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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024118905
(43)【公開日】2024-09-02
(54)【発明の名称】ＡＶＰ受容体及びその利用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/72 20060101AFI20240826BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240826BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240826BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240826BHJP
G01N 33/566 20060101ALI20240826BHJP
【ＦＩ】
C07K14/72 ZNA
C12N15/12
C12N5/10
C12Q1/02
G01N33/566
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023025479
(22)【出願日】2023-02-21
(71)【出願人】
【識別番号】000006770
【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】土居 耕介
(72)【発明者】
【氏名】井上 飛鳥
(72)【発明者】
【氏名】生田 達也
(72)【発明者】
【氏名】川上 耕季
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ03
4B063QQ79
4B063QR72
4B063QR80
4B063QS32
4B063QS36
4B063QS38
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】１－デアミノ－８－Ｄ－アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）の影響を排除してアルギニンバソプレシンを測定する方法を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）受容体活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質を発現する培養細胞、該培養細胞を含有する、ＡＶＰ測定用キット、および該培養細胞を用いる試料中のＡＶＰレベルの分析方法を提供する。
【選択図】図２－１
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）受容体活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質を発現する培養細胞、該培養細胞を含有する、ＡＶＰ測定用キット、および該培養細胞を用いる試料中のＡＶＰレベルの分析方法を提供する。
【選択図】図２－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記のいずれか一のタンパク質：
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
【請求項2】
下記のいずれか一のタンパク質である、請求項1に記載のタンパク質：
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；；
(3)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；；
(3)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
【請求項3】
配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質を発現する、培養細胞。
【請求項6】
さらにｃＡＭＰバイオセンサーを発現する、請求項５に記載の培養細胞。
【請求項7】
請求項５に記載の培養細胞を含有する、ＡＶＰ測定用キット。
【請求項8】
体外診断用医薬品である、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
下記の工程を含む、試料中のＡＶＰレベルの分析方法：
(a) 試料を、ＡＶＰ受容体を発現する培養細胞に添加してインキュベートし、
このときＡＶＰ受容体は、1-デアミノ-8-D-アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）による活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものであり；
(b)インキュベート後のＡＶＰ受容体の活性化レベルを分析し；
(c)得られた分析結果に基づき、ＤＤＡＶＰの影響の低減されたＡＶＰレベルを分析する。
(a) 試料を、ＡＶＰ受容体を発現する培養細胞に添加してインキュベートし、
このときＡＶＰ受容体は、1-デアミノ-8-D-アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）による活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものであり；
(b)インキュベート後のＡＶＰ受容体の活性化レベルを分析し；
(c)得られた分析結果に基づき、ＤＤＡＶＰの影響の低減されたＡＶＰレベルを分析する。
【請求項10】
ＡＶＰ受容体が、請求項１～３のいずれか１項に記載されたタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ；Arginine Vasopressin）受容体に関する。
【背景技術】
【0002】
バソプレシンＶ２受容体（Ｖ２Ｒ）は、主に尿細管上皮細胞に存在するＡＶＰの受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。脳下垂体から分泌されたＡＶＰがＶ２Ｒに結合すると、その刺激により細胞中のアデニレートシクラーゼが活性化されて環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生され、ｃＡＭＰシグナルを受けて尿の再吸収が行われる。
【0003】
中枢性尿崩症はＡＶＰの部分的又は完全な欠損を原因とする疾患であり、中枢性尿崩症患者においてはＡＶＰの分泌が正常に行われないため、腎臓における尿の再吸収に異常を示すことにより多尿・口渇といった症状を引き起こす。バソプレシンの分泌異常を原因とする疾患としては中枢性尿崩症の他に抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）等が知られている。また、Ｖ２受容体遺伝子への変異を主な原因とする疾患として腎性尿崩症が知られており、中枢性尿崩症と同じく尿の再吸収に異常を示すため、類似の症状を示す。
【0004】
尿崩症患者に適切な治療を提供するためには、患者の疾患を鑑別することが重要である。たとえば中枢性尿崩症においては、患者血液試料中のＡＶＰ濃度を測定することで、中枢性尿崩症の診断ができることが知られている。このように、ＡＶＰ濃度の測定法は産業上有用であり、開発が進められている。
【0005】
ＡＶＰ濃度の測定法は、抗原抗体反応を利用した手法が知られている。具体的な方法としては、患者血漿にアイソトープ標識したＡＶＰを加えたのちに、抗ＡＶＰ抗体と血漿を反応させることで、血漿中に含まれるアイソトープ標識ＡＶＰと血漿由来ＡＶＰの競合阻害反応により血漿中ＡＶＰ濃度を測定する方法である（非特許文献１）。
【0006】
また、近年では細胞内ｃＡＭＰ量の測定をＡＶＰ濃度の測定に応用した例も知られている。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を被験試料存在下でインキュベートし、試料中に含まれるＡＶＰがＶ２Ｒを刺激することにより産生されるｃＡＭＰの量を、カルシウムイオンを介した発光によって検出するバイオアッセイ系を利用したＡＶＰの測定法が知られている（特許文献１）。
【0007】
Ｖ２Ｒに関しては、変異によって引き起こされる病態等について、多くの先行研究が存在している（例えば、非特許文献２）。しかし、いずれも疾病の機序等を解明するための研究であり、ＡＶＰ濃度の測定法に応用するための研究ないし検討は一切行われてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】再表２０１２／０８６７５６
【特許文献2】特開２０１６－７５７０７号公報
【特許文献3】特開２０１７－１９２３９６号公報
【特許文献4】特願２０１９－２０５９５号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】ＡＶＰキット「ヤマサ」添付文書, 2021年6月改訂（第4版）, https://www.info.pmda.go.jp/downfiles/ivd/PDF/800075_22700AMX00611000_A_04_03.pdf
【非特許文献2】NDT Plus, 2, 20-22（2008）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明者らは、ＡＶＰ濃度の測定法の検討を行う中で、野生型Ｖ２ＲはＡＶＰ、ＤＤＡＶＰ(中枢性尿崩症治療薬、ＡＶＰ誘導体、1-deamino-8-D-arginine vasopressin）のいずれにおいても同程度活性化され、血中に存在するＤＤＡＶＰによってＶ２Ｒが活性化されることで、試料中ＡＶＰ濃度の正確な測定を妨げていることを発見した。患者血液試料中のＡＶＰの測定に際しては、ＤＤＡＶＰの影響を排除できることが望ましい。
【0011】
また、血液試料中のＡＶＰの濃度は０．１～数ｐｇ／ｍＬであり、非常に低い濃度であるため、ＡＶＰ濃度の測定が高感度で行えることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、ヒトＶ２Ｒの構造情報等から、アミノ酸配列における９６番目のグルタミン残基、及び１１９番目のグルタミン残基がＡＶＰとＤＤＡＶＰの選択性に重要であることを見出し、さらに検討を進めることにより、本発明を完成させた。本発明は以下を提供する。
【0013】
［１］ 下記のいずれか一のタンパク質：
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
［２］ 下記のいずれか一のタンパク質である、１に記載のタンパク質：
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；；
(3)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
［３］ 配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
［４］ １～３のいずれか１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［５］ １～３のいずれか１に記載のタンパク質を発現する、培養細胞。
［６］ さらにｃＡＭＰバイオセンサーを発現する、５に記載の培養細胞。
［７］ ５又は６に記載の培養細胞を含有する、ＡＶＰ測定用キット。
［８］ 体外診断用医薬品である、７に記載のキット。
［９］ 下記の工程を含む、試料中のＡＶＰレベルの分析方法：
(a) 試料を、ＡＶＰ受容体を発現する培養細胞に添加してインキュベートし、
このときＡＶＰ受容体は、1-デアミノ-8-D-アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）による活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものであり；
(b)インキュベート後のＡＶＰ受容体の活性化レベルを分析し；
(c)得られた分析結果に基づき、ＤＤＡＶＰの影響の低減されたＡＶＰレベルを分析する。
［１０］ ＡＶＰ受容体が、１～３のいずれか１項に記載されたタンパク質である、９に記載の方法。
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
［２］ 下記のいずれか一のタンパク質である、１に記載のタンパク質：
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；；
(3)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がEであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質、又は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
［３］ 配列番号2、3、又は4のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
［４］ １～３のいずれか１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［５］ １～３のいずれか１に記載のタンパク質を発現する、培養細胞。
［６］ さらにｃＡＭＰバイオセンサーを発現する、５に記載の培養細胞。
［７］ ５又は６に記載の培養細胞を含有する、ＡＶＰ測定用キット。
［８］ 体外診断用医薬品である、７に記載のキット。
［９］ 下記の工程を含む、試料中のＡＶＰレベルの分析方法：
(a) 試料を、ＡＶＰ受容体を発現する培養細胞に添加してインキュベートし、
このときＡＶＰ受容体は、1-デアミノ-8-D-アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）による活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものであり；
(b)インキュベート後のＡＶＰ受容体の活性化レベルを分析し；
(c)得られた分析結果に基づき、ＤＤＡＶＰの影響の低減されたＡＶＰレベルを分析する。
［１０］ ＡＶＰ受容体が、１～３のいずれか１項に記載されたタンパク質である、９に記載の方法。
【発明の効果】
【0014】
本発明により、ＡＶＰ選択性の高い、Ｖ２受容体が提供される。
本発明により、ＤＤＡＶＰの影響が低減されたＡＶＰの測定を行うことができる。
本発明により、ＤＤＡＶＰの影響が低減されたＡＶＰの測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、本明細書実施例１にてＶ２Ｒに導入された変異点を示す模式図である。図中、星印が変異点の位置を表す。アルファベット１文字、数字２桁ないし３桁の順からなる文字列は、数字がヒトＶ２Ｒにおける当該アミノ酸残基の番号を表し、アルファベットが野生型Ｖ２Ｒにおけるアミノ酸残基を示している。
【図2-1】図２－１は、野生型Ｖ２Ｒ、及びＶ２Ｒ変異体（９６番目のグルタミン（Ｑ））における濃度反応曲線を示す。縦軸はＡＶＰ又はＤＤＡＶＰ各濃度添加後のｃＡＭＰレベル（ＲＬＵ）をホルスコリン添加後のｃＡＭＰレベル（ＲＬＵ）で規準化した値を示す。横軸はＡＶＰ又はＤＤＡＶＰの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
［変異が導入されたＡＶＰ受容体］
（変異体）
本発明の一態様は、配列番号1のアミノ酸配列からなるヒトＶ２Ｒにおいて、９６番目のグルタミン（Ｑ）、又は１１９番目のＱに変異を有する変異体である。変異体のうち、９６番目相当がＥ、Ｍ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、又はＴへ変異した変異体、及び１１９番目相当がＭ、Ａ、Ｃ、Ｎ、又はＴへ変異した変異体は、低い濃度のＡＶＰが測定できるものであり、かつ野生型よりもＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が高い点で、好ましい。中でも、９６番目相当がＥへ変異した変異体、９６番目相当がＭへ変異した変異体、１１９番目相当がＭへ変異した変異体（配列番号4）は、非常に低に濃度のＡＶＰが測定でき、特に好ましい。このような変異体は、下記のいずれかのタンパク質である。
（変異体）
本発明の一態様は、配列番号1のアミノ酸配列からなるヒトＶ２Ｒにおいて、９６番目のグルタミン（Ｑ）、又は１１９番目のＱに変異を有する変異体である。変異体のうち、９６番目相当がＥ、Ｍ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、又はＴへ変異した変異体、及び１１９番目相当がＭ、Ａ、Ｃ、Ｎ、又はＴへ変異した変異体は、低い濃度のＡＶＰが測定できるものであり、かつ野生型よりもＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が高い点で、好ましい。中でも、９６番目相当がＥへ変異した変異体、９６番目相当がＭへ変異した変異体、１１９番目相当がＭへ変異した変異体（配列番号4）は、非常に低に濃度のＡＶＰが測定でき、特に好ましい。このような変異体は、下記のいずれかのタンパク質である。
【0017】
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質。
【0018】
配列表には、配列番号２としてＱ９６Ｅ変異体のアミノ酸配列、配列番号３としてＱ９６Ｍ変異体のアミノ酸配列、配列番号４としてＱ１１９Ｍ変異体のアミノ酸配列を示す。
【0019】
本発明の説明において、あるタンパク質がAVP受容体活性を有するとは、AVPに対する反応性があること、具体的には細胞の膜上に発現させたときにAVPが結合することができ、結合により所定のシグナル伝達を行うことができ、cAMPを産生させることができることをいう。AVP受容体活性は、血液試料中に含まれる程度の比較的低濃度のAVPと反応でき、血液試料中のAVPの測定に用いることができる程度に高いことが好ましい。
【0020】
上記(2)でいう「96番目相当」とは、基準となる(1)の配列番号1の配列においては96番目であるが、配列番号1の配列において1若しくは複数のアミノ酸を欠失等した場合は、位置がずれて96番目ではなくなる場合であっても、配列番号1の配列の96番目に対応する位置を指す。他の(3)等の項についても「相当」の意味は同様である。対応する位置は、当業者であれば2つの配列を最適の態様で整列させる等して、適宜特定することができる。
【0021】
Ｖ２Ｒに導入される変異が、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加による場合、中でもアミノ酸を置換する変異が好ましい。これは、アミノ酸を置換する変異は、アミノ酸欠失や挿入に比してＧＰＣＲの基本的な立体構造を保持したまま構成アミノ酸を変化させることができ、機能改変に適しているためである。
【0022】
Ｖ２Ｒは、ヒトＡＶＰなどの測定対象に反応を示す限りにおいて、その由来に制限はない。動物細胞にて発現した際にヒトのＶ２Ｒと近い反応性を示すことから、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができる。中でも、過去にＴＳＡｂ活性測定に用いられてきた細胞の由来である点から、ヒト、マウス、ラット、ブタであることが好ましく、生体内のＶ２Ｒに対するＴＳＡｂ活性をそのまま反映できる点から、ヒトであることがより好ましい。
【0023】
Ｖ２Ｒが特定のアミノ酸配列を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係るＶ２Ｒは、特定のアミノ酸配列を含むといえる。一般的に、タンパク質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばＮ末端修飾（例えば、アセチル化 、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、又は側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。
【0024】
一態様として提供されるＶ２Ｒ変異体は、上記変異を有することから、ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が向上している。当該Ｖ２Ｒ変異体は、ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が向上しているため、好適にＡＶＰ濃度の測定に用いることができる。この点については後述する。
【0025】
（ポリヌクレオチド、ベクター、培養細胞）
本発明の一態様は、上記のＶ２Ｒ変異体をコードするポリヌクレオチドである。具体的には下記のいずれかのポリヌクレオチドである。
本発明の一態様は、上記のＶ２Ｒ変異体をコードするポリヌクレオチドである。具体的には下記のいずれかのポリヌクレオチドである。
【0026】
(1)配列番号2又は3のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2)配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がグルタミン酸(E)、メチオニン(M)、グリシン(G)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつアルギニンバソプレシン(AVP)受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(3)配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、M、G、I、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号2又は3のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし96番目相当がE、又はMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(4)配列番号4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(5)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がメチオニン(M)、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン(N)、又はトレオニン(T)であるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは複数個、好ましくは1～37個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(6)配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がM、A、C、N、又はTであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド；好ましくは、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし119番目相当がMであるアミノ酸配列からなり、かつAVP受容体活性を有する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0027】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成可能である。その他、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のＶ２Ｒ変異体のアミノ酸配列と、遺伝暗号表から、適宜設計することができる。
【0028】
本発明の一態様は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターである。このようなベクターは、一般に知られている分子生物学的手法によって調製することができ、その調製方法として、例えばＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法、ライゲーション法、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング法、アッセンブリー法等が例示される。
【0029】
上記ポリヌクレオチドを導入するのに用いることのできるベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＥＴ－Ｂｌｕｅ－２）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１－１１、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。
【0030】
本発明の一態様は、上記Ｖ２Ｒ変異体を発現する、培養細胞である。このような培養細胞は、上記ベクターの導入により、上記Ｖ２Ｒ変異体が一過的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）又は安定的（ｓｔａｂｌｅ）に発現する培養細胞であればよい。培養細胞は、動物細胞であることが好ましい。なお、以下では、培養細胞として動物細胞を用いた場合を例に説明することがある。
【0031】
使用される細胞株に特に限定はないが、購入や実験のし易さの点から、哺乳類甲状腺細胞株（FRTL-5等）、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ細胞）、ヒト骨肉腫細胞株（Ｕ２ＯＳ細胞）が好ましく、中でも遺伝子導入効率や安定増殖の点からヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ細胞）がより好ましい。
【0032】
このような動物細胞は、Ｖ２Ｒ変異体を発現することにより、ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が改善されていることから、ＡＶＰ濃度の測定法に好適に用いることができる。適用されるＡＶＰ濃度の測定法に特に限定はなく、特許文献２～４に記載された方法を例示することができるが、前処理が不要かつ短時間で測定が完了するという点で、特許文献４に記載された方法が好ましい。
【0033】
このような動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０（Simian virus 40）の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているＶ２受容体をコードする遺伝子を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。自己抗体活性の測定に用いられるために、適宜Ｖ２Ｒ変異体をコードする遺伝子以外の遺伝子が導入されていても良く、例えばｃＡＭＰバイオセンサーを用いる特許文献４に記載の方法であれば、ｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子が導入されていても良い。
【0034】
（ｃＡＭＰバイオセンサー）
本発明の一態様は、上記Ｖ２Ｒ変異体を発現する動物細胞であって、さらにｃＡＭＰバイオセンサーを発現するものである。
本発明の一態様は、上記Ｖ２Ｒ変異体を発現する動物細胞であって、さらにｃＡＭＰバイオセンサーを発現するものである。
【0035】
本発明に関する説明において、「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。
【0036】
用いることのできるｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.）を挙げることができ、本明細書の実施例の項において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。このようなｃＡＭＰバイオセンサーを発現する動物細胞は、後述する細胞調製法により、調製することができる。
【0037】
（キット）
本発明の一態様は、Ｖ２Ｒ変異体を発現する動物細胞を含む、ＡＶＰ測定用キットである。
本発明の一態様は、Ｖ２Ｒ変異体を発現する動物細胞を含む、ＡＶＰ測定用キットである。
【0038】
ＡＶＰ測定用キットは、血液中のＡＶＰ濃度の上昇又は低下に関連した疾患又は状態の検査や診断のために用いることができる。このような疾患の例として、中枢性尿崩症等を挙げることができる。また、腎性尿崩症では血中ＡＶＰ濃度は変動しないため、このキットは腎性尿崩症の診断には直接的には有用ではないが、腎性尿崩症と、血中ＡＶＰ濃度が低下する中枢性尿崩症との鑑別には有用であると考えられる。
【0039】
キットは、常用されている試薬を適宜、構成の一部とすることができる。一例として、動物細胞液、発光基質液、反応プレート、標準液、希釈液のようなキット構成が考えられる。キットは、体外診断用医薬品とすることができる。
【0040】
（ＡＶＰレベルの分析方法）
本発明の一態様は、下記の工程を含む、試料中のＡＶＰレベルの分析方法である。
(a) 試料を、ＡＶＰ受容体（より特定するとＶ２受容体）を発現する培養細胞に添加してインキュベートし、
このときＡＶＰ受容体は、1-デアミノ-8-D-アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）による活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものであり；
(b)インキュベート後のＡＶＰ受容体の活性化レベル（より特定するとＶ２Ｒ活性化レベル）を分析し；
(c)得られた分析結果に基づき、ＤＤＡＶＰの影響の低減されたＡＶＰレベルを分析する。
本発明の一態様は、下記の工程を含む、試料中のＡＶＰレベルの分析方法である。
(a) 試料を、ＡＶＰ受容体（より特定するとＶ２受容体）を発現する培養細胞に添加してインキュベートし、
このときＡＶＰ受容体は、1-デアミノ-8-D-アルギニンバソプレシン（ＤＤＡＶＰ）による活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものであり；
(b)インキュベート後のＡＶＰ受容体の活性化レベル（より特定するとＶ２Ｒ活性化レベル）を分析し；
(c)得られた分析結果に基づき、ＤＤＡＶＰの影響の低減されたＡＶＰレベルを分析する。
【0041】
ＡＶＰ受容体の活性化レベルは、ｃＡＭＰレベルとして分析できる。ｃＡＭＰレベルとは、Ｖ２Ｒに起因して哺乳動物細胞内で産生されるｃＡＭＰ量を意味し、本願明細書で述べているようにルシフェラーゼを用いる系で測定した場合は、ＲＬＵと定義することができる。
【0042】
ＡＶＰ受容体を発現する培養細胞であって、このときＡＶＰ受容体がＤＤＡＶＰによる活性化が抑制され、ＡＶＰ選択的に活性化されるものである培養細胞は、上述したポリヌクレオチドを含むベクターにより、哺乳動物細胞を形質転換することにより、調製することができる。特に好ましい態様においては、哺乳動物細胞として、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（２９３Ａ細胞）が用いられる。この細胞は、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手できる（Cat no. Ｒ７０５０７）。
【0043】
特定のＡＶＰ受容体を発現する培養細胞は、例えば、GloSensor cAMP Assayを用いて、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSensor-22F、Promega社製）と、発現ベクター、例えばｐＣＡＧＧＳ (Niwa, H., Gene. 108 (2), 193-200 (1991))にＶ２Ｒを組み込んだもの（ｐＣＡＧＧＳ_Ｖ２Ｒ）を用いることにより調製できる。
【0044】
細胞調製法の一例を示す。
〔１〕４．０×１０6個の２９３Ａ細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地に播種し、２４時間培養する。
〔２〕pGloSenso-22FとｐＣＡＧＧＳ_Ｖ２Ｒを、Polyethyleneimine MAX（Polyscience社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、２９３Ａ細胞へトランスフェクションする。
〔３〕トランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、Ｖ２Ｒ刺激物質（例えばＡＶＰやＤＤＡＶＰ）の添加により発光強度の増加が見られるものを選抜する。
〔１〕４．０×１０6個の２９３Ａ細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地に播種し、２４時間培養する。
〔２〕pGloSenso-22FとｐＣＡＧＧＳ_Ｖ２Ｒを、Polyethyleneimine MAX（Polyscience社製）を用い、GloSensor cAMP Assay（Promega社製）に添付のプロトコールに従って、２９３Ａ細胞へトランスフェクションする。
〔３〕トランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、Ｖ２Ｒ刺激物質（例えばＡＶＰやＤＤＡＶＰ）の添加により発光強度の増加が見られるものを選抜する。
【0045】
このようにして調製された細胞を用いた活性測定方法の一例を示す。
〔１〕細胞を２４時間培養した後、２％（ｖ／ｖ）のD-Luciferin Pottasium Salt（富士フィルム和光純薬社製）を含むインキュベート用液に交換し、室温で２時間平衡化処理を行う。
〔２〕Ｖ２Ｒ刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後、ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定する。測定されたＲＬＵを、ｃＡＭＰレベルと定義する。
〔１〕細胞を２４時間培養した後、２％（ｖ／ｖ）のD-Luciferin Pottasium Salt（富士フィルム和光純薬社製）を含むインキュベート用液に交換し、室温で２時間平衡化処理を行う。
〔２〕Ｖ２Ｒ刺激物質を添加し、２０分間インキュベーションした後、ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定する。測定されたＲＬＵを、ｃＡＭＰレベルと定義する。
【0046】
なお、ＡＶＰレベルの分析方法は、上記測定法と同等性が担保される範囲内で、適宜改変することもできる。
【0047】
（その他の用語）
本発明に関する説明において、「Ｖ２Ｒ活性化レベル」とは、Ｖ２Ｒ刺激物質に対するＶ２Ｒの応答性を意味し、哺乳動物細胞中の恒常ｃＡＭＰレベルに対する、Ｖ２Ｒ刺激物質存在下におけるｃＡＭＰレベルの比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）によって定義される。
本発明に関する説明において、「Ｖ２Ｒ活性化レベル」とは、Ｖ２Ｒ刺激物質に対するＶ２Ｒの応答性を意味し、哺乳動物細胞中の恒常ｃＡＭＰレベルに対する、Ｖ２Ｒ刺激物質存在下におけるｃＡＭＰレベルの比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）によって定義される。
【0048】
本発明に関する説明において、「恒常ｃＡＭＰレベル」とは、Ｖ２Ｒ刺激物質非存在条件下で示すｃＡＭＰレベルのことを意味する。本明細書において恒常ｃＡＭＰレベルは、上記ｃＡＭＰレベル測定法の活性測定条件〔２〕で、Ｖ２Ｒ刺激物質を添加しないことで測定することができる。
【0049】
本発明に関する説明において、「Ｖ２Ｒ刺激物質」とは、Ｖ２Ｒを刺激（活性化）するリガンドを意味し、ＡＶＰや、ＤＤＡＶＰが例示される。
【0050】
本発明に関する説明において、「ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比」とは、上記ｃＡＭＰレベル測定法に従いＶ２Ｒを一過性発現する株において、Ｖ２Ｒ刺激物質であるＡＶＰを添加したときのｐＥＣ５０（-log10EC50）と、ＤＤＡＶＰを添加したときのｐＥＣ５０の比を意味し、具体的にはＡＶＰを添加したときのｐＥＣ５０（単位）を、ＤＤＡＶＰを添加したときのｐＥＣ５０（単位）で減じた値を意味する。ｐＥＣ５０の測定方法は、後述する実施例に記載の通りである。
【0051】
上記定義から理解されることであるが、「ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比」は、発現しているＶ２ＲのＡＶＰに対する親和性と、ＤＤＡＶＰに対する親和性、２つの親和性の関係性を示す指標である。
【0052】
本発明に関する説明において、「ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が高い（低い）」とは、前述のＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比の大小を意味する。当該定義から理解されることであるが、ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が高い場合、発現Ｖ２ＲはＤＤＡＶＰに対する親和性よりも、ＡＶＰに対する親和性の方が高いことを意味する。ＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が低い場合、発現Ｖ２ＲはＡＶＰに対する親和性よりも、ＤＤＡＶＰに対する親和性の方が高いことを意味する。
【0053】
なお、本発明に関するｃＡＭＰレベル測定法、動物細胞調製法、自己抗体の測定キットの詳細については、本明細書に記載された内容の他に、本明細書に記載された文献、特に特許文献４、及び特許文献４に記載された文献の内容を適宜参照することができる。
【0054】
本発明に関する説明において、アミノ酸又はアミノ酸残基については、特に記載した場合を除き、Aはアラニン、Cはシステイン、Dはアスパラギン酸、Eはグルタミン酸、Fはフェニルアラニン、Gはグリシン、Hはヒスチジン、Iはイソロイシン、Kはリシン、Lはロイシン、Mはメチオニン、Nはアスパラギン、Pはプロリン、Qはグルタミン、Rはアルギニン、Sはセリン、Tはトレオニン、Uはセレノシステイン(3)、Vはバリン、Wはトリプトファン、Yはチロシンを表す。
【0055】
本発明に関する説明において、ポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基を含む。上記の等価物は、例えばＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。
【0056】
本発明に関する説明において、「野生型Ｖ２Ｒ」とは、変異の導入されていないＶ２Ｒであることを意味する。本発明に関する説明において、変異の導入されていないＶ２Ｒアミノ酸配列とは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＶ２Ｒアミノ酸配列であることとする。本発明に関する説明において、Ｖ２Ｒの由来はヒトに限定されないが、Ｖ２Ｒの由来について特に記載のない場合、Ｖ２Ｒはヒト由来（配列番号1）であることを意味する。また、本発明に関する説明において、野生型Ｖ２Ｒのことを「ＷＴ」と表記することがある。
【0057】
本発明に関する説明において、アルファベット１文字と数字、数字の後に更にアルファベット１文字が続く文字列によって変異体を表す場合、左端のアルファベットは変異前のアミノ酸を、中央数字は当該アミノ酸残基の位置を、右端のアルファベットは変異後のアミノ酸をそれぞれ示し、左端のアミノ酸が右端のアミノ酸へ点変異した変異体であることを意味する。例えば「Ｑ９６Ｅ」であれば、９６番目のグルタミンがグルタミン酸へと置換される点変異が導入された変異体であることを意味する。
【0058】
本発明に関する説明において、タンパク質又はアミノ酸配列について「1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1-250個、1-200個、1-150個、1-100個、1-50個、1-40個、1-38個、1-37個、1-35個、1-30個、1-20個、1-15個、1-9個又は1-4個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチド又はタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
【0059】
本発明に関し、塩基配列(ヌクレオチド配列ということもある。) 、又はアミノ酸配列について「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、ＮＣＢＩ（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/）のＢＬＡＳＴによって測定された値であると定義する。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのＡｌｇｏｒｉｔｈｍには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓ又はＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。
【0060】
本発明に関し、塩基配列又はアミノ酸配列について、同一性というときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも50%、例えば60%以上、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97.5%以上さらに好ましくは99%以上の配列の同一性を指す。
【0061】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例0062】
［実施例１. Ｖ２Ｒにおける変異アミノ酸の探索］
以下に示す方法に従い、野生型Ｖ２Ｒ変異に適したアミノ酸を探索した。
以下に示す方法に従い、野生型Ｖ２Ｒ変異に適したアミノ酸を探索した。
【0063】
１－１. 野生型ヒトＶ２Ｒ構造の作製
非特許文献５に記載されているヒトＶ２Ｒの構造情報（ＰＤＢＩＤ ７ＫＨ０）をもとに、構造情報が得られていない部位を補うために野生型ヒトＶ２Ｒの構造をホモロジーモデリングより作製した。７ＫＨ０からＶ２Ｒ、ＡＶＰ以外の余分なタンパク質等の情報を削除し、ホモロジーモデリングに使用する鋳型とした。ホモロジーモデリングにはＭｏｄｅｌｌａｒ（非特許文献３）を使用し、使用するアミノ酸配列はＮＣＢＩに登録されているVasopressin V2receptor isoform 2 (NP_001139623.1)を使用した。Modellarにより１００個の構造を作製し、得られた構造の中で最もmolpdfの値が小さいものを以降の操作に用いた。
非特許文献５に記載されているヒトＶ２Ｒの構造情報（ＰＤＢＩＤ ７ＫＨ０）をもとに、構造情報が得られていない部位を補うために野生型ヒトＶ２Ｒの構造をホモロジーモデリングより作製した。７ＫＨ０からＶ２Ｒ、ＡＶＰ以外の余分なタンパク質等の情報を削除し、ホモロジーモデリングに使用する鋳型とした。ホモロジーモデリングにはＭｏｄｅｌｌａｒ（非特許文献３）を使用し、使用するアミノ酸配列はＮＣＢＩに登録されているVasopressin V2receptor isoform 2 (NP_001139623.1)を使用した。Modellarにより１００個の構造を作製し、得られた構造の中で最もmolpdfの値が小さいものを以降の操作に用いた。
【0064】
１－２. ＤＡＶＰ結合型野生型ヒトＶ２Ｒ構造の作製
１－１で得られた野生型ヒトＶ２Ｒ結合構造をＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｅｄｉｎｇｏｒ社）で操作し、ＡＶＰの８番目のアルギニンをＤ－アルギニンへと変換した。この構造をＲｏｓｅｔｔａ（非特許文献４）によりＲｅｌａｘを行い、構造の最適化を行った。Ｒｅｌａｘでは１００００個の構造を作製し、ＳＣＯＲＥの値が１００００個の構造の中央値となるものをＤＡＶＰ結合型野生型ヒトＶ２Ｒ構造とした。
１－１で得られた野生型ヒトＶ２Ｒ結合構造をＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｅｄｉｎｇｏｒ社）で操作し、ＡＶＰの８番目のアルギニンをＤ－アルギニンへと変換した。この構造をＲｏｓｅｔｔａ（非特許文献４）によりＲｅｌａｘを行い、構造の最適化を行った。Ｒｅｌａｘでは１００００個の構造を作製し、ＳＣＯＲＥの値が１００００個の構造の中央値となるものをＤＡＶＰ結合型野生型ヒトＶ２Ｒ構造とした。
【0065】
［実施例２．Ｖ２Ｒ変異体の調製］
以下に示す方法に従い、野生型Ｖ２Ｒから１アミノ酸が置換されたＶ２Ｒ変異体を調製した。
以下に示す方法に従い、野生型Ｖ２Ｒから１アミノ酸が置換されたＶ２Ｒ変異体を調製した。
【0066】
２－１．Ｖ２Ｒ変異体の設計
Ｖ２Ｒの活性に影響があると推測される変異として、ＤＡＶＰ結合型野生型ヒトＶ２Ｒの構造情報から推測された、以下の変異を検討した。
Ｑ９６、Ｑ１１９
Ｖ２Ｒの活性に影響があると推測される変異として、ＤＡＶＰ結合型野生型ヒトＶ２Ｒの構造情報から推測された、以下の変異を検討した。
Ｑ９６、Ｑ１１９
【0067】
２－２．変異Ｖ２Ｒの発現ベクター調製
２－１．に記載した変異に対応するよう、変異点に相当するヌクレオチドを挟んで３’側と５’側に２０～３０ｍｅｒの人工プライマーを設計し、野生型ヒトＶ２Ｒの３’側プライマーと変異導入するための１～３塩基を追加した５’側プライマーと、野生型ヒトＶ２Ｒを発現するベクターｐＣＡＧＧＳ＿ｈＶ２Ｒを用いて、東洋紡社ＫＯＤ-Ｏｎｅ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ＫＭＭ-１０１）によるｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法で、Ｖ２Ｒ配列への点変異導入を行った。点変異導入プラスミドを形質転換した大腸菌シングルコロニーからプラスミドを精製、シーケンス解析により点変異の導入を確認した。
２－１．に記載した変異に対応するよう、変異点に相当するヌクレオチドを挟んで３’側と５’側に２０～３０ｍｅｒの人工プライマーを設計し、野生型ヒトＶ２Ｒの３’側プライマーと変異導入するための１～３塩基を追加した５’側プライマーと、野生型ヒトＶ２Ｒを発現するベクターｐＣＡＧＧＳ＿ｈＶ２Ｒを用いて、東洋紡社ＫＯＤ-Ｏｎｅ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ＫＭＭ-１０１）によるｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法で、Ｖ２Ｒ配列への点変異導入を行った。点変異導入プラスミドを形質転換した大腸菌シングルコロニーからプラスミドを精製、シーケンス解析により点変異の導入を確認した。
【0068】
２－３．Ｖ２Ｒ変異体一過性発現細胞株の取得
４．０×１０6個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（２９３Ａ細胞）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手、Cat no. R70507）を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地とともに６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
４．０×１０6個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（２９３Ａ細胞）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手、Cat no. R70507）を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ-ＭＥＭ培地とともに６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
【0069】
２－２．にて取得したＶ２Ｒ変異体ベクター０.０２μｇと、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質を発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）１μｇを、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｉｍｉｎｅ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、２９３Ａ細胞へトランスフェクションした。上記操作によって、Ｖ２Ｒ変異体を一過性発現する、２９３Ａ細胞を取得した。
【0070】
Ｖ２Ｒ変異体の一過性発現株に対する対照として用いるため、２－２記載の野生型ヒトＶ２Ｒの発現ベクターにより、野生型ヒトＶ２Ｒ一過性発現株も取得した。
【0071】
［実施例３．Ｖ２Ｒ変異体のＡＶＰ及びＤＤＡＶＰに対する活性測定］
実施例２にて得られたＶ２Ｒ変異体ないし野生型Ｖ２Ｒを一過性発現する２９３Ａ細胞に、ＡＶＰ及びＤＤＡＶＰ（ともにペプチド研究所）を添加して、各Ｖ２ＲのＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比を測定した。
実施例２にて得られたＶ２Ｒ変異体ないし野生型Ｖ２Ｒを一過性発現する２９３Ａ細胞に、ＡＶＰ及びＤＤＡＶＰ（ともにペプチド研究所）を添加して、各Ｖ２ＲのＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比を測定した。
【0072】
測定法は以下の通りである。
（測定条件）
Ｖ２Ｒ変異体を一過性発現する２９３Ａ細胞、及び野生型Ｖ２Ｒを一過性発現する２９３Ａ細胞を２４時間培養後、細胞を回収し、１０ｍＭのD-Luciferin Potassium Salt（富士フィルム和光純薬工業製）及び０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むハンクス平衡緩衝液に懸濁し、ＡＶＰ又はＤＤＡＶＰを０、１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｐＭとなるよう添加し、また、ポジティブコントロールとしてホルスコリンを１０μＭとなるように添加した。２０分間インキュベーションした後のＲＬＵ値を９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Molecular Devices社製）で測定し、得られたＲＬＵ値を0 ｐＭのＲＬＵ値で除し（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）、さらにホルスコリン添加ウェルのＦｏｌｄ ｃｈａｎｇｅが１００％となるように規準化した（cAMP accumulation value）。得られたcAMP accumulation valueを片対数グラフにし、縦軸にcAMP accumulation value、横軸に添加したリガンド濃度をプロットし、濃度反応曲線を得た。得られた濃度反応曲線から半数効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。
（測定条件）
Ｖ２Ｒ変異体を一過性発現する２９３Ａ細胞、及び野生型Ｖ２Ｒを一過性発現する２９３Ａ細胞を２４時間培養後、細胞を回収し、１０ｍＭのD-Luciferin Potassium Salt（富士フィルム和光純薬工業製）及び０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むハンクス平衡緩衝液に懸濁し、ＡＶＰ又はＤＤＡＶＰを０、１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｐＭとなるよう添加し、また、ポジティブコントロールとしてホルスコリンを１０μＭとなるように添加した。２０分間インキュベーションした後のＲＬＵ値を９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Molecular Devices社製）で測定し、得られたＲＬＵ値を0 ｐＭのＲＬＵ値で除し（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）、さらにホルスコリン添加ウェルのＦｏｌｄ ｃｈａｎｇｅが１００％となるように規準化した（cAMP accumulation value）。得られたcAMP accumulation valueを片対数グラフにし、縦軸にcAMP accumulation value、横軸に添加したリガンド濃度をプロットし、濃度反応曲線を得た。得られた濃度反応曲線から半数効果濃度（ＥＣ５０）を算出した。
【0073】
各Ｖ２Ｒ変異体のＡＶＰ又はＤＤＡＶＰ添加時における濃度反応曲線を、図２－１及び図２－２に示す。野生型Ｖ２ＲではＡＶＰ添加時の濃度反応曲線とＤＤＡＶＰ添加時の濃度反応曲線がほぼ一致しているにもかかわらず、Ｖ２Ｒ変異体では濃度反応曲線が一致せず、ＡＶＰ優位に細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇していることが読み取れる。
【0074】
各Ｖ２Ｒ変異体のＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比の値を、下表に示す。なお、各列は導入された変異を表し、「ＷＴ」は野生型を示す。
【0075】
【表1】
【0076】
上記結果より、Ｑ９６、Ｑ１１９に変異を有する変異体において、野生型Ｖ２ＲよりもＡＶＰ／ＤＤＡＶＰ比が向上していることが読み取れる。詳細には、９６番目相当がＥ、Ｍ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、又はＴへ変異した変異体、及び１１９番目相当がＭ、Ａ、Ｃ、Ｎ、又はＴへ変異した変異体は、低い濃度のＡＶＰが測定できるものであり、かつ表１での値がＷＴの０．１を超えるものであった。中でも、９６番目相当がＥへ変異した変異体（配列番号2）、９６番目相当がＭへ変異した変異体（配列番号3）、１１９番目相当がＭへ変異した変異体（配列番号4）は、非常に低濃度のＡＶＰが測定でき、優れていた。
【0077】
［実施例の項で引用した文献］
非特許文献３：Journal of Molecular biology，234，779-815(1993)
非特許文献４：Annual Review of Biochemistry, 77, 363-382(2008)
非特許文献５：Cell Research, 31, 932～934(2021)
非特許文献３：Journal of Molecular biology，234，779-815(1993)
非特許文献４：Annual Review of Biochemistry, 77, 363-382(2008)
非特許文献５：Cell Research, 31, 932～934(2021)
【産業上の利用可能性】
【0078】
本発明は、中枢性尿崩症の診断及び治療に資するものである。
【0079】
［配列表に記載した配列の説明］
SEQ ID NO:1 human V2 receptor amino acid sequence
SEQ ID NO:2 Q96E mutant amino acid sequence
SEQ ID NO:3 Q96M mutant amino acid sequence
SEQ ID NO:4 Q119M mutant amino acid sequence
SEQ ID NO:1 human V2 receptor amino acid sequence
SEQ ID NO:2 Q96E mutant amino acid sequence
SEQ ID NO:3 Q96M mutant amino acid sequence
SEQ ID NO:4 Q119M mutant amino acid sequence
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【配列表】