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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024117325
(43)【公開日】2024-08-29
(54)【発明の名称】観察装置および観察方法
(51)【国際特許分類】
G02B 21/36 20060101AFI20240822BHJP
G01N 21/45 20060101ALI20240822BHJP
G01N 21/17 20060101ALI20240822BHJP
G02B 21/06 20060101ALI20240822BHJP
【ＦＩ】
G02B21/36
G01N21/45 A
G01N21/17 610
G02B21/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】23
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023023360
(22)【出願日】2023-02-17
(71)【出願人】
【識別番号】000236436
【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113435
【弁理士】
【氏名又は名称】黒木 義樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140442
【弁理士】
【氏名又は名称】柴山 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100110582
【弁理士】
【氏名又は名称】柴田 昌聰
(72)【発明者】
【氏名】安彦 修
(72)【発明者】
【氏名】竹内 康造
(72)【発明者】
【氏名】山田 秀直
【テーマコード（参考）】
2G059
2H052
【Ｆターム（参考）】
2G059AA05
2G059BB08
2G059BB12
2G059BB14
2G059EE01
2G059EE02
2G059EE09
2G059FF02
2G059FF03
2G059GG01
2G059GG02
2G059JJ11
2G059JJ13
2G059JJ22
2G059KK04
2G059LL04
2G059MM01
2H052AA04
2H052AA05
2H052AC34
2H052AF14
2H052AF25
(57)【要約】
【課題】観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる観察装置を提供する。
【解決手段】観察装置１Ａは、光源１０、照射部３１、撮像部５０および処理部６０等を備える。照射部３１は、光源１０から出力された空間的にコヒーレントな光を入力し、その入力した光から第１光および第２光を生成し、これら第１光および第２光を互いに重ね合わせて観察対象物Ｓに照射する。照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物Ｓに対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。撮像部５０は、第１光および第２光の双方を受光して、複数の焦点面それぞれにおける干渉強度画像を撮像する。処理部６０は、干渉強度画像に基づいて所要の処理をして、複素振幅画像などを生成する。
【選択図】図１
【解決手段】観察装置１Ａは、光源１０、照射部３１、撮像部５０および処理部６０等を備える。照射部３１は、光源１０から出力された空間的にコヒーレントな光を入力し、その入力した光から第１光および第２光を生成し、これら第１光および第２光を互いに重ね合わせて観察対象物Ｓに照射する。照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物Ｓに対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。撮像部５０は、第１光および第２光の双方を受光して、複数の焦点面それぞれにおける干渉強度画像を撮像する。処理部６０は、干渉強度画像に基づいて所要の処理をして、複素振幅画像などを生成する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の光照射方向それぞれに沿って光を観察対象物に照射したときの複数の焦点面それぞれにおける光の複素振幅画像を生成する初期画像生成部と、
前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の焦点面のうちの任意の焦点面の複素振幅画像で表される光の波面を任意の他の焦点面まで伝搬させたときの光の波面を表す複素振幅画像に基づいて、前記他の焦点面の複素振幅画像を更新する画像更新部と、
を備え、
前記画像更新部は、前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記初期画像生成部により生成された複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す、
観察装置。
前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の焦点面のうちの任意の焦点面の複素振幅画像で表される光の波面を任意の他の焦点面まで伝搬させたときの光の波面を表す複素振幅画像に基づいて、前記他の焦点面の複素振幅画像を更新する画像更新部と、
を備え、
前記画像更新部は、前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記初期画像生成部により生成された複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す、
観察装置。
【請求項2】
前記複数の焦点面の相互間の離間距離は、前記観察対象物の観察に用いる対物レンズの開口数に基づく焦点深度より長い、
請求項１に記載の観察装置。
請求項１に記載の観察装置。
【請求項3】
前記複数の焦点面のうちの何れか１以上の焦点面は前記観察対象物中に位置する、
請求項１に記載の観察装置。
請求項１に記載の観察装置。
【請求項4】
前記画像更新部により繰り返し更新された前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成部を更に備える、
請求項１に記載の観察装置。
請求項１に記載の観察装置。
【請求項5】
前記複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成部を更に備える、
請求項４に記載の観察装置。
請求項４に記載の観察装置。
【請求項6】
前記位相微分画像に基づいて前記観察対象物の屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成部を更に備える、
請求項５に記載の観察装置。
請求項５に記載の観察装置。
【請求項7】
空間的にコヒーレントな光を出力する光源と、
前記光から第１光および第２光を生成し、前記第１光および前記第２光の双方を観察対象物に照射する照射部と、
前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た前記第１光および前記第２光の双方を受光して、前記第１光と前記第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像部と、
前記焦点面の位置を設定する焦点面位置設定部と、
を更に備え、
前記照射部は、
前記観察対象物に対して前記第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、
前記観察対象物に対して前記第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射し、
前記撮像部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記第１光と前記第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの前記干渉強度画像を撮像し、
前記初期画像生成部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記複数の位相差それぞれに設定されたときに前記撮像部により撮像された前記干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求める干渉項算出部と、
前記複数の焦点面それぞれについて、前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項に基づいて前記第１光の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記第１光の複素振幅画像に基づいて前記第２光の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
を含み、
前記画像更新部は、
前記第２複素振幅画像生成部により前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて生成された前記第２光の複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す、
請求項１に記載の観察装置。
前記光から第１光および第２光を生成し、前記第１光および前記第２光の双方を観察対象物に照射する照射部と、
前記観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た前記第１光および前記第２光の双方を受光して、前記第１光と前記第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像部と、
前記焦点面の位置を設定する焦点面位置設定部と、
を更に備え、
前記照射部は、
前記観察対象物に対して前記第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、
前記観察対象物に対して前記第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射し、
前記撮像部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記第１光と前記第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの前記干渉強度画像を撮像し、
前記初期画像生成部は、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記複数の位相差それぞれに設定されたときに前記撮像部により撮像された前記干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求める干渉項算出部と、
前記複数の焦点面それぞれについて、前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項に基づいて前記第１光の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記第１光の複素振幅画像に基づいて前記第２光の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
を含み、
前記画像更新部は、
前記第２複素振幅画像生成部により前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて生成された前記第２光の複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す、
請求項１に記載の観察装置。
【請求項8】
前記照射部は、
互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち前記第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を前記空間光変調器に入射させ、その入射光のうち前記第１方位の直線偏光の光を前記第１光とし、前記第２方位の直線偏光の光を前記空間光変調器により位相変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して前記第２光とする、
請求項７に記載の観察装置。
互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち前記第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を前記空間光変調器に入射させ、その入射光のうち前記第１方位の直線偏光の光を前記第１光とし、前記第２方位の直線偏光の光を前記空間光変調器により位相変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して前記第２光とする、
請求項７に記載の観察装置。
【請求項9】
前記照射部は、
ミラーおよび強度変調型の空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記ミラーにより反射させ、前記第２光を前記空間光変調器により強度変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して、前記第１光および前記第２光を合波して出力する、
請求項７に記載の観察装置。
ミラーおよび強度変調型の空間光変調器を含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記ミラーにより反射させ、前記第２光を前記空間光変調器により強度変調して前記光照射方向および前記位相差を設定して、前記第１光および前記第２光を合波して出力する、
請求項７に記載の観察装置。
【請求項10】
前記照射部は、
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を合波して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記第１ミラーまたは前記第２ミラーの反射面の位置によって前記位相差を設定する、
請求項７に記載の観察装置。
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を２分岐して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を合波して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記第１ミラーまたは前記第２ミラーの反射面の位置によって前記位相差を設定する、
請求項７に記載の観察装置。
【請求項11】
前記照射部は、
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を偏光分離して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を偏波合成して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記撮像部は、
複数の偏光成分の光それぞれについて同時に撮像が可能な偏光カメラを含み、複数の偏光成分の光それぞれについて撮像を行うことにより前記位相差が互いに異なる複数の前記干渉強度画像を撮像する、
請求項７に記載の観察装置。
第１ミラーおよび第２ミラーを含み、
前記光源から出力された光を偏光分離して前記第１光および前記第２光とし、前記第１光を前記第１ミラーにより反射させ、前記第２光を前記第２ミラーにより反射させて、前記第１光および前記第２光を偏波合成して出力し、
前記第２ミラーの反射面の方位によって前記光照射方向を設定し、
前記撮像部は、
複数の偏光成分の光それぞれについて同時に撮像が可能な偏光カメラを含み、複数の偏光成分の光それぞれについて撮像を行うことにより前記位相差が互いに異なる複数の前記干渉強度画像を撮像する、
請求項７に記載の観察装置。
【請求項12】
前記焦点面位置設定部は、前記観察対象物の位置を調整することにより、または、前記観察対象物と前記撮像部との間にある結像光学系を調整することにより、前記焦点面の位置を設定する、
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
【請求項13】
前記第１複素振幅画像生成部は、前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項のコヒーレント和に基づいて前記第１光の複素振幅画像の位相を求める、
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
【請求項14】
前記第１複素振幅画像生成部は、前記第１光および前記第２光のうち前記第１光のみを前記観察対象物に照射したときに前記撮像部により撮像された強度画像に基づいて前記第１光の複素振幅画像の振幅を求める、
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
【請求項15】
前記第１複素振幅画像生成部は、前記第２光の前記複数の光照射方向それぞれについて求めた前記干渉項の強度和に基づいて前記第１光の複素振幅画像の振幅を求める、
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
請求項７～１１の何れか１項に記載の観察装置。
【請求項16】
複数の光照射方向それぞれに沿って光を観察対象物に照射したときの複数の焦点面それぞれにおける光の複素振幅画像を生成する初期画像生成ステップと、
前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の焦点面のうちの任意の焦点面の複素振幅画像で表される光の波面を任意の他の焦点面まで伝搬させたときの光の波面を表す複素振幅画像に基づいて、前記他の焦点面の複素振幅画像を更新する画像更新ステップと、
を備え、
前記画像更新ステップにおいて、前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記初期画像生成ステップにおいて生成された複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す、
観察方法。
前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複数の焦点面のうちの任意の焦点面の複素振幅画像で表される光の波面を任意の他の焦点面まで伝搬させたときの光の波面を表す複素振幅画像に基づいて、前記他の焦点面の複素振幅画像を更新する画像更新ステップと、
を備え、
前記画像更新ステップにおいて、前記複数の光照射方向それぞれ及び前記複数の焦点面それぞれについて、前記初期画像生成ステップにおいて生成された複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す、
観察方法。
【請求項17】
前記複数の焦点面の相互間の離間距離は、前記観察対象物の観察に用いる対物レンズの開口数に基づく焦点深度より長い、
請求項１６に記載の観察方法。
請求項１６に記載の観察方法。
【請求項18】
前記複数の焦点面のうちの何れか１以上の焦点面は前記観察対象物中に位置する、
請求項１６に記載の観察方法。
請求項１６に記載の観察方法。
【請求項19】
前記画像更新ステップにおいて繰り返し更新された前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成ステップを更に備える、
請求項１６に記載の観察方法。
請求項１６に記載の観察方法。
【請求項20】
前記複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成ステップを更に備える、
請求項１９に記載の観察方法。
請求項１９に記載の観察方法。
【請求項21】
前記位相微分画像に基づいて前記観察対象物の屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成ステップを更に備える、
請求項２０に記載の観察方法。
請求項２０に記載の観察方法。
【請求項22】
請求項１６～２１の何れか１項に記載の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項23】
請求項２２に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、観察装置および観察方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
近年、スフェロイドやオルガノイドと呼ばれる３次元の細胞組織を作製する技術が進歩している。また、これらの３次元細胞組織を創薬や再生医療などに応用する研究が進んでいる。これらの３次元細胞組織は光学的に透明な多重散乱体である。このような光学的に透明な散乱体をイメージングする技術として、これまでに多種多様な手法が提案されている。そのうち蛍光プローブを用いるイメージング技術としては、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡が挙げられる。一方、蛍光プローブを用いない非染色・非侵襲のイメージング技術としては、光コヒーレンス・トモグラフィ（Optical Coherence Tomography、ＯＣＴ）などが知られている。
【0003】
スフェロイドやオルガノイドなどのような観察対象物については非染色・非侵襲のイメージングが望まれる場合が多いものの、これらの観察対象物のイメージングにＯＣＴが適用されたという報告例は多くない。その理由としては、ＯＣＴによるイメージングの分解能が低いこと、および、ＯＣＴによるイメージングにより得られた信号の解釈が難しいこと、が考えられる。したがって、現時点では、ゴールドスタンダードとなりうる非染色の３次元細胞組織のイメージング技術は確立されていないと言ってよい。
【0004】
観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、定量位相イメージング（Quantitative Phase Imaging、ＱＰＩ）も知られている。ＱＰＩは、観察対象物（例えば細胞）の光路長という物理的な情報を取得することができることから、生物分野で応用が進んでいる。ＱＰＩにより取得した画像を用いて、微分干渉画像や位相差顕微鏡画像などの他の種類の画像を生成することができる。ＱＰＩは、情報量が比較的多い画像を取得することができる技術であり、従来の明視野画像を用いた解析よりハイコンテントな解析にも適用することができると期待されている。また、近年の機械学習による画像認識精度の向上により非染色のイメージング技術を使ったハイコンテントな解析が盛んに研究されており、今後、多重散乱体の非染色イメージングは重要な役割を担うことが期待される。しかし、ＱＰＩは、取得される画像があくまで光路長の２次元への投影であるので、真の３次元の構造を把握できない。
【0005】
また、観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、特許文献１に記載されている光回折トモグラフィ（Optical Diffraction Tomography、ＯＤＴ）も知られている。ＯＤＴは、ＱＰＩを３次元イメージング可能な技術に発展させたものであり、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。ＯＤＴを用いて細胞観察を行うことにより、細胞核やミトコンドリアなどの細胞小器官の同定が可能になり、また、３次元的な形態変化の追跡が可能になって、ＱＰＩより更にハイコンテントな解析ができることが期待されている。また、特許文献２に記載されている技術も、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１７－２１９８２６号公報
【特許文献2】米国特許第１０２１５６９７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
特許文献１，２に記載された技術を含む従来の技術では、光源から出力された光を２分岐し、観察対象物を経た一方の分岐光を物体光とし、観察対象物を経ない他方の分岐光を参照光として、これら物体光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像部により撮像する。そして、この干渉強度画像に基づいて所要の演算をすることにより、複素振幅画像を生成することができ、更には観察対象物の３次元屈折率分布画像を生成することができる。従来の二光束干渉法では、観察対象物を経ない既知の波面（平面波）を有する参照光を用いて、干渉計により物体光と参照光とを干渉させて干渉強度画像を取得することにより、物体光の複素振幅（振幅および位相）を正確に求めることができる。
【0008】
しかし、従来の二光束干渉法では、互いに大きく異なる経路を経て撮像部に到達する物体光と参照光とを効率よく干渉させる為に、コヒーレンス長が長い単一周波数の光を出力するレーザ光源を用いる必要がある。物体光と参照光とを効率よく干渉させる為に、撮像部に到るまでの両光間の光路長差をできる限り短くする必要があるが、観察装置の光学系の調整は容易でなく、環境変動等の要因により光路長差が変化すると干渉信号も変化することから安定性に欠ける。
【0009】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の観察装置の第１態様は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って光を観察対象物に照射したときの複数の焦点面それぞれにおける光の複素振幅画像を生成する初期画像生成部と、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、複数の焦点面のうちの任意の焦点面の複素振幅画像で表される光の波面を任意の他の焦点面まで伝搬させたときの光の波面を表す複素振幅画像に基づいて、他の焦点面の複素振幅画像を更新する画像更新部と、を備える。画像更新部は、複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて、初期画像生成部により生成された複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す。
【0011】
本発明の観察装置は、次のような態様としてもよい。
第２態様では、第１態様に加えて、複数の焦点面の相互間の離間距離は、観察対象物の観察に用いる対物レンズの開口数に基づく焦点深度より長い。
第２態様では、第１態様に加えて、複数の焦点面の相互間の離間距離は、観察対象物の観察に用いる対物レンズの開口数に基づく焦点深度より長い。
【0012】
第３態様では、第１態様または第２態様に加えて、複数の焦点面のうちの何れか１以上の焦点面は観察対象物中に位置する。
【0013】
第４態様では、第１～第３の態様の何れかに加えて、観察装置は、画像更新部により繰り返し更新された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成部を更に備える。
【0014】
第５態様では、第４態様に加えて、観察装置は、複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成部を更に備える。
【0015】
第６態様では、第５態様に加えて、観察装置は、位相微分画像に基づいて観察対象物の屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成部を更に備える。
【0016】
第７態様では、第１～第６の態様の何れかに加えて、観察装置は、(1) 空間的にコヒーレントな光を出力する光源と、(2) 光から第１光および第２光を生成し、第１光および第２光の双方を観察対象物に照射する照射部と、(3) 観察対象物に照射されて観察対象物を経た第１光および第２光の双方を受光して、第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する撮像部と、(4) 焦点面の位置を設定する焦点面位置設定部と、を更に備える。照射部は、観察対象物に対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物に対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。撮像部は、第２光の複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像する。初期画像生成部は、(a) 第２光の複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて、複数の位相差それぞれに設定されたときに撮像部により撮像された干渉強度画像に基づいて位相シフト法により干渉項を求める干渉項算出部と、(b) 複数の焦点面それぞれについて、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項に基づいて第１光の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(c) 第２光の複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて、第１光の複素振幅画像に基づいて第２光の複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、を含む。画像更新部は、第２複素振幅画像生成部により第２光の複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて生成された第２光の複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す。
【0017】
第８態様では、第７態様に加えて、照射部は、互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する空間光変調器を含み、光源から出力された光を空間光変調器に入射させ、その入射光のうち第１方位の直線偏光の光を第１光とし、第２方位の直線偏光の光を空間光変調器により位相変調して光照射方向および位相差を設定して第２光とする。
【0018】
第９態様では、第７態様に加えて、照射部は、ミラーおよび強度変調型の空間光変調器を含み、光源から出力された光を２分岐して第１光および第２光とし、第１光をミラーにより反射させ、第２光を空間光変調器により強度変調して光照射方向および位相差を設定して、第１光および第２光を合波して出力する。
【0019】
第１０態様では、第７態様に加えて、照射部は、第１ミラーおよび第２ミラーを含み、光源から出力された光を２分岐して第１光および第２光とし、第１光を第１ミラーにより反射させ、第２光を第２ミラーにより反射させて、第１光および第２光を合波して出力し、第２ミラーの反射面の方位によって光照射方向を設定し、第１ミラーまたは第２ミラーの反射面の位置によって位相差を設定する。
【0020】
第１１態様では、第７態様に加えて、照射部は、第１ミラーおよび第２ミラーを含み、光源から出力された光を偏光分離して第１光および第２光とし、第１光を第１ミラーにより反射させ、第２光を第２ミラーにより反射させて、第１光および第２光を偏波合成して出力し、第２ミラーの反射面の方位によって光照射方向を設定する。撮像部は、複数の偏光成分の光それぞれについて同時に撮像が可能な偏光カメラを含み、複数の偏光成分の光それぞれについて撮像を行うことにより位相差が互いに異なる複数の干渉強度画像を撮像する。
【0021】
第１２態様では、第７～第１１の態様の何れかに加えて、焦点面位置設定部は、観察対象物の位置を調整することにより、または、観察対象物と撮像部との間にある結像光学系を調整することにより、焦点面の位置を設定する。
【0022】
第１３態様では、第７～第１２の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項のコヒーレント和に基づいて第１光の複素振幅画像の位相を求める。
【0023】
第１４態様では、第７～第１３の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第１光および第２光のうち第１光のみを観察対象物に照射したときに撮像部により撮像された強度画像に基づいて第１光の複素振幅画像の振幅を求める。
【0024】
第１５態様では、第７～第１３の態様の何れかに加えて、第１複素振幅画像生成部は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項の強度和に基づいて第１光の複素振幅画像の振幅を求める。
【0025】
本発明の観察方法の第１態様は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って光を観察対象物に照射したときの複数の焦点面それぞれにおける光の複素振幅画像を生成する初期画像生成ステップと、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、複数の焦点面のうちの任意の焦点面の複素振幅画像で表される光の波面を任意の他の焦点面まで伝搬させたときの光の波面を表す複素振幅画像に基づいて、他の焦点面の複素振幅画像を更新する画像更新ステップと、を備える。画像更新ステップにおいて、複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて、初期画像生成ステップにおいて生成された複素振幅画像を初期画像として更新処理を繰り返す。
【0026】
本発明の観察方法は、次のような態様としてもよい。
第２態様では、第１態様に加えて、複数の焦点面の相互間の離間距離は、観察対象物の観察に用いる対物レンズの開口数に基づく焦点深度より長い。
第２態様では、第１態様に加えて、複数の焦点面の相互間の離間距離は、観察対象物の観察に用いる対物レンズの開口数に基づく焦点深度より長い。
【0027】
第３態様では、第１態様または第２態様に加えて、複数の焦点面のうちの何れか１以上の焦点面は観察対象物中に位置する。
【0028】
第４態様では、第１～第３の態様の何れかに加えて、観察方法は、画像更新ステップにおいて繰り返し更新された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複素微分干渉画像を生成する複素微分干渉画像生成ステップを更に備える。
【0029】
第５態様では、第４態様に加えて、観察方法は、複素微分干渉画像に基づいて位相微分画像を生成する位相微分画像生成ステップを更に備える。
【0030】
第６態様では、第５態様に加えて、観察方法は、位相微分画像に基づいて観察対象物の屈折率分布画像を生成する屈折率分布画像生成ステップを更に備える。
【0031】
本発明のプログラムは、上記の本発明の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのものである。本発明の記録媒体は、上記の本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能なものである。
【発明の効果】
【0032】
本発明によれば、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【0035】
【0036】
図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。この観察装置１Ａは、光源１０、照射部３１、撮像部５０および処理部６０等を備える。光源１０は、空間的にコヒーレントな光を出力する。光源１０から出力される光は、時間的にコヒーレントであってもよいし、時間的にコヒーレントでなくてもよい。光源１０は、レーザ光源であってもよいし、例えばＳＬＤ（Super Luminescent Diode）、ＳＣ（Super Continuum）光源および光周波数コム光源などの光源であってよい。また、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）や水銀ランプなどから出力された空間インコヒーレントな光を、ピンホール等を通すことで空間的なコヒーレンスを高めてもよい。
【0037】
レンズ２１は、光源１０と光学的に接続されており、光源１０から出力された光を光ファイバ２３の光入射端２２に集光して、その光を光入射端２２に入射させる。光ファイバ２３は、光入射端２２に入射された光を光出射端２４まで導光する。光ファイバ２３により導光された光は光出射端２４から発散光として出射される。レンズ２５は、光出射端２４と光学的に接続されており、光出射端２４から発散光として出力された光を入力してコリメートし、そのコリメートした光を照射部３１へ出力する。
【0038】
照射部３１は、光源１０から出力されてレンズ２１，光ファイバ２３およびレンズ２５を経た光を入力し、その入力した光から第１光および第２光を生成する。照射部３１は、これら第１光および第２光を互いに重ね合わせて観察対象物Ｓに照射する。照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光を一定の光照射方向に沿って照射し、観察対象物Ｓに対して第２光を複数の光照射方向それぞれに沿って照射する。
【0039】
照射部３１は、ビームスプリッタ３１１、位相変調型の空間光変調器３１３、偏光子３１４、２分の１波長板３１５、偏光子３１６、レンズ３１８および対物レンズ３１９を含む。
【0040】
ビームスプリッタ３１１は、レンズ２５との間に設けられた偏光子３１４および２分の１波長板３１５を経て到達した光を空間光変調器３１３へ反射させる。また、ビームスプリッタ３１１は、空間光変調器３１３から到達した光を入力して、この光を偏光子３１６へ出力する。
【0041】
空間光変調器３１３は、変調面に入射される互いに直交する第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光のうち、第１方位の直線偏光の光に対して位相変調することなく、第２方位の直線偏光の光に対して選択的に位相変調する。偏光子３１４および２分の１波長板３１５は、ビームスプリッタ３１１から空間光変調器３１３の変調面へ入射される光が第１方位および第２方位それぞれの直線偏光成分を互いに同程度に含むように、光の偏光状態を設定する。
【0042】
偏光子３１６は、空間光変調器３１３からビームスプリッタ３１１を経て到達した光を入力し、その光に含まれる第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光を干渉可能とする。偏光子３１６は、空間光変調器３１３からビームスプリッタ３１１を経て到達した光（第１方位および第２方位それぞれの直線偏光の光）の偏光方位に対して４５度だけ異なる方位の光学軸を有し、入力した光のうち光学軸の方位の偏光成分を選択的に透過させる。レンズ３１８および対物レンズ３１９は、偏光子３１６から出力された第１光および第２光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0043】
このような構成を有する照射部３１は、空間光変調器３１３により位相変調されなかった第１方位の直線偏光の光を第１光として、この第１光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３１は、空間光変調器３１３により位相変調された第２方位の直線偏光の光を第２光として、この第２光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２光の光照射方向は、空間光変調器３１３の変調面における位相変調パターンの向き及び間隔により設定することができる。また、第１光と第２光との間の位相差は、空間光変調器３１３の変調面における位相変調パターンのシフトにより設定することができる。
【0044】
対物レンズ４１は、照射部３１により観察対象物Ｓに照射されて観察対象物Ｓを経た光（第１光、第２光）を入力し、その光をミラー４２へ出力する。レンズ４３は、対物レンズ４１から出力されてミラー４２により反射された光を入力し、その光を撮像部５０の撮像面に入射させる。
【0045】
焦点面位置設定部４６は、対物レンズ４１の光軸の方向に沿って観察対象物Ｓ（または、観察対象物Ｓを載置する試料台）の位置を調整することにより、焦点面（撮像部５０の撮像面に対して光学的に共役な面）の位置を設定する。焦点面位置設定部４６は、例えば可動ステージやピエゾアクチュエータを含む構成とすることができる。
【0046】
撮像部５０は、レンズ４３から撮像面に到達した第１光および第２光の双方を受光して、第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する。撮像部５０は、第２光の複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像する。
【0047】
処理部６０は、撮像部５０と電気的に接続されており、撮像部５０により撮像された干渉強度画像に基づいて所要の処理をして、複素振幅画像などを生成する。処理部６０の処理内容については後述する。
【0048】
処理部６０はコンピュータであってよい。処理部６０は、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰまたはＦＰＧＡ等の処理装置、および、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭまたはＲＯＭ等の記憶部を含む。記憶部は、各種の画像および処理実行の為のプログラム等を記憶する。このプログラムは、観察装置の製造時または出荷時に記憶部に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＢＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
【0049】
図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。この観察装置１Ｂは、光源１０、照射部３２、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｂ（図２）は、照射部３１に替えて照射部３２を備える点で相違する。
【0050】
照射部３２は、ビームスプリッタ３２１、ミラー３２２、強度変調型の空間光変調器３２３、レンズ３２８および対物レンズ３２９を含む。空間光変調器３２３は、ＤＭＤ（Digital Micromirror Device）であってもよい。
【0051】
ビームスプリッタ３２１は、レンズ２５から到達した光を２分岐して第１分岐光（第１光）および第２分岐光（第２光）とし、第１分岐光をミラー３２２へ出力し、第２分岐光を空間光変調器３２３へ出力する。また、ビームスプリッタ３２１は、ミラー３２２により反射された第１分岐光を入力するとともに、空間光変調器３２３により強度変調された第２分岐光を入力して、これら第１分岐光および第２分岐光を合波してレンズ３２８へ出力する。レンズ３２８および対物レンズ３２９は、ビームスプリッタ３２１から出力された第１分岐光および第２分岐光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0052】
このような構成を有する照射部３２は、ミラー３２２により反射された第１分岐光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３２は、空間光変調器３２３により強度変調された第２分岐光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２分岐光の光照射方向は、空間光変調器３２３の変調面における強度相変調パターンの向き及び間隔により設定することができる。また、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差は、空間光変調器３２３の変調面における強度変調パターンのシフトにより設定することができる。
【0053】
なお、ミラー３２２または空間光変調器３２３の位置により位相差を調整することもできる。しかし、空間光変調器３２３の変調面における強度変調パターンのシフトにより位相差を設定する場合の方が、構成要素の機械的な移動がない点で好ましい。
【0054】
図３は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。この観察装置１Ｃは、光源１０、照射部３３、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｃ（図３）は、照射部３１に替えて照射部３３を備える点で相違する。
【0055】
照射部３３は、ビームスプリッタ３３１、ミラー３３２、ミラー３３３、レンズ３３８および対物レンズ３３９を含む。ミラー３３２は、例えばピエゾアクチュエータによる駆動により、反射面に直交する方向に沿って反射面の位置が可変である。ミラー３３３は、例えばガルバノミラー、ボイスコイルミラーやピエゾチルトミラー等により、反射面の方位が可変である。
【0056】
ビームスプリッタ３３１は、レンズ２５から到達した光を２分岐して第１分岐光（第１光）および第２分岐光（第２光）とし、第１分岐光をミラー３３２へ出力し、第２分岐光をミラー３３３へ出力する。また、ビームスプリッタ３３１は、ミラー３３２により反射された第１分岐光を入力するとともに、ミラー３３３により反射された第２分岐光を入力して、これら第１分岐光および第２分岐光を合波してレンズ３３８へ出力する。レンズ３３８および対物レンズ３３９は、ビームスプリッタ３３１から出力された第１分岐光および第２分岐光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0057】
このような構成を有する照射部３３は、ミラー３３２により反射された第１分岐光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３３は、ミラー３３３により反射された第２分岐光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２分岐光の光照射方向は、ミラー３３３の反射面の方位により設定することができる。また、第１分岐光と第２分岐光との間の位相差は、ミラー３３２の反射面の位置により設定することができる。この位相差は、ミラー３３３の反射面の位置により設定してもよい。
【0058】
図４は、観察装置１Ｄの構成を示す図である。この観察装置１Ｄは、光源１０、照射部３４、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｄ（図４）は、照射部３１に替えて照射部３４を備える点で相違し、撮像部５０に替えて撮像部５１を備える点で相違し、対物レンズ４１と撮像部５１との間の光路上に設けられた４分の１波長板４４を更に備える点で相違する。
【0059】
照射部３４は、偏光ビームスプリッタ３４１、ミラー３４２、ミラー３４３、偏光子３４４、２分の１波長板３４５、４分の１波長板３４６、４分の１波長板３４７、レンズ３４８および対物レンズ３４９を含む。ミラー３４３は、例えばガルバノミラー、ボイスコイルミラーやピエゾチルトミラー等により、反射面の方位が可変である。
【0060】
偏光ビームスプリッタ３４１は、レンズ２５との間に設けられた偏光子３４４および２分の１波長板３４５を経て到達した光を偏光分離して第１分岐光（第１光）および第２分岐光（第２光）とし、第１分岐光をミラー３４２へ出力し、第２分岐光をミラー３４３へ出力する。４分の１波長板３４６は、第１分岐光を反射させるミラー３４２と偏光ビームスプリッタ３４１との間に設けられており、第１分岐光を２度通過させることで、第１分岐光の直線偏光の方位を９０°回転させる。４分の１波長板３４７は、第２分岐光を反射させるミラー３４３と偏光ビームスプリッタ３４１との間に設けられており、第２分岐光を２度通過させることで、第２分岐光の直線偏光の方位を９０°回転させる。
【0061】
偏光ビームスプリッタ３４１は、ミラー３４２により反射されて４分の１波長板３４６を通過した第１分岐光を入力するとともに、ミラー３４３により反射されて４分の１波長板３４７を通過した第２分岐光を入力して、これら入力した第１分岐光および第２分岐光を偏波合成してレンズ３４８へ出力する。レンズ３４８および対物レンズ３４９は、偏光ビームスプリッタ３４１から出力された第１分岐光および第２分岐光それぞれを平面波として観察対象物Ｓに照射する。
【0062】
このような構成を有する照射部３４は、ミラー３４２により反射された第１分岐光を観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って照射することができる。照射部３４は、ミラー３４３により反射された第２分岐光を観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って照射することができる。観察対象物Ｓへの第２分岐光の光照射方向は、ミラー３４３の反射面の方位により設定することができる。
【0063】
４分の１波長板４４は、対物レンズ４１と撮像部５１との間の光路上に設けられている。４分の１波長板４４は、互いに直交する直線偏光である第１分岐光および第２分岐光を入力して、これら第１分岐光および第２分岐光を互いに異なる回転方向の円偏光として出力する。
【0064】
撮像部５１は、複数の偏光成分の光それぞれについて個別に且つ同時に撮像が可能な偏光カメラを含む。撮像部５１は、４分の１波長板４４を経た第１分岐光および第２分岐光を受光することで、両光間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像することができる。
【0065】
偏光カメラとしてソニー株式会社により商品化されているイメージセンサ（Polarsens（登録商標））やTeledyneDALSA社により商品化されているイメージセンサ（Area Scan Polarization Sensor）を挙げることができる。これらは、４つの方位の直線偏光の２次元像を同時に撮像することができ、位相差がπ／２ずつ異なる４つの干渉強度画像を同時に得ることができる。また、偏光カメラとしてTeledyne DALSA社により商品化されているイメージセンサ（Line Scan Polarization Sensor）も挙げることができ、これは、３つの方位の直線偏光の２次元像を同時に撮像することができる。
【0066】
図５は、観察装置１Ｅの構成を示す図である。観察装置１Ａ（図１）は、観察対象物Ｓを透過した第１光および第２光の干渉による干渉強度画像を撮像する。これに対して、観察装置１Ｅ（図５）は、観察対象物Ｓで反射された第１光および第２光の干渉による干渉強度画像を撮像する。
【0067】
観察装置１Ｅ（図５）は、光源１０、照射部３５、撮像部５０および処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｅ（図５）は、照射部３１に替えて照射部３５を備える点で相違する。照射部３５は、照射部３１の構成において、レンズ３１８と対物レンズ３１９との間の光路上にビームスプリッタ４５が挿入されている。
【0068】
観察対象物Ｓへの光照射の際には、ビームスプリッタ３１１から出力された第１光および第２光は、偏光子３１６、レンズ３１８、ビームスプリッタ４５および対物レンズ３１９を順に経て観察対象物Ｓへ照射される。撮像部５０による撮像の際には、観察対象物Ｓで反射された第１光および第２光は、対物レンズ３１９、ビームスプリッタ４５およびレンズ４３を順に経て撮像部５０に到達する。観察装置１Ｅ（図５）の対物レンズ３１９は、観察装置１Ａ（図１）の対物レンズ４１を兼ねている。
【0069】
観察装置１Ｅ（図５）の反射型の構成は、観察装置１Ａ（図１）の透過型の構成に対応するものである。同様にして、観察装置１Ｂ（図２）、観察装置１Ｃ（図３）および観察装置１Ｄ（図４）それぞれの透過型の構成に対応して、反射型の構成も可能である。観察装置１Ｄ（図４）に対応する反射型の構成の場合には、４分の１波長板４４および撮像部５１を用いる。
【0070】
図６は、観察装置１Ｆの構成を示す図である。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｆ（図６）は、観察対象物Ｓの位置を調整する焦点面位置設定部４６に替えて、対物レンズ４１の位置を調整する焦点面位置設定部４７を備える点で相違する。
【0071】
焦点面位置設定部４７は、対物レンズ４１の光軸の方向に沿って対物レンズ４１の位置を調整することにより、焦点面（撮像部５０の撮像面に対して光学的に共役な面）の位置を設定する。焦点面位置設定部４７は、例えば可動ステージやピエゾアクチュエータを含む構成とすることができる。
【0072】
【0073】
図７は、観察装置１Ｇの構成を示す図である。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｇ（図７）は、観察対象物Ｓの位置を調整する焦点面位置設定部４６に替えて、対物レンズ４１と撮像部５０との間に設けられた焦点面位置設定部４８を備える点で相違する。
【0074】
焦点面位置設定部４８は、焦点距離が可変であるレンズの焦点距離を調整することにより、焦点面（撮像部５０の撮像面に対して光学的に共役な面）の位置を設定する。焦点面位置設定部４８は、例えば液体レンズを含む構成とすることができる。焦点面位置設定部４８は、図７に示される構成ではレンズ４３と撮像部５０との間の光路上に設けられているが、ミラー４２とレンズ４３との間の光路上に設けられてもよいし、対物レンズ４１とミラー４２との間の光路上に設けられてもよい。
【0075】
【0076】
図６、図７に示される焦点面位置設定部４７，４８は、観察対象物Ｓと撮像部５０との間にある結像光学系を調整することにより、焦点面の位置を設定するものである。結像光学系を調整する焦点面位置設定部は、他の構成も可能である。また、複数の焦点面位置設定部を組合せてもよい。
【0077】
図２２は、観察装置１Ｈの構成を示す図である。この観察装置１Ｈは、光源１０、照射部３０、撮像部５０ａ，５０ｂおよび処理部６０等を備える。観察装置１Ａ（図１）と比べると、観察装置１Ｈ（図２２）は、ビームスプリッタ４９を備える点で相違し、レンズ４３および撮像部５０に替えてレンズ４３ａ，４３ｂおよび撮像部５０ａ，５０ｂを備える点で相違する。
【0078】
対物レンズ４１は、照射部３１により観察対象物Ｓに照射されて観察対象物Ｓを経た光（第１光、第２光）を入力し、その光をミラー４２へ出力する。ビームスプリッタ４９は、対物レンズ４１から出力されてミラー４２により反射された光を入力して、その光の一部を透過すると共に、他の一部を反射する。ビームスプリッタ４９は、例えば、ハーフミラーである。レンズ４３ａは、ビームスプリッタ４９を透過した光を入力し、その光を撮像部５０ａの撮像面に入射させる。一方、レンズ４３ｂは、ビームスプリッタ４９を反射した光を入力し、その光を撮像部５０ｂの撮像面に入射させる。
【0079】
撮像部５０ａ，５０ｂそれぞれの焦点面（撮像面に対して光学的に共役な面）の位置が互いに異なるように、ビームスプリッタ４９からレンズ４３ａを経て撮像部５０ａに到る光学系、および、ビームスプリッタ４９からレンズ４３ｂを経て撮像部５０ｂに到る光学系は、それぞれ調整されている。例えば、レンズ４３ａ，４３ｂそれぞれの焦点距離はいずれもｆであるとし、レンズ４３ａと撮像部５０ａとの間の光学距離はｆに設定し、レンズ４３ｂと撮像部５０ｂとの間の光学距離はｆ＋δに設定する。これにより、撮像部５０ａ，５０ｂそれぞれの焦点面は互いにδだけ離間させることができる。撮像部５０ａ，５０ｂそれぞれの位置を調整することで、焦点面の位置を調整することができる。
【0080】
撮像部５０ａは、レンズ４３ａから撮像面に到達した第１光および第２光の双方を受光して、第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する。また、撮像部５０ｂは、レンズ４３ｂから撮像面に到達した第１光および第２光の双方を受光して、第１光と第２光との干渉による干渉強度画像を撮像する。従って、撮像部５０ａ及び５０ｂにより、第２光の複数の光照射方向それぞれ及び複数の焦点面それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差が複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像を撮像することができる。
【0081】
処理部６０は、撮像部５０ａ，５０ｂと電気的に接続されており、撮像部５０ａ，５０ｂそれぞれにより撮像された干渉強度画像に基づいて所要の処理をして、複素振幅画像などを生成する。
【0082】
この観察装置１Ｈ（図２２）の構成では、焦点面位置設定部は、観察対象物Ｓと撮像部５０ａ，５０ｂとの間にある結像光学系を調整することにより、具体的には、撮像部５０ａ，５０ｂの位置またはレンズ４３ａ，４３ｂの焦点距離を調整することにより、焦点面の位置を設定することができる。ビームスプリッタ４９と撮像部５０ａとの間の光路上、および、ビームスプリッタ４９と撮像部５０ｂとの間の光路上の、双方または何れか一方に、観察装置１Ｇ（図７）に設けられたような焦点面位置設定部４８（例えば焦点距離が可変である液体レンズを含む構成）が設けられていてもよい。観察対象物Ｓの位置を調整する焦点面位置設定部４６、および、対物レンズ４１の位置を調整する焦点面位置設定部４７は、設けられていなくてもよい。
【0083】
同様にして、観察装置１Ｂ（図２）、観察装置１Ｃ（図３）、観察装置１Ｄ（図４）および観察装置１Ｅ（図５）それぞれにおいて、対物レンズの後段で光をビームスプリッタにより２分岐して二つの撮像部で撮像する構成としてもよい。
【0084】
図８は、照射部３１～３５から観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。ここでは、観察対象物Ｓへ光を照射する対物レンズの光軸に平行な方向にｚ軸を有するｘｙｚ直交座標系を設定した上で、各々の光照射方向をｋｘｋｙｋｚ波数空間における位置で表す。この図は、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。光照射方向の走査は、ｋｘｋｙ平面において、（ａ）矩形格子状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｂ）ハニカム状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｃ）六方格子状に離散的かつ周期的に配置されるようなものであってもよいし、（ｄ）同心の複数の円それぞれの周上に離散的に配置されるようなものであってもよいし、（ｅ）螺旋状に離散的に配置されるようなものであってもよい。何れの場合にも、観察対象物Ｓへ光を照射する対物レンズの許す限りで光照射方向の走査が可能である。ラスタスキャンおよびランダムスキャンの何れであってもよい。ラスタスキャンの場合には、戻りスキャンが有ってもよいし無くてもよい。
【0085】
図９および図１０は、二つの焦点面それぞれにおいて干渉強度画像を撮像する際に照射部３１～３５から観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。これらの図では、光照射方向の走査をｋｘｋｙ平面において矩形格子状に離散的かつ周期的に配置させるようにした場合を示す。これらの図において、一方の焦点面において干渉強度画像を撮像する際の光照射方向（group Ａ）を黒丸印で示し、他方の焦点面において干渉強度画像を撮像する際の光照射方向（group Ｂ）を×印で示す。一方の焦点面において干渉強度画像を撮像する際の光照射方向（黒丸印）と、他方の焦点面において干渉強度画像を撮像する際の光照射方向（×印）とは、ｋｘｋｙ平面において、図９に示されるように互いに一致するように配置されていてもよいし、図１０に示されるように交互に配置されていてもよい。
【0086】
次に、観察装置１Ａ（図１）を用いた観察方法について説明する。他の構成の観察装置を用いた場合でも同様である。以下では、二つの焦点面Ａ，Ｂそれぞれにおいて干渉強度画像を撮像する場合について説明する。
【0087】
図１１（ａ），（ｂ）は、観察対象物Ｓへの第１光および第２光の入射、ならびに、観察対象物Ｓを経た後の撮像部５０への第１光および第２光の入射、を模式的に示す図である。図１１（ａ）に示されるように、ｚ＝ｚＡの位置にある焦点面Ａにおいて干渉強度画像を撮像する際に、観察対象物Ｓへ入射する第１光の波面をｕA,0,in（ｒ）と表し、第２光の複数（Ｎ個）の光照射方向のうち第ｎ光照射方向（ｎ＝１～Ｎ）に沿って観察対象物Ｓへ入射する第２光の波面をｕA,n,in（ｒ）exp（ｉφ）と表し、焦点面Ａにおける第１光の波面をｕA,0（ｒ）と表し、焦点面Ａにおける第２光の波面をｕA,n（ｒ）exp（ｉφ）と表す。図１１（ｂ）に示されるように、ｚ＝ｚＢの位置にある焦点面Ｂにおいて干渉強度画像を撮像する際に、観察対象物Ｓへ入射する第１光の波面をｕB,0,in（ｒ）と表し、第２光の複数（Ｎ個）の光照射方向のうち第ｎ光照射方向（ｎ＝１～Ｎ）に沿って観察対象物Ｓへ入射する第２光の波面をｕB,n,in（ｒ）exp（ｉφ）と表し、焦点面Ｂにおける第１光の波面をｕB,0（ｒ）と表し、焦点面Ｂにおける第２光の波面をｕB,n（ｒ）exp（ｉφ）と表す。ｚは対物レンズ４１の光軸の方向に沿った位置を表す変数である。ｒは対物レンズ４１の光軸に垂直な面における位置を表す変数である。φは第１光と第２光との間の位相差である。ｉは虚数単位である。
【0088】
焦点面Ａ，Ｂそれぞれは、観察対象物Ｓの中にあってもよいし、観察対象物Ｓより撮像部５０側の外にあってもよいし、観察対象物Ｓより照射部３１側の外にあってもよい。焦点面Ａ，Ｂのうち一方が観察対象物Ｓの中にあって他方が観察対象物Ｓの外にあってもよい。焦点面Ａ，Ｂの双方が観察対象物Ｓの外にあってもよい。焦点面Ａ，Ｂの双方が観察対象物Ｓの中にあってもよい。焦点面Ａ，Ｂの双方が、観察対象物Ｓの中にあって、対物レンズの光軸の方向に沿った観察対象物Ｓの中心位置の付近にあるのが好適である。
【0089】
焦点面Ａと焦点面Ｂとの相互間の離間距離｜ｚＡ－ｚＢ｜は、各々の焦点面で得られる干渉強度画像が互いに異なるように、対物レンズ４１の開口数に基づく焦点深度より長いのが好適である。また、焦点面Ａと焦点面Ｂとの相互間の離間距離｜ｚＡ－ｚＢ｜は、処理部６０の画像更新部６６（後述）における繰り返し更新処理が短時間で終わるようにするために、できるだけ短いのが好適である。
【0090】
焦点面Ａにおいて干渉強度画像を撮像する際と、焦点面Ｂにおいて干渉強度画像を撮像する際との間で、第２光の光照射方向の数Ｎは、互いに同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。
【0091】
撮像部５０による撮像により取得される干渉強度画像Ｉｎ（ｒ，φ）は下記（１）式で表される。干渉強度画像Ｉｎ（ｒ，φ）は、第１光と第２光との間の位相差をφとして、観察対象物に対して第１光を一定の光照射方向に沿って観察対象物Ｓへ入射させ、観察対象物に対して第２光を第ｎ光照射方向に沿って入射させたときに、撮像部５０による撮像により取得される干渉強度画像である。なお、ここでは、焦点面の位置を表す添え字Ａ，Ｂを省略した。以降においても、同様に記述することができる場合には、添え字Ａ，Ｂを省略する。
【0092】
【数1】
【0093】
図１２は、観察装置の処理部６０の構成を示す図である。処理部６０は、初期画像生成部６１、画像更新部６６、複素微分干渉画像生成部６７、位相微分画像生成部６８および屈折率分布画像生成部６９を含む。初期画像生成部６１は、干渉項算出部６３、第１複素振幅画像生成部６４および第２複素振幅画像生成部６５を含む。
【0094】
図１３は、観察方法のフローチャートである。観察方法のステップＳ１～Ｓ９のうちステップＳ１～Ｓ５の説明では、焦点面Ａにおいて干渉強度画像を撮像する場合と、焦点面Ｂにおいて干渉強度画像を撮像する場合との間で、同様の処理を行い同様の式を記述することができるので、添え字Ａ，Ｂを省略する。
【0095】
照射ステップＳ１において、照射部３１は、観察対象物Ｓに対して第１光および第２光を重ねて照射する。このとき、観察対象物Ｓに対する第１光の光照射方向を一定とし、観察対象物Ｓに対する第２光の光照射方向を複数の光照射方向それぞれとし、第１光と第２光との間の位相差φを各値に設定する。
【0096】
撮像ステップＳ２において、撮像部５０は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、第１光と第２光との間の位相差φが複数の位相差それぞれに設定されたときの干渉強度画像（（１）式）を撮像する。
【0097】
初期画像生成ステップは、干渉項算出ステップＳ３、第１複素振幅画像生成ステップＳ４および第２複素振幅画像生成ステップＳ５を含み、これらの後の画像更新ステップＳ６において繰り返し更新処理を行う際の初期画像を生成する。
【0098】
干渉項算出ステップＳ３において、干渉項算出部６３は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて、複数の位相差φそれぞれに設定されたときに撮像部５０により取得された干渉強度画像（（１）式）に基づいて、位相シフト法により干渉項を求める。例えば、３点位相シフト法を用いる場合、干渉項算出部６３は、下記（２）式により干渉項Ｃｎ（ｒ）＝ｕ０
＊（ｒ）・ｕｎ（ｒ）を求める。干渉項ｕ０（ｒ）・ｕｎ
＊（ｒ）を求めてもよい。４点以上の位相シフト法を用いてもよい。この干渉項Ｃｎ（ｒ）を第２光の複数の光照射方向それぞれについて（すなわち、各ｎ（＝１～Ｎ））について求める。
【0099】
【数2】
【0100】
第１複素振幅画像生成ステップＳ４において、第１複素振幅画像生成部６４は、第２光の複数の光照射方向それぞれについて求めた干渉項Ｃｎ（ｒ）に基づいて、第１光の複素振幅画像を生成する。第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相は、次のようにして推定することができる。第１光と第２光との間の位相傾き（光入射方向の差異）を補正した後、その補正後の干渉項のコヒーレント和Ｃsum（ｒ）を下記（３）式により求める。ここでは、第１光の光入射方向をｚ軸に平行とし、第２光の第ｎ光入射方向を表す波数ベクトルをｋｎとする。
【0101】
【数3】
【0102】
この（３）式の最右辺の第１因子（ｕ０
＊（ｒ））の位相は、観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って入射した第１光の成分であり、オプティカルセクショニング効果がないので、散乱の影響を大きく受ける。一方、（３）式の最右辺の第２因子（ｕｎ（ｒ）exp（ｉｋｎｒ）の総和）の位相は、複数の光入射方向についての総和であり、コヒーレント和によるオプティカルセクショニング効果によって、焦点面付近の情報が選択的に抽出されたものであるので、比較的平坦な分布を有する。このことから、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相φ０（ｒ）は、下記（４）式で表されるとおり、位相傾き補正後の干渉項のコヒーレント和Ｃsum（ｒ）の位相で近似的に表すことができる。
【0103】
【数4】
【0104】
第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅は、第２光を観察対象物Ｓに照射せずに、第１光のみを観察対象物Ｓに照射したときに、撮像部５０により撮像された強度画像｜ｕ０（ｒ）｜２から求めることができる。例えば、観察装置１Ａ（図１）では照射部３１において偏光子３１４および２分の１波長板３１５それぞれの光学軸の方位を調整することにより、観察装置１Ｂ（図２）では照射部３２において空間光変調器３２３の変調パターン設定により、観察装置１Ｃ（図３）では照射部３３においてミラー３３３を取り外すことにより、観察装置１Ｄ（図４）では照射部３４においてミラー３４３を取り外すことにより、第１光のみを観察対象物Ｓに照射することができる。
【0105】
また、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅は、干渉項Ｃｎ（ｒ）に基づいて次のようにして推定することもできる。干渉項Ｃｎ（ｒ）の強度和Ｉsum（ｒ）を下記（５）式により求める。
【0106】
【数5】
【0107】
この（５）式の最右辺の第１因子（｜ｕ０（ｒ）｜２）は、観察対象物Ｓに対して一定の光照射方向に沿って入射した第１光の成分であり、オプティカルセクショニング効果がないので、散乱の影響を大きく受ける。一方、（５）式の最右辺の第２因子（｜ｕｎ（ｒ）｜２の総和）は、複数の光入射方向についての総和であり、コヒーレント和によるオプティカルセクショニング効果によって、散乱光が平均化されて比較的均一な分布となる。このことから、第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の振幅Ａ０（ｒ）は、下記（６）式で示されるとおり、干渉項Ｃｎ（ｒ）の強度和Ｉsum（ｒ）の平方根で近似的に表すことができる。
【0108】
【数6】
【0109】
第１複素振幅画像生成ステップＳ４において、第１複素振幅画像生成部６４は、以上のようにして求めた第１光の複素振幅ｕ０（ｒ）の位相φ０（ｒ）および振幅Ａ０（ｒ）に基づいて、下記（７）式により、第１光の複素振幅画像ｕ０（ｒ）を生成することができる。
【0110】
【数7】
【0111】
オプティカルセクショニング効果とは、例えば共焦点顕微鏡や微分干渉顕微鏡において、対物レンズの焦点面の画像を選択的に取得することができる効果である。これらの顕微鏡では、入射側および検出側の双方の開口数を大きくとることで、選択的照射および選択的検出を実現して、オプティカルセクショニング効果を実現することができる。
【0112】
第２複素振幅画像生成ステップＳ５において、第２複素振幅画像生成部６５は、第１光の複素振幅画像ｕ０（ｒ）および干渉項Ｃｎ（ｒ）に基づいて、下記（８）式により、複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像ｕｎ（ｒ）を生成することができる。ただし、この（８）式では右辺の分母の値が０であるときにｕｎ（ｒ）の値が不定となるので、この（８）式に替えて下記（９）式により、複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像ｕｎ（ｒ）を生成するのが好ましい。εは正の微小値である。ε＝０とした場合、（９）式は（８）式と一致する。
【0113】
【数8】
【0114】
【数9】
【0115】
ここまでのステップＳ１～Ｓ５の説明では、焦点面Ａにおいて干渉強度画像を撮像する場合と、焦点面Ｂにおいて干渉強度画像を撮像する場合との間で、同様の処理を行い同様の式を記述することができるので、添え字Ａ，Ｂを省略した。続く画像更新ステップＳ６の説明では、第ｎ光照射方向に沿って観察対象物Ｓへ入射した第２光の焦点面Ａでの波面を表す複素振幅画像をｕA,n（ｒ）と表し、第ｎ光照射方向に沿って観察対象物Ｓへ入射した第２光の焦点面Ｂでの波面を表す複素振幅画像をｕB,n（ｒ）と表す。
【0116】
画像更新ステップＳ６において、画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれについて、二つの焦点面Ａ，Ｂのうちの任意の焦点面の複素振幅画像で表される光の波面を他の焦点面まで伝搬させたときの光の波面を表す複素振幅画像に基づいて、前記他の焦点面の複素振幅画像を更新する。画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれ及び二つの焦点面Ａ，Ｂそれぞれについて、初期画像生成部６１の第２複素振幅画像生成部６５により生成された複素振幅画像ｕA,n（ｒ），ｕB,n（ｒ）を初期画像として更新処理を繰り返すことにより、複素振幅画像に含まれるノイズを低減する。画像更新部６６による処理の内容については後述する。
【0117】
複素微分干渉画像生成ステップＳ７において、複素微分干渉画像生成部６７は、画像更新部６６による処理後の複数の光照射方向それぞれの第２光の複素振幅画像ｕｎ（ｒ）（ｕA,n（ｒ）またはｕB,n（ｒ））に基づいて、下記（１０）式により複素微分干渉画像Ｗ（ｒ）を生成することができる。δｒはシアーを表す。δｒのｘ成分δｘおよびｙ成分δｙのうち少なくとも一方は非０である。δｘ≠０，δｙ＝０であれば、ｘ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。δｘ＝０，δｙ≠０であれば、ｙ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。δｘ≠０，δｙ≠０であれば、δｘとδｙとの比に応じた方向をシアー方向とする複素微分干渉画像が得られる。
【0118】
【数10】
【0119】
位相微分画像生成ステップＳ８において、位相微分画像生成部６８は、複素微分干渉画像Ｗ（ｒ）の位相で表される位相微分画像を生成することができる。さらに、屈折率分布画像生成ステップＳ９において、屈折率分布画像生成部６９は、波面の自由伝搬の式を用いてｚ軸方向の各位置における位相微分画像（すなわち３次元位相微分画像）を求め、これに基づいてデコンボリューションにより観察対象物Ｓの屈折率分布画像を生成することができる。
【0120】
次に、画像更新ステップＳ６における画像更新部６６の処理の内容について説明する。図１４は、画像更新ステップＳ６における画像更新部６６の処理フローを説明する図である。画像更新部６６は、繰り返し行う更新処理の各回において、伝搬ステップＳ１１、更新ステップＳ１２、伝搬ステップＳ１３および更新ステップＳ１４の各処理を行う。初期画像生成部６１の第２複素振幅画像生成部６５により生成された複素振幅画像ｕA,n（ｒ），ｕB,n（ｒ）をｕA,n,0（ｒ），ｕB,n,0（ｒ）と表す。ｕA,n,0（ｒ），ｕB,n,0（ｒ）を初期画像として更新処理をｊ回繰り返した後の複素振幅画像をｕA,n,j（ｒ），ｕB,n,j（ｒ）と表す。
【0121】
初期画像生成部６１の第２複素振幅画像生成部６５により生成された複素振幅画像ｕA,n,0（ｒ），ｕB,n,0（ｒ）の振幅については厳密解であると見做すことができる場合は、画像更新部６６は、位相のみについて更新処理を行えばよいので、更新処理の各回において次のような処理を行う。
【0122】
第ｊ回の更新処理における伝搬ステップＳ１１において、画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれについて、焦点面Ａにおいて複素振幅画像ｕA,n,j-1（ｒ）で表される光の波面を焦点面Ｂまで計算により自由伝搬させ、そのときの焦点面Ｂにおける光の波面を表す複素振幅画像ｕ’A,n,j-1（ｒ）を求める。
【0123】
例えば、ｚ＝０の位置からｚ＝ｄの位置への光波面の自由伝搬を想定する場合、ｚ＝０の位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，０）とし、このｕ（ｘ，ｙ，０）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋｘ，ｋｙ，０）とし、ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，ｄ）とし、このｕ（ｘ，ｙ，ｄ）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋｘ，ｋｙ，ｄ）とすると、自由伝搬は下記（１１）式，（１２）式を含む処理により計算で求めることができる。ｋ０は観察対象物中における光の波数である。
【0124】
【数11】
【0125】
【数12】
【0126】
第ｊ回の更新処理における更新ステップＳ１２において、画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれについて、下記（１３）式により、焦点面Ｂにおける複素振幅画像ｕB,n,j-1（ｒ）を更新して、更新後のｕB,n,j（ｒ）を求める。（１３）式中のφ’Ａ（ｒ）はｕ’A,n,j-1（ｒ）のコヒーレント和であり（下記（１４）式）、φＢ（ｒ）はｕB,n,j-1（ｒ）のコヒーレント和である（下記（１５）式）。
【0127】
【数13】
【0128】
【数14】
【0129】
【数15】
【0130】
焦点面Ａにおける複素振幅画像ｕA,n,j-1（ｒ）に含まれるノイズは大きいが、オプティカルセクショニング効果によって、ｕA,n,j-1（ｒ）を焦点面Ｂまで自由伝搬させたときのｕ’A,n,j-1（ｒ）のコヒーレント和の画像は、焦点面Ｂにおける複素振幅画像ｕB,n,j-1（ｒ）のコヒーレント和の画像より厳密解に近い。更新ステップＳ１２においては、このことを利用して、焦点面Ｂにおける複素振幅画像ｕB,n,j-1（ｒ）を更新して、より厳密解に近いｕB,n,j（ｒ）を求める。
【0131】
第ｊ回の更新処理における伝搬ステップＳ１３において、画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれについて、焦点面Ｂにおいて複素振幅画像ｕB,n,j（ｒ）で表される光の波面（更新ステップＳ１２で求められた波面）を焦点面Ａまで計算により自由伝搬させ、そのときの焦点面Ａにおける光の波面を表す複素振幅画像ｕ’B,n,j（ｒ）を求める。
【0132】
第ｊ回の更新処理における更新ステップＳ１４において、画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれについて、下記（１６）式により、焦点面Ａにおける複素振幅画像ｕA,n,j-1（ｒ）を更新して、更新後のｕA,n,j（ｒ）を求める。（１６）式中のφＡ（ｒ）はｕA,n,j-1（ｒ）のコヒーレント和であり（下記（１７）式）、φ’Ｂ（ｒ）はｕ’B,n,j（ｒ）のコヒーレント和である（下記（１８）式）。
【0133】
【数16】
【0134】
【数17】
【0135】
【数18】
【0136】
焦点面Ｂにおける複素振幅画像ｕB,n,j（ｒ）に含まれるノイズは大きいが、オプティカルセクショニング効果によって、ｕB,n,j（ｒ）を焦点面Ａまで自由伝搬させたときのｕ’B,n,j（ｒ）のコヒーレント和の画像は、焦点面Ａにおける複素振幅画像ｕA,n,j-1（ｒ）のコヒーレント和の画像より厳密解に近い。更新ステップＳ１４においては、このことを利用して、焦点面Ａにおける複素振幅画像ｕA,n,j-1（ｒ）を更新して、より厳密解に近いｕA,n,j（ｒ）を求める。
【0137】
画像更新部６６による更新処理の繰り返しは、予め設定した最大回数だけ行うようにしてもよい。また、画像更新部６６による更新処理の繰り返しは、上記（１４）式の値と上記（１５）式の値との差の絶対値が所定値以下となり、上記（１７）式の値と上記（１８）式の値との差の絶対値が所定値以下となるまで、行うようにしてもよい。
【0138】
画像更新部６６は、初期画像生成部６１の第２複素振幅画像生成部６５により生成された複素振幅画像ｕA,n,0（ｒ），ｕB,n,0（ｒ）の振幅および位相の双方について更新処理を行う場合、更新処理の各回において次のような処理を行う。
【0139】
第ｊ回の更新処理における伝搬ステップＳ１１において、画像更新部６６は、上記と同様に、複数の光照射方向それぞれについて、焦点面Ａにおいて複素振幅画像ｕA,n,j-1（ｒ）で表される光の波面を焦点面Ｂまで計算により自由伝搬させ、そのときの焦点面Ｂにおける光の波面を表す複素振幅画像ｕ’A,n,j-1（ｒ）を求める。
【0140】
第ｊ回の更新処理における更新ステップＳ１２において、画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれについて、上記（１３）式に替えて下記（１９）式により、焦点面Ｂにおける複素振幅画像ｕB,n,j-1（ｒ）を更新して、更新後のｕB,n,j（ｒ）を求める。（１９）式中のＩ’Ａ（ｒ）はｕ’A,n,j-1（ｒ）の強度和の平方根であり（下記（２０）式）、ＩＢ（ｒ）はｕB,n,j-1（ｒ）の強度和の平方根である（下記（２１）式）。
【0141】
【数19】
【0142】
【数20】
【0143】
【数21】
【0144】
第ｊ回の更新処理における伝搬ステップＳ１３において、画像更新部６６は、上記と同様に、複数の光照射方向それぞれについて、焦点面Ｂにおいて複素振幅画像ｕB,n,j（ｒ）で表される光の波面（更新ステップＳ１２で求められた波面）を焦点面Ａまで計算により自由伝搬させ、そのときの焦点面Ａにおける光の波面を表す複素振幅画像ｕ’B,n,j（ｒ）を求める。
【0145】
第ｊ回の更新処理における更新ステップＳ１４において、画像更新部６６は、複数の光照射方向それぞれについて、下記（１６）式に替えて下記（２２）式により、焦点面Ａにおける複素振幅画像ｕA,n,j-1（ｒ）を更新して、更新後のｕA,n,j（ｒ）を求める。（２２）式中のＩＡ（ｒ）はｕA,n,j-1（ｒ）の強度和の平方根であり（下記（２３）式）、Ｉ’Ｂ（ｒ）はｕ’B,n,j（ｒ）の強度和の平方根である（下記（２４）式）。
【0146】
【数22】
【0147】
【数23】
【0148】
【数24】
【0149】
なお、上記（１９）式では右辺の分母にあるＩＢ（ｒ）の値が０であるときにｕB,n,j（ｒ）の値が不定となるので、この（１９）式に替えて下記（２５）式を用いるのが好ましい。同様に、上記（２２）式に替えて下記（２６）式を用いるのが好ましい。εは正の微小値である。ε＝０とした場合、（２５）式は（１９）式と一致し、（２６）式は（２２）式と一致する。
【0150】
【数25】
【0151】
【数26】
【0152】
複素微分干渉画像生成ステップＳ７において、複素微分干渉画像生成部６７は、画像更新部６６による処理により得られた複素振幅画像ｕA,n,J（ｒ），ｕB,n,J（ｒ）の双方または何れか一方に基づいて、複素微分干渉画像を生成する。Ｊは、画像更新部６６による更新処理の繰り返しの回数である。複素微分干渉画像生成部６７は、複素振幅画像ｕA,n,J（ｒ），ｕB,n,J（ｒ）の何れか一方のみを用いて、複素微分干渉画像を生成してもよい。
【0153】
また、複素微分干渉画像生成部６７は、複素振幅画像ｕA,n,J（ｒ）で表される光の波面を焦点面Ｂまで計算により自由伝搬させて当該伝搬後の複素振幅画像ｕ’A,n,J（ｒ）を生成して、この複素振幅画像ｕ’A,n,J（ｒ）と複素振幅画像ｕB,n,J（ｒ）とを光照射方向毎に足し合わせて得られる複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、複数の焦点面それぞれの干渉強度画像を取得する際に、図９に示されるように、第２光の複数の光入射方向を一致させる。
【0154】
また、複素微分干渉画像生成部６７は、複素振幅画像ｕA,n,J（ｒ）で表される光の波面を所定面（例えば、焦点面Ａと焦点面Ｂとの間の中間面Ｐ）まで計算により自由伝搬させて当該伝搬後の複素振幅画像ｕ”A,n,J（ｒ）を生成するとともに、複素振幅画像ｕB,n,J（ｒ）で表される光の波面を前記所定面まで計算により自由伝搬させて当該伝搬後の複素振幅画像ｕ”B,n,J（ｒ）を生成して、これら複素振幅画像ｕ”A,n,J（ｒ）と複素振幅画像ｕ”B,n,J（ｒ）とを光照射方向毎に足し合わせて得られる複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合も、複数の焦点面それぞれの干渉強度画像を取得する際に、図９に示されるように、第２光の複数の光入射方向を一致させる。
【0155】
複素振幅画像ｕA,n,J（ｒ），ｕB,n,J（ｒ）は、焦点面の位置が相違するものの、観察対象物からの信号については互いに同じ情報を有し、重畳しているノイズについては一般に異なっている。したがって、複素振幅画像ｕA,n,J（ｒ），ｕB,n,J（ｒ）の双方または何れか一方の光波面を計算により共通面（例えば、焦点面Ａ、焦点面Ｂ、中間面Ｐ）まで自由伝搬させた後に、共通面における二つの複素振幅画像を光照射方向毎に足し合わせることにより、ノイズを低減することができる。
【0156】
これまでの説明では、干渉強度画像を取得する焦点面の数を２とした。しかし、干渉強度画像を取得する焦点面の数は３以上であってもよい。例えば、三つの焦点面Ａ，Ｂ，Ｃそれぞれにおいて干渉強度画像を取得して、これら三つの焦点面それぞれにおける複素振幅画像を更新する場合、画像更新部６６は、繰り返し行う更新処理の各回において、次のような処理をすればよい。焦点面Ａにおける複素振幅画像で表される光の波面を焦点面Ｂまで計算により自由伝搬させ、その伝搬後の複素振幅画像を用いて焦点面Ｂにおける複素振幅画像を更新する。次に、焦点面Ｂにおける複素振幅画像で表される光の波面を焦点面Ｃまで計算により自由伝搬させ、その伝搬後の複素振幅画像を用いて焦点面Ｃにおける複素振幅画像を更新する。次に、焦点面Ｃにおける複素振幅画像で表される光の波面を焦点面Ａまで計算により自由伝搬させ、その伝搬後の複素振幅画像を用いて焦点面Ａにおける複素振幅画像を更新する。画像更新部６６における更新処理は他の態様も可能である。
【0157】
干渉強度画像を取得する焦点面の数を多くすると、次のような効果が期待される。すなわち、観察対象物の光吸収が非常に大きい場合、上記（２）式で表される干渉項Ｃｎ（ｒ）において絶対値が０になる領域が生じると、上記（８）式または（９）式で表される複素振幅画像は、その光吸収が非常に大きい領域の情報が欠けたものとなる。二つの焦点面Ａ，Ｂで干渉強度画像を取得する場合、これら二つの焦点面Ａ，Ｂそれぞれの複素振幅画像において共通の領域の情報が欠けることがあっても、三つの焦点面Ａ，Ｂ，Ｃで干渉強度画像を取得する場合、これら三つの焦点面Ａ，Ｂ，Ｃそれぞれの複素振幅画像の全てにおいて共通の領域の情報が欠けるという事態の発生頻度を低減することができる。したがって、何れかの焦点面Ａの複素振幅画像の或る領域の情報が欠けていたとしても、他の何れかの焦点面ＢまたはＣの複素振幅画像の同じ領域の情報を用いることで、焦点面Ａの複素振幅画像の欠けた情報を補完することができる。
【0158】
このような補完をする場合、複数の焦点面それぞれの干渉強度画像を取得する際に、図９に示されるように、第２光の複数の光入射方向を一致させるのが好ましい。干渉強度画像を取得する焦点面の数が多くなると、干渉強度画像の取得に要する時間が長くなり、処理部６０による処理の時間も長くなるので、干渉強度画像を取得する焦点面の数は、多くても１００であり、１０以下であるのが好ましい。
【0159】
次に、シミュレーション結果について説明する。以下に説明するシミュレーションでは、細胞塊を模擬したものを観察対象物として用いた。本実施例では、焦点面Ａ，Ｂの何れも観察対象物内に設定した。焦点面Ａ，Ｂは、対物レンズの光軸の方向に沿った観察対象物の中心位置から光照射側および撮像側それぞれへ距離７λの位置に設定した。λは光の波長である。従来の二光束干渉法を用いる場合を比較例１とした。観察対象物の中心位置のみに焦点面を設定して、画像更新部６６による更新処理を行わない場合を比較例２とした。画像更新ステップＳ６において画像更新部６６により複素振幅画像の位相のみについて更新処理を行う場合、ならびに、複素振幅画像の振幅および位相の双方について更新処理を行う場合、それぞれついてシミュレーションをした。
【0160】
図１５～図１７は、画像更新ステップＳ６において画像更新部６６により複素振幅画像の位相のみについて更新処理を行う場合のシミュレーション結果を示す図である。細胞塊を模擬した観察対象物は、屈折率分布を有するものの、吸収を均一なものとした。
【0161】
図１５は、各種の複素振幅画像の位相の画像を示す図である。この図において、最上段は、観察対象物への第２光の光照射方向を対物レンズの光軸に平行にしたときの焦点面ＡでのｕA,n（ｒ）の位相画像を示す。第２段は、ｕA,n（ｒ）を焦点面Ｂへ自由伝搬したときの焦点面Ｂでのｕ’A,n（ｒ）のコヒーレント和の位相画像を示す。第３段は、観察対象物への第２光の光照射方向を対物レンズの光軸に平行にしたときの焦点面ＢでのｕB,n（ｒ）の位相画像を示す。最下段は、ｕB,n（ｒ）を焦点面Ａへ自由伝搬したときの焦点面Ａでのｕ’B,n（ｒ）のコヒーレント和の位相画像を示す。また、左端の第１列は、厳密解の画像を示す。第２列は、画像更新ステップＳ６における更新回数０の初期画像を示す。第３列は、画像更新ステップＳ６において３回の更新処理を行った後の画像を示す。右端の第４列は、画像更新ステップＳ６において２５回の更新処理を行った後の画像を示す。
【0162】
図１６は、各種の位相微分画像を示す図である。この図において、上段は比較例１により生成された位相微分画像を示し、中段は比較例２により生成された位相微分画像を示し、下段は本実施例により生成された位相微分画像を示す。また、左端はｚ軸に平行な断面における位相微分画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における位相微分画像を示す。
【0163】
図１７は、各種の屈折率分布画像を示す図である。この図において、最上段は厳密解の屈折率分布画像を示し、第２段は比較例１により生成された屈折率分布画像を示し、第３段は比較例２により生成された屈折率分布画像を示し、最下段は本実施例により生成された屈折率分布画像を示す。また、左端はｙ方向への最大値投影画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における屈折率分布画像を示す。
【0164】
図１８～図２１は、画像更新ステップＳ６において画像更新部６６により複素振幅画像の振幅および位相の双方について更新処理を行う場合のシミュレーション結果を示す図である。細胞塊を模擬した観察対象物は、屈折率分布を有し、また、この屈折率分布に応じた吸収分布を有するものとした。
【0165】
図１８は、各種の複素振幅画像の振幅の画像を示す図である。この図において、最上段は、観察対象物への第２光の光照射方向を対物レンズの光軸に平行にしたときの焦点面ＡでのｕA,n（ｒ）の振幅画像を示す。第２段は、ｕA,n（ｒ）を焦点面Ｂへ自由伝搬したときの焦点面Ｂでのｕ’A,n（ｒ）の強度和による振幅画像を示す。第３段は、観察対象物への第２光の光照射方向を対物レンズの光軸に平行にしたときの焦点面ＢでのｕB,n（ｒ）の振幅画像を示す。最下段は、ｕB,n（ｒ）を焦点面Ａへ自由伝搬したときの焦点面Ａでのｕ’B,n（ｒ）の強度和による振幅画像を示す。また、左端の第１列は、厳密解の画像を示す。第２列は、画像更新ステップＳ６における更新回数０の初期画像を示す。第３列は、画像更新ステップＳ６において３回の更新処理を行った後の画像を示す。右端の第４列は、画像更新ステップＳ６において２５回の更新処理を行った後の画像を示す。
【0166】
図１９は、各種の複素振幅画像の位相の画像を示す図である。この図において、最上段は、観察対象物への第２光の光照射方向を対物レンズの光軸に平行にしたときの焦点面ＡでのｕA,n（ｒ）の位相画像を示す。第２段は、ｕA,n（ｒ）を焦点面Ｂへ自由伝搬したときの焦点面Ｂでのｕ’A,n（ｒ）のコヒーレント和の位相画像を示す。第３段は、観察対象物への第２光の光照射方向を対物レンズの光軸に平行にしたときの焦点面ＢでのｕB,n（ｒ）の位相画像を示す。最下段は、ｕB,n（ｒ）を焦点面Ａへ自由伝搬したときの焦点面Ａでのｕ’B,n（ｒ）のコヒーレント和の位相画像を示す。また、左端の第１列は、厳密解の画像を示す。第２列は、画像更新ステップＳ６における更新回数０の初期画像を示す。第３列は、画像更新ステップＳ６において３回の更新処理を行った後の画像を示す。右端の第４列は、画像更新ステップＳ６において２５回の更新処理を行った後の画像を示す。
【0167】
図２０は、各種の位相微分画像を示す図である。この図において、上段は比較例１により生成された位相微分画像を示し、中段は比較例２により生成された位相微分画像を示し、下段は本実施例により生成された位相微分画像を示す。また、左端はｚ軸に平行な断面における位相微分画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における位相微分画像を示す。
【0168】
図２１は、各種の屈折率分布画像を示す図である。この図において、最上段は厳密解の屈折率分布画像を示し、第２段は比較例１により生成された屈折率分布画像を示し、第３段は比較例２により生成された屈折率分布画像を示し、最下段は本実施例により生成された屈折率分布画像を示す。また、左端はｙ方向への最大値投影画像を示し、その他はｚ方向の三つの位置それぞれにおけるｘｙ断面における屈折率分布画像を示す。
【0169】
図１５，図１８および図１９に示されるとおり、本実施例では、更新回数０の初期画像の複素振幅画像は厳密解の複素振幅画像と大きく異なるが、更新回数が多くなるに従い複素振幅画像は厳密解に近くなっていく。２５回の更新後の複素振幅画像は厳密解とよく一致している。また、図１６，図１７，図２０および図２１に示されるとおり、本実施例では、比較例１の場合と同程度の鮮明な位相微分画像および屈折率分布画像が得られ、比較例２の場合より鮮明な位相微分画像および屈折率分布画像が得られている。
【0170】
本実施形態において観察対象物に対して一定の光照射方向に沿って照射される第１光は、従来の二光束干渉法（比較例１）における参照光に替わるものである。従来の二光束干渉法（比較例１）では、参照光が観察対象物を経ることはなく、観察対象物を経た後の物体光と参照光とが合波されて撮像部により受光される。これに対して、本実施形態では、照射部において生成された第１光および第２光の双方は、その照射部から出力されて観察対象物を経て撮像部により受光される。
【0171】
本実施形態では、照射部が干渉光学系の構成を有する場合であっても、その干渉光学系の分岐光路上に観察対象物が配置されない。本実施形態では、照射部における干渉光学系の分岐光路は、分岐光路上に観察対象物を配置する従来の二光束干渉法（比較例１）の場合の分岐光路と比べて短くすることができる。したがって、本実施形態では、照射部は小型なものとすることができ、このような照射部を備える観察装置も小型なものとすることができる。なお、照射部が干渉光学系の構成を有する場合、その干渉光学系は、上記実施形態ではマイケルソン干渉計であったが、マッハツェンダ干渉計であってもよい。
【0172】
また、本実施形態では、照射部は、小型化することができることから、光学系の調整が容易であり、第１光と第２光との間の光路長差を短くすることも容易である。これにより、光源は、コヒーレンス長が長い単一周波数の光を出力するものである必要がなくなり、光源選択の自由度が増える。
【0173】
また、本実施形態では、照射部は一体化された構成とすることもできる。特に、照射部が空間光変調器を含む構成である場合、その照射部を構成する各部品（空間光変調器、ビームスプリッタ、ミラー、レンズ等）の相対的位置関係を固定して一体化することができる。また、照射部においてミラーの位置または方位をピエゾアクチュエータにより調整する構成であっても、その照射部を構成する各部品（ビームスプリッタ、ピエゾアクチュエータ、レンズ等）の相対的位置関係を固定して一体化することができる。このように照射部を一体化した構成とすることにより、その照射部を備える観察装置を組み立てることが更に容易となり、観察対象物を更に容易に観察することができる。
【0174】
本実施形態によれば、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を容易に観察することができる。
【0175】
以上のような効果は、画像更新部６６による更新処理を行わない場合（比較例２）でも得られる。しかし、本発明者らの知見によれば、比較例２では、観察対象物の中に焦点面を設定した場合には鮮明な画像が得られず、観察対象物の外に焦点面を設定した場合に比較的鮮明な画像が得られる。比較例２では、比較的鮮明な画像を得るために観察対象物の外に焦点面を設定しようとすると、観察対象物が存在する範囲を確認した上で焦点面を設定する必要がある。また、比較例２では、観察対象物の外に焦点面を設定すると、その焦点面において干渉強度画像を取得すべき領域は観察対象物の断面積より広くすることが必要となり、これにより画像の解像度が低下してしまう。これに対して、本実施形態では、観察対象物に対して焦点面を任意の位置に容易に設定することができ、また、観察対象物の中に焦点面を設定すれば画像の解像度の低下を回避することができる。
【符号の説明】
【0176】
１Ａ～１Ｇ…観察装置、２…記録媒体、１０…光源、２１…レンズ、２２…光入射端、２３…光ファイバ、２４…光出射端、２５…レンズ、３１～３５…照射部、４１…対物レンズ、４２…ミラー、４３，４３ａ，４３ｂ…レンズ、４４…４分の１波長板、４５…ビームスプリッタ、４６～４８…焦点面位置設定部、４９…ビームスプリッタ、５０，５０ａ，５０ｂ，５１…撮像部、６０…処理部、６１…初期画像生成部、６３…干渉項算出部、６４…第１複素振幅画像生成部、６５…第２複素振幅画像生成部、６６…画像更新部、６７…複素微分干渉画像生成部、６８…位相微分画像生成部、６９…屈折率分布画像生成部。
３１１…ビームスプリッタ、３１３…空間光変調器、３１４…偏光子、３１５…２分の１波長板、３１６…偏光子、３１８…レンズ、３１９…対物レンズ、３２１…ビームスプリッタ、３２２…ミラー、３２３…空間光変調器、３２８…レンズ、３２９…対物レンズ、３３１…ビームスプリッタ、３３２，３３３…ミラー、３３８…レンズ、３３９…対物レンズ、３４１…偏光ビームスプリッタ、３４２，３４３…ミラー、３４４…偏光子、３４５…２分の１波長板、３４６，３４７…４分の１波長板、３４８…レンズ、３４９…対物レンズ。
３１１…ビームスプリッタ、３１３…空間光変調器、３１４…偏光子、３１５…２分の１波長板、３１６…偏光子、３１８…レンズ、３１９…対物レンズ、３２１…ビームスプリッタ、３２２…ミラー、３２３…空間光変調器、３２８…レンズ、３２９…対物レンズ、３３１…ビームスプリッタ、３３２，３３３…ミラー、３３８…レンズ、３３９…対物レンズ、３４１…偏光ビームスプリッタ、３４２，３４３…ミラー、３４４…偏光子、３４５…２分の１波長板、３４６，３４７…４分の１波長板、３４８…レンズ、３４９…対物レンズ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】