知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024117065
(43)【公開日】2024-08-28
(54)【発明の名称】治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体
(51)【国際特許分類】
A61K 41/00 20200101AFI20240821BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240821BHJP
A61K 33/26 20060101ALI20240821BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240821BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240821BHJP
【ＦＩ】
A61K41/00
A61P35/00
A61K33/26
A61P19/02
A61K47/26
【審査請求】有
【請求項の数】28
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024009235
(22)【出願日】2024-01-25
(31)【優先権主張番号】10-2023-0020922
(32)【優先日】2023-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】518107501
【氏名又は名称】コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】１４５，Ａｎａｍ－ｒｏ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】カン，ヒミン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ウ－ヨン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076BB32
4C076CC27
4C076DD66
4C076FF68
4C084AA11
4C084MA67
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA11
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA67
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZA96
4C086ZB26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】癌治療、骨関節炎治療及び骨欠損治療に有効な、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を提供する。
【解決手段】鉄イオン、及び１種以上のリガンド、を含み、前記リガンドと鉄イオンが可逆的に自己集合又は自己分解され、前記リガンドと鉄イオンは、第１結合によって自己集合されて自己集合体を形成し、前記自己集合体は、前記金属イオン及びリガンドのいずれか一つ以上によって自己集合が行われ、前記自己集合体は複数個に備えられ、互いに隣接する自己集合体の間は第２結合によって自己結合されて備えられる、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体である。
【選択図】図１
【解決手段】鉄イオン、及び１種以上のリガンド、を含み、前記リガンドと鉄イオンが可逆的に自己集合又は自己分解され、前記リガンドと鉄イオンは、第１結合によって自己集合されて自己集合体を形成し、前記自己集合体は、前記金属イオン及びリガンドのいずれか一つ以上によって自己集合が行われ、前記自己集合体は複数個に備えられ、互いに隣接する自己集合体の間は第２結合によって自己結合されて備えられる、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
鉄イオン、及び
１種以上のリガンド、を含み、
前記リガンドと鉄イオンが可逆的に自己集合又は自己分解され、
前記リガンドと鉄イオンは第１結合によって自己集合されて自己集合体を形成し、
前記自己集合体は、前記金属イオン及びリガンドのいずれか一つ以上によって自己集合が行われ、
前記自己集合体は複数個に備えられ、互いに隣接する自己集合体の間は第２結合によって自己結合されて備えられる、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
１種以上のリガンド、を含み、
前記リガンドと鉄イオンが可逆的に自己集合又は自己分解され、
前記リガンドと鉄イオンは第１結合によって自己集合されて自己集合体を形成し、
前記自己集合体は、前記金属イオン及びリガンドのいずれか一つ以上によって自己集合が行われ、
前記自己集合体は複数個に備えられ、互いに隣接する自己集合体の間は第２結合によって自己結合されて備えられる、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項2】
前記第１結合は、配位結合を含み、
前記第２結合は、水素結合及びπ－π相互作用のいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記第２結合は、水素結合及びπ－π相互作用のいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項3】
前記自己集合体又は互いに隣接する自己集合体の間は、生理学的条件（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で第１時間自己集合されるか、又は第２時間自己分解され、
前記第１時間は、１分～２４時間であり、
前記第２時間は、１日～９０日である、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記第１時間は、１分～２４時間であり、
前記第２時間は、１日～９０日である、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項4】
前記リガンドは、
リン酸塩及びホスホネートの少なくともいずれか一つを含む、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
リン酸塩及びホスホネートの少なくともいずれか一つを含む、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項5】
前記リガンドは、
ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＥＰ（２－アミノエチルホスホン酸、２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏｈｅｘｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏａｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＦＡＮＡ（２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏａｒａｂｉｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＣｅＮＡ（ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の少なくともいずれか一つである、請求項４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＥＰ（２－アミノエチルホスホン酸、２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏｈｅｘｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏａｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＦＡＮＡ（２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏａｒａｂｉｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＣｅＮＡ（ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の少なくともいずれか一つである、請求項４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項6】
前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のいずれか一つ以上を含む、請求項４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項7】
前記リガンドがＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である場合、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、個別的な球形に備えられ、
前記リガンドがＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である場合、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられる、請求項６に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記リガンドがＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である場合、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられる、請求項６に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項8】
前記自己集合体は、常磁性を有し、
外部磁場印加によって前記自己集合体の移動が制御される、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
外部磁場印加によって前記自己集合体の移動が制御される、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項9】
前記自己集合体は、キレート剤を含む条件、強酸条件及び強塩基条件の少なくともいずれか一つの条件で自己分解が促進され、
前記キレート剤を含む条件で、前記キレート剤は、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ビピリジン（ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）、及びフェロジン（ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ）のいずれか一つ以上であり、
前記強酸条件のｐＨは、２～５で、
前記強塩基条件のｐＨは、９～１２である、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記キレート剤を含む条件で、前記キレート剤は、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ビピリジン（ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）、及びフェロジン（ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ）のいずれか一つ以上であり、
前記強酸条件のｐＨは、２～５で、
前記強塩基条件のｐＨは、９～１２である、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項10】
前記自己集合体は、過酸化水素を含む条件で活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）を生成し、
前記活性酸素種は、細胞のリン脂質を酸化させ、ＧＰＸ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ４）又はＳｙｓｔｅｍ ｘｃ－シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｃｙｓｔｉｎｅ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）（Ｘｃ）を抑制して、フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記活性酸素種は、細胞のリン脂質を酸化させ、ＧＰＸ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ４）又はＳｙｓｔｅｍ ｘｃ－シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｃｙｓｔｉｎｅ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）（Ｘｃ）を抑制して、フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項11】
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体は、ターゲット癌細胞に移動して、フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する、請求項１０に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体は、ターゲット癌細胞に移動して、フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する、請求項１０に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項12】
前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する間に、正常細胞では毒性を示さない、請求項１０に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項13】
前記自己集合体は癌治療に用いられ、
前記癌は、乳癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、結腸癌、甲状腺癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、脳癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、膵腸癌、前立腺癌、皮膚癌、舌癌、子宮癌、胃癌、骨癌、及び血液癌からなる群より選択されたいずれか一つ以上である、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記癌は、乳癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、結腸癌、甲状腺癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、脳癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、膵腸癌、前立腺癌、皮膚癌、舌癌、子宮癌、胃癌、骨癌、及び血液癌からなる群より選択されたいずれか一つ以上である、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項14】
前記リガンドは、ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含み、
前記自己集合体は、自己分解される間に前記ＡＴＰを放出して、Ｐ２Ｙ１受容体を通じてマクロファージのＭ２分極化を促進する、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記自己集合体は、自己分解される間に前記ＡＴＰを放出して、Ｐ２Ｙ１受容体を通じてマクロファージのＭ２分極化を促進する、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項15】
前記自己集合体は、骨関節の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に分布するマクロファージのＭ２分極化を促進し、
前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有する、請求項１４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有する、請求項１４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項16】
前記自己集合体は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）環境を保持し、骨軟骨を保護して、骨関節炎を予防、改善又は治療する、請求項１５に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項17】
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体はターゲット骨関節部位に移動し、骨軟骨を保護して、骨関節炎を予防、改善又は治療する、請求項１５に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体はターゲット骨関節部位に移動し、骨軟骨を保護して、骨関節炎を予防、改善又は治療する、請求項１５に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項18】
前記自己集合体は、骨関節の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に分布するマクロファージのＭ２分極化を促進し、
前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有する間に、正常細胞では毒性を示さない、請求項１５に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有する間に、正常細胞では毒性を示さない、請求項１５に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項19】
前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含み、
前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられ、
前記３次元凝集体は、平均直径が５００μｍ～１０ｃｍである、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられ、
前記３次元凝集体は、平均直径が５００μｍ～１０ｃｍである、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項20】
前記自己集合体は、前記３次元凝集体の形態で骨欠損部位に移植され、欠損された骨組職を修復させる骨移植材として利用される、請求項１９に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項21】
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、
前記自己集合体は、前記３次元凝集体の形態で骨欠損部位に移植され、
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体は、一方向及び他方向のいずれか一つ以上に移動する、請求項１９に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記自己集合体は、前記３次元凝集体の形態で骨欠損部位に移植され、
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体は、一方向及び他方向のいずれか一つ以上に移動する、請求項１９に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項22】
前記自己集合体は、骨欠損部位に移植され、
前記自己集合体の表面に宿主細胞が付着されて骨格を形成する、請求項１９に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記自己集合体の表面に宿主細胞が付着されて骨格を形成する、請求項１９に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項23】
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体の表面に付着された宿主細胞も一緒に移動する、請求項２２に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記外部磁場印加によって、前記自己集合体の表面に付着された宿主細胞も一緒に移動する、請求項２２に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項24】
前記自己集合体は、骨欠損部位に移植され、
前記自己集合体は、自己分解されて、１日～７０日間前記ＡＭＰを放出する、請求項１９に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記自己集合体は、自己分解されて、１日～７０日間前記ＡＭＰを放出する、請求項１９に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項25】
前記自己集合体で放出される前記ＡＭＰは、宿主細胞の表面でアデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）に分解されて、前記宿主細胞の表面のアデノシン受容体の信号伝逹（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を促進し、
前記アデノシン受容体は、アデノシンＡ２Ｂ受容体を含む、請求項２４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記アデノシン受容体は、アデノシンＡ２Ｂ受容体を含む、請求項２４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項26】
前記自己集合体で放出される前記ＡＭＰは、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）のアデノシン受容体の信号伝逹によって間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を促進し、
前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化は骨生成を促進する、請求項２４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化は骨生成を促進する、請求項２４に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項27】
前記自己集合体は、骨欠損部位に移植されて欠損された骨組職を再生する間に、正常細胞では毒性を示さない、請求項２０に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【請求項28】
前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のいずれか一つ以上を含み、
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部で印加される磁場によって移動が制御され、
前記リガンドがＡＭＰ及びＡＴＰのいずれか一つ以上である場合、前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導し、
前記リガンドがＡＴＰの場合、前記自己集合体は骨関節炎を予防、改善又は治療し、
前記リガンドがＡＭＰの場合、前記自己集合体は骨欠損部位に移植されて、欠損された骨組職を再生する、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部で印加される磁場によって移動が制御され、
前記リガンドがＡＭＰ及びＡＴＰのいずれか一つ以上である場合、前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導し、
前記リガンドがＡＴＰの場合、前記自己集合体は骨関節炎を予防、改善又は治療し、
前記リガンドがＡＭＰの場合、前記自己集合体は骨欠損部位に移植されて、欠損された骨組職を再生する、請求項１に記載の治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体に関し、より詳しくは、癌、骨関節炎及び骨欠損治療に向上された効果を有する治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体に関する。
【背景技術】
【0002】
最近、抗癌治療は、化学的に合成された薬物に依存する。代表的に、癌治療に用いられるドキソルビシンを含む化学療法薬物は、癌細胞の細胞自滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発して癌を治療する。一方、抗癌治療に用いられる代表的な薬物であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）は、それぞれ心臓、腎臓、神経に副作用を引き起こすと知られており、このような副作用により、患者の状態によって適切な処方が難しい限界点を有する。特にたくさん活用されるドキソルビシンの場合、薬物を使用可能な領域であるＴＩ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）が非常に狭く、このようなＴＩよりも高い濃度を用いる場合、致命的な副作用を発生させることと知られている。
【0003】
また、このような化学療法薬物は、脱毛、骨髄抑制、嘔吐、発疹、口内炎及び過敏症、アレルギー、心臓損傷、注射部位の操作損傷、放射線リコール（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｃａｌｌ）、治療関連白血病などの深刻な副作用を引き起こすことがある。また、癌が進行されながら細胞死滅抵抗性が大きくなるため、化学療法薬物による治療効能が弱くなることがある。
【0004】
したがって、従来の抗癌剤は癌を標的として、細胞死滅を誘導する方法に発展しており、多くの技術が開発されたが、このような癌細胞の除去に対する有効性は保持し、副作用の発生が少なく、従来の薬物による細胞死滅に抵抗性を有する癌を除去するための新しい方法が多様に研究されている。
【0005】
関節炎は、世界で最も一般的な慢性疾患の一つであるが、骨関節炎の病理生理学は完壁に研究されておらず、現在としては完全な治療法がない状態である。骨関節炎は、関節軟骨を損傷させて、患者に極甚な疼痛と障害を誘発し、関節軟骨の生理学的再生は制限された水準だけで発生する。そこで、多様な研究者が動物モデルを用いて骨関節炎の病理生理学を研究しながら治療法を捜してきた。最近には、薬物を用いて骨関節炎を治療する方法が行われている。このように、関節炎の治療に用いられる薬物では、ヒアルロン酸、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ）、ステロイド性ＴＡＡ（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）を利用して、炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を妨害する程度で、軟骨を再生させる薬物はほとんど全くない状況である。
【0006】
また、骨関節には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ、ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を含んで、多様な種類の細胞が存在する。骨関節内（ｊｏｉｎｔ ｃａｖｉｔｙ）の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）のサイトカインバランス（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｂａｌａｎｃｅ）が崩れて抗－炎症性（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインが抗炎症性（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）より過度に増加されて骨関節炎が悪化される。
【0007】
したがって、骨関節の治療に効果的で、骨関節内のサイトカインバランスを正常骨関節水準に調節することができる薬物及び治療方法に対する研究が必要である。
【0008】
大腿骨を含む長骨骨折で広範囲な骨欠損は、臨床的に治療が非常に難しい。最近にはこのような広範囲骨欠損の治療方法として、誘導膜方法（ｉｎｄｕｃｅｄｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が用いられる。誘導膜方法は、一次手術で死んだ骨や感染された骨を全部除去した後、欠損部位をリン酸カルシウム（Ｃａ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの骨セメントで満たし、骨セメントと反応して生ずる誘導膜形成を約４～６週間待ってから、その後に二次手術で骨セメントの除去及び骨欠損部位に大量の自家骨の移植を施行する方法である。このような誘導膜方法に用いられるＢＭＰの場合、実際治療に活用されるのに非常に高い価格を形成しており、臨床的に克服すべき問題点がある。また、ＢＭＰを含んでいる自家骨移植などを利用して限定的に行われており、採取する自家骨が不足な場合や、骨欠損部位が広すぎて骨盤骨、脛骨を含んだ採取可能なすべての自家骨を採取しても、その量が不足な場合がある。
【0009】
このような自家骨移植は、採取部位の痛症によるリハビリ遅延、出血、感染、医原性骨折のような多くの合併症を誘発して、誘導膜方法で自家骨を代替できる移植材の研究が必要な状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】ＫＲ１０－０９０１１２７ Ｂ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の目的は、生体内の物質に基づいて多様な形態に自己集合が可能であり、生体で副反応が発生しない、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を提供することである。
【0012】
また、本発明の他の目的は、生体に毒性がなく、リガンドの種類によって多様な形態に自己集合され、生体内に存在する治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を生体外部で容易に位置制御が可能で、標的する位置を効果的に治療することができる、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明の一側面によれば、本発明の実施形態は、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を含む。
【0014】
一実施形態において、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、鉄イオン；及び１種以上のリガンド；を含み、前記リガンドと鉄イオンが可逆的に自己集合又は自己分解され、前記リガンドと鉄イオンは第１結合によって自己集合されて自己集合体を形成してもよい。
【0015】
一実施形態において、前記自己集合体は、前記金属イオン及びリガンドのいずれか一つ以上によって自己集合が行われ、前記自己集合体は複数個に備えられ、互いに隣接する自己集合体の間は第２結合によって自己結合されて備えられてもよい。
【0016】
一実施形態において、前記第１結合は配位結合を含み、前記第２結合は水素結合及びπ－π相互作用のいずれか一つ以上を含んでもよい。
【0017】
一実施形態において、前記自己集合体又は互いに隣接する自己集合体の間は、生理学的条件（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で第１時間自己集合されるか、又は第２時間自己分解され、前記第１時間は、１分～２４時間であり、前記第２時間は、１日～９０日であってもよい。
【0018】
一実施形態において、前記リガンドは、リン酸塩及びホスホネートの少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0019】
一実施形態において、前記リガンドは、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＥＰ（２－アミノエチルホスホン酸、２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏｈｅｘｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏａｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＦＡＮＡ（２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏａｒａｂｉｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＣｅＮＡ（ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の少なくともいずれか一つであってもよい。
【0020】
一実施形態において、前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のいずれか一つ以上を含んでもよい。
【0021】
一実施形態において、前記リガンドがＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である場合、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、個別的な球形に備えられ、前記リガンドがＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である場合、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられてもよい。
【0022】
一実施形態において、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって前記自己集合体の移動が制御されてもよい。
【0023】
一実施形態において、前記自己集合体は、キレート剤を含む条件、強酸条件及び強塩基条件の少なくともいずれか一つの条件で自己分解が促進されてよい。
【0024】
前記キレート剤を含む条件で、前記キレート剤は、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ビピリジン（ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）、及びフェロジン（ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ）のいずれか一つ以上であり、前記強酸条件のｐＨは、２～５であり、前記強塩基条件のｐＨは、９～１２であってもよい。
【0025】
一実施形態において、前記自己集合体は、過酸化水素を含む条件で過量の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）を生成し、前記活性酸素種は、細胞のリン脂質を酸化させ、ＧＰＸ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ４）又はＳｙｓｔｅｍ ｘｃ－シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｃｙｓｔｉｎｅ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）（Ｘｃ）を抑制して、フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導してもよい。
【0026】
一実施形態において、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、前記外部磁場印加によって、前記自己集合体は、ターゲット癌細胞に移動して、フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導してもよい。
【0027】
一実施形態において、前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する間に、正常細胞では毒性を示さないことがある。
【0028】
一実施形態において、前記自己集合体は癌治療に用いられ、前記癌は、乳癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、結腸癌、甲状腺癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、脳癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、膵腸癌、前立腺癌、皮膚癌、舌癌、子宮癌、胃癌、骨癌、及び血液癌からなる群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。
【0029】
一実施形態において、前記リガンドは、ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含み、前記自己集合体は、自己分解される間に前記ＡＴＰを放出して、Ｐ２Ｙ１受容体を通じてマクロファージのＭ２分極化を促進してもよい。
【0030】
一実施形態において、前記自己集合体は、骨関節の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に分布するマクロファージのＭ２分極化を促進し、前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有してもよい。
【0031】
一実施形態において、前記自己集合体は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）環境を保持し、骨軟骨を保護して、骨関節炎を予防、改善又は治療することができる。
【0032】
一実施形態において、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、前記外部磁場印加によって、前記自己集合体はターゲット骨関節部位に移動し、骨軟骨を保護して、骨関節炎を予防、改善又は治療することができる。
【0033】
一実施形態において、前記自己集合体は、骨関節の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に分布するマクロファージのＭ２分極化を促進し、前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有する間に、正常細胞では毒性を示さないことがある。
【0034】
一実施形態において、前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含み、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられ、前記３次元凝集体は、平均直径が５００μｍ～１０ｃｍであってもよい。
【0035】
一実施形態において、前記自己集合体は、前記３次元凝集体の形態で骨欠損部位に移植され、欠損された骨組職を修復させる骨移植材として利用されてもよい。
【0036】
一実施形態において、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、前記自己集合体は、前記３次元凝集体の形態で骨欠損部位に移植され、前記外部磁場印加によって、前記自己集合体は、一方向及び他方向のいずれか一つ以上に移動してもよい。
【0037】
一実施形態において、前記自己集合体は、骨欠損部位に移植され、前記自己集合体の表面に宿主細胞が付着されて骨格を形成してもよい。
【0038】
一実施形態において、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、前記外部磁場印加によって、前記自己集合体の表面に付着された宿主細胞も一緒に移動してもよい。
【0039】
一実施形態において、前記自己集合体は、骨欠損部位に移植され、前記自己集合体は、自己分解されて、１日～７０日間前記ＡＭＰを放出してもよい。
【0040】
一実施形態において、前記自己集合体で放出される前記ＡＭＰは、宿主細胞の表面でアデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）に分解されて、前記宿主細胞の表面のアデノシン受容体の信号伝逹（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を促進し、前記アデノシン受容体は、アデノシンＡ２Ｂ受容体を含んでもよい。
【0041】
一実施形態において、前記自己集合体で放出される前記ＡＭＰは、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）のアデノシン受容体の信号伝逹によって間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を促進し、前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化は骨生成を促進してもよい。
【0042】
一実施形態において、前記自己集合体は、骨欠損部位に移植されて欠損された骨組職を再生する間に、正常細胞では毒性を示さないことがある。
【0043】
一実施形態において、前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のいずれか一つ以上を含み、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部で印加される磁場によって移動が制御され、前記リガンドがＡＭＰ及びＡＴＰのいずれか一つ以上である場合、前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導し、前記リガンドがＡＴＰの場合、前記自己集合体は骨関節炎を予防、改善又は治療し、前記リガンドがＡＭＰの場合、前記自己集合体は骨欠損部位に移植されて、欠損された骨組職を再生することができる。
【発明の効果】
【0044】
上記した本発明に係ると、局所部位に標的治療が可能であり、副作用がなく、細胞死滅を容易に誘導して癌治療に効果的な治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を提供することができる。
【0045】
また、本発明に係ると、骨関節炎の悪化を防ぐために、骨関節炎が発生した骨関節内のサイトカインバランスを正常骨関節水準に調節する治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を提供することができる。
【0046】
また、本発明に係ると、骨欠損を効果的に治療し、副作用のない治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】本発明の一実施形態によって鉄イオンとＡＴＰが自己集合体を形成する状態を概略的に示した図面である。
【図2】本発明の一実施形態による鉄イオンとＡＭＰが自己集合体を形成する状態を概略的に示した図面である。
【図3】Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体のＳＥＭイメージと、常磁性を測定した結果である。
【図4】本発明の一実施形態による平均直径がそれぞれ１５０ｎｍ及び７０ｎｍのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体のＳＥＭイメージである。
【図5】Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体のＴＥＭイメージである。
【図6】Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を利用して癌細胞にフェロトーシス（ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導する状態を概略的に示した図面である。
【図7】鉄アッセイキット（ｉｒｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を利用して測定したｐＨ５．５又はｐＨ７．４でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の鉄イオン放出量を示したグラフである。
【図8】各条件によるＤＣＦＤＡ染色で測定した細胞内ＲＯＳ濃度を示した。
【図9】ＩＶＩＳ Ｌ－０１２ ＲＯＳ信号を分析した結果である。
【図10】磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の持続的なＦｅ２＋放出による癌細胞のフェロトーシスを確認した結果である。
【図11】磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体がドキソルビシンと同様に骨肉種（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）癌を効果的に治療することを示した。
【図12】Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を生体内に移植した後の毒性を確認した結果である。
【図13】磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の軟骨保護（Ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を確認した結果である。
【図14】ＨＰＬＣで測定したＦｅ－ＡＴＰ自己集合体でＡＴＰ放出累積プロファイルを示したグラフである。
【図15】Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の分解によるマクロファージの分極化を免疫蛍光イメージで確認した結果である。
【図16】Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の分解によってマクロファージの分極化をフローサイトメトリーで確認した結果である。
【図17】Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の分解をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した結果である。
【図18】Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体による骨関節炎治療効果を確認するための膝骨関節のＣ－Ａｒｍ及び３－ＤマイクロＣＴイメージである。
【図19】８週目の骨関節炎モデルの膝骨関節の２－ＤマイクロＣＴイメージ、Ｈ＆Ｅ染色、サフラニン－ｏ（ｓａｆｒａｎｉｎ－ｏ）（Ｓ－Ｏ）染色イメージである。
【図20】８週目の骨関節炎モデルのＨ＆Ｅ染色、サフラニン－ｏ（ｓａｆｒａｎｉｎ－ｏ）（Ｓ－Ｏ）染色及びコラーゲンＸ染色イメージである。
【図21】８週目の骨関節炎モデルの膝骨関節の滑膜のｉＮＯＳ及びＡｒｇ－１染色イメージである。
【図22】骨関節炎ラットモデル（ｒａｔｍｏｄｅｌ）で確認したＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の毒性結果である。
【図23】３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体の骨再生効果を概略的に示した図面である。
【図24】３Ｄ形態のＦｅ－ＡＭＰ自己集合体が凝集されたマイクロポア構造を示したＳＥＭイメージである。
【図25】３Ｄ形態のＦｅ－ＡＭＰ自己集合体を磁気的に標的化する状態を示した図面である。
【図26】Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体で時間によって放出されたＡＭＰを示したグラフである。
【図27】３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体で放出されたＡＭＰ－分解アデノシンによって骨形成分化が促進されることを免疫蛍光イメージで確認した結果である。
【図28】３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体で放出されたＣＤ７３－媒介ＡＭＰ－分解アデノシンによって骨形成分化を確認したウェスタンブロッティング結果である。
【図29】０、２、４、６及び８週で骨折を確認するための大腿骨のＣ－Ａｒｍイメージである。
【図30】８週目の骨折を識別するための大腿骨のマイクロＣＴイメージである。
【図31】骨折に対するＨ＆Ｅ、オステオカルシン及びＴＲＡＰ染色イメージである。
【図32】生体内３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体の毒性を確認した結果である。
【発明の実施のための形態】
【0048】
その他実施形態の具体的な事項は、詳細な説明及び図面に含まれている。
【0049】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、添付する図面とともに詳細に後述されている実施形態を参照すると明確になり得る。しかしながら、本発明は以下に開示される実施形態に限定されるのでなく、互いに異なる多様な形態に具現されることができ、以下の説明で他に明示されない限り、本発明に成分、反応条件、成分の含量を表現するすべての数字、値及び／又は表現は、このような数字が本質的に他のもの中でこのような値を得る際に発生する測定の多様な不確実性が反映された近似値であるので、すべての場合、「約」という用語によって修飾されることに理解されるべきである。また、本記載で数値範囲が開示される場合、このような範囲は連続的であり、他に指摘されない限りこのような範囲の最小値から最大値が含まれた前記最大値までのすべての値を含む。さらに、このような範囲が整数を指称する場合、他に指摘されない限り最小値から最大値が含まれた前記最大値までを含むすべての整数が含まれる。
【0050】
また、本発明で範囲が変数に対して記載される場合、前記変数は、前記範囲の記載された終了点を含む記載された範囲内のすべての値を含むことに理解され得る。例えば、「５～１０」の範囲は、５、６、７、８、９、及び１０の値だけでなく、６～１０、７～１０、６～９、７～９などの任意の下位範囲を含み、５．５、６．５、７．５、５．５～８．５及び６．５～９などのような記載された範囲の範疇に妥当な整数の間の任意の値も含むことに理解され得るはずである。例えば、「１０％～３０％」の範囲は、１０％、１１％、１２％、１３％などの値と３０％までを含むすべての整数だけでなく、１０％～１５％、１２％～１８％、２０％～３０％などの任意の下位範囲を含み、１０．５％、１５．５％、２５．５％などのように記載された範囲の範疇内の妥当な整数の間の任意の値も含むことに理解され得るはずである。
【0051】
図１は、本発明の一実施形態によって鉄イオンとＡＴＰが自己集合体を形成する状態を概略的に示した図面である。図２は、本発明の一実施形態による鉄イオンとＡＭＰが自己集合体を形成する状態を概略的に示した図面である。
【0052】
図１及び図２を参照すると、本実施形態による治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、鉄イオン、及び１種以上のリガンドを含み、前記リガンドと鉄イオンが可逆的に自己集合又は自己分解され、前記リガンドと鉄イオンは、第１結合によって自己集合されて自己集合体を形成する治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を含むことができる。また、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体において、前記自己集合体は、前記金属イオン及びリガンドのいずれか一つ以上によって自己集合が行われ、前記自己集合体は複数が備えられ、互いに隣接する自己集合体の間は第２結合によって自己結合されて備えられてもよい。
【0053】
本実施形態において、治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体（以下、生体分子－金属イオン自己集合複合体）は、疾病などの治療に効果があり、磁性を有し、生体分子と金属イオンが自己集合された形態の自己集合体を含み、前記自己集合体は、一つ以上に備えられて、複合体を形成することができる。
【0054】
前記リガンドは、リン酸塩及びホスホネートの少なくともいずれか一つを含んでもよい。具体的には、前記リガンドは、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＥＰ（２-アミノエチルホスホン酸、２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏｈｅｘｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＮＡ（１、５－ａｎｈｙｄｒｏａｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＦＡＮＡ（２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏａｒａｂｉｎｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＣｅＮＡ（ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の少なくともいずれか一つであってもよい。より具体的には、前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のいずれか一つ以上を含んでもよい。
【0055】
前記リガンドと前記鉄イオンは、第１結合によって自ら自己結合して自己集合体を形成し、互いに隣接する自己集合体の間は第２結合によって自ら自己結合して、生体分子－金属イオン自己集合複合体を形成することができる。前記生体分子－金属イオン自己集合複合体において、前記第１結合は配位結合を含み、前記第２結合は水素結合及びπ－π相互作用のいずれか一つ以上を含んでもよい。
【0056】
図１で、鉄イオン（Ｆｅ２＋）は、リガンドであるＡＴＰと配位結合によって自己集合して、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を形成することができる。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は、互いに隣接するＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の間に水素結合及びπ－π相互作用のいずれか一つ以上によって自己集合して、本発明の一実施形態による治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を形成することができる。
【0057】
また、図２で、鉄イオン（Ｆｅ２＋）は、リガンドであるＡＭＰと配位結合によって自己集合して、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を形成することができる。Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、互いに隣接するＦｅ－ＡＭＰ自己集合体の間に水素結合及びπ－π相互作用のいずれか一つ以上によって自己集合して、本発明の一実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体を形成することができる。
【0058】
前記鉄イオンは、ＡＴＰ又はＡＭＰのリン酸基部位及び水（Ｈ２Ｏ）と配位結合して、金属錯体を形成することができる。また、前記ＡＴＰ又はＡＭＰのアデニン部位の芳香族環は、π－π相互作用を形成することができる。また、前記アデニン部位の窒素と前記鉄イオンに結合した水分子は、水素結合を形成することができる。前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、配位結合、π－π相互作用及び水素結合のいずれか一つ以上を利用して自己結合されて、一つ以上の自己集合体を含む複合体の形態に形成されることができる。
【0059】
前記自己集合体又は互いに隣接する自己集合体の間は、生理的条件（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で第１時間の間自己集合されるか、又は第２時間の間自己分解されてもよい。前記第１時間は１分～２４時間であり、前記第２時間は１日～９０日であってもよい。
【0060】
前記生理的条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、イオン強度、粘度、及び生存有機体と両立することができ／又は通常生存培養酵母細胞又は哺乳動物細胞のうち、細胞内に存在する類似生化学的媒介変数を指称する。例えば、ヒト細胞の場合、約３７℃、例えば３５～３９℃区間の温度、１ｋＰａ～２００ｋＰａ区間、約７のｐＨなどを含む。具体的には、生体又は動物に毒性がない条件、生体又は動物が保持できる条件を意味する。
【0061】
前記自己集合体は、第１時間の１分～２４時間に自己集合されることができるが、１分未満の場合には、自己集合体が第１結合又は第２結合を安定的に形成できなくて問題となり、２４時間の場合、十分に自己集合されるので、これを超えて時間を保持することが効率を低下させる。具体的には、前記第１時間は、約１分～２０時間、又は、約１分～１５時間、又は、約１分～１０時間、約１分～５時間、又は、約１分～２時間、又は、約１分～３０分であってもよい。
【0062】
前記自己集合体は、第２時間の１日～９０日間自己分解されることができるが、上述した時間の間に自己分解されながら、鉄イオン又はリガンドを放出することにより、安定的で、かつ治療的な効果を奏することができる。具体的には、前記第２時間は、約１日～４５日、又は、約１日～３０日、又は、約１日～１５日、又は、約１日～１０日であってもよい。
【0063】
前記リガンドがＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の場合、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、個別的な球形に備えられてもよい。また、前記リガンドがＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の場合、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられてもよい。
【0064】
具体的には、前記リガンドがＡＴＰの場合、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、球形を呈し、均一な直径に形成されてもよい。前記生体分子－金属イオン自己集合複合体の直径は、前記リガンドの濃度及び鉄イオンの濃度のいずれか一つ以上によって異なるように形成されてもよい。具体的には、前記鉄イオンの濃度が高い場合、前記自己集合体の直径は増加されてもよい。また、前記リガンドの濃度が高い場合、前記自己集合体の直径は増加されてもよい。本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、リガンドをＡＴＰで利用する場合、鉄イオンの濃度及び／又はＡＴＰの濃度を制御して、生体分子－金属イオン自己集合複合体の直径を制御することができる。
【0065】
前記リガンドがＡＭＰの場合、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、３次元凝集体の形態に備えられてもよい。具体的には、内部に複数個のマイクロポアを有する体積を有する形態に備えられてもよい。例えば、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、リガンドをＡＭＰで利用する場合にも、前記鉄イオンの濃度及び／又はＡＭＰの濃度を制御することにより、前記３次元凝集体の大きさを制御することができる。具体的には、鉄イオンの濃度を増加させたり、或いはＡＭＰの濃度を増加させる場合、前記３次元凝集体の大きさを増加させることができる。前記３次元凝集体の大きさは、１００ｎｍ～１００ｃｍであってもよい。具体的には、前記３次元凝集体の大きさは、球形の場合平均直径で、円筒状の場合断面の平均直径と高さの平均値で、多角形の場合、辺の長さと高さの平均値であってもよい。前記３次元凝集体の大きさは、約１００ｎｍ～８０ｃｍ、又は、約１００ｎｍ～５０ｃｍ、又は、約１００ｎｍ～３０ｃｍ、又は、約１００ｕｍ～３０ｃｍ、又は、約２００ｕｍ～３０ｃｍ、約３００ｕｍ～３０ｃｍ、又は、約４００ｕｍ～３０ｃｍ、又は５００ｕｍ～３０ｃｍ、又は５００ｕｍ～２０ｃｍ、又は５００ｕｍ～１０ｃｍであってもよい。
【0066】
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって前記自己集合体の移動が制御されることができる。具体的には、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、生体内又は生体外に備えられ、外部磁場印加によって前記生体分子－金属イオン自己集合複合体を構成する自己集合体の移動を制御することができる。したがって、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、所望の位置に移動を制御することができ、具体的には、生体内に注入した後にも標的する細胞又は組織的に前記生体分子－金属イオン自己集合複合体を移動させて、直接的に効果を示すようにすることができる。
【0067】
前記自己集合体は、キレート剤を含む条件、強酸条件及び強塩基条件の少なくともいずれか一つの条件で自己分解が促進されることができる。
【0068】
前記キレート剤を含む条件で、前記キレート剤は、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ビピリジン（ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）、及びフェロジン（ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ）のいずれか一つ以上であってもよい。
【0069】
前記キレート剤は、前記リガンドの代わりに鉄イオンと結合を形成して、前記自己集合体が自己分解されることを促進させることができる。前記キレート剤は、前記鉄イオンに対して前記リガンドよりも親和力の高い物質であってもよく、例えば、ＥＤＴＡであってもよい。
【0070】
前記強酸条件のｐＨは、２～５で、前記強塩基条件のｐＨは、９～１２であってもよい。具体的には、前記強酸条件のｐＨは、３～４で、前記強塩基条件のｐＨは、１０～１１であってもよい。例えば、前記強酸は、例えば塩酸（ＨＣｌ）であってもよく、前記強塩基は、例えば、ＮａＯＨであってもよい。
【0071】
前記強酸又は強塩基条件は、前記鉄イオンとリガンドの結合が分解されることを促進させることができ、前記自己集合複合体の自己分解を促進させることもできる。
【0072】
前記自己集合体は常磁性を有することができる。前記自己集合体又は生体分子－金属イオン自己集合複合体の体積が増加されるほど、磁気モーメントが増加されることができる。したがって、前記自己集合複合体が大きく形成されるほど、磁場を印加すれば磁場による引力（又は斥力）がより大きく作用することができる。具体的には、生体内及び生体外で前記生体分子－金属イオン自己集合複合体側に磁場を印加する場合、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、前記磁場によって移動が制御されることができ、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体が大きいほど生体分子－金属イオン自己集合複合体の移動速度をより増加させることができる。また、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体に磁場が形成された場合のみ磁性を帯びるので、生体内及び生体外で前記生体分子－金属イオン自己集合複合体を容易に調節することができる。
【0073】
本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、フェロトーシス（ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することができ、特定癌細胞を死滅させることができる。
【0074】
通常、抗癌治療には化学的に合成された薬物に依存し、そのうち、代表的な薬物であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などは、心臓、腎臓、神経などに副作用を引き起こして問題となる。また、癌を治療する過程で、正常組職（ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ）に損傷を減らすために、癌を標的とする標的治療剤、免疫治療剤などが開発されて用いられているが、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）のような場合には、患者個人ごとに有しいる標的物質が異なることから、標的治療剤を利用しにくく、免疫治療剤のような場合、高価であるため、実際治療で用いるには非常に難しい状況である。
【0075】
一方、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、生体に毒性がなく、外部で印加する磁性によって癌細胞を標的化して移動させることができる。また、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、癌細胞でフェロトーシスを誘導して癌細胞を効果的に死滅させることができ、周辺の正常細胞に影響がなく、体内毒性がないので安定的に使用可能である。前記フェロトーシスは、細胞リン脂質の酸化的損傷によって誘導される細胞死滅とは異なる方式で細胞死滅を誘導することができる。
【0076】
本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体で、前記自己集合体は、１０μＭ以上の濃度の過酸化水素を含む条件で過量の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）を生成し、前記活性酸素種の生成量は添加した自己集合体の濃度及び過酸化水素の濃度に比例することができる。前記自己集合体及び過酸化水素を添加する前の癌細胞と比べた時、活性酸素種の生成量が４倍以上生成されることができ、前記活性酸素種によってフェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を効果的に誘導することができる。具体的には、前記過酸化水素の濃度は、約１０μＭ～１０Ｍ、又は１０μＭ～５Ｍ、又は２０μＭ～１０Ｍ、又は３０μＭ～１０Ｍ、又は４０μＭ～１０Ｍ、又は５０μＭ～１０Ｍであってもよい。
【0077】
通常、一般細胞は過酸化水素の濃度が約２０ｎＭ以下で、癌細胞は過酸化水素の濃度が約１０μＭ以上、例えば１０μＭ～１００μＭで一般細胞よりも高く表れる。よって、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、高い過酸化水素濃度を示す癌細胞のみで自己分解されてＦｅ２＋を放出し、放出されたＦｅ２＋は、フェントン反応で過量のＲＯＳを生成するようになって、フェロトーシス（ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ）による癌細胞死滅が発生することができる。
【0078】
前記活性酸素種は、細胞のリン脂質を酸化させ、ＧＰＸ４（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ４）又はＳｙｓｔｅｍ ｘｃ－シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｃｙｓｔｉｎｅ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）（Ｘｃ）を抑制して、フェロトーシスによって癌細胞の死滅を誘導することができる。前記ＧＰＸ４は、細胞内に存在し、酸化されたリン脂質を復旧する酵素であり、ＧＰＸ４は、Ｓｙｓｔｅｍ ｘｃ－シスチン／グルタミン酸アンチポーター（ｃｙｓｔｉｎｅ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）（Ｘｃ）によって調節される。
【0079】
前記本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、鉄イオンを含み、前記鉄イオンは、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体を構成する自己集合体の自己分解によって放出されることができる。前記鉄イオンは生体物質で、癌細胞内に高濃度に存在する過酸化水素と反応してフェントン反応でＲＯＳを発生させ、前記ＲＯＳは、酸化反応で細胞リン脂質を損傷させて、癌細胞のフェロトーシスを誘発することができる。具体的には、前記ＲＯＳは、細胞のリン脂質を酸化させ、酸化されたリン脂質が過量発生してＧＰＸ４とＸｃが減少される。前記酸化されたリン脂質が過度に発生する場合、ＧＰＸ４によって復旧し難い状態になると、細胞のフェロトーシスが誘発される。
【0080】
前記細胞のフェロトーシスが癌細胞ではない他の器官に作用する場合、心臓副作用（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙなど）が発生されることがあり、したがって、人工的に合成されたドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）などのような薬物を利用してフェロトーシスを誘導して癌を治療する過程で、癌細胞の周辺の正常細胞まで副作用を発生して問題となる。
【0081】
一方、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、外部で印加される磁場によって局所部位を標的化することができて、選択的に癌細胞のみ取り除くことができる。前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、生体分子と、体内毒性のない鉄イオンからなり、体内毒性がなくて、副作用がなく、長期間持続的に使用可能である。また、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、正常細胞には影響を及ぼさないながら、癌細胞特異的にフェロトーシスを誘導して癌細胞を死滅させて、癌治療に効果的に作用することができる。
【0082】
前記生体分子－金属イオン自己集合複合体で、自己集合体は、酸性（ａｃｉｄｉｃ）条件で自己分解の速度が増加することができる。よって、中性条件である正常細胞では分解速度が遅い一方、酸性条件は癌細胞では分解速度が早く実行されることができる。また、癌細胞では正常細胞より相対的に高い過酸化水素と酸性条件で前記生体分子－金属イオン自己集合複合体によって特異的にＲＯＳを生成させることができる。すなわち、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体で、前記自己集合体の分解速度は正常細胞よりも癌細胞で非常に早く発生されるので、前記自己集合体の自己分解によって発生する鉄イオンの分解及びＲＯＳ生成フェントン反応大部分は前記癌細胞に作用するので、前記正常細胞にはほとんど影響が発生しない。
【0083】
また、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、従来の治療における代表的な薬物であるドキソルビシンと比較すると、局所部位標的が可能で、副作用は少なく、癌細胞死滅の有効性は類似し、心臓の副作用が発生しないという効果を奏する。
【0084】
本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体で、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御され、前記外部磁場印加によって前記自己集合体は、ターゲット癌細胞に移動して、フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導することができる。
【0085】
前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する場合、ドキソルビシンと同様の水準で前記癌細胞を死滅させることができる。また、前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導する間に、正常細胞では毒性を示さないこともある。
【0086】
本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体で、前記自己集合体は癌治療に用いられ、前記癌は、乳癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、結腸癌、甲状腺癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、子宮頸癌、脳癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、膵腸癌、前立腺癌、皮膚癌、舌癌、子宮癌、胃癌、骨癌、及び血液癌からなる群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。
【0087】
本発明の他の実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体で、前記自己集合体は、鉄イオンとリガンドが第１結合で自己集合し、前記自己集合体は、互いに隣接する自己集合体同士が第２結合で自己集合することができる。この時、前記リガンドは、ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含み、前記自己集合体は、自己分解される間に前記ＡＴＰを放出して、Ｐ２Ｙ１受容体を通じてマクロファージのＭ２分極化を促進することができる。また、前記自己集合体は、骨関節の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に分布するマクロファージのＭ２分極化を促進し、前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有することができる。
【0088】
通常、関節炎の治療は炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を防止する水準で行われ、軟骨を再生させる薬物はほとんど全くない状況である。骨関節には、ＭＳＣ、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、纎維母細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を含んで、多様な種類の細胞が存在し、骨関節内（ｊｏｉｎｔ ｃａｖｉｔｙ）の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）のサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）バランスが崩れる場合、炎症を促進する炎症誘発サイトカイン（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が抗炎症性サイトカイン（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）よりも過度に増加する場合、骨関節炎が悪化される。
【0089】
前記自己集合体は、生体物質であるＡＴＰをリガンドに含み、前記ＡＴＰは多様な細胞膜受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して、細胞の機能を制御することができる。前記ＡＴＰと結合する細胞膜受容体の種類は、ＡＴＰの濃度によって制御されることができる。前記マクロファージは、骨関節内滑液のサイトカインのバランスに大きな影響を与える可能性がある。骨関節炎が発生した骨関節内滑液には、約０．５ｎＭのＡＴＰが含まれており、前記Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を通じてＡＴＰ濃度を若干高めた場合（例えば、数μＭ）は、Ｐ２Ｙ受容体シリーズを通じてＭ２分極化を促進して、抗炎症性サイトカインの分泌を促進するが、前記ＡＴＰ濃度が非常に高い場合（例えば、数ｍＭ）は、Ｐ２Ｘ受容体シリーズを通じてＭ１分極化を促進して、炎症誘発サイトカインの分泌を促進する。
【0090】
具体的には、本実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体を骨関節炎が発生した部位に注入する場合、前記自己集合体は分解されてＡＴＰを放出し、前記ＡＴＰは、５－１０μＭ濃度に制御されて、骨関節の滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に分布するマクロファージのＭ２分極化を促進し、前記マクロファージのＭ２分極化は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有することができる。また、前記自己集合体の自分分解によって発生したＡＴＰが前記マクロファージのＭ２分極化を制御する場合、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）活性を有する間に、正常細胞では毒性を示さない場合もある。また、前記自己集合体は、骨関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）の抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）環境を保持して骨軟骨を保護して、骨関節炎を予防、改善又は治療することができる。
【0091】
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御されることができる。よって、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体を生体内注入した後、前記外部磁場印加によって前記自己集合体はターゲット骨関節部位に移動して骨軟骨を保護して、骨関節炎を予防、改善又は治療することができる。
【0092】
本発明のまた他の実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体は、一つ以上の自己集合体を含み、前記自己集合体は、鉄イオンとリガンドが第１結合によって自己集合されることができる。この時、前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含み、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、複数個の自己集合体が凝集されて、マイクロポアを有する３次元凝集体に備えられてもよい。前記３次元凝集体は、平均直径が５００μｍ～１０ｃｍであってもよい。前記自己集合体は、前記３次元凝集体の形態で骨欠損部位に移植されて、欠損された骨組職を修復させる骨移植材として利用されることができる。例えば、前記３次元凝集体に形成された生体分子－金属イオン自己集合複合体で、平均直径が５００μｍ未満の場合、骨移植材として用いるのに小さすぎて問題となり、１０ｃｍを超える場合には、前記３次元凝集体の強度が減少されて問題となる。
【0093】
前記３次元凝集体の形態は、用いられるモールドによって多様な形態の立体構造からなってもよく、内部に複数個のマイクロポアを含んでもよい。例えば、前記３次元凝集体は、前記マイクロポアが３次元的に相互連結されている網目構造に備えられてもよおい。
【0094】
大腿骨を含む長骨骨折で広範囲な領域で骨欠損が発生した場合、臨床的に治療が非常に難しい。現在、自家骨移植とともに多様な同種骨、異種骨、合成骨のような骨代替材を用いているが、骨代替材の比率が高いほど骨吸収率も高くなって、治療効果が低くなる。また、自家骨移植は、採取部位の痛症によるリハビリ遅延、出血、感染、医原性骨折のようなたくさんの合併症を誘発するという問題がある。
【0095】
本発明の実施形態による生体分子－金属イオン自己集合複合体で、前記自己集合体は自己分解されてＡＭＰを放出することができるが、放出される前記ＡＭＰは、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）のアデノシン受容体の信号伝逹によって間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を促進し、前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の骨分化は骨生成を促進することができる。
【0096】
前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、骨欠損部位に移植される場合、前記骨欠損部位の移植材として作用しながら、同時に前記自己集合体の自己分解を通じてＡＭＰを放出することができる。前記自己集合体で放出されたＡＭＰは、骨欠損部位を満たし、ＭＳＣ付着及びＭＳＣの骨分化を促進することができる。
【0097】
また、本実施形態による前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御されることができる。前記自己集合体は、前記３次元凝集体の形態で骨欠損部位に移植される場合、前記外部磁場印加によって前記自己集合体は、一方向及び他方向のいずれか一つ以上に移動することができる。
【0098】
前記自己集合体は骨欠損部位に移植され、前記自己集合体の表面に宿主細胞が付着されて骨格を形成することができる。また、前記自己集合体は、常磁性を有し、外部磁場印加によって移動が制御されることができる。例えば、前記自己集合体は、骨結束部位に移植する場合、前記外部磁場の印加によって自己集合体が移動することができる。この時、前記自己集合体の表面に付着された宿主細胞も一緒に移動することができる。
【0099】
前記自己集合体は、骨欠損部位に移植され、前記自己集合体は自己分解されて、１日～７０日間前記ＡＭＰを放出することができる。前記自己集合体で放出される前記ＡＭＰは、宿主細胞の表面でアデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）に分解されて、前記宿主細胞の表面のアデノシン受容体の信号伝逹（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を促進することができる。例えば、前記アデノシン受容体は、アデノシンＡ２Ｂ受容体を含むことができる。
【0100】
前記自己集合体は、骨欠損部位に移植されて、欠損された骨組職を再生する場合、骨欠損移植材であるカルシウム－リン酸塩セメント（Ｃａ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｅｍｅｎｔ）と同様の水準に骨再生を促進することができる。また、前記自己集合体は、骨欠損部位に移植されて欠損された骨組職を再生する間に、正常細胞では毒性を示さないこともある。
【0101】
本実施形態による治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体は、単量体である自己集合体が互いに結合して形成された自己集合複合体であってもよく、前記自己集合体は、鉄イオン及び前記鉄イオンと第１結合で自己集合されるリガンドを含んでもよい。また、前記自己集合体は、互いに隣接する自己集合体が第２結合で自己集合されて、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体を形成してもよい。
【0102】
前記自己集合体は、前記自己集合体の周辺環境によって自己分解されることができ、また、自己分解される速度を制御することができる。
【0103】
前記リガンドは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のいずれか一つ以上を含んでもよい。例えば、前記自己集合体が自己分解される場合、前記鉄イオン又はリガンドが放出されることができる。また、前記自己集合体の自己分解される速度を制御することにより、前記鉄イオン又は前記リガンドが放出される速度を制御することができる。
【0104】
前記生体分子－金属イオン自己集合複合体は、製造方法、例えば鉄イオンを含む材料の濃度、前記リガンドを含む材料の濃度を制御することにより、前記治療用磁性生体分子－金属イオン自己集合複合体の大きさを制御することができる。
【0105】
前記自己集合体は、常磁性を有し、外部で印加される磁場によって移動が制御されることができるが、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体の移動を生体外部で制御することができ、また、前記生体分子－金属イオン自己集合複合体を生体内に移植した場合にも、外部で印加される磁場によって前記生体分子－金属イオン自己集合複合体の位置と移動速度を制御することができる。
【0106】
前記リガンドがＡＭＰ及びＡＴＰのいずれか一つ以上である場合、前記自己集合体は、前記フェロトーシスを通じて癌細胞の死滅を誘導し、前記リガンドがＡＴＰの場合、前記自己集合体は、骨関節炎を予防、改善又は治療することができる。また、前記リガンドがＡＭＰの場合、前記自己集合体は骨欠損部位に移植されて、欠損された骨組職を再生することができる。
【0107】
以下、本発明の実施例及び比較例を記載する。しかしながら、下記実施例は、本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の権利範囲が下記実施例によって制限されるものではない。
【0108】
自己集合体の製造
１．材料
アデノシン－５’－モノホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：４５７８－３１－８、アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ））
アデノシン－５’－トリホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：５１９６３－６１－２、Ｄａｅｊｕｎｇ試薬）
塩化鉄（ＩＩ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、９７％、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｇ、ｃａｔ．Ｎｏ．３７２８７０）
ＰＭＭＡ（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、直径１２５～１５０μｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＢ０５Ｎ）
２．Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の製造
製造例１
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を合成するために、脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）を利用して、ＦｅＣｌ２溶液とＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を用意した。ＦｅＣｌ２溶液は、１０ｍＬの脱イオン水に２５．３５ｍｇの塩化鉄（ＩＩ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、９７％、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｇ、ｃａｔ．Ｎｏ．３７２８７０）を添加して製造し、ＡＴＰ溶液は、１０ｍＬの脱イオン水に１１０．２３ｍｇのアデノシン－５’－トリホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：５１９６３－６１－２、Ｄａｅｊｕｎｇ試薬）を添加して製造した。
１．材料
アデノシン－５’－モノホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：４５７８－３１－８、アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ））
アデノシン－５’－トリホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：５１９６３－６１－２、Ｄａｅｊｕｎｇ試薬）
塩化鉄（ＩＩ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、９７％、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｇ、ｃａｔ．Ｎｏ．３７２８７０）
ＰＭＭＡ（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、直径１２５～１５０μｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＢ０５Ｎ）
２．Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の製造
製造例１
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を合成するために、脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）を利用して、ＦｅＣｌ２溶液とＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を用意した。ＦｅＣｌ２溶液は、１０ｍＬの脱イオン水に２５．３５ｍｇの塩化鉄（ＩＩ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、９７％、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｇ、ｃａｔ．Ｎｏ．３７２８７０）を添加して製造し、ＡＴＰ溶液は、１０ｍＬの脱イオン水に１１０．２３ｍｇのアデノシン－５’－トリホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：５１９６３－６１－２、Ｄａｅｊｕｎｇ試薬）を添加して製造した。
【0109】
１ｍＬの２０ｍＭ ＡＴＰ溶液が収容された反応器に１ｍＬの２０ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液を添加し、渦流混合器（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で混合して混合溶液を製造した。製造された混合溶液を室温で１２時間保持して、Ｆｅ２＋とＡＴＰとの間の自発的集合を誘導してＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を製造した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を含有する溶液を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。未反応試薬を除去するために、上清液を捨て、脱イオン水を添加した後、溶液を遠心分離する過程を２回実行した。洗浄後、１１２．６ｍｇの粒子状のＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を２ｍＬの脱イオン水に分散させた。製造されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、表１に示した。
【0110】
製造例２
混合溶液を製造する時、１ｍＬの１ｍＭ ＡＴＰ溶液が収容された反応器に１ｍＬの１ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液を利用し、製造された混合溶液を室温で３０分間反応させることを除いては、製造例１と同様にＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を製造し、これを表１に示した。
混合溶液を製造する時、１ｍＬの１ｍＭ ＡＴＰ溶液が収容された反応器に１ｍＬの１ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液を利用し、製造された混合溶液を室温で３０分間反応させることを除いては、製造例１と同様にＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を製造し、これを表１に示した。
【0111】
製造例３
混合溶液を製造する時、１ｍＬの０．１ｍＭ ＡＴＰ溶液が収容された反応器に１ｍＬの０．１ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液を利用し、製造された混合溶液を室温で３０分間反応させることを除いては、製造例１と同様にＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を製造し、これを表１に示した。
混合溶液を製造する時、１ｍＬの０．１ｍＭ ＡＴＰ溶液が収容された反応器に１ｍＬの０．１ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液を利用し、製造された混合溶液を室温で３０分間反応させることを除いては、製造例１と同様にＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を製造し、これを表１に示した。
【0112】
【表1】
製造例４
Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を合成するために、脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）にＦｅＣｌ２溶液とＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を用意した。ＦｅＣｌ２溶液は、１０ｍＬの脱イオン水に２５．３５ｍｇの塩化鉄（ＩＩ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、９７％、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｇ、ｃａｔ．Ｎｏ．３７２８７０）を添加して製造し、ＡＭＰ溶液は１０ｍＬの脱イオン水に７８．２４ｍｇのＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加して製造した。
【0113】
１ｍＬの２０ｍＭ ＡＭＰ溶液が収容された反応器に１ｍＬの２０ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液を添加して、渦流混合器（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で混合して混合溶液を製造した。製造された混合溶液を室温で１２時間保持し、Ｆｅ２＋とＡＭＰとの間の自発的集合を誘導してＦｅ－ＡＭＰ自己集合体を製造した。Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を含有する溶液を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。未反応試薬を取り除くために、上清液を捨て、脱イオン水を添加した後、溶液を遠心分離する過程を２回実行した。洗浄後、８９．２４ｇの粒子状のＦｅ－ＡＭＰ自己集合体を２ｍＬの脱イオン水に分散させた。
【0114】
４．Ｆｅ３Ｏ４合成
製造例５
５．４ｇの塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）及び１８．３ｇのオレイン酸ナトリウムを３０ｍＬの脱イオン水（ＤＩ）、４０ｍＬのエタノール（ＥｔＯＨ）及び７０ｍＬのヘキサンからなる混合溶媒に添加して、混合物を製造した。この混合物を６０℃で８時間加熱し、上部ヘキサン層に含まれたオレイン酸鉄錯体を脱イオン水で洗浄し、ヘキサンを蒸発させて乾燥されたオレイン酸鉄錯体を得た。継いで、オレイン酸鉄錯体を０．１４ｇのオレイン酸及び５ｇの１－オクタデセンと混合した。この混合溶液を３２０℃で３０分間激烈に撹拌した後、２５℃に冷却させた。冷却させた混合溶液で合成されたＦｅ３Ｏ４ナノ粒子をエタノールで繰り返し洗浄した後、遠心分離して、平均直径が１０ｎｍのＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を製造した。
製造例５
５．４ｇの塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）及び１８．３ｇのオレイン酸ナトリウムを３０ｍＬの脱イオン水（ＤＩ）、４０ｍＬのエタノール（ＥｔＯＨ）及び７０ｍＬのヘキサンからなる混合溶媒に添加して、混合物を製造した。この混合物を６０℃で８時間加熱し、上部ヘキサン層に含まれたオレイン酸鉄錯体を脱イオン水で洗浄し、ヘキサンを蒸発させて乾燥されたオレイン酸鉄錯体を得た。継いで、オレイン酸鉄錯体を０．１４ｇのオレイン酸及び５ｇの１－オクタデセンと混合した。この混合溶液を３２０℃で３０分間激烈に撹拌した後、２５℃に冷却させた。冷却させた混合溶液で合成されたＦｅ３Ｏ４ナノ粒子をエタノールで繰り返し洗浄した後、遠心分離して、平均直径が１０ｎｍのＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を製造した。
【0115】
自己集合体の基本性能評価方法
１．Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体でＦｅ又はＡＴＰ放出特性確認
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を利用して、Ｆｅ及びＡＴＰ放出特性を確認した。
１．Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体でＦｅ又はＡＴＰ放出特性確認
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を利用して、Ｆｅ及びＡＴＰ放出特性を確認した。
【0116】
ＦｅＣｌ２溶液は、１０ｍＬの脱イオン水に２５．３５ｍｇの塩化鉄（ＩＩ）（Ｉｒｏｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、９７％、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５ｇ、ｃａｔ．Ｎｏ．３７２８７０）を添加して製造し、ＡＴＰ溶液は、１０ｍＬの脱イオン水に１１０．２３ｍｇのアデノシン－５’－トリホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：５１９６３－６１－２、Ｄａｅｊｕｎｇ試薬）を添加して製造した。
【0117】
５ｍＬの２０ｍＭ ＡＴＰ溶液と５ｍＬの２０ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液をそれぞれファルコン（ｆａｌｃｏｎ）チューブで添加して、ボルテックスミキサー（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を利用して１分間混合して、混合溶液を製造した。製造された混合溶液を室温で１２時間保持した。継いで、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。未反応試薬を含む上清液を除去し、これに１０ｍＬの脱イオン水を追加した。脱イオン水を追加した後、再び１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液を除去して、固体物質であるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を回収した。除去された上清液は、ＨＰＬＣを通じて初期に添加されたＡＴＰ量でアンローディングされたＡＴＰ量を引いてＡＴＰローディング効率を測定するのに用いた。回収されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体に１ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４又はｐＨ５．５）を添加し、これを透析袋（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ、ＳｎａｋｅＳｋｉｎＴＭ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ、７ｋＤａ ＭＷＣＯ）に移した。
【0118】
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を含む透析袋を４ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４又はｐＨ５．５）が添加されたバイアルに入れて室温で保管した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を含む透析袋が入っているバイアルで、４０μＬの上清液を１日、３日、５日、７日にそれぞれ採取して放出されたＦｅの濃度又はＡＴＰ濃度を測定して計算した。ここで、ＰＢＳ溶液をバイアルに追加して全体体積を一貫するように保持した。
【0119】
累積ＡＴＰ放出プロファイルは、分析カラム（ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８、１３０Å、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、粒径５μｍ）を有するＨＰＬＣ（Ａｒｃ ＨＰＬＣ Ｃｏｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ）で得た。移動相Ａ及び移動相Ｂは次のように製造された。移動相Ａの場合、０．０６ｍｏｌ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．０４ｍｏｌ／ＬのＫＨ２ＰＯ４及び０．１ｍｏｌ／ＬのＫＯＨを脱イオン水（ｐＨ７．０）に溶解させた。移動相Ｂは、ＰＢＳ溶液である。
溶離プログラムは次の通りである。Ａ／Ｂ＝１００／０（ｖ／ｖ）２分；Ａ／Ｂ＝２分間９５／０（ｖ／ｖ）；Ａ／Ｂ＝２分間８０／２０（ｖ／ｖ）；Ａ／Ｂ＝１．３分間７５／２５（ｖ／ｖ）；及びＡ／Ｂ＝１．７分間１００／０（ｖ／ｖ）実行した後、移動相Ａ／Ｂ＝１００／０（ｖ／ｖ）をさらに１分間一定に保持した。流速は１．２ｍＬ／ｍｉｎでアイソクラチックで、注入されたサンプル体積は２０μＬであり、ＵＶ－ｖｉｓ吸光度は、２６０ｎｍでモニタリングされた。また、累積Ｆｅ放出プロファイルは、多様なｐＨで累積Ｆｅ放出プロフィールを得るために、Ｆｅ分析（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍＴＭ Ｉｒｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｂｉｏａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた（下記図７、図１４）。
溶離プログラムは次の通りである。Ａ／Ｂ＝１００／０（ｖ／ｖ）２分；Ａ／Ｂ＝２分間９５／０（ｖ／ｖ）；Ａ／Ｂ＝２分間８０／２０（ｖ／ｖ）；Ａ／Ｂ＝１．３分間７５／２５（ｖ／ｖ）；及びＡ／Ｂ＝１．７分間１００／０（ｖ／ｖ）実行した後、移動相Ａ／Ｂ＝１００／０（ｖ／ｖ）をさらに１分間一定に保持した。流速は１．２ｍＬ／ｍｉｎでアイソクラチックで、注入されたサンプル体積は２０μＬであり、ＵＶ－ｖｉｓ吸光度は、２６０ｎｍでモニタリングされた。また、累積Ｆｅ放出プロファイルは、多様なｐＨで累積Ｆｅ放出プロフィールを得るために、Ｆｅ分析（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍＴＭ Ｉｒｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｂｉｏａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた（下記図７、図１４）。
【0120】
２．１．Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体でＡＭＰ放出特性確認
Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を利用してＡＭＰ放出特性を確認した。
Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を利用してＡＭＰ放出特性を確認した。
【0121】
累積ＡＭＰ放出プロファイルを獲得して、ＡＭＰ誘発骨折治癒のための持続的なＡＭＰ放出を確認した。Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を製造するために、アデノシン－５’－トリホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：５１９６３－６１－２、Ｄａｅｊｕｎｇ試薬）を利用する代りに、アデノシン－５’－モノホスフェート二ナトリウム塩（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ＣＡＳ：４５７８－３１－８、アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ））を利用し、その他には、Ｆｅ又はＡＴＰ放出特性を確認するために製造されたサンプルと同じ方法でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を回収した。
【0122】
Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体が備えられた透析袋が入っているバイアルで、４００μＬの上清液を１日、３日、７日、１４日、２１日にそれぞれ収集して放出されたＡＭＰの濃度をＨＰＬＣを通じて測定した。累積ＡＭＰ放出プロファイルは、累積ＡＴＰ放出試験で用いられたのと同じ方法でＨＰＬＣによって得られた（下記、図２６参照）。
【0123】
３．ＩＶＩＳ Ｌ－０１２ ＲＯＳ信号分析
発光プローブ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ）Ｌ－０１２（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、韓国）を超純水Ｈ２Ｏに溶かし、実験する直前に新鮮な状態で用意した。５０ｕｌのインジェクション（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）用量で、２５ｍｇ／ｋｇをマウスの背中に皮下投与した。
発光プローブ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ）Ｌ－０１２（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、韓国）を超純水Ｈ２Ｏに溶かし、実験する直前に新鮮な状態で用意した。５０ｕｌのインジェクション（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）用量で、２５ｍｇ／ｋｇをマウスの背中に皮下投与した。
【0124】
ＣＬ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）放出評価は、ｉｎｄｉＧＯＴＭソフトウェアとＩＶＩＳ（Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＮｉｇｈｔＯＷＬ ＩＩ ＬＢ ９８３、ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｌ－０１２を注入した直後に始めた。十分なＣＬ放出データを収集するために、マウスを毎回２０秒間露出させた。マウスの皮膚で放出されるＣＬをリアルタイムで記録して視覚化した後、関心領域で放出するＣＬを総フラックス（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃｏｎｄ）で定量化した。
【0125】
自己集合体を利用した癌細胞死滅、骨関節炎及び骨欠損治療評価方法
実験例１（癌細胞死滅、骨肉種モデル）
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を合成するために、脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）を利用してＦｅＣｌ２溶液とＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を用意した。５ｍＬの４０ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液と５ｍＬの４０ｍＭ ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を脱イオン水の中に混合して多様な濃度で用意した。５ｍＬの２０ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液と５ｍＬの２０ｍＭ ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を同じ濃度で添加し、ボルテックスミキサー（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を利用して、１分間混合して混合溶液を製造した。混合溶液を室温で１２時間保持して、自己集合を誘導してＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を製造した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を含有する溶液を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。未反応試薬を除去するために、上清液を捨て、脱イオン水を添加した後、溶液を遠心分離する過程を２回にわたって実行した。洗浄後、収集されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体粒子５ｍｇを１ｍＬの脱イオン水に分散させ、そのうち２０μＬをマウスに注入した。
実験例１（癌細胞死滅、骨肉種モデル）
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を合成するために、脱イオン水（ＤＩ ｗａｔｅｒ）を利用してＦｅＣｌ２溶液とＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を用意した。５ｍＬの４０ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液と５ｍＬの４０ｍＭ ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を脱イオン水の中に混合して多様な濃度で用意した。５ｍＬの２０ｍＭ ＦｅＣｌ２溶液と５ｍＬの２０ｍＭ ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を同じ濃度で添加し、ボルテックスミキサー（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を利用して、１分間混合して混合溶液を製造した。混合溶液を室温で１２時間保持して、自己集合を誘導してＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を製造した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を含有する溶液を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。未反応試薬を除去するために、上清液を捨て、脱イオン水を添加した後、溶液を遠心分離する過程を２回にわたって実行した。洗浄後、収集されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体粒子５ｍｇを１ｍＬの脱イオン水に分散させ、そのうち２０μＬをマウスに注入した。
【0126】
本実験で利用されたマウスは、８週齢のｍａｌｅ Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ マウス（Ｏｒｉｅｎｔ、Ｓｅｏｎｇｎａｍ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）で、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の骨肉種での効能を確認するために、下記表２のように、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＡＴＰ（Ｄａｅｊｕｎｇ試薬、ＣＡＳ：５１９６３－６１－２）、ＤＯＸ（ドキソルビシン）、Ｆｅ－ＡＴＰ、Ｆｅ－ＡＴＰ（ｍａｇ）、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（ｍａｇ）とともに比較した。この時、前記Ｆｅ－ＡＴＰは５ｍｇ／ｋｇ、Ｆｅ３Ｏ４は７ｍｇ／ｋｇをそれぞれ注入した。
【0127】
【表2】
【0128】
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を注射する前、酸素に２％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）が混合されたガスを２Ｌ／ｍｉｎで注入して、マウスを吸入痲酔させた。手術４週後、表２に記載されたグループによって７日間隔で総６週間６回薬物を注入した。２０μＬのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体をそれぞれ腫瘍部位に注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、既存の化学療法薬物（ｃｈｅｍｏａｇｅｎｔ）の効果と比較するために、２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＡＤマイシン（ＡＤ ｍｙｃｉｎ）、保寧製薬（Ｂｏｒｙｕｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＡＳ＃２３２１４－９２－８）を注射した。Ｆｅ３Ｏ４グループは、マウス内部に５ｍｇ／ｋｇのＦｅイオンが注入されるように製作して、同じ体積である２０μＬで注入した。ここで、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の注入量は５ｍｇ／ｋｇ（自己集合体重量／マウス重量）にし、Ｆｅ３Ｏ４の注入量は７ｍｇ／ｋｇ（自己集合体重量／マウス重量）にした。比較例として、ＰＢＳグループは、それぞれＰＢＳ（ｐＨ７．４）を同一体積である２０μＬで注入した。磁気的に標的化（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を確認するために、各区分で（ｍａｇ）に記載されたグループには２７０ｍＴの円形ネオジム磁石（直径５ｍｍ、高さ２ｍｍ）を注射位置にテガダームとサージカル・テープで固定させた。
【0129】
６週が経った後、ＣＯ２を利用してマウスを安楽死させた後、足部位の腫瘍組職をサンプルとして採取し、組織検査（ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を行った。
【0130】
実験例２（骨関節炎モデル）
実験例１と同一に製造された１ｍｇのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散させ、２０μＬをラットに注入した。
実験例１と同一に製造された１ｍｇのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体粒子を１０ｍＬの脱イオン水に分散させ、２０μＬをラットに注入した。
【0131】
本実験で利用されたマウスは、８週齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットであり、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の骨関節炎での効能を確認するために、下記表３のように、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、Ｆｅ－ＡＴＰ、Ｆｅ－ＡＴＰ（ｍａｇ）とともに比較した。ここで、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の注入量は、８ｕｇ／ｋｇ（自己集合体重量／ラット重量）である。ラット一匹の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）は、約１００μＬ程度であるので、２ｕｇのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を２０μＬのＰＢＳに溶かして注入した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を利用したＡＴＰ放出プロファイルを参考すると（図１４参照）、常温でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体で１日中約７％のＡＴＰが放出され、７日間約２８％のＡＴＰが放出される。よって、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体８ｕｇ／ｋｇ（自己集合体重量／ラット重量）をラットに注入する場合、ラットの滑液内のＡＴＰ濃度が５～８μＭになって、Ｍ２マクロファージを促進するようになる。
【0132】
【表3】
【0133】
まず、１０ｍｇ／ｋｇのラットにアルファキサロン（ａｌｆａｘａｌｏｎｅ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＡＳ＃２３９３０－１９－０）と１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン塩酸塩（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＡＳ＃２３０７６－３５－９）を筋肉内注射し、酸素に２％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）が混合されたガスを２Ｌ／ｍｉｎで注入して、マウスを吸入痲酔させた。感染を防ぐために、抗生剤であるエンロフロキサシン（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ、Ｂａｙｔｒｉｌ、Ｂａｙｅｒ、ＣＡＳ＃９３１０６－６０－６）を生理食塩水に５倍に希釈して、５ｍｇ／ｋｇを、手術後、５日間一日１回注射し、痛症を軽減させるために、鎮痛剤であるケトプロフェン（Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ、Ｋｅｔｏｐｒｏ ｉｎｊ、Ｕｎｉｂｉｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ、ＣＡＳ＃２２０７１－１５－４）５ｍｇ／ｋｇを手術後１日中皮内注射した。
【0134】
前十字靱帯切除術（Ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ、ＡＣＬＴ）を実行するために、膝部位に肌を切開した後、膝関節を確認し、膝蓋腱（ｐａｔｅｌｌａ ｔｅｎｄｏｎ）を横に移して前方十字靭帯を露出させた。露出された前方十字靭帯を眼科はさみで中央から１／３地点まで切って、ラックマンテスト（Ｌａｃｈｍａｎ ｔｅｓｔ）を実行して切断有無を確認した。生理食塩水で膝を洗浄した後、表３による処理を実行した。表３に対応するグループに対して、処理は関節腔内の関節液に注射する方式で実行した。各グループ別に、７日間隔で総８週間８回薬物を注入した。２０μＬのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体、２０ｕＬのＰＢＳを同一体積で注入した。Ｆｅ－ＡＴＰ（ｍａｇ）グループの場合、同一に２０μＬのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を注入しながら、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の磁気的標的化を確認するために、２７０ｍＴの円形ネオジム磁石（直径８ｍｍ、高さ２ｍｍ）を関節部位にサージカル・テープで固定した。それぞれの処理を実行した後、膝部位の肌を再び縫合し、８週が経ってから、次の単純放射線撮影及びマイクロコンピュータ断層撮影検査（Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）及び組織学的分析を行った。
【0135】
単純放射線撮影（０、２、４、６、８週）を行うために、１０ｍｇ／ｋｇのアルファキサロン（ａｌｆａｘａｌｏｎｅ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＡＳ＃２３９３０－１９－０）と１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン塩酸塩
（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＡＳ＃２３０７６－３５－９）を筋肉内注射して、全身麻酔を先行した後に実行した。単純放射線撮影装備（Ｃｉｏｓ Ａｌｐｈａ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を利用して手術直後にＡＣＬＴの確認及び周辺骨折発生有無を確認した。その後、単純放射線撮影を２週間間隔で８週間施行して、映像学的経過を観察し、ケルグレン－ローレンス分類法（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ－Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｓｃｏｒｅ）によって点数化した。
（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＡＳ＃２３０７６－３５－９）を筋肉内注射して、全身麻酔を先行した後に実行した。単純放射線撮影装備（Ｃｉｏｓ Ａｌｐｈａ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を利用して手術直後にＡＣＬＴの確認及び周辺骨折発生有無を確認した。その後、単純放射線撮影を２週間間隔で８週間施行して、映像学的経過を観察し、ケルグレン－ローレンス分類法（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ－Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｓｃｏｒｅ）によって点数化した。
【0136】
Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ（８週）及び組織学（８週）を確認するために、１０ｍｇ／ｋｇのアルファキサロン（ａｌｆａｘａｌｏｎｅ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＡＳ＃２３９３０－１９－０）と１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン塩酸塩（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＡＳ＃２３０７６－３５－９）を筋肉内注射して全身麻酔をした後、ＣＯ２ガスで安楽死を誘導した。膝軟骨を採取して、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液に固定した。ｍｉｃｒｏ ＣＴ ｓｃａｎ（Ｇｅｎｏｓｓ、Ｓｕｗｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を行って軟骨の再生状態を評価した。
【0137】
実験例３（骨欠損モデル）
３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体をマイクロポアを有するスカフォールドの形態に製造した。３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体マイクロポアを本スカフォールド（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｂｏｎｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ）の場合、ＰＭＭＡ（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、浸出（ｌｅａｃｈｉｎｇ）方法を利用した。まず、円筒状ポリエチレン鋳型（直径８ｍｍ）にＰＭＭＡ（直径１２５～１５０μｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＢ０５Ｎ）３００ｍｇを充填した。このモールドに脱イオン水に溶かした２Ｍ ＦｅＣｌ２溶液２００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで５分間柔らかく混合した。次に、脱イオン水に溶かした２Ｍ ＡＭＰ溶液２００μＬをモールドに添加し、ボルテックスミキサーを用いて５分間激烈に混合した。混合物を含有するモールドを密封して、２５℃で１日中保持した。その後、３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体をモールドで分離し、ＰＭＭＡを浸出するために、振動条件（１００ｒｐｍ）で３日間５０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に含浸させた。ＤＣＭは、２４時間ごとに交換した。３日後、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体が３Ｄ形態に凝集された３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体を５０ｍＬの脱イオン水に３０分間浸けた後、常温で乾燥させた。３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体を１ｃｍ又は０．８ｃｍの高さに切断して骨の治療に利用する前に紫外線を照射して３０分間殺菌した。
３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体をマイクロポアを有するスカフォールドの形態に製造した。３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体マイクロポアを本スカフォールド（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｂｏｎｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ）の場合、ＰＭＭＡ（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、浸出（ｌｅａｃｈｉｎｇ）方法を利用した。まず、円筒状ポリエチレン鋳型（直径８ｍｍ）にＰＭＭＡ（直径１２５～１５０μｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＢ０５Ｎ）３００ｍｇを充填した。このモールドに脱イオン水に溶かした２Ｍ ＦｅＣｌ２溶液２００μＬを添加し、ボルテックスミキサーで５分間柔らかく混合した。次に、脱イオン水に溶かした２Ｍ ＡＭＰ溶液２００μＬをモールドに添加し、ボルテックスミキサーを用いて５分間激烈に混合した。混合物を含有するモールドを密封して、２５℃で１日中保持した。その後、３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体をモールドで分離し、ＰＭＭＡを浸出するために、振動条件（１００ｒｐｍ）で３日間５０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に含浸させた。ＤＣＭは、２４時間ごとに交換した。３日後、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体が３Ｄ形態に凝集された３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体を５０ｍＬの脱イオン水に３０分間浸けた後、常温で乾燥させた。３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体を１ｃｍ又は０．８ｃｍの高さに切断して骨の治療に利用する前に紫外線を照射して３０分間殺菌した。
【0138】
本実験で利用されたウサギは、１６週～２０週齢のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ｍａｌｅで、３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体の骨欠損治療の効能を確認するために、下記表４のように、比較群として処理しないグループ（Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）、Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰ、カルシウムリン酸塩（Ｃａ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）にそれぞれ区分して処理した。ここで、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰは、０．８ｃｍのＦｅ－ＡＭＰ凝集体であり、Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰは、１ｃｍのＦｅ－ＡＭＰ凝集体であり、（ｍａｇ）は磁気的標的化を確認するために、２７０ｍＴの円形ネオジム磁石（直径８ｍｍ、高さ２ｍｍ）をサージカル・テープで固定したのである。
【0139】
【表4】
【0140】
広範囲骨欠損モデルの製作（０－８週）で、手術に先立って深麻酔（ｘｙｌａｚｉｎｅ＋ａｌｆａｌａｘｏｎｅ＋ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を行い、抗生剤（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）と鎮痛剤（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）を処理した。キシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ５ｍｇ／ｋｇ ＩＭ）、アルファキサロン（ａｌｆａｘａｌｏｎｅ ３ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）を筋肉内注射して痲酔し、抗生剤であるエンロフロキサシン（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ５ｍｇ／ｋｇ ＳＣ）と、鎮痛剤であるケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ ５ｍｇ／ｋｇ ＩＭ）を皮内注射した後、酸素に２％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）が混合されたガスを２Ｌ／ｍｉｎで注入して、マウスを吸入痲酔させた。
【0141】
完全に深麻酔されたことを確認した後、ウサギの大腿部を約７ｃｍ切開し、その後、前外側接近法によって大腿骨に到逹した。その後、大腿骨幹部に１ｃｍの骨欠損を作る位置を表示した後、切除部位に金属ピンを利用して穴を開けた。手術用電動鋸（Ｃｏｌｉｂｒｉ ＩＩ、Ｄｅｐｕｙ Ｓｙｎｔｈｅｓ）を利用して、骨切除部位のうち金属板が覆う部位のみ部分的に切除した。１．５ｃｍの骨欠損近位部３つ、遠位部２つの金属ねじを固定することができるように、６ホール２．７ロッキングコンプレッションプレート（ｌｏｃｋｉｎｇ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｔｅ、ＬＣＰ２．７ ｓｔｒａｉｇｈｔ（６ｈｏｌｅｓ、Ｌ５８ｍｍ）－Ｄｅｐｕｙ Ｓｙｎｔｈｅｓ）を位置させた後、近位部３つ、遠位部２つの金属ねじをウサギの骨が壊れないように真剣に固定した。部分切除を施行した骨切除部位を手術用電動鋸（Ｃｏｌｉｂｒｉ ＩＩ、Ｄｅｐｕｙ Ｓｙｎｔｈｅｓ）を利用して、完全切除を真剣に施行した。この時、ウサギの骨は脆性が高くて、壊れやすいため、真剣に実行した。
【0142】
骨欠損部位に３－Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ凝集体又は骨移植材（主成分ｃａｌｃｉｕｍ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＮｅｏＢｏｎｅ、ＳＮ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｕｗｏｎ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を挿入した後、筋膜縫合及び皮膚縫合を施行した。Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＴＰ（ｍａｇ）グループの場合、細胞集合（ｃｅｌｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）のための磁気的な移動を制御するために、２７０ｍＴの円形ネオジム磁石（直径２０ｍｍ、高さ２ｍｍ）を手術部位に毎日交互に上側と下側に３回変えながら位置させ、テガダームとサージカル・テープで固定させた。その後、８週間の誘導膜の形成及び成熟を待ってから、手術後３日間抗生剤であるエンロフロキサシン（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ５ｍｇ／ｋｇ ＳＣ）と、鎮痛剤であるケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ ５ｍｇ／ｋｇ ＩＭ）を注射した。実験結果を評価するために、次の単純放射線撮影及びマイクロコンピュータ断層撮影検査（Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）及び組織学（８週）の分析を行った。
【0143】
単純放射線撮影（０、２、４、６、８週）は、放射線撮影装備（Ｃｉｏｓ Ａｌｐｈａ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を利用して実行し、実行する前にキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ５ｍｇ／ｋｇ ＩＭ）、アルファキサロン（ａｌｆａｘａｌｏｎｅ ３ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）を筋肉内注射して痲酔した後に行った。１次手術の直後に金属板固定と周辺骨折発生有無を確認した。その後、４週間の誘導膜熟成まで臨床的経過を観察し、経過に異常がある場合、１次手術後、２週に単純放射線撮影をして映像学的経過観察を行った。その後、２週間隔で単純放射線撮影を総８週間施行して、映像学的経過を観察し、これをＲＵＳＴ ｓｃｏｒｅを通じて点数化した。手術後８週で骨固定有無を正面（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）、側面（ｌａｔｅｒａｌ）の２枚の単純放射線撮影で４つの皮質骨の中で３個以上の固定を基準に評価した。
【0144】
マイクロコンピュータ断層撮影検査（Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）（０週、８週）は、器官（Ｇｅｎｏｓｓ、Ｓｕｗｏｎ、Ｋｏｒｅａ）して行った。手術８週後にウサギを犠牲して（ＫＣｌ）大腿骨（ｆｅｍｕｒ）を獲得し、４％パラホルムアルデヒド溶液に固定させた後、ｍｉｃｒｏ－ＣＴ撮影をして、再建された骨の容積を３Ｄソフトウェア（ゼノス提供）を通じて評価した。
【0145】
組織学（８週）検査は、安楽死に先立って深麻酔をした後に実行した。安楽死は、塩化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、用量：２ｍｍｏｌ／ｋｇ、ＩＶ）を利用し、キシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ５ｍｇ／ｋｇ ＩＭ）、アルファキサロン（ａｌｆａｘａｌｏｎｅ３ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）を記入された用量の２倍用量にして痲酔させた後、塩化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、用量：２ｍｍｏｌ／ｋｇ、ＩＶ）を注射して安楽死を誘導した。安楽死を誘導後には心停止が確かに発生したか否かを確認した。臓器毒性及び骨周辺筋肉組職検査は、Ｈ＆Ｅ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で、骨免疫染色は、ＩＨＣ（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、Ｇｅｎｏｓｓ、Ｓｕｗｏｎ、Ｋｏｒｅａ）で実行した。
【0146】
自己集合体の基本性能及び自己集合体を利用した癌細胞死滅、骨関節炎、及び骨欠損治療評価結果
以下、図３～図３２を利用して、本発明の実施形態によって製造された自己集合体の基本性能と、自己集合体を利用した癌細胞死滅、骨関節炎、及び骨欠損治療評価結果を示した。
以下、図３～図３２を利用して、本発明の実施形態によって製造された自己集合体の基本性能と、自己集合体を利用した癌細胞死滅、骨関節炎、及び骨欠損治療評価結果を示した。
【0147】
図３は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体のＳＥＭイメージと、常磁性を測定した結果である。前記Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の常磁性測定は、振動試料磁性測定装置（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）を利用して測定した。図３は、製造例１によって製造されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体のＳＥＭイメージで、平均直径が６００ｎｍで均一な大きさの球形の粒子形態に製造されることを確認することができた。
【0148】
Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は、Ｆｅ２＋の鉄イオンとＡＴＰが１次的には配位結合を通じて自己集合体を形成し、製造されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、互いに隣接するＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の間の水素結合又はπ－π相互作用によって凝集されることを確認することができた。また、凝集された形態に製造されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、平均直径がほぼ均一な球形に製造されることを確認することができた。また、２７０ｍＴの円形ネオジム磁石（直径８ｍｍ、高さ２ｍｍ）を利用して磁場を形成した後、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は移動した。すなわち、製造例１によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、可逆的な（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）磁性特性である常磁性（ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｓｍ）を有し、これによって、外部磁石に引き寄せられて動くことを示すことを確認することができた。
【0149】
図４は、本発明の一実施形態による平均直径がそれぞれ１５０ｎｍ及び７０ｎｍのＦｅ－ＡＴＰ自己集合体のＳＥＭイメージである。図４は、製造例２及び製造例３によって製造されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体で、鉄イオンの濃度と、ＡＴＰの濃度によって自己集合体の直径が制御されることを確認した。同じ方法で製造するが、製造例２のように、鉄イオンの濃度を１ｍＭ及びＡＴＰ濃度を１ｍＭとする場合は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の平均直径は１５０ｎｍであり、製造例３のように、鉄イオンの濃度を０．１ｍＭ及びＡＴＰ濃度を０．１ｍＭとする場合、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の平均直径は７０ｎｍに示した。すなわち、鉄イオンの濃度を高くしたり、又はＡＴＰ濃度を高くする場合、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の平均直径を増加させることができた。
【0150】
図５は、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体のＴＥＭイメージである。図５は、製造例４によって、鉄イオンとＡＭＰを利用して製造されたＦｅ－ＡＭＰ自己集合体である。Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、複数個が凝集された形態で、マイクロポアを有する３Ｄ形態に備えられることを確認することができた。すなわち、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は複数個が凝集して備えられ、凝集したＦｅ－ＡＭＰ自己集合体の間にはマイクロポアを形成することを確認することができた。
【0151】
【0152】
図６は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を利用して、癌細胞にフェロトーシス（ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導する状態を概略的に示した図面である。図６は、実験例１に対するもので、生体内に移植されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を生体外部で磁力を印加して、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を移動させることができた。また、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を移動させる時、標的とした癌細胞に移動させることができ、その後、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体が自己分解されて、鉄イオン（Ｆｅ２＋）を持続的に放出して、癌細胞のフェロトーシスを誘導した。即ち、本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、自己分解と、磁場によってＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の位置を移動させて、特定癌細胞に対する標的化が可能である。よって、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は、フェロトーシスを利用した癌治療のための鉄イオン－媒介されたフェントン（ｆｅｎｔｏｎ）反応を可能にすることができる。
【0153】
図７は、鉄アッセイキット（ｉｒｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を利用して測定したｐＨ５．５又はｐＨ７．４でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の鉄イオン放出量を示したグラフである。実験例１でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体で放出されたＦｅ２＋の効果を確認する前に、生体流体と同様のＰＢＳを利用して、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体でＦｅ２＋放出量を確認した。ｐＨ５．５及びｐＨ７．４の両側で、全部Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体が自己分解されて、鉄イオンであるＦｅ２＋が放出されることを確認することができた。また、ｐＨが７．４の場合よりもｐＨが５．５の場合にＦｅ２＋がより早く、よりたくさん放出されることを確認することができた。すなわち、Ｆｅ２＋の放出は、相対的に酸性条件で加速化され、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の周辺条件を変化させることにより、Ｆｅ２＋の放出速度及び放出量を制御することができることを確認することができた。本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体でＦｅ２＋の放出量は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を多様に設計することにより、多様に製造することができる。
【0154】
図８は、各条件によるＤＣＦＤＡ染色で測定した細胞内ＲＯＳ濃度を示した。下記実験例１によって、マウスで実験する前に細胞で各条件による実験を実行した。各条件は、下記表５に示すように、ＫＨＯＳ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌを利用して、対照群であるＰＢＳのみ処理、ＤＯＸのみ処理、Ｆｅ－ＡＴＰ処理、ＡＴＰのみ処理、及びＦｅＣｌ２処理に区分した。ここで、ＦｅＣｌ２の場合は、溶けてＦｅ２＋とＣｌ－に分解されるので、Ｆｅ－ＡＴＰで放出されるＦｅ２＋と比較するために追加した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を利用した場合、ＰＢＳのみ同じ体積で注入した対照群（ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に比べて、ＲＯＳ生成が促進されることを確認した。また、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を利用した場合は、ＡＴＰのみを利用した場合よりもＲＯＳ生成が促進された。すなわち、これはＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の自己分解によって発生した鉄イオンによる効果に判断される。
【0155】
本発明のＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、癌細胞治療に通常用いられるドキソルビシン（ＤＯＸ）よりも効果的にＲＯＳを生成させることを確認した。図８は、癌細胞を示したもので、癌細胞の場合、内部に過酸化水素の濃度が一般細胞（２０ｎＭ）よりも高い濃度（１０μＭ－１００μＭ）で、本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体で自己分解されて放出されたＦｅ２＋とのフェントン反応で過量のＲＯＳを生成するようになって、フェロトーシス（ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ）を通じた癌細胞死滅が発生する。
【0156】
【表5】
【0157】
図１０は、磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の持続的なＦｅ２＋放出を通じた癌細胞のフェロトーシスを確認した結果である。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は、ＰＢＳ及びＦｅ３Ｏ４よりも癌細胞治療に優れた効果を示すことを確認することができた。また、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体に対して外部で磁場Ｆｅ－ＡＴＰ（ｍａｇ）を印加した場合には、前記Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体が磁気的に標的化されて、癌細胞治療により効果が上昇することを確認することができた。磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、通常用いられる抗癌剤であるドキソルビシン（ＤＯＸ）に対応する水準に癌発生を抑制することを確認することができた。一方、Ｆｅ３Ｏ４のみを利用した場合には、磁気的に標的化有無に関係なく生体内で分解効率が低くて、癌の発生を抑制できないことを確認することができた。
【0158】
図１１は、磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体がドキソルビシンと同様に骨肉種（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）癌を効果的に治療することを示した。図１１で、Ｈ＆Ｅ染色で紫色で現われる核が多い場合、癌細胞がたくさん存在することを意味し、ＴＵＮＥＬ染色で茶色で現われるＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔが多い場合、癌細胞が多数死滅されたことを意味する。また、癌組職は、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（ｅｏｓｉｎ）を利用したＨ＆Ｅ染色及びＴＵＮＥＬ染色で示した。免疫組職化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）染色を利用し、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体による癌細胞死滅で、放出されたＬＰＯ、ＧＰＸ４、及びＸｃ受容体は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体で放出されたＦｅ２＋によるフェントン反応によって刺激されたフェロトーシスに寄与することを確認することができた。
【0159】
図１２は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を生体内に移植した後の毒性を確認した結果である。図１２で、骨肉種マウスモデルで磁場下でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を移植した後にも、対照群はＰＢＳと同様に現われ、生体内主要臓器で毒性が観察されないことを確認することができた。すなわち、本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は自己分解されて、Ｆｅ２＋を放出しても、人体内に毒性がなく、磁場を印加する場合にも毒性がないことを確認することができた。
【0160】
【0161】
図１３は、磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の軟骨保護（Ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を確認した結果である。図１３は、実験例２に対するもので、磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は自己分解されてＡＴＰを放出し、放出されたＡＴＰは、抗炎症マクロファージの分極を誘導して、骨関節炎の治療に効果的であることを示した。
【0162】
図１４は、ＨＰＬＣで測定したＦｅ－ＡＴＰ自己集合体でＡＴＰ放出累積プロファイルを示したグラフである。実験例２でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体で放出されたＡＴＰの効果を確認する前に、生体流体と同様のＰＢＳを利用してＦｅ－ＡＴＰ自己集合体でＡＴＰ放出量を確認した。本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は自己分解されて、上記検討したように、鉄イオンが放出されながら、またＡＴＰも放出されることを確認することができた。また、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体で、約２５日間３０％のＡＴＰが放出されることを確認することができた。本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体でＡＴＰの放出量は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体を多様に設計することにより、多様に製造することができる。
【0163】
図１５～図１７は、下記実験例２によってラットで実験する前に細胞で各条件による実験を実行した。各条件は下記表６に示すように、対照群であるＰＢＳのみ処理、Ｆｅ－ＡＴＰ処理、ＡＴＰのみ処理、ＦｅＣｌ２処理及びＦｅ３Ｏ４処理に区分した。
【0164】
【表6】
【0165】
図１６は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の分解によってマクロファージの分極化を確認した結果である。図１６を参照すると、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は自己分解されてＡＴＰを放出し、骨関節炎治療のためのマクロファージのＡＴＰ－媒介された抗炎症分極化を可能にすることを確認することができ、これをフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を通じて確認することができた。
【0166】
図１７は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体の分解をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した結果である。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は分解されて、マクロファージのＡＩＰ－媒介された抗炎症分極化を可能にすることを確認した。低い濃度のＡＴＰは、マクロファージのＭ２分極化を促進するＰ２Ｙ１信号伝逹を刺激し、低い濃度のＡＴＰは、マクロファージのＭ２分極化を抑制するＰ２Ｘ７信号伝逹を抑制することを確認することができた。
【0167】
図１８は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体による骨関節炎治療効果を確認するための膝骨関節のＣ－Ａｒｍ及び３－ＤマイクロＣＴイメージである。０、２、４、６及び８週で、ＡＣＬＴ及び骨関節炎モデルの末梢骨折を識別するために、膝骨関節のＣ－Ａｒｍイメージを確認した。８週目で骨関節炎モデルのＡＣＬＴ及び末梢骨折を確認するために、３－ＤマイクロＣＴイメージを確認した。ＰＢＳ（ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に比べて、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体及び磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、骨関節炎治療に効果があることを確認することができた。
【0168】
図１９は、８週目の骨関節炎モデルの膝骨関節の２－ＤマイクロＣＴイメージ、Ｈ＆Ｅ染色、サフラニン－ｏ（ｓａｆｒａｎｉｎ－ｏ）（Ｓ－Ｏ）染色イメージである。図１９は本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を処理した場合に対してＡＣＬＴ及び末梢骨折を確認した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体及び磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、膝関節の軟骨を保護して、軟骨が損傷されることを防止することを確認した。
【0169】
図２０は、８週目の骨関節炎モデルの膝骨関節のＨ＆Ｅ染色、サフラニン－ｏ（ｓａｆｒａｎｉｎ－ｏ）（Ｓ－Ｏ）染色及びコラーゲンＸ染色イメージである。図２０では、８週目の骨関節炎モデルでＡＣＬＴ及び末梢骨折を確認した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体及び磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、抗炎症性マクロファージ分極化を通じて炎症を緩和し、軟骨で骨に転移を媒介する肥大分化された軟骨細胞（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）の形成を抑制した。特に、磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体よりもさらに高い効果を示した。ここで、コラーゲンＸは、肥大分化された軟骨細胞を染色したが、肥大分化された軟骨細胞は、ｃａｒｔｉｌａｇｅ－ｔｏ－ｂｏｎｅ転移を促進して、骨関節炎を悪化させることを確認した。
【0170】
図２１は、８週目の骨関節炎モデルの膝骨関節の滑膜のｉＮＯＳ及びＡｒｇ－１染色イメージである。図２１では、骨関節炎モデルのＡＣＬＴ及び末梢骨折を確認した。Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は、Ｐ２Ｙ１信号伝逹を通じて、マクロファージのＭ２分極化を促進して軟骨分解から膝関節を保護し、特に、磁気的に標的化されたＦｅ－ＡＴＰ自己集合体はより効果的であることを確認することができた。
【0171】
図２２は、骨関節炎ラットモデル（ｒａｔ ｍｏｄｅｌ）で確認したＦｅ－ＡＴＰ自己集合体の毒性結果である。磁場下でＦｅ－ＡＴＰ自己集合体を多様な部位に移植した後確認し、主要臓器で生体内毒性が現われなかった。すなわち、本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体は自己分解されて、ＡＴＰを放出しても、人体内に毒性がなく、磁場を印加する場合にも毒性がないことを確認することができた。
【0172】
【0173】
図２３は、３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体の骨再生効果を概略的に示した図面である。
【0174】
図２３は、実験例３に対するもので、３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝逹で媒介された幹細胞の造骨細胞分化によって骨再生効果を示すことを確認することができる。３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝逹を通じてｄｅｇｒａｄｅｄ－ＡＭＰ－媒介骨折治療のための磁気運動に基づく細胞の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）ができるように３次元マクロ多孔性凝集体に形成された。
【0175】
図２４は、３Ｄ形態のＦｅ－ＡＭＰ自己集合体が凝集されたマイクロポア構造を示したＳＥＭイメージである。本実施形態によるＦｅ－ＡＭＰ自己集合体は、マイクロポア構造を有する３Ｄ形態に製造が可能であり、その大きさも数マイクロメートルから数十センチメートルまで大きさを多様に制御することができる。また、このように製造されたＦｅ－ＡＭＰ自己集合体は、生体外又は生体内で自己分解されることができ、自己分解される場合、鉄イオンＦｅ２＋又はＡＭＰを放出することを確認することができた。
【0176】
図２５は、３Ｄ形態のＦｅ－ＡＭＰ自己集合体を磁気的に標的化する状態を示した図面である。図２５を参照すると、３Ｄ形態のＦｅ－ＡＭＰ自己集合体も外部で磁場を印加する場合、３Ｄ形態のＦｅ－ＡＭＰ自己集合体の移動を制御することができた。
【0177】
図２６は、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体で時間によって放出されたＡＭＰを示したグラフである。実験例３でＦｅ－ＡＭＰ自己集合体で放出されたＡＭＰの効果を確認する前に、生体流体と同様のＰＢＳを利用して、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体でＡＭＰ放出量を確認した。本実施形態によるＦｅ－ＡＭＰ自己集合体は、時間が経つにつれて自己分解されて、ＡＭＰを放出することを確認することができ、その放出時間は約２５日間持続され、約４０％が放出されることを確認することができた。本実施形態によるＦｅ－ＡＭＰ自己集合体でＡＭＰの放出量は、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を多様に設計することによって、多様に製造することができる。
【0178】
図２７及び図２８は、下記実験例３によってウサギで実験する前に細胞で各条件による実験を実行した。各条件は、下記表７に示したように、対照群であるＰＢＳのみ処理、Ｆｅ－ＡＭＰ処理、ＡＭＰのみ処理、アデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）及びＰＯ４（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ＋ＰＯ４）の複合処理、及びＡｄｅｎｏｓｉｎｅ処理、ＰＯ４処理、ＦｅＣｌ２処理、及び骨形成誘導培地（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）処理に区分した。ここで、ＦｅＣｌ２の場合は、溶けてＦｅ２＋とＣｌ－に分解されるので、Ｆｅ－ＡＴＰで放出されるＦｅ２＋と比較するために追加した。
【0179】
【表7】
【0180】
図２８は、３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体で放出されたＣＤ７３－媒介ＡＭＰ－分解アデノシンによって骨形成分化を確認したウェスタンブロッティング結果である。図２８を参照すると、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体で放出されたＣＤ７３－媒介ＡＭＰ－分解アデノシンは、アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝逹を通じて骨形成分化を促進し、Ａ２Ｂ受容体抑制剤（ＰＳＢ ６０３）を添加することにより、アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝逹を抑制して、ｈＭＳＣの骨形成分化が抑制された。ＣＤ７３は、ＡＭＰをａｄｅｎｏｓｉｎｅ＋ＰＯ４に分解し、アデノシン－Ａ２Ｂ受容体の信号伝達によって骨形成分化が促進されることを確認することができた。
【0181】
図２９は、０、２、４、６及び８週で骨折を確認するための大腿骨のＣ－Ａｒｍイメージである。図２９を参照すると、比較群に対して、本発明の３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、通常用いられる骨折用移植材であるリン酸カルシウムと同様の効果を示すことを確認することができた。具体的には、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、対照群に比べて骨折治療に効果があったが、磁気的に標的化されたＳｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体がＳｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体に比べて骨折治療にさらに効果的であった。また、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体とＬｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体が同様にリン酸カルシウムと類似するように骨折を治療することを確認することができた。すなわち、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体とＳｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体を比較すると、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体は磁石によって動きを付与することができ、これによって骨折治療により効果的であることを確認することができた。
【0182】
図３０は、８週目の骨折を識別するための大腿骨のマイクロＣＴイメージである。図３０で、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体は、磁気的移動に基づいた細胞動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）及び低下されたＡＭＰ－媒介アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝達に起因した全体的な骨折治療を示した。Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、全体的な骨折治癒を示し、これは低下されたＡＭＰ－媒介アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝達に起因することを確認した。骨折治療の効果は、Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体、Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体、及びＳｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体の順に示し、Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、リン酸カルシウムとほぼ同様の効果を示した。また、図３０で、Ｐ ｖａｌｕｅが低いほど二つの値の差が大きくなることを意味する。Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｖｓ Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰは、ｐ＝０．０７４、Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｖｓ Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍｇ）は、ｐ＜０．００１、Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｖｓ Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰは、ｐ＜０．００１、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｓ リン酸カルシウムは、ｐ＜０．００１、及びＳｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ ｖｓ Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍｇ）Ｐ＝０．００８にそれぞれ示した。
ｖｓ Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰは、ｐ＝０．０７４、Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｖｓ Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍｇ）は、ｐ＜０．００１、Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｖｓ Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰは、ｐ＜０．００１、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｓ リン酸カルシウムは、ｐ＜０．００１、及びＳｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ ｖｓ Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍｇ）Ｐ＝０．００８にそれぞれ示した。
【0183】
図３１は、骨折に対するＨ＆Ｅ、オステオカルシン、及びＴＲＡＰ染色イメージである。Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体は、磁気的移動に基づいた細胞動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）及び低下されたＡＭＰ－媒介アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝達に起因した全体的骨折治療を示した。Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、全体的な骨折治癒を示し、これは、低下されたＡＭＰ－媒介アデノシン－Ａ２Ｂ受容体信号伝達に起因することを確認した。
【0184】
図３１を参照すると、Ｈ＆Ｅ染色イメージを通じて組職（ｔｉｓｓｕｅ）の模様、オステオカルシン染色イメージを通じて骨形成分化の程度、ＴＲＡＰ染色イメージを通じて破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の有無を確認することができた。Ｌｏｎｇ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体とＳｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ（ｍａｇ）自己集合体では欠陥
（ｄｅｆｅｃｔ）の中部分まで連結されて骨が生成されたことを確認することができ、破骨細胞が活性化されたことを参照すると、骨環境の分解と再生性が促進されて、骨が育つ環境が造成されたことに見える。Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体の場合、磁場が印加されなかったため、新たに生成された骨が結合部位を全部連結できないことを確認することができた。
（ｄｅｆｅｃｔ）の中部分まで連結されて骨が生成されたことを確認することができ、破骨細胞が活性化されたことを参照すると、骨環境の分解と再生性が促進されて、骨が育つ環境が造成されたことに見える。Ｓｈｏｒｔ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体の場合、磁場が印加されなかったため、新たに生成された骨が結合部位を全部連結できないことを確認することができた。
【0185】
図３２は、生体内３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体の毒性を確認した結果である。３Ｄ Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体を骨折治癒ウサギモデルに移植した後、磁場下で確認し、主要臓器で毒性が現われないことを確認した。
【0186】
上述したように、本実施形態によるＦｅ－ＡＴＰ自己集合体又はＦｅ－ＡＭＰ自己集合体は、生体内で毒性がなく、生体内又は生体外で自己分解されて、鉄イオン又はＡＴＰ／ＡＤＰを放出することができ、その放出量及び放出速度を制御することができる。また、常磁性を有するので、外部磁場印加によって特定位置に移動を制御して磁気的に標的化されることができる。また、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体又はＦｅ－ＡＭＰ自己集合体を磁気的に標的化した場合にも、生体内で毒性が発見されなかった。
【0187】
具体的には、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は、フェロトーシスを通じる癌細胞死滅を誘導して癌治療に効果的である。また、Ｆｅ－ＡＴＰ自己集合体は、ＡＴＰを放出することによって、骨関節炎を治療することができ、Ｆｅ－ＡＭＰ自己集合体は、骨欠損部位に移植材として作用することができる。
【0188】
本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者は本発明がその技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に実施され得ることを理解するはずである。したがって、以上で記述した実施形態はすべての面で例示的なもので、限定的でないことに理解すべきである。本発明の範囲は、上記詳細な説明よりは後述する特許請求範囲によって示され、特許請求範囲の意味及び範囲そしてその均等概念から導出されるすべての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれることに解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
