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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024118298
(43)【公開日】2024-08-30
(54)【発明の名称】オートファジー抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/88 20060101AFI20240823BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20240823BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240823BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20240823BHJP
A61K 125/00 20060101ALN20240823BHJP
【ＦＩ】
A61K36/88
A61K31/7048
A61P43/00 105
A61P35/00
A61K125:00
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023024652
(22)【出願日】2023-02-20
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小野 茂之
(72)【発明者】
【氏名】川崎 彰子
(72)【発明者】
【氏名】峯岸 慶彦
【テーマコード（参考）】
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA10
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB21
4C086ZB26
4C088AB71
4C088AC12
4C088BA10
4C088BA31
4C088ZB21
4C088ZB26
(57)【要約】
【課題】オートファジーを抑制するオートファジー抑制剤を提供する。
【解決手段】スピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を有効成分とするオートファジー抑制剤。
【選択図】なし
【解決手段】スピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を有効成分とするオートファジー抑制剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を有効成分とするオートファジー抑制剤。
【請求項2】
スピラクレオシドを含む植物抽出物がブッチャーブルーム抽出物である、請求項１記載のオートファジー抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はオートファジー抑制剤に関する。
【背景技術】
【0002】
オートファジーは細胞内において、その恒常性を維持するための機構として非常に重要であることが理解されている（非特許文献１）。すなわち、細胞の活動に伴って、あるいは外界からの刺激によって傷害を受けた細胞内小器官（例えば、ミトコンドリア）やタンパク質等を消化することで、細胞内を正常な状態に保つ役割をしている。
【0003】
一方、がんとの関係においては、がん化を誘発するような傷害分子等が発生した際には、オートファジーが機能することで、そのような傷害分子を分解（消化）することにより、未然にがんの発生を防いでいる。
【0004】
しかし、がん（腫瘍）が形成されてしまった場合、特に進行がんの場合には、オートファジーは好ましくない作用をする（非特許文献１）。腫瘍細胞は増殖速度が速いため、十分な血管新生が行われないので、代謝ストレス（低酸素、低グルコース）下にある。その結果、それを回避するためにオートファジーを活性化することで、生存に必要なアミノ酸等を調達して、がん細胞の生存、増殖を維持している。従って、進行がんを治療する方法の１つとして、活性化しているオートファジーを抑制することが注目されている。
【0005】
例えば、代表的なオートファジー抑制剤として知られているクロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）やヒドロキシクロロキン（Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）を抗がん剤と併用することにより、抗腫瘍効果を高めることを目的とした臨床研究が進められている（非特許文献１、２）。しかしながら、たとえば、ヒドロキシクロロキンを用いた抗がん療法における薬物動態学－薬理学研究からは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでオートファジー抑制効果が認められる高マイクロモル濃度（１０μＭ＜）では、一貫してヒトにおいては適用できないことが指摘されている（非特許文献３）。
そのような状況から、より低濃度で効果のあるオートファジー抑制剤の開発が望まれていた。
そのような状況から、より低濃度で効果のあるオートファジー抑制剤の開発が望まれていた。
【0006】
スピラクレオシド（ｓｐｉｌａｃｌｅｏｓｉｄｅ）は、ブッチャーブルーム（Ｂｕｔｃｈｅｒ’ｓ ｂｒｏｏｍ）から単離・同定されたステロイドサポニンであり（非特許文献４）、角層の剥離を促進するカテプシンＤの発現促進作用を有することが知られている（特許文献１）。
【0007】
しかしながら、スピラクレオシドやブッチャーブルームがオートファジーを抑制することはこれまでに全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２００４－１５５６６３号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】「オートファジー－生命をささえる細胞の自己分解システム」、水島昇、吉森保 編、（株）化学同人、2012年
【非特許文献2】Buzun K et al. Autophagy modulators in cancer therapy. Int J Mol Sci. 2021;22:5804
【非特許文献3】McAfee Q et al. Autophagy inhibitor Lys05 has single-agent antitumor activity and reproduces the phenotype of a genetic autophagy deficiency. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:8253-8258
【非特許文献4】Kameyama A et al. Isolation and structural determination of spilacleosides A and B having a novel 1,3-dioxolan-4-one ring. Tetrahedron Lett 44: 2737-2739 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、オートファジー抑制剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、オートファジーを抑制する物質を探索した結果、スピラクレオシドにオートファジーを抑制する作用があり、これがオートファジー抑制剤となり得ることを見出した。
【0012】
すなわち、本発明は、スピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又はその画分を有効成分とするオートファジー抑制剤に係るものである。
【発明の効果】
【0013】
本発明のオートファジー抑制剤によれば、低濃度で優れたオートファジー抑制効果を発揮し得る。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】単離されたスピラクレオシド溶液の１３Ｃ－ＮＭＲ及び１Ｈ－ＮＭＲ測定値（６００ＭＨｚ，測定溶媒：ｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｄ５））。
【図2】オートファジー抑制剤として作用するスピラクレオシド及びＬＣ３－IIを指標とするスピラクレオシドのオートファジー抑制効果（ウェスタンブロット）。
【図3】オートファジー抑制剤として作用するブッチャーブルーム抽出物及びＬＣ３－IIを指標とするブッチャーブルーム抽出物のオートファジー抑制効果（ウェスタンブロット）。
【図4】ＣＱのＬＣ３－IIを指標とするオートファジー抑制効果（ウェスタンブロット）。
【図5】ＨＣＱのＬＣ３－IIを指標とするオートファジー抑制効果（ウェスタンブロット）。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明において、「スピラクレオシド」（ｓｐｉｌａｃｌｅｏｓｉｄｅ）とは、下記の式（１）で表されるスピラクレオシドＡ、式（２）で表されるスピラクレオシドＢ、又は、これらの混合物を指す。
【0016】
【化1】
【0017】
スピラクレオシドは、例えばユリ科ナギイカダ属の植物であるブッチャーブルーム（和名ナギイカダ、学名Ｒｕｓｃｕｓ Ａｃｕｌｅａｔｕｓ Ｌ．）から抽出し、分離精製することにより取得できる（前記特許文献１参照）。例えば、ブッチャーブルームの抽出物をスチレン－ビニルベンゼン系合成吸着剤、アクリル系合成吸着剤等に吸着させ、目的物以外の成分を除去した後，目的物を含む画分を適切な溶媒を用いて吸着剤から溶出させる。その後、シリカゲル等を担体とする逆相カラム、又は、ジオール構造を有する官能基を結合したシリカゲルを担体とするゲルろ過用カラム等を備えた中圧、又は、高速液体クロマトグラフィーで分画することにより、単離することができる。
【0018】
本発明において、スピラクレオシドを含む植物抽出物としては、例えばブッチャーブルームの抽出物が挙げられる。ブッチャーブルームの抽出物としては、スピラクレオシドが含有される抽出物であればよいが、ブッチャーブルームの根、根茎、葉等から溶媒抽出法により抽出された抽出物であるのが好ましい。
【0019】
抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、１－ペンタノール、１－ヘキサノール、１－ヘプタノール、１－オクタノール等の１価アルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、１,３－ブチレングリコール、１,４－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール ２００、ポリエチレングリコール ３００、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル（セロソルブ）、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（エチルカルビトール）等のグリコール類、又は、グリコールのモノエーテル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状、又は、環状のエーテル類；ヘキサン、シクロヘキサン等の鎖状、又は、環状の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、二酸化炭素、超臨界二酸化炭素、油脂、ワックス、その他のオイル類が挙げられる。これら上述の抽出のための溶媒は、一種、又は、二種以上を組み合わせて使用することができる。物性（抽出効率、安定性）、安全性、及び汎用性の点から、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、１－ペンタノール、１－ヘキサノール、１－オクタノール等の炭素数１～８の１価アルコール類、プロピレングリコール、１、３－ブチレングリコール、１、４－ブチレングリコール、セロソルブ、エチルカルビトールがより好ましく、１価アルコール類、又は、その水溶液がより好ましく、さらにエタノール水溶液が好ましい。
１価アルコール類水溶液におけるアルコール濃度（ｖ／ｖ）は、好ましくは０．１％以上、より好ましくは１％以上、さらに好ましくは１０％以上であり、かつ好ましくは９９．９％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である。又、好ましくは１～７０％、より好ましくは１０～６０％、さらに好ましくは２０～５０％である。
エタノール水溶液の濃度（ｖ／ｖ）としては、好ましくは１～９９．９％が挙げられ，より好ましくは１０～７０％，さらに好ましくは２０～４０％が挙げられる。
１価アルコール類水溶液におけるアルコール濃度（ｖ／ｖ）は、好ましくは０．１％以上、より好ましくは１％以上、さらに好ましくは１０％以上であり、かつ好ましくは９９．９％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である。又、好ましくは１～７０％、より好ましくは１０～６０％、さらに好ましくは２０～５０％である。
エタノール水溶液の濃度（ｖ／ｖ）としては、好ましくは１～９９．９％が挙げられ，より好ましくは１０～７０％，さらに好ましくは２０～４０％が挙げられる。
【0020】
抽出溶媒の使用量は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されないが、例えば、ブッチャーブルーム乾燥物１ｇに対し、１～１０００ｍＬ、好ましくは５～１００ｍＬ等を例示することができる。
抽出条件は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されない。抽出期間（時間）は、例えば、１時間以上、好ましくは１日以上、３０日間以下、好ましくは１４日間以下等を例示することができる。抽出温度は、０℃以上、使用する溶媒の沸点以下で実施することが好ましく、より好ましくは常温から使用溶媒の沸点以下の温度範囲を例示することができる。ただし、加圧条件下において実施する場合には、抽出温度は使用溶媒の沸点に限定されることなく、抽出効率に鑑みて適宜、最適な温度を設定することができる。
抽出条件は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されない。抽出期間（時間）は、例えば、１時間以上、好ましくは１日以上、３０日間以下、好ましくは１４日間以下等を例示することができる。抽出温度は、０℃以上、使用する溶媒の沸点以下で実施することが好ましく、より好ましくは常温から使用溶媒の沸点以下の温度範囲を例示することができる。ただし、加圧条件下において実施する場合には、抽出温度は使用溶媒の沸点に限定されることなく、抽出効率に鑑みて適宜、最適な温度を設定することができる。
【0021】
抽出手段は、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、加圧加熱抽出、蒸留、超臨界抽出等の通常の手段を用いることができる。
【0022】
抽出物は、例えば医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。又、必要に応じて、液液分配、固液分配、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
【0023】
本発明において、スピラクレオシドを含む植物抽出物の画分としては、上記植物抽出物について、公知の分離精製方法を適宜組み合わせて、スピラクレオシドの濃度・割合を高めた画分が挙げられる。ここで、分離精製手段としては、例えば、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜分離、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【0024】
上記の抽出物、又は、その画分はそのまま用いることもできるが、当該抽出物、又は、その画分を希釈、濃縮、若しくは凍結乾燥した後、粉末、又は、ペースト状に調製して用いることもできる。又、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、エタノール水溶液等の溶剤で溶解・希釈して用いることもできる。又、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【0025】
後記実施例に示すように、スピラクレオシド、又は、スピラクレオシドを含むブッチャーブルーム抽出物は、ヒト表皮角化細胞におけるオートファジーを抑制する作用（オートファジーの抑制）を有する。
なお，「オートファジーの抑制」には、基底状態のオートファジー活性の阻害やオートファジーの各プロセスの阻害（例えば，オートファゴソーム形成の抑制）等も包含されるが、本発明において、「オートファジーの抑制」という場合には、オートファゴソームとリソソームの融合によるオートリソソームの形成を阻害することを意味する。
従って、スピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を、動物、好ましくはヒトに投与することによりオートファジーの抑制が可能となる。前述したとおり、オートファジーを抑制することは、がんの治療に有用である。
なお，「オートファジーの抑制」には、基底状態のオートファジー活性の阻害やオートファジーの各プロセスの阻害（例えば，オートファゴソーム形成の抑制）等も包含されるが、本発明において、「オートファジーの抑制」という場合には、オートファゴソームとリソソームの融合によるオートリソソームの形成を阻害することを意味する。
従って、スピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を、動物、好ましくはヒトに投与することによりオートファジーの抑制が可能となる。前述したとおり、オートファジーを抑制することは、がんの治療に有用である。
【0026】
すなわち、スピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分は、オートファジーを抑制するためのオートファジー抑制剤となり、又、これを製造するために使用できる。当該オートファジー抑制剤は、単独、又は、抗がん剤と併用することより、がん治療に使用することができる。
ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又は、それらに由来する検体における使用であり得、又、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療、又は、診断する方法を含まない概念、より具体的には医師、又は、医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療、又は、診断を実施する方法を含まない概念である。
ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又は、それらに由来する検体における使用であり得、又、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療、又は、診断する方法を含まない概念、より具体的には医師、又は、医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療、又は、診断を実施する方法を含まない概念である。
【0027】
本発明のオートファジー抑制剤は、オートファジー抑制作用を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品となり、又、当該医薬品、医薬部外品、食品に配合して使用される素材、又は、製剤となり得る。
なお、当該食品には、オートファジー抑制効果をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが包含される。
なお、当該食品には、オートファジー抑制効果をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが包含される。
【0028】
本発明のオートファジー抑制剤を医薬品（医薬部外品を含む）として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤（軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤等）等による非経口投与が挙げられる。非経口投与としては、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与等が挙げられるが注射投与が好ましい。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられる。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のスピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を単独で、又は、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のスピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を単独で、又は、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
【0029】
本発明のオートファジー抑制剤を食品として用いる場合、当該食品の形態は、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料などの各種食品組成物の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明のスピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を単独で、又は、他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明のスピラクレオシド、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その画分を単独で、又は、他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【0030】
本発明のオートファジー抑制剤におけるスピラクレオシドの含有量（ｗ／ｗ）は、好ましくは０．００１％以上、より好ましくは０．０１％以上、且つ好ましくは１００％以下、より好ましくは５０％以下であり、より好ましくは１０％以下であり、又、好ましくは０．００１～５０％、より好ましくは０．０１～２０％、より好ましくは０．０１～１０％である。又、スピラクレオシドを含む植物抽出物、又は、その分画物においては、その乾燥物中に含有されるスピラクレオシド量が、上記含有量に一致するように調製して配合され得る。
【0031】
本発明のオートファジー抑制剤の投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢、又は、その他の要因に従って変動し得るが、経口投与、又は、摂取の場合成人（体重６０Ｋｇ）１人当たり、スピラクレオシドとして、１日あたり、好ましくは０．０００１ｇ以上、より好ましくは０．０００２ｇ以上であり、より好ましくは０．０００５ｇ以上であり、且つ好ましくは５ｇ以下、より好ましくは４ｇ以下、より好ましくは３ｇ以下である。又、１日あたり好ましくは０．０００５～５ｇ、より好ましくは０．００１～２ｇである。
【0032】
また、本発明のオートファジー抑制剤の投与対象者としては、例えばがん患者が挙げられる。
【実施例0033】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【0034】
製造例１ ブッチャーブルーム抽出物の調製
ナギイカダ（Ｒｕｓｃｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ Ｌ．）の乾燥根茎を細切りし、その１５ｋｇに３０％エタノール（ｖ／ｖ）を１５０Ｌ加え、室温下、時々攪拌しながら１週間抽出を行った後、ろ過した。ろ液をＨＰ－２０樹脂カラム（担体量＝２０Ｌ）に吸着し、５０％エタノール ６０Ｌで洗浄後、９９．５％エタノール ６０Ｌで活性成分を含む吸着物を溶出させた。溶出液に活性炭を適量加え、室温で３時間攪拌した。メンブレンフィルターで活性炭を除去後、ろ液を減圧濃縮してエキスパウダー２５０ｇを得た。
エキスパウダーを固形分含量が１％（ｗ／ｖ）となるように３０％エタノールへ溶解して、ブッチャーブルーム抽出物を調製した。
ナギイカダ（Ｒｕｓｃｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ Ｌ．）の乾燥根茎を細切りし、その１５ｋｇに３０％エタノール（ｖ／ｖ）を１５０Ｌ加え、室温下、時々攪拌しながら１週間抽出を行った後、ろ過した。ろ液をＨＰ－２０樹脂カラム（担体量＝２０Ｌ）に吸着し、５０％エタノール ６０Ｌで洗浄後、９９．５％エタノール ６０Ｌで活性成分を含む吸着物を溶出させた。溶出液に活性炭を適量加え、室温で３時間攪拌した。メンブレンフィルターで活性炭を除去後、ろ液を減圧濃縮してエキスパウダー２５０ｇを得た。
エキスパウダーを固形分含量が１％（ｗ／ｖ）となるように３０％エタノールへ溶解して、ブッチャーブルーム抽出物を調製した。
【0035】
製造例２ ブッチャーブルーム抽出物中の活性成分の分画と同定
ブッチャーブルーム抽出物の調製過程で得たエキスパウダー２ｇを、シリカゲルカラム（山善、ユニバーサルカラムＰｒｅｍｉｕｍ）によりクロロホルム／メタノールを用いて分画し、活性画分（１）を０．２１ｇ得た。画分（１）の９７．５ｍｇを用い２回目のシリカゲルカラム分画を行い、活性画分（２）を５６．５ｍｇ得た。活性画分（２）の２６ｍｇを用い３回目のシリカゲルカラム分画を行い、活性画分（３）を１１．６ｍｇ得た。さらに、活性画分（３）の５．２ｍｇを用い分取ＨＰＬＣ（化学物質評価研究機構製、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ２：１０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：０．１％ギ酸水溶液、溶離液Ｂ：アセトニトリル）により分画・精製を進め、活性画分（４）を１．９ｍｇ得た（エキスパウダーからの収率０．９％）。活性画分（４）をＮＭＲで構造解析したところ、ブッチャーブルーム抽出物中の活性成分はスピラクレオシド（Ｓｐｉｌａｃｌｅｏｓｉｄｅ）であると同定された。
スピラクレオシドの構造式に付した炭素番号にもとづく１３Ｃ－ＮＭＲ及び１Ｈ－ＮＭＲの結果を図１に示す。尚，上述したように、スピラクレオシドには、スピラクレオシドＡ及びＢが知られており、本発明の構造解析からはそれらを判別することはできてはいない。しかし、どちらの場合においても、構造式中に付される炭素番号は同一となるので、図１では、スピラクレオシドＡを用い示している。
又、単離収率より、ブッチャーブルーム抽出物中のスピラクレオシドの濃度は０．０８３ｍＭ（８３μＭ）と算出された。
ブッチャーブルーム抽出物の調製過程で得たエキスパウダー２ｇを、シリカゲルカラム（山善、ユニバーサルカラムＰｒｅｍｉｕｍ）によりクロロホルム／メタノールを用いて分画し、活性画分（１）を０．２１ｇ得た。画分（１）の９７．５ｍｇを用い２回目のシリカゲルカラム分画を行い、活性画分（２）を５６．５ｍｇ得た。活性画分（２）の２６ｍｇを用い３回目のシリカゲルカラム分画を行い、活性画分（３）を１１．６ｍｇ得た。さらに、活性画分（３）の５．２ｍｇを用い分取ＨＰＬＣ（化学物質評価研究機構製、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ２：１０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ：０．１％ギ酸水溶液、溶離液Ｂ：アセトニトリル）により分画・精製を進め、活性画分（４）を１．９ｍｇ得た（エキスパウダーからの収率０．９％）。活性画分（４）をＮＭＲで構造解析したところ、ブッチャーブルーム抽出物中の活性成分はスピラクレオシド（Ｓｐｉｌａｃｌｅｏｓｉｄｅ）であると同定された。
スピラクレオシドの構造式に付した炭素番号にもとづく１３Ｃ－ＮＭＲ及び１Ｈ－ＮＭＲの結果を図１に示す。尚，上述したように、スピラクレオシドには、スピラクレオシドＡ及びＢが知られており、本発明の構造解析からはそれらを判別することはできてはいない。しかし、どちらの場合においても、構造式中に付される炭素番号は同一となるので、図１では、スピラクレオシドＡを用い示している。
又、単離収率より、ブッチャーブルーム抽出物中のスピラクレオシドの濃度は０．０８３ｍＭ（８３μＭ）と算出された。
【0036】
製造例２ スピラクレオシド溶液の調製
製造例１で得られた画分（４）１ｍｇを３０％エタノール １０．５８ｍＬに溶解しスピラクレオシド溶液を調製した（スピラクレオシドの濃度＝８３μＭ）。
製造例１で得られた画分（４）１ｍｇを３０％エタノール １０．５８ｍＬに溶解しスピラクレオシド溶液を調製した（スピラクレオシドの濃度＝８３μＭ）。
【0037】
実施例１ オートファジー抑制剤として作用するスピラクレオシド溶液及びＬＣ３－IIを指標としたスピラクレオシド溶液のオートファジー抑制効果
本発明において、ある素材がオートファジー抑制剤であるか否かは、以下に示すオートファジーの代表的なマーカーの１つであるＬＣ３－IIを用いたフラックスアッセイ（ｆｌuｘ ａｓｓａｙ）によって評価した。
ＬＣ３タンパク質は，オートファジーが促進されるとＬＣ３－ＩからＬＣ３－IIに変換され、ＬＣ３－IIの発現量が増加する。しかし、ＬＣ３－IIは、オートファジーが誘導されると発現量が増加する一方で、オートファジーの進行に伴って分解される。このことは、ある素材がＬＣ３－IIを増加させたからといって、必ずしもオートファジーが促進されていることを意味しない。そこで、この特徴を勘案し、ある素材のオートファジー促進の有無を検討する方法として、ＬＣ３－IIを用いたウェスタンブロット法によるフラックスアッセイが広く利用されている（Mizushima N, Yoshimori T (2007) How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545）。具体的には、ある素材のオートファジー検討条件下に、オートファゴソームとリソソームの融合を阻害（オートリソソームの形成を阻害）する薬剤（クロロキン（ＣＱ）、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、バフィロマイシンＡ１等の阻害剤、すなわち、オートファジー抑制剤）を添加することにより、ＬＣ３－IIのバンド強度への影響を観察する。その際、阻害剤未添加系に比較して、阻害剤添加系のＬＣ３－IIのバンド強度がさらに増加した場合はオートファジーを促進していることを（オートファジー促進剤であることを）、逆に、ＬＣ３－IIのバンド強度が変化しない、増加しない場合はオートファジーを抑制していることを（オートファジー抑制剤であることを）示している。
従って、本発明では、スピラクレオシド溶液、及びブッチャーブルーム抽出物がオートファジー抑制剤であることを、ＨＣＱを用いたフラックスアッセイによって、又、スピラクレオシド溶液、ブッチャーブルーム抽出物、及びオートファジー抑制剤であることが確立されているＣＱ、ＨＣＱのオートファジー抑制効果は、ウェスタンブロットにおけるそれらのＬＣ３－IIのバンド強度をそれぞれの対照と比較することで評価した。
本発明において、ある素材がオートファジー抑制剤であるか否かは、以下に示すオートファジーの代表的なマーカーの１つであるＬＣ３－IIを用いたフラックスアッセイ（ｆｌuｘ ａｓｓａｙ）によって評価した。
ＬＣ３タンパク質は，オートファジーが促進されるとＬＣ３－ＩからＬＣ３－IIに変換され、ＬＣ３－IIの発現量が増加する。しかし、ＬＣ３－IIは、オートファジーが誘導されると発現量が増加する一方で、オートファジーの進行に伴って分解される。このことは、ある素材がＬＣ３－IIを増加させたからといって、必ずしもオートファジーが促進されていることを意味しない。そこで、この特徴を勘案し、ある素材のオートファジー促進の有無を検討する方法として、ＬＣ３－IIを用いたウェスタンブロット法によるフラックスアッセイが広く利用されている（Mizushima N, Yoshimori T (2007) How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545）。具体的には、ある素材のオートファジー検討条件下に、オートファゴソームとリソソームの融合を阻害（オートリソソームの形成を阻害）する薬剤（クロロキン（ＣＱ）、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、バフィロマイシンＡ１等の阻害剤、すなわち、オートファジー抑制剤）を添加することにより、ＬＣ３－IIのバンド強度への影響を観察する。その際、阻害剤未添加系に比較して、阻害剤添加系のＬＣ３－IIのバンド強度がさらに増加した場合はオートファジーを促進していることを（オートファジー促進剤であることを）、逆に、ＬＣ３－IIのバンド強度が変化しない、増加しない場合はオートファジーを抑制していることを（オートファジー抑制剤であることを）示している。
従って、本発明では、スピラクレオシド溶液、及びブッチャーブルーム抽出物がオートファジー抑制剤であることを、ＨＣＱを用いたフラックスアッセイによって、又、スピラクレオシド溶液、ブッチャーブルーム抽出物、及びオートファジー抑制剤であることが確立されているＣＱ、ＨＣＱのオートファジー抑制効果は、ウェスタンブロットにおけるそれらのＬＣ３－IIのバンド強度をそれぞれの対照と比較することで評価した。
【0038】
１）細胞培養は、正常ヒト表皮角化細胞を購入し（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ増殖剤セット（クラボウ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で行った。
細胞は、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌ培養プレートに播種し、ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔの状態（約８０％）まで培養した。その後、細胞培地をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ増殖剤（５種類）からヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＦＧ）及びウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）以外の添加剤を加えた培地に交換し、さらに２４時間培養した。以後の実験は、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ増殖剤（５種類）からヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＦＧ）及びウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）以外の添加剤を加えた培地に再度、交換した後に行った。
細胞は、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌ培養プレートに播種し、ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔの状態（約８０％）まで培養した。その後、細胞培地をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ増殖剤（５種類）からヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＦＧ）及びウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）以外の添加剤を加えた培地に交換し、さらに２４時間培養した。以後の実験は、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ増殖剤（５種類）からヒト組換え型上皮成長因子（ｈＥＦＧ）及びウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）以外の添加剤を加えた培地に再度、交換した後に行った。
【0039】
２）上記１）で準備した細胞に、（１）対照、（２）ＨＣＱ（ヒドロキシクロロキン硫酸塩、富士フィルム和光純薬）、（３）スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）、（４）ＨＣＱ＋スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）のｗｅｌｌを用意し（ｎ＝３）、（１）には水（ＨＣＱの溶媒）＋３０％エタノール（スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）の溶媒）、（２）には水（ＨＣＱの溶媒）＋３０％エタノール（スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）の溶媒）、（３）には水（ＨＣＱの溶媒）＋スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）、（４）には水（ＨＣＱの溶媒）＋スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）を添加して４８時間培養した。
スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）の培地への添加量は０．１％（ｖ／ｖ）で行った（スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）はスピラクレオシドの８３μＭ濃度の溶液であるので、細胞刺激時の終濃度は８３μＭである）。
その後、（１）には水（ＨＣＱの溶媒）、（２）にはＨＣＱ、（３）には水（ＨＣＱの溶媒）、（４）にはＨＣＱを添加し、さらに２４時間培養した。ＨＣＱは水に溶解して、終濃度が１０μＭになるように添加した。水（ＨＣＱの溶媒）及び３０％エタノール（スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）の溶媒）は、ＨＣＱ、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）それぞれの添加量に相当する量を添加した。
スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）の培地への添加量は０．１％（ｖ／ｖ）で行った（スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）はスピラクレオシドの８３μＭ濃度の溶液であるので、細胞刺激時の終濃度は８３μＭである）。
その後、（１）には水（ＨＣＱの溶媒）、（２）にはＨＣＱ、（３）には水（ＨＣＱの溶媒）、（４）にはＨＣＱを添加し、さらに２４時間培養した。ＨＣＱは水に溶解して、終濃度が１０μＭになるように添加した。水（ＨＣＱの溶媒）及び３０％エタノール（スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）の溶媒）は、ＨＣＱ、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）それぞれの添加量に相当する量を添加した。
【0040】
培養終了後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、１５、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。上清についてＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いタンパク質量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
【0041】
１次抗体はａｎｔｉ－ＬＣ３Ｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、 １：２０００）を、２次抗体はｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ＨＲＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：２０００）を用いた。その後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｙｔｉｖａ）で発色させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い発現量を可視化した。内部標準にはβ－Ａｃｔｉｎ（β－ａｃｔｉｎ（１３Ｅ５） ｒａｂｂｉｔ－ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：５０００）を用いた。
【0042】
３）結果
表１及び図２に示すとおり、ＨＣＱ＋スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）のＬＣ３－IIのバンド強度は、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）単独のＬＣ３‐IIのバンド強度と比較して、有意な差は認められなかった。すなわち、ＨＣＱ＋スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）のＬＣ３－IIのバンド強度は、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）単独のＬＣ３－IIのバンド強度以上には増加していなかった。従って、このことは、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）によってオートファジーが抑制されていること，すなわちスピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）はオートファジー抑制剤であることを意味している。又、調製したスピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）中のスピラクレオシドの濃度は８３μＭで、培地中には０．１％（ｖ／ｖ）で添加されたことより、スピラクレオシドの終濃度は８３ｎＭ（約１００μＭ）である。この濃度において、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）は対照に比較して有意にＬＣ３－IIのバンド強度を増加させた。従って、スピラクレオシドは、少なくとも、８３μＭ（約１００μＭ）以上でオートファジー抑制効果を発揮できることを意味している。さらに、この検討は、ブッチャーブルーム抽出物中のオートファジー抑制効果を示す活性成分がスピラクレオシドであることを示している。
表１及び図２に示すとおり、ＨＣＱ＋スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）のＬＣ３－IIのバンド強度は、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）単独のＬＣ３‐IIのバンド強度と比較して、有意な差は認められなかった。すなわち、ＨＣＱ＋スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）のＬＣ３－IIのバンド強度は、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）単独のＬＣ３－IIのバンド強度以上には増加していなかった。従って、このことは、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）によってオートファジーが抑制されていること，すなわちスピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）はオートファジー抑制剤であることを意味している。又、調製したスピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）中のスピラクレオシドの濃度は８３μＭで、培地中には０．１％（ｖ／ｖ）で添加されたことより、スピラクレオシドの終濃度は８３ｎＭ（約１００μＭ）である。この濃度において、スピラクレオシド溶液（Ｓ溶液）は対照に比較して有意にＬＣ３－IIのバンド強度を増加させた。従って、スピラクレオシドは、少なくとも、８３μＭ（約１００μＭ）以上でオートファジー抑制効果を発揮できることを意味している。さらに、この検討は、ブッチャーブルーム抽出物中のオートファジー抑制効果を示す活性成分がスピラクレオシドであることを示している。
【0043】
【表1】
【0044】
実施例２ オートファジー抑制剤として作用するブッチャーブルーム抽出物及びＬＣ３－IIを指標としたブッチャーブルーム抽出物のオートファジー抑制効果
【0045】
１）実施例１の１）と同様に準備した細胞に、（１）対照、（２）ＨＣＱ、（３）ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）、（４）ＨＣＱ＋ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）のｗｅｌｌを用意し（ｎ＝３）、まず、（１）には水（ＨＣＱの溶媒）＋３０％エタノール（ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の溶媒）、（２）には水（ＨＣＱの溶媒）＋３０％エタノール（ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の溶媒）、（３）には水（ＨＣＱの溶媒）＋ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）、（４）には水（ＨＣＱの溶媒）＋ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）を添加して４８時間培養した。ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の培地への添加量は０．１％（ｖ／ｖ）で行った（細胞を刺激した際のブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の最終固形分濃度は、０．００１％（ｗ／ｖ））。
その後、（１）には水（ＨＣＱの溶媒）、（２）にはＨＣＱ、（３）には水（ＨＣＱの溶媒）、（４）にはＨＣＱを添加し、さらに２４時間培養した。ＨＣＱは水に溶解して、終濃度が１０μＭになるように添加した。水（ＨＣＱの溶媒）及び３０％エタノール（ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の溶媒）は、ＨＣＱ、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）それぞれの添加量に相当する量を添加した。
培養終了後、実施例１と同様に処理して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
その後、（１）には水（ＨＣＱの溶媒）、（２）にはＨＣＱ、（３）には水（ＨＣＱの溶媒）、（４）にはＨＣＱを添加し、さらに２４時間培養した。ＨＣＱは水に溶解して、終濃度が１０μＭになるように添加した。水（ＨＣＱの溶媒）及び３０％エタノール（ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の溶媒）は、ＨＣＱ、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）それぞれの添加量に相当する量を添加した。
培養終了後、実施例１と同様に処理して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
【0046】
２）結果
表２及び図３に示すとおり、ＨＣＱ＋ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）のＬＣ３－IIのバンド強度は、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）単独のＬＣ３－IIのバンド強度と比較して、有意に低下していた。すなわち、ＨＣＱ＋ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）のＬＣ３－IIのバンド強度は、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）単独のＬＣ３－IIのバンド強度以上には増加していなかった。従って、このことは、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）によってオートファジーが抑制されていること、すなわちブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）はオートファジー抑制剤であることを意味している。又、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）からの活性成分の単離・同定検討より、１％（ｗ／ｖ）の固形分を含有するように調製されたブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）中の活性成分スピラクレオシド濃度は約８３μＭと算出されている。ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の培地への添加濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）であるので、フラックスアッセイ中におけるブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の活性成分濃度は８３ｎＭ（約１００ｎＭ）となる。ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）は、この濃度で対照に比較して有意にＬＣ３－IIのバンド強度を増加させたことから、抽出物の状態で、約１００μＭ程のスピラクレオシドを含有していれば、１０００倍に希釈された状態においてもオートファジー抑制効果を発揮できることを意味している。
表２及び図３に示すとおり、ＨＣＱ＋ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）のＬＣ３－IIのバンド強度は、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）単独のＬＣ３－IIのバンド強度と比較して、有意に低下していた。すなわち、ＨＣＱ＋ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）のＬＣ３－IIのバンド強度は、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）単独のＬＣ３－IIのバンド強度以上には増加していなかった。従って、このことは、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）によってオートファジーが抑制されていること、すなわちブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）はオートファジー抑制剤であることを意味している。又、ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）からの活性成分の単離・同定検討より、１％（ｗ／ｖ）の固形分を含有するように調製されたブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）中の活性成分スピラクレオシド濃度は約８３μＭと算出されている。ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の培地への添加濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）であるので、フラックスアッセイ中におけるブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）の活性成分濃度は８３ｎＭ（約１００ｎＭ）となる。ブッチャーブルーム抽出物（ＢＢ）は、この濃度で対照に比較して有意にＬＣ３－IIのバンド強度を増加させたことから、抽出物の状態で、約１００μＭ程のスピラクレオシドを含有していれば、１０００倍に希釈された状態においてもオートファジー抑制効果を発揮できることを意味している。
【0047】
【表2】
【0048】
参考例１ ＣＱ及びＨＣＱのＬＣ３－IIを指標としたオートファジー抑制効果
１）実施例１の１）と同様に準備した細胞に、ＣＱ（富士フィルム和光純薬）の場合はＤＭＳＯに溶解して、又、ＨＣＱの場合は水に溶解して、それぞれ終濃度で、０．１、１、１０μＭになるように添加し、７２時間培養した。対照には、ＣＱの場合には同量のＤＭＳＯを、ＨＣＱの場合には同量の水を添加した。
培養終了後、実施例１と同様に処理して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
２）結果
表３及び図４、表４及び図５に示すとおり、オートファジー抑制剤として知られているＣＱ及びＨＣＱは、１０μＭ濃度で対照に比較して有意にＬＣ３－IIのバンド強度を増加させた。従って、実施例と同条件で検討した場合、ＣＱ及びＨＣＱは約１０μＭからオートファジー抑制効果を示し、スピラクレオシド、ブッチャーブルーム抽出物に比較して、その効果は約１／１００であることを意味している。
１）実施例１の１）と同様に準備した細胞に、ＣＱ（富士フィルム和光純薬）の場合はＤＭＳＯに溶解して、又、ＨＣＱの場合は水に溶解して、それぞれ終濃度で、０．１、１、１０μＭになるように添加し、７２時間培養した。対照には、ＣＱの場合には同量のＤＭＳＯを、ＨＣＱの場合には同量の水を添加した。
培養終了後、実施例１と同様に処理して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
２）結果
表３及び図４、表４及び図５に示すとおり、オートファジー抑制剤として知られているＣＱ及びＨＣＱは、１０μＭ濃度で対照に比較して有意にＬＣ３－IIのバンド強度を増加させた。従って、実施例と同条件で検討した場合、ＣＱ及びＨＣＱは約１０μＭからオートファジー抑制効果を示し、スピラクレオシド、ブッチャーブルーム抽出物に比較して、その効果は約１／１００であることを意味している。
【0049】
【表3】
【0050】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
