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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024117324
(43)【公開日】2024-08-29
(54)【発明の名称】観察装置および観察方法
(51)【国際特許分類】
G02B 21/14 20060101AFI20240822BHJP
G01N 21/17 20060101ALI20240822BHJP
G01N 21/45 20060101ALI20240822BHJP
G02B 21/00 20060101ALI20240822BHJP
【ＦＩ】
G02B21/14
G01N21/17 610
G01N21/45 A
G02B21/00
【審査請求】有
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023023359
(22)【出願日】2023-02-17
(71)【出願人】
【識別番号】000236436
【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113435
【弁理士】
【氏名又は名称】黒木 義樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140442
【弁理士】
【氏名又は名称】柴山 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100110582
【弁理士】
【氏名又は名称】柴田 昌聰
(72)【発明者】
【氏名】安彦 修
(72)【発明者】
【氏名】竹内 康造
(72)【発明者】
【氏名】山田 秀直
【テーマコード（参考）】
2G059
2H052
【Ｆターム（参考）】
2G059AA05
2G059BB08
2G059BB12
2G059BB14
2G059EE01
2G059EE02
2G059EE09
2G059FF02
2G059FF03
2G059GG01
2G059GG02
2G059JJ13
2G059JJ19
2G059JJ20
2G059JJ22
2G059KK04
2G059LL04
2G059MM01
2H052AA03
2H052AC30
2H052AC34
2H052AD01
2H052AF25
(57)【要約】
【課題】観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる観察装置を提供する。
【解決手段】観察装置１Ａは、光源１０、照射部３１、撮像部５０および処理部６０等を備える。照射部３１は、光源１０から出力された空間的にコヒーレントな光を入力し、その入力した光から第１光および第２光を生成し、これら第１光および第２光を互いに重ね合わせて観察対象物Ｓに照射する。照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物Ｓに対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。撮像部５０は、第１光および第２光の双方を受光して、両光の干渉による干渉強度画像を撮像する。処理部６０は、干渉強度画像に基づいて所要の処理をして、複素振幅画像などを生成する。
【選択図】図１
【解決手段】観察装置１Ａは、光源１０、照射部３１、撮像部５０および処理部６０等を備える。照射部３１は、光源１０から出力された空間的にコヒーレントな光を入力し、その入力した光から第１光および第２光を生成し、これら第１光および第２光を互いに重ね合わせて観察対象物Ｓに照射する。照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物Ｓに対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。撮像部５０は、第１光および第２光の双方を受光して、両光の干渉による干渉強度画像を撮像する。処理部６０は、干渉強度画像に基づいて所要の処理をして、複素振幅画像などを生成する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
空間的にコヒーレントな光を出力する光源と、
前記光から第１光および第２光を生成し、前記第１光および前記第２光の双方を観察対象物に照射する照射部と、
前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た前記第１光および前記第２光の双方を受光して、前記第１光と前記第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像部と、
前記干渉強度画像に基づいて処理を行う処理部と、
を備え、
前記照射部は、
前記観察対象物に対して前記第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、
前記観察対象物に対して前記第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射し、
前記撮像部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１光と前記第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの前記干渉強度画像を撮像し、
前記処理部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の位相差それぞれに設定されたときに前記撮像部により撮像された前記干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求める干渉項算出部と、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項に基づいて前記第１光の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
前記第１光の複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの前記第２光の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
を含む、
観察装置。
前記光から第１光および第２光を生成し、前記第１光および前記第２光の双方を観察対象物に照射する照射部と、
前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た前記第１光および前記第２光の双方を受光して、前記第１光と前記第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像部と、
前記干渉強度画像に基づいて処理を行う処理部と、
を備え、
前記照射部は、
前記観察対象物に対して前記第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、
前記観察対象物に対して前記第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射し、
前記撮像部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１光と前記第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの前記干渉強度画像を撮像し、
前記処理部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の位相差それぞれに設定されたときに前記撮像部により撮像された前記干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求める干渉項算出部と、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項に基づいて前記第１光の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
前記第１光の複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの前記第２光の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
を含む、
観察装置。
【請求項2】
前記撮像部は、前記観察対象物の外側の面における前記干渉強度画像を撮像する、
請求項１に記載の観察装置。
請求項１に記載の観察装置。
【請求項3】
前記照射部は、
互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち前記第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を前記空間光変調器に入射させ、その入射光のうち前記第１方位の直線偏光の光を前記第１光とし、前記第２方位の直線偏光の光を前記空間光変調器により位相変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して前記第２光とする、
請求項１に記載の観察装置。
互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち前記第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を前記空間光変調器に入射させ、その入射光のうち前記第１方位の直線偏光の光を前記第１光とし、前記第２方位の直線偏光の光を前記空間光変調器により位相変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して前記第２光とする、
請求項１に記載の観察装置。
【請求項4】
前記照射部は、
ミラーおよび強度変調型の空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記ミラーにより反射させ、前記第２光を前記空間光変調器により強度変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して、前記第１光および前記第２光を合波して出力する、
請求項１に記載の観察装置。
ミラーおよび強度変調型の空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記ミラーにより反射させ、前記第２光を前記空間光変調器により強度変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して、前記第１光および前記第２光を合波して出力する、
請求項１に記載の観察装置。
【請求項5】
前記照射部は、
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を合波して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記第１ミラーまたは前記第２ミラーの反射面の位置によって前記位相差を設定する、
請求項１に記載の観察装置。
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を合波して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記第１ミラーまたは前記第２ミラーの反射面の位置によって前記位相差を設定する、
請求項１に記載の観察装置。
【請求項6】
前記照射部は、
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を偏光分離して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を偏波合成して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記撮像部は、
複数の偏光成分の光それぞれについて同時に撮像が可能な偏光カメラを含み、複数の偏光成分の光それぞれについて撮像を行うことにより前記位相差が互いに異なる複数の前記干渉強度画像を撮像する、
請求項１に記載の観察装置。
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を偏光分離して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を偏波合成して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記撮像部は、
複数の偏光成分の光それぞれについて同時に撮像が可能な偏光カメラを含み、複数の偏光成分の光それぞれについて撮像を行うことにより前記位相差が互いに異なる複数の前記干渉強度画像を撮像する、
請求項１に記載の観察装置。
【請求項7】
前記第１複素振幅画像生成部は、前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項のコヒーレント和に基づいて前記第１光の複素振幅画像の位相を求める、
請求項１～６何れか一項に記載の観察装置。
請求項１～６何れか一項に記載の観察装置。
【請求項8】
前記第１複素振幅画像生成部は、前記第１光および前記第２光のうち前記第１光のみを前記観察対象物に照射したときに前記撮像部により撮像された強度画像に基づいて前記第１光の複素振幅画像の振幅を求める、
請求項１～６の何れか一項に記載の観察装置。
請求項１～６の何れか一項に記載の観察装置。
【請求項9】
前記第１複素振幅画像生成部は、前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項の強度和に基づいて前記第１光の複素振幅画像の振幅を求める、
請求項１～６の何れか一項に記載の観察装置。
請求項１～６の何れか一項に記載の観察装置。
【請求項10】
前記処理部は、前記複数の光照射方向それぞれの前記第２光の複素振幅画像に基づいて複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成部を更に含む、
請求項１～６の何れか一項に記載の観察装置。
請求項１～６の何れか一項に記載の観察装置。
【請求項11】
前記処理部は、前記複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成部を更に含む、
請求項１０に記載の観察装置。
請求項１０に記載の観察装置。
【請求項12】
前記処理部は、前記位相微分画像に基づいて前記観察対象物の屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成部を更に含む、
請求項１１に記載の観察装置。
請求項１１に記載の観察装置。
【請求項13】
光源から出力された空間的にコヒーレントな光から第１光および第２光を生成し、前記第１光および前記第２光の双方を観察対象物に照射する照射ステップと、
前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た前記第１光および前記第２光の双方を受光して、前記第１光と前記第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像ステップと、
前記干渉強度画像に基づいて処理を行う処理ステップと、
を備え、
前記照射ステップにおいて、
前記観察対象物に対して前記第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、
前記観察対象物に対して前記第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射し、
前記撮像ステップにおいて、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１光と前記第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの前記干渉強度画像を撮像し、
前記処理ステップにおいて、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の位相差それぞれに設定されたときに前記撮像ステップにおいて撮像された前記干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求め、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項に基づいて前記第１光の複素振幅画像を生成し、
前記第１光の複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの前記第２光の複素振幅画像を生成する、
観察方法。
前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た前記第１光および前記第２光の双方を受光して、前記第１光と前記第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像ステップと、
前記干渉強度画像に基づいて処理を行う処理ステップと、
を備え、
前記照射ステップにおいて、
前記観察対象物に対して前記第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、
前記観察対象物に対して前記第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射し、
前記撮像ステップにおいて、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１光と前記第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの前記干渉強度画像を撮像し、
前記処理ステップにおいて、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の位相差それぞれに設定されたときに前記撮像ステップにおいて撮像された前記干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求め、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項に基づいて前記第１光の複素振幅画像を生成し、
前記第１光の複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの前記第２光の複素振幅画像を生成する、
観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、観察装置および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
近年、スフェロイドやオルガノイドと呼ばれる３次元の細胞組織を作製する技術が進歩している。また、これらの３次元細胞組織を創薬や再生医療などに応用する研究が進んでいる。これらの３次元細胞組織は光学的に透明な多重散乱体である。このような光学的に透明な散乱体をイメージングする技術として、これまでに多種多様な手法が提案されている。そのうち蛍光プローブを用いるイメージング技術としては、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡が挙げられる。一方、蛍光プローブを用いない非染色・非侵襲のイメージング技術としては、光コヒーレンス・トモグラフィ（Optical Coherence Tomography、ＯＣＴ）などが知られている。
【0003】
スフェロイドやオルガノイドなどのような観察対象物については非染色・非侵襲のイメージングが望まれる場合が多いものの、これらの観察対象物のイメージングにＯＣＴが適用されたという報告例は多くない。その理由としては、ＯＣＴによるイメージングの分解能が低いこと、および、ＯＣＴによるイメージングにより得られた信号の解釈が難しいこと、が考えられる。したがって、現時点では、ゴールドスタンダードとなりうる非染色の３次元細胞組織のイメージング技術は確立されていないと言ってよい。
【0004】
観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、定量位相イメージング（Quantitative Phase Imaging、ＱＰＩ）も知られている。ＱＰＩは、観察対象物（例えば細胞）の光路長という物理的な情報を取得することができることから、生物分野で応用が進んでいる。ＱＰＩにより取得した画像を用いて、微分干渉画像や位相差顕微鏡画像などの他の種類の画像を生成することができる。ＱＰＩは、情報量が比較的多い画像を取得することができる技術であり、従来の明視野画像を用いた解析よりハイコンテントな解析にも適用することができると期待されている。また、近年の機械学習による画像認識精度の向上により非染色のイメージング技術を使ったハイコンテントな解析が盛んに研究されており、今後、多重散乱体の非染色イメージングは重要な役割を担うことが期待される。しかし、ＱＰＩは、取得される画像があくまで光路長の２次元への投影であるので、真の３次元の構造を把握できない。
【0005】
また、観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、特許文献１に記載されている光回折トモグラフィ（Optical Diffraction Tomography、ＯＤＴ）も知られている。ＯＤＴは、ＱＰＩを３次元イメージング可能な技術に発展させたものであり、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。ＯＤＴを用いて細胞観察を行うことにより、細胞核やミトコンドリアなどの細胞小器官の同定が可能になり、また、３次元的な形態変化の追跡が可能になって、ＱＰＩより更にハイコンテントな解析ができることが期待されている。また、特許文献２に記載されている技術も、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１７－２１９８２６号公報
【特許文献2】米国特許第１０２１５６９７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
特許文献１，２に記載された技術を含む従来の技術では、光源から出力された光を２分岐し、観察対象物を経た一方の分岐光を物体光とし、観察対象物を経ない他方の分岐光を参照光として、これら物体光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像部により撮像する。そして、この干渉強度画像に基づいて所要の演算をすることにより、複素振幅画像を生成することができ、更には観察対象物の３次元屈折率分布画像を生成することができる。従来の二光束干渉法では、観察対象物を経ない既知の波面（平面波）を有する参照光を用いて、干渉計により物体光と参照光とを干渉させて干渉強度画像を取得することにより、物体光の複素振幅（振幅および位相）を正確に求めることができる。
【0008】
しかし、従来の二光束干渉法では、互いに大きく異なる経路を経て撮像部に到達する物体光と参照光とを効率よく干渉させる為に、コヒーレンス長が長い単一周波数の光を出力するレーザ光源を用いる必要がある。物体光と参照光とを効率よく干渉させる為に、撮像部に到るまでの両光間の光路長差をできる限り短くする必要があるが、観察装置の光学系の調整は容易でなく、環境変動等の要因により光路長差が変化すると干渉信号も変化することから安定性に欠ける。
【0009】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の観察装置の第１態様は、(1) 空間的にコヒーレントな光を出力する光源と、(2) 光から第１光および第２光を生成し、第１光および第２光の双方を観察対象物に照射する照射部と、(3) 観察対象物に照射されて観察対象物を経た第１光および第２光の双方を受光して、第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像部と、(4) 干渉強度画像に基づいて処理を行う処理部と、を備える。照射部は、観察対象物に対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物に対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。撮像部は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像する。処理部は、(a) 第２光の複数の光照射方向それぞれについて、複数の位相差それぞれに設定されたときに撮像部により撮像された干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求める干渉項算出部と、(b) 第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項に基づいて第１光の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(c) 第１光の複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像を生成するする第２複素振幅画像生成部と、を含む。
【0011】
本発明の観察装置は、次のような態様としてもよい。
第２態様では、第１態様に加えて、撮像部は、観察対象物の外側の面における干渉強度画像を撮像する。
第２態様では、第１態様に加えて、撮像部は、観察対象物の外側の面における干渉強度画像を撮像する。
【0012】
第３態様では、第１態様または第２態様に加えて、照射部は、互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する空間光変調器を含み、光源から出力された光を空間光変調器に入射させ、その入射光のうち第１方位の直線偏光の光を第１光とし、第２方位の直線偏光の光を空間光変調器により位相変調して光照射方向および位相差を設定して第２光とする。
【0013】
第４態様では、第１態様または第２態様に加えて、照射部は、ミラーおよび強度変調型の空間光変調器を含み、光源から出力された光を２分岐して第１光および第２光とし、第１光をミラーにより反射させ、第２光を空間光変調器により強度変調して光照射方向および位相差を設定して、第１光および第２光を合波して出力する。
【0014】
第５態様では、第１態様または第２態様に加えて、照射部は、第１ミラーおよび第２ミラーを含み、光源から出力された光を２分岐して第１光および第２光とし、第１光を第１ミラーにより反射させ、第２光を第２ミラーにより反射させて、第１光および第２光を合波して出力し、第２ミラーの反射面の方位によって光照射方向を設定し、第１ミラーまたは第２ミラーの反射面の位置によって位相差を設定する。
【0015】
第６態様では、第１態様または第２態様に加えて、照射部は、第１ミラーおよび第２ミラーを含み、光源から出力された光を偏光分離して第１光および第２光とし、第１光を第１ミラーにより反射させ、第２光を第２ミラーにより反射させて、第１光および第２光を偏波合成して出力し、第２ミラーの反射面の方位によって光照射方向を設定する。撮像部は、複数の偏光成分の光それぞれについて同時に撮像が可能な偏光カメラを含み、複数の偏光成分の光それぞれについて撮像を行うことにより位相差が互いに異なる複数の干渉強度画像を撮像する。
【0016】
第７態様では、第１～第６の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項のコヒーレント和に基づいて第１光の複素振幅画像の位相を求める。
第８態様では、第１～第７の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第１光および第２光のうち第１光のみを観察対象物に照射したときに撮像部により撮像された強度画像に基づいて第１光の複素振幅画像の振幅を求める。
第９態様では、第１～第７の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項の強度和に基づいて第１光の複素振幅画像の振幅を求める。
第８態様では、第１～第７の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第１光および第２光のうち第１光のみを観察対象物に照射したときに撮像部により撮像された強度画像に基づいて第１光の複素振幅画像の振幅を求める。
第９態様では、第１～第７の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項の強度和に基づいて第１光の複素振幅画像の振幅を求める。
【0017】
第１０態様では、第１～第９の態様の何れかに加えて、処理部は、複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像に基づいて複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成部を更に含む。
第１１態様では、第１０態様に加えて、処理部は、複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成部を更に含む。
第１２態様では、第１１態様に加えて、処理部は、位相微分画像に基づいて観察対象物の屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成部を更に含む。
第１１態様では、第１０態様に加えて、処理部は、複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成部を更に含む。
第１２態様では、第１１態様に加えて、処理部は、位相微分画像に基づいて観察対象物の屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成部を更に含む。
【0018】
本発明の観察方法の第１態様は、(1) 光源から出力された空間的にコヒーレントな光から第１光および第２光を生成し、第１光および第２光の双方を観察対象物に照射する照射ステップと、(2) 観察対象物に照射されて観察対象物を経た第１光および第２光の双方を受光して、第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像ステップと、(3) 干渉強度画像に基づいて処理を行う処理ステップと、を備える。照射ステップにおいて、観察対象物に対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物に対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。撮像ステップにおいて、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像する。処理ステップにおいて、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、複数の位相差それぞれに設定されたときに撮像ステップにおいて撮像された干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求め、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項に基づいて第１光の複素振幅画像を生成し、第１光の複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像を生成する。
【0019】
本発明の観察方法は、第１態様に加えて、上記の観察装置の第２～第１２の態様の何れかと同趣旨の態様としてもよい。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【0023】
【0024】
図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。この観察装置１Ａは、光源１０、照射部３１、撮像部５０および処理部６０等を備える。光源１０は、空間的にコヒーレントな光を出力する。光源１０から出力される光は、時間的にコヒーレントであってもよいし、時間的にコヒーレントでなくてもよい。光源１０は、レーザ光源であってもよいし、例えばＳＬＤ（Super Luminescent Diode）、ＳＣ（Super Continuum）光源および光周波数コム光源などの光源であってよい。また、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）や水銀ランプなどから出力された空間インコヒーレントな光を、ピンホール等を通すことで空間的なコヒーレンスを高めてもよい。
【0025】
レンズ２１は、光源１０と光学的に接続されており、光源１０から出力された光を光ファイバ２３の光入射端２２に集光して、その光を光入射端２２に入射させる。光ファイバ２３は、光入射端２２に入射された光を光出射端２４まで導光する。光ファイバ２３により導光された光は光出射端２４から発散光として出射される。レンズ２５は、光出射端２４と光学的に接続されており、光出射端２４から発散光として出力された光を入力してコリメートし、そのコリメートした光を照射部３１へ出力する。
【0026】
照射部３１は、光源１０から出力されてレンズ２１，光ファイバ２３およびレンズ２５を経た光を入力し、その入力した光から第１光および第２光を生成する。また、照射部３１は、これら第１光および第２光を互いに重ね合わせて観察対象物Ｓに照射する。照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物Ｓに対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。
【0027】
照射部３１は、ビームスプリッタ３１１、位相変調型の空間光変調器３１３、偏光子３１４、２分の１波長板３１５、偏光子３１６、レンズ３１８および対物レンズ３１９を含む。
【0028】
ビームスプリッタ３１１は、レンズ２５との間に設けられた偏光子３１４および２分の１波長板３１５を経て到達した光を空間光変調器３１３へ反射させる。また、ビームスプリッタ３１１は、空間光変調器３１３から到達した光を入力して、この光を偏光子３１６へ出力する。
【0029】
空間光変調器３１３は、変調面に入射される互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち、第１方位の直線偏光の光に対して位相変調することなく、第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する。偏光子３１４および２分の１波長板３１５は、ビームスプリッタ３１１から空間光変調器３１３の変調面へ入射される光が第１方位および第２方位それぞれの直線偏光成分を互いに同程度に含むように、光の偏光状態を設定する。
【0030】
偏光子３１６は、空間光変調器３１３からビームスプリッタ３１１を経て到達した光を入力し、その光に含まれる第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光を干渉可能とする。偏光子３１６は、空間光変調器３１３からビームスプリッタ３１１を経て到達した光（第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光）の偏光方位に対して４５度だけ異なる方位の光学軸を有し、入力した光のうち光学軸の方位の偏光成分を選択的に透過させる。レンズ３１８および対物レンズ３１９は、偏光子３１６から出力された第１光および第２光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0031】
このような構成を有する照射部３１は、空間光変調器３１３により位相変調されなかった第１方位の直線偏光の光を第１光として、この第１光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３１は、空間光変調器３１３により位相変調された第２方位の直線偏光の光を第２光として、この第２光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２光の光照射方向は、空間光変調器３１３の変調面における位相変調パターンの向き及び間隔により設定することができる。また、第１光と第２光との間の位相差は、空間光変調器３１３の変調面における位相変調パターンのシフトにより設定することができる。
【0032】
対物レンズ４１は、照射部３１により観察対象物Ｓに照射されて観察対象物Ｓを経た光（第１光、第２光）を入力し、その光をミラー４２へ出力する。レンズ４３は、対物レンズ４１から出力されてミラー４２により反射された光を入力し、その光を撮像部５０の撮像面に入射させる。
【0033】
撮像部５０は、レンズ４３から撮像面に到達した第１光および第２光の双方を受光して、第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する。撮像部５０は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像する。
【0034】
処理部６０は、撮像部５０と電気的に接続されており、撮像部５０により撮像された干渉強度画像に基づいて所要の処理をして、複素振幅画像などを生成する。処理部６０の処理内容については後述する。
【0035】
図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。この観察装置１Ｂは、光源１０、照射部３２、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｂ（図２）は、照射部３１に替えて照射部３２を備える点で相違する。
【0036】
照射部３２は、ビームスプリッタ３２１、ミラー３２２、強度変調型の空間光変調器３２３、レンズ３２８および対物レンズ３２９を含む。空間光変調器３２３は、ＤＭＤ（Digital Micromirror Device）であってもよい。
【0037】
ビームスプリッタ３２１は、レンズ２５から到達した光を２分岐して第１分岐光（第１光）および第２分岐光（第２光）とし、第１分岐光をミラー３２２へ出力し、第２分岐光を空間光変調器３２３へ出力する。また、ビームスプリッタ３２１は、ミラー３２２により反射された第１分岐光を入力するとともに、空間光変調器３２３により強度変調された第２分岐光を入力して、これら第１分岐光および第２分岐光を合波してレンズ３２８へ出力する。レンズ３２８および対物レンズ３２９は、ビームスプリッタ３２１から出力された第１分岐光および第２分岐光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0038】
このような構成を有する照射部３２は、ミラー３２２により反射された第１分岐光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３２は、空間光変調器３２３により強度変調された第２分岐光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２分岐光の光照射方向は、空間光変調器３２３の変調面における強度相変調パターンの向き及び間隔により設定することができる。また、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差は、空間光変調器３２３の変調面における強度変調パターンのシフトにより設定することができる。
【0039】
なお、ミラー３２２または空間光変調器３２３の位置により位相差を調整することもできる。しかし、空間光変調器３２３の変調面における強度変調パターンのシフトにより位相差を設定する場合の方が、構成要素の機械的な移動がない点で好ましい。
【0040】
図３は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。この観察装置１Ｃは、光源１０、照射部３３、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｃ（図３）は、照射部３１に替えて照射部３３を備える点で相違する。
【0041】
照射部３３は、ビームスプリッタ３３１、ミラー３３２、ミラー３３３、レンズ３３８および対物レンズ３３９を含む。ミラー３３２は、例えばピエゾアクチュエータによる駆動により、反射面に直交する方向に沿って反射面の位置が可変である。ミラー３３３は、例えばガルバノミラー、ボイスコイルミラーやピエゾチルトミラー等により、反射面の方位が可変とされる。
【0042】
ビームスプリッタ３３１は、レンズ２５から到達した光を２分岐して第１分岐光（第１光）および第２分岐光（第２光）とし、第１分岐光をミラー３３２へ出力し、第２分岐光をミラー３３３へ出力する。また、ビームスプリッタ３３１は、ミラー３３２により反射された第１分岐光を入力するとともに、ミラー３３３により反射された第２分岐光を入力して、これら第１分岐光および第２分岐光を合波してレンズ３３８へ出力する。レンズ３３８および対物レンズ３３９は、ビームスプリッタ３３１から出力された第１分岐光および第２分岐光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0043】
このような構成を有する照射部３３は、ミラー３３２により反射された第１分岐光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３３は、ミラー３３３により反射された第２分岐光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２分岐光の光照射方向は、ミラー３３３の反射面の方位により設定することができる。また、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差は、ミラー３３２の反射面の位置により設定することができる。この位相差は、ミラー３３３の反射面の位置により設定してもよい。
【0044】
図４は、観察装置１Ｄの構成を示す図である。この観察装置１Ｄは、光源１０、照射部３４、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｄ（図４）は、照射部３１に替えて照射部３４を備える点で相違し、撮像部５０に替えて撮像部５１を備える点で相違し、対物レンズ４１と撮像部５１との間の光路上に設けられた４分の１波長板４４を更に備える点で相違する。
【0045】
照射部３４は、偏光ビームスプリッタ３４１、ミラー３４２、ミラー３４３、偏光子３４４、２分の１波長板３４５、４分の１波長板３４６、４分の１波長板３４７、レンズ３４８および対物レンズ３４９を含む。ミラー３４３は、例えばガルバノミラー、ボイスコイルミラーやピエゾチルトミラー等により、反射面の方位が可変とされる。
【0046】
偏光ビームスプリッタ３４１は、レンズ２５との間に設けられた偏光子３４４および２分の１波長板３４５を経て到達した光を偏光分離して第１分岐光（第１光）および第２分岐光（第２光）とし、第１分岐光をミラー３４２へ出力し、第２分岐光をミラー３４３へ出力する。４分の１波長板３４６は、第１分岐光を反射させるミラー３４２と偏光ビームスプリッタ３４１との間に設けられており、第１分岐光を２度通過させることで、第１分岐光の直線偏光の方位を９０°回転させる。４分の１波長板３４７は、第２分岐光を反射させるミラー３４３と偏光ビームスプリッタ３４１との間に設けられており、第２分岐光を２度通過させることで、第２分岐光の直線偏光の方位を９０°回転させる。
【0047】
偏光ビームスプリッタ３４１は、ミラー３４２により反射されて４分の１波長板３４６を通過した第１分岐光を入力するとともに、ミラー３４３により反射されて４分の１波長板３４７を通過した第２分岐光を入力して、これら入力した第１分岐光および第２分岐光を偏波合成してレンズ３４８へ出力する。レンズ３４８および対物レンズ３４９は、偏光ビームスプリッタ３４１から出力された第１分岐光および第２分岐光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0048】
このような構成を有する照射部３４は、ミラー３４２により反射された第１分岐光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３４は、ミラー３４３により反射された第２分岐光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２分岐光の光照射方向は、ミラー３４３の反射面の方位により設定することができる。
【0049】
４分の１波長板４４は、対物レンズ４１と撮像部５１との間の光路上に設けられている。４分の１波長板４４は、互いに直交する直線偏光である第１分岐光および第２分岐光を入力して、これら第１分岐光および第２分岐光を互いに異なる回転方向の円偏光として出力する。
【0050】
撮像部５１は、複数の偏光成分の光それぞれについて個別に且つ同時に撮像が可能な偏光カメラを含む。撮像部５１は、４分の１波長板４４を経た第１分岐光および第２分岐光を受光することで、両光間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像することができる。
【0051】
偏光カメラとしてソニー株式会社により商品化されているイメージセンサ（Polarsens（登録商標））やTeledyneDALSA社により商品化されているイメージセンサ（Area Scan Polarization Sensor）を挙げることができる。これらは、４つの方位の直線偏光の２次元像を同時に撮像することができ、位相差がπ／２ずつ異なる４つの干渉強度画像を同時に得ることができる。また、偏光カメラとしてTeledyne DALSA社により商品化されているイメージセンサ（Line Scan Polarization Sensor）も挙げることができ、これは、３つの方位の直線偏光の２次元像を同時に撮像することができる。
【0052】
図５は、観察装置１Ｅの構成を示す図である。観察装置１Ａ（図１）は、観察対象物Ｓを透過した第１光および第２光の干渉による干渉強度画像を撮像する。これに対して、観察装置１Ｅ（図５）は、観察対象物Ｓで反射された第１光および第２光の干渉による干渉強度画像を撮像する。
【0053】
観察装置１Ｅ（図５）は、光源１０、照射部３５、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｅ（図５）は、照射部３１に替えて照射部３５を備える点で相違する。照射部３５は、照射部３１の構成において、レンズ３１８と対物レンズ３１９との間の光路上にビームスプリッタ４５が挿入されている。
【0054】
観察対象物Ｓへの光照射の際には、ビームスプリッタ３１１から出力された第１光および第２光は、偏光子３１６、レンズ３１８、ビームスプリッタ４５および対物レンズ３１９を順に経て観察対象物Ｓへ照射される。撮像部５０による撮像の際には、観察対象物Ｓで反射された第１光および第２光は、対物レンズ３１９、ビームスプリッタ４５およびレンズ４３を順に経て撮像部５０に到達する。観察装置１Ｅ（図５）の対物レンズ３１９は、観察装置１Ａ（図１）の対物レンズ４１を兼ねている。
【0055】
観察装置１Ｅ（図５）の反射型の構成は、観察装置１Ａ（図１）の透過型の構成に対応するものである。同様にして、観察装置１Ｂ（図２）、観察装置１Ｃ（図３）および観察装置１Ｄ（図４）それぞれの透過型の構成に対応して、反射型の構成も可能である。観察装置１Ｄ（図４）に対応する反射型の構成の場合には、４分の１波長板４４および撮像部５１を用いる。
【0056】
図６は、観察装置１Ｆの構成を示す図である。観察装置１Ａ（図１）は、撮像部５０と観察対象物Ｓとの間に結像光学系が設けられていて、撮像部５０の撮像面に対して光学的に共役な面における干渉強度画像を撮像する。これに対して、観察装置１Ｆ（図６）は、結像光学系が設けられておらず、撮像部５０の撮像面が観察対象物Ｓの直下に近接して配置されている。
【0057】
観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｆ（図６）は、結像光学系（対物レンズ４１、ミラー４２、レンズ４３）が設けられていない点で相違する。撮像部５０は、観察対象物Ｓを透過した直後の第１光および第２光を撮像面に受光して、これら第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する。
【0058】
観察装置１Ｆ（図６）の構成は、観察装置１Ａ（図１）の構成に対応するものである。同様にして、観察装置１Ｂ（図２）、観察装置１Ｃ（図３）および観察装置１Ｄ（図４）それぞれの構成に対応して、結像光学系を設けない構成も可能である。観察装置１Ｄ（図４）に対応する結像光学系を設けない構成の場合には、４分の１波長板４４および撮像部５１を用いる。
【0059】
図７は、照射部３１～３５から観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。ここでは、観察対象物Ｓへ光を照射する対物レンズの光軸に平行な方向にｚ軸を有するｘｙｚ直交座標系を設定した上で、各々の光照射方向をｋｘｋｙｋｚ波数空間における位置で表す。この図は、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。光照射方向の走査は、ｋｘｋｙ平面において、（ａ）矩形格子状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｂ）ハニカム状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｃ）六方格子状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｄ）同心の複数の円それぞれの周上に離散的に配置されるようなものであってもよいし、（ｅ）螺旋状に離散的に配置されるようなものであってもよい。何れの場合にも、観察対象物Ｓへ光を照射する対物レンズの許す限りで光照射方向の走査が可能である。ラスタスキャンおよびランダムスキャンの何れであってもよい。ラスタスキャンの場合には、戻りスキャンが有ってもよいし無くてもよい。
【0060】
次に、観察装置１Ａ（図１）を用いた観察方法について説明する。他の構成の観察装置を用いた場合でも同様である。
【0061】
図８は、観察対象物Ｓへの第１光および第２光の入射、ならびに、観察対象物Ｓを経た後の撮像部５０への第１光および第２光の入射、を模式的に示す図である。観察対象物Ｓへ入射する第１光の波面をｕ０,in（ｒ）と表す。第２光の複数（Ｎ個）の光照射方向のうち第ｎ光照射方向（ｎ＝１～Ｎ）に沿って観察対象物Ｓへ入射する第２光の波面をｕｎ,in（ｒ）exp（ｉφ）と表す。ｒは位置を表す変数である。φは、第１光と第２光との間の位相差である。ｉは虚数単位である。撮像部５０の撮像面または焦点面（撮像面に対して光学的に共役な面）における第１光の波面をｕ０（ｒ）と表し、第２光の波面をｕｎ（ｒ）exp（ｉφ）と表す。
【0062】
撮像部５０による撮像により取得される干渉強度画像Ｉｎ（ｒ，φ）は下記（１）式で表される。干渉強度画像Ｉｎ（ｒ，φ）は、第１光と第２光との間の位相差をφとして、観察対象物に対して第１光を一定の光照射方向に沿って観察対象物Ｓへ入射させ、観察対象物に対して第２光を第ｎ光照射方向に沿って入射させたときに、撮像部５０による撮像により取得される干渉強度画像である。焦点面（撮像面に対して光学的に共役な面）は、観察対象物Ｓにあってもよいし、観察対象物Ｓより撮像部５０側にあってもよいし、観察対象物Ｓより照射部３１側にあってもよい。
【0063】
【数1】
【0064】
図９は、観察装置の処理部６０の構成を示す図である。処理部６０は、干渉項算出部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、複素微分干渉画像生成部６４、位相微分画像生成部６５および屈折率分布画像生成部６６を含む。
【0065】
図１０は、観察方法のフローチャートである。照射ステップＳ１において、照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光および第２光を重ねて照射する。このとき、観察対象物Ｓに対する第１光の光照射方向を一定とし、観察対象物Ｓに対する第２光の光照射方向を複数の光照射方向それぞれとし、第１光と第２光との間の位相差φを各値に設定する。
【0066】
撮像ステップＳ２において、撮像部５０は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差φが複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像（（１）式）を撮像する。
【0067】
処理部６０が行う処理ステップは、ステップＳ３～Ｓ８を含む。干渉項算出ステップＳ３において、処理部６０の干渉項算出部６１は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、複数の位相差φそれぞれに設定されたときに撮像部５０により取得された干渉強度画像（（１）式）に基づいて、位相シフト法により干渉項を求める。例えば、３点位相シフト法を用いる場合、干渉項算出部６１は、下記（２）式により干渉項Ｃｎ（ｒ）＝ｕ０
＊（ｒ）・ｕｎ（ｒ）を求める。干渉項ｕ０（ｒ）・ｕｎ
＊（ｒ）を求めてもよい。４点以上の位相シフト法を用いてもよい。この干渉項Ｃｎ（ｒ）を第２光の複数の光照射方向それぞれについて（すなわち、各ｎ（＝１～Ｎ））について求める。
【0068】
【数2】
【0069】
第１複素振幅画像生成ステップＳ４において、処理部６０の第１複素振幅画像生成部６２は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項Ｃｎ（ｒ）に基づいて、第１光の複素振幅画像を生成する。第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相は、次のようにして推定することができる。第１光と第２光との間の位相傾き（光入射方向の差異）を補正した後、その補正後の干渉項のコヒーレント和Ｃsum（ｒ）を下記（３）式により求める。ここでは、第１光の光入射方向をｚ軸に平行とし、第２光の第ｎ光入射方向を表す波数ベクトルをｋｎとする。
【0070】
【数3】
【0071】
この（３）式の最右辺の第１因子（ｕ０
＊（ｒ））の位相は、観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って入射した第１光の成分であり、オプティカルセクショニング効果がないので、散乱の影響を大きく受ける。一方、（３）式の最右辺の第２因子（ｕｎ（ｒ）exp（ｉｋｎｒ）の総和）の位相は、複数の光入射方向についての総和であり、コヒーレント和によるオプティカルセクショニング効果によって、焦点面付近の情報が選択的に抽出されたものであるので、比較的平坦な分布を有する。このことから、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相φ０（ｒ）は、下記（４）式で表されるとおり、位相傾き補正後の干渉項のコヒーレント和Ｃsum（ｒ）の位相で近似的に表すことができる。
【0072】
【数4】
【0073】
第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅は、第２光を観察対象物Ｓに照射せずに、第１光のみを観察対象物Ｓに照射したときに、撮像部５０により撮像された強度画像｜ｕ０（ｒ）｜２から求めることができる。例えば、観察装置１Ａ（図１）では照射部３１において偏光子３１４および２分の１波長板３１５それぞれの光学軸の方位を調整することにより、観察装置１Ｂ（図２）では照射部３２において空間光変調器３２３の変調パターン設定により、観察装置１Ｃ（図３）では照射部３３においてミラー３３３を取り外すことにより、観察装置１Ｄ（図４）では照射部３４においてミラー３４３を取り外すことにより、第１光のみを観察対象物Ｓに照射することができる。
【0074】
また、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅は、干渉項Ｃｎ（ｒ）に基づいて次のようにして推定することもできる。干渉項Ｃｎ（ｒ）の強度和Ｉsum（ｒ）を下記（５）式により求める。
【0075】
【数5】
【0076】
この（５）式の最右辺の第１因子（｜ｕ０（ｒ）｜２）は、観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って入射した第１光の成分であり、オプティカルセクショニング効果がないので、散乱の影響を大きく受ける。一方、（５）式の最右辺の第２因子（｜ｕｎ（ｒ）｜２の総和）は、複数の光入射方向についての総和であり、コヒーレント和によるオプティカルセクショニング効果によって、散乱光が平均化されて比較的均一な分布となる。このことから、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅Ａ０（ｒ）は、下記（６）式で示されるとおり、干渉項Ｃｎ（ｒ）の強度和Ｉsum（ｒ）の平方根で近似的に表すことができる。
【0077】
【数6】
【0078】
第１複素振幅画像生成ステップＳ４において、第１複素振幅画像生成部６２は、以上のようにして求めた第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相φ０（ｒ）および振幅Ａ０（ｒ）に基づいて、下記（７）式により、第１光の複素振幅画像ｕ０（ｒ）を生成することができる。
【0079】
【数7】
【0080】
オプティカルセクショニング効果とは、例えば共焦点顕微鏡や微分干渉顕微鏡において、対物レンズの焦点面の画像を選択的に取得することができる効果である。これらの顕微鏡では、入射側および検出側の双方の開口数を大きくとることで、選択的照射および選択的検出を実現して、オプティカルセクショニング効果を実現することができる。
【0081】
第２複素振幅画像生成ステップＳ５において、処理部６０の第２複素振幅画像生成部６３は、第１光の複素振幅画像ｕ０（ｒ）および干渉項Ｃｎ（ｒ）に基づいて、下記（８）式により、複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像ｕｎ（ｒ）を生成することができる。ただし、この（８）式では右辺の分母が０であるときにｕｎ（ｒ）が不定となるので、この（８）式に替えて下記（９）式により、複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像ｕｎ（ｒ）を生成するのが好ましい。εは正の微小値である。ε＝０とした場合、（９）式は（８）式と一致する。
【0082】
【数8】
【0083】
【数9】
【0084】
複素微分干渉画像生成ステップＳ６において、処理部６０の複素微分干渉画像生成部６４は、複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像ｕｎ（ｒ）に基づいて、下記（１０）式により複素微分干渉画像Ｗ（ｒ）を生成することができる。δｒはシアーを表す。δｒのｘ成分δｘおよびｙ成分δｙのうち少なくとも一方は非０である。δｘ≠０，δｙ＝０であれば、ｘ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。δｘ＝０，δｙ≠０であれば、ｙ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。δｘ≠０，δｙ≠０であれば、δｘとδｙとの比に応じた方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。
【0085】
【数10】
【0086】
位相微分画像生成ステップＳ７において、処理部６０の位相微分画像生成部６５は、複素微分干渉画像Ｗ（ｒ）の位相で表される位相微分画像を生成することができる。さらに、屈折率分布画像生成ステップＳ８において、処理部６０の屈折率分布画像生成部６６は、波面の自由伝搬の式を用いてｚ軸方向の各位置における位相微分画像（すなわち３次元位相微分画像）を求め、これに基づいてデコンボリューションにより観察対象物Ｓの屈折率分布画像を生成することができる。
【0087】
次に、シミュレーション結果について説明する。以下に説明するシミュレーションＡ，Ｂでは位相微分画像を求め、シミュレーションＣでは屈折率分布画像まで求めた。
【0088】
シミュレーションＡでは、図１１に示されるように、５種類の位相画像を互いに間隔をあけて並列配置したものを観察対象物とし、５種類の位相画像のうち最も撮像部に近い位相画像から５λだけ離れた撮像部側の面に焦点面を設定した。λは光の波長である。図１１は、シミュレーションＡ時の配置を模式的に説明する図である。
【0089】
図１２は、シミュレーションＡ時に干渉項に基づいて求められた（ａ）｜ｕ０（ｒ）｜、（ｂ）｜ｕｎ（ｒ）｜２の強度和の平方根、および、（ｃ）推定された第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅Ａ０（ｒ）、それぞれの画像を示す図である。この図に示されるように、｜ｕ０（ｒ）｜は散乱の影響を大きく受けているのに対して、｜ｕｎ（ｒ）｜２の総和は比較的均一な分布となっており、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅Ａ０（ｒ）は、干渉項の強度和Ｉsum（ｒ）の平方根で近似的に表すことができる。
【0090】
図１３は、シミュレーションＡ時に干渉項に基づいて求められた（ａ）ｕ０
＊（ｒ）の位相、（ｂ）ｕｎ（ｒ）のコヒーレント和の位相、および、（ｃ）推定された第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相φ０（ｒ）、それぞれの画像を示す図である。この図に示されるように、ｕ０
＊（ｒ）の位相は散乱の影響を大きく受けているのに対して、ｕｎ（ｒ）のコヒーレント和の位相は比較的平坦な分布を有しており、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相φ０（ｒ）は、干渉項のコヒーレント和Ｃsum（ｒ）の位相で近似的に表すことができる。
【0091】
図１４は、シミュレーションＡの結果を示す図である。この図において、上段は厳密解の位相微分画像を示し、中段は従来の二光束干渉法により生成された位相微分画像を示し、下段は本実施形態により生成された位相微分画像を示す。この図に示されるように、シミュレーションＡで生成された位相微分画像は、従来の二光束干渉法により生成された位相微分画像と同程度の鮮明さであった。
【0092】
シミュレーションＢでは、図１５に示されるように、５種類の位相画像を互いに間隔をあけて並列配置したものを観察対象物とし、５種類の位相画像のうち中央にある位相画像の面に焦点面を設定した。λは光の波長である。図１５は、シミュレーションＢ時の配置を模式的に説明する図である。
【0093】
図１６は、シミュレーションＢ時に干渉項に基づいて求められた（ａ）｜ｕ０（ｒ）｜、（ｂ）｜ｕｎ（ｒ）｜２の強度和の平方根、および、（ｃ）推定された第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅Ａ０（ｒ）、それぞれの画像を示す図である。この図に示されるように、｜ｕ０（ｒ）｜は散乱の影響を大きく受けているのに対して、｜ｕｎ（ｒ）｜２の総和は比較的均一な分布となっており、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅Ａ０（ｒ）は、干渉項の強度和Ｉsum（ｒ）の平方根で近似的に表すことができる。
【0094】
図１７は、シミュレーションＢ時に干渉項に基づいて求められた（ａ）ｕ０
＊（ｒ）の位相、（ｂ）ｕｎ（ｒ）のコヒーレント和の位相、および、（ｃ）推定された第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相φ０（ｒ）、それぞれの画像を示す図である。この図に示されるように、シミュレーションＢの焦点面の位置に関する条件では、ｕ０
＊（ｒ）の位相は散乱の影響を大きく受けており、ｕｎ（ｒ）のコヒーレント和の位相も少なからず散乱の影響を受けている。
【0095】
図１８は、シミュレーションＢの結果を示す図である。この図において、上段は厳密解の位相微分画像を示し、中段は従来の二光束干渉法により生成された位相微分画像を示し、下段は本実施形態により生成された位相微分画像を示す。この図に示されるように、シミュレーションＢで生成された位相微分画像は、従来の二光束干渉法により生成された位相微分画像と比べると乱れたものとなっている。焦点面にある中央の位相画像は特に乱れている。しかし、焦点面が観察対象物に位置する場合であっても、位相微分画像を生成することができることが確認された。
【0096】
シミュレーションＣでは、図１９に示されるように、細胞塊を模擬したものを観察対象物として用い、観察対象物と撮像部との間に焦点面を設定した。図１９は、シミュレーションＣ時の配置を模式的に説明する図である。図２０および図２１それぞれは、シミュレーションＣの結果を示す図である。
【0097】
図２０において、上段は従来の二光束干渉法により生成された位相微分画像を示し、下段は本実施形態により生成された位相微分画像を示す。また、図２０において、左端はｚ軸に平行な断面における位相微分画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における位相微分画像を示す。
【0098】
図２１において、上段は厳密解の屈折率分布画像を示し、中段は従来の二光束干渉法により生成された屈折率分布画像を示し、下段は本実施形態により生成された屈折率分布画像を示す。また、図２１において、左端はｙ方向への最大値投影画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における屈折率分布画像を示す。
【0099】
シミュレーションＣで生成された位相微分画像、屈折率分布画像は、従来の二光束干渉法により生成された位相微分画像、屈折率分布画像と同程度の鮮明さであった。
【0100】
シミュレーションＡ～Ｃの結果から、撮像部と観察対象物との間に結像光学系を設ける場合に、撮像部の焦点面（撮像面に対して光学的に共役な面）は観察対象物の外に設定するのが好適であることが分かる。
【0101】
本実施形態において観察対象物に対して一定の光照射方向に沿って照射される第１光は、従来の二光束干渉法における参照光に替わるものである。従来の二光束干渉法では、参照光が観察対象物を経ることはなく、観察対象物を経た後の物体光と参照光とが合波されて撮像部により受光される。これに対して、本実施形態では、照射部において生成された第１光および第２光の双方は、その照射部から出力されて観察対象物を経て撮像部により受光される。
【0102】
本実施形態では、照射部が干渉光学系の構成を有する場合であっても、その干渉光学系の光路上に観察対象物が配置されない。本実施形態では、照射部における干渉光学系の光路は、光路上に観察対象物を配置する従来の二光束干渉法の場合の光路と比べて短くすることができる。したがって、本実施形態では、照射部は小型なものとすることができ、このような照射部を備える観察装置も小型なものとすることができる。なお、照射部が干渉光学系の構成を有する場合、その干渉光学系は、上記実施形態ではマイケルソン干渉計であったが、マッハツェンダ干渉計であってもよい。
【0103】
また、本実施形態では、照射部は、小型化することができることから、光学系の調整が容易であり、第１光と第２光との間の光路長差を短くすることも容易である。これにより、光源は、コヒーレンス長が長い単一周波数の光を出力するものである必要がなくなり、光源選択の自由度が増える。
【0104】
また、本実施形態では、照射部は一体化された構成とすることもできる。特に、照射部が空間光変調器を含む構成である場合、その照射部を構成する各部品（空間光変調器、ビームスプリッタ、ミラー、レンズ等）の相対的位置関係を固定して一体化することができる。また、照射部においてミラーの位置または方位をピエゾアクチュエータにより調整する構成であっても、その照射部を構成する各部品（ビームスプリッタ、ピエゾアクチュエータ、レンズ等）の相対的位置関係を固定して一体化することができる。このように照射部を一体化した構成とすることにより、その照射部を備える観察装置を組み立てることが更に容易となり、観察対象物を更に容易に観察することができる。
【0105】
本実施形態によれば、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる。
【符号の説明】
【0106】
１Ａ～１Ｆ…観察装置、１０…光源、２１…レンズ、２２…光入射端、２３…光ファイバ、２４…光出射端、２５…レンズ、３１～３５…照射部、４１…対物レンズ、４２…ミラー、４３…レンズ、４４…４分の１波長板、４５…ビームスプリッタ、５０，５１…撮像部、６０…処理部、６１…干渉項算出部、６２…第１複素振幅画像生成部、６３…第２複素振幅画像生成部、６４…複素微分干渉画像生成部、６５…位相微分画像生成部、６６…屈折率分布画像生成部。
３１１…ビームスプリッタ、３１３…空間光変調器、３１４…偏光子、３１５…２分の１波長板、３１６…偏光子、３１８…レンズ、３１９…対物レンズ、３２１…ビームスプリッタ、３２２…ミラー、３２３…空間光変調器、３２８…レンズ、３２９…対物レンズ、３３１…ビームスプリッタ、３３２，３３３…ミラー、３３８…レンズ、３３９…対物レンズ、３４１…偏光ビームスプリッタ、３４２，３４３…ミラー、３４４…偏光子、３４５…２分の１波長板、３４６，３４７…４分の１波長板、３４８…レンズ、３４９…対物レンズ。
３１１…ビームスプリッタ、３１３…空間光変調器、３１４…偏光子、３１５…２分の１波長板、３１６…偏光子、３１８…レンズ、３１９…対物レンズ、３２１…ビームスプリッタ、３２２…ミラー、３２３…空間光変調器、３２８…レンズ、３２９…対物レンズ、３３１…ビームスプリッタ、３３２，３３３…ミラー、３３８…レンズ、３３９…対物レンズ、３４１…偏光ビームスプリッタ、３４２，３４３…ミラー、３４４…偏光子、３４５…２分の１波長板、３４６，３４７…４分の１波長板、３４８…レンズ、３４９…対物レンズ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
