胞を過剰の非標識結合剤と共にインキュベートし、この細胞を最適濃度未満のビオチン標識抗体と共にインキュベートし、続いて蛍光標識ストレプトアビジンと共にインキュベートし、フローサイトメトリーで分析することにより実施し得る。

【0261】

抗体等の２種の結合剤は、同一の抗原及び同一のエピトープに結合する場合には、「同一の特異性」を有する。そのような結合剤は、競合結合アッセイにおいて結合に関して競合することとなる。一実施形態において、同一のエピトープに結合している結合剤は、標的分子上の同一のアミノ酸に結合すると考えられる。抗体が標的抗原上の同一のエピトープに結合することを、当業者に公知の標準的なアラニンスキャニング実験又は抗体－抗原結晶化実験により決定し得る。

【0262】

結合剤の抗原への結合に関して競合する能力は、この結合剤が抗原の同一のエピトープ領域に結合してもよいし、別のエピトープに結合する場合には、その特定のエピトープ領域への結合剤の結合を立体的に阻害してもよいことを示す。競合する結合剤を、表面プラズモン共鳴分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、又はフローサイトメトリー等の標準的な結合アッセイにおいて、１種又は複数種の結合剤と競合する能力に基づいて容易に同定し得る（国際公開第２０１３／１７３２２３号パンフレットを参照されたい）。例えば、結合剤間の競合を、クロスブロッキングアッセイ（ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）により検出し得る。例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイを、マイクロタイタープレートのウェルに標的抗原をコーティングし、抗原結合剤と候補の競合試験結合剤とを添加することにより実施し得る。ウェル中の抗原に結合した抗原結合剤の量は、間接的に、例えば同一のエピトープへの結合に関してこれと競合する候補の競合試験結合剤の結合能と相関する。具体的には、同一のエピトープに対する候補の競合試験結合剤の親和性が大きいほど、抗
原でコーティングされたウェルに結合した抗原結合剤の量は少なくなる。ウェルに結合した抗原結合剤の量を、検出可能な又は測定可能な標識物質で結合剤を標識することにより測定し得る。国際公開第２０１３／１７３２２３号パンフレットで説明されているように、当該技術分野で公知であるように、（例えばＢｉａｃｏｒｅ機器を使用する）表面プラズモン共鳴分析を使用して、結合剤により認識される重複エピトープ領域と異なるエピトープ領域とを同定し得る。或いは、競合を、生体層干渉法を使用して決定し得る。

【0263】

別の結合剤（例えば、本明細書で説明されている重鎖及び軽鎖の可変領域を含む結合剤）と抗原への結合に関して競合する結合剤、又は別の結合剤（例えば、本明細書で説明されている重鎖及び軽鎖の可変領域を含む結合剤、例えば、抗体）の抗原に対する特異性を有する結合剤は、本明細書で説明されている前記重鎖及び／又は軽鎖の可変領域のバリアント（例えば、本明細書で説明されているＣＤＲの改変及び／又はある程度の同一性）を含む結合剤であり得る。

【0264】

本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。

【0265】

本明細書で使用される場合、「アイソタイプスイッチング」は、抗体のクラス又はアイソタイプが、あるＩｇクラスから他のＩｇクラスの内の１つへと変化する現象を指す。

【0266】

「天然に存在する」という用語は、物体に適用されるように本明細書で使用される場合には、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在しており、実験室で人為的に改変されていないポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。

【0267】

「再配列された」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｖセグメントが、それぞれ、本質的に完全なＶＨドメイン又はＶＬドメインをコードするコンフォメーションにおいて、Ｄ－Ｊセグメント又はＪセグメントのすぐ隣に配置されている、重鎖又は軽鎖の免疫グロブリン遺伝子座の配置を指す。再配列された免疫グロブリン（抗体）遺伝子座を、生殖細胞系列のＤＮＡとの比較により同定し得、再配列された遺伝子座は、少なくとも１つの組換えヘプタマー／ノナマー相同性エレメントを有する。

【0268】

「未再配列の」又は「生殖系列配置」という用語は、Ｖセグメントに関して本明細書で使用される場合、ＶセグメントがＤセグメント又はＪセグメントにすぐ隣接するように組み換えられていない配置を指す。

【0269】

一実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有しており、即ち、ＣＬＤＮ１８．２に存在するエピトープ（好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン（特に、第１の細胞外ループ、好ましくはＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸２９～７８位）内に位置するエピトープ）に結合する能力を有しており、好ましくは結合する。特定の実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する薬剤は、ＣＬＤＮ１８．１に存在していないＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合する。

【0270】

ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する薬剤は、好ましくは、（好ましくはヒト、マウス、及び／又はカニクイザルの）ＣＬＤＮ１８．２に結合するが（好ましくはヒト、マウス、及び／又はカニクイザルの）ＣＬＤＮ１８．１には結合しない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する薬剤は、（好ましくはヒト、マウス、及び／又はカニクイザルの）ＣＬＤＮ９には結合しない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する薬剤は、ＣＬＤＮ１８．２に対して特異的である。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する薬剤は、細胞表面上で発現されるＣＬＤＮ１８．２に結合する。特に好ま
しい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有する薬剤は、生細胞の表面上に存在するＣＬＤＮ１８．２の天然エピトープに結合する。

【0271】

「断片」という用語は、特に、重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の内の１つ又は複数（好ましくは少なくともＣＤＲ３可変領域）を指す。一実施形態において、前記相補性決定領域（ＣＤＲ）の内の１つ又は複数は、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のセットから選択される。特に好ましい実施形態において、「断片」という用語は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を指す。

【0272】

一実施形態において、本明細書で説明されている１つ若しくは複数のＣＤＲ、ＣＤＲのセット、又はＣＤＲのセットの組み合わせを含む結合ドメインは、前記ＣＤＲ及びこれらに介在するフレームワーク領域を含む。好ましくは、この部分はまた、第１及び第４のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％も含み、この５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端５０％及び第４のフレームワーク領域のＮ末端５０％である。組換えＤＮＡ技術により作製された結合剤の構築により、免疫グロブリン重鎖、他の可変領域、又はタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に本発明の可変領域を結合するためのリンカーの導入を含む、クローニング又は他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによりコードされる可変領域のＮ末端又はＣ末端への残基の導入がもたらされ得る。

【0273】

一実施形態において、本明細書で説明されている１つ若しくは複数のＣＤＲ、ＣＤＲのセット、又はＣＤＲのセットの組み合わせを含む結合ドメインは、ヒト抗体フレームワーク中の前記ＣＤＲを含む。

【0274】

ＣＤＲ領域の正確な同定は、関与するアミノ酸残基を決定するために使用される算出方法に依存する。例えば、Ｋａｂａｔ他（上記を参照されたい）によれば、可変領域は、一般に、ＶＬ中のアミノ酸残基２４～３４（ＣＤＲ１）、５０～５６（ＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＣＤＲ３）と、ＶＨ中の３１～３５（ＣＤＲ１）、５０～６５（ＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＣＤＲ３）付近とを包含し；可変領域はまた、超可変ループを形成する残基（例えば、ＶＬ中の残基２６～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）、及び９１～９６（ＣＤＲ３）、並びにＶＨ中の２６～３２（ＣＤＲ１）、５３～５５（ＣＤＲ２）、及び９６～１０１（ＣＤＲ３）も包含し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７））。

【0275】

当業者は、下記の表１に示されるように、本明細書で開示されている配列内のＣＤＲ位置の正確な特定は、使用されるナンバリングシステムに応じてわずかに異なる場合があることを理解するだろう（Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）を参照されたい）：

【0276】

【表1】

【0277】

そのため、本明細書で開示されているＣＤＲ配列は、様々なナンバリングシステムに従って誘導されるそのバリアントも含む。従って、各ＶＨの開示は、そこから誘導可能なＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の開示であり、各ＶＬの開示は、そこから誘導可能なＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の開示である。

【0278】

本明細書全体を通して、本明細書で説明されているように、ＣＤ３又はＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインの可変領域（おおよそ、軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）の残基を指す場合には、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが使用されており、ＣＨ１及びＣＨ２－ＣＨ３（任意選択的にヒンジを含む）領域に関しては、ＥＵナンバリングシステムが使用される。

【0279】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号３８、３９、及び４０からなる群から選択されるアミノ酸配列内で特定される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨを含む。より好ましくは、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号３９で表されるアミノ酸配列内で特定される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨを含む。

【0280】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号４１及び４２からなる群から選択されるアミノ酸配列内で特定される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬを含む。より好ましくは、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号４２で表されるアミノ酸配列内で特定される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0281】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、下記のセットのＣＤＲを含む：
ＶＨは、配列番号３４に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含み、及び
ＶＬは、配列番号３７に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む。

【0282】

一実施形態におおいて、ＶＨは、配列番号３２に記載されている配列若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、及び／又は配列番号３３に記載されている配列若しくはそ
の機能的バリアントを含むＣＤＲ２をさらに含み、並びに／又はＶＬは、配列番号３５に記載されている配列若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、及び／又は配列番号３６に記載されている配列若しくはその機能的バリアントを含むＣＤＲ２をさらに含む。

【0283】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、下記のセットのＣＤＲを含む：
ＶＨは、配列番号３２に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、配列番号３３に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及び配列番号３４に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含み、ＶＬは、配列番号３５に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ１、配列番号３６に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ２、及び配列番号３７に記載されている配列又はその機能的バリアントを含むＣＤＲ３を含む。好ましくは、ＶＨは、配列番号３２、３３、及び３４のＣＤＲ１、２、及び３を含み、ＶＬは、配列番号３５、３６、及び３７のＣＤＲ１、２、及び３を含む。

【0284】

一実施形態において、前記重鎖及び軽鎖の可変領域は、フレームワーク領域内に散在している前記相補性決定領域を含む。一実施形態において、各可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、２、及び３）、並びに４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、２、３、及び４）を含む。一実施形態において、前記相補性決定領域及び前記フレームワーク領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へと、下記の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

【0285】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号３８、３９、４０からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）を含み、好ましくは配列番号３９で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。

【0286】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号４１、４２からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含み、好ましくは配列番号４２で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。

【0287】

一実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、下記の組み合わせのＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。
一実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、下記の組み合わせのＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。

【0288】

特に好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、下記の組み合わせのＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む：
ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含み、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列又
はその機能的バリアントを含む。

【0289】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤内に存在するＶＨドメイン及びＶＬドメインのフレームワーク領域は、アミノ酸の変化を含み得るが、ヒト生殖細胞系列配列との少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を保持する。

【0290】

さらなる実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域であって、（ｉ）上述した重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗体とＣＬＤＮ１８．２結合に関して競合し、並びに／又は（ｉｉ）上述した重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗体のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を含む。

【0291】

一実施形態において、本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する結合ドメインは、本明細書で説明されているＦａｂ分子のフォーマットを有する。この実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、第１のポリペプチド鎖等のあるポリペプチド鎖の一部であり、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、本発明の結合剤の第３のポリペプチド鎖等の別のポリペプチド鎖の一部である。一実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）は、本明細書で説明されている第１及び第２のポリペプチド鎖の一部であり、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）は、第３のポリペプチド鎖、及び本発明の結合剤の第３のポリペプチド鎖と同一の第４のポリペプチド鎖の一部である。

【0292】

Ｆａｂ２－ｓｃＦｖフォーマットでの本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に結合する結合ドメインは、同一であってもよいし、本質的に同一であってもよいし、異なっていてもよく、そのため、ＣＬＤＮ１８．２の同一の若しくは本質的に同一のエピトープ、又は異なるエピトープに結合し得ることを理解されたい。そのため、Ｆａｂ２－ｓｃＦｖフォーマットでの本発明の結合剤のＣＬＤＮ１８．２に結合する両方の結合ドメインは、本明細書で説明されているＣＬＤＮ１８．２に結合する結合ドメインの内の１つに対応していてもよいし、本質的に対応していてもよいか、又はこれらは、本明細書で説明されているＣＬＤＮ１８．２に結合する結合ドメインから独立して選択されてもよい。

【0293】

一般に、当該技術分野で公知の任意のＣＤ３結合ドメイン又はその断片は、本発明の結合剤で使用され得る（例えば、抗ＣＤ３抗体のＣＤ３結合ドメイン）。本発明に係る結合剤を提供するのに有用な抗ＣＤ３抗体として、ＵＣＨＴ１－ＨＳ（ヒト化ｍＡｂ）、ＵＣＨＴ１－ＭＭ（マウスｍＡｂ）、ＣＬＢ－Ｔ３、ＴＲ６６、１４５－２Ｃ１１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0294】

ＵＣＨＴ１は、ヒト及び霊長類のサンプルタイプ中のＣＤ３を検出するモノクローナルＩｇＧ１抗ＣＤ３抗体である。ＣＬＢ－Ｔ３は、ＣＤ３抗原に対するマウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体であり、８０－９０％のヒト末梢Ｔリンパ球及び髄質胸腺細胞と反応する。ＴＲ６６は、ヒトＣＤ３のイプシロン鎖を認識するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗ＣＤ３抗体である。１４５－２Ｃ１１は、アルメニアンハムスターモノクローナル抗マウスＣＤ３抗体である。

【0295】

好ましくは、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ネイティブな立体配置でＴＣＲを発現する活性化初代ヒトＴ細胞上に存在する他のＴＣＲサブユニットと関連してヒトＣＤ３を特異的に認識し得る抗体／抗体分子及び抗体様分子に由来する。ＣＤ３－イプシロン鎖に特異的な抗体に由来するＶＨドメイン及びＶＬドメインが最も好ましく、前記（親）抗体は、ＴＣＲ複合体と関連して提示されるヒトＣＤ３のネイティブな若しくはネイティブに近い構造又は立体配座のエピトープを反映するエピトープに特異的に結合可能であるべきである。本発明の一実施形態において、Ｃ
Ｄ３に対する特異性を有する結合ドメインのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ＵＣＨＴ１－ＨＳ、ＵＣＨＴ１－ＭＭ、ＣＬＢ－Ｔ３、及びＴＲ６６からなる群から選択されるＣＤ３特異的抗体に由来する。

【0296】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号５４、５８、６１、６４、６７、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列内で特定されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨを含む。

【0297】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、下記の実施形態（ｉ）～（ｖｉ）から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のセットを含むＶＨを含む：
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４５又はその機能的バリアント、
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号５０又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４５又はその機能的バリアント、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号５１又はその機能的バリアント、
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号５２又はその機能的バリアント、
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号５３又はその機能的バリアント、及び
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号４９又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４５又はその機能的バリアント。

【0298】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号５５に従うアミノ酸配列内で特定されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

【0299】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、下記のセットのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む：
ＣＤＲ１：配列番号４６又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４７又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４８又はその機能的バリアント。

【0300】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、下記の実施形態（ｉ）～（ｖｉ）から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のセットをそれぞれ含むＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む：
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４５又はその機能的バリアント、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４６又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４７又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４８又はその機能的バリアント、
（ｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号５０又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４５又はその機能的バリアント、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４６又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４７又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４８又はその機能的バリアント、
（ｉｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号５１又はその機能的バリアント、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４６又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４７又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４８又はその機能的バリアント、
（ｉｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号５２又はその機能的バリアント、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４６又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４７又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４８又はその機能的バリアント、
（ｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４３又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号５３又はその機能的バリアント、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４６又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４７又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４８又はその機能的バリアント、及び
（ｖｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４９又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４４又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４５又はその機能的バリアント、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４６又はその機能的バリアント、ＣＤＲ２：配列番号４７又はその機能的バリアント、ＣＤＲ３：配列番号４８又はその機能的バリアント。

【0301】

好ましい実施形態において、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、下記の実施形態（ｉ）～（ｖｉ）から選択されるＶＨ及びＶＬを含む：
（ｉ）ＶＨは、配列番号５４に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号５８に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号６１に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｖ）ＶＨは、配列番号６４に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｖ）ＶＨは、配列番号６７に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、及び
（ｖｉ）ＶＨは、配列番号７０に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。

【0302】

一実施形態において、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号５６、５７、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６８、６９、７１、及び７２からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。当然のことながら、前記配列に含まれるｓｃＦｖリンカーは、任意の他のｓｃＦｖリンカーに置き換えられ得、例えば、配列番号２～２０からなる群から選択されるｓｃＦｖリンカー又はその機能的バリアントに置き換えられ得る。

【0303】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号５４、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0304】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、配列番号５５に記載されているアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むＶＬを含む。

【0305】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤のＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインは、下記の実施形態（ｉ）～（ｉｉｉ）から選択されるＶＨ及びＶＬを含む：
（ｉ）ＶＨは、配列番号５４に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、
又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、
（ｉｉ）ＶＨは、配列番号５８に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、及び
（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号６１に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなり、ＶＬは、配列番号５５に従うアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。

【0306】

いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインを含む結合剤は、ＣＤ３に高親和性で結合し、即ち、強力なＣＤ３結合剤である（例えば、配列番号５６若しくは５７；又は配列番号５４、又はそこで特定されるＣＤＲ１、２、及び３、並びに５５、又はそこで特定されるＣＤＲ１、２、及び３を含む結合剤）。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインを含む結合剤は、ＣＤ３に中程度の親和性で結合し、即ち、中程度のＣＤ３結合剤である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインを含む結合剤は、ＣＤ３に低親和性で結合し、即ち、低ＣＤ３結合剤である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対する結合親和性が高いほど、ＲＴＣＣが増強される。一実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２への２価の結合は、１価の結合と比較してＲＴＣＣを増強する。

【0307】

ある特定の実施形態において、本明細書で説明されているように、本発明の結合剤の１本又は複数本のポリペプチド鎖は、ＣＨ１を含む。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖は、ＣＨ１を含む。別の好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第１及び第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１を含む。好ましくは、本発明の結合剤の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ１は、ＩｇＧに由来しており、好ましくはＩｇＧ１に由来しており、より好ましくはヒトＩｇＧ１に由来している。ある特定の実施形態において、本発明の結合剤の１本又は複数本のポリペプチド鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。好ましくは、本発明の結合剤の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧに由来しており、好ましくはＩｇＧ１に由来しており、より好ましくはヒトＩｇＧ１に由来している。好ましい実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ＶＨ（ＣＤ３）及びＶＬ（ＣＤ３）を含む本発明の結合剤の第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ２及びＣＨ３を含み、前記ドメインは、好ましくは、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、例えばヒトＩｇＧ１）に由来している。別の好ましい実施形態において、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、ＶＨ（ＣＤ３）、及びＶＬ（ＣＤ３）を含む本発明の結合剤の第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、前記ドメインは、好ましくは、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、例えばヒトＩｇＧ１）に由来している。

【0308】

ある特定の実施形態において、ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む第３及び任意選択的な第４のポリペプチド鎖等の本発明の結合剤のポリペプチド鎖は、Ｉｇκ又はＩｇλ（好ましくはＩｇκ、より好ましくはヒトＩｇκ）由来のＣＬ等のＣＬを含む。

【0309】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖は、配列番号２８で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第２のポリペプチド鎖は、配列番号２９若しくは３０で表されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含む。好ましい実施形態において、結合剤の第３及び任意選択的な第４のポリペプチド鎖は、配列番号３１で表されるアミノ酸配列又はその機
能的バリアントを含む。

【0310】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤は、下記の実施形態：
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号２８又はその機能的バリアントを含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２９又はその機能的バリアントを含み、及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号３１又はその機能的バリアントを含むか、又は
（ｉｉ）第１のポリペプチド鎖は、配列番号２８又はその機能的バリアントを含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号３０又はその機能的バリアントを含み、及び第３のポリペプチド鎖は、配列番号３１又はその機能的バリアントを含む
から選択されるアミノ酸配列を含む第１、第２、第３、及び任意選択的な第４のポリペプチド鎖を含み、
第４のポリペプチド鎖は、存在する場合には、第３のポリペプチド鎖と同一である。

【0311】

好ましい実施形態において、本発明の結合剤は、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３に記載されているアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第２のポリペプチド鎖は、配列番号７５に記載されているアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８に記載されているアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインとを含む本発明の結合剤は、配列番号７３、７５、及び７８の第１、第２、及び第３ポリペプチド鎖のセット、又はその機能的バリアントを含む。

【0312】

別の好ましい実施形態において、本発明の結合体は、ＣＬＮ１８．２に対する特異性を有する少なくとも２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第１のポリペプチド鎖は、配列番号７３に記載されているアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第２のポリペプチド鎖は、配列番号７４、７６、及び７７からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。好ましい実施形態において、本発明の結合剤の第３のポリペプチド鎖は、配列番号７８に記載されているアミノ酸配列又はその機能的バリアントを含むか、又はからなる。好ましい実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する少なくとも２つの結合ドメインと、ＣＤ３に対する特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインとを含む本発明の結合剤は、配列番号（ｉ）７３、７４、及び７８；（ｉｉ）７３、７６、及び７８；（ｉｉｉ）７３、７７、及び７８、又はこれらの機能的バリアントからなる群から選択される第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖のセットを含み、第４の結合ドメインは、第３の結合ドメインと同一である。

【0313】

本明細書で説明されている結合剤は、この薬剤をコードするＲＮＡ等の核酸を投与することにより、及び／又はこの薬剤をコードするＲＮＡ等の核酸を含む宿主細胞を投与することにより、患者に送達され得ることを理解されたい。結合剤が複数本のポリペプチド鎖を含む場合には、異なるポリペプチド鎖は、同一の核酸でコードされてもよいし、異なる核酸（例えば、核酸のセット）でコードされてもよい。そのため、投与される核酸は、核酸のセット等の様々な核酸分子の混合物であってもよい。結合剤をコードする核酸又は核酸のセットは、例えば、患者等の対象に投与される場合には、裸の形態で存在していてもよいし、リポソーム、又はナノ粒子、又はウイルス粒子の形態等の適切な送達ビヒクル中に存在していてもよいし、宿主細胞内に存在していてもよい。提供される核酸又は核酸の
セットは、治療用抗体で少なくとも部分的に観察される不安定性を軽減する持続的な方法で、長期にわたり薬剤を産生し得る。患者に送達される核酸又は核酸のセットを、組換え手段により産生し得る。核酸又は核酸のセットは、宿主細胞内に存在することなく患者に投与される場合には、好ましくは、この核酸によりコードされる結合剤の発現のために患者の細胞に取り込まれる。核酸又は核酸のセットは、宿主細胞内に存在しつつ患者に投与される場合には、好ましくは、この核酸によりコードされる結合剤を産生するように、患者内の宿主細胞により発現される。

【0314】

本発明に関連する「組換え」という用語は、「遺伝子操作により作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明に関連する組換え核酸等の「組換え体」は、天然には存在していない。

【0315】

「天然に存在する」という用語は、本明細書で使用される場合、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）内に存在しており、自然界の供給源から単離され得、実験室で人為的に改変されていないペプチド又は核酸は、天然に存在している。

【0316】

「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むことが意図されており、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより産生された分子、及び化学的に合成された分子を含むことが意図されている。核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。ＲＮＡは、インビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）又は合成ＲＮＡを含む。

【0317】

核酸又は核酸のセットは、ベクターに含まれ得る。核酸のセットはまた、この核酸のセットの各核酸がベクターに含まれるように、ベクターのセットにも含まれ得る。「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者に公知のあらゆるベクターを含み、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えば、ラムダファージ、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター、又は人工染色体ベクター、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）を含む。前記ベクターとして、発現ベクター及びクローニングベクターが挙げられる。発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列、及び特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、若しくは哺乳類）又はインビトロでの発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般に、ある特定の所望のＤＮＡ断片を操作して増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いている場合がある。

【0318】

本発明に関連して、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に又は実質的にリボヌクレオチド残基で構成されている分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位で水酸基を有するヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ等の単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより産生されたＲＮＡ、及び１つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変により、天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。そのような改変として、例えば、ＲＮＡの末端又は内部に、例えばＲＮＡの１つ又は複数のヌクレオチドで、非ヌクレオチド物質の付加が挙げられ得る。ＲＮＡ分子のヌクレオチドはまた、非標準ヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチド、又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドも含み得る。この改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。

【0319】

本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味する「ｍ
ＲＮＡ」を含み、好ましくはこれに関し、テンプレートとしてＤＮＡを使用して産生されてよく、ペプチド又はタンパク質をコードする「転写物」に関連する。ｍＲＮＡは、典型的には、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、タンパク質又はペプチドをコードする領域、及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは、細胞内及びインビトロでの半減期が限られている。好ましくは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートを使用するインビトロでの転写により産生される。本発明の一実施形態において、ＲＮＡは、インビトロでの転写又は化学合成により得られる。インビトロでの転写の方法論は、当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。

【0320】

本発明の一実施形態において、ＲＮＡは、一本鎖の自己複製ＲＮＡ等の自己複製ＲＮＡである。一実施形態において、自己複製ＲＮＡは、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡである。一実施形態において、自己複製ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ、又はウイルスＲＮＡ由来のＲＮＡである。一実施形態において、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスゲノムＲＮＡであるか、又はアルファウイルスゲノムＲＮＡに由来する。アルファウイルスＲＮＡは、当該技術分野で公知であるように、ｍＲＮＡとして作用し得る。一実施形態において、自己複製ＲＮＡは、ウイルス遺伝子発現ベクターである。一実施形態において、ウイルスは、セムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）である。一実施形態において、自己複製ＲＮＡは、１つ又は複数の導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子の少なくとも１つは、本明細書で説明されている結合剤をコードする。一実施形態において、ＲＮＡが、ウイルスＲＮＡであるか、又はウイルスＲＮＡに由来する場合には、導入遺伝子は、構造タンパク質をコードするウイルス配列等のウイルス配列を部分的に又は完全に置き換え得る。一実施形態において、自己複製ＲＮＡは、インビトロで転写されたＲＮＡである。

【0321】

本発明に従って使用されるＲＮＡの発現及び／又は安定性を増加させるために、好ましくは、発現されるペプチド又はタンパク質の配列を変更することなく、改変させ得る。

【0322】

本発明に従って使用されるＲＮＡに関連する「改変」という用語は、前記ＲＮＡに天然には存在しないＲＮＡのあらゆる改変を含む。

【0323】

本発明の一実施形態において、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップされていない５’－三リン酸を有していない。そのようなキャップされていない５’－三リン酸の除去を、ＲＮＡをホスファターゼで処理することにより達成し得る。

【0324】

本発明に係るＲＮＡは、その安定性を高め、並びに／又は細胞毒性及び／若しくは免疫原性を低下させるために、天然に存在するか又は合成の改変リボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施形態において、本発明に従って使用されるＲＮＡでは、５－メチルシチジンは、一部が又は完全にシチジンに置換されており、好ましくは完全にシチジンに置換されている。或いは、又は加えて、一実施形態において、本発明に従って使用されるＲＮＡでは、プソイドウリジンは、一部が又は完全にウリジンに置換されており、好ましくは完全にウリジンに置換されている。

【0325】

一実施形態において、「改変」という用語は、ＲＮＡに５’－キャップ又は５’－キャップ類似体を付与することに関する。「５－キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端で見出されるキャップ構造を指しており、一般に、独特な５’－５’－三リン酸連結を介してｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態において、このグアノシンは、７位でメチル化されている。「従来の５’－キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡの５’－キャップを指しており、好ましくは７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明に関連して、「５’－キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似しており、好ましくはインビボで及び／又は細胞内で、結合し
た場合にＲＮＡを安定化させる能力を有するように改変されている５’－キャップ類似体を含む。

【0326】

ＲＮＡに５’－キャップ又は５’－キャップ類似体を付与することは、前記５’－キャップ又は５’－キャップ類似体の存在下でのＤＮＡテンプレートのインビトロでの転写により達成され得、前記５’－キャップは、生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれるか、又はＲＮＡは、例えば、インビトロでの転写により生成され得、５’－キャップは、キャッピング酵素（例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素）を使用して、転写後にＲＮＡに結合され得る。

【0327】

ＲＮＡは、さらなる改変を含み得る。例えば、本発明で使用されるＲＮＡのさらなる改変は、天然に存在するポリ（Ａ）テイルの伸長若しくは短縮化であり得るか、又は５’－若しくは３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の変更（例えば、前記ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入、例えば、グロビン遺伝子（例えば、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビン、ベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロブリン、より好ましくはヒトベータ－グロビン）由来の３’－ＵＴＲの１つ若しくは複数（好ましくは２つ）のコピーの挿入）であり得る。

【0328】

従って、本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性及び／又は発現を増加させるために、このＲＮＡを、好ましくは１０～５００個、より好ましくは３０～３００個、さらにより好ましくは６５～２００個、特に１００～１５０個のアデノシン残基の長さを有するポリＡ配列と共に存在するように改変し得る。特に好ましい実施形態において、ポリＡ配列は、約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。加えて、ＲＮＡ分子の３’－非翻訳領域に２つ以上の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）を組み込むことにより、翻訳効率が向上し得る。特定の一実施形態において、３’－ＵＴＲは、ヒトβ－グロビン遺伝子に由来する。

【0329】

好ましくは、ＲＮＡは、細胞（特に、インビボで存在する細胞）に送達される（即ちトランスフェクトされる）場合には、これがコードするタンパク質、ペプチド、又は抗原が発現される。

【0330】

「トランスフェクション」という用語は、核酸（特にＲＮＡ）の細胞への導入に関する。本発明の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、核酸の細胞への導入、又はそのような細胞による核酸の取り込みも含み、この細胞は、対象（例えば患者）中に存在し得る。そのため、本発明によれば、本明細書で説明されている核酸のトランスフェクション用の細胞は、インビトロ又はインビボで存在し得、例えば、この細胞は、患者の臓器、組織、及び／又は器官の一部を形成し得る。本発明によれば、トランスフェクションは、一過性であり得るか、又は安定であり得る。トランスフェクションの用途によっては、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性に発現されるだけでも十分である。トランスフェクションプロセスで導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないことから、この外来核酸は、有糸分裂により希釈されるか、又は分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が細胞及びその娘細胞のゲノムに実際に残ることが望まれる場合には、安定したトランスフェクションが起こらなければならない。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、コードされたタンパク質を一過性に発現させ得る。

【0331】

ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、又は数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明に関連して、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性を示す。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現期間」に影響を及ぼす場合がある。半減期が長いＲＮＡは長期間にわたり発現されることが予想され得る。

【0332】

本発明に関連して、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝コードがＲＮＡに転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡは、タンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は、「インビトロでの転写」を含み、「インビトロでの転写」という用語は、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）がインビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、転写産物の生成には、クローニングベクターが適用される。このクローニングベクターは、一般に、転写ベクターと呼ばれており、本発明に従って、「ベクター」という用語に包含される。

【0333】

本発明に係る「翻訳」という用語は、細胞のリボソームにおける、メッセンジャーＲＮＡの鎖がアミノ酸の配列の構築を指示してペプチド又はタンパク質を作るプロセスに関する。

【0334】

「発現」という用語は、最も一般的な意味で本発明に従って使用され、例えば、転写及び／又は翻訳によるＲＮＡ及び／又はペプチド若しくはタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関しては、「発現」又は「翻訳」という用語は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。また、この用語は、核酸の部分発現も含む。さらに、発現は、一過性であり得るか、又は安定であり得る。本発明によれば、発現という用語はまた、「異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）発現」又は「異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）発現」も含む。

【0335】

「異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）発現」又は「異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）発現」は、本発明に従って、発現が、基準（例えば、ある特定のタンパク質（例えば腫瘍抗原）の異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）発現又は異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）発現に関連する疾患を有していない対象における状態）と比較して変化しており、好ましくは増加していることを意味する。発現の増加とは、少なくとも１０％、特に、少なくとも２０％、少なくとも５０％、若しくは少なくとも１００％、又はより多い増加を指す。一実施形態において、発現は疾患組織でのみ見出されており、健康な組織での発現は抑制されている。
「特異的に発現される」という用語は、タンパク質が本質的に特定の組織又は臓器でのみ発現されることを意味する。例えば、胃粘膜で特異的に発現される腫瘍抗原は、前記タンパク質が主に胃粘膜で発現されて他の組織では発現されないか又は他の組織若しくは他の臓器型では有意な程度まで発現されないことを意味する。そのため、胃粘膜の細胞のみで現され、精巣等のあらゆる他の組織では有意に低い程度まで発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞で特異的に発現される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はまた、正常な条件下で、複数種の組織型又は臓器（例えば、２又は３種の組織型又は臓器）で特異的に発現され得るが、好ましくは、３種以下の異なる組織型又は臓器型で発現され得る。この場合には、次いで、腫瘍抗原は、これらの臓器で特異的に発現される。例えば、腫瘍抗原が、正常条件下で、好ましくは肺及び胃でほぼ同程度まで発現されている場合には、前記腫瘍抗原は、肺及び胃で特異的に発現されている。

【0336】

本発明によれば、「コードするＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡが、適切な環境（好ましくは細胞内）で存在する場合には、発現されて、このＲＮＡがコードするタンパク質又はペプチドが産生され得ることを意味する。

【0337】

本発明のいくつかの態様は、本明細書で説明されている結合剤をコードするＲＮＡ等の核酸によりインビトロでトランスフェクトされ、好ましくは、低い前駆体頻度から臨床的に適切な細胞数までのエクスビボでの拡大後に患者等のレシピエントに移入される宿主細胞の養子移入に依存している。本発明に係る処置に使用される宿主細胞は、処置されるレシピエントに対して自家であってもよいし、同種であってもよいし、同系であってもよい。

【0338】

「自家」という用語は、同一対象に由来するものを説明するために使用される。例えば、「自家移植」は、同一対象に由来する組織又は臓器の移植を指す。そのような手順は、有利であり、なぜならば、他の手段では拒絶反応を引き起こす免疫学的障壁が克服されるからである。

【0339】

「同種」という用語は、同一種の異なる個体に由来するものを説明するために使用される。１つ又は複数の遺伝子座での遺伝子が同一ではない場合には、２つ以上の個体は、互いに同種であると言われる。

【0340】

「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体又は組織（即ち、一卵性双生児若しくは同系交配系統の動物、又はこれらの組織）に由来するものを説明するために使用される。

【0341】

「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを説明するために使用される。例として、ある個体の骨髄の別の個体への移植は、異種移植を構成する。異種遺伝子とは、対象以外の供給源に由来する遺伝子のことである。

【0342】

本発明に係る「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、ペプチド結合により共有結合的に連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは９個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、及び好ましくは最大８、１０、２０、３０、４０、又は５０個、特に１００個のアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチドを指しており、好ましくは、１００個超のアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同義語であり、本明細書では互換的に使用される。

【0343】

特定のアミノ酸配列（例えば、配列表に示されるアミノ酸配列）に関して本明細書で付与される教示は、前記特定の配列と機能的に等価な配列（例えば、特定のアミノ酸配列と同一の又は類似の特性を示すアミノ酸配列）をもたらす、前記特定の配列のバリアントにも関連するように解釈されるべきである。重要な１つの特性は、標的への結合を保持すること、又はエフェクター機能を維持することである。好ましくは、特定の配列に関してバリアントである配列は、抗体中の特定の配列を置き換える場合には、ＣＬＤＮ１８．２及び／又はＣＤ３に対する前記抗体の結合を保持しており、好ましくは、本明細書で説明されている前記抗体の機能を保持する。さらに、好ましくは、特定の配列に関してバリアントである配列は、結合剤中の特定の配列を置き換える場合には、ＣＬＤＮ１８．２及び／又はＣＤ３への前記結合剤の結合を保持しており、好ましくは、本明細書で説明されている前記結合剤の機能（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞媒介性溶解）を保持する。

【0344】

例えば、配列表に示されている配列は、特に、システイン残基を、システイン以外のアミノ酸（好ましくは、セリン、アラニン、スレオニン、グリシン、チロシン、トリプトファン、ロイシン、又はメチオニンに置き換えることにより、１つ又は複数、好ましくは全ての遊離システイン残基を除去するように改変され得る。

【0345】

特に、ＣＤＲ、超可変領域、及び可変領域の配列は、ＣＬＤＮ１８．２及び／又はＣＤ３に結合する能力を失うことなく改変され得ることを、当業者には理解されるだろう。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書で規定される領域と同一であるか、又は高度に相同である。「高度に相同」とは、ＣＤＲ中に、１～５個、好ましくは１～４個、例えば１～３個、又は１若しくは２個の置換が行なわれ得ることが企図される。加えて、超可変領域及び可変領域は、本明細書で具体的に開示されている領域と実質的な相同性を示すように改変され得る。一実施形態において、可変領域配列は、本明細書で具体的に開示されている可変
領域配列から、フレームワーク配列においてのみ逸脱している。

【0346】

本発明の結合剤は、細胞内（例えば、細胞質ゾル内、ペリプラズマ内、若しくは封入体内）で産生され、次いで宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得るか；又は細胞外（例えば、宿主細胞が培養されている培地内）で産生され、次いで培養培地から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。ポリペプチドの組換え製造に使用される方法及び試薬（例えば、特定の好適な発現ベクター、形質転換又はトランスフェクション方法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導方法、培養条件等）は、当該技術分野で公知である。同様に、タンパク質の単離及び精製技術は、当業者に公知である。

【0347】

「細胞」又は「宿主細胞」という用語は、好ましくは、インタクトな細胞に関し、即ち、酵素、オルガネラ、又は遺伝物質等の通常の細胞内成分を放出していないインタクトな膜を有する細胞に関する。インタクトな細胞とは、好ましくは、生細胞のことであり、即ち、通常の代謝機能を実行可能な生細胞のことである。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外来性核酸でトランスフェクトされ得るあらゆる細胞に関する。好ましくは、この細胞は、外来性核酸でトランスフェクトされてレシピエントに移植された場合には、レシピエント中で核酸を発現し得る。「細胞」という用語は、細菌細胞を含み；他の有用な細胞は、酵母細胞、真菌細胞、又は哺乳類細胞である。好適な細菌細胞として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）等のグラム陰性細菌株由来の細胞、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）等のグラム陽性細菌株由来の細胞が挙げられる。好適な真菌細胞として、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種由来の細胞が挙げられる。適切な酵母細胞として、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））、並びにハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種由来の細胞が挙げられる。好適な哺乳類細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３ＨＥＫ細胞等が挙げられる。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び異種タンパク質の発現に当該技術分野で使用される他の細胞も、同様に使用され得る。哺乳類細胞（例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、及び霊長類の細胞）は、養子移入に特に好ましい。細胞は、多くの組織型に由来し得、免疫系の細胞（特に、樹状細胞及びＴ細胞等の抗原提示細胞、造血幹細胞及び間葉系幹細胞等の幹細胞、並びに他の細胞型）等の初代細胞及び細胞株を含む。抗原提示細胞は、表面で主要組織適合性複合体に関連する抗原を提示する細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの複合体を認識し得る。

【0348】

「減少」、「低下」、又は「阻害」は、本明細書で使用される場合、全体的な減少、又は細胞のレベル（例えば、発現レベル若しくは増殖レベル）において、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。

【0349】

「増加」又は「増強」等の用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、最も好
ましくは少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約５００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約１００００％の増加若しくは増強、又はさらに大きい増加若しくは増強に関する。

【0350】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
ＡＤＣＣは、本明細書で説明されているエフェクター細胞（特にリンパ球）細胞死滅能力を説明しており、この能力は、好ましくは、抗体により標識された標的細胞を必要とする。

【0351】

ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合することで生じる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリが同定されており、特定の細胞集団が、定義されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示及び腫瘍指向性Ｔ細胞応答の誘導につながる様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘導するための機序と見なされ得る。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボでの誘導は、腫瘍指向性Ｔ細胞応答及び宿主由来の抗体応答をもたらす。

【0352】

抗体依存性細胞媒介性食作用
ＡＤＣＰは、多くの抗体療法の１つの作用機序である。これは、抗体は、そのＦｃドメインを食細胞上の特定の受容体に接続させ、食作用を誘発することにより、結合した標的を除去する、高度に制御されたプロセスとして定義される。ＡＤＣＰは、マクロファージ上のＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）が主要な経路を表す、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及びＦｃγＲＩＩＩａを介して、単球、マクロファージ、好中球、及び樹状細胞により媒介され得る。

【0353】

ＡＤＣＰは、好ましくは、ＦｃγＲを発現する非特異的食細胞が、腫瘍細胞を含む疾患細胞等の標的細胞に結合した抗体を認識した場合に起こり、その後、腫瘍細胞を含む疾患細胞等の標的細胞の食作用が引き起こされる。ＡＤＣＰはまた、抗原提示を促進するか又は炎症性メディエータの分泌を刺激することにより、下流の適応免疫応答も刺激する。ＡＤＣＰは、免疫調節剤との同時処置により、インビボで改善され得る。ＡＤＣＰのＦｃ受容体依存的な機能は、ウイルス及びウイルス感染細胞のクリアランスのための機序を提供し、さらには、抗原提示を促進するか又は炎症性メディエータの分泌を刺激することにより下流の適応免疫応答を刺激するための機序も提供する。

【0354】

補体依存性細胞傷害
ＣＤＣは、抗体により誘導され得るさらに別の細胞死滅方法である。ＩｇＭは、補体活性化に最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３はまた、古典的補体活性化経路を介したＣＤＣの誘導でも非常に有効である。好ましくは、このカスケードでは、抗原抗体複合体の形成により、ＩｇＧ分子等の参加抗体分子のＣ_Ｈ２ドメイン上の近接した複数のＣ１ｑ結合部位が暴露される（Ｃ１ｑは、補体Ｃ１の３つのサブコンポーネントの内の１つである）。好ましくは、これらの暴露されたＣ１ｑ結合部位は、それまで低親和性のＣ１ｑ－ＩｇＧ相互作用を高親和性に変換し、これにより、一連の他の補体タンパク質が関与する一連の事象が引き起こされ、エフェクター細胞の走化性／活性化因子Ｃ３ａ及びＣ５ａのタンパク質分解放出が引き起こされる。好ましくは、補体カスケードは、膜攻撃複合体の形成で終わり、これにより、細胞膜にポアが形成され、水及び溶質の細胞の内外への自由な通過が促進される。

【0355】

本明細書で説明されている結合剤及び抗体を、従来のモノクローナル抗体方法論（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術）等の様々な技術により製造し得る。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原理的には、モノクローナル抗体を製
造するための他の技術を利用し得、例えば、Ｂリンパ球のウイルス形質転換若しくは発がん性形質転換、又は抗体遺伝子のライブラリを使用するファージディスプレイ技術を利用し得る。

【0356】

モノクローナル抗体等のモノクローナル結合剤を分泌するハイブリドーマの調製に好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常によく確立された手順である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコル及び技術は、当該技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、ネズミ骨髄腫細胞）及び融合手順も、公知である。モノクローナル抗体等のモノクローナル結合剤を分泌するハイブリドーマの調製に好ましい他の動物系は、ラット及びウサギ系である（例えば、Ｓｐｉｅｋｅｒ－Ｐｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３４８（１９９５）で説明されており、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照されたい）。

【0357】

さらに別の好ましい実施形態において、ヒト抗体等のヒト結合剤を、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックマウス又はトランス染色体マウスを使用して生成し得る。これらのトランスジェニックマウス及びトランス染色体マウスは、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスとして公知のマウスを含み、本明細書では総称して「トランスジェニックマウス」と称される。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体等のヒト結合剤の産生を、国際公開第２００４０３５６０７号パンフレットにおいてＣＤ２０に関して詳述されているように実施し得る。

【0358】

モノクローナル抗体等のモノクローナル結合剤を生成するためのさらに別の戦略は、特異性が規定された結合剤を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することである（例えば、Ｂａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｇｅｎｔｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓを参照されたい）。組換え結合剤操作の詳細に関しては、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ ａｎｄ Ｋｒａｕｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ＩＳＢＮ－０－８９６０３－９１８－８及びＢｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＩＳＢＮ １－５８８２９－０９２－１も参照されたい。

【0359】

抗体を生成するために、マウスを、説明されているように、抗原配列（即ち、抗体に対する配列）に由来するキャリア結合ペプチド、組換え発現抗原若しくはその断片の富化調製物、及び／又は抗原を発現する細胞で免疫化し得る。或いは、抗原又はその断片をコードするＤＮＡでマウスを免疫化し得る。抗原の精製調製物又は富化調製物を使用する免疫化により抗体が得られない場合では、マウスをまた、抗原を発現する細胞（例えば細胞株）で免疫化して、免疫応答を促進し得る。免疫応答を、尾静脈又は後眼窩出血により得られる血漿サンプル及び血清サンプルにより、免疫化プロトコルの経過にわたりモニタリングし得る。免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを、融合に使用し得る。マウスを、屠殺して脾臓を摘出する３日前に、抗原発現細胞を腹腔内又は静脈内にブーストして、特異的抗体分泌ハイブリドーマの割合を増加させ得る。

【0360】

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫化マウスから脾細胞及びリンパ節細胞を単離して、マウス骨髄腫細胞株等の適切な不死化細胞株と融合させ得る。次いで、得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングし得る。次いで、個々のウェルを、抗体分泌ハイブリドーマに関してＥＬＩＳＡでス
クリーニングし得る。抗原発現細胞を使用する免疫蛍光法及びＦＡＣＳ分析により、抗原に対する特異性を有する抗体を同定し得る。抗体を分泌するハイブリドーマを、再播種し、再度スクリーニングし、それでもモノクローナル抗体に関して陽性である場合には、限界希釈によりサブクローニングし得る。安定したサブクローンを、インビボで培養して、キャラクタリゼーションのために組織培養培地中で抗体を生成し得る。

【0361】

抗体等の結合剤はまた、例えば、当該技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマでも産生され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。

【0362】

例えば、一実施形態において、目的の遺伝子（例えば抗体遺伝子）を、例えば、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット、同第８９／０１０３６号パンフレット、欧州特許第３３８８４１号明細書で開示されているＧＳ遺伝子発現系、又は当該技術分野で公知の他の発現系により使用される真核生物発現プラスミド等の発現ベクターにライゲートさせ得る。クローニングされた抗体遺伝子を有する精製プラスミドを、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、若しくはＨＥＫ２９３細胞等の真核宿主細胞、或いは植物由来細胞、真菌細胞、若しくは酵母細胞のような他の真核細胞に導入し得る。この遺伝子を導入するために使用される方法は、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リポフェクタミン等の当該技術分野で説明されている方法であり得る。この抗体遺伝子の宿主細胞への導入後、この抗体を発現する細胞を同定して選択し得る。この細胞は、発現レベルを増幅し、抗体を産生するためにスケールアップし得るトランスフェクトーマを表す。組換え抗体を、この培養上清及び／又は細胞から単離して精製し得る。

【0363】

或いは、クローン化された結合剤（例えば抗体）遺伝子は、微生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））等の原核細胞を含む他の発現系で発現され得る。さらに、結合剤（例えば抗体）は、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、ヒツジ及びウサギの乳、若しくはニワトリの卵）、又はトランスジェニック植物で産生され得る（例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６：１６５－１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７－１５７；及びＦｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５－８３９を参照されたい）。

【0364】

キメラ化
非標識マウス抗体は、ヒトでは、繰り返し適用された場合に免疫原性が高く、治療効果の低下につながる。主な免疫原性は、重鎖定数領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体由来の結合剤の免疫原性は、それぞれの結合剤がキメラ化されているか又はヒト化されている場合には、低減され得るか、又は完全に回避され得る。キメラ結合剤は、異なる部分が異なる動物種に由来する結合剤（例えば、マウス抗体由来の可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有する結合剤）である。結合剤のキメラ化は、マウス抗体重鎖及び軽鎖の可変領域と、ヒト重鎖及び軽鎖の定常領域とを結合させることにより達成される（例えば、Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ＩＳＢＮ－０－８９６０３－９１８－８により説明されている）。好ましい実施形態において、キメラ結合剤は、ヒトカッパ－軽鎖定数領域と、マウス軽鎖可変領域とを結合させることにより生成される。同様に好ましい実施形態において、キメラ結合剤は、ヒトラムダ－軽鎖定数領域とマウス軽鎖可変領域とを結合させることにより生成され得る。キメラ結合剤の生成に好ましい重鎖定数領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。キメラ結合剤の生成に好ましい他の重鎖定数領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭである。

【0365】

ヒト化
抗体等の結合剤は、主に６つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由のために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列と比べて個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体－抗原相互作用に関与していることから、特性が異なる別の抗体のフレームワーク配列に移植されている特定の天然に存在する抗体のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え結合剤（例えば抗体）を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３を参照されたい）。そのようなフレームワーク配列を、生殖細胞系抗体遺伝子の配列を含む公開ＤＮＡデータベースから得ることができる。この生殖細胞系列配列は、成熟抗体遺伝子配列とは異なっており、なぜならば、Ｂ細胞の成熟過程中にＶ（Ｄ）Ｊ結合によって形成される、完全に構築された可変遺伝子を含まないからである。生殖細胞系列遺伝子の配列はまた、可変領域全体にわたって個々に均一に、高親和性二次レパートリー抗体の配列とも異なる。

【0366】

抗原に結合する抗体及び他の結合剤の能力を、標準的な結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫蛍光、及びフローサイトメトリー分析）を使用して決定し得る。

【0367】

抗体等の結合剤を精製するために、選択された産生細胞株を、２リットルのスピナーフラスコで増殖させて、組換え抗体を精製し得る。或いは、抗体等の結合剤を、透析ベースのバイオリアクタで生成し得る。上清を濾過し得、必要に応じて、プロテインＬ－セファロースを使用する親和性クロマトグラフィーの前に濃縮し得る。溶出された結合剤を、ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーにより調べて純度を確保し得る。緩衝液をＰＢＳに交換し得、それぞれの吸光係数を使用して、ＯＤ２８０により濃度を決定し得る。組換え結合剤をアリコートして、－６５～－８５℃で保存し得る。

【0368】

抗原を発現している生細胞へのモノクローナル抗体等のモノクローナル結合剤の結合を実証するために、フローサイトメトリーを使用し得る。抗原を天然に発現しているか又はトランスフェクション後に発現している細胞株、及び抗原発現を欠く陰性コントロール（標準的な増殖条件下で増殖させる）を、ハイブリドーマ上清中での又は１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中での様々な濃度のモノクローナル抗体と混合して、３０分にわたり４℃インキュベートし得る。洗浄後、蛍光標識検出試薬（例えば、蛍光がコンジュゲートした抗ＩｇＧ抗体、抗Ｆａｂ抗体、又はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌ）は、一次結合剤の染色と同一の条件下で抗原結合モノクローナル結合剤に結合し得る。サンプルを、光及び側方散乱特性を使用するＦＡＣＳ装置によるフローサイトメトリーで分析し、単一の生細胞をゲートし得る。抗原特異的モノクローナル結合剤と非特異的結合剤とを一回の測定で区別するために、共トランスフェクション方法を採用し得る。抗原及び蛍光マーカーをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を、上述したように染色し得る。トランスフェクトされた細胞を、結合剤で染色された細胞とは異なる蛍光チャンネルで検出し得る。トランスフェクトされた細胞の大部分は、両方の導入遺伝子を発現することから、抗原特異的モノクローナル結合剤は、蛍光マーカー発現細胞に優先的に結合するが、非特異的結合剤は、トランスフェクトされていない細胞に同等の比率で結合する。フローサイトメトリーアッセイに加えて、又はフローサイトメトリーアッセイの代わりに、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用し得る。細胞を、上述したように正確に染色して、蛍光顕微鏡で調べることができる。

【0369】

抗原を発現している生細胞へのモノクローナル抗体等のモノクローナル結合剤の結合を実証するために、免疫蛍光顕微鏡分析を使用し得る。例えば、自然発生的に又はトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株と、抗原発現を欠く陰性コントロールとを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、及びｌ００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンが補充されている）中において、標準増殖条件下にて、チャンバースライドで増殖させる。次いで、細胞を、メタノール又はパラホルムアルデヒドで固定し得るか、又は未処理のままにし得る。次いで、細胞を、２５℃で３０分にわたり、抗原に対するモノクローナル結合剤と反応させ得る。洗浄後、細胞を、同一条件で、Ａｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させ得る。次いで、細胞を蛍光顕微鏡で調べ得る。

【0370】

抗原を発現している細胞からの細胞抽出物、及び適切な陰性コントロールを調製して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、ブロッキングし、試験するモノクローナル結合剤で調べる。ＩｇＧ結合を、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼを使用して検出して、ＥＣＬ基質で現像し得る。

【0371】

抗体等の結合剤を、日常的な外科手術中に患者から採取した非がん組織サンプル若しくはがん組織サンプル、又は自然発生的に若しくはトランスフェクション後に抗原を発現する細胞株が接種された異種移植腫瘍を有するマウスから採取した非がん組織サンプル若しくはがん組織サンプルからの、パラホルムアルデヒド若しくはアセトンで固定された凍結切片、又はパラホルムアルデヒドで固定されたパラフィン包埋組織切片を使用して、当業者に公知の方法で免疫組織化学的に、抗原との反応性に関してさらに試験し得る。免疫染色のために、抗原に反応する結合剤をインキュベートし、続いて、供給業者の指示に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス又はヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）をインキュベートし得る。

【0372】

前臨床試験
本明細書で説明されている結合剤をまた、インビボモデル（例えば、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞株が接種された異種移植腫瘍を有する免疫不全マウス）でも試験して、ＣＬＤＮ１８．２を発現する腫瘍細胞の増殖の制御での有効性を決定し得る。
ＣＬＤＮ１８．２発現腫瘍細胞を免疫不全マウス又は他の動物に異種移植した後のインビボ研究を、本明細書で説明されている結合剤を使用して実施し得る。結合剤、及びＰＢＭＣ等の任意選択的なエフェクター細胞を、腫瘍がないマウスに投与し、続いて腫瘍細胞を注射して、腫瘍の形成又は腫瘍に関連する症状を予防する結合剤の効果を測定し得る。結合剤、及びＰＢＭＣ等の任意選択的なエフェクター細胞を、腫瘍担持マウスに投与して、腫瘍増殖、転移、又は腫瘍に関連する症状を軽減するためのそれぞれの結合剤の治療効果を決定し得る。結合剤及び任意選択的なエフェクター細胞の適用を、細胞分裂阻害薬（ｃｙｓｔｏｓｔａｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、血管新生阻害剤、又は抗体等の他の物質の適用と組み合わせて、組合せによる有効性の増大と毒性の可能性を決定し得る。結合剤により媒介される毒性副作用を分析するために、動物に、本明細書で説明されている結合剤又はコントロール試薬を接種し、ＣＬＤＮ１８．２－結合剤治療に関連すると考えられる症状について完全に調べ得る。

【0373】

結合剤により認識されるエピトープのマッピングを、“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）ｂｙ Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ ＩＳＢＮ－０８９６０３－３７５－９、及び“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２４８ ｂｙ ＩＳＢＮ－０８９６
０３－３７５－９、及び“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２４８ ｂｙ Ｏｌｗｙｎ Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆｒａｎｋ Ｃ．Ｈａｙで詳述されているように実施し得る。

【0374】

本明細書で説明されている化合物及び薬剤を、任意の適切な医薬組成物の形態で投与し得る。

【0375】

本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応又は所望の効果を得るために、本明細書で説明されている結合剤及び任意選択的な本明細書で論じられているさらなる薬剤の有効量を含む。

【0376】

医薬組成物は、通常、均一な剤形で提供され、それ自体が公知の方法で調製され得る。医薬組成物は、例えば、溶液又は懸濁液の形態であり得る。

【0377】

医薬組成物は、塩、緩衝物質、保存剤、担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含み得、これらは全て、好ましくは薬学的に許容される。「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。

【0378】

薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用され得、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的な方法で、下記の酸から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。薬学的に許容される塩をまた、ナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩等のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としても調製し得る。

【0379】

医薬組成物での使用に適した緩衝物質として、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。

【0380】

医薬組成物での使用に適した保存剤として、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールが挙げられる。

【0381】

注射用製剤は、乳酸リンゲル等の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

【0382】

「担体」という用語は、天然又は合成の性質を有する有機成分又は無機成分を指しており、この担体中に、活性成分が、適用を容易にするか、増強するか、又は可能にするために配合される。本発明によれば、「担体」という用語はまた、患者への投与に適した１種又は複数種の適合性のある固体又は液体の充填剤、希釈剤、又はカプセル化物質も含む。

【0383】

非経口投与用の可能な担体物質は、例えば、滅菌水、リンゲル、乳酸リンゲル、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、特に、生体適合性のあるラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。

【0384】

「賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合には、医薬組成物中に存在し得、有効成分ではない全ての物質（例えば、担体、結合剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝液、香味剤、又は着色剤等）を示すことが意図されている。

【0385】

本明細書で説明されている薬剤及び組成物を、例えば注射又は注入による非経口投与等の任意の従来の経路で投与し得る。投与は、好ましくは非経口的であり、例えば、静脈内
、動脈内、皮下、皮内、又は筋肉内である。

【0386】

非経口投与に適した組成物は、通常、活性化合物の無菌の水性又は非水性の調製物を含み、この調製物は、好ましくは、レシピエントの血液に対して等張である。適合する担体及び溶媒の例は、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム液である。加えて、通常は無菌の固定油が、溶液又は懸濁液の媒体として使用される。

【0387】

本明細書で説明されている薬剤及び組成物を、有効量で投与する。「有効量」は、単独で又はさらなる用量と共に、所望の反応又は所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患又は特定の状態の処置の場合には、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅延させることを含み、特に、疾患の進行を妨げるか又は反転させることを含む。疾患又は状態の処置における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の予防でもあり得る。

【0388】

本明細書で説明されている薬剤又は組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重症度、患者の個々のパラメータ（例えば、年齢、生理学的状態、体格、及び体重）、処置期間、付随する療法の種類（存在する場合）、具体的な投与経路、並びに同様の要因に依存する。従って、本明細書で説明されている薬剤の投与量は、様々なそのようなパラメータに依存する場合がある。初期用量では患者の反応が不十分な場合には、より高用量（又は、より局所的な別の投与経路により達成される効果的な高用量）を使用し得る。

【0389】

本明細書で説明されている薬剤及び組成物を、本明細書で説明されている障害等の様々な障害を処置するか又は予防するために、例えばインビボで患者に投与し得る。好ましい患者として、本明細書で説明されている薬剤及び組成物を投与することにより矯正され得るか又は改善され得る障害を有するヒト患者が挙げられる。これには、ＣＬＤＮ１８．２の発現パターンの変更を特徴とする細胞が関与する障害も含まれる。

【0390】

例えば、一実施形態において、本明細書で説明されている薬剤を使用して、がん疾患（例えば、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞の存在を特徴とする本明細書で説明されているがん疾患）を有する患者を処置し得る。

【0391】

本発明に従って説明されている医薬組成物及び処置方法をまた、本明細書で説明されている疾患を予防するための免疫化又はワクチン接種にも使用し得る。

【0392】

本発明の医薬組成物は、１種又は複数種のアジュバント等の補助的な免疫増強物質と共に投与し得、その有効性をさらに高めるために、好ましくは免疫刺激の相加効果を達成するために、１種又は複数種の免疫増強物質を含み得る。「アジュバント」という用語は、免疫反応を延長させるか、増強するか、又は促進する化合物に関する。これに関して、様々な種類のアジュバントに応じて様々な機序が可能である。例えば、ＤＣの成熟を可能にする化合物（例えば、リポ多糖又はＣＤ４０リガンド）は、適切なアジュバントの第１のクラスを形成する。一般に、「危険シグナル」のタイプ（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡ等）又はＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカインの免疫系に影響を及ぼす任意の薬剤を、免疫反応を制御された方法で増強し得る及び／又は影響を及ぼし得るアジュバントとして使用し得る。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドも、任意選択的にこの文脈で使用され得るが、上述したように、ある特定の状況下で起こるその副作用を考慮しなければならない。特に好ましいアジュバントは、サイトカイン、例えば、モノカイン、リンパカイン、インターロイキン、又はケモカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦα、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－α、又は増殖因子、例えばｈＧＨである。さらに公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、又は油、例えば、Ｍｏｎ
ｔａｎｉｄｅ（登録商標）、最も好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１である。Ｐａｍ３Ｃｙｓ等のリポペプチドも、本発明の医薬組成物におけるアジュバントとしての使用に適している。

【0393】

本明細書で提供される薬剤及び組成物を、単独で使用してもよいし、手術、放射線照射、化学療法、及び／又は骨髄移植（自家、同系、同種、又は非血縁）等の従来の治療レジメンと組み合わせて使用してもよい。

【0394】

がんの治療は、２、３、４種、又はさらに多い抗がん剤／治療薬の複合作用により、単剤療法アプローチの効果と比べてもかなり強い相乗効果が得られることが多いことから、併用戦略が特に望ましい分野である。そのため、本発明の別の実施形態において、本発明の方法及び医薬組成物等の免疫又はワクチン接種に基づく機序を利用するがん治療は、類似の又は他の特異的機序を標的とする様々な他の薬物及び／又は方法と効果的に併用され得る。これらの中でも、例えば、従来の腫瘍治療、マルチエピトープ戦略、追加の免疫療法、及び血管新生又はアポトーシスを標的とする処置アプローチとの組合せがある（概説に関して、例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００８：Ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，５７（１１）：１７３５－１７４３を参照されたい）。様々な薬剤の連続投与は、様々なチェックポイントでがん細胞の増殖を阻害し得、他の薬剤は、例えば、がんが慢性疾患へと代わる可能性がある新生血管形成、悪性細胞の生存、又は転移を阻害し得る。下記のリストは、本発明と併用され得る抗がん剤及び治療のいくつかの非限定的な例を示す。

【0395】

１．化学療法
化学療法は、複数種のがんに対する標準治療である。最も一般的な化学療法剤は、がん細胞の主な特性の内の１つである急速に分裂する細胞を死滅させることにより作用する。そのため、従来の化学療法薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び細胞分裂又はＤＮＡ合成に影響を及ぼす他の抗腫瘍剤）との併用は、抑制細胞、免疫系の再起動を除去することによるか、腫瘍細胞を免疫媒介性死滅に対してより感受性にすることによるか、又は免疫系の細胞のさらなる活性化により、本発明の治療効果を有意に改善し得る。化学療法薬とワクチン接種に基づく免疫療法薬との相加的な抗がん作用は、複数の研究で実証されている（例えば、Ｑｕｏｉｘ ｅｔ ａｌ．２０１１：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ ＴＧ４０１０ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ
ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｈａｓｅ ２Ｂ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１２（１２）：１１２５－３３．を参照されたく；Ｌｉｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１０：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：ｔｈｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ
ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０：６９２０９７９も参照されたく；Ｈｉｒｏｏｋａ ｅｔ ａｌ ２００９：Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅ ｌｏｃａｌｌｙ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｐａｎｃｒｅａｓ ３８（３）：ｅ６９－７４も参照されたい）。数百種類の利用可能な化学療法薬が存在しており、基本的に併用療法に適している。本発明と組み合わされ得る化学療法薬のいくつかの（非限定的な）例は、下記である：カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔ
ｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、エトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ、Ｍｅｘａｔｅ、Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ、Ａｂｒａｘａｎｅ）、ソラフィニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）。

【0396】

２．手術
癌の手術－腫瘍を取り除く手術－は、依然としてがん処置の基礎である。手術は、あらゆる残存する腫瘍細胞を除去するために、他のがん処置と組み合わされ得る。外科手術とその後の免疫療法処置との併用は、数え切れないほど実証されている有望なアプローチである。

【0397】

３．放射線
放射線療法は、依然としてがん処置の重要な要素であり、全がん患者の約５０％は、罹患中に放射線療法を受けている。放射線療法の主な目的は、がん細胞からその増殖（細胞分裂）可能性を奪うことである。がんを処置するために使用される放射線の種類は、光子線（Ｘ線及びガンマ線）、並びに粒子線（電子線、陽子線、及び中性子線）である。放射線をがんの位置に照射するには、２つの方法がある。外照射は、高エネルギー線（光子、陽子、又は粒子線）を腫瘍の位置に向けることにより、体外から照射される。内部放射又は小線源治療は、カテーテル又はシードに封入された放射線源により体内から腫瘍部位へと直接照射される。本発明と組み合わせて適用可能な放射線療法技術は、例えば下記である：分割（分割レジメン（例えば、数週間にわたる照射される１．５～３Ｇｙの毎日の分割）で照射される放射線療法）、３Ｄ原体放射線療法（３ＤＣＲＴ；全腫瘍体積への放射線の照射）、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ；複数の放射線ビームのコンピュータ制御による強度変調）、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ；補正を可能にする放射線療法前の画像処理を含む技術）、及び体幹部定位放射線治療（ＳＲＢＴ、わずか数回の処置分割で非常に高い個別線量の放射線を照射する）。放射線治療の概説に関して、Ｂａｓｋａｒ ｅｔ
ａｌ．２０１２：Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ：ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ．Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．９（３）：１９３－１９９を参照されたい。

【0398】

４．抗体
抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、様々な機序を介してがん細胞に対する治療効果を発揮する。抗体は、アポトーシス又はプログラム細胞死の発生に直接的な効果を有し得る。抗体は、例えば増殖因子受容体等のシグナル伝達経路の構成要素をブロックし得、腫瘍細胞の増殖を効果的に停止させる。モノクローナル抗体を発現する細胞では、抗イディオタイプ抗体の形成が引き起こされ得る。間接的な効果として、単球及びマクロファージ等の細胞傷害性を有する細胞の動員が挙げられる。このタイプの抗体媒介性細胞死は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。抗体はまた、補体とも結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として公知の直接的な細胞傷害が引き起こされる。さらに、標的細胞に結合した抗体は、非特異的な食細胞により認識され得、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）として公知の標的細胞の食作用が引き起こされる。外科手術と免疫治療薬又は免疫療法とを組み合わせることは、例えばＧａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．２００９：Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２（４）：３３３－４０で実証されているように、成功したア
プローチである。下記のリストは、本発明と併用され得る抗がん抗体及び潜在的な抗体標的（括弧内）のいくつかの非限定的な例を提供する：アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）（ＣＡ－１２５）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）（ＶＥＧＦＲ２）、アラツモマブペンテタート（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）（ＭＯＲＡｂ－００９）、アナツモマブマフェナトキス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）（ＴＡＧ－７２）、アポリズマブ（Ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＨＬＡ－ＤＲ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＥＡ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＤ２２）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（ＶＥＧＦ－Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＣＤ４４ ｖ６）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）（ＣＤ３０ ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎ）（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラベタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（前立腺癌細胞）、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）（ＣＮＴＯ８８８）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）（ＥｐＣＡＭ，ＣＤ３）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトキス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）（ＥｐＣＡＭ）、シキスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）（ＩＧＦ－１受容体）、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ４０）、ダルツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＮＰＣ－１Ｃ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ，ＣＤ３）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）（インテグリンαｖβ３）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）（ＳＣＨ ９００１０５）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）（ＩＧＦ－１受容体）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（ＴＧＦ－β）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）（ＣＤ８０）、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）（ＩＧＦ－Ｉ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）（ＩＬ－１β）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（カルボニックアンヒドラーゼ９ （ＣＡ－ＩＸ））、グレンバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）（ＣＤ２０）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）（ＶＥＧＦＲ－１）、イゴボマ（Ｉｇｏｖｏｍａ）（ＣＡ－１２５）、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガミシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（ＣＤ２２）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＥＡ）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）（ＴＲＡＩＬ－
Ｒ２）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）（ＣＤ２３）、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＩＬ－５）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）（ＣＤ７４）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）（ＧＤ３ ガングリオシド）、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトキス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマベスタフェナトキス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）（５Ｔ４）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）（ＥＧＦＲ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ２０）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）（ＰＤＧＦ－Ｒ α）、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトキス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）（ＣＡ－１２５）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）（ＯＸ－４０）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（ＥＧＦＲ）、パツリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）（ＨＥＲ３）、ペムツモマ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａ）（ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）（腺癌抗原）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）（フィブロネクチン外部ドメインＢ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）（ＨＧＦ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）（ＩＧＦ－１受容体）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）（ＩＬ－６）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（アルファ－フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトキス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）（ＣＤ１９）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）（ＣＤ２２１）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＴＮＸ－６５０（ＩＬ－１３）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）（ＥｐＣＡＭ）、ウビリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）（４－１ＢＢ）、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）（腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）（ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＤ４）。

【0399】

５．サイトカイン、ケモカイン、副刺激分子、融合タンパク質
有益な免疫調節又は腫瘍阻害効果を誘発するための、本発明の医薬組成物と、サイトカイン、ケモカイン、副刺激分子、及び／又はその融合タンパク質との併用は、本発明の別の実施形態である。腫瘍への免疫細胞の浸潤を増加させ、腫瘍から排出されるリンパ節への抗原提示細胞の移動を促進するために、Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、及びＣＸ３Ｃ構造を持つ様々なケモカインを使用し得る。最も有望なケモカインの内のいくつかは、例えば、ＣＣＲ７、及びそのリガンドＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１であり、さらには、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３
、ＣＣＬ５、及びＣＣＬ１６である。他の例は、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、及びＣＸＣＬ１２である。さらに、例えばＢ７リガンド（Ｂ７．１及びＢ７．２）等の副刺激分子又は調節分子が有用である。同様に有用なのは、他のサイトカイン、例えば、特にインターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ１７）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮアルファ１～ＩＦＮアルファ８、ＩＦＮアルファ１０、ＩＦＮアルファ１３、ＩＦＮアルファ１４、ＩＦＮアルファ１６、ＩＦＮアルファ１７、ＩＦＮアルファ２１、ＩＦＮベータ１、ＩＦＮＷ、ＩＦＮＥ１、及びＩＦＮＫ）、造血因子、ＴＧＦ（例えば、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、及びＴＧＦファミリの他のメンバー）、最後に、受容体の腫瘍壊死因子ファミリのメンバー及びそのリガンド、並びに下記を含むがこれらに限定されない他の刺激分子：４－１ＢＢ、４－１ＢＢ－Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＴＬＡ－４ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、Ｆａｓ、Ｆａｓ－Ｌ、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ｐ７５ＮＧＦ－Ｒ、ＤＲ６、ＬＴ．ベータ．Ｒ、ＲＡＮＫ、ＥＤＡＲ１、ＸＥＤＡＲ、Ｆｎ１１４、Ｔｒｏｙ／Ｔｒａｄｅ、ＴＡＪ、ＴＮＦＲＩＩ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＲＥＬＴ、及びＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ－１）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質、ＴＮＦ受容体関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）、及び死受容体－６（ＤＲ６）。特に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ及びＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞の生存及び増殖に直接影響を及ぼすことから、複合免疫療法の重要な標的である。概説に関して、Ｌｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１：Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ，ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ３（１１），１３１７－１３４０を参照されたい。

【0400】

６．細菌処置
研究者らは、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）等の嫌気性菌を使用して、酸素の乏しい腫瘍の内部を消費している。次いで、これは、腫瘍の酸素化された側面と接触する場合に死滅し、このことは、身体の残りの部分には無害であることを意味する。別の戦略は、無毒のプロドラッグを有毒な薬物へと変換し得る酵素で形質転換された嫌気性菌を使用することである。腫瘍の壊死領域及び低酸素領域での細菌の増殖により、酵素は、腫瘍内でのみ発現される。そのため、全身的に適用されたプロドラッグは、腫瘍内でのみ代謝されて有毒な薬物になる。このことは、非病原性嫌気性生物クロストリジウム・スポロジェネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）で有効であることが実証されている。

【0401】

７．キナーゼ阻害剤
がん細胞の増殖及び生存は、キナーゼ活性の調節解除と密接に連動していることから、補完的ながん治療の潜在的な標的の別の大きな群には、キナーゼ阻害剤が含まれる。正常なキナーゼ活性を回復させて腫瘍の増殖を抑えるために、幅広い種類の阻害剤が使用される。標的キナーゼの群には、受容体チロシンキナーゼが含まれており、例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｂ－Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２／ＥｒｂＢ２、ＩＧＦ－ＩＲ、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＤＧＦＲ－β、ｃ－Ｋｉｔ、Ｆｌｔ－４、Ｆｌｔ３－野生型、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、ＲＯＮ、ｃ－Ｒｅｔ、ＡＬＫ、細胞質チロシンキナーゼ、例えば、ｃ－ＳＲＣ、ｃ－ＹＥＳ、Ａｂｌ、ＪＡＫ－２、セリン／スレオニンキナーゼ、例えば、ＡＴＭ、Ａｕｒｏｒａ Ａ＆Ｂ、ＣＤＫ、ｍＴＯＲ、ＰＫＣｉ、ＰＬＫ、ｂ－Ｒａｆ、Ｓ６Ｋ、ＳＴＫ１１／ＬＫＢ１、及び脂質キナーゼ、例えば、ＰＩ３Ｋ、ＳＫ１が含まれる。小分子キナーゼ阻害剤は、例えば、ＰＨＡ－７３９３５８、ニロチニブ（Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、及びＰＤ１６６３２６、ＮＳＣ ７４３４１１、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）（ＧＷ－５７２０１６）、カネルチニブ（Ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）（ＣＩ－１０３３）、セマキニブ（Ｓｅｍａｘｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（Ｖａｔａｌａｎｉｂ）（ＰＴＫ７８７／
ＺＫ２２２５８４）、スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（ＳＵ１１２４８）、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（ＢＡＹ ４３－９００６）、及びレフルノミド（Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）（ＳＵ１０１）である。さらなる情報に関して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ９，２８－３９を参照されたい。

【0402】

８．Ｔｏｌｌ様受容体
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリのメンバーは、自然免疫と適応免疫との間の重要なつながりであり、多くのアジュバントの効果は、ＴＬＲの活性化に依存している。がんに対する確立されたワクチンの多くは、ワクチン反応を促進するためにＴＬＲのリガンドを組み込む。ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４に加えて、特にＴＬＲ７及びＴＬＲ８が、受動免疫療法アプローチにおけるがん治療のために検討されている。密接に関連するＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、免疫細胞、腫瘍細胞、及び腫瘍微小環境に影響を及ぼすことにより抗腫瘍反応に寄与し、ヌクレオシド類似体構造により活性化され得る。全てのＴＬＲは、単独の免疫治療薬又はがんワクチンアジュバントとして使用されており、本発明の製剤及び方法と組み合わされ得る。さらなる情報に関して、ｖａｎ Ｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．２００５：Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ＴＬＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７（１）：４９－５５を参照されたい。

【0403】

９．血管新生阻害剤
腫瘍媒介性回避機序及び免疫抑制による影響を受ける免疫調節受容体を標的とする治療に加えて、腫瘍環境を標的とする治療も存在している。血管新生阻害剤は、腫瘍が生存するために必要とする血管の広範な成長（血管新生）を防止する。例えば、増加する栄養素及び酸素の需要を満たすために腫瘍細胞により促進される血管新生は、様々な分子を標的にすることによりブロックされ得る。本発明と組み合わされ得る血管新生媒介分子又は血管新生阻害剤の非限定的な例は、可溶性ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦアイソフォームＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５、受容体ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及び受容体ニューロピリン－２（ＮＲＰ－２）、アンジオポエチン２、ＴＳＰ－１及びＴＳＰ－２、アンジオスタチン及び関連分子、エンドスタチン、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子－４、ＴＩＭＰ及びＣＤＡＩ、Ｍｅｔｈ－１及びＭｅｔｈ－２、ＩＦＮ－α、－β、及び－γ、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－４、－１２、及び－１８、プロトロンビン（クリングルドメイン－２）、アンチトロンビンＩＩＩ断片、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質、レスチン、並びに例えば、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ－４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ－α、血小板因子－４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、血管新生抑制ステロイド＋ヘパリン、軟骨由来血管新生阻害因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、２－メトキシエストラジオール、テコガラン、テトラチオモリブデン酸、サリドマイド、トロンボスポンジン、プロラクチンＶβ３阻害剤、リノミド、タスキニモドであり、概説に関して、例えば、Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ ａｎｄ Ｄｒａｎｏｆｆ ２０１１：Ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ．（９）：９７６－８１を参照されたい。

【0404】

１０．低分子標的療法薬
低分子標的療法薬は、一般に、がん細胞内の変異タンパク質、過剰発現タンパク質、又はその他の重要なタンパク質の酵素ドメインの阻害剤である。顕著で非限定的な例は、チロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ／Ｇｌｉｖｅｃ）とゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）である。がん療法のためのワクチンと組み合わされた、いくつかのキナー
ゼを標的とするリンゴ酸スニチニブ及び／又はトシル酸ソラフェニブ等の低分子の使用はまた、先の特許出願第２００９００４２１３号明細書でも説明されている。

【0405】

１１．ウイルスベースのワクチン
本発明の製剤と共に併用治療アプローチに使用され得る入手可能な又は開発中のウイルスベースのがんワクチンが多数存在している。そのようなウイルスベクターの使用の１つの利点は、免疫活性化に必要な危険シグナルを生じるウイルス感染の結果として生じる炎症反応により免疫反応を開始する固有の能力である。理想的なウイルスベクターは、安全であるべきであり、抗腫瘍特異的反応を高め得るように、抗ベクター免疫反応を導入すべきではない。ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びアビポックスウイルス等の組換えウイルスが、動物腫瘍モデルで使用されており、その有望な結果に基づいて、ヒトでの臨床試験が開始されている。特に重要なウイルスベースのワクチンは、ウイルスの外被からある特定のタンパク質を含む小さな粒子であるウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ウイルス様粒子は、ウイルスの遺伝物質を全く含まず、感染を引き起こし得ないが、腫瘍抗原をその被膜上に提示するように構築され得る。ＶＬＰは、様々なウイルスに由来し得、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、又はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ）、及びフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）を含む他のウイルスファミリに由来し得る。一般的な概説に関して、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｅｎ ２００７：Ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｗｈａｔ ｄｏ ｗｅ ｋｎｏｗ ａｎｄ ｗｈｅｒｅ ａｒｅ ｗｅ ｇｏｉｎｇ？ ＡＰＭＩＳ １１５（１１）：１１７７－９３；ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１１：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １０（１１）：１５６９－８３；及びＧｕｉｌｌａｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０：Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ，ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｐｒｏｃｅｄｉａ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ ２（２），１２８－１３３を参照されたい。

【0406】

１２．マルチエピトープ戦略
マルチエピトープの使用は、ワクチン接種に関する有望な結果を示す。知的アルゴリズムシステムと組み合わされた高速配列決定技術は、腫瘍ムタノームの利用を可能にし、本発明と組み合わされ得る個別化ワクチンのためのマルチエピトープを提供し得る。さらなる情報に関して、２００７：Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３０：７６２－７７２；さらに、Ｃａｓｔｌｅ
ｅｔ ａｌ．２０１２：Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｏｍｅ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２（５）：１０８１－９１を参照されたい。

【0407】

１３．養子Ｔ細胞移植
例えば、腫瘍抗原ワクチン接種とＴ細胞移植との組合せが、Ｒａｐｏｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１１：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ
ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｈＴＥＲＴ ａｎｄ
ｓｕｒｖｉｖｉｎ ａｆｔｅｒ ＡＳＣＴ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １１７（３）：７８８－９７で説明されている。

【0408】

１４．ペプチドベースの標的療法
ペプチドは、細胞表面の受容体、又は腫瘍を取り囲む影響を受けた細胞外マトリックスに結合し得る。このペプチドに付着した放射性核種（例えばＲＧＤ）は、細胞の近くで核種が崩壊した場合には、最終的にはがん細胞を死滅させる。特に、これらの結合モチーフのオリゴマー又はマルチマーは、腫瘍特異性及び結合活性の向上につながり得ることから、非常に興味深いものである。非限定的な例に関して、Ｙａｍａｄａ ２０１１：Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ，ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ．Ｎｉｈｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ６９（９）：１６５７－６１を参照されたい。

【0409】

１５．他の治療
相乗効果を生み出すために本発明の製剤及び方法と組み合わされ得る多くの他のがん治療が存在している。非限定的な例は、アポトーシスを標的とする処置、温熱療法、ホルモン療法、テロメラーゼ療法、インスリン増強療法、遺伝子療法、及び光力学療法である。

【0410】

本発明を、下記の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されない。

【実施例0411】

実施例１：ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインを含む結合剤の生成
本発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメインを含む結合剤（抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）を使用してＣＤ３＋エフェクターＴ細胞を再指向させてＣＬＤＮ１８．２発現細胞株を破壊する可能性を検討した。マウス抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（配列番号３８及び４１）からの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を使用して、いくつかの抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂを生成した（国際公開第２００７／０５９９９７号パンフレットを参照されたい）。加えて、ＣＤ３に対して異なる親和性を有する抗ＣＤ３ ｓｃＦｖに関するいくつかの配列を使用した。下記の表２は、マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤ及びＣＤ３ ＡＢＤを保有するｂｓＡｂの概要を示す。

【0412】

【表2】

【0413】

実施例１Ａ：抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂの産生
抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂの略図を、図１に示す。

【0414】

ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）及びＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）をコードするＤＮＡを、遺伝子合成により生成し、適切な融合パートナー（例えば、定常領域又は抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ）を含むｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ重鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子合成により生成した。ＤＮＡを、発現のためにＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性抗体（配列番号９３、９４、９５）も、コントロールとして生成した。

【0415】

実施例１Ｂ：抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂによるＮＵＧＣ－４細胞株及びＫＰ－４細胞株への結合及び再指向されたＴ細胞細胞傷害
ＮＵＧＣ－４は、高レベルのＣＬＤＮ１８．２を発現する胃癌細胞株であり、ＫＰ－４は、非常に低レベルのＣＬＤＮ１８．２（ＣＬＤＮ１８．２陰性コントロ－ル細胞株に相当）を発現する膵癌細胞株である。従って、本発明者らは、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂ及び抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂコントロールにより媒介されるＮＵＧＣ－４細胞株及びＫＰ－４細胞株に対する結合及び再指向されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を検討した。

【0416】

２００，０００個の細胞（ＮＵＧＣ－４又はＫＰ－４）を、氷上で１時間にわたり、指定濃度の抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂと共にインキュベートした。次いで、試料を洗浄し、氷上で１時間にわたり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， Ｐｅｎｎ．）で染色した。試料を再度洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。ＫＰ－４細胞及びＮＵＧＣ－４細胞への結合を示すデータを、図２に示す。

【0417】

抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂにより媒介されるＲＴＣＣを検討するために、３７℃で２４時間にわたり、ＮＵＧＣ－４又はＫＰ－４を、ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的細胞比）、及び指定濃度の抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂ
と共にインキュベートした。製造業者の指示に従って乳酸デヒドロゲナーゼレベルを測定するためにＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を使用して、ＲＴＣＣを決定し、データを、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）で取得した。図３を参照されたい。

【0418】

まとめると、データは、試験した全ての濃度で、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂが用量依存的にＮＵＧＣ－４細胞に結合したが、ＫＰ－４細胞への結合はほとんど検出され得なかったことを示す。特に、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４７、ＸＥＮＰ２４６４８、及びＸＥＮＰ２４６４９）は、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４５及びＸＥＮＰ２４６４６）と比べてはるかに強力にＮＵＧＣ－４細胞に結合する。このことは、おそらく、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットにより伝えられる特別な結合活性に起因する。細胞結合と一致して、データは、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂがＮＵＧＣ－４上で用量依存的にＲＴＣＣを誘導したが、ＫＰ－４細胞上ではＲＴＣＣが誘導されなかったことを示す。

【0419】

実施例１Ｃ：ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞を使用する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂのさらなるキャラクタリゼーション
（ａ）ＣＬＤＮ１８．２発現細胞株としてのＳＮＵ－６０１の同定
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂをさらにキャラクタライズするために、本発明者らは、ＮＵＧＣ－４の発現と比較してＣＬＤＮ１８．２の発現レベルが高い細胞株を同定しようとした。本発明者らは、下記のようにフローサイトメトリーを使用して、様々な細胞株へのＸＥＮＰ２４６４７の結合を調べた。様々な細胞株（及び陰性コントロールとしてのＲａｍｏｓ細胞）からの２００，０００個の細胞を、氷上で１時間にわたりＸＥＮＰ２４６４７と共にインキュベートし、続いて氷上で１時間にわたりＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎ．）により染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図４は、ＮＵＧＣ－４及びＳＮＵ－６０１へのＸＥＮＰ２４６４７の結合を示す。このデータは、ＳＮＵ－６０１がＮＵＧＣ－４と比較してＣＬＤＮ１８．２を高レベルで発現することを示す。従って、本発明者らは、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞を使用して、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂをさらにキャラクタライズした。

【0420】

（ｂ）ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞上での抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３
ｂｓＡｂの結合
本発明者らは、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞上での抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂの結合を調べた。実験を、上述したように行なった。具体的には、様々な細胞株（及び陰性コントロールとしてのＲａｍｏｓ細胞）からの２００，０００個の細胞を、氷上で１時間にわたり指定の濃度の指定のｂｓＡｂと共にインキュベートし、続いて氷上で１時間にわたりＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎ．）により染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＮＵＧＣ－４及びＳＮＵ－６０１へのｂｓＡｂの結合を示すＰＥ ＭＦＩを、図５に示す。それぞれのｂｓＡｂは、ＮＵＧＣ－４及びＳＮＵ－６０１の両方に用量依存的に結合しており、ＳＮＵ－６０１細胞への最大結合量は、ＮＵＧＣ－４と比べて高く、このことは、それぞれの細胞株でのそれぞれのＣＬＤＮ１８．２発現レベルと一致している。上記の実施例１Ｂの結果と一致して、データは、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂが「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂと比べて強力に細胞に結合したこ
とを示す。

【0421】

（ｃ）抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂによるＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞への再指向されたＴ細胞細胞傷害性の誘導
次に、本発明者らは、ＮＵＧＣ－４及びＳＮＵ－６０１への抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂにより媒介されるＲＴＣＣを調べた。実験を、上述したように行なった。具体的には、ＮＵＧＣ－４細胞又はＳＮＵ－６０１細胞を、３７℃で２４時間又は４８時間にわたり、ヒトＰＢＭＣ（２０：１のエフェクター対標的細胞比）、及び指定の濃度の指定のｂｓＡｂ、及び抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１と共にインキュベートした。コントロ－ルとして、標的細胞のみ、又はｂｓＡｂを使用しない標的細胞及びエフェクター細胞を使用した。インキュベーション後、試料を、氷上で１時間にわたり、下記の抗体で染色した：抗ＣＤ６９－ＰＥ、抗ＣＤ２５－ＡＰＣ、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０、及び抗ＣＤ８－ＢＶ６０５。次いで、細胞を、ＢＵＶ３９５ Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）及び７－ＡＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）で染色した。最後に、細胞を、フローサイトメトリーで分析した。

【0422】

ＡｎｎｅｘｉｎＶ及び７ＡＡＤの結合はアポトーシス誘導の指標である。従って、生細胞は、ＡｎｎｅｘｉｎＶ－７ＡＡＤ－であり、死細胞は、ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋細胞、７ＡＡＤ＋細胞、及びＡｎｎｅｘｉｎＶ＋７ＡＡＤ＋細胞の合計であった。エフェクター細胞及び指定のｂｓＡｂとのインキュベート後の死滅した／瀕死の標的細胞及び生きている標的細胞の数を示すデータを、図６－９に示す。このデータは、死滅した／瀕死の細胞の増加、及び生きている細胞の減少により示されるように、ｂｓＡｂが標的細胞（即ち、ＮＵＧＣ－４細胞及びＳＮＵ－６０１細胞）の死滅を増強することを示す。特に、このデータは、ＣＤ３に対する親和性が高い結合ドメインは、ＲＴＣＣを増強することを示す（例えば、ＸＥＮＰ２４６４５とＸＥＮＰ２４６４６との比較、及びＸＥＮＰ２４６４７とＸＥＮＰ２４６４９との比較）。さらに、ＣＤ３に特異的な同一の結合ドメインを有するｂｓＡｂの場合には、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂは、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂと比べて強力にＲＴＣＣを増強する（例えば、ＸＥＮＰ２４６４７とＸＥＮＰ２４６４５との比較）。加えて、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」ｂｓＡｂを超える「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」ｂｓＡｂによるＲＴＣＣの増強（例えば、ＣＤ３に対して同一の親和性を有するＸＥＮＰ２４６４５（Ｆａｂ－ｓｃＦｖフォーマット）及びＸＥＮＰ２４６４７（Ｆａｂ２－ｓｃＦｖフォーマット））は、ＣＬＤＮ１８．２を高レベルで発現するＳＮＵ－６０１でより顕著であり、このことは、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットが、ＣＬＤＮ１８．２を高レベルで発現する細胞株に関する選択性を提供することを示唆する。

【0423】

本発明者らはまた、本発明のｂｓＡｂによるＴ細胞の活性化も調べた。ＣＤ６９は、初期活性化マーカーであり、ＣＤ２５は、後期活性化マーカーであり、両者とも、ＴＣＲシグナル伝達を介したＴ細胞活性化後に上方制御される。ＣＤ１０７ａは、Ｔ細胞の脱顆粒及び細胞傷害活性の機能的マーカーである。エフェクター細胞を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋
Ｔ細胞を同定するためにゲートした。次いで、Ｔ細胞を、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ１０７ａの発現に関してゲートした。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞でのマーカーの上方制御を示すデータを、図１０－１３に示す。このデータは、ＲＴＣＣの結果と一致した傾向を示す。例えば、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒を増強する。

【0424】

実施例２：ヒト化ＣＬＤＮ１８．２抗原結合ドメインを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂの生成
ＣＬＤＮ１８．２に対する特異性を有するヒト化ＡＢＤを有するｂｓＡｂｓを生成した。下記の表３は、生成されたヒト化ｂｓＡｂの概要を示す。

【0425】

【表3】

【0426】

実施例２Ａ：ＣＬＤＮ１８．２抗原結合ドメインのヒト化
本発明者らは、文字列内容の最適化（ｓｔｒｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、国際公開第２００５／０５６７５９号パンフレット及び米国特許第７，６５７，３８０号明細書を参照されたい）を使用して、ヒト化可変領域を有する抗ＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂを操作した（ＶＨ：配列番号３９、４０、ＶＬ：配列番号４２）。ヒト生殖細胞系列との同一性は、マウスＡＢＤ（配列番号３８、４１；「Ｈ０Ｌ０」）に関する７３．２％から、２種のバリアントに関するそれぞれ８６．６％（配列番号４０、４２；「Ｈ２Ｌ１」）及び８８．３％（配列番号３９、４２；「Ｈ１Ｌ１」）へと増加した。ヒト化ｍＡｂの可変領域を使用して、実施例１Ａで説明したように、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」及び「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットの両方での抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂをさらに生成した。

【0427】

実施例２Ｂ：ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤのヒト化は、結合、ＲＴＣＣ、Ｔ細胞活性化を維持した
次に、本発明者らは、マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂ、及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによる細胞結合、ＲＴＣＣの誘導、及びＴ細胞活性化の誘導を比較した。

【0428】

図４で観察されるように、ＳＮＵ－６０１細胞株は、ＮＵＧＣ－４細胞株と比べて高レベルのＣＬＤＮ１８．２発現を特徴としていたが、ＳＮＵ－６０１細胞集団は、ＣＬＤＮ
１８．２発現に関して非常に不均一であった。従って、フローサイトメトリーを使用して、ＣＬＤＮ１８．２発現に基づいてＳＮＵ－６０１細胞を選別し、４日にわたりＣＬＤＮ１８．２＋集団を拡大した。拡大したＣＬＤＮ１８．２＋集団（これ以降、富化ＳＮＵ－６０１又はＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）と称される）を、実施例１Ｃで説明されているようにＣＬＤＮ１８．２発現に関して再評価し、富化されていないＳＮＵ－６０１細胞と比較した（図１４を参照されたい）。このデータは、ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）が実質的により多くのＣＬＤＮ１８．２＋細胞の集団を含むこと示す。このセクションの実験を、ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞を使用して実施する。

【0429】

ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞へのヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂの結合を、実施例１Ｂで説明されているように評価した。具体的には、２００，０００個のＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞を、氷上で１時間にわたり、指定の濃度の指定のｂｓＡｂと共にインキュベートした。次いで、試料を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎ．）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。コントロール試料は、マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂ、２価の抗ＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂ、細胞のみ、及び二次抗体のみを含んでいた。ｂｓＡｂによる結合を示すＡｌｅｘａＦ６５７ ＭＦＩを、図１５に示す。このデータは、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂが、マウスＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂと同様にＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞に結合したことを示しており、このことは、ヒト化はｂｓＡｂの結合効果を維持することを示す。特に、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂは、２価の抗ＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂと比較して同様の結合を示した。加えて、データは、配列番号３９及び４２（Ｈ１Ｌ１）に従うヒト化ＶＨ及びＶＬを含むｂｓＡｂ（例えば、ＸＥＮＰ２９４７２、ＸＥＮＰ２９４７４、ＸＥＮＰ２９４７６、及びＸＥＮＰ２９４７８）が、配列番号４０及び４２（Ｈ２Ｌ１）に従うヒト化ＶＨ及びＶＬを含むｂｓＡｂ（例えば、ＸＥＮＰ２９４７３、ＸＥＮＰ２９４７５、ＸＥＮＰ２９４７７、及びＸＥＮＰ２９４７９）と比べて良好に結合を維持したことを示す。

【0430】

次に、本発明者らは、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞へのＲＴＣＣの誘導とＴ細胞活性化とを調べた。ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）で標識した。ＣＦＳＥ標識ＳＮＵ－６０１（２Ｅ４）細胞を、３７℃で２４時間にわたり、ヒトＰＢＭＣ（１０：１のエフェクター対標的比）及び抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１と共にインキュベートした。インキュベーション後、上清を回収し、Ｖ－ＰＬＥＸ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔ（製造業者のプロトコルに従う；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）によりサイトカイン分析を行い、細胞を、室温で１５分にわたり、Ａｑｕａ Ｚｏｍｂｉｅ染色剤で染色した。次いで、細胞を洗浄し、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｃｙ７、抗ＣＤ８－ｐｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、及び抗ＣＤ６９－ＡＰＣ染色抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。本発明者らは、ＲＴＣＣの誘導を調査するために、下記の２つの異なるアプローチを使用した：ａ）ＣＳＦＥ＋標的細胞の数の減少（図１５Ａを参照されたい）、及びｂ）ＣＳＦＥ＋標的細胞でのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ染色（図１５Ｂ、Ｃを参照されたい）。本発明者らはまた、ＣＤ６９及びＣＤ１０７ａの発現に基づいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化及び脱顆粒も調べた（図１６～２０を参照されたい）。最後に、本発明者らは、Ｔ細胞によるＩＦＮγ及びＴＮＦαの分泌を調べた（図２１を参照されたい）。結合データと一致して、ヒト化は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＢＤを有するｂｓＡｂによるＲＴＣＣの誘導、及びＴ細胞活性化、及びサイトカイン分泌
を維持した。特に、実施例１Ｃと一致して、親和性がより高いＣＤ３結合及び／又は２価のＣＬＤＮ１８．２結合は、ＲＴＣＣの効力、並びにＴ細胞活性化、脱顆粒、及びサイトカイン分泌を増強する。

【0431】

実施例３：抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂのさらなるキャラクタリゼーション
下記の表４は、生成して試験したさらなるｂｓＡｂの概要を示す。

【0432】

【表4】

【0433】

実施例３Ａ：抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂは、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２及びマウスＣＬＤＮ１８．２との交差反応性を示す
（例えば、モデル動物で治療薬を調べることにより）臨床開発を容易にするために、ｂｓＡｂがマウス及び／又はカニクイザルＣＬＤＮ１８．２との交差反応性を示すことは有用である。従って、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂを、ヒトＣＬＤＮ１８．２、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２、及びマウスＣＬＤＮ１８．２への結合に関して調べた。ヒトＣＬＤＮ１８．２、カニクイザルＣＬＤＮ１８．２、又はマウスＣＬＤＮ１８．２を発現するように、ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、指定の濃度のｂｓＡｂと混合し、４℃で１時間にわたりインキュベートした。細胞を洗浄し、次いで４℃で１時間にわたり、２次Ａｂで染色した。さらに２回洗浄した後、細胞を、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで分析した。図２２及び２３に示されるデータは、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂが、ヒト、カニクイザル、及びマウスの各ＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトした細胞に用量依存的に結合したことを示す。特に、「Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４７及びＸＥＮＰ２９４７６）は、「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットのｂｓＡｂ（即ち、ＸＥＮＰ２４６４５及びＸＥＮＰ２９４７２）と比較して、ＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトした細胞にはるかに強力に結合し、二価のｍＡｂフォーマット（即ち、ＸＥＮＰ２４６４４）と同様の効力で結合する。

【0434】

実施例３Ｂ：抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂは、オフターゲット反応性を示さない
オフターゲット反応性の欠如を確認するために、ヒトＣＬＤＮ１８．１、カニクイザルＣＬＤＮ１８．１、及びマウスＣＬＤＮ１８．１、並びにヒトＣＬＤＮ９に対する本発明のｂｓＡｂの結合を、ヒトＣＬＤＮ１８．１、カニクイザルＣＬＤＮ１８．１、若しくはマウスＣＬＤＮ１８．１、又はヒトＣＬＤＮ９を発現するように一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３を使用する以外は、全体的には上述したように調べた。図２４に示されるデータは、抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂがオフターゲット反応性を全く示さなかったことを示す。

【0435】

実施例３Ｃ：抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂは、様々なＲＴＣＣ効力を示す
抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂの効力をランク付けするために、ｂｓＡｂ及
び比較対象のｂｓＡｂ（ＡＭＧ９１０；国際公開第２０２０／０２５７９２号パンフレットの配列番号１３２）によるＮＵＧＣ４標的細胞の死滅を調べた。ＮＵＧＣ４標的細胞をＣＳＦＥで標識し、３７℃で一晩回復させた。次いで、ＮＵＧＣ４細胞を、４８時間にわたり、１０：１のエフェクター：標的比でのエフェクター細胞（各実験で異なるドナー）、及び指定の濃度の抗体と共にインキュベートした。細胞を染色して生細胞／死細胞を区別し、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１、及び抗ＣＤ６９－ＢＶ７８５で染色して様々なＴ細胞集団のＴ細胞活性化を区別し、Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターで分析した。図２５に示されるデータは、ｂｓＡｂがＲＴＣＣを効率的に誘導することを示す。ｂｓＡｂを、そのＲＴＣＣ効力に従って、下記のようにランク付けし得る：ＸＥＮＰ３１７２６（最高の効力）＞ＸＥＮＰ３２４６１＞ＸＥＮＰ２９４７８＞ＸＥＮＰ２９４７２（最低の効力）。特に、ＸＥＮＰ３２４６１は、比較対象の二重特異性抗体と同様の効力でＲＴＣＣを誘導しており、ＸＥＮＰ３１７２６は、比較対象の二重特異性抗体と比較して増強された効力でＲＴＣＣを誘導した。

【0436】

実施例３Ｄ：様々なＣＬＤＮ１８．２抗原密度を発現する細胞株でのＲＴＣＣ誘導のインビトロでのキャラクタリゼーション
抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂを、ＣＬＤＮ１８．２密度が異なる細胞に対する細胞死滅活性に関して調べた。最初のセットの実験では、ＢｘＰｃ３（６００ｋ個の、ＣＬＤＮ１８．２結合部位）、ＧＳＵ（７０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位）、ＮＵＧＣ４（５０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位）、及びＫａｔｏＩＩＩ（３０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位）標的細胞を、ＣＳＦＥで標識し、９６ウェル平底培養プレート中の１００μｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ）中に約１０Ｋ個の細胞／ウェルで播種して、３７℃で一晩回復させた。エフェクター細胞を、ヒトＰＢＭＣから単離し、１０：１のエフェクター：標的比での標的細胞、及び指定の濃度のｂｓＡｂと共にインキュベートした。インキュベーションの４８時間後、細胞を、３０分にわたり室温で、ＰＢＳ中のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能な青色死細胞染色キット（１：１０００）で染色した。次いで、試料を、１×ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１、及び抗ＣＤ６９－ＢＶ７８５で染色し、氷冷ＰＢＳで再度洗浄し、９０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。データを、固定容量（６０μｌ）でＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａにより取得した。ＲＴＣＣの誘導、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン分泌を示すデータを、図２６～３３に示す。実施例３Ｃのデータと一致して、このデータは、ＸＥＮＰ３１７２６及びＸＥＮＰ３２４６１（並びに追加のｂｓＡｂであるＸＥＮＰ３１７２４及びＸＥＮＰ２９４７６）が、ＸＥＮＰ２９４７８及びＸＥＮＰ２９４７２（並びに追加のｂｓＡｂであるＸＥＮＰ２９４７４）と比較して強力にＲＴＣＣを誘導したことを示す。

【0437】

別のセットの実験では、３：１という低いエフェクター：標的比での活性を調べた。ＫａｔｏＩＩＩ（３０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位）及びＨＧＣ２７－４Ｈ２（２０ｋ個のＣＬＤＮ１８．２結合部位）標的細胞を、ＣＳＦＥで標識し、９６ウェル平底培養プレート中の１００μｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ）中に播種して、３７℃で一晩回復させた。エフェクター細胞を、ヒトＰＢＭＣから単離し、３：１のエフェクター：標的比での標的細胞、及び指定の濃度のｂｓＡｂと共にインキュベートした。インキュベーションの２４時間後、細胞を、３０分にわたり室温で、ＰＢＳ中のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能な青色死細胞染色キット（１：１０００）で染色した。次いで、試料を、１×ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ７５０、抗ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、抗ＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１、及び抗ＣＤ６９－ＢＶ７８５で染色し、氷冷ＰＢＳで再度洗浄し、９０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。データを、固定容量（６０μｌ）でＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａにより取得した。ＲＴＣＣの誘導、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン分泌を示すデータを、図３４～３６に示す。
最後の実験では、１：１というさらに低いエフェクター：標的比での活性を、ＫａｔｏＩＩＩ標的細胞を使用して全体的には上述されているように調べた。データを図３７に示す。このデータは、試験したｂｓＡｂが、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞に対してＲＴＣＣ及び標的細胞死滅を効率的に誘導することを示す。

【0438】

実施例４：ＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０腫瘍担持ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスモデルにおけるＡＳＰ２１３８（ＸＥＮＰ３１７２６）の抗腫瘍効果
ＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０腫瘍担持ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）移植ＮＯＧマウスモデルにおける腫瘍増殖に対する抗ＣＬＤＮ１８．２×抗ＣＤ３ ｂｓＡｂ
ＡＳＰ２１３８（ＸＥＮＰ３１７２６）の効果を調べた。１４日にわたるＡＳＰ２１３８の週１回の腹腔内投与は、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ６０％、９１％、及び９９％のＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０腫瘍の顕著な増殖阻害を誘導したが、体重は減少しなかった。加えて、３ｍｇ／ｋｇ群での１０匹のマウス中の１匹は、完全な腫瘍退縮を達成した。

【0439】

この研究は、ＡＳＰ２１３８がヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスモデルにおいてヒトのクローディン１８．２発現胃がんに対して抗腫瘍効果を示すことを実証した。

【0440】

実施例４Ａ：材料及び方法
（ａ）抗体
ＡＳＰ２１３８（ロット番号ＤＳＰ２０８０４；アステラス製薬株式会社、東京、日本）を、投与前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。

【0441】

（ｂ）細胞株
内因的にヒトクローディン１８．２を発現する胃がん細胞株ＮＵＧＣ－４のサブクローンであるＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０を、Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧ（Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、５％ＣＯ_２中において３７℃で、１０％熱不活性化ウシ胎児血清及び１％ｇｌｕｔａｍａｘが補充されたＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。

【0442】

（ｃ）動物
６週齢の雌ＮＯＧマウスを、インビボサイエンス株式会社（東京、日本）から購入した。本研究は、ＡＡＡＬＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの認定を受けたアステラス製薬株式会社つくば研究所のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ
Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得た。

【0443】

（ｄ）ヒトＰＢＭＣ注射及び腫瘍接種
ヒトＰＢＭＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９３０００－１０Ｍ）を、２．５×１０^７個の細胞／ｍＬでＰＢＳに懸濁させ、５×１０^６個の細胞／２００μＬ／マウスで７週齢のマウスに静脈内注射した。ヒトＰＢＭＣ注射の１週間後、ＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０細胞を、１×１０^７個の細胞／ｍＬでＰＢＳに懸濁させ、１×１０^６個の細胞／１００μＬ／マウスで８週齢のマウスの脇腹に皮下接種して増殖させた。

【0444】

（ｅ）投与及び測定
ＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０細胞の接種の８日後、マウスを、群間で同様の平均腫瘍体積で割り当てた（ｎ＝１０）。次いで、ＡＳＰ２１３８の投与を開始した。投与の初日を、０日目とした。マウスに、０日目及び７日目にＰＢＳ又はＡＳＰ２１３８（０．１、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。腫瘍直径及び体重を、それぞれ０、３、７、１０、及び１４日目に、ノギス及びはかりを使用して測定した。腫瘍体
積［ｍｍ^３］を、式：
（腫瘍長軸の長さ［ｍｍ］）×（腫瘍短軸の長さ［ｍｍ］）^２×０．５
で決定した。

【0445】

腫瘍増殖の阻害率（Ｉｎｈ％）を、下記式：
Ｉｎｈ％＝１００×（１－各群での［１４日目の平均腫瘍体積－０日目の平均腫瘍体積］÷ＰＢＳ群での［１４日目の平均腫瘍体積－０日目の平均腫瘍体積］）
を使用して算出した。

【0446】

（ｆ）統計解析
値を、腫瘍体積及び体重の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表す。ＡＳＰ２１３８処置群での１４日目の平均腫瘍体積及び体重を、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用してＰＢＳ群と比較した。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意とみなした。データ処理に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０．２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン２００２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用した。

【0447】

実施例４Ｂ：結果及び結論
１４日にわたるＡＳＰ２１３８の週１回の腹腔内投与により、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスモデルにおいて、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇでのＮＵＧＣ－４ １０ｃＦ７＿５＿３Ｅ１０腫瘍の増殖阻害が、それぞれ６０％、９１％、及び９９％有意に誘導された（図３８）。加えて、３ｍｇ／ｋｇ群での１０匹中のマウスの１匹は、完全な腫瘍退縮を達成した。ＡＳＰ２１３８で処置されたマウスの体重は、いずれの試験用量でも影響を受けなかった（図３８）。

【0448】

この研究は、ＡＳＰ２１３８が、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスモデルにおいてヒト胃がんに対して抗腫瘍効果を示すことを実証した。試験した全てのｂｓＡｂ濃度に関して、インビボでの優れた抗腫瘍効果が示された。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38A】

【図38B】

【図38C】

【配列表】

2024116283000001.app

【外国語明細書】