(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024118242
(43)【公開日】2024-08-30
(54)【発明の名称】アミロイド触媒を用いるアミノ基の修飾方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/00 20060101AFI20240823BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20240823BHJP
【ＦＩ】
C07K1/00 ZNA
C07K7/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023024577
(22)【出願日】2023-02-20
(71)【出願人】
【識別番号】308038613
【氏名又は名称】公立大学法人和歌山県立医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】相馬 洋平
(72)【発明者】
【氏名】澤崎 鷹
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA20
4H045BA14
4H045EA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】アミロイドを触媒として用い、有機分子の位置選択的な官能基変換を可能とする新規触媒系を提供することを課題とする。
【解決手段】アミロイドを触媒とするアミノ基の修飾方法であり、水中において、アミロイド触媒の存在下で、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含み、前記アミロイド触媒は、β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であり、
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである。）、前記第１の化合物は、アミロイド結合モチーフを含み、前記アミノ基がスペーサーを介して前記アミロイド結合モチーフに連結している、方法である。
【選択図】なし
【解決手段】アミロイドを触媒とするアミノ基の修飾方法であり、水中において、アミロイド触媒の存在下で、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含み、前記アミロイド触媒は、β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であり、
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである。）、前記第１の化合物は、アミロイド結合モチーフを含み、前記アミノ基がスペーサーを介して前記アミロイド結合モチーフに連結している、方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミロイドを触媒とするアミノ基の修飾方法であり、
水中において、アミロイド触媒の存在下で、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含み、
前記アミロイド触媒は、β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であり、
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである。）
前記第１の化合物は、アミロイド結合モチーフを含み、前記アミノ基がスペーサーを介して前記アミロイド結合モチーフに連結している、
方法。
水中において、アミロイド触媒の存在下で、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含み、
前記アミロイド触媒は、β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であり、
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである。）
前記第１の化合物は、アミロイド結合モチーフを含み、前記アミノ基がスペーサーを介して前記アミロイド結合モチーフに連結している、
方法。
【請求項2】
前記アミノ基の修飾が、前記アミノ基のＮ原子へのアリールアシル基の付加、アリールアルキルの付加、アリール基の付加、又は、Ｎ原子を含むヘテロアリール化である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記アミロイド結合モチーフが、アゾベンゼン構造、ベンゾチアゾール構造、キサンテン構造、フェノチアジン構造、ホウ素ジピロメテン構造、クルクミン構造、及びポルフィリン構造よりなる群から選択される１以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ペプチドが、前記配列を含む７～４０のアミノ酸よりなる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の化合物が、前記反応基に連結したアリール構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記第２の化合物における反応基が、ハロゲン原子、活性アシル基、又はカルボニル基から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記アミロイド触媒が、チオフラビンＴ色素を用いたアッセイにより得られた蛍光強度の対数（ＡＰＩ）が３以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
酸性条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であるアミロイド；
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである。）。
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである。）。
【請求項10】
請求項９に記載のアミロイドを含む、アミノ基修飾反応のための触媒組成物。
【請求項11】
アミノ基修飾反応における触媒としての、請求項９に記載のアミロイドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミロイド触媒を用いるアミノ基の修飾方法、及び当該アミロイド触媒に関する。
【背景技術】
【0002】
アミロイドは、ペプチドやタンパク質が積み重なった繊維状の構造体で、βシートが繊維軸に対して垂直に並んだクロスβシート構造を有する（例えば、非特許文献１）。生体内でのアミロイドの蓄積は、様々な機能障害を引き起こすことが知られており（このような疾患は「アミロイド病」と総称される）、３５種類以上のタンパク質がアミロイド病の原因物質として同定されている。そのようなアミロイドとしては、例えば、タウ蛋白質、パーキンソン病のαシヌクレイン、糖尿病のアミリン、全身性アミロイド－シスのトランスサイレチン、ハンチントン病のハンチンチン等が知られている。
【0003】
一方、近年の研究では、短いペプチドから形成され、化学反応を触媒する活性を有する機能性アミロイドが明らかとなっている。例えば、金属塩を担持したアミロイドが酵素のエステラーゼ活性などを再現することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、このようなアミロイドの触媒活性は、アミロイドに組み込まれた金属塩や求核官能基などの高い反応性部分に依存する。したがって、既存のアミロイド触媒は、一般に、広範囲の基質に対して非選択的に反応し、同等の反応性部位を持つ基質に対する選択的変換は依然として難しい。さらに、アミロイド触媒を使用する化学反応の範囲は、主として、エステル加水分解、アルドール/レトロアルドール反応、および芳香環酸化などに限定されているという課題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】F. Chiti and C. M. Dobson, Annu. Rev. Biochem., 2017, 86, 27-68.
【非特許文献2】Nat. Chem, 2014, 6, 303
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
かかる従来技術の問題点に鑑み、本発明は、アミロイドを触媒として用い、有機分子の官能基を基質選択的に変換可能な新規触媒系を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、金属塩などの既存の酵素が持つ活性中心を用いるのではなく、反応基質との結合（近接効果）を起点にし、アミロイド自身が触媒作用を生じさせる新規触媒系を開発した。より具体的には、特定の配列を有するペプチドが凝集して形成されるアミロイドを触媒として用いることで、水中反応場において、有機化合物である反応基質に存在するアミノ基を選択的に修飾可能であり、かつ広い反応に適用可能であることを見出した。これらの知見により、本発明を完成するに至ったものである。
【0007】
すなわち、本発明は、一態様において、アミロイドを触媒とするアミノ基の修飾方法に関し、
＜１＞アミロイドを触媒とするアミノ基の修飾方法であり、水中において、アミロイド触媒の存在下で、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含み、前記アミロイド触媒は、β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であり、
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである）
前記第１の化合物は、アミロイド結合モチーフを含み、前記アミノ基がスペーサーを介して前記アミロイド結合モチーフに連結している、方法；
＜２＞前記アミノ基の修飾が、前記アミノ基のＮ原子へのアリールアシル基の付加、アリールアルキルの付加、アリール基の付加、又は、Ｎ原子を含むヘテロアリール化である、上記＜１＞に記載の方法；
＜３＞前記アミロイド結合モチーフが、アゾベンゼン構造、ベンゾチアゾール構造、キサンテン構造、フェノチアジン構造、ホウ素ジピロメテン構造、クルクミン構造、及びポルフィリン構造よりなる群から選択される１以上である、上記＜１＞に記載の方法；
＜４＞前記ペプチドが、前記配列を含む７～４０のアミノ酸よりなる、上記＜１＞に記載の方法；
＜５＞前記第２の化合物が、前記反応基に連結したアリール構造を有する、上記＜１＞に記載の方法；
＜６＞前記第２の化合物における反応基が、ハロゲン原子、活性アシル基、又はカルボニル基から選択される、上記＜１＞に記載の方法；
＜７＞前記アミロイド触媒が、チオフラビンＴ色素を用いたアッセイにより得られた蛍光強度の対数（ＡＰＩ）が３以上である、上記＜１＞に記載の方法；及び
＜８＞酸性条件下で行われる、上記＜１＞に記載の方法
を提供するものである。
＜１＞アミロイドを触媒とするアミノ基の修飾方法であり、水中において、アミロイド触媒の存在下で、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含み、前記アミロイド触媒は、β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であり、
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである）
前記第１の化合物は、アミロイド結合モチーフを含み、前記アミノ基がスペーサーを介して前記アミロイド結合モチーフに連結している、方法；
＜２＞前記アミノ基の修飾が、前記アミノ基のＮ原子へのアリールアシル基の付加、アリールアルキルの付加、アリール基の付加、又は、Ｎ原子を含むヘテロアリール化である、上記＜１＞に記載の方法；
＜３＞前記アミロイド結合モチーフが、アゾベンゼン構造、ベンゾチアゾール構造、キサンテン構造、フェノチアジン構造、ホウ素ジピロメテン構造、クルクミン構造、及びポルフィリン構造よりなる群から選択される１以上である、上記＜１＞に記載の方法；
＜４＞前記ペプチドが、前記配列を含む７～４０のアミノ酸よりなる、上記＜１＞に記載の方法；
＜５＞前記第２の化合物が、前記反応基に連結したアリール構造を有する、上記＜１＞に記載の方法；
＜６＞前記第２の化合物における反応基が、ハロゲン原子、活性アシル基、又はカルボニル基から選択される、上記＜１＞に記載の方法；
＜７＞前記アミロイド触媒が、チオフラビンＴ色素を用いたアッセイにより得られた蛍光強度の対数（ＡＰＩ）が３以上である、上記＜１＞に記載の方法；及び
＜８＞酸性条件下で行われる、上記＜１＞に記載の方法
を提供するものである。
【0008】
また、別の態様において、本発明は、上記アミロイド触媒及びその使用にも関し、より詳細には、
＜９＞β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であるアミロイド；
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａ）；
＜１０＞上記＜９＞に記載のアミロイドを含む、アミノ基修飾反応のための触媒組成物；及び
＜１１＞アミノ基修飾反応における触媒としての、上記＜９＞に記載のアミロイドの使用
を提供するものである。
＜９＞β－シート構造を有し、以下の配列を含むペプチドの凝集体であるアミロイド；
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ
（ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａ）；
＜１０＞上記＜９＞に記載のアミロイドを含む、アミノ基修飾反応のための触媒組成物；及び
＜１１＞アミノ基修飾反応における触媒としての、上記＜９＞に記載のアミロイドの使用
を提供するものである。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、特定の配列を有するペプチドが凝集して形成されるアミロイドを触媒として用いることで、水中反応場において、有機化合物である反応基質に存在するアミノ基を基質選択的に修飾可能であり、かつ広い反応に適用可能である。かかる反応機構は、金属塩などの酵素が持つ活性中心を用いる既存のアミロイド触媒系とは根本的に異なる新規なものである。
【0010】
本発明によれば、物質生産プロセスにおいて有機分子の基質選択的な官能基変換に適用できる。また、細胞内・生体内においてアミロイド周辺での有機分子の変換を可能とする技術及びその適用（プロドラッグ、ドラッグデリバリーシステムなど）が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【0013】
１．定義
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【0014】
本明細書中において、「アルキル又はアルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）である。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【0015】
本明細書中において、「芳香環」とは、単環式又は縮合多環式の共役不飽和炭化水素環構造を意味し、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含んでいてもよい。
【0016】
本明細書中において、「アリール又はアリール基」とは、単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール基」または「ヘテロ芳香族基」と呼ぶ。アリールが単環および縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈｅ）、チエニル基（２－又は３－チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２－ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３－イソチアゾリル基、３－イソオキサゾリル基、１，２，４－オキサジアゾール－５－イル基又は１，２，４－オキサジアゾール－３－イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－インデニル基、２－インデニル基、２，３－ジヒドロインデン－１－イル基、２，３－ジヒドロインデン－２－イル基、２－アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２－ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－２－イル基、ナフチリジニル、ジヒドロナフチリジニル、テトラヒドロナフチリジニル、イミダゾピリジニル、プテリジニル、プリニル、キノリジニル、インドリジニル、テトラヒドロキノリジニル、およびテトラヒドロインドリジニル、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－２－イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【0017】
本明細書中において、「アルキルアミノ」及び「アリールアミノ」は、－ＮＨ２基の水素原子が上記アルキル又はアリールの１又は２で置換されたアミノ基を意味する。例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ベンジルアミノ等が挙げられる。
【0018】
本明細書中において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【0019】
２．本発明のアミノ基修飾方法
上述のように、本発明は、特定の配列を有するペプチドが凝集したβ－シート構造を有するアミロイド触媒の存在下で、水中において、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含む、アミノ基の修飾方法に関する。
上述のように、本発明は、特定の配列を有するペプチドが凝集したβ－シート構造を有するアミロイド触媒の存在下で、水中において、アミノ基を有する第１の化合物に、前記アミノ基との反応基を有する第２の化合物を添加する工程を含む、アミノ基の修飾方法に関する。
【0020】
一般に、天然に存在する酵素は鍵と鍵穴のモデルに従って酵素-基質複合体を特異的に形成することにより、基質選択的に化学反応を触媒する（図１Ａ）。酵素の触媒反応は、基質が酵素活性部位に強力に結合することを介した近接効果に基づいて進行するものである。
【0021】
一方、本発明は、酵素の基質選択的な触媒作用の発現原理を利用し、アミロイド－基質複合体によって駆動される触媒作用（ＣＡＳＬ）を用いるものである（図１Ｂ）。ここで、上記第１の化合物が、基質に相当する。具体的には、アミロイドのクロスβシートに強力に結合する第１の化合物（基質）が、アミロイド触媒との複合体形成に基づく近接効果により選択的に活性化されることを利用し、アミノ基の選択的な修飾反応が可能であることを見出したものである。
【0022】
有機溶媒中におけるアミンの修飾反応は古典的なものであるが、水中でのかかる反応は容易ではない。中性からわずかに酸性のｐＨ領域では、ｐＫａが約１０のアルキルアミンはカチオン化して求核性を有しない。また、そのｐＨ領域では、塩基試薬もプロトン化され、脱プロトン化能に関して不活性である。一方、酵素は、水中、基質との結合を介して基質のアンモニウム塩を遊離アミンに脱プロトン化する。特に、本発明では、酵素の主鎖であるアミド基が基質のプロトンを受容する機構を、ＣＡＳＬによる水中でのアミン修飾反応に適用したものである。それにより、水中環境下では不活性な第１の化合物と第２の化合物の反応が、特定のアミロイド触媒を用いることで選択的に進行することを実証した。
【0023】
本発明の方法において触媒として用いられるアミロイドは、β－シート構造を有し、以下の式（Ｉ）の配列を含むペプチドの凝集体である。
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ （Ｉ）
Ｘ－Ｐｈｅ－Ｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ （Ｉ）
【0024】
ここで、Ｘは、Ａｓｎ又はＡｌａであり；Ｙは、Ｇｌｙ又はＡｌａである。
【0025】
上記ペプチドは、好ましくは、式（Ｉ）の配列を含む７～４０のアミノ酸よりなる。例えば、式（Ｉ）における「Ｘ」の左側に１～２０の任意のアミノ酸を有することできる。同様に、式（Ｉ）における「Ｌｅｕ」の右側に１～２０の任意のアミノ酸を有することできる。かかるペプチドの具体例は、後述の実施例において挙げるペプチド群である。
【0026】
また、上記ペプチドのいずれか一方の末端は、－ＮＨ２で連結している。好ましくは、式（Ｉ）の「Ｌｅｕ」側の末端に、－ＮＨ２が連結している。
【0027】
上記β－シート構造は、好ましくは、βシートが繊維軸に対して垂直に並んだクロスβ－シート構造である。
【0028】
上記アミロイドは、凝集性が高くなるほど、その触媒能が高くなる。かかる凝集性は、例えば、チオフラビンＴ色素を用いたアッセイによる蛍光強度変化のよって評価することができる。さらにその蛍光強度の対数をＡＰＩ値として、アミロイド凝集性の指標として用いることができる。本発明におけるアミロイド触媒は、好ましくは、ＡＰＩ値が３以上、より好ましくが、ＡＰＩ値が６以上、特に好ましくは、ＡＰＩ値が７以上の凝集性を有する。
【0029】
必ずしも理論に拘束されるものではないが、後述の実施例で示すように、本発明のアミロイド触媒におけるアミド結合のうちの少なくとも１つは、基質である第１の化合物におけるアミノ基のプロトンと結合してこれを活性化するために機能する。一方、その他のアミド結合は、β－シート構造の積み重なりのために主として使用されるものと考えられる。
【0030】
次に、本発明で用いられる第１の化合物は、基質としてアミロイド触媒と結合して活性化される化合物であり、分子内のアミノ基が修飾される対象となる化合物である。より具体的には、第１の化合物は、アミロイド結合モチーフを含み、前記アミノ基がスペーサーを介して前記アミロイド結合モチーフに連結している構造を有する。
【0031】
上記アミロイド結合モチーフとしては、当該技術分野において公知のモチーフを用いることができるが、例えば、アゾベンゼン構造、ベンゾチアゾール構造、キサンテン構造、フェノチアジン構造、ホウ素ジピロメテン構造、クルクミン構造、及びポルフィリン構造よりなる群から選択される１以上であることができる。ただし、これらに限定されるものではない。好ましくは、上記アミロイド結合モチーフは、アゾベンゼン構造である。第１の化合物は、かかるアミロイド結合モチーフを分子内に含む任意の誘導体であることができる。
【0032】
第１の化合物におけるスペーサーとしては、それぞれ置換されていてもよいアルキル鎖、エーテル鎖、これらの組合せであることができ、一部にアミド基、エステル基が導入されたものであってもよい。当該スペーサーは、好ましくは、１～２０の炭素数、より好ましくは、１～１０の炭素数を有することができる。ただし、これらに限定されるものではない。
【0033】
第１の化合物におけるアミノ基は、溶媒である水中で、プロトン化してカチオンのアンモニウムイオン（－ＮＨ３
＋、ＮＨ２Ｒ＋、又はＮＨＲ２
＋）となり得るものである。ここで、Ｒは、それぞれ独立にアルキル基等の任意の置換基であることができる。当該アミノ基は、好ましくは、アルキルアミノ基である。
【0034】
本発明における第２の化合物は、基質である第１の化合物のアミノ基と反応して、当該アミノ基を修飾するものである。したがって、第２の化合物は、第１の化合物のアミノ基と反応するための反応基を分子内に有する。かかる反応基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ハロゲン原子、活性アシル基、又はカルボニル基を挙げることができる。活性アシル基としては、チアゾリジンチオン基などを挙げることができる。
【0035】
また、第２の化合物は、好ましくは、前記反応基に連結したアリール構造を有する。ただし、後述のように、アミノ基の修飾反応の種類に応じて当該部位の構造を選択することができる。
【0036】
本発明の修飾方法における溶媒は、水である。上述のように、本発明では、水中環境下では進行しない化学反応を、アミロイド触媒を用いることで可能とする点が重要な特徴である。当該溶媒のｐＨは、当該技術分野において公知のバッファー（緩衝液）を用いて調整することができ、典型的には、ｐＨが４～７、好ましくは、ｐＨが５～６の範囲とすることができる。また、場合に応じて、水と有機溶媒との混合物を用いることができる。そのような有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等のプロトン性溶媒；ＤＭＳＯ等の非プロトン性極性溶媒を挙げることができる。
【0037】
本発明における「アミノ基の修飾」には、典型的には、アミノ基のＮ原子へのアリールアシル基の付加、アリールアルキルの付加、アリール基の付加；又は、Ｎ原子を含むヘテロアリール化などを挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。当該修飾は、目的とする修飾反応に応じて、第２の化合物を選択することで適宜変更することが可能である。
【0038】
本発明における第１及び第２の化合物は、塩として存在する場合がある。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、カルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、これらの塩に限定されることはない。
【0039】
本発明における第１及び第２の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【0040】
また、本発明における第１及び第２の化合物又はそれらの塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、水、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【0041】
本明細書の実施例には、第１及び第２の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、これらの化合物を容易に製造することができる。
【0042】
２．本発明のアミロイド触媒
別の態様において、本発明は、上記の修飾方法において触媒として機能するアミロイドにも関する。当該アミロイドは、上述のように、β－シート構造を有し、上述の式（Ｉ）の配列を含むペプチドの凝集体であり、その詳細は既に述べたとおりである。
別の態様において、本発明は、上記の修飾方法において触媒として機能するアミロイドにも関する。当該アミロイドは、上述のように、β－シート構造を有し、上述の式（Ｉ）の配列を含むペプチドの凝集体であり、その詳細は既に述べたとおりである。
【0043】
或いは、本発明は、上記アミロイドを含む、アミノ基修飾反応のための触媒組成物を提供するものである。別の観点からは、本発明は、アミノ基修飾反応における触媒としての、上記アミロイドの使用ということもできる。
【実施例0044】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【0045】
１．ペプチドの合成
図２に記載のＥＮＴＲＹ１～１５のペプチドを合成した。ペプチドは、リンクアミド樹脂を使用し、Ｃ末端からＮ末端までＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチドシンセサイザーで標準のＦｍｏｃ固相合成法により自動合成した。合成が完了するまで、脱保護－洗浄－カップリングを含むサイクルが自動的に実行される。詳細な手順は以下のとおりである。
図２に記載のＥＮＴＲＹ１～１５のペプチドを合成した。ペプチドは、リンクアミド樹脂を使用し、Ｃ末端からＮ末端までＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチドシンセサイザーで標準のＦｍｏｃ固相合成法により自動合成した。合成が完了するまで、脱保護－洗浄－カップリングを含むサイクルが自動的に実行される。詳細な手順は以下のとおりである。
【0046】
［Ｎ－アシル化ペプチドの合成］
樹脂上のペプチドを、一般的なＳＰＰＳ手順に従って合成した。チューブ中の樹脂に、対応する無水酢酸またはピバリン酸無水物（５％ｖ／ｖ）およびピリジン（５％ｖ／ｖ）のＤＭＦ溶液（０．０５Ｍ）を加えた。３０分間振盪した後、樹脂を濾過により回収し、ＤＭＦで洗浄した。樹脂をＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏ（９５／２．５／２．５）で室温で１時間処理した。混合物を濾過して樹脂を除去し、濾液を減圧下で濃縮した。残留物にＥｔ２Ｏを加えてペプチドを沈殿させ、混合物を濾過した。残渣をＤＭＳＯで抽出した。分取ＨＰＬＣ（方法Ｃ）および分画の凍結乾燥によって精製して、 Ｎ－アシル化ペプチドを得た。
樹脂上のペプチドを、一般的なＳＰＰＳ手順に従って合成した。チューブ中の樹脂に、対応する無水酢酸またはピバリン酸無水物（５％ｖ／ｖ）およびピリジン（５％ｖ／ｖ）のＤＭＦ溶液（０．０５Ｍ）を加えた。３０分間振盪した後、樹脂を濾過により回収し、ＤＭＦで洗浄した。樹脂をＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏ（９５／２．５／２．５）で室温で１時間処理した。混合物を濾過して樹脂を除去し、濾液を減圧下で濃縮した。残留物にＥｔ２Ｏを加えてペプチドを沈殿させ、混合物を濾過した。残渣をＤＭＳＯで抽出した。分取ＨＰＬＣ（方法Ｃ）および分画の凍結乾燥によって精製して、 Ｎ－アシル化ペプチドを得た。
【0047】
【化1】
【0048】
上記スキーム中、Ｒ４は、公知の手法に従って合成した。反応容器中のＲ４に、 ＰｓｅｕｄｏＦＧ（０．２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．４ｍｍｏｌ）の予備混合溶液を添加した。６０分間攪拌した後、得られた混合物をＤＭＦで洗浄した。膨潤後、樹脂に結合したＮ－ＦｍｏｃペプチドをＤＭＦ中の１０％ピペリジンで３回脱保護し(２分×３)、ペプチドＲ５を得た。Ｒ５に、 Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（０．５ミリモル）、ＨＢＴＵ（０．５ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（１ミリモル）の予備混合溶液を加えた。３０分間攪拌した後、得られた混合物をＤＭＦで洗浄した。膨潤後、樹脂に結合したＮ－ＦｍｏｃペプチドをＤＭＦ中の１０％ピペリジンで３回脱保護し(２分×３)、ペプチドＲ６を得た。Ｒ６をＮ－アシル化ペプチドとの合成と同様の手順により、ＦＯを得た。
【0049】
【化2】
【0050】
Ｒ７は、公知の手法に従って合成した。反応容器中のＲ７に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（８当量）、ＤＩＣ（８当量）の予備混合溶液を添加した。５分間攪拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤＭＡＰ（１当量）の溶液を添加した。３０分間攪拌した後、得られた混合物をＤＭＦで洗浄した。カップリングプロセスを３回繰り返した。膨潤後、樹脂に結合したＮ－ＦｍｏｃペプチドをＤＭＦ中の１０％ピペリジンで３回脱保護し(２分×３)、ペプチドＲ８を得た。チューブ内の樹脂に、対応する無水酢酸 (５% (v/v)) とピリジン５% (v/v) の ＤＭＦ (0.05 M) 溶液を加えた。３０分間振とうした後、樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄した。樹脂をTFA/トリイソプロピルシラン/Ｈ２Ｏ (95/2.5/2.5) で室温で1時間処理した。混合物を濾過して樹脂を除去し、濾液を減圧下で濃縮した。残留物にＥｔ２Ｏを加えてペプチドを沈殿させ、混合物を濾過した。残留物をＤＭＳＯで抽出し、分取ＨＰＬＣ(方法Ｃ)により精製し、画分を凍結乾燥してＮＯを得た。
【0051】
得られた各ペプチドの同定は、それぞれ以下のとおりである。
Ac-NFGAF-NH2: LCMS (ESI): found m/z 596.3 calcd. 596.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 7.7 min (method H).
Ac-FYLLYY-NH2: LCMS (ESI): found m/z 922.4 calcd. 923.0 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 3.9 min (method G).
Ac-LIAGFN-NH2: found m/z 675.4 calcd. 675.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.6 min (method H).
Ac-NFGSVQFV-NH2: found m/z 938.5 calcd. 939.0 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 7.8 min (method H).
Ac-AIIGLM-NH2: LCMS (ESI): found m/z 658.4 calcd. 658.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 12.0 min (method H).
Ac-NFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 675.4 calcd. 675.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.8 min. (method H).
Ac-NFGAILS-NH2: LCMS (ESI): found m/z 762.4 calcd. 762.9 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.5 min. (method H).
Ac-NNFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 789.4 calcd. 789.9 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.1 min. (method H).
Ac-AFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 632.5 calcd. 632.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.6min. (method H).
Ac-DFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 676.4 calcd. 676.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.2 min. (method H).
Piv-NFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 717.5 calcd. 717.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 7.3 min. (method H).
Ac-NAGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 599.4 calcd. 599.6 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 6.3 min. (method H).
Ac-NFAAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 689.4 calcd. 689.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.6 min. (method H).
Ac-NFGAAL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 633.4 calcd. 633.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.3 min. (method H).
Ac-NFGAIA-NH2: LCMS (ESI): found m/z 633.4 calcd. 633.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 6.7 min. (method H).
FO: LCMS (ESI): found m/z 676.8 calcd. 676.5 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.2 min. (method H).
NO: LCMS (ESI): found m/z 676.8 calcd. 676.5 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.5 min. (method H).
Ac-NFGAF-NH2: LCMS (ESI): found m/z 596.3 calcd. 596.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 7.7 min (method H).
Ac-FYLLYY-NH2: LCMS (ESI): found m/z 922.4 calcd. 923.0 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 3.9 min (method G).
Ac-LIAGFN-NH2: found m/z 675.4 calcd. 675.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.6 min (method H).
Ac-NFGSVQFV-NH2: found m/z 938.5 calcd. 939.0 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 7.8 min (method H).
Ac-AIIGLM-NH2: LCMS (ESI): found m/z 658.4 calcd. 658.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 12.0 min (method H).
Ac-NFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 675.4 calcd. 675.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.8 min. (method H).
Ac-NFGAILS-NH2: LCMS (ESI): found m/z 762.4 calcd. 762.9 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.5 min. (method H).
Ac-NNFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 789.4 calcd. 789.9 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 8.1 min. (method H).
Ac-AFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 632.5 calcd. 632.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.6min. (method H).
Ac-DFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 676.4 calcd. 676.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.2 min. (method H).
Piv-NFGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 717.5 calcd. 717.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 7.3 min. (method H).
Ac-NAGAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 599.4 calcd. 599.6 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 6.3 min. (method H).
Ac-NFAAIL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 689.4 calcd. 689.8 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.6 min. (method H).
Ac-NFGAAL-NH2: LCMS (ESI): found m/z 633.4 calcd. 633.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.3 min. (method H).
Ac-NFGAIA-NH2: LCMS (ESI): found m/z 633.4 calcd. 633.7 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 6.7 min. (method H).
FO: LCMS (ESI): found m/z 676.8 calcd. 676.5 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.2 min. (method H).
NO: LCMS (ESI): found m/z 676.8 calcd. 676.5 ([M+H]+). Purity>95% (based on HPLC analysis at 220nm); tR = 9.5 min. (method H).
【0052】
得られた合成ペプチドのＤＭＳＯ溶液を１０ ｍＭ ＨＣｌ水溶液で半分に希釈し、室温で３０分間インキュベートした後、使用するまで－８０℃で保存した。
【0053】
２．アミロイドの評価
［チオフラビンＴアッセイ］
上記１．で合成したペプチドによりアミロイドを形成し、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイにより凝集度を評価した。
［チオフラビンＴアッセイ］
上記１．で合成したペプチドによりアミロイドを形成し、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイにより凝集度を評価した。
【0054】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＴｈＴ（５μＭ）の溶液に、ペプチド（４ｍＭストック溶液から１２．５μＬ）を添加した。この溶液の蛍光強度を室温で励起波長４４０ｎｍ、発光波長４８０ｎｍで測定した。相対強度 (I/I0 )を、次の式に従い算出した。
【数1】
【0055】
ＡＰＩ値は、以下の式から算出した。
【数2】
【0056】
得られた結果を以下の表に示す。
【表1】
【0057】
［置換アッセイ］
ＰＢＳ (pH7.4) 中の ＴｈＴ (5 μM) の９８７．５μL 溶液に、ペプチド (4 mM) の１２．５μL ストック溶液を加えて、１ｍＬ溶液を提供した。置換アッセイでは、溶液中のＴｈＴの蛍光スペクトルを最初に測定しました。蛍光強度を記録した後、基質 (1 mM、10 mM、または 100 mM ストック溶液から 0.1 μL) を添加し、混合物の蛍光強度を測定た。このプロセスを繰り返し、１５のデータを得た。各強度は、初期強度に基づいて相対強度に変換した。比較として、ＤＭＳＯ (0.1 μL) を使用して、ベヒクルがこのアッセイに影響を与えないことを確認した。結果は、２つの独立した実験の平均である。
ＰＢＳ (pH7.4) 中の ＴｈＴ (5 μM) の９８７．５μL 溶液に、ペプチド (4 mM) の１２．５μL ストック溶液を加えて、１ｍＬ溶液を提供した。置換アッセイでは、溶液中のＴｈＴの蛍光スペクトルを最初に測定しました。蛍光強度を記録した後、基質 (1 mM、10 mM、または 100 mM ストック溶液から 0.1 μL) を添加し、混合物の蛍光強度を測定た。このプロセスを繰り返し、１５のデータを得た。各強度は、初期強度に基づいて相対強度に変換した。比較として、ＤＭＳＯ (0.1 μL) を使用して、ベヒクルがこのアッセイに影響を与えないことを確認した。結果は、２つの独立した実験の平均である。
【0058】
３．第１の化合物（基質）の合成
以下の手順により、第１の化合物に相当する各基質分子を合成した。
以下の手順により、第１の化合物に相当する各基質分子を合成した。
【0059】
［化合物１の合成］
以下の合成スキームにより、化合物１を合成した。
以下の合成スキームにより、化合物１を合成した。
【化3】
【0060】
［化合物１－１］
【化4】
【0061】
4-アミノ-1-ブタノール(1.86 mL, 20.0 mmol) の乾燥 THF (15 mL)混合物に、ジ-tert-ブチルジカーボネート (5.24g, 24.0 mmol) を０℃で加えた。その温度で１時間撹拌した後、混合物を室温に戻し、１２時間撹拌を続けた。混合物を減圧下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解した。有機層を水およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１／１、Ｒｆ０．５）により精製して、化合物１－１を無色油として得た(２．５４g、６７％)。
【0062】
［化合物１－２］
【化5】
【0063】
化合物１－１(1.00g、5.29ミリモル)、ＤＭＡＰ(0.64mg、5.29 ミリモル) および ＥＤＣＩ (0.93 mL、5.29 ミリモル) の乾燥 ＤＭＦ (15 mL) 中の混合物に、4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4'-カルボン酸 (１．４２ｇ、５．２９ミリモル）を室温で加えた。同温で１８時間攪拌後、減圧濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解した。有機層を水および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１／１、Ｒｆ０．５）により精製して、化合物１－２をオレンジ色の固体として得た(５８１．９ｍｇ、２．５ ％)。
1H NMR (CDCl3): δ = 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.85-7.91 (m, 4H), 6.76 (d, J =8.8 Hz, 2H), 4.59 (br, 1H), 4.35 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.21 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.11 (s, 6H), 1.79-1.86 (m, 2H), 1.62-1.70 (m, 2H), 1.45 (s, 9H)
13C NMR (CDCl3): δ = 166.5, 156.2, 153.0, 153.0, 143.8, 130.7, 130.4, 125.7, 122.1, 111.6, 64.8, 40.4, 28.6, 27.0, 26.3
HRMS (ESI, m/z): found m/z 441.2490 calcd. 441.2502 ([M+H]+).
1H NMR (CDCl3): δ = 8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.85-7.91 (m, 4H), 6.76 (d, J =8.8 Hz, 2H), 4.59 (br, 1H), 4.35 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.21 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.11 (s, 6H), 1.79-1.86 (m, 2H), 1.62-1.70 (m, 2H), 1.45 (s, 9H)
13C NMR (CDCl3): δ = 166.5, 156.2, 153.0, 153.0, 143.8, 130.7, 130.4, 125.7, 122.1, 111.6, 64.8, 40.4, 28.6, 27.0, 26.3
HRMS (ESI, m/z): found m/z 441.2490 calcd. 441.2502 ([M+H]+).
【0064】
［化合物１］
【化6】
【0065】
乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物１-２（２２０ｍｇ、５．２９ｍｍｏｌ）の混合物に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を室温で添加した。同温で０．５時間攪拌後、減圧濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、および塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｅｔ ３ Ｎ＝９／１／０．１、Ｒｆ ０．４）によって精製して、化合物１をオレンジ色の固体として得た (17.0 mg)。
1H NMR (DMSO-d6): δ =7.41 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.13-7.18 (m, 4H), 6.16 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.39 (s, 6H), 2.11 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.83 (br, 2H), 0.93-1.01 (m, 2H), 1.05-1.13 (m, 2H)
13C NMR (CDCl3): δ = 165.9, 155.8, 153.6, 143.1, 130.9, 130.2, 125.9, 122.3, 112.1, 64.9, 49.1, 40.3, 25.8
HRMS (ESI, m/z): found m/z 341.1988 calcd. 341.1978 ([M+H]+).
1H NMR (DMSO-d6): δ =7.41 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.13-7.18 (m, 4H), 6.16 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.39 (s, 6H), 2.11 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.83 (br, 2H), 0.93-1.01 (m, 2H), 1.05-1.13 (m, 2H)
13C NMR (CDCl3): δ = 165.9, 155.8, 153.6, 143.1, 130.9, 130.2, 125.9, 122.3, 112.1, 64.9, 49.1, 40.3, 25.8
HRMS (ESI, m/z): found m/z 341.1988 calcd. 341.1978 ([M+H]+).
【0066】
同様の手順により、アゾベンゼンとアミノ基を含むスペーサー鎖の結合部分を変更した化合物１ａ～１ｃ（図３）；アミノ基を含むスペーサー鎖の結合位置を変更した化合物２ａ～２b（図３）；及び、種々のスペーサーに変更した化合物３ａ～３ｅ（図４）をそれぞれ合成した。
【0067】
［比較合成例１：化合物１－Ｂｚ－１及び１－Ｂｚ］
【化7】
【0068】
［化合物１－Ｂｚ－１］
4-アミノ-1-ブタノール(464.5 μL, 5.0 mmol)の混合物に、 N -(ベンゾイルオキシ)スクシンイミド (1096 mg, 5.0 mmol) を０℃ で加えた。この温度で２時間撹拌した後、混合物を水および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ＝１００％、Ｒｆ０．４）によって精製して、化合物１－Ｂｚ－１を白色固体として得た（３９６．７ｍｇ、４１％）。
4-アミノ-1-ブタノール(464.5 μL, 5.0 mmol)の混合物に、 N -(ベンゾイルオキシ)スクシンイミド (1096 mg, 5.0 mmol) を０℃ で加えた。この温度で２時間撹拌した後、混合物を水および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ＝１００％、Ｒｆ０．４）によって精製して、化合物１－Ｂｚ－１を白色固体として得た（３９６．７ｍｇ、４１％）。
【0069】
［化合物１－Ｂｚ］
ＤＭＦ(1mL) 中の 化合物１－Ｂｚ－１ (57.9 mg、0.30 mmol)、ＥＤＣＩ (57.5、0.30 mmol) および ＤＭＡＰ (24.4 mg、0.20 mmol) の混合物に、4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4'-カルボン酸 (53.9 mg、 ０．２０ミリモル）を添加した。室温で２時間攪拌後、ＥｔＯＡｃを加えた。有機層を水および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１９／１、Ｒｆ０．３）によって精製して、化合物１－Ｂｚをオレンジ色の固体（６９．１ｍｇ、７８％）として得た。
1H NMR (CDCl3): δ =8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.92-7.84 (m, 4H), 7.78-7.76 (m, 2H), 7.50-7.43 (m, 1H), 7.43-7.40 (m, 2H), 6.75 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.36 (br, 1H), 4.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.57-3.52 (m, 2H), 3.10 (s, 6H), 1.92-1.86 (m, 2H), 1.83-1.76 (m, 2H)
13C NMR (DMSO-d6): δ =165.9, 165.1, 155.0, 152.8, 142.4, 134.4, 130.8, 130.2, 129.6, 128.0, 126.9, 125.1, 121.6, 111.4, 64.4, 38.6, 25.6, 25.5, 25.0
HRMS (ESI, m/z): found m/z 445.2235 calcd. 445.2240 ([M+Na]+)
ＤＭＦ(1mL) 中の 化合物１－Ｂｚ－１ (57.9 mg、0.30 mmol)、ＥＤＣＩ (57.5、0.30 mmol) および ＤＭＡＰ (24.4 mg、0.20 mmol) の混合物に、4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4'-カルボン酸 (53.9 mg、 ０．２０ミリモル）を添加した。室温で２時間攪拌後、ＥｔＯＡｃを加えた。有機層を水および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１９／１、Ｒｆ０．３）によって精製して、化合物１－Ｂｚをオレンジ色の固体（６９．１ｍｇ、７８％）として得た。
1H NMR (CDCl3): δ =8.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.92-7.84 (m, 4H), 7.78-7.76 (m, 2H), 7.50-7.43 (m, 1H), 7.43-7.40 (m, 2H), 6.75 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.36 (br, 1H), 4.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.57-3.52 (m, 2H), 3.10 (s, 6H), 1.92-1.86 (m, 2H), 1.83-1.76 (m, 2H)
13C NMR (DMSO-d6): δ =165.9, 165.1, 155.0, 152.8, 142.4, 134.4, 130.8, 130.2, 129.6, 128.0, 126.9, 125.1, 121.6, 111.4, 64.4, 38.6, 25.6, 25.5, 25.0
HRMS (ESI, m/z): found m/z 445.2235 calcd. 445.2240 ([M+Na]+)
【0070】
［比較合成例２：化合物２ｂ－Ｂｚ］
【化8】
【0071】
化合物１－Ｂｚ－１ (69.2 mg, 0.36 mmol)、ＤＭＡＰ (43.8 mg, 0.36 mmol) および ＥＤＣＩ (68.7 mg, 0.36 mmol) の混合物に、メチルレッド (96.5 mg, 0.36 mmol) を室温で加えた。同温度で８時間攪拌後、ＥｔＯＡｃを加えた。有機層を水および塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝１／１、Ｒｆ０．６）によって精製して、化合物２ｂ－Ｂｚをオレンジ色の固体として得た (２６．５ｍｇ、１７％)。
1H NMR (CDCl3): δ =7.83 (d, J =8.8 Hz, 2H), 7.76-7.74 (m, 1H), 7.67-7.64 (m, 2H), 7.59-7.52 (m, 2H), 7.47-7.43 (m, 1H), 7.40-7.34 (m, 3H), 6.68 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.08 (br, 1H), 4.32 (t, J = 6.2 Hz, 2H),3.34 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.00 (s, 6H), 1.75-1.70 (m, 2H), 1.64-1.57 (m, 2H)
13C NMR (CDCl3): δ = 168.6, 167.5, 152.8, 152.6, 143.6, 134.7, 131.8, 131.4, 129.6, 128.5, 128.4, 128.2, 126.9, 125.5, 119.4, 111.4, 65.0, 40.3, 39.7, 26.32, 26.29
HRMS (ESI, m/z): found m/z 445.2225 calcd. 445.2240 ([M+H]+).
1H NMR (CDCl3): δ =7.83 (d, J =8.8 Hz, 2H), 7.76-7.74 (m, 1H), 7.67-7.64 (m, 2H), 7.59-7.52 (m, 2H), 7.47-7.43 (m, 1H), 7.40-7.34 (m, 3H), 6.68 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.08 (br, 1H), 4.32 (t, J = 6.2 Hz, 2H),3.34 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.00 (s, 6H), 1.75-1.70 (m, 2H), 1.64-1.57 (m, 2H)
13C NMR (CDCl3): δ = 168.6, 167.5, 152.8, 152.6, 143.6, 134.7, 131.8, 131.4, 129.6, 128.5, 128.4, 128.2, 126.9, 125.5, 119.4, 111.4, 65.0, 40.3, 39.7, 26.32, 26.29
HRMS (ESI, m/z): found m/z 445.2225 calcd. 445.2240 ([M+H]+).
【0072】
４．アミロイド触媒を用いたアミノ基修飾反応
上記で合成した基質（第１の化合物）について、アミロイド触媒を用いたアミノ基修飾反応を行った。
上記で合成した基質（第１の化合物）について、アミロイド触媒を用いたアミノ基修飾反応を行った。
【0073】
［基質溶液の調製］
分取ＨＰＬＣによって精製された基質化合物はＴＦＡ塩であり、ＤＭＳＯに溶解してストック溶液を調製した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した化合物をＴＦＡに溶解し、室温で１０分間インキュベートした。溶液を減圧下で赤色固体に濃縮した。固体にＤＭＳＯを添加して、基質化合物の１ｍＭ溶液とした。
分取ＨＰＬＣによって精製された基質化合物はＴＦＡ塩であり、ＤＭＳＯに溶解してストック溶液を調製した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した化合物をＴＦＡに溶解し、室温で１０分間インキュベートした。溶液を減圧下で赤色固体に濃縮した。固体にＤＭＳＯを添加して、基質化合物の１ｍＭ溶液とした。
【0074】
［反応手順］
５０ｍＭ 酢酸緩衝液 (pH6.0) ９２．５μＬ、１ｍＭ ストック溶液からの基質２．５μＬ、および４ｍＭ ストック溶液からのアミロイド触媒５μＬから調製した溶液をボルテックスし、５分間インキュベートした。そして、１．０μＬの３－ベンゾイルチアゾリジン－２－チオン (１０ｍＭ ストック溶液から) を加えた。３７℃ で６時間インキュベートした後、１００μＬのＤＭＳＯを添加し、１０μＬを注入して分析用ＨＰＬＣ (４７５ｎｍ または３５０ｎｍ) で分析した。特に明記しない限り、収率は、合成生成物標準から生成された標準曲線を用いて決定した。
５０ｍＭ 酢酸緩衝液 (pH6.0) ９２．５μＬ、１ｍＭ ストック溶液からの基質２．５μＬ、および４ｍＭ ストック溶液からのアミロイド触媒５μＬから調製した溶液をボルテックスし、５分間インキュベートした。そして、１．０μＬの３－ベンゾイルチアゾリジン－２－チオン (１０ｍＭ ストック溶液から) を加えた。３７℃ で６時間インキュベートした後、１００μＬのＤＭＳＯを添加し、１０μＬを注入して分析用ＨＰＬＣ (４７５ｎｍ または３５０ｎｍ) で分析した。特に明記しない限り、収率は、合成生成物標準から生成された標準曲線を用いて決定した。
【0075】
［化合物１のベンゾイル化］
上記２．で合成した各種アミロイド（図２）の存在化において、アミロイド結合モチーフであるアゾベンゼン誘導体である化合物１と、ベンゾイル供与体である３－ベンゾイルチアゾリジン－２－チオンを反応させ、化合物１のアミノ基のＮ－ベンゾイル化修飾を行った（図３）。その結果、得られた収率を図２の右欄に示す。
上記２．で合成した各種アミロイド（図２）の存在化において、アミロイド結合モチーフであるアゾベンゼン誘導体である化合物１と、ベンゾイル供与体である３－ベンゾイルチアゾリジン－２－チオンを反応させ、化合物１のアミノ基のＮ－ベンゾイル化修飾を行った（図３）。その結果、得られた収率を図２の右欄に示す。
【0076】
ここで、各ペプチドのアミロイド凝集の傾向は、チオフラビン－Ｔ (ＴｈＴ) 色素アッセイを使用して評価した。その蛍光強度は、クロス－βシートの程度に応じて増加する。さらに、アミロイド形成能の指標としてＴｈＴ値の対数(ＡＰＩ)を採用しました。各アミロイドのＡＰＩ値を図２中に示す。
【0077】
まず、アミロイドが存在しない場合、アミンは、３７℃の酸性緩衝液 (pH 6.0) においてベンゾイル (Ｂｚ) 供与体に対して不活性であった (Ｅｎｔｒｙ１)。次いで、ペンタからオクタペプチドで構成されるアミロイド触媒を用いて反応を行った。その結果、膵島アミロイドポリペプチド (ＩＡＰＰ)由来の「Ａｃ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－ＮＨ２」(ＮＬ６) によって形成されるアミロイド（ＡＰＩ）の場合には、収率７８％で、ベンゾイル化修飾が進行すること確認された（Ｅｎｔｒｙ７）。一方、ＴＤＰ－４３由来のＥｎｔｒｙ２のペプチドでは、収率を４％であった。さらに、 ＩＡＰＰ配列に従ってそれぞれＮＬ６のＮ末端およびＣ末端でそれぞれ１残基ずつ伸長したＥｎｔｒｙ８及び９ヘプタペプチドでは、 ＮＬ６よりも低い収量であった。
【0078】
次に、アミロイド触媒ＮＬ６の各アミノ酸をアラニン残基に包括的に置換することにより、 ＮＬ６の側鎖が反応触媒作用に関与しているかどうかを検討した(Ｅｎｔｒｙ１０～１５)。その結果、アミロイド形成能力（ＡＰＩ）が、ベンゾイル化の収率と相関していることが示唆された。特に、ＮＬ６のＧｌｙをアラニン残基に置換したＥｎｔｒｙ１２では、収率８１％が得られた。
【0079】
しかしながら、一方で、興味深いことに、Ｅｎｔｒｙ２のペプチドでは、ＡＰＩが比較的高いにもかかわらず収率が低い結果となっており、これは、ベンゾイル化反応の進行のためには、アミロイド形成能だけでは十分ではなく、ＮＬ６配列における「－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ」側鎖部分が、反応を促進するために重要な役割を果たしていることを示している。
【0080】
さらに、ペプチド配列中の一級アミド (Ａｓｎ) をカルボン酸 (Ａｓｐ) に置換すると、アミロイド形成能と触媒活性の両方が失われることが分かった(Ｅｎｔｒｙ１１)。
【0081】
これらの結果は、アミロイド生成能が触媒活性の必要条件ではあるが十分条件ではないことを示唆している。アミロイド触媒を添加する代わりにｐＨを塩基性にした緩衝条件下では、アミノ基のベンゾイル化は高収率で達成されなかったことは、本発明の優位性を示している。
【0082】
［種々の基質のベンゾイル化］
次に、基質として、化合物１に加えて、図３に示す種々の構造を有する化合物について、同様にアミノ基修飾反応を行った。図３に、その収率を示す。図中の「ＩＣ５０」は、これら基質化合物をＮＬ６アミロイドに添加した場合に、ＴｈＴ蛍光強度が半減する基質濃度を意味し、アミロイドに対する結合親和性の指標である。
次に、基質として、化合物１に加えて、図３に示す種々の構造を有する化合物について、同様にアミノ基修飾反応を行った。図３に、その収率を示す。図中の「ＩＣ５０」は、これら基質化合物をＮＬ６アミロイドに添加した場合に、ＴｈＴ蛍光強度が半減する基質濃度を意味し、アミロイドに対する結合親和性の指標である。
【0083】
化合物１から４’-ジメチルアミノ置換基を削除した化合物１ａは、アミロイドに対する親和性が低下(IC50 = 1.5μM)するとともに、収率が４０％に低下した。アゾベンゼンとアルキルアミンの間の結合をエステルからアニリドに変更した化合物１ｂは親和性及び収率がほぼ維持された一方、エステルからアミドへ変更した化合物１ｃでは、親和性及び収率が低下した。
【0084】
これらの結果は、基質とアミロイド触媒との結合を駆動力として反応が進行するメカニズムを示唆している。対照として、 ＮＬ６アミロイドへの結合能力を持たないＮ－Ｆｍｏｃ－１，４－ブタンジアミン（ＩＣ ５０ ＞１ｍＭ ）を基質として用いた場合には、極微量のベンゾイル化生成物しか与えなかった。
【0085】
また、化合物１において、アルキルアミンの結合位置をアゾ基へのパラ位から、メタ位やオルト位に変更した化合物２ａ及び２ｂでは、アミロイドに対する親和性は維持されたにも関わらず、収率がそれぞれ３５％及び２４％に低下した。これらの結果は、アミロイド結合モチーフ部位からのアミン伸長の方向が、アミロイド触媒による活性化効率にとって重要であることを示唆している。
【0086】
次に、スペーサーの影響を検討するために、図４に示す種々の基質化合物についても、ベンゾイル化反応の収率を求めた。その結果、エーテル鎖に変更したり（化合物３ａ）、長さを短くしても（化合物３ｂ）、ほとんど収率に影響を与えないことが分かった。また、スペーサーの種類を変更しても（化合物３ｃ～３ｅ）、反応の進行においては許容されることが分かった。
【0087】
これらの結果について、ＮＬ６アミロイドに対する基質の親和性(ＩＣ５０)に対する反応収率 (％)をプロットした結果を図５に示す。これら２つの因子が十分に相関していることが示された。
【0088】
［他の修飾の反応への展開］
次に、ベンゾイル化反応以外にも、他のアミノ基の修飾反応に適用可能であることを検証した。具体的には、ＮＬ６アミロイドの存在下で、化合物１と、図６の（i）～(iii)の記載の化合物（第２の化合物に相当）との反応を行った。反応（i）は、2,4-ジニトロフルオロベンゼンを用いたアリール基の付加である。反応（ii）は、2-エチニルベンズアルデヒドを用いることで、イミン形成とそれに続く環化により、Ｎ－アルキル化イソキノリニウム塩が得られた。反応(iii)は、ベンズアルデヒドとシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用した還元的アミノ化によるアルキル化である。図６のグラフに示すように、いずれの場合も、アミロイドが存在しない場合は反応が進行しないのに対し、アミロイド触媒を用いることで、それぞれ５６％、３３％、６８％の収率が得られた。
次に、ベンゾイル化反応以外にも、他のアミノ基の修飾反応に適用可能であることを検証した。具体的には、ＮＬ６アミロイドの存在下で、化合物１と、図６の（i）～(iii)の記載の化合物（第２の化合物に相当）との反応を行った。反応（i）は、2,4-ジニトロフルオロベンゼンを用いたアリール基の付加である。反応（ii）は、2-エチニルベンズアルデヒドを用いることで、イミン形成とそれに続く環化により、Ｎ－アルキル化イソキノリニウム塩が得られた。反応(iii)は、ベンズアルデヒドとシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用した還元的アミノ化によるアルキル化である。図６のグラフに示すように、いずれの場合も、アミロイドが存在しない場合は反応が進行しないのに対し、アミロイド触媒を用いることで、それぞれ５６％、３３％、６８％の収率が得られた。
【0089】
５．反応機構の検証
本発明の反応機構を検証するアミロイド触媒の結晶学的解析を行った。Ｘ線結晶構造解析に適したＮＬ６の結晶は得られなかったが、Ｎ末端のアセチル基の代わりに、かさ高いピバロイル基を導入した誘導体（ｐＮＬ）では、ギ酸溶媒から細長く針状の結晶が得られた（図７）。
本発明の反応機構を検証するアミロイド触媒の結晶学的解析を行った。Ｘ線結晶構造解析に適したＮＬ６の結晶は得られなかったが、Ｎ末端のアセチル基の代わりに、かさ高いピバロイル基を導入した誘導体（ｐＮＬ）では、ギ酸溶媒から細長く針状の結晶が得られた（図７）。
【0090】
［Piv-NFGAIL-NH 2のX線結晶構造決定］
アミロイド形成性ペプチドＰｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２をギ酸に溶解し、低速蒸発法により結晶を得た。結晶を、２０％エチレングリコールを含むギ酸に浸漬して凍結保護し、液体窒素で瞬間凍結した。Ｘ線回折データから、初期構造は、膵島アミロイドポリペプチド（アミリン）のＮＮＦＧＡＩＬセグメントの結晶構造から最初のアスパラギン残基を除いたＮＦＧＡＩＬの構造を検索モデルとして、Ｐｈａｓｅｒで分子置換することにより得られた。最終構造の品質は ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ でアクセスしました。
アミロイド形成性ペプチドＰｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２をギ酸に溶解し、低速蒸発法により結晶を得た。結晶を、２０％エチレングリコールを含むギ酸に浸漬して凍結保護し、液体窒素で瞬間凍結した。Ｘ線回折データから、初期構造は、膵島アミロイドポリペプチド（アミリン）のＮＮＦＧＡＩＬセグメントの結晶構造から最初のアスパラギン残基を除いたＮＦＧＡＩＬの構造を検索モデルとして、Ｐｈａｓｅｒで分子置換することにより得られた。最終構造の品質は ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ でアクセスしました。
【0091】
［フィブリル-基質1複合体の分子ドッキングシミュレーション］
結晶全体の最小部分である非対称単位は、Ｐｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２分子と1つのギ酸分子で構成される。結晶内のＰｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２分子の集合体を手動で抽出することにより、Coot6を使用して推定Ｐｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２フィブリル構造を生成した。この構造は、3つのＰｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２ 分子によって形成されるフィブリル伸長軸に沿ったスタッキング ユニットで構築される。
結晶全体の最小部分である非対称単位は、Ｐｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２分子と1つのギ酸分子で構成される。結晶内のＰｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２分子の集合体を手動で抽出することにより、Coot6を使用して推定Ｐｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２フィブリル構造を生成した。この構造は、3つのＰｉｖ－ＮＦＧＡＩＬ－ＮＨ２ 分子によって形成されるフィブリル伸長軸に沿ったスタッキング ユニットで構築される。
【0092】
誘導体ｐＮＬは、アミロイド生成能（ＡＰＩ＝５）および触媒活性（収率２９％）であった。ｐＮＬの結晶は、 Ｘ線結晶解析に適しており、原子分解能で構造が得られた（図７Ｂ）。ｐＮＬの結晶構造は、 8つのアミド結合 (Ａｓｎ側鎖を含む) のうち7つが、繊維軸に沿った水素結合の形成を通じてアミロイド構造の構築に関与していることを示している (図７Ｃ及びＤ)。一方、ＰｈｅとＧｌｙの間のアミド結合は、カルボニル酸素原子は、ギ酸との水素結合を形成する繊維軸ではなく、溶媒にさらされた領域に向かって配向する。ｐＮＬの結晶構造への化合物１のドッキング解析は、反応部位としての化合物１のアミノ基がＰｈｅ－Ｇｌｙアミドのカルボニル酸素の十分近くに位置し、水素結合の形成が可能であることを示している（図７Ｃ及びＤ）。
【0093】
２種類のアミド結合の存在を確認するために、アミドとは異なりエステル結合が水素結合供与体を失う、アミドからエステルへの置換を行った。ＮＬ６の ＡｓｎとＰｈｅの間のアミド結合をエステル結合に置換した場合(ＮＯ)、 アミロイド形成はできなかった(図８) 。この結果は、ＮＬ６のＡｓｎとＰｈｅの間のアミド結合が、アミロイド形成に重要な水素結合を形成することを裏付けるものである。対照的に、ＰｈｅとＧｌｙの間のアミドをエステル結合に置換した場合(ＦＯ) 、ＮＬ６のアミロイド形成能を保持しており(ＡＰＩ＞6)、これはＰｈｅ－Ｇｌｙアミド結合がアミロイド形成に関与していないという結晶構造からの解釈と一致する。
【0094】
しかし、ＦＯでは、アミロイド形成能は維持されているにもかかわらず、 化合物１のＮ-ベンゾイル化の触媒活性はＮＬ６と比較して著しく低下していた(収率 = 21% 、図８)。 エステルのカルボニル酸素は、アミドよりも弱い水素結合受容体であると報告されている。したがって、ＦＯの場合の低収率は、 ＮＬ６のＰｈｅ－Ｇｌｙアミドのカルボニル酸素が、アミン修飾に必要な化合物１の脱プロトン化に重要な役割を果たしていることを裏付けるものである。ＮＯでは、アミロイド形成能の欠如により触媒活性を失った。
【0095】
６．混合反応系での検証
混合反応系における選択性の結果を図９に示す。本質的に同等のアミン官能基の反応性を有する化合物１および化合物２ｂの競合的ベンゾイル化を、アミロイド触媒存在化 (条件１)、高ｐＨ 緩衝液 (条件２、３)、および塩基と溶媒 (条件４，５) の各条件で行った。条件２～５では、ベンゾイル化生成物１－Ｂｚ と２ｂ－Ｂｚの比率は、ほぼ１：１だったが、アミロイド触媒存在化の条件１では、１－Ｂｚの収率は２ｂ－Ｂｚの収率の５倍となった。
混合反応系における選択性の結果を図９に示す。本質的に同等のアミン官能基の反応性を有する化合物１および化合物２ｂの競合的ベンゾイル化を、アミロイド触媒存在化 (条件１)、高ｐＨ 緩衝液 (条件２、３)、および塩基と溶媒 (条件４，５) の各条件で行った。条件２～５では、ベンゾイル化生成物１－Ｂｚ と２ｂ－Ｂｚの比率は、ほぼ１：１だったが、アミロイド触媒存在化の条件１では、１－Ｂｚの収率は２ｂ－Ｂｚの収率の５倍となった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
