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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024118710
(43)【公開日】2024-09-02
(54)【発明の名称】リパーゼの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/20 20060101AFI20240826BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240826BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240826BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240826BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240826BHJP
C11D 3/386 20060101ALI20240826BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240826BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240826BHJP
【ＦＩ】
C12N9/20 ZNA
C12N1/21
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C11D3/386
C12N15/31
C12N15/55
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023025142
(22)【出願日】2023-02-21
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】日置 貴大
(72)【発明者】
【氏名】川原 彰人
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4H003
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC07
4B050DD02
4B050KK03
4B050LL04
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA15X
4B065AA26X
4B065AA41Y
4B065AA57X
4B065AA83X
4B065AA86X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA31
4B065CA57
4H003DA01
4H003DA05
4H003DA13
4H003DA17
4H003EC01
(57)【要約】 （修正有）
【課題】産業上有用なサブファミリーＩ．２に分類されるリパーゼに近縁で、Ｌｉｆに依存せずに活性型で異種発現可能なリパーゼの製造方法の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法。
【請求項2】
前記形質転換微生物がＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌以外の微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記形質転換微生物が大腸菌又はバチルス属細菌である、請求項１記載の方法。
【請求項4】
配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換微生物。
【請求項5】
Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌以外の微生物である、請求項４記載の形質転換微生物。
【請求項6】
大腸菌又はバチルス属細菌である、請求項４記載の形質転換微生物。
【請求項7】
配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リパーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
リパーゼは、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与し、洗浄用途において有用である。
【0003】
細菌由来のバクテリアリパーゼは８つのファミリーに分類される（非特許文献１）。ファミリーＩのリパーゼのうち、サブファミリーＩ．２に分類されるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌由来のリパーゼは産業上有用なリパーゼとして広く利用されている。しかしながら、サブファミリーＩ．２リパーゼは活性型への折りたたみに特異的シャペロン（Ｌｉｐａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｌｄａｓｅ；Ｌｉｆ）を要することが知られており（非特許文献２）、活性型での異種発現に課題がある。Ｌｉｆの共発現によって異種発現が改善することが報告されている（非特許文献３）が、その生産性は低く、異種発現には依然として課題が存在する。
【0004】
サブファミリーＩ．１とサブファミリーＩ．２は同一のｐｆａｍファミリーＰＦ００５６１に属し、これらのサブファミリーのリパーゼは構造・配列上の類似性を有する。サブファミリーＩ．１のリパーゼの多くは、サブファミリーＩ．２のリパーゼと同様にＬｉｆ依存性であることが報告されている（非特許文献２）一方で、サブファミリーＩ．１の中でもＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ由来リパーゼ、Ｐｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属細菌由来リパーゼ、メタゲノム由来リパーゼＬｉｐＣ１２などが活性型への折りたたみをＬｉｆに依存しないこと、及び大腸菌にて活性型で異種発現可能であることが報告されている（非特許文献４～７）。これまで知られているサブファミリーＩ．１ Ｌｉｆ非依存性リパーゼは、単一のクレード（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅ）を形成し、その他にはＬｉｆ非依存性のサブファミリーＩ．１リパーゼは見つかっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Arpigny JL, Jaeger KE. The Biochemical journal 343 Pt 1(Pt 1) (1999): 177-183.
【非特許文献2】Rosenau, Frank, Jan Tommassen, and Karl‐Erich Jaeger. Chembiochem 5.2 (2004): 152-161.
【非特許文献3】Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial Cell Factories 11.1 (2012): 1-12.
【非特許文献4】Alquati, Claudia, et al. European Journal of Biochemistry 269.13 (2002): 3321-3328.
【非特許文献5】Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
【非特許文献6】Ji, Xiuling, et al. Protein expression and purification 115 (2015): 125-131.
【非特許文献7】Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、産業上有用なサブファミリーＩ．２に分類されるリパーゼに近縁で、Ｌｉｆに依存せずに活性型で異種発現可能なリパーゼの製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、バクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１及びＩ．２に分類される広範なリパーゼの由来細菌ゲノムについて網羅的に解析した結果、サブファミリーＩ．１のリパーゼにおいて既存のＬｉｆ非依存性クレードと異なる系統の新規Ｌｉｆ非依存性クレードが存在すること、斯かるクレードに属するリパーゼはＬｉｆに依存せずに活性型で異種発現でき、Ｓｅｃシグナルを有することから分泌発現可能であることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、下記１）～３）に係るものである。
１）配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法。
２）配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換微生物。
３）配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
１）配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法。
２）配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換微生物。
３）配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の効果】
【0009】
本発明のリパーゼの製造方法によれば、Ｌｉｆに依存せずに活性型のリパーゼを異種発現させて効率よく製造することができる。また、斯かるリパーゼは、分泌発現可能で回収が容易であり、洗浄剤組成物などの産業上の応用に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】バクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１及びＩ．２のリパーゼの系統樹。三角マーク及び星マークはそれぞれ由来菌のゲノム中にＬｉｆ様遺伝子が存在しないことを示す。
【図2】バクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１のリパーゼのＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅ及びその近傍の系統樹。三角マークは由来菌のゲノム中にＬｉｆ様遺伝子が存在しないことを示す。
【図3】Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するリパーゼＰｌｉＬｉｐをＬｉｆを伴わずに異種発現させた場合のリパーゼ活性。
【図4】Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するリパーゼＰｓｈＬｉｐをＬｉｆを伴わずに異種発現させた場合のリパーゼ活性。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0012】
本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を指し、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、典型的にはエステラーゼ活性であり、オクタン酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【0013】
本明細書において、「クレード」とは、共通祖先における祖先配列と共通祖先から派生したすべての子孫における配列（現存配列及び現存配列と共通祖先における祖先配列の中間的な祖先配列）とから構成される集団である（evolution.berkeley.edu/evolibrary/article/0_0_0/evo_06）。クレードは系統樹として視覚化することができる。
【0014】
本明細書において、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅ」とは、タンパク質の進化を表す有根系統樹上で、バクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１に分類され、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ又はＰｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓに由来する既知のＬｉｐａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｌｄａｓｅ（Ｌｉｆ）非依存性リパーゼを含むクレードを指す。ここで、Ｌｉｆとはリパーゼの活性型への折りたたみの際に働く特異的シャペロンを指し、Ｌｉｆ依存性リパーゼとは活性型での発現にＬｉｆを要するリパーゼを、Ｌｉｆ非依存性リパーゼとは活性型での発現にＬｉｆを要さないリパーゼを意味する。
【0015】
本明細書において、「Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅ」とは、タンパク質の進化を表す有根系統樹上で、バクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１に分類され、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌に由来するＬｉｆ非依存性リパーゼを含むクレードを指す。具体的には、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにアクセッション番号ＷＰ＿０６２５６６５７３．１、ＷＰ＿０５４５５２８５９．１、ＷＰ＿１３０１６６１６３．１、ＷＰ＿０６３７０２８３４．１、ＷＰ＿１６７６５９０００．１及びＷＰ＿１３８５５７９９０．１として登録されている６つのリパーゼを含むクレードである。
【0016】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0017】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。
あるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の例としては、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。
ここで、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、さらに好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上９０個以下、好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、さらにより好ましくは１個以上１５個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
あるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の例としては、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。
ここで、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、さらに好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上９０個以下、好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、さらにより好ましくは１個以上１５個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【0018】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
【0019】
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【0020】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【0021】
本明細書において、プロモーターなどの制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【0022】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【0023】
従来知られているバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１に属するＬｉｆ非依存性リパーゼは、単一のクレード（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅ）を形成し、その他にはバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１に属するＬｉｆ非依存性リパーゼは見つかっていなかった。しかるところ、後記実施例に示すように、バクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１及びＩ．２に分類されるリパーゼの由来細菌ゲノムについて、リパーゼ遺伝子とＬｉｆ様遺伝子の共存性に基づいてリパーゼのＬｉｆ依存性を網羅的に解析した結果、新たにＬｉｆ非依存性リパーゼからなるクレード（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅ）が見出された。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにアクセッション番号ＷＰ＿０６２５６６５７３．１、ＷＰ＿０５４５５２８５９．１、ＷＰ＿１３０１６６１６３．１、ＷＰ＿０６３７０２８３４．１、ＷＰ＿１６７６５９０００．１及びＷＰ＿１３８５５７９９０．１（それぞれ成熟領域は配列番号２、配列番号４、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列）として登録されている６つのリパーゼを含むクレードである。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅのリパーゼは、明確な分泌シグナルを持たない一方、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅのリパーゼはＳｅｃシグナルを有する。よって、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅのリパーゼは、Ｌｉｆ非依存性であることが新たに見出されたリパーゼであるのみならず、既知のＬｉｆ非依存性リパーゼとは異なる様式で細胞外に効率的に分泌され、異種微生物での発現に好適である。よって、配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させれば、Ｌｉｆに依存せずに、すなわちＬｉｆの共発現なしに、活性型のリパーゼを効率よく製造することができる。
【0024】
したがって、本発明は、配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法を提供する。
【0025】
配列番号２のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにアクセッション番号ＷＰ＿０６２５６６５７３．１として登録されているＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ由来のリパーゼ（ＰｓｈＬｉｐ）の成熟領域のアミノ酸配列を示す。配列番号４のアミノ酸配列は、ＷＰ＿０５４５５２８５９．１として登録されているＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のリパーゼ（ＰｌｉＬｉｐ）の成熟領域のアミノ酸配列を示す。配列番号１４のアミノ酸配列は、ＷＰ＿１３０１６６１６３．１として登録されているＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のリパーゼ（ＰｓｐＬｉｐ１）の成熟領域のアミノ酸配列を示す。配列番号１５のアミノ酸配列は、ＷＰ＿０６３７０２８３４．１として登録されているＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のリパーゼ（ＰｓｐＬｉｐ２）の成熟領域のアミノ酸配列を示す。配列番号１６のアミノ酸配列は、ＷＰ＿１６７６５９０００．１として登録されているＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のリパーゼ（ＰｓｐＬｉｐ３）の成熟領域のアミノ酸配列を示す。配列番号１７のアミノ酸配列は、ＷＰ＿１３８５５７９９０．１として登録されているＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のリパーゼ（ＰｓｐＬｉｐ４）の成熟領域のアミノ酸配列を示す。ＰｓｈＬｉｐ、ＰｌｉＬｉｐ及びＰｓｐＬｉｐ１～４は、それぞれ、Ｌｉｆ非依存性であることが本発明者らにより初めて見出されたリパーゼであり、Ｎ末端にＳｅｃシグナルを有している。
【0026】
配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列としては、製造されたリパーゼの回収の容易さの点から、好ましくは配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有しかつＳｅｃシグナルを含むアミノ酸配列が好ましい。
【0027】
配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチド（以下、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドとも称する）は、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
【0028】
目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、常法に従って調製することができる。例えば、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、上述したリパーゼを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。
【0029】
上記の手順で得られたポリヌクレオチドに対して、さらに部位特異的変異導入を行うことにより、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを調製してもよい。
【0030】
あるいは、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、目的のリパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的又は遺伝子工学的に合成してもよい。例えば、該ポリヌクレオチドは、配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列に基づいて、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸合成受託サービス（例えば、株式会社医学生物学研究所、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社などより提供されている）を利用することができる。さらに、合成したポリヌクレオチドをＰＣＲ、クローニングなどにより増幅することもできる。
【0031】
目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが導入される微生物の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
【0032】
目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のリパーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）などのシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）を用いることもできる。
【0033】
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチド（すなわちリパーゼ遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。
【0034】
上記プロモーター領域、ターミネーター領域、分泌シグナル領域などの制御配列の種類は、特に限定されず、導入する微生物に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列などが挙げられる。
【0035】
あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された微生物を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主としての微生物に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
【0036】
上記目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
【0037】
目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主としての微生物に導入するか、又は目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主としての微生物に導入し、該微生物のゲノムに該ポリヌクレオチドを組み込むことにより、本発明の形質転換微生物を得ることができる。
【0038】
微生物としては、目的のリパーゼが由来する微生物以外の細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。具体的には、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌以外の微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌が好ましく、バチルス属細菌がより好ましく、枯草菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）がさらに好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０．１，２０２１，１－１３に記載のプロテアーゼ９重欠損株Ｄｐｒ９、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）などが挙げられる。
【0039】
微生物へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換微生物を得ることができる。
【0040】
あるいは、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、微生物のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に微生物のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを微生物に導入して、微生物ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドが微生物のゲノムに導入される。
【0041】
本発明の方法においては、上記のような手順で得られた、目的のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養する。形質転換微生物は、該形質転換微生物の種類に応じた一般的な培養方法に従って培養すればよく、培養に使用する培地も、該形質転換微生物の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。例えば、バチルス属菌の培養のための培地は、菌の生育に必要な炭素源及び窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、菌種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。
【0042】
本発明の方法において、該形質転換微生物の培養により、目的のリパーゼが発現される。発現したリパーゼは、好ましくは細胞外に分泌又は放出され、培養物の細胞外成分中に蓄積する。斯くして製造されたリパーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。
【0043】
本発明のリパーゼの製造方法によれば、Ｌｉｆに依存せずに活性型のリパーゼを効率よく製造することができ、該リパーゼの大量生産が可能となる。製造された配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼは、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下が挙げられ、また５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。
ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下が挙げられ、また５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。
【0044】
洗浄剤組成物中へのリパーゼの配合量は、当該リパーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また０．１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５～５００ｍｇであるのがより好ましい。
【0045】
洗浄剤組成物は、上記リパーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼなどである。このうち、上記リパーゼとは異なるリパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどが好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、などが挙げられる。
セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）などが挙げられる。
アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、などが挙げられる。
リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）などが挙げられる。
プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、などが挙げられる。
セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）などが挙げられる。
アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、などが挙げられる。
リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）などが挙げられる。
【0046】
洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
【0047】
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。
【0048】
洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である。
【0049】
（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。
二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。
【0050】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
【0051】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【0052】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。
【0053】
（６）蛍光剤
洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。
洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。
【0054】
（７）その他の成分
洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。
洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。
【0055】
洗浄剤組成物は、上記リパーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
【0056】
斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
また、当該洗浄剤組成物は、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での使用に適する。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での使用に適する。好ましい使用態様としては、ランドリーでの低温（１５～３０℃）洗浄における使用、自動食器洗浄機による低温（１５～３０℃）洗浄における使用が挙げられる。
また、当該洗浄剤組成物は、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での使用に適する。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での使用に適する。好ましい使用態様としては、ランドリーでの低温（１５～３０℃）洗浄における使用、自動食器洗浄機による低温（１５～３０℃）洗浄における使用が挙げられる。
【0057】
本発明の洗浄剤組成物を用いることで、汚れの除去を必要とする被洗浄物（例えば、衣類、食器、硬質表面、排水管、義歯、医療器具など）を洗浄すること、すなわち汚れを除去することができる。斯かる洗浄方法は、汚れの除去を必要とする被洗浄物と本発明の洗浄剤組成物とを接触させる工程を含む。好ましくは、汚れとは油汚れである。
【0058】
本発明の洗浄方法において、被洗浄物と洗浄剤組成物とを接触させるには、該洗浄剤組成物を溶かした水に、該被洗浄物を漬け置きしてもよく、また該洗浄剤組成物を、該被洗浄物に直接塗布してもよい。本発明の方法においては、該漬け置き又は洗剤組成物の塗布後の被洗浄物をさらに手洗い、スポンジによる擦り洗い、洗濯機などで洗ってもよいが、必ずしもその必要はない。
【0059】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法。
＜２＞前記リパーゼが配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列からなるものである、＜１＞記載の方法。
＜３＞前記形質転換微生物がＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌以外の微生物である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞前記形質転換微生物が大腸菌又はバチルス属細菌である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜５＞配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換微生物。
＜６＞前記ベクター又はＤＮＡ断片が配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、＜５＞記載の形質転換微生物。
＜７＞Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌以外の微生物である、＜５＞又は＜６＞記載の形質転換微生物。
＜８＞大腸菌又はバチルス属細菌である、＜５＞又は＜６＞記載の形質転換微生物。
＜１＞配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換微生物を培養し、該リパーゼを発現させることを含む、リパーゼの製造方法。
＜２＞前記リパーゼが配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列からなるものである、＜１＞記載の方法。
＜３＞前記形質転換微生物がＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌以外の微生物である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞前記形質転換微生物が大腸菌又はバチルス属細菌である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜５＞配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換微生物。
＜６＞前記ベクター又はＤＮＡ断片が配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、＜５＞記載の形質転換微生物。
＜７＞Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属細菌以外の微生物である、＜５＞又は＜６＞記載の形質転換微生物。
＜８＞大腸菌又はバチルス属細菌である、＜５＞又は＜６＞記載の形質転換微生物。
【0060】
＜９＞配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
＜１０＞低温で使用される、＜９＞記載の洗浄剤組成物。
＜１１＞４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用される、＜１０＞記載の洗浄剤組成物。
＜１２＞＜９＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
＜１３＞洗浄剤組成物の製造のための配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
＜１４＞汚れの洗浄のための配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
＜１０＞低温で使用される、＜９＞記載の洗浄剤組成物。
＜１１＞４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用される、＜１０＞記載の洗浄剤組成物。
＜１２＞＜９＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
＜１３＞洗浄剤組成物の製造のための配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
＜１４＞汚れの洗浄のための配列番号２、４及び１４～１７のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
【実施例0061】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0062】
（１）サブファミリーＩ．１及びＩ．２に属するリパーゼのシャペロン依存性の網羅的推定
Ｌｉｆ依存性リパーゼはゲノム上でＬｉｆとクラスターを形成することが報告されていることから（Ｅｌ Ｋｈａｔｔａｂｉ， Ｍｏｈａｍｅｄ， ｅｔ ａｌ． “Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｌｄａｓｅ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ ａｓ ａ ｓｔｅｒｉｃ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５．３５ （２０００）： ２６８８５－２６８９１．）、ゲノム上のリパーゼ遺伝子近傍におけるＬｉｆ様遺伝子の有無によってＬｉｆ依存性を推定できると考え、公共データベースに含まれるリパーゼ配列のＬｉｆ依存性の網羅的推定を行った。
細菌リパーゼのサブファミリー分類を提案したＡｒｐｉｇｎｙらの文献（Ａｒｐｉｇｎｙ， Ｊｅａｎ Ｌｏｕｉｓ， ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｅｒｉｃｈ ＪＡＥＧＥＲ． “Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３４３．１ （１９９９）： １７７－１８３．）においてサブファミリーＩ．１又はＩ．２に分類されたリパーゼ９配列（Ｄ５０５８７、ＡＦ０３１２２６、Ｘ１６９４５、Ｘ８０８００、Ｘ１４０３３、Ｕ８８９０７、Ｕ３３８４５、Ｘ７０３５４、Ｍ５８４９４）をクエリ配列とし、ＢＬＡＳＴ検索（ｅ－ｖａｌｕｅ＝１ｅ－２０）によってＮＣＢＩのｎｒデータベースからホモログ配列を収集した。Ｅｎｔｒｅｚを用いて各リパーゼ遺伝子の上流下流各５０００ｂｐが取得可能かどうかを判別し、近傍ゲノム配列が取得可能な配列のみを抽出した。ｃｄ－ｈｉｔを用いて配列同一性７０％でクラスタリングし、ＭＡＦＦＴ－ＤＡＳＨによりマルチプルシーケンスアライメントを作成してＩｑｔｒｅｅにて系統解析を行った。
Ｅｎｔｒｅｚを用いて各リパーゼ遺伝子の上流下流各５０００ｂｐの範囲に含まれるＯＲＦのアミノ酸配列を取得した。Ｌｉｆ様遺伝子の探索にはＨＭＭＥＲを用いた。ｐｆａｍファミリーＰＦ０３２８０（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐａｓｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＨＭＭを用いて相同性検索を行い、各リパーゼ遺伝子の上流下流各５０００ｂｐの範囲にＬｉｆ様遺伝子が含まれるかどうかを調べた。近傍にＬｉｆ様遺伝子が含まれなかったリパーゼ遺伝子については、各由来菌のプロテオーム全体にＬｉｆ様遺伝子が含まれるかどうかを同様に調べた。
Ｌｉｆ依存性リパーゼはゲノム上でＬｉｆとクラスターを形成することが報告されていることから（Ｅｌ Ｋｈａｔｔａｂｉ， Ｍｏｈａｍｅｄ， ｅｔ ａｌ． “Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｌｄａｓｅ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ ａｓ ａ ｓｔｅｒｉｃ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５．３５ （２０００）： ２６８８５－２６８９１．）、ゲノム上のリパーゼ遺伝子近傍におけるＬｉｆ様遺伝子の有無によってＬｉｆ依存性を推定できると考え、公共データベースに含まれるリパーゼ配列のＬｉｆ依存性の網羅的推定を行った。
細菌リパーゼのサブファミリー分類を提案したＡｒｐｉｇｎｙらの文献（Ａｒｐｉｇｎｙ， Ｊｅａｎ Ｌｏｕｉｓ， ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｅｒｉｃｈ ＪＡＥＧＥＲ． “Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３４３．１ （１９９９）： １７７－１８３．）においてサブファミリーＩ．１又はＩ．２に分類されたリパーゼ９配列（Ｄ５０５８７、ＡＦ０３１２２６、Ｘ１６９４５、Ｘ８０８００、Ｘ１４０３３、Ｕ８８９０７、Ｕ３３８４５、Ｘ７０３５４、Ｍ５８４９４）をクエリ配列とし、ＢＬＡＳＴ検索（ｅ－ｖａｌｕｅ＝１ｅ－２０）によってＮＣＢＩのｎｒデータベースからホモログ配列を収集した。Ｅｎｔｒｅｚを用いて各リパーゼ遺伝子の上流下流各５０００ｂｐが取得可能かどうかを判別し、近傍ゲノム配列が取得可能な配列のみを抽出した。ｃｄ－ｈｉｔを用いて配列同一性７０％でクラスタリングし、ＭＡＦＦＴ－ＤＡＳＨによりマルチプルシーケンスアライメントを作成してＩｑｔｒｅｅにて系統解析を行った。
Ｅｎｔｒｅｚを用いて各リパーゼ遺伝子の上流下流各５０００ｂｐの範囲に含まれるＯＲＦのアミノ酸配列を取得した。Ｌｉｆ様遺伝子の探索にはＨＭＭＥＲを用いた。ｐｆａｍファミリーＰＦ０３２８０（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐａｓｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＨＭＭを用いて相同性検索を行い、各リパーゼ遺伝子の上流下流各５０００ｂｐの範囲にＬｉｆ様遺伝子が含まれるかどうかを調べた。近傍にＬｉｆ様遺伝子が含まれなかったリパーゼ遺伝子については、各由来菌のプロテオーム全体にＬｉｆ様遺伝子が含まれるかどうかを同様に調べた。
【0063】
解析結果を図１に示した。Ｌｉｆ非依存性の既知リパーゼはすべて同一のクレード（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅ）に含まれていた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅのリパーゼの大部分は由来菌ゲノム中にＬｉｆ様遺伝子が検出されなかったことから、本解析の妥当性が支持された。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅとは異なるクレードにおいて唯一、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ由来のリパーゼＷＰ＿０６２５６６５７３．１は由来菌ゲノム中にＬｉｆ様遺伝子が検出されなかった（図１星マーク）。ｃｄ－ｈｉｔによるクラスタリングを７０％から９５％に変更してこの周辺配列の解析を再度行った。その結果、ＷＰ＿０６２５６６５７３．１を含む６配列（ＷＰ＿０６２５６６５７３．１、ＷＰ＿０５４５５２８５９．１、ＷＰ＿１３０１６６１６３．１、ＷＰ＿０６３７０２８３４．１、ＷＰ＿１６７６５９０００．１及びＷＰ＿１３８５５７９９０．１、それぞれ成熟領域は配列番号２、配列番号４、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列）から成るクレード（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅ）はいずれも由来菌ゲノム中にＬｉｆ様遺伝子が検出されなかった（図２）。このことから、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅのリパーゼは新規のＬｉｆ非依存性リパーゼ群である可能性が示唆された。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅのリパーゼはいずれもＮ末端にＳｅｃシグナルを有しており、明確なシグナル配列を持たないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ／Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｃｌａｄｅとは異なる様式で細胞外に分泌されることが示唆された。
【0064】
（２）リパーゼの異種発現プラスミドの構築
Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するリパーゼであるＰｓｈＬｉｐ及びＰｌｉＬｉｐの大腸菌用発現プラスミドを次のように構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子ＰｓｈＬｉｐ及びＰｌｉＬｉｐ（それぞれ配列番号１及び３のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号２及び４のアミノ酸配列をコードする）を、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ）のｐｅｌＢシグナル配列直下にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって挿入し、それぞれプラスミドｐＥＴ－ＰｓｈＬｉｐ及びｐＥＴ－ＰｌｉＬｉｐを構築した。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼ（ＰａｅＬｉｐ）の活性型での発現にはＬｉｆ（ＰａｅＬｉｆ）が必要であることが知られている（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ， Ｓｕｓｓａｎｎｅ， ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｐａｓｅ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１．” Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３８．７ （１９９２）： １３２５－１３３５．）。ＰａｅＬｉｐ及びＰａｅＬｉｆの大腸菌用発現プラスミドを次のように構築した。Ｎ末端にｐｅｌＢシグナル配列（配列番号５のポリヌクレオチド、配列番号６のアミノ酸配列をコードする）を付加したＰａｅＬｉｐ遺伝子（配列番号７のポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸配列をコードする）を人工遺伝子合成し、ｐＥＴＤｕｅｔＴＭ－１（Ｍｅｒｃｋ）のＭＣＳ１にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって挿入して、プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｐを構築した。人工遺伝子合成したＰａｅＬｉｆ遺伝子（配列番号９のポリヌクレオチド、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする）を、ｐＥＴＤｕｅｔ－１及びｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｐのＭＣＳ２にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって挿入して、それぞれプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｆ及びｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｐ－ＰａｅＬｉｆを構築した。
ＰｓｈＬｉｐの枯草菌用発現プラスミドを次のように構築した。ＷＯ２０２１／１５３１２９に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含む配列番号２６のＶＨＨの発現用プラスミドの、ＶＨＨ遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｎ末端側に枯草菌ａｍｙＥ由来シグナル配列（配列番号１１のポリヌクレオチド、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする）が連結されたリパーゼＰｓｈＬｉｐ遺伝子（配列番号１３のポリヌクレオチド、配列番号２のアミノ酸配列をコードする）の人工合成遺伝子をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって載せ替えることでプラスミドｐＨＹ－ａｍｙＥｓｉｇ－ＰｓｈＬｉｐを構築した。
Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するリパーゼであるＰｓｈＬｉｐ及びＰｌｉＬｉｐの大腸菌用発現プラスミドを次のように構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子ＰｓｈＬｉｐ及びＰｌｉＬｉｐ（それぞれ配列番号１及び３のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号２及び４のアミノ酸配列をコードする）を、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ）のｐｅｌＢシグナル配列直下にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって挿入し、それぞれプラスミドｐＥＴ－ＰｓｈＬｉｐ及びｐＥＴ－ＰｌｉＬｉｐを構築した。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼ（ＰａｅＬｉｐ）の活性型での発現にはＬｉｆ（ＰａｅＬｉｆ）が必要であることが知られている（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ， Ｓｕｓｓａｎｎｅ， ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｐａｓｅ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１．” Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３８．７ （１９９２）： １３２５－１３３５．）。ＰａｅＬｉｐ及びＰａｅＬｉｆの大腸菌用発現プラスミドを次のように構築した。Ｎ末端にｐｅｌＢシグナル配列（配列番号５のポリヌクレオチド、配列番号６のアミノ酸配列をコードする）を付加したＰａｅＬｉｐ遺伝子（配列番号７のポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸配列をコードする）を人工遺伝子合成し、ｐＥＴＤｕｅｔＴＭ－１（Ｍｅｒｃｋ）のＭＣＳ１にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって挿入して、プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｐを構築した。人工遺伝子合成したＰａｅＬｉｆ遺伝子（配列番号９のポリヌクレオチド、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする）を、ｐＥＴＤｕｅｔ－１及びｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｐのＭＣＳ２にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって挿入して、それぞれプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｆ及びｐＥＴＤｕｅｔ－ＰａｅＬｉｐ－ＰａｅＬｉｆを構築した。
ＰｓｈＬｉｐの枯草菌用発現プラスミドを次のように構築した。ＷＯ２０２１／１５３１２９に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含む配列番号２６のＶＨＨの発現用プラスミドの、ＶＨＨ遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｎ末端側に枯草菌ａｍｙＥ由来シグナル配列（配列番号１１のポリヌクレオチド、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする）が連結されたリパーゼＰｓｈＬｉｐ遺伝子（配列番号１３のポリヌクレオチド、配列番号２のアミノ酸配列をコードする）の人工合成遺伝子をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって載せ替えることでプラスミドｐＨＹ－ａｍｙＥｓｉｇ－ＰｓｈＬｉｐを構築した。
【0065】
（３）ハロアッセイ
（２）で構築した各発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、得られたコロニーをオリーブオイル寒天培地（ＬＢ（２％ ＬＢ ｐｒｅｍｉｘ（ＳＥＲＶＡ）、１．５％（ｗ／ｖ）アラビアガム、８０ｍｇ／Ｌ ブリリアントグリーン、１．５％（ｖ／ｖ）オリーブ油、５０μＭ ＩＰＴＧ、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に植えついで１０℃、２０℃で２日間インキュベートした後のハロ形成を観察した（表1）。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するＰｓｈＬｉｐ及びＰｌｉＬｉｐは、Ｌｉｆを伴わない異種発現においてもオリーブオイル分解性を示した。一方で、Ｌｉｆ依存性であるＰａｅＬｉｐは単独ではオリーブオイル分解性を示さず、Ｌｉｆとの共発現によってのみオリーブオイル分解性を示した。
（２）で構築した各発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、得られたコロニーをオリーブオイル寒天培地（ＬＢ（２％ ＬＢ ｐｒｅｍｉｘ（ＳＥＲＶＡ）、１．５％（ｗ／ｖ）アラビアガム、８０ｍｇ／Ｌ ブリリアントグリーン、１．５％（ｖ／ｖ）オリーブ油、５０μＭ ＩＰＴＧ、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に植えついで１０℃、２０℃で２日間インキュベートした後のハロ形成を観察した（表1）。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するＰｓｈＬｉｐ及びＰｌｉＬｉｐは、Ｌｉｆを伴わない異種発現においてもオリーブオイル分解性を示した。一方で、Ｌｉｆ依存性であるＰａｅＬｉｐは単独ではオリーブオイル分解性を示さず、Ｌｉｆとの共発現によってのみオリーブオイル分解性を示した。
【0066】
【表1】
【0067】
（４）大腸菌の液体培養
プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）及びｐＥＴ－ＰｌｉＬｉｐを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にそれぞれ形質転換し、得られたコロニーを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌して３７℃で一晩振盪培養した。この培養液１５０μＬを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌して３７℃で２時間培養した。終濃度０または５０μＭのＩＰＴＧを添加し、２０℃で約１９時間培養した後に培養液を５００μＬずつ回収して遠心上清を回収した。菌体を氷冷ＰＢＳ１ｍＬで１回洗浄し、２００ｍｇ／Ｌリゾチームを含むＰＢＳ２５０μＬに懸濁して表情で３０分間静置した後に超音波破砕を行い、遠心上清を細胞破砕液として回収した。
酪酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を１／１５Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に終濃度２ｍＭで添加し混合したものを基質溶液として用いた。リパーゼの作用による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することでリパーゼの活性を求めることができる。サンプル（培養上清または細胞破砕液）２０μＬと基質溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、２５℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した（図３）。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するＰｌｉＬｉｐは、Ｌｉｆを伴わない異種発現においても培養上清及び細胞破砕液中にリパーゼ活性を示した。
プラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）及びｐＥＴ－ＰｌｉＬｉｐを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にそれぞれ形質転換し、得られたコロニーを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌して３７℃で一晩振盪培養した。この培養液１５０μＬを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌して３７℃で２時間培養した。終濃度０または５０μＭのＩＰＴＧを添加し、２０℃で約１９時間培養した後に培養液を５００μＬずつ回収して遠心上清を回収した。菌体を氷冷ＰＢＳ１ｍＬで１回洗浄し、２００ｍｇ／Ｌリゾチームを含むＰＢＳ２５０μＬに懸濁して表情で３０分間静置した後に超音波破砕を行い、遠心上清を細胞破砕液として回収した。
酪酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を１／１５Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に終濃度２ｍＭで添加し混合したものを基質溶液として用いた。リパーゼの作用による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することでリパーゼの活性を求めることができる。サンプル（培養上清または細胞破砕液）２０μＬと基質溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、２５℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した（図３）。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するＰｌｉＬｉｐは、Ｌｉｆを伴わない異種発現においても培養上清及び細胞破砕液中にリパーゼ活性を示した。
【0068】
（５）枯草菌の液体培養
空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴａＫａＲａ）及びリパーゼ発現プラスミドｐＨＹ－ａｍｙＥｓｉｇ－ＰｓｈＬｉｐをそれぞれ枯草菌Ｄｐｒ９株（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０．１（２０２１）：１－１３．参照）にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）中で、３０℃、３日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
酪酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に終濃度２ｍＭで添加し混合したものを基質溶液として用いた。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００倍希釈した培養上清２μＬと基質溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した（図４）。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するＰｓｈＬｉｐは、Ｌｉｆを伴わない枯草菌の分泌発現において、培養上清中にリパーゼ活性を示した。
空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴａＫａＲａ）及びリパーゼ発現プラスミドｐＨＹ－ａｍｙＥｓｉｇ－ＰｓｈＬｉｐをそれぞれ枯草菌Ｄｐｒ９株（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０．１（２０２１）：１－１３．参照）にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）中で、３０℃、３日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
酪酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に終濃度２ｍＭで添加し混合したものを基質溶液として用いた。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００倍希釈した培養上清２μＬと基質溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した（図４）。Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｏｙａｓａｋｉｅｎｓｉｓ ｃｌａｄｅに属するＰｓｈＬｉｐは、Ｌｉｆを伴わない枯草菌の分泌発現において、培養上清中にリパーゼ活性を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】