特開 2024-119041 中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024119041

(43)【公開日】2024-09-02

(54)【発明の名称】中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/447 20060101AFI20240826BHJP

【ＦＩ】

G01N27/447 331E

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024016256

(22)【出願日】2024-02-06

(31)【優先権主張番号】P 2023025159

(32)【優先日】2023-02-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】504059429

【氏名又は名称】ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002963

【氏名又は名称】弁理士法人ＭＴＳ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】新多 智明

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 一謹

(57)【要約】

【課題】揮発による不安定性を改善し、測定対象化合物の吸着を防ぐことで、安定的に測定可能とする。
【解決手段】中空状の毛細管（１２）中の溶液試料の電気泳動における移動度の違いによって試料１６を分離する際に、試料１６を含む測定溶液中に非揮発性溶媒を添加して、試料１６中の電気伝導度を泳動バッファ１８より下げ、前記中空状の毛細管（１２）へ試料１６を注入した時の電場増幅スタッキングによる試料１６の濃縮効果を高める。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

中空状の毛細管中の溶液試料の電気泳動における移動度の違いによって試料を分離する際に、
試料を含む測定溶液中に非揮発性溶媒を添加して、試料中の電気伝導度を泳動バッファより下げ、前記中空状の毛細管へ試料を注入した時の電場増幅スタッキングによる試料の濃縮効果を高めることを特徴とする中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法。

【請求項2】

前記非揮発性溶媒が、水と混和可能な、常圧にて沸点１００℃以上の有機溶媒であることを特徴とする請求項１に記載の中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法。

【請求項3】

前記有機溶媒が、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチル・サルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、２－メチオキシエタノール（２－ＭＥ）のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法。

【請求項4】

試料トレイに測定試料を配置した後、３０分以上経過した後に測定することを特徴とする請求項１に記載の中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法。

【請求項5】

測定溶液に含まれる前記有機溶媒の割合が１０％以上であることを特徴とする請求項２又は３に記載の中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法。

【請求項6】

前記中空状の毛細管を用いた電場増幅スタッキングによる濃縮と試料の大量注入によるスタッキングの濃縮を併用することを特徴とする請求項１に記載の中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法に係り、特に、キャピラリー電気泳動による試料分離に用いるのに好適な、電場増幅スタッキングによる試料の濃縮効果を高めて、安定的に測定することができる中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、メタボローム研究が盛んに行われるようになり、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）－質量分析（ＭＳ）が広く使用されるようになってきている（特許文献１、２参照）。

【0003】

このＣＥ－ＭＳでは、例えば図１に示す如く、試料１６の分離を行なうためのキャピラリー１２、試料容器である注入バイアル１４中の試料１６と共に該キャピラリー１２の中に導入され、注入バイアル１４を、試料１６を分離するための泳動バッファ（以下、単にバッファと称する）１８が充填された泳動バイアル１５に交換し、キャピラリー１２の両端に高電圧を印加するための、前記バッファ１８に挿入される電極（図示省略）を備えた、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置１０と、前記泳動バイアル１５に蓋をして密閉し、ポンプにより加圧することによってバッファ１８に押し出され、前記キャピラリー１２から生ずる液流にシース液２０とシースガス２２を加えてスプレー噴霧させイオン化を行なうためのスプレイヤー２４及びニードル２６と、該ニードル２６から噴霧された試料を質量分析するための質量分析（ＭＳ）装置４０とを備えている。

【0004】

図において、２８は、注入バイアル１４もしくは泳動バイアル１５が並べられた試料トレイである。

【0005】

キャピラリー電気泳動では、夾雑成分が多い試料では、一般的に電気伝導率が高くなるため、電場増幅効果による濃縮効果が得られず、ピークがブロード化することが知られている。

【0006】

そこで、非特許文献１に示すように、アセトニトリル（ＡＣＮ）を試料に添加することで、試料中の電気伝導率を下げ、濃縮率を上げる手法が検討されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特許第４３８５１７１号公報

【特許文献2】特開２０１９－２０００７２号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Shihabi, Z. K. (1999). Acetonitrile Stacking. In Clinical Applications of Capillary Electrophoresis, 157-163, Humana Press.

【非特許文献2】Gil, E. P., Ostapczuk, P., & Emons, H. (1999). Determinationof arsenic species by field amplified injection capillary electrophoresis aftermodification of the sample solution with methanol. Analytica chimica acta, 389 (1-3), 9-19.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、ＡＣＮのような揮発性溶媒を使用すると、注入バイアル１４中の溶媒が揮発して、連続測定の際、安定的に測定することが困難であるという問題があった。

【0010】

一方、本発明に類似するものとして、非特許文献２には、濃縮効率を上げるための有機溶媒として、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を候補として挙げているが、ＤＭＦによる濃縮を示すデータはなく、安定性に関する記述もなかった。

【0011】

本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、揮発による不安定性を改善し、測定対象化合物の吸着を防ぐことで、安定的に測定することが可能な試料濃縮方法を提供することを可能とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は、中空状の毛細管中の溶液試料の電気泳動における移動度の違いによって試料を分離する際に、試料を含む測定溶液中に非揮発性溶媒を添加して、試料中の電気伝導度を泳動バッファより下げ、前記中空状の毛細管へ試料を注入した時の電場増幅スタッキングによる試料の濃縮効果を高めることを特徴とする中空状の毛細管を用いた電気泳動における試料濃縮方法により、前記課題を解決するものである。

【0013】

ここで、前記非揮発性溶媒を、水と混和可能な、常圧にて沸点１００℃以上の有機溶媒とすることができる。「常圧にて沸点１００℃以上の有機溶媒」とするのは、安定的に測定するためには揮発性が低い溶媒を使用する必要があるためである。

【0014】

又、前記有機溶媒を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチル・サルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、２－メチオキシエタノール（２－ＭＥ）のいずれかとすることができる。

【0015】

なお、測定溶液中に添加する非揮発性溶媒はＤＭＦ、ＤＭＳＯ、２－ＭＥなどに限定されず、水よりも揮発しにくい他の溶媒を用いることも可能である。

【0016】

又、試料トレイに測定試料を配置した後、３０分以上経過した後に測定することができる。「３０分以上経過した後に測定する」のは、本発明により安定性が向上するためである。

【0017】

望ましくは０．５時間から４８時間の範囲であり、最も望ましくは１時間から２４時間の範囲とすることができる。一般的に有機溶媒は揮発性が高く、時間経過により溶媒量が減少・測定試料中の分析対象物質濃度が経時的に上昇し、結果的に測定試料を装置にセットした後のタイミング依存で測定値が変動している。特に、昨今ではオートサンプラーの利用が一般的で、試料トレイに測定試料をセットした後、必ずしも一定でないある程度の時間が経過した後に測定されることが多い。そのような状況では前述のように測定試料セット後のタイミング次第で測定値が変動してしまい精確な測定値を得る上で障害となるため、揮発性の低い有機溶媒を添加することで測定試料の揮発による減少を抑え、測定値の変動を抑制して安定化させている。

【0018】

又、測定溶液に含まれる前記有機溶媒の割合を１０％以上とすることができる。有機溶媒の割合は、望ましくは１％～９５％であり、最も望ましくは１０％～５５％である。

【0019】

又、前記中空状の毛細管を用いた電場増幅スタッキングによる濃縮と試料の大量注入によるスタッキングの濃縮を併用することができる。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、揮発による不安定性を改善し、測定対象化合物の吸着を防ぐことで、安定的に測定することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＣＥ－ＭＳ装置の構成例を模式的に示す図

【図2】本発明の第１実施形態を模式的に示す図

【図3】第１実施形態において、ＤＭＦの濃度を変えた際の測定結果のピーク形状を比較して示すチャート

【図4】同じくピーク高さ／面積を比較して示す図

【図5】同じく有機溶媒を変えた際の測定結果のピーク形状を比較して示すチャート

【図6】同じくピーク高さ／面積を比較して示す図

【図7】本発明の第２実施形態を模式的に示す図

【図8】第２実施形態の測定結果を従来例と比較して示す図

【図9】濃縮効果に係る検討手順を示す流れ図

【図10】第２実施形態の測定結果のピーク形状を示すチャート

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実施例に記載した内容により限定されるものではない。又、以下に記載した実施形態及び実施例における構成要件には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のもの、いわゆる均等の範囲のものが含まれる。更に、以下に記載した実施形態及び実施例で開示した構成要素は適宜組み合わせてもよいし、適宜選択して用いてもよい。

【0023】

発明者の実験によると、非揮発性溶媒であるＤＭＦを試料１６中に添加することで、ＡＣＮを用いた場合と同様に濃縮率を上げて揮発による不安定性を改善し、測定対象化合物の吸着を防ぐことで、安定的に測定可能となることが分かった。

【0024】

本発明の第１実施形態を図２に模式的に示す。

【0025】

本実施形態では、まず図２（１）に示す如く、ＣＥ１０の入口側からポンプを用いて注入バイアル１４内を加圧し、試料１６をバッファ１８が充満されたキャピラリー１２内に注入する。注入が終了した状態を図２（２）に示す。

【0026】

次いで図２（３）に示す如く、電圧を印加する。この過程で、正電荷を持つ化合物がバッファ１８との境界面で圧縮されて濃縮試料１７となる。この際、有機溶媒を添加することで、試料濃縮効果が得られる最大注入量を上げることができ、その範囲はキャピラリー１２の全長の０．５％～５０％の試料である。

【0027】

次いで図２（４）に示す如く、電気泳動を行うと、濃縮試料１７が、分離試料１７ａ、１７ｂ、１７ｃ・・・へと分離される。

【0028】

再溶解液に添加するＤＭＦの濃度を変えた際の濃縮効果を確認した。

【0029】

前処理にはプールヒト血漿を使用し、添加物ＥＳはアンジオテンシンＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎII標準溶液（ｆ．ｃ．５μｇ／ｍＬ）とした。

【0030】

粘性補正を行い、各条件の注入量が同じになるように注入時間を設定した場合のピーク形状を図３に、ピーク高さＨｅｉｇｈｔと面積Ａｒｅａの比を図４に示す。ＤＭＦ濃度１０％でも一定の濃縮効果を確認でき、濃度を１０％→２０％→５０％と上げるにしたがって濃縮効果は高くなることが確認できた。

【0031】

次に、再溶解液にＤＭＦ、及び、ＤＭＦ以外の溶媒であるＤＭＳＯ、２－ＭＥを添加した際の濃縮効果を確認した。

【0032】

前処理にはプールヒト血漿を使用し、添加物ＥＳはアンジオテンシンＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎII標準溶液（ｆ．ｃ．５μｇ／ｍＬ）とした。

【0033】

粘性補正を行い、各条件の注入量が同じになるように注入時間を設定した場合のピーク形状を図５に、ピーク高さＨｅｉｇｈｔと面積Ａｒｅａの比を図６に示す。ＤＭＦ以外の溶媒を使用してもＤＭＦと同様の濃縮効果が得られることが確認できた。

【0034】

続いて大量注入法と組み合わせた第２実施形態を図７に示す。大量注入を併用した場合、より濃縮効果が大きくなるが、必ずしも大量注入を併用する必要は無い。

【0035】

具体的には、図７（１）に示す如く、試料１６をＣＥ１０の入口側から注入する。

【0036】

次いで注入バイアル１４を泳動バイアル１５に交換し、図７（２）に示す如く、電圧を印加した状態で、ポンプにより泳動バイアル１５内を減圧し試料溶媒を入口側へと引き込む。この過程で、正電荷を持つ化合物がバッファ１８との境界面で圧縮されて濃縮試料１７となる。

【0037】

次いで図７（３）に示す如く、試料溶媒の幅が小さくなったところでポンプをＯＦＦにして通常のキャピラリー電気泳動と同様に電気泳動を行うと、濃縮試料１７が、分離試料１７ａ、１７ｂ・・・へと分離される。

【0038】

実験に際して、標品は、ペプチドとして、安定性の検討ではグルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）、グレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）、エンドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）－１、オレキシン（Ｏｒｅｘｉｎ）Ｂ、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）を用い、濃縮の検討ではアンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）IIを用いた。なお、標品はペプチドに限定されず、カオチン性化合物であれば良い。

【0039】

ここでは、５種類の中分子ペプチド標品をＣＥ－ＭＳ（Ｃａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で測定し、安定性を評価した。

【0040】

測定試料に対し、ＡＣＮ５０％を添加した群、ＤＭＦ２０％を添加した群、未添加群の３群について、それぞれ３ｒｕｎずつ測定した。測定結果を図８に比較して示す。図８中の補正面積値については、粘性の違いによる注入量の補正を行っている。未添加群では特にＧｈｒｅｌｉｎやＧｌｕｃａｇｏｎなど、一部のペプチドが経時的に減少していることから、バイアルへの吸着が起こっているものと思われる。また、ＡＣＮ５０％添加群では、Ｇｈｒｅｌｉｎ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１、ＯｒｅｘｉｎＡ、Ｉｎｓｕｌｉｎなど、多くの化合物で経時的な増加が確認されており、これはＡＣＮの揮発による影響と推察される。ＤＭＦ２０％添加群では、これらの問題が改善され、安定的に測定することが可能になる。

【0041】

濃縮効果に係る検討手順は、図９に示す如く、最初にＡＣＮ５０％で大量注入法での濃縮が可能かを検討した後に、ＤＭＦ２０％に適用させた。図１に示したＣＥ－ＭＳ装置により、ヒト血漿の前処理済試料を用いて、ＣＥ－ＭＳ（Ｃａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で注入量を上げた際に濃縮が可能か検討した。図７は、注入量が５０ｍｂａｒ×１０ｓの通常メソッドと比べ、試料注入量を３０倍にした大量注入法（５０ｍｂａｒ×３００ｓ）で測定している状態である。

【0042】

ヒト血漿前処理済試料にＤＭＦ２０％を添加することで、大量注入法による濃縮が可能であることが確認できた。図１０から明らかなように、注入量が５０ｍｂａｒ×１０ｓの通常メソッドより３０倍多く注入した大量注入法の条件でも、ピーク形状はシャープになり、アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）IIの場合、通常メソッドに比べて高さ比較で１０．８倍、面積比較で２８．２倍となることが確認できた。

【0043】

このように、ＤＭＦを添加することで、キャピラリー１２に試料を大量に注入して濃縮することが可能になった。

【0044】

なお、前記実施形態においては、本発明がＣＥ－ＭＳに適用されていたが、本発明の適用対象はこれに限定されず、ＣＥ－電気伝導度検出器、ＣＥ－レーザー励起発光（ＬＩＦ）、ＵＶ吸光度検出器など、他の検出器と組み合わせたＣＥや、ＣＥ以外の中空状の毛細管を用いた試料分離にも同様に適用できることは明らかである。添加する有機溶媒もＤＭＦに限定されず、例えばＤＭＳＯ、２－ＭＥなどを用いることができる。

【符号の説明】

【0045】

１０…キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置
１２…キャピラリー
１４…注入バイアル
１５…泳動バイアル
１６…試料
１７…濃縮試料
１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…分離試料
１８…（泳動）バッファ
２０…シース液
２２…シースガス
２４…スプレイヤー
２６…ニードル
４０…質量分析（ＭＳ）装置

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】