特開 2024-119281 ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を分解資化可能な微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024119281

(43)【公開日】2024-09-03

(54)【発明の名称】ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を分解資化可能な微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/14 20060101AFI20240827BHJP

   C02F 3/34 20230101ALI20240827BHJP

   C12N 11/04 20060101ALN20240827BHJP

【ＦＩ】

C12N1/14 A ZNA

C02F3/34 Z

C12N11/04

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023026067

(22)【出願日】2023-02-22

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （その１） 発行日 ２０２２年１０月１５日 刊行物 日本水処理生物学会誌 別巻 第４２号 （その２） 開催日 ２０２２年１１月１８日から２０２２年１１月２０日 集会名、開催場所 日本水処理生物学会第５８回大会（熊本大会） 熊本大学黒髪南地区（熊本市中央区黒髪２－３９－１） （その３） ウェブサイトの掲載日 ２０２２年７月６日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐ：／／ｇｅｔｅｎｔｒｙ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｇｅｔｅｎｔｒｙ／ｎａ／ＬＣ６７１５２１？ｆｉｌｅｔｙｐｅ＝ｈｔｍｌ （その４） ウェブサイトの掲載日 ２０２２年１０月１２日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐ：／／ｇｅｔｅｎｔｒｙ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｇｅｔｅｎｔｒｙ／ｎａ／ＬＣ７３１８２１？ｆｉｌｅｔｙｐｅ＝ｈｔｍｌ （その５） 提出日 ２０２２年１０月２５日 寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター （その６） ウェブサイトの掲載日 ２０２３年１月２７日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｎｂｒｃ／ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｎｂｒｃ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ／ＮＢＲＣＤｉｓｐＳｅａｒｃｈＳｅｒｖｌｅｔ？ｌａｎｇ＝ｊｐ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｎｂｒｃ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ／ＮＢＲＣＣａｔａｌｏｇｕｅＤｅｔａｉｌＳｅｒｖｌｅｔ？ＩＤ＝ＮＢＲＣ＆ＣＡＴ＝００１１５８５８

(71)【出願人】

【識別番号】513099603

【氏名又は名称】兵庫県公立大学法人

(71)【出願人】

【識別番号】391010895

【氏名又は名称】小西化学工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】武尾 正弘

(72)【発明者】

【氏名】戸村 正稔

(72)【発明者】

【氏名】福島 大樹

(72)【発明者】

【氏名】新家 悟之

【テーマコード（参考）】

4B033

4B065

4D040

【Ｆターム（参考）】

4B033NA13

4B033NB48

4B033NB62

4B033NC06

4B033ND04

4B033ND08

4B033NG03

4B033NH10

4B065AA58X

4B065AC20

4B065CA55

4D040DD07

4D040DD12

4D040DD16

(57)【要約】

【課題】ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解可能な微生物を提供する。さらに、当該微生物を用いたジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法を提供する。
【解決手段】ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有する、真菌、及び当該真菌により、対象物中のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させる工程を含む、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有する、真菌。

【請求項2】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能を有する、請求項１に記載の真菌。

【請求項3】

エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）に属する真菌である、請求項１に記載の真菌。

【請求項4】

エクソフィアラ・ゼノバイオティカ種（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ）に属する真菌である、請求項１に記載の真菌。

【請求項5】

（Ａ）２８Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号１で示される塩基配列と９９％以上の同一性を有する、及び／又は
（Ｂ）ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号２で示される塩基配列と９９％以上の同一性を有する、
請求項１に記載の真菌。

【請求項6】

４，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の資化能を有する、請求項１に記載の真菌。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の真菌により、対象物中のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させる工程を含む、
ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法。

【請求項8】

前記真菌が固定化真菌である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有する真菌を含む、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を分解資化可能な微生物、当該微生物を用いたジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

４，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン（明細書及び図面において、「ジヒドロキシジフェニルスルホン」又は「４，４’－ＤＤＳ」と略することもある）は、更に需要が見込まれるポリエーテルスルホンやポリスルホン等の耐熱性エンジニアリングプラスチックの原材料等で大量に使用されている（例えば、強度や耐候性を必要とする航空機機体素材への使用）。しかしながら、類似構造のビスフェノール類に比べ、極めて生分解されにくく、ジヒドロキシジフェニルスルホンを単一炭素源として利用し、完全分解することのできる微生物は未だ報告されていない。

【0003】

一方、ジヒドロキシジフェニルスルホンは他のビスフェノール類に比べて水溶性が高いため、生物蓄積性や生物濃縮性は低い。産業上、一般環境の浄化よりはむしろ発生源でのジヒドロキシジフェニルスルホンの除去や局所的に高濃度で含まれる環境に対する効果的な浄化法の開発が望まれる。

【0004】

これまでにジヒドロキシジフェニルスルホンの生物分解については、土壌や汚泥、河川水等の環境試料を出発材料とする、混合微生物集団による分解の報告がいくつかあるが、ジヒドロキシジフェニルスルホンを資化できる本質的な微生物は報告されていない。

【0005】

汚泥や土壌等を出発材料とする混合微生物集団や集積物を用いたジヒドロキシジフェニルスルホンの分解では、ジヒドロキシジフェニルスルホンを分解する本質的な菌株の組み合わせや分解の仕組みが不明である。それ故、それらを活用したジヒドロキシジフェニルスルホンの分解処理法を開発したり、その処理系を維持したりする場合、常にその能力の低下や消失のリスクがあり、一旦そのようなケースに遭遇すると原因の究明や分解能力の再構築が困難である。

【0006】

フェノール類化合物を分解する能力を有する微生物としては、特許文献１及び２に報告がなされている。

【0007】

特許文献１では、好気条件下で、フェノールを資化し、共代謝でトリクロロエチレンを分解することができるβプロテオバクテリアに属する細菌が報告されている。

【0008】

特許文献２では、フェノール類化合物を分解する能力を有する微生物としてのアルカリゲネス属微生物は、一般の汚泥中に極めて微量ながら存在する可能性があり、その汚泥を担体の存在下に連続曝気条件下でフェノール類化合物含有排水に馴化すると、その極めて微量のアルカリゲネス属微生物であっても、その汚泥中における主たる微生物の一つといえるまでに選択的に増殖されることが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２００２－１４２７５６号公報

【特許文献2】特開２０１６－０４１３９３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解可能な微生物を提供することを目的とする。さらに、本発明は、当該微生物を用いたジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

好気的生物学的廃水処理法や土壌浄化法でジヒドロキシジフェニルスルホン含有廃水やジヒドロキシジフェニルスルホン汚染土壌等を浄化する場合、処理系に安定して微生物を定着させ、その分解能力を発揮させるためには、ジヒドロキシジフェニルスルホンを基質として資化及び増殖できる微生物の存在が極めて重要かつ有利である。そこで、本発明者らは、従来までジヒドロキシジフェニルスルホン資化微生物が明確に分離されてこなかったため、新規にジヒドロキシジフェニルスルホン資化微生物を環境試料から取得することを試みた。

【0012】

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ジヒドロキシジフェニルスルホンを分解及び資化できる真菌エクソフィアラ・ゼノバイオティカ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ）ＢＰＳ１株を初めて分離及び同定した。また、従来までは、ジヒドロキシジフェニルスルホン分解混合微生物系を用いても５０ｍｇ／Ｌ程度のジヒドロキシジフェニルスルホンの分解で、しかもその分解に長時間を必要としていたが、本発明により、この菌株の単独使用で、短時間かつ高濃度でのジヒドロキシジフェニルスルホンの分解が示唆された。

【0013】

本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の真菌、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法等を提供するものである。

【0014】

項１．ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有する、真菌。
項２．ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能を有する、項１に記載の真菌。
項３．エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）に属する真菌である、項１又は２に記載の真菌。
項４．エクソフィアラ・ゼノバイオティカ種（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ）に属する真菌である、項１又は２に記載の真菌。
項５．（Ａ）２８Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号１で示される塩基配列と９９％以上の同一性を有する、及び／又は
（Ｂ）ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡが、配列番号２で示される塩基配列と９９％以上の同一性を有する、
項１～４のいずれか一項に記載の真菌。
項６．４，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の資化能を有する、項１～５のいずれか一項に記載の真菌。
項７．項１～６のいずれか一項に記載の真菌により、対象物中のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させる工程を含む、
ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法。
項８．前記真菌が固定化真菌である、項７に記載の方法。
項９．ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有する真菌を含む、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理剤。

【発明の効果】

【0015】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物は産業上重要な化学物質でありながら、生分解性が極めて悪いことが知られているが、本発明により、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化能及び／又は分解能を有する真菌が初めて提供される。これまでに単一のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化する微生物は明確に報告されておらず、特に真菌の報告は今まで無く、本発明の真菌が初めてである。

【0016】

また、従来までは、ジヒドロキシジフェニルスルホン分解混合微生物系を用いても、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の分解に長時間を必要としていたが、本発明により、この真菌の単独使用で、短時間かつ高濃度でのジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の分解が可能となる。これは、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有工業廃水等の生物処理への適用の可能性を示唆するものである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ジヒドロキシジフェニルスルホン分解菌の集積培養の経時変化を示すグラフである。

【図2】１／２ＬＢ寒天培地上の菌叢を示す写真である。

【図3】分離株ＢＰＳ１株によるジヒドロキシジフェニルスルホンの分解及び増殖を示すグラフである。値は平均±ＳＤ、ｎ＝３。

【図4】分離株ＢＰＳ１株の２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅した部分を示す図である。

【図5】分離株ＢＰＳ１株の２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（５８７ｂｐ）を示す図である。

【図6】分離株ＢＰＳ１株のＩＴＳ領域の増幅した部分を示す図である。

【図7】分離株ＢＰＳ１株のＩＴＳ領域の増幅した部分の塩基配列（５７１ｂｐ）を示す図である。

【図8】株式会社日立ハイテク製卓上顕微鏡ＴＭ－１０００及び日本電子株式会社製卓上走査電子顕微鏡ＪＣＭ－６０００による分離株の形態観察の結果を示す写真である。

【図9】分離株ＢＰＳ１株によるジヒドロキシジフェニルスルホンの分解と溶存炭素量との関係を示すグラフである。

【図10】分離株ＢＰＳ１株によるジヒドロキシジフェニルスルホンの分解と遊離硫酸イオンの生成の関係を示すグラフである。

【図11】分離株ＢＰＳ１株による初期濃度の異なるジヒドロキシジフェニルスルホンの分解を示すグラフである。

【図12】分離株ＢＰＳ１株の固定化細胞によるジヒドロキシジフェニルスルホンの分解を示すグラフである。

【図13】分離株ＢＰＳ１株による２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン（図面において、「２，４’－ＤＤＳ」と略する）の分解及び増殖を示すグラフである。値は平均±ＳＤ、ｎ＝３。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

【0019】

本発明の真菌は、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有することを特徴とする（以下、「本発明の真菌」と称することもある）。

【0020】

本明細書において、「資化」とは微生物がある化合物を栄養源として利用することを意味し、ある化合物を栄養源として利用しないことを含む「分解」とは異なるものとする。

【0021】

当該真菌としては、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有するものであればいかなるものでもよい。中でも、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能を有するものが好ましい。

【0022】

当該真菌は、例えば、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を含有する廃水を処理している処理場の活性汚泥を分離源とし、後述する実施例に記載の方法等を用いることで取得することが可能である。

【0023】

かかる真菌としては、例えば、エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）に属する真菌が挙げられ、エクソフィアラ属に属する真菌の中でもエクソフィアラ・ゼノバイオティカ種（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ）に属する真菌が好ましい。

【0024】

エクソフィアラ・ゼノバイオティカ種に属する真菌の一例としては、エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株が挙げられる。後述する実施例で示すように、ＢＰＳ１株はジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び分解能を有する。以下に、エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株の菌学的性質及び遺伝学的性質を示す。

【0025】

（ｉ）菌学的性質
エクソフィアラ・ゼノバイオティカ種を定義したＤｅ Ｈｏｏｇらの論文（Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，９０，２５７－２６８（２００６））のＦｉｇ．３のイラストと酷似した形態、すなわち、菌糸様細胞、酵母様細胞、分生胞子、分生胞子生産細胞等が存在する。

【0026】

（ｉｉ）遺伝学的性質
エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株の染色体ＤＮＡに含まれる２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（以下、２８Ｓ ｒＤＮＡという）領域の塩基配列を配列番号１に示す。また、エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株の染色体ＤＮＡに含まれるＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）－５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（以下、ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡという）領域の塩基配列を配列番号２に示す。これら２８Ｓ ｒＤＮＡ領域及びＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列の決定は、エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行って２８Ｓ ｒＤＮＡ領域及びＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域を増幅し、常法に従ってその全長の塩基配列を決定することによって行った。なお、２８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子領域のＰＣＲによる増幅には図４に記載のプライマーＮＬ１及びＮＬ２を使用し、また、ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲによる増幅には図６に記載のプライマーＩＴＳ１及びＩＴＳ４を使用した。なお、取得した配列からプライマー配列は除去している。

【0027】

エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株の２８Ｓ ｒＤＮＡ領域及びＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列についてデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、ＢＰＳ１株は、エクソフィアラ・ゼノバイオティカ種に属する真菌であることが確認された。

【0028】

当該エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託されている（２０２２年１１月９日）。具体的には、エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株は、受託番号ＮＢＲＣ１１５８５８で寄託されている。この菌株は、所定の手続によって寄託機関から分譲を受けることができる。

【0029】

上記エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株以外に、当該真菌の具体例としては、配列番号１で示される塩基配列と９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる２８Ｓ ｒＤＮＡを有する真菌、及び配列番号２で示される塩基配列と９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡを有する真菌が例示される。ここでの同一性としては、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上等も挙げられる。

【0030】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物は産業上重要な化学物質でありながら、生分解性が極めて悪いことが知られているが、エクソフィアラ・ゼノバイオティカＢＰＳ１株は、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び分解することが可能である。これまでに単一のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化する微生物は明確に分離されていなかったため、ＢＰＳ１株は新規の微生物である。さらに、真核生物のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の分解資化菌の報告は存在しないことから、この点においてもＢＰＳ１株は新規の微生物と考えられる。

【0031】

本発明におけるジヒドロキシジフェニルスルホン化合物としては、４，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、２，２’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、それらの塩等が挙げられる。ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物は、１種のみ又は２種以上の組合せのいずれであってもよい。

【0032】

そのような塩としては、特に限定されず、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、鉄塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；アンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸等の有機酸との酸付加塩が挙げられる。

【0033】

本発明のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理方法は、本発明の真菌により、対象物中のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させる工程を含むことを特徴とする（以下、「本発明の処理方法」と称することもある）。

【0034】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物等は、上記と同様である。

【0035】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物とは、本発明の真菌による処理の対象物となるものであって、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物が含有するものである限り特に限定されない。ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の具体例としては、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を含有する（工場等からの）廃水、下水及び汚水、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を含有する（工場敷地、工場跡地等の）土壌等が挙げられる。本発明の処理方法により、対象物中のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させることが可能であるので、対象物となる廃水、土壌等を浄化することができる。

【0036】

本発明の処理方法において、真菌を固定化して用いることもできる。真菌の固定化には、包括法、架橋法、担体結合法等が存在する。包括法とは真菌を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、又は半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する方法であり、架橋法とは真菌を２個又はそれ以上の官能基を持った試薬（多官能性架橋剤）で架橋する方法であり、担体結合法とは水不溶性の担体に真菌を結合させる方法である。固定化に用いられる固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン、活性炭、ゼオライト、セライト、セルロース、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

【0037】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させる工程は、好気条件下で実施されることが望ましい。

【0038】

本発明の処理方法において、資化及び／又は分解させるジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の（液体中の）濃度は、例えば、４，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン、２，２’－ジヒドロキシジフェニルスルホンの場合、１μＭ以上、５ｍＭ以下である。

【0039】

本発明の処理方法により、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を、例えば、初期濃度の１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下まで資化及び／又は分解させることが可能である。

【0040】

また、本発明の処理方法により、対象物中のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させるために必要な期間は、例えば、１時間以上、３日以下である。

【0041】

本発明において真菌を使用する際の使用条件（使用温度、培養条件等）は特に限定されるものではなく、使用する真菌の性質及び特徴に応じてジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解に最適な使用条件を選択すればよい。

【0042】

本発明の真菌により、対象物中のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解させるために、対象物に本発明の真菌の添加、投与、接触等を行う。本発明の真菌は、いわゆる活性汚泥法のような一般的な好気的生物処理法に、乾燥粉末や液体の高濃度微生物製剤として添加し、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物分解能力を既存の処理法に与える方法、あるいは一般的な微生物固定化法により高濃度固定化物を調製後、廃水処理系に投入する方法等で工業廃水の処理に適用できる。また、本発明の真菌は、土壌や水系に上記の形態で直接散布することでも使用可能である。その際に使用する本発明の真菌の量は特に限定されず、使用する真菌の種類等に応じてジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を資化及び／又は分解に最適な量を選択すればよい。

【0043】

従来までは、ジヒドロキシジフェニルスルホン分解混合微生物系を用いても、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の分解に長時間を必要としていたが、本発明の処理方法によって、本発明の真菌の単独使用で、短時間かつ高濃度でのジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の分解が可能となる。これは、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有工業廃水等の生物処理への適用の可能性を示唆するものである。本発明により、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物を含む工業廃水等を環境フレンドリーな方法で浄化することが可能となる。

【0044】

本発明のジヒドロキシジフェニルスルホン化合物含有物の処理剤は、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物の資化能及び／又は分解能を有する真菌を含むことを特徴とする（以下、「本発明の処理剤」と称することもある）。

【0045】

ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物等は、上記と同様である。

【0046】

本発明の処理剤は、基本的には上記真菌を含むものであればよく、その他に、培地成分、保護剤、ｐＨ調整剤等を含むものであってもよい。本発明の処理剤の形態としては、例えば、ペレット状、粉末状、繊維状等の固形形態、液状形態等が挙げられる。

【0047】

本発明によれば、目標１２「持続可能な消費生産形態を確保する」等の持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）の達成に貢献することができる。

【0048】

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（Ｔｈｅ ｔｅｒｍ “ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ” ｉｎｃｌｕｄｅｓ “ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ” ａｎｄ “ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ．”）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。

【0049】

また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。

【実施例0050】

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。

【0051】

（１）和歌山市和歌川終末処理場から採取した活性汚泥を微生物源として、これを１ｍＭ－ジヒドロキシジフェニルスルホンを含む無機塩培地１００ｍＬ（Ｋ_２ＨＰＯ_４ １ｇ／Ｌ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ，ＦｅＣｌ_３ ０．０２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ０．１ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ_２ ０．１ｇ／Ｌ，ｐＨ７．４，以下ＭＳＢと略す）に１％（ｖ／ｖ）で植種し、３０℃、１５０ｒｐｍで回転振盪培養によるジヒドロキシジフェニルスルホン分解微生物群の集積を行った。その結果、図１に示す通り、１ヶ月以上の馴養の後、２週間程度で１ｍＭのジヒドロキシジフェニルスルホン（約２５０ｍｇ／Ｌ）を完全に消失させる微生物集積物を得た。ジヒドロキシジフェニルスルホンの分析はＨＰＬＣによるＵＶ吸収（２７５ｎｍ）検出で行ったが、この波長での検出でクロマトグラム上には顕著な中間体は検出されなかったため、ジヒドロキシジフェニルスルホンの芳香環は壊れた可能性が高いと推定された。

【0052】

（２）ジヒドロキシジフェニルスルホン分解集積物を希釈して１ｍＭ－ジヒドロキシジフェニルスルホンを含むＭＳＢ寒天培地（寒天濃度１．５％ｗ／ｖ）あるいは１／２ＬＢ寒天培地（バクトトリプトン５ｇ／Ｌ，バクトイーストエキストラクト２．５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０，寒天濃度１．５％ｗ／ｖ）に塗沫し、３０℃で静置培養したところ、図２の写真の真菌と推定される菌株を得た。

【0053】

（３）本菌株を約０．５ｍＭ－ジヒドロキシジフェニルスルホン（約１２５ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳＢ液体培地に１白金耳植種し、３０℃、１５０ｒｐｍで回転振盪培養したところ、図３に示す通り、１５日間でほぼ完全にジヒドロキシジフェニルスルホンを消失させ、濁度による本質的な菌体の増殖も確認できた。これにより、本菌株をジヒドロキシジフェニルスルホン分解資化菌ＢＰＳ１株と命名した。

【0054】

（４）寒天培地上の菌体の一部を採取し、図４に示すプライマーを表１の組成のＰＣＲ反応液に入れた後、適切な温度プログラムにより２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域をＰＣＲ法で増幅した結果、０．６ｋｂサイズのＤＮＡ断片が得られた。このＰＣＲ増幅断片の塩基配列を解析したところ、プライマー配列を除き、図５に示す５８７ｂｐの塩基配列（ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＬＣ６７１５２１）が得られた。Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴによる相同性検索の結果、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ＣＢＳ １２８０９３株、１２８１０４株、１２８０９５株、１２７９０９株の２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列と９９．６５％、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｓｐｉｎｉｆｅｒａ ＣＢＳ １２８０９１株、１２８０８９株とも９９．６５％の相同性があった。この結果から、少なくとも本菌株は、黒色酵母として知られるＥｘｏｐｈｉａｌａ属の真菌と推定された。これまでに真核生物のジヒドロキシジフェニルスルホン分解資化菌の報告は存在しないため、新規のジヒドロキシジフェニルスルホン分解資化菌と考えられる。

【0055】

【表1】

【0056】

さらに、図６に示すプライマーを表１の組成のＰＣＲ反応液に入れた後、適切な温度プログラムによりＩＴＳ領域をＰＣＲ法で増幅した結果、０．６ｋｂサイズのＤＮＡ断片が得られた。このＰＣＲ増幅断片の塩基配列を解析したところ、プライマー配列を除き、図７に示す５７１ｂｐの塩基配列（ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＬＣ７３１８２１）が得られた。Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴによる相同性検索の結果、表２に示す様にＥｘｏｐｈｉａｌａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ＣＢＳ １２７９０９株、ｓｔｒａｉｎ Ａ４４株、ＢＭＵ ００２２３株、ＩＦＭ ５８５４６株のＩＴＳ領域の配列と１００％の相同性があった。この結果から、本菌株は、黒色酵母として知られるＥｘｏｐｈｉａｌａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ種の真菌と同定された。

【0057】

【表2】

【0058】

（５）本菌株の卓上走査電子顕微鏡（Ｍｉｎｉｓｃｏｐｅ（登録商標） ＴＭ－１０００，株式会社日立ハイテク及び日本電子株式会社製卓上走査電子顕微鏡ＮｅｏＳｃｏｐｅ（登録商標） ＪＣＭ－６０００）による形態観察の結果、図８に示す通り、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａの種の定義を行なったＤｅ Ｈｏｏｇらの論文（Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，９０，２５７－２６８（２００６））のＦｉｇ．３のイラストと酷似した形態、すなわち、菌糸様細胞、酵母様細胞、分生胞子、分生胞子生産細胞等が観察された。この結果も前記同定を支持するものである。

【0059】

（６）本菌株ＢＰＳ１株によるジヒドロキシジフェニルスルホンの資化を補強するため、前記（３）のジヒドロキシジフェニルスルホン分解試験と同様の分解試験を実施し、ジヒドロキシジフェニルスルホン分解に伴う溶存炭素量の変化を株式会社島津製作所製ＴＯＣ－Ｖ_ＣＳＮを用い、ＮＰＯＣ法で測定した。その結果、図９に示す通り、約０．４８ｍＭ（約１２０ｍｇ／Ｌ）のジヒドロキシジフェニルスルホンが１５日間でほぼ消失し、それに伴い約５０ｍｇＣ／Ｌの炭素量の減少が観測された。ジヒドロキシジフェニルスルホン（Ｃ_１２Ｈ_１０Ｏ_４Ｓ，ＭＷ＝２５０．２７）の理論炭素率は５７．６％（１４４／２５０＝０．５７６）であるので、投入された理論炭素量は１２０×０．５７６＝６９．１ｍｇＣ／Ｌと計算される。この結果から、投入したジヒドロキシジフェニルスルホンの炭素の７２．５％（５０／６９＝０．７２５）が消失したことになる。減少分の炭素は、資化されて菌体への炭素固定に使用されたり、あるいは呼吸等によりＣＯ_２として放出されたと考えられる。

【0060】

（７）本菌株ＢＰＳ１株によるジヒドロキシジフェニルスルホンの分解をさらに補強するため、ＭＳＢの組成を硫黄成分なしのＳ－ｆｒｅｅ ＭＳＢ（Ｋ_２ＨＰＯ_４ １ｇ／Ｌ，（ＮＨ_４）Ｃｌ ０．５ｇ／Ｌ，ＮａＮＯ_３ ０．５ｇ／Ｌ，ＭｇＣｌ_２ ０．２ｇ／Ｌ，ＦｅＣｌ_３ ０．０２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ０．１ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ_２ ０．１ｇ／Ｌ，ｐＨ７．４）に変更し、前記（３）と同様のジヒドロキシジフェニルスルホン分解試験を実施した。その結果、図１０に示す通り、約０．５５ｍＭのジヒドロキシジフェニルスルホンは１５日間でほぼ消失し、それに伴い０．３ｍＭ以上の遊離硫酸イオンが検出された。したがって、ジヒドロキシジフェニルスルホンの芳香環をつなぐスルホン部分の硫黄原子はかなりの量が硫酸イオンとして遊離したことが明らかとなった。本試験では、ＨＰＬＣによるイオンクロマトグラフィーで硫酸イオンのみを分析したため、亜硫酸イオンやチオ硫酸イオンのような他の無機硫黄イオン種として硫黄原子が存在する可能性もある。この結果からも、ジヒドロキシジフェニルスルホンのかなりの構造が破壊されたことが明確である。

【0061】

（８）本菌株ＢＰＳ１株がどの程度のジヒドロキシジフェニルスルホン分解能力を有するかを確認するため、ジヒドロキシジフェニルスルホンの初期濃度を１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ程度に調整した培地を用いて分解試験を実施した。その結果、図１１に示す通り、２ｍＭ弱（約１．８ｍＭ，４５０ｍｇ／Ｌ）の濃度までは同じ分解試験法で分解が可能であることがわかったが、６ｍＭでは分解が途中で停止した。この濃度のジヒドロキシジフェニルスルホンの微生物分解はこれまでに報告された例はない。

【0062】

（９）実廃水処理系を想定し、ジヒドロキシジフェニルスルホンの分解にかかる時間を大幅に短縮するために、固定化細胞によるジヒドロキシジフェニルスルホンの分解を試みた。まず、雑菌の増殖を防ぐため５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む、ＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ，バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ，ｐＨ７．４）（以下、ＬＣ培地と称す）１００ｍＬに、ジヒドロキシジフェニルスルホン分解活性を維持したＢＰＳ１株の前培養液を２ｍＬ（２％ｖ／ｖ）加え、ジヒドロキシジフェニルスルホンの最終濃度が０．５ｍＭとなるように調整後、２５℃、１４０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養を行った。培養液中の菌体を遠心分離（９６００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ）で集菌し、滅菌水で２回洗浄した。さらに、得られた菌体を滅菌水４ｍＬで再懸濁（ＯＤ_６００＝３程度）し、あらかじめアルギン酸ナトリウムを湯煎で滅菌水に溶かした溶液（最終濃度３０ｇ／Ｌ）２０ｍＬに加えて混合した。この溶液を、１ｍＬ容注射器を用いて１．５％ｗ／ｖ ＣａＣｌ_２水溶液に滴下し、１５分静置してゲル化させた。得られたビーズ（直径３ｍｍ前後）を滅菌水でよく洗浄し、ＬＣ培地５０ｍＬに加え、ジヒドロキシジフェニルスルホンを添加後、２５℃、１４０ｒｐｍで回転振盪培養する分解試験を行った。ビーズの充填率は、５０ｍＬの培地に対し、約２４ｍＬのビーズを添加しているので、３２．４％（２４／７４＝０．３２４）程度であった。図１２に示す通り、このビーズによる分解試験では３ｍＭ程度（約７５０ｍｇ／Ｌ）のジヒドロキシジフェニルスルホンが２４時間～４８時間以内に迅速に消失し、繰り返し分解も可能であった。単一菌による増殖をさせながらの分解では８日～１４日程度かかる分解を、一般的な固定化法により１日～２日以内で完結させることができる。

【0063】

また、構造類似体に対する分解性の一例として、（３）の４，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホン分解試験と同様の方法で２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホンを分解させたところ、図１３に示す通り、１３日程度で０．６ｍＭの２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホンがほぼ完全に分解され、菌体の増殖も観察された（２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホンの分解が始まる４時間目以降に、約０．１５の濁度の増加があり、これは（３）の４，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホンの分解時の増殖と同等である）。この結果から、ＢＰＳ１株は２，４’－ジヒドロキシジフェニルスルホンも資化できると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0064】

本発明の適用範囲として、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物製造プロセスから、あるいはプロセス洗浄水として、低濃度（具体的には、～数百ｍｇ／Ｌ）のジヒドロキシジフェニルスルホン含有廃水を生じ得るが、本発明の真菌は、いわゆる活性汚泥法のような一般的な好気的生物処理法に、乾燥粉末や液体の高濃度微生物製剤として添加し、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物分解能力を既存の処理法に与える方法、あるいは一般的な微生物固定化法により高濃度固定化物を調製後、廃水処理系に投入する方法等で工業廃水の処理に適用できる。また、本発明の真菌は、土壌や水系に上記の形態で直接散布することにより、ジヒドロキシジフェニルスルホン化合物に対するバイオレメディエーションにも適用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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