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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024119830
(43)【公開日】2024-09-03
(54)【発明の名称】ベスト病の処置のためのアデノ随伴ウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240827BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240827BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240827BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240827BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240827BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240827BHJP
C12N 15/67 20060101ALN20240827BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 140Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/63 Z
A61K31/7105
A61P27/02
A61K48/00
A61K35/76
C12N15/12
C12N15/67 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024081593
(22)【出願日】2024-05-20
(62)【分割の表示】P 2021511541の分割
【原出願日】2019-08-30
(31)【優先権主張番号】62/754,530
(32)【優先日】2018-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/749,622
(32)【優先日】2018-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/726,184
(32)【優先日】2018-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501453307
【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハウスヴィルト，ウィリアム，ダブリュー．
(72)【発明者】
【氏名】レウィン，アルフレッド，エス．
(72)【発明者】
【氏名】イルデフォンソ，クリスチャン，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ヤング，ブリアンナ，エム．
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、ベスト病などのベストロフィノパチーを処置するのに有用な方法および組成物を提供することである。
【解決手段】本発明の解決手段は、ベスト病などのベストロフィノパチーを処置するのに有用な方法および組成物に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の解決手段は、ベスト病などのベストロフィノパチーを処置するのに有用な方法および組成物に関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）ヌクレオチド配列ＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＵＣＡＣＡＧＵＧＵ（配列番号２）を含むセンス鎖およびヌクレオチド配列ＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号３）を含むアンチセンス鎖；および
ｂ）ループ
を含む、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）。
ｂ）ループ
を含む、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）。
【請求項2】
ループが、ヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号７）を含む、請求項１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項3】
ヌクレオチド配列ＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＵＣＡＣＡＧＵＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＡＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号１）を含む、請求項１に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡをコードする、ベクター。
【請求項5】
前記ｓｈＲＮＡの標的となる配列を含有しない組換えＢＥＳＴ１コード配列をさらに含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項6】
組換えＢＥＳＴ１コード配列が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項５に記載のベクター。
【請求項7】
組換えＢＥＳＴ１コード配列が、配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項8】
組換えＢＥＳＴ１コード配列が、配列番号９のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡおよび組換えＢＥＳＴ１配列をコードするベクター。
【請求項10】
配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項11】
プラスミドである、請求項４～１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項12】
ウイルスベクターである、請求項４～１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項13】
ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項14】
ｒＡＡＶベクターが、自己相補的である、請求項１３に記載のベクター。
【請求項15】
請求項１３または１４に記載のｒＡＡＶベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
【請求項16】
ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ウイルス粒子である、請求項１５に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項17】
請求項４～１４のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１５または１６に記載のｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項18】
請求項１７に記載の組成物を対象へ投与することを含む、対象におけるＢＥＳＴ１発現を調節する方法。
【請求項19】
請求項１７に記載の組成物を対象へ投与することを含む、対象におけるベスト病を処置する方法。
【請求項20】
対象が、ヒト対象である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
ベスト病を処置することにおける使用のための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項22】
ベスト病を処置するための医薬の製造における使用のための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項23】
ベスト病を処置することにおける、請求項１７に記載の組成物の使用。
【請求項24】
ベスト病を処置するための医薬の製造における、請求項１７に記載の組成物の使用。
【請求項25】
請求項１７に記載の組成物を対象へ投与することを含む、対象における常染色体劣性ベストロフィノパチー（ＡＲＢ）を処置する方法。
【請求項26】
対象が、ヒト対象である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
ＡＲＢを処置することにおける使用のための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項28】
ＡＲＢを処置するための医薬の製造における使用のための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項29】
ＡＲＢを処置することにおける、請求項１７に記載の組成物の使用。
【請求項30】
ＡＲＢを処置するための医薬の製造における、請求項１７に記載の組成物の使用。
【請求項31】
ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号３）を含むアンチセンス鎖を含む、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／７２６，１８４号、２０１８年１０月２３日に出願された米国仮出願第６２／７４９，６２２号、および２０１８年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／７５４，５３０号の出願日の利益を主張し、各々の内容全体は参照により組み込まれる。
政府の支援
発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＥＹ０２１７２１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
本出願は、２０１８年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／７２６，１８４号、２０１８年１０月２３日に出願された米国仮出願第６２／７４９，６２２号、および２０１８年１１月１日に出願された米国仮出願第６２／７５４，５３０号の出願日の利益を主張し、各々の内容全体は参照により組み込まれる。
政府の支援
発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＥＹ０２１７２１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0002】
背景
ＢＥＳＴ１遺伝子（ＶＭＤ２とも呼ばれる）の変異は、ベスト病としても知られるベスト卵黄様黄斑変性症を含むいくつかの形態の網膜変性を引き起こす。（ベスト病は、ベスト黄斑変性症、卵黄変性症、および卵黄様黄斑変性症とも呼ばれる。）ベストロフィノパチー（bestrophinopathy）は、網膜色素上皮の側底膜に関連するカルシウム依存性塩化物チャネルとして機能するタンパク質（ベストロフィン、またはＢＥＳＴ１）をコードするヒトＢＥＳＴ１遺伝子の２００を超える種々の変異によって引き起こされる。ベストロフィノパチーでは、ＲＰＥを通過する体液輸送の欠陥が、ＲＰＥと光受容体細胞との間の相互作用を損なう。この損傷は、網膜がその支持層から剥離し、ＲＰＥおよび網膜下腔内に酸化されたプロテオリピド（リポフスチン）が蓄積することにつながる。最終的に、光受容体は、主に（中心視野をもたらす）黄斑領域で死ぬ。ヒトでは、ＢＥＳＴ１変異は通常、常染色体優性であり、一方の欠陥のあるコピーは、もう一方の親から受け継いだ正常な（野生型）遺伝子の存在に関係なく、疾患につながることを意味する。しかしながら、常染色体劣性ベストロフィノパチー（ＡＲＢ）も報告されている。
ＢＥＳＴ１遺伝子（ＶＭＤ２とも呼ばれる）の変異は、ベスト病としても知られるベスト卵黄様黄斑変性症を含むいくつかの形態の網膜変性を引き起こす。（ベスト病は、ベスト黄斑変性症、卵黄変性症、および卵黄様黄斑変性症とも呼ばれる。）ベストロフィノパチー（bestrophinopathy）は、網膜色素上皮の側底膜に関連するカルシウム依存性塩化物チャネルとして機能するタンパク質（ベストロフィン、またはＢＥＳＴ１）をコードするヒトＢＥＳＴ１遺伝子の２００を超える種々の変異によって引き起こされる。ベストロフィノパチーでは、ＲＰＥを通過する体液輸送の欠陥が、ＲＰＥと光受容体細胞との間の相互作用を損なう。この損傷は、網膜がその支持層から剥離し、ＲＰＥおよび網膜下腔内に酸化されたプロテオリピド（リポフスチン）が蓄積することにつながる。最終的に、光受容体は、主に（中心視野をもたらす）黄斑領域で死ぬ。ヒトでは、ＢＥＳＴ１変異は通常、常染色体優性であり、一方の欠陥のあるコピーは、もう一方の親から受け継いだ正常な（野生型）遺伝子の存在に関係なく、疾患につながることを意味する。しかしながら、常染色体劣性ベストロフィノパチー（ＡＲＢ）も報告されている。
【0003】
希少疾患であるベスト病は、ゆっくりと進行する黄斑変性症であり、一般的に小児期に発症し、時には１０代後半に発症する。発症した個体は、最初は正常な視力を有し、その後、中心視力が減少し、変視症になる。個体は正常な周辺視野および暗順応を保持する。個体は黄斑上に卵黄に似た塊を発達させる。この塊は最終的に崩壊し、黄斑全体に広がり、中心視野の低下につながる。ベスト病は、家族歴または眼科検査、例として眼底の外観または眼電図（ＥＯＧ）に基づいて診断され得る。
遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）は、分子的に不均一で病態生理学的に異なる盲眼状態の大きな群を包含する。遺伝的欠陥は、しばしば主に桿体または錐体光受容体（ＰＲ）またはその両方に作用し、特定の欠陥は、光伝達、毛様体輸送、形態形成、神経伝達、または他を伴い得る。網膜色素上皮（ＲＰＥ）に関連する原発性（primary）欠陥はあまり一般的ではないが、注目を集める臨床試験により注目が高まっている。
遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）は、分子的に不均一で病態生理学的に異なる盲眼状態の大きな群を包含する。遺伝的欠陥は、しばしば主に桿体または錐体光受容体（ＰＲ）またはその両方に作用し、特定の欠陥は、光伝達、毛様体輸送、形態形成、神経伝達、または他を伴い得る。網膜色素上皮（ＲＰＥ）に関連する原発性（primary）欠陥はあまり一般的ではないが、注目を集める臨床試験により注目が高まっている。
【0004】
原発性ＲＰＥ欠陥による最も一般的なＩＲＤは、ＲＰＥの側底部分に関連する膜貫通タンパク質をコードするＢＥＳＴ１の変異によって引き起こされる。ＢＥＳＴ１（ベストロフィン）は、経上皮イオン輸送、細胞内カルシウムシグナル伝達およびＲＰＥ細胞体積の調節、および網膜下腔の恒常性環境の調節を媒介する多機能チャネルタンパク質である。真核細胞では、ＢＥＳＴ１は、４つの膜貫通ヘリックス、細胞質ゾルのＮおよびＣ末端、および塩化物浸透のカルシウム依存性の制御に対して感受性がある連続的な中心細孔を備えた安定したホモペンタマーを形成する。
【0005】
ヒトでは、ＢＥＳＴ１変異は、特徴的な黄斑病変をしばしば伴うベストロフィノパチーとして集合的にグループ化された広範囲のＩＲＤをもたらす。病変から離れた網膜領域は、眼の立位電位（standing potential）の異常を反映するＥＯＧに網膜全体の電気生理学的欠陥が存在するにも関わらず、全体的に正常に見える傾向がある。イヌＢＥＳＴ１遺伝子（ｃＢＥＳＴ１）における天然に存在する二アレル変異は、イヌ中心窩様領域への網膜下病変の顕著な偏向を含む、優性および劣性形態の両方のヒトベストロフィノパチーに対して明確な表現型の類似性を有するイヌＩＲＤを引き起こす。
【0006】
適切な解剖学的並置およびＲＰＥ頂端微絨毛（ＭＶ）とＰＲ外側セグメント（ＯＳ）との間の持続した相互作用は、正常な視力にとって重要であると考えられる。網膜下腔のイオン組成および体積調節の両方が、この複合体の正確な分子近接性およびＲＰＥ－ＰＲ界面の恒常性を維持するために必須である。in vitroおよびex vivo研究は、遺伝的変異、代謝摂動、ならびに光刺激が網膜下腔のイオン組成およびＲＰＥおよび／またはＰＲの生理学的応答を変化させることを長い間示してきた。より最近では、健康および疾患における外側網膜の微小解剖およびその光への応答のin vivo研究は、現代の網膜イメージングモダリティで益々有益になっている。
【0007】
ＢＥＳＴ１遺伝子の変異は、隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の原発性チャネル病により、網膜の剥離および光受容体（ＰＲ）細胞の変性を引き起こす。網膜剥離の形成に先立つＲＰＥとＰＲ細胞との間の相互作用の病態生理はよく理解されていないままである。
【発明の概要】
【0008】
発明の概要
開示の側面は、対象における（例として、ヒトにおける）ベストロフィノパチー（例として、ベスト卵黄様黄斑変性症）を処置するための組成物に関する。開示の側面は、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡ（例として、変異および正常コピーの両方）の発現を抑制するように設計されている。いくつかの態様において、発現は、ＲＮＡ干渉を使用して抑制される。いくつかの態様において、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡは、正常なＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡと同時に置き換えられて、正常なタンパク質のみを産生する。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ＢＥＳＴ１遺伝子のイントロンのないコピーに加えて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の産生をもたらす低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の遺伝子を送達するために使用される。
開示の側面は、対象における（例として、ヒトにおける）ベストロフィノパチー（例として、ベスト卵黄様黄斑変性症）を処置するための組成物に関する。開示の側面は、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡ（例として、変異および正常コピーの両方）の発現を抑制するように設計されている。いくつかの態様において、発現は、ＲＮＡ干渉を使用して抑制される。いくつかの態様において、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡは、正常なＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡと同時に置き換えられて、正常なタンパク質のみを産生する。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ＢＥＳＴ１遺伝子のイントロンのないコピーに加えて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の産生をもたらす低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の遺伝子を送達するために使用される。
【0009】
いくつかの態様において、対象（例として、ヒト）のＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のアレルは、対象（例として、ベスト病を有する対象、例えば、ベスト病を有するヒト）に低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を投与することによってサイレンシングされる。いくつかの態様において、置換ＢＥＳＴ１コード配列はまた、機能的なベストロフィンタンパク質を提供するために、例として、対象に光受容体機能を回復させるために、対象に投与される。いくつかの態様において、置換ＢＥＳＴ１コード配列は、置換遺伝子を干渉ＲＮＡの効果に対して耐性にする内因性遺伝子アレル（単数または複数）に対して１以上のヌクレオチド置換を有する。いくつかの態様において、置換ＢＥＳＴ１コード配列は、遺伝子をｓｈＲＮＡによって媒介される分解に対して耐性にする１以上（例として、１、２、３、４、または５以上）の置換を含むヒトＢＥＳＴ１コード配列（例として、野生型ヒトＢＥＳＴ１コード配列）である。いくつかの態様において、置換ＢＥＳＴ１コード配列は、標的部位に１以上のサイレント変異（コドンの第３の位置における塩基変化）を含み、遺伝子をｓｈＲＮＡによって媒介される分解に対して「脱標的化」させる。
【0010】
いくつかの側面において、開示は、ヌクレオチド配列ＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＵＣＡＣＡＧＵＧＵ（配列番号２）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号３）を含むアンチセンス鎖、およびループを含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様において、ループは、ヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号７）を含む。
【0011】
いくつかの側面において、開示は、ヌクレオチド配列ＧＣＵＧＣＵＡＵＡＵＧＧＣＧＡＧＵＵＣＵＵ（配列番号６）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＡＡＧＡＡＣＵＣＧＣＣＡＵＡＵＡＧＣＡＧＣ（配列番号５）を含むアンチセンス鎖、およびループを含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様において、ループは、ヌクレオチド配列ＣＵＣＧＡＧ（配列番号８）を含む。
【0012】
いくつかの態様において、開示は、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号３）を含むアンチセンス鎖を含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。
いくつかの側面において、開示は、先行する段落に記載されたｓｈＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むベクターを提供する。
いくつかの側面において、開示は、ｓｈＲＮＡの標的となる配列を含有しない組換え機能的（例として、野生型）ＢＥＳＴ１コード配列をさらに含むベクターを提供する。いくつかの側面において、ベクターは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている組換え機能的ＢＥＳＴ１コード配列をさらに含む。
いくつかの側面において、開示は、先行する段落に記載されたｓｈＲＮＡをコードする遺伝子配列を含むベクターを提供する。
いくつかの側面において、開示は、ｓｈＲＮＡの標的となる配列を含有しない組換え機能的（例として、野生型）ＢＥＳＴ１コード配列をさらに含むベクターを提供する。いくつかの側面において、ベクターは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている組換え機能的ＢＥＳＴ１コード配列をさらに含む。
【0013】
いくつかの側面において、開示は、配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む組換えＢＥＳＴ１コード配列を含むベクターを提供する。いくつかの側面において、開示は、配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む組換えＢＥＳＴ１コード配列を含むベクターを提供する。
いくつかの側面において、開示は、プラスミドまたはウイルスベクターであるベクターを提供する。いくつかの側面において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの側面において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的である。
いくつかの側面において、開示は、ＡＡＶ血清型２ウイルス粒子であるｒＡＡＶウイルス粒子を提供する。
いくつかの側面において、開示は、ベクターまたはｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容し得る担体を含む組成物を提供する。
いくつかの側面において、開示は、プラスミドまたはウイルスベクターであるベクターを提供する。いくつかの側面において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの側面において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的である。
いくつかの側面において、開示は、ＡＡＶ血清型２ウイルス粒子であるｒＡＡＶウイルス粒子を提供する。
いくつかの側面において、開示は、ベクターまたはｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容し得る担体を含む組成物を提供する。
【0014】
いくつかの側面において、開示は、対象におけるＢＥＳＴ１発現を調節する方法を提供し、当該方法は、ベクターまたはｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容し得る担体を含む組成物をヒト対象などの対象へ投与することを含む。いくつかの側面において、開示は、対象におけるベストロフィノパチー（例として、ベスト病およびＡＲＢ）を処置する方法を提供し、当該方法は、組成物を投与することを含む。
いくつかの態様において、機能的ＢＥＳＴ１配列をコードするベクターは、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子発現をノックダウンすることなく、細胞のＢＥＳＴ１機能を（例として、少なくとも部分的に）補足または修正するために提供される。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、コドン最適化されている。
いくつかの態様において、機能的ＢＥＳＴ１配列をコードするベクターは、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子発現をノックダウンすることなく、細胞のＢＥＳＴ１機能を（例として、少なくとも部分的に）補足または修正するために提供される。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、コドン最適化されている。
【0015】
いくつかの態様において、機能的ＢＥＳＴ１配列をコードするベクターは、細胞のＢＥＳＴ１機能を（例として、少なくとも部分的に）補足または修正するために提供され、ｓｈＲＮＡ配列は、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子発現をノックダウンするために提供される。いくつかの態様において、内因性Ｂｅｓｔ１発現は、ｓｈＲＮＡを使用してノックダウンされる。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、コドン最適化されている。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、ｓｈＲＮＡに耐性があるように改変されている。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１およびｓｈＲＮＡ配列は、同じＡＡＶベクター上にコードされている。
【0016】
いくつかの側面において、開示は、ベスト病を処置することにおける使用のための組成物およびベスト病を処置するための医薬の製造における使用のための組成物を提供する。いくつかの側面において、開示は、ベクターまたはｒＡＡＶ粒子を含む組成物、ここでベクターは、ＡＲＢを処置することにおける使用のための機能的ＢＥＳＴ１配列をコードする、およびＡＲＢを処置するための医薬の製造における使用のための組成物を提供する。
これらおよび他の側面は、以下の図面、例、および請求項において記載されている。
これらおよび他の側面は、以下の図面、例、および請求項において記載されている。
【図面の簡単な説明】
【0017】
図面の簡単な記載
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の一定の側面をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによってよりよく理解することができる。図面において説明されているデータは、決して開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の一定の側面をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによってよりよく理解することができる。図面において説明されているデータは、決して開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【0018】
【図1A-D】図１Ａ～１Ｄは、イヌＢＥＳＴ１変異に関連するＲＰＥ頂端微絨毛突起の網膜全体の病態を示す。図１Ａおよび１Ｂは、野生型（図１Ａ）（４２週）と比較したｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊；８９週）（図１Ｂ）の分子病態を示す共焦点画像を示す。網膜凍結切片は、抗ＥＺＲＩＮおよびヒト錐体アレスチンで免疫標識され、ピーナッツ凝集素レクチンおよびＤＡＰＩ標識と組み合わされた。図１Ｃは、抗ＢＥＳＴ１および抗ＳＬＣ１６Ａ１で免疫標識された６週齢のイヌ野生型およびｃＢｅｓｔ変異（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）網膜の代表的な顕微鏡写真を示す。白色の矢印は、錐体－ＭＶのサブセットを指す。図１Ｄは、ｃＢｅｓｔ変異体と同齢の対照の眼との間の網膜全体の錐体－ＭＶ数の定量化を示す。ｙ軸は、調べた各色分けされた網膜領域の１平方ミリメートル当たりの錐体－ＭＶの平均数を表す。略語：Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン＆エオシン染色；ＰＲＬ、光受容体ＩＳ／ＯＳ層；ｉ、下方；Ｎ、鼻；Ｓ、上方；Ｔ、側頭。
【0019】
【図2A-C】図２Ａ～２Ｆは、野生型およびｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）変異体における網膜外側構造の光媒介性変化を示す。図２Ａは、より弱いおよびより強い明順応（ＬＡ）を有する、１５週齢の正常（ＷＴ）イヌおよび１１週齢のｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）の中心網膜中心窩野（中心窩様領域）を通る水平経線に沿った断面イメージングを示す。細い白色の矢印は、ＯＣＴの上側頭（superotemporal）位置を示す。図２Ｂは、より弱いおよびより強いＬＡを有する、ｃＢｅｓｔ処置イヌ（６の眼、１１週齢）と比較した、ＷＴイヌ（１２の眼、１５～１７週齢）における中心窩様領域（Ｔ、側頭網膜）および視神経乳頭の鼻縁（Ｎ、鼻網膜）からの３°鼻での縦反射プロファイル（ＬＲＰ）（８５の単一ＬＲＰの平均）を示す。矢印は、ＩＳ／ＯＳおよびＲＰＥ／Ｔのピークを示す。一重および二重矢印は、ｃＢｅｓｔの追加の低反射層を示す。図２Ｃは、２つのＬＡ条件下でのＷＴおよびｃＢｅｓｔの眼におけるＩＳ／ＯＳピークとＲＰＥ／Ｔピークとの間の距離を示す。エラーバーの付いた記号は、両方の場所での各群の眼の平均（±２ＳＤ）距離を表す。図２Ｄは、暗順応プロトコルおよび明順応プロトコルの概略図である。動物を終夜暗順応（Ｄ／Ａ）し、ＯＣＴイメージングを行った。次いで、５つの増加する露光（Ｌ１からＬ５）が使用された。
【0020】
【図3A-B】図３Ａ～３Ｄは、ＢＥＳＴ１遺伝子増強治療が、ｃＢｅｓｔ変異体において、小窩黄斑（foveomacular）病変の持続的な逆転およびＲＰＥ－ＰＲ界面構造の回復をもたらすことを示す。図３Ａは、３つの時点でのｃＢｅｓｔイヌ（ＥＭ３５６－ＯＤ；Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）の右眼におけるin vivoイメージングによって記録された中心網膜下剥離の自然経過を示す。挿入図は、自家蛍光およびＯＣＴ画像を示す。図３Ｂは、ＡＡＶ２－ｃＢＥＳＴ１（１．５ｘ１０１０ｖｇ／ｍＬ）の網膜下注射が図３Ａに示される眼において行われる前（５２週齢）および後に撮影された眼底画像を示す。網膜下小疱領域は破線の円で示される。注射後４３週および２４５週に取得された画像は、中心病変の持続した逆転、および処置された領域内の完全に再付着した網膜を示す。中央および右の挿入図は、自家蛍光およびＯＣＴ画像を示す。
【0021】
【図4A-B】図４Ａ～４Ｆは、ＢＳＳまたはＡＡＶ－ｈＢＥＳＴ１を網膜下に注射したｃＢｅｓｔ変異イヌ［ｃｍｒ１（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊）、ｃｍｒ１／ｃｍｒ３（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）、またはｃｍｒ３（Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ）］における網膜下遺伝子治療後の網膜領域全体の微小剥離の逆転を示す。図４Ａは、ＢＳＳまたはＡＡＶ－ｈＢＥＳＴ１を網膜下に注射したｃＢｅｓｔ変異イヌ［ｃｍｒ１（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊）、ｃｍｒ１／ｃｍｒ３（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）、またはｃｍｒ３（Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ）］のＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の組織分布のマップを示す。処置の境界は、注射時に撮影された小疱の眼底写真（点線）、および表示されている場合は、イメージング時に明らかな境界（破線）に基づく。すべての眼は、比較を容易にするために、視神経および主要な血管（黒色）、タペータム境界（白色）、および中心窩様領域（白色の楕円）が重ねられた同等の右眼として示される。図４Ｂは、処置された小疱（Ｔｘ；塗りつぶされた記号）および未処置の外側小疱（Ｃｔｒｌ；白抜きの記号）領域内のｃＢｅｓｔ眼の上方および下方の網膜位置におけるＷＴのＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の差異を示す。破線は、正常な変動性の９５パーセンタイルを区切る。ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の組織分布は、処置前（左）および処置後（右）に示される。
【0022】
【図5A-C】図５Ａ～５Ｇは、ＡＲＢを有する２人のヒト対象における網膜部位の表現型を示す。図５Ａは、天然のＲＰＥフルオロフォアリポフスチンを利用して、短波長低照度自家蛍光イメージング（ＳＷ－ＲＡＦＩ）で画像化した、２人のＡＲＢ患者、Ｐ１およびＰ２の網膜全体のＲＰＥの健康状態を示す。白色の矢印は、視野測定プロファイルおよびＯＣＴスキャンの場所を示す。長方形は、他のパネルに示されている関心領域を示す。黒色の矢印は、鼻の中央周辺の網膜における疾患から健康への推移を示す。図５Ｂは、水平経線にわたって測定された眼の、暗順応（上）の桿体および明順応（下）の錐体の視野測定の光感受性を示す。灰色の領域は、視神経（ＯＮＨ）に対応する生理学的盲点を除いて正常な感受性を表す。図５Ｃは、中心窩を横断する水平経線に沿ったＯＣＴを伴う網膜断面を示す。
【0023】
【図6A-D】図６Ａ～６Ｄは、ＣＮＧＢ３関連色覚異常（ＡＣＨＭ３）のイヌモデルにおけるＲＰＥ－ＰＲ嵌合ゾーンを示す。図６Ａおよび６Ｂは、６週齢のＣＮＧＢ３－Ｄ２６２Ｎ変異体（図６Ａ）およびＣＮＧＢ３ヌル（図６Ｂ；ＣＮＧＢ３－／－）網膜の代表的な蛍光顕微鏡画像を示し、ＲＰＥ細胞の側底原形質膜に限定されたＢＥＳＴ１、およびＲＰＥ頂端突起を標識するマーカーであるＳＬＣ１６Ａ１の正常な発現を実証する。矢印は、錐体関連ＲＰＥ頂端微絨毛（ｃ－ＭＶ）のサブセットを指す。図６Ａおよび６Ｂはまた、抗ＣＮＧＢ３および抗ＥＺＲＩＮ共標識を示し、参照のために、同齢の野生型網膜が示されている。図６Ｃおよび６Ｄは、８５週齢（図６Ｃ）および５７週齢（図６Ｄ）の発症したイヌからのＣＮＧＢ３変異網膜におけるＲＰＥ－ＰＲ界面の免疫組織化学的評価を示す。ＲＰＥ頂端側面およびその微絨毛の拡張はＥＺＲＩＮで免疫標識され、ｃ－ＭＶのサブセットは矢印で示されている。略語：ＡＣＨＭ３、３型色覚異常；ｃＣＮＧＢ３、イヌＣＮＧＢ３遺伝子；ｃ－ＭＶ、錐体関連ＲＰＥ頂端微絨毛；ＣＮＧＢ３、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３タンパク質；ｈＣＡＲ、ヒト錐体アレスチン；ＳＬＣ１６Ａ１、溶質キャリアファミリー１６メンバー１。
【0024】
【図8A-B】図８Ａ～８Ｂは、ｃＢｅｓｔ眼において、微小剥離を伴う網膜領域での超厚ＯＮＬ、および遺伝子治療によるその修正を示す。図８Ａは、未注射のｃＢｅｓｔ眼（図２Ａ～２Ｆおよび４Ａ～４ＦにＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ厚さマップとして示される）が、網膜微小剥離の広い領域に対応する超厚ＯＮＬ、およびいくつかの眼における総病変上および中心窩様領域の近くのＯＮＬの局所的薄化を実証することを示す。図８Ｂは、処置されたｃＢｅｓｔ眼（図４Ａ～４ＦにＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ厚さマップとして示される）が、未処置領域内の超厚、正常、または薄化したＯＮＬに囲まれたＡＡＶ処置領域において正常なＯＮＬ厚さを実証することを示す。ＯＤ、右眼；ＯＳ、左眼。
【0025】
【図9A-F】図９Ａ～９Ｆは、ｃＢｅｓｔ発症（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）イヌ（ＥＭ３５６－ＯＳ）における限局性黄斑病変の進展を示す。図９Ａは、下にあるＲＰＥからの光受容体層の離散的な分離が進行して、正面に明らかなより大きな網膜下マクロ剥離（卵黄様病変）を形成することを示し、図９Ｂは、２３週齢での対応するＯＣＴスキャンを示す。図９Ｃは、網膜下病変内に蓄積する高自家蛍光物質の最初の兆候が、８週後に観察されたことを示す（３１週；初期の偽性前房蓄膿病変）。図９Ｄは、６６週齢で、典型的な偽性前房蓄膿の外観が記録され、これに続き、１７２週齢および２９７週齢で、自家蛍光物質の分散を伴う卵黄破裂様病変が記録されることを示す（挿入図、拡大）。図９Ｅおよび９Ｆは、ＯＮＬの有意な薄化がＯＣＴスキャンによって明らかであることを示す。濃い線は、対応するＳＤ－ＯＣＴスキャンの位置を示す。
【0026】
【図10】図１０は、３つのｃＢｅｓｔモデル［ｃｍｒ１（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊）、ｃｍｒ１／ｃｍｒ３（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）、およびｃｍｒ３（Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ）］におけるＡＡＶ－ｈＢＥＳＴ１処置後の網膜保存を、野生型対照の眼およびｃＢｅｓｔ未処置の眼と比較して示す。
【図11A-D】図１１Ａ～１１Ｄは、ｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）網膜におけるＲＰＥ細胞骨格レスキューに対するＢＥＳＴ１導入遺伝子発現の用量応答効果を示す。図１１Ａは、外科的小疱領域（左）から、隣接する境界域の領域（中央）を通って、注射ゾーンの外側の連続した範囲（右）に向かう断面の概観を示す。図１１Ｂは、増強されたＢＥＳＴ１を用いて処置された領域内のＲＰＥ頂端突起の顕著な拡張を示す。図１１Ｃは、ＢＥＳＴ１（個々のＲＰＥ細胞内の弱いシグナル）の斑状の分布およびＲＰＥ－ＰＲ微小剥離に関連する小疱境界域における痕跡微絨毛および桿体ＭＶの存在を示す。図１１Ｄは、ＢＥＳＴ１発現および処置ゾーンの外側のＲＰＥ頂端突起の両方の非不在下での網膜下病変の形成を示す。
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
詳細な記載
出願の側面は、対象における（例として、ベスト病を有するヒト対象）におけるベスト病を処置するために有用である方法および組成物を提供する。
いくつかの態様において、開示は、１以上の変異ＢＥＳＴ１遺伝子を有する対象に機能的ベストロフィンタンパク質を送達するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、組換えＢＥＳＴ１遺伝子（例として、コード配列、例えばｃＤＮＡまたはオープンリーディングフレーム）は、ウイルスベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）上に提供される。いくつかの態様において、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のアレルの発現もまたノックダウンされる。例えば、いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ）は、組換えＢＥＳＴ１遺伝子とともに対象に送達される。いくつかの態様において、ウイルスベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）は、組換えＢＥＳＴ１遺伝子および内因性ＢＥＳＴ１遺伝子を標的とする１以上のｓｉＲＮＡの両方をコードする。いくつかの態様において、組換えＢＥＳＴ１遺伝子は、１以上のｓｉＲＮＡによる標的化に対して耐性を与える１以上のヌクレオチド置換を含むように改変される。いくつかの態様において、組換えＢＥＳＴ１遺伝子は、（例として、対象における、例えばヒト対象における発現のために）コドン最適化されている。
出願の側面は、対象における（例として、ベスト病を有するヒト対象）におけるベスト病を処置するために有用である方法および組成物を提供する。
いくつかの態様において、開示は、１以上の変異ＢＥＳＴ１遺伝子を有する対象に機能的ベストロフィンタンパク質を送達するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、組換えＢＥＳＴ１遺伝子（例として、コード配列、例えばｃＤＮＡまたはオープンリーディングフレーム）は、ウイルスベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）上に提供される。いくつかの態様において、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のアレルの発現もまたノックダウンされる。例えば、いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ）は、組換えＢＥＳＴ１遺伝子とともに対象に送達される。いくつかの態様において、ウイルスベクター（例として、ｒＡＡＶベクター）は、組換えＢＥＳＴ１遺伝子および内因性ＢＥＳＴ１遺伝子を標的とする１以上のｓｉＲＮＡの両方をコードする。いくつかの態様において、組換えＢＥＳＴ１遺伝子は、１以上のｓｉＲＮＡによる標的化に対して耐性を与える１以上のヌクレオチド置換を含むように改変される。いくつかの態様において、組換えＢＥＳＴ１遺伝子は、（例として、対象における、例えばヒト対象における発現のために）コドン最適化されている。
【0031】
いくつかの態様において、開示は、ヌクレオチド配列ＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＵＣＡＣＡＧＵＧＵ（配列番号２）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号３）を含むアンチセンス鎖、およびループを含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様において、ループは、ヌクレオチド配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号７）を含む。
他の態様において、開示は、ヌクレオチド配列ＧＣＵＧＣＵＡＵＡＵＧＧＣＧＡＧＵＵＣＵＵ（配列番号６）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＡＡＧＡＡＣＵＣＧＣＣＡＵＡＵＡＧＣＡＧＣ（配列番号５）を含むアンチセンス鎖、およびループを含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様において、ループは、ヌクレオチド配列ＣＵＣＧＡＧ（配列番号８）を含む。
いくつかの態様において、開示は、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号３）を含むアンチセンス鎖を含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。
他の態様において、開示は、ヌクレオチド配列ＧＣＵＧＣＵＡＵＡＵＧＧＣＧＡＧＵＵＣＵＵ（配列番号６）を含むセンス鎖、ヌクレオチド配列ＡＡＧＡＡＣＵＣＧＣＣＡＵＡＵＡＧＣＡＧＣ（配列番号５）を含むアンチセンス鎖、およびループを含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様において、ループは、ヌクレオチド配列ＣＵＣＧＡＧ（配列番号８）を含む。
いくつかの態様において、開示は、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＵＵＵＧＡＣＧ（配列番号３）を含むアンチセンス鎖を含む低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を提供する。
【0032】
いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、プロモーター（例として、ヒトＨ１ ＲＮＡプロモーター）によって駆動されるｓｈＲＮＡとしてベクターを使用して送達され得る。いくつかの態様において、このベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、二本鎖または自己相補的ＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡをコードするベクター配列は、ＢＥＳＴ１配列を含む。
したがって、いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＧ（配列番号１８）（ループ配列に下線が引かれている）の配列を有する核酸によって、ＤＮＡベクター（例として、ウイルスベクター）上にコードされ得る。いくつかの態様において、種々のループ配列が、配列番号７に示されるループ配列について置換される。
したがって、いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＧ（配列番号１８）（ループ配列に下線が引かれている）の配列を有する核酸によって、ＤＮＡベクター（例として、ウイルスベクター）上にコードされ得る。いくつかの態様において、種々のループ配列が、配列番号７に示されるループ配列について置換される。
【0033】
また、いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、ＧＣＴＧＣＴＡＴＡＴＧＧＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣ（配列番号１９）（ループ配列に下線が引かれている）の配列を有する核酸によって、ＤＮＡベクター（例として、ウイルスベクター）上にコードされ得る。いくつかの態様において、種々のループ配列が、配列番号８に示されるループ配列について置換される。
いくつかの態様において、同じベクターは、正常な（例として、野生型）Ｂｅｓｔ１タンパク質をコードするが、ベクターによって発現されるｓｈＲＮＡの作用に耐性があるコード配列を含む。
いくつかの態様において、同じベクターは、正常な（例として、野生型）Ｂｅｓｔ１タンパク質をコードするが、ベクターによって発現されるｓｈＲＮＡの作用に耐性があるコード配列を含む。
【0034】
いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、配列番号９と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、配列番号１０と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、配列番号１１と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、配列番号１０と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、配列番号１１と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
【0035】
いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、配列番号１５と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
１７５７ｂｐの野生型ＢＥＳＴ１配列は、以下のように定義される（配列番号９）：
１７５７ｂｐの野生型ＢＥＳＴ１配列は、以下のように定義される（配列番号９）：
【化1】
【0036】
いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、野生型ＢＥＳＴ１遺伝子の領域に対応する短い脱標的化配列を含む。ｓｈＲＮＡ７４４配列をコードするベクター配列とともに使用され得る例示の脱標的化配列は、以下のように定義される（配列番号１０）：ＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴ。
【0037】
ＢＥＳＴ１配列を脱標的化するために、他のヌクレオチド置換がなされ得る。例えば、いくつかの態様において、脱標的化配列は、ＢＥＳＴ１コード配列上の種々の位置に位置付けられ、野生型ＢＥＳＴ１遺伝子の種々の領域に対応する。ｓｈＲＮＡ０５配列をコードするベクター配列とともに使用され得る例示の脱標的化配列は、以下のように定義される（配列番号１１）：ＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＴ。
【0038】
いくつかの態様において、配列番号１（および／またはその相補体）の配列を含む核酸によってコードされるｓｈＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ０５）は、ベクターで処置された宿主細胞において（例として、対象において、例えばヒト対象において）転写される。いくつかの態様において、２以上の種々のｓｈＲＮＡ（例として、種々の開始部位および／または終止部位を有し、例えば、１または２の追加のまたはより少ないヌクレオチドによってｓｈＲＮＡ０５とは異なる）が、宿主細胞において転写される。
【0039】
いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、プロモーター（例として、ヒトオプシン近位プロモーター）によって駆動される。いくつかの態様において、プロモーターは、以下の配列番号１２と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
【0040】
いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、以下の配列番号１３と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、以下の配列番号１４と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
【0041】
例示のプロモーターの配列は以下のとおりである：
ＶＭＤ２プロモーター、６２３ｂｐフラグメント（配列番号１２）
ＶＭＤ２プロモーター、６２３ｂｐフラグメント（配列番号１２）
【化2】
【0042】
Ｈ１プロモーター（配列番号１３）
Ｕ６プロモーター（配列番号１４）
【化3】
【化4】
【0043】
いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１コード配列は、ＡＡＶベクターまたはプラスミドなどのベクター中にある。
いくつかの態様において、本明細書に記載のベクターは、脱標的化ＢＥＳＴ１配列、配列番号１０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のベクターは、脱標的化ＢＥＳＴ１配列、配列番号１０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。
【0044】
いくつかの態様において、機能的ＢＥＳＴ１配列をコードするベクターは、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子発現をノックダウンすることなく、細胞のＢＥＳＴ１機能を（例として、少なくとも部分的に）補足または修正するために提供される。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、コドン最適化されている。
いくつかの態様において、機能的ＢＥＳＴ１配列およびｓｈＲＮＡ配列をコードするベクターは、細胞のＢＥＳＴ１機能を（例として、少なくとも部分的に）補足または修正し、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子発現をノックダウンするために提供される。いくつかの態様において、内因性Ｂｅｓｔ１発現は、ｓｈＲＮＡを使用してノックダウンされる。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、コドン最適化されている。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、ｓｈＲＮＡに耐性があるように改変されている。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１およびｓｈＲＮＡ配列は、同じＡＡＶベクター上にコードされている。
いくつかの態様において、機能的ＢＥＳＴ１配列およびｓｈＲＮＡ配列をコードするベクターは、細胞のＢＥＳＴ１機能を（例として、少なくとも部分的に）補足または修正し、内因性ＢＥＳＴ１遺伝子発現をノックダウンするために提供される。いくつかの態様において、内因性Ｂｅｓｔ１発現は、ｓｈＲＮＡを使用してノックダウンされる。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、コドン最適化されている。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１配列は、ｓｈＲＮＡに耐性があるように改変されている。いくつかの態様において、ＢＥＳＴ１およびｓｈＲＮＡ配列は、同じＡＡＶベクター上にコードされている。
【0045】
いくつかの態様において、開示は、対象におけるＢＥＳＴ１発現を調節する方法を提供し、当該方法は、ヒト対象などの対象に、ベクターまたはｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容し得る担体を含む組成物を投与することを含む。いくつかの側面において、開示は、対象におけるベストロフィノパチー（例として、ベスト病およびＡＲＢ）を処置する方法を提供し、当該方法は、組成物を投与することを含む。
【0046】
いくつかの態様において、開示は、ベスト病を処置することにおける使用のための組成物、およびベスト病を処置するための医薬の製造における使用のための組成物を提供する。いくつかの側面において、開示は、ＡＲＢを処置することにおける使用のためのベクターまたはｒＡＡＶ粒子を含む組成物、ここで当該ベクターは、機能的ＢＥＳＴ１配列をコードする、およびＡＲＢを処置するための医薬の製造における使用のための組成物を提供する。
【0047】
開示の側面は、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター（例として、ｓｈＲＮＡおよび／または置換ＢＥＳＴ１をコードする）の、様々な組織、器官、および／または細胞への送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子に関する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、本明細書に記載のカプシドタンパク質、例として、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子内に含有されるベクターは、目的のＲＮＡ（例として、配列番号１の配列を含むｓｈＲＮＡ）をコードし、置換ＢＥＳＴ１コード配列（例として、配列番号１０の配列を含む）を含む。
【0048】
ｒＡＡＶ粒子内に含有される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、少なくとも（ａ）１以上の異種核酸領域（例として、ｓｈＲＮＡおよび／またはＢｅｓｔ１タンパク質をコードする）および（ｂ）１以上の異種核酸領域（または導入遺伝子）に隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（例として、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）を含む１以上の領域を含み得る。いくつかの態様において、異種核酸領域は、目的のＲＮＡ（例として、配列番号３の配列を含むｓｈＲＮＡ）をコードし、置換ＢＥＳＴ１コード配列（例として、配列番号１０の配列を含む）を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、４ｋｂと５ｋｂとの間のサイズ（例として、４．２～４．７ｋｂのサイズ）である。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２カプシドなどのウイルスカプシドによってカプシド化され得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは一本鎖である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは二本鎖である。いくつかの態様において、二本鎖ｒＡＡＶベクターは、例えば、ベクターの別の領域に相補的であるベクターの領域を含有し、ベクターの二本鎖の形成を開始する自己相補的ベクターであり得る。
【0049】
本明細書に開示のとおり、標的変異を伴うＢｅｓｔ１構造の分析は、網膜色素上皮の頂端微絨毛の喪失および結果として生じる網膜の微小剥離が、イヌベストロフィノパチーの最も初期の特徴を表すことを示した。網膜の露光が拡大し、暗順応が収縮し、微小剥離が起こる。網膜下アデノ随伴ウイルスベースの遺伝子治療は、卵黄様病変および光変調微小剥離の両方を修正する。
【0050】
イヌＢＥＳＴ１疾患モデルにおける分子病態の研究は、ＲＰＥ微絨毛鞘（ensheathment）および錐体ＰＲ関連不溶性光受容体間マトリックスの欠陥に関連するＲＰＥ－ＰＲ界面での網膜全体の異常を明らかにした。in vivoイメージングは、網膜全体のＲＰＥ－ＰＲ微小剥離を実証し、これは、暗順応で収縮し、中程度の強度の光に曝露されると拡大した。アデノ随伴ウイルス２を使用した網膜下ＢＥＳＴ１遺伝子増強治療は、臨床的に検出可能な網膜下病変だけでなく、びまん性微小剥離も逆転させた。免疫組織化学的分析は、ＢＥＳＴ１導入遺伝子発現を有する領域におけるＲＰＥ－ＰＲ界面での構造上の変更の修正を示した。成功した処置効果は、１ｍＬの範囲当たり０．１×１０１１～５×１０１１のベクターゲノムのベクター力価を有する３つの異なるイヌＢＥＳＴ１遺伝子型で実証された。二アレルのＢＥＳＴ１変異を有する患者は、網膜積層欠陥の広い領域、重度のＰＲ感受性喪失、およびレチノイドサイクルの遅延を示した。ＲＰＥ－ＰＲ界面での細胞構築の回復によるマクロおよび微小剥離の逆転におけるイヌＢＥＳＴ１遺伝子治療の成功のヒトのトランスレーションは、改善された視覚機能をもたらし、ベストロフィノパチーを発症する患者の疾患進行を防ぐことを約束する。
【0051】
本明細書でさらに開示されるように、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２媒介ＢＥＳＴ１遺伝子増強が、この原発性無症候性欠陥ならびに疾患を修正することが発見された。
【0052】
ｒＡＡＶ粒子は、任意の誘導体または偽型（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２／１、２／５、２／８、または２／９）を含む、任意のＡＡＶ血清型のものであり得る。本明細書に使用されるとき、ｒＡＡＶ粒子の血清型は、カプシドタンパク質の血清型を指す。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ２である。誘導体および偽型の非限定例は、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０，ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ→Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１、およびＡＡＶｒ３．４５を含む。かかるＡＡＶ血清型および誘導体／偽型、およびかかる誘導体／偽型を産生する方法は、当該技術分野において知られている（例として、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）１つの血清型（例として、ＡＡＶ２）からのＩＴＲを含む核酸ベクター、および（ｂ）別の血清型（例として、ＡＡＶ５）に由来するカプシドタンパク質で構成されるカプシドを含む、偽型ｒＡＡＶ粒子である。偽型ｒＡＡＶベクターを産生および使用するための方法は、当該技術分野において知られている（例として、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照）。
【0053】
ｒＡＡＶ粒子およびｒＡＡＶベクターを産生する方法もまた、当該技術分野において知られており、市販されている（例として、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；および米国特許公開番号US 2007/0015238およびUS 2012/0322861（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）、およびＡＴＣＣおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキットを参照）。例えば、ｒＡＡＶベクターを含有するプラスミドは、例として、ｒｅｐ遺伝子（例として、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（例として、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３（本明細書に記載の改変されたＶＰ３領域を含む）をコードする）を含有する１以上のヘルパープラスミドと組み合わされ、ｒＡＡＶ粒子をパッケージングし、続いて精製することができるように、産生細胞株にトランスフェクトされ得る。
【0054】
いくつかの態様において、１以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子（例として、本明細書に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質をコードする）を含む第１のヘルパープラスミド、およびＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドを含む。いくつかの態様において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子であり、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２に由来し、本明細書に記載の改変されたカプシドタンパク質を産生するために、遺伝子への改変を含み得る。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作製する方法は、当該技術分野において知られており、市販されている（例として、以下を参照：PlasmidFactory（ビーレフェルト、ドイツ）のｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；以下から入手可能な他の製品およびサービス：Vector Biolabs（フィラデルフィア、ＰＡ）；Cellbiolabs（サンディエゴ、ＣＡ）；Agilent Technologies（サンタクララ、Ｃａ）；およびAddgene（ケンブリッジ、ＭＡ）；ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188）。
【0055】
例示の非限定的なｒＡＡＶ粒子産生方法が次に記載される。１以上のヘルパープラスミドが産生または取得され、これは、所望されるＡＡＶ血清型のｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦと、それらのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含む。ｃａｐ ＯＲＦはまた、本明細書に記載の改変されたカプシドタンパク質を産生するための１以上の改変を含み得る。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）は、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション、脂質、またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー分子を介して、ヘルパープラスミド（単数または複数）および本明細書に記載の異種核酸ベクターを含有するプラスミド（例として、図１３、１４、１５または１６に示される野生型または変異ｃＢＥＳＴ１またはｈＢＥＳＴ１遺伝子を含む異種核酸を含有するプラスミド）にトランスフェクトされる。次いで、ＨＥＫ２９３細胞は、少なくとも６０時間インキュベートされ、ｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする。代替的に、別の例において、Ｓｆ９ベースの産生（producer）安定細胞株を、核酸ベクターを含有する単一の組換えバキュロウイルスに感染させる。さらなる代替として、別の例において、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株を、核酸ベクターを含有するＨＳＶ、および任意に、本明細書に記載のｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦおよびそれらのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含有する１以上のヘルパーＨＳＶに感染させる。次いで、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞は、少なくとも６０時間インキュベートされ、ｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする。次いで、ｒＡＡＶ粒子は、当該技術分野で知られている、または本明細書に記載の任意の方法を使用して、例として、イオジキサノールステップ勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって精製され得る。
【0056】
開示はまた、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む宿主細胞を企図する。かかる宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞を含み、ヒト宿主細胞が好ましく、例として、細胞または組織培養において単離され得る。いくつかの態様において、宿主細胞は眼の細胞である。
いくつかの側面において、開示は、細胞または動物への投与のために、およびとりわけ、ヒト細胞、組織、およびヒトに発症する疾患の治療のために、薬学的に許容し得る溶液中の本明細書に開示の１以上のｒＡＡＶベースの組成物の製剤を、単独で、または治療の１以上の他のモダリティと組み合わせて提供する。
いくつかの側面において、開示は、細胞または動物への投与のために、およびとりわけ、ヒト細胞、組織、およびヒトに発症する疾患の治療のために、薬学的に許容し得る溶液中の本明細書に開示の１以上のｒＡＡＶベースの組成物の製剤を、単独で、または治療の１以上の他のモダリティと組み合わせて提供する。
【0057】
したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子、および任意に薬学的に許容し得る担体を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、処置を必要とする対象に投与され得る。いくつかの態様において、対象は、脳および／または眼の１以上の状態、疾患、または障害（例として、ベスト病）を有するか、または有することが疑われる。いくつかの態様において、対象は、本明細書に開示の状態、疾患、および障害（例として、ベスト病）の１以上を有するか、または有することが疑われる。いくつかの態様において、対象は、１以上の内因性変異ＢＥＳＴ１アレル（例として、眼または網膜の疾患または障害に関連するか、またはそれを引き起こす）を有する。いくつかの態様において、対象は、少なくとも１の常染色体優性変異ＢＥＳＴ１アレル（例として、それはベスト病を引き起こす）を有する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は霊長目の非ヒト動物である。霊長目の非ヒト動物対象の非限定例は、マカク（例として、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、サバンナモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンを含む。他の例示の対象は、イヌおよびネコなどの飼い慣らされた動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を含む。
【0058】
いくつかの態様において、細胞または対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６～１０１４粒子／ｍＬまたは１０３～１０１５粒子／ｍＬの範囲のオーダー、またはいずれかの範囲のそれらの間の任意の値（例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４粒子／ｍＬなど）であり得る。一態様において、１０１３粒子／ｍＬを超えるｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６～１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬまたは１０３～１０１５ｖｇ／ｍＬの範囲のオーダー、またはいずれかの範囲のそれらの間の任意の値（例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ｖｇ／ｍＬなど）であり得る。一態様において、１０１３ｖｇ／ｍＬを超えるｒＡＡＶ粒子が投与される。ｒＡＡＶ粒子は、単回用量として投与するか、または処置されている特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得る２以上の投与に分割することができる。いくつかの態様において、０．０００１ｍＬ～１０ｍＬ（例として、０．０００１ｍＬ、０．００１ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．１ｍＬ、１ｍＬ、１０ｍＬ）が、１つの用量で対象に送達される。
【0059】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、１×１０１０～５×１０１３ｖｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、約１×１０１０、２．５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、２．５×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、２．５×１０１２、５×１０１２、１×１０１３、２．５×１０１３、または５×１０１３ｖｇ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、粒子力価は、１×１０１０ｖｇ／ｍＬ未満である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、１×１０１５ｖｇ／ｍＬよりも大きい。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、５×１０１３ｖｇ／ｍＬよりも大きい。具体的な態様において、ｒＡＡＶ粒子力価は、約２×１０１１または２．５×１０１１である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、本明細書にさらに記載の方法を介して（例として、網膜下または硝子体内に）投与される。
【0060】
ｒＡＡＶ粒子は、単回用量として投与するか、または処置されている特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得る２以上の投与に分割することができる。いくつかの態様において、本出願において記載されている１～５００マイクロリットルの組成物（例として、ｒＡＡＶ粒子を含む）が、対象の一方または両方の眼に投与される。例えば、いくつかの態様において、約１、約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００マイクロリットルが各眼に投与され得る。しかしながら、いくつかの態様において、より少ないまたはより大きい量が投与され得ることを理解されたい。
【0061】
必要に応じて、ｒＡＡＶ粒子または核酸ベクターは、他の薬剤、例として、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な薬剤などとも組み合わせて投与され得る（治療的ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、またはそのバリアントの１以上の全身投与または局所投与を含む）。実際、追加の薬剤が標的細胞または宿主組織との接触時に重大な悪影響を引き起こさないことを考えると、含まれ得る他の成分に事実上制限はない。よって、ｒＡＡＶ粒子は、特定の場合に必要とされるように、様々な他の薬剤とともに送達され得る。かかる組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、または代替的に本明細書に記載されるように化学的に合成され得る。
【0062】
他の側面において、開示は、細胞または動物への投与のために、およびとりわけ、ヒト細胞、組織、およびヒトに発症する疾患の治療のために、薬学的に許容し得る溶液中の本明細書に開示のｓｈＲＮＡをコードする１以上のプラスミドの製剤を、単独で、または治療の１以上の他のモダリティと組み合わせて提供する。開示はまた、本明細書に開示のｓｈＲＮＡをコードするプラスミドの投与の方法を提供する。例示の方法は、哺乳動物（例として、ヒト）へのプラスミドの投与の方法を含んでいた。
【0063】
いくつかの態様において、哺乳動物（例として、ヒト）への投与のための開示されたプラスミド製剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＤＮＡプラスミドベクターを含む。ベクターの濃度は、１ｍｇ／ｍｌと３ｍｇ／ｍｌとの間であり得る。ある態様において、濃度は、約２ｍｇ／ｍｌである。他の態様において、濃度は、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．７５ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．８５ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約１．９５ｍｇ／ｍｌ、約２．０５ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、または約２．１５ｍｇ／ｍｌである。
【0064】
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の製剤は、例として、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内、および筋肉内の投与および製剤を含む様々な処置計画で本明細書に記載の特定の組成物を使用するための好適な投薬および処置計画の開発と同様に、当業者に周知である。
【0065】
典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％の治療剤（例として、ｒＡＡＶ粒子またはプラスミド）またはそれ以上を含有し得るが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージは当然変化し得、便宜上、全製剤の重量または体積の約１または２％と、約７０％または８０％以上との間であり得る。当然のことながら、各治療的に有用な組成物中の治療剤（単数または複数）（例として、ｒＡＡＶ粒子）の量は、化合物の任意の所与の単位用量で好適な投薬量が得られるように調製され得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与の経路、製品の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的考察などの要因は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図され、そのため、様々な投薬量および処置計画が望まれ得る。
【0066】
ある状況において、皮下、眼内、硝子体内、非経口、皮下、静脈内、脳室内、筋肉内、髄腔内、経口、腹腔内、経口または経鼻吸入、または直接注射による１以上の細胞、組織、または器官への直接注射のいずれかで、本明細書に開示の好適に製剤化された医薬組成物で本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を送達することが望ましい。
【0067】
注射可能な使用に好適な組成物（例として、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む）の医薬形態は、滅菌水溶液または分散体を含む。いくつかの態様において、形態は、容易な通針性（syringability）が存在する程度まで無菌で流動性である。いくつかの態様において、形態は、製造および保管の条件下で安定であり、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対して保存される。担体は、例えば、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合では必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。
【0068】
「担体」という用語は、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は、水、および、鉱油などの石油系油、落花生油、大豆油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成由来の油のものを含む油などの滅菌液体であり得る。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として用いられ得る。
【0069】
本開示の組成物は、様々な経路を通じて眼に送達され得る。それらは、眼への局所適用によって、または例えば硝子体（硝子体内注射）または網膜下（網膜下注射）光受容体間空間への眼内注射によって、眼内に送達され得る。いくつかの態様において、それらは桿体光受容体細胞に送達される。代替的に、それらは眼の周囲の組織への挿入または注射によって局所的に送達され得る。それらは、経口経路を通じて、または皮下、静脈内、または筋肉内注射によって全身的に送達され得る。代替的に、それらは、カテーテルを用いてまたは移植片を用いて送達され得、かかる移植片は、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状の物質でできており、シラスティック膜または繊維などの膜、生分解性ポリマー、またはタンパク質性の物質を含む。それらは、例えば、眼の外科手術中、または病態の発病直後、または急性または長期の症状の発生中に、その発生を防ぐために、症状の発病前に投与され得る。
【0070】
注射可能な水溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要に応じて好適に緩衝され得、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られているであろう。例えば、１つの投薬量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に加えるか、提案された注入部位に注射することができる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第１５版、１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照）。処置される対象の状態に応じて、投薬量にいくらかの変動が必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与の責任者は、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトのための投与の場合、調製物は、無菌性、発熱性、および（例として、FDA Office of Biologics standardsで要求されるような）一般的な安全性および純度の基準を満たすべきである。
【0071】
滅菌注射液は、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を、必要に応じて上記に列挙した他のいくつかの成分とともに適切な溶媒に必要な量で組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散体は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技法であり、これは、前もって滅菌濾過された溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を生成する。
【0072】
組成物（例として、本明細書に記載のｓｈＲＮＡ、ベクター、またはｒＡＡＶ粒子を含む）の量およびかかる組成物の投与時間は、本教示の利益を有する当業者の範囲内である。しかしながら、治療的有効量の開示された組成物の投与は、例えば、かかる処置を受けている患者に治療上の利益を提供するのに十分な数のｒＡＡＶ粒子の単回注射などの単回投与によって達成され得る。代替的に、状況によっては、かかる組成物の投与を監督する医師によって決定され得るように、比較的短い期間または比較的長い期間のいずれかで、組成物の複数または連続投与を提供することが望ましい場合がある。
【0073】
いくつかの態様において、桿体細胞は、細胞のＢＥＳＴ１遺伝子発現のサイレンシング時に、構造的に無傷のままであり、および／または生存可能である。いくつかの態様において、細胞のＢＥＳＴ１遺伝子発現がサイレンシングされている桿体細胞は、通常、ＢＥＳＴ１を含有するであろう短縮された外側セグメントを有し得る。いくつかの態様において、外側セグメントの長さは、外因的に加えられた（硬化された）ＢＥＳＴ１遺伝子を使用して（例として、部分的または完全に）維持または回復され得、その発現は、本出願において記載されている組成物を使用するサイレンシングに耐性がある。
【0074】
本明細書で使用される用語としての疾患を「処置する」とは、対象が経験する疾患または障害（例として、ベスト病）の少なくとも１の兆候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。上記の組成物は、典型的には、有効量、すなわち、所望の結果を生み出すことができる量で対象に投与される。所望の結果は、投与される活性剤に依存するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、異種核酸を宿主器官、組織、または細胞に移すことができる粒子の量であり得る。
【0075】
開示の方法で利用される組成物の毒性および有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）を決定するために培養細胞または実験動物のいずれかを使用する標準的な医薬の手順によって決定され得る。毒性と有効性の治療指数との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示すそれらの組成物が好ましい。有毒な副作用を示すものを使用することもできるが、かかる副作用の潜在的な損傷を最小限に抑える送達システムを設計するように注意すべきである。本明細書に記載の組成物の投薬量は、一般に、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ５０を含む範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【0076】
さらなる詳細なしに、当業者は、上記の記載に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法であれ、開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【0077】
例
例１
ＲＰＥ－ＰＲ界面での初期の網膜全体の病態。
障害のあるＲＰＥ－ＰＲ相互作用の背後にある病態生理学を理解するために、臨床的に明らかな疾患を伴うｃＢｅｓｔ網膜を評価した。ＰＲ ＯＳとの直接的な相互作用に関与するＲＰＥ頂端膜の重要な特徴を、ＲＰＥ頂端ＭＶの形成に必須な膜－細胞骨格リンカータンパク質であるＥＺＲＩＮに対する免疫組織化学（ＩＨＣ）によって調べ、錐体ＰＲマトリックス特異的界面を区別するためのヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）およびピーナッツ凝集素レクチン（ＰＮＡ）標識と組み合わせた。野生型（ＷＴ）網膜の共焦点顕微鏡法およびの３Ｄ再構成画像の分析により、ＲＰＥ頂端膜の両方の固有の構成要素である錐体および桿体関連ＭＶの複雑なシート様構造が露出した。錐体－ＭＶ（ＲＰＥ頂端錐体鞘としても知られている）は、桿体－ＭＶよりも顕著であり、個々の錐体外側セグメント（ＣＯＳ）をＲＰＥ頂端表面につなぐ高度に組織化されたラッピングを形成した（図１Ａ）。網膜下腔において、この細胞間複合体は、ＰＮＡレクチンの選択的結合によって検出された同様に複雑な錐体特異的不溶性細胞外マトリックス鞘（錐体－ＩＰＭ）でさらに包まれていた（図１Ａ）。しかしながら、罹患したｃＢｅｓｔ網膜では、ＣＯＳのかかる複雑な細胞外区画化が失われ、微絨毛鞘の欠如は、リポフスチン顆粒で過負荷になり、不溶性錐体－ＩＰＭが損なわれた肥大したＲＰＥ細胞を伴った（図１Ｂ）。これらの所見は、発症後の２２の眼（４５～２７０週齢の範囲）の網膜のタペータム部分および非タペータム部分の両方で調べた３つの異なるｃＢＥＳＴ１遺伝子型（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊、Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ、およびＲ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）で確認された。
例１
ＲＰＥ－ＰＲ界面での初期の網膜全体の病態。
障害のあるＲＰＥ－ＰＲ相互作用の背後にある病態生理学を理解するために、臨床的に明らかな疾患を伴うｃＢｅｓｔ網膜を評価した。ＰＲ ＯＳとの直接的な相互作用に関与するＲＰＥ頂端膜の重要な特徴を、ＲＰＥ頂端ＭＶの形成に必須な膜－細胞骨格リンカータンパク質であるＥＺＲＩＮに対する免疫組織化学（ＩＨＣ）によって調べ、錐体ＰＲマトリックス特異的界面を区別するためのヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）およびピーナッツ凝集素レクチン（ＰＮＡ）標識と組み合わせた。野生型（ＷＴ）網膜の共焦点顕微鏡法およびの３Ｄ再構成画像の分析により、ＲＰＥ頂端膜の両方の固有の構成要素である錐体および桿体関連ＭＶの複雑なシート様構造が露出した。錐体－ＭＶ（ＲＰＥ頂端錐体鞘としても知られている）は、桿体－ＭＶよりも顕著であり、個々の錐体外側セグメント（ＣＯＳ）をＲＰＥ頂端表面につなぐ高度に組織化されたラッピングを形成した（図１Ａ）。網膜下腔において、この細胞間複合体は、ＰＮＡレクチンの選択的結合によって検出された同様に複雑な錐体特異的不溶性細胞外マトリックス鞘（錐体－ＩＰＭ）でさらに包まれていた（図１Ａ）。しかしながら、罹患したｃＢｅｓｔ網膜では、ＣＯＳのかかる複雑な細胞外区画化が失われ、微絨毛鞘の欠如は、リポフスチン顆粒で過負荷になり、不溶性錐体－ＩＰＭが損なわれた肥大したＲＰＥ細胞を伴った（図１Ｂ）。これらの所見は、発症後の２２の眼（４５～２７０週齢の範囲）の網膜のタペータム部分および非タペータム部分の両方で調べた３つの異なるｃＢＥＳＴ１遺伝子型（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊、Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ、およびＲ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）で確認された。
【0078】
構造的な錐体－ＭＶ異常が錐体機能障害および疾患に続発する可能性を評価するために、異なるイヌＩＲＤモデル（原発性錐体光受容体チャネル病、ＣＮＧＢ３関連色覚異常）におけるＲＰＥ－ＣＯＳ相互作用を調べた。ＲＰＥ－ＣＯＳ複合体を６週齢で最初に調べた。ミスセンス変異または遺伝子座欠失変異のいずれかを含むＣＮＧＢ３変異網膜は、ＲＰＥ－ＰＲ界面に明らかな不規則性を示さず、ＲＰＥ頂端マーカーの適切な局在化は特定の抗ＢＥＳＴ１標識と関連していた（図６Ａおよび６Ｂ）。二重免疫染色は、ｈＣＡＲ陽性であるがＣＮＧＢ３陰性のＣＯＳと互いに嵌合する錐体－ＭＶに沿ったＥＺＲＩＮの特異的分布を示した。徐々に錐体ＰＲ変性を受けるより高齢（５７および８５週齢）変異網膜におけるＣＮＧＢ３チャネルサブユニット機能障害の結果として、ＲＰＥ頂端部の微絨毛鞘は依然として大部分が無傷のままであることが見出された（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【0079】
ＣＮＧＢ３変異網膜の知見は、ｃＢｅｓｔの錐体－ＭＶ鞘に関連する構造変化が錐体欠損に続発するのではなく、ＢＥＳＴ１の変異によって引き起こされるＲＰＥチャネル病に特異的であることを示唆した。イヌにおける臨床的疾患の発症のかなり前であり、出生後の網膜分化の終わり近くである６週の時点が、これらの実験の焦点であった（図１Ｃおよび１Ｄ）。同齢のＷＴ対照とは対照的に、ｃＢｅｓｔ ＲＰＥにおける特定の側底ＢＥＳＴ１免疫標識の欠如は、かなり滑らかな頂端表面および明らかに未発達の（痕跡）頂端微絨毛と関連していた（図１Ｃ、矢印）。錐体－ＭＶの空間密度および錐体－ＭＶおよび桿体ＭＶの長さの定量化は、４つの網膜位置でのデコンボリューションされた３Ｄ Ｚスタック投影画像で行った（図１Ｄ）。錐体－ＭＶの平均数の有意差（Ｐ＜０．０００１）が、調べた各網膜領域のｃＢｅｓｔとＷＴとの間に見られた（図１Ｄ）。錐体光受容体の数は対照と同等であったが、ｃＢｅｓｔの錐体－ＭＶは数がはるかに少なく、まばらに分布しており、組織分布的位置に関係なく、対照よりも一貫して短く、はるかに細かく見えた。対照（ＷＴ）の眼では、錐体－ＭＶの平均的な長さは、タペータム上側頭象限で１７．４（±０．２５）μｍであり、下方非タペータム網膜で１２．３（±０．２３）μｍであったが、桿体－ＭＶの長さは、網膜のタペータム部分および非タペータム部分でそれぞれ６．７（±０．１１）μｍおよび５．３（±０．２７）μｍであった。しかしながら、ｃＢｅｓｔでは、識別された希少な錐体－ＭＶ拡張の平均的な長さが大幅に短縮された（中心のタペータムおよび非タペータムの下方部分でそれぞれ６．０±０．３１および６．５±０．７４μｍ）。ｃＢｅｓｔの微細な桿体－ＭＶの定量的評価は、光学分解能の限界を超えていた。
【0080】
ｃＢＥＳＴ１変異眼は露光に伴って拡大する網膜全体の微小剥離を有する。
ＩＨＣによって検出された初期のＲＰＥ－ＰＲ界面異常のin vivo相関を決定するために、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）による非侵襲的イメージングを使用して、検眼鏡検査の病変が検出されるかなり前の若い年齢のｃＢｅｓｔ眼を評価した。定性的に、評価されたすべての眼の中心網膜は、ＷＴ眼では検出できなかった外顆粒層（ＯＮＬ）の遠位に位置する外側網膜に追加の低散乱層を示した（図２Ａ、矢印および二重矢印）。予期せぬことに、低散乱層は、単一の実験セッション内で同じ眼に繰り返し記録されて変動した。さらなる分析により、明るい短波長光で行われる介在する自家蛍光イメージングのために網膜がより大きな網膜放射照度に曝露された場合、イメージングセッションの終わりに向かって得られたスキャンで低散乱層の幅がより広いことが明らかになった（図２Ａ、二重矢印、より多くのＬＡ）。低散乱層の幅は、自家蛍光イメージングが行われる前のイメージングセッションの初期に得られたスキャンでは小さかった（図２Ａ、矢印、より少ないＬＡ）。
ＩＨＣによって検出された初期のＲＰＥ－ＰＲ界面異常のin vivo相関を決定するために、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）による非侵襲的イメージングを使用して、検眼鏡検査の病変が検出されるかなり前の若い年齢のｃＢｅｓｔ眼を評価した。定性的に、評価されたすべての眼の中心網膜は、ＷＴ眼では検出できなかった外顆粒層（ＯＮＬ）の遠位に位置する外側網膜に追加の低散乱層を示した（図２Ａ、矢印および二重矢印）。予期せぬことに、低散乱層は、単一の実験セッション内で同じ眼に繰り返し記録されて変動した。さらなる分析により、明るい短波長光で行われる介在する自家蛍光イメージングのために網膜がより大きな網膜放射照度に曝露された場合、イメージングセッションの終わりに向かって得られたスキャンで低散乱層の幅がより広いことが明らかになった（図２Ａ、二重矢印、より多くのＬＡ）。低散乱層の幅は、自家蛍光イメージングが行われる前のイメージングセッションの初期に得られたスキャンでは小さかった（図２Ａ、矢印、より少ないＬＡ）。
【0081】
定量的研究は、縦反射プロファイルを取得し、鼻および側頭の網膜の位置の両方で測定を行うことによって行った。ＷＴ眼（ｎ＝１２、１５～１７週齢）は、外網状層（ＯＰＬ）および外境界膜（ＥＬＭ）に網膜外側の高散乱ピークを示し、介在する低散乱層をＯＮＬとして定義した（図２Ｂ）。ＥＬＭの遠位には、光受容体の内側セグメントと外側セグメントとの間の接合部に対応する高散乱ピーク（ＩＳ／ＯＳ）、ＲＰＥ－タペータム界面の近くで発生する主要なピーク（ＲＰＥ／Ｔ）、および（解像が困難なことが多い）光受容体ＯＳ先端に対応する介在する少数の高散乱ピークがあった（図２Ｂ）。異常な低散乱層（図２Ｂ、矢印）は、より少ない露光でｃＢｅｓｔ眼（ｎ＝６、１１週齢）において検出可能であった。より大きな露光で、低散乱層はより深く、より明確になった（図２Ｂ、二重矢印）。鼻および側頭の網膜の位置の両方が同じ効果を示した。ＩＳ／ＯＳピークとＲＰＥ／Ｔピークとの間の距離（図２Ａおよび２Ｂ、矢印）を測定した。ＷＴ眼では、距離は４１．３（±４．５）μｍであったが、ｃＢｅｓｔ眼では、この距離は、鼻および側頭網膜領域について、それぞれ、４６．８（±６．７）μｍおよび４５．２（±６．８）μｍ（より少ない露光）および５５．８（±１０．５）μｍおよび５３．５（±６．３）μｍ（より多い露光）で有意に大きかった（Ｐ＜０．００１）（図２Ｃ）。
【0082】
低散乱層の厚さを露光の機能としてよりよく理解するために、２種類の実験を行った。主な実験（ＷＴ、ｎ＝１２、１５～１７週齢；ｃＢｅｓｔ、ｎ＝３、１３週齢）では、眼を終夜暗順応させ、次いで標準的な臨床眼科機器によって生成される極めて薄暗い光から中程度の光までの範囲で、徐々に大きくなる強度の５つの介在する短時間の４８８ｎｍの露光で２時間にわたって、暗所で連続イメージングを行った（図２Ｄ）。より短い実験プロトコルでは、最も高い２つの露光のみを異なる眼で使用した（ｃＢｅｓｔ、ｎ＝３、１３週齢）。終夜の暗順応後、ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離はＷＴ眼では４０．０（±４．５）μｍであったが、ｃＢｅｓｔでは４７．１（±４．８）μｍであった（図２Ｅ）。差異は統計的に有意であった（Ｐ＜０．００１）。益々明るい露光は、ｃＢｅｓｔ眼においてＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の単調な拡大をもたらし、５９．４（±８．７）μｍの見かけのプラトーに達した（図２Ｅ）。ＷＴの眼では、露光の影響は無視できるか小さいかのどちらかであり、ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離は４０．９（±４．３）μｍのプラトーに達した。よって、光への曝露は、任意の検出可能な検眼鏡検査の知見の前の年齢で数分以内にｃＢｅｓｔ眼で最大１８．４（±８．７）μｍの急性網膜微小剥離を引き起こすように見えた。光を介した微小剥離は、２４時間未満の期間にわたって消失した（図７）。
【0083】
局所遺伝子治療の準備において、光駆動微小剥離の網膜部位分布を、完全に明順応したｃＢｅｓｔおよびＷＴ眼において評価した（図２Ｆ）。ＷＴ眼（ｎ＝４、１０４週齢）全体の平均ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離は、上方網膜領域および下方網膜領域で比較的均一であり、タペータム網膜と色素性（非タペータム）網膜との間の移行に対応する明確な境界があった。ＷＴ眼のタペータム網膜の距離が遠いのは、高散乱ピーク（タペータム網膜におけるタペータム対色素性ＲＰＥ）に対する主要な要因の差異が原因である可能性があった。２９７週齢のｃＢｅｓｔ眼（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）では、中心窩様領域での著しく明らかな網膜剥離に加えて、相対的にびまん性の網膜全体の微小剥離があった（図２Ｆ、より暗い色で示されている）。１２週齢の若いｃＢｅｓｔ眼（Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ）では、検眼鏡検査の異常は明らかではなかったが、視線（visual streak）に沿い、視神経乳頭を取り囲む大きな微小剥離の明確なバンドがあった。変異体の眼と平均ＷＴとの間の差異マップは、微小剥離の程度の空間分布を示した（図２Ｆ、右）。
【0084】
光受容体に対する潜在的な有害事象を評価するために、ＯＮＬの厚さを、微小剥離を伴う網膜領域全体に組織分布的にマッピングした（図８Ａおよび８Ｂ）。微小剥離は、光受容体の変性から予想されるＯＮＬの薄化をもたらさなかった。代わりに、ｃＢｅｓｔのＯＮＬはＷＴよりも均一に厚くなる傾向があった。超厚領域は、中心－上方タペータム網膜を典型的に含んでいたが、下方の非タペータム網膜にまで及ぶこともあった（図８Ａ）。重要なことに、ＯＮＬの超厚領域は、顕微鏡で調べると、対照に匹敵する数のＰＲ核を有していた。これは、イメージングによって観察された超厚ＯＮＬの考えられる原因として、核間の間隔の拡大を示唆している。
【0085】
イヌベストロフィノパチーの自然経過。
遺伝子治療の結果を評価するための前提条件として、ｃＢｅｓｔの自然経過を１８匹のイヌの群［１２匹のオス（Ｍ）および６匹のメス（Ｆ）；６～２９７週齢の範囲］から決定した（表１）。ｃＢｅｓｔイヌは、最も初期の疾患の発病を検出し、疾患の進行を理解するために、検眼鏡検査および非侵襲的イメージングによって連続的にモニタリングした。体系的なin vivoイメージングに基づいて、最初の疾患の兆候を、イヌ中心窩様領域のわずかな限局性網膜隆起として、早くも１１週齢（平均１５週齢）で検出した（図９Ａ）。下にあるＲＰＥからの光受容体層のこの離散的な分離は進行して、正面および２３週齢での対応するＯＣＴスキャンで明らかな、より大きな網膜下マクロ剥離（卵黄様病変）を形成した（図９Ｂ）。断面イメージングでのこの離散的なＲＰＥ－ＰＲ剥離は、正面のイメージングでは目立たないものの、遺伝子型に関係なく、調べたｃＢｅｓｔ眼（ｎ＝３４）の間で一貫していることがわかった。無症候性段階から、疾患は進行して、イヌ中心窩に限定され、微小剥離に囲まれたマクロ剥離（卵黄様段階）を形成した（図３Ａ、左パネル）。原発性病変は徐々に進化して、中心窩様領域を含む網膜中心窩野内の特徴的な水疱性剥離として現れるようになった（図３Ａ、中央および右のパネル、および図９Ｂ～９Ｄ）。特徴的な高自家蛍光の存在は、病変の下部で明らかであった（図３Ａ、中央の挿入パネル；偽性前房蓄膿段階）。進行した疾患段階は、中心病変内の高自家蛍光物質の部分的な吸収および分散を伴い、ＯＮＬの有意な薄化に関連した（図９Ｅおよび９Ｆ）。
遺伝子治療の結果を評価するための前提条件として、ｃＢｅｓｔの自然経過を１８匹のイヌの群［１２匹のオス（Ｍ）および６匹のメス（Ｆ）；６～２９７週齢の範囲］から決定した（表１）。ｃＢｅｓｔイヌは、最も初期の疾患の発病を検出し、疾患の進行を理解するために、検眼鏡検査および非侵襲的イメージングによって連続的にモニタリングした。体系的なin vivoイメージングに基づいて、最初の疾患の兆候を、イヌ中心窩様領域のわずかな限局性網膜隆起として、早くも１１週齢（平均１５週齢）で検出した（図９Ａ）。下にあるＲＰＥからの光受容体層のこの離散的な分離は進行して、正面および２３週齢での対応するＯＣＴスキャンで明らかな、より大きな網膜下マクロ剥離（卵黄様病変）を形成した（図９Ｂ）。断面イメージングでのこの離散的なＲＰＥ－ＰＲ剥離は、正面のイメージングでは目立たないものの、遺伝子型に関係なく、調べたｃＢｅｓｔ眼（ｎ＝３４）の間で一貫していることがわかった。無症候性段階から、疾患は進行して、イヌ中心窩に限定され、微小剥離に囲まれたマクロ剥離（卵黄様段階）を形成した（図３Ａ、左パネル）。原発性病変は徐々に進化して、中心窩様領域を含む網膜中心窩野内の特徴的な水疱性剥離として現れるようになった（図３Ａ、中央および右のパネル、および図９Ｂ～９Ｄ）。特徴的な高自家蛍光の存在は、病変の下部で明らかであった（図３Ａ、中央の挿入パネル；偽性前房蓄膿段階）。進行した疾患段階は、中心病変内の高自家蛍光物質の部分的な吸収および分散を伴い、ＯＮＬの有意な薄化に関連した（図９Ｅおよび９Ｆ）。
【0086】
いずれの場合も、連続イメージングが続き（表１）、ｃＢｅｓｔは両側に現れ、進行速度は変動するが、ほぼ常に顕著な対称性を示した（図３Ａおよび図９Ａ～９Ｆ）。両眼に検眼鏡検査的に見える総網膜剥離は、中心網膜に限定されたままであるか、中心部外病変が全体に散在してより広範囲になり、依然として中心錐体が豊富な領域への強い偏向があり、超厚ＯＮＬに関連している。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0087】
キー：ＢＳＳ、平衡塩類溶液；ｃＢＥＳＴ１、イヌ導入遺伝子；ｈＢＥＳＴ１、ヒト導入遺伝子；Ｉｎｊ．、注射した；ＯＤ、右眼；ＯＳ、左眼；ＯＵ、両側；ｐ．ｉ．、注射後；ＵｎＴｘ、未処置；ｖｇ、ベクターゲノム；ＷＴ、野生型。ｃＢＥＳＴ１変異：Ｒ２５＊／Ｒ２５＊、ｐ．Ａｒｇ２５Ｔｅｒ－ホモ接合体；Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ、ｐ．Ｐｒｏ４６３ｆｓ－ホモ接合体；Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ、ｐ．Ａｒｇ２５Ｔｅｒ／ｐ．Ｐｒｏ４６３ｆｓ－複合ヘテロ接合体。
【0088】
網膜下ＢＥＳＴ１遺伝子増強治療は疾患を安定的に修正する。
ＡＡＶ２を介した網膜下遺伝子増強治療の概念実証を評価するために、２２のｃＢｅｓｔ眼に２７～６９週でヒトＶＭＤ２プロモーターによって駆動されるイヌ（ｃＢＥＳＴ１）またはヒト（ｈＢＥＳＴ１）導入遺伝子を注射した［０．１～５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ範囲のベクター力価または平衡塩類溶液（ＢＳＳ）対照］（表１）。開示されたｒＡＡＶ粒子を作製するために使用されるｈＢＥＳＴ１およびｃＢＥＳＴ１異種核酸を含む例示のＡＡＶベクターのマップをそれぞれ図１３および１４に示す。種々の段階の限局性または多発性網膜剥離を示すｃＢｅｓｔイヌに、ＡＡＶを片側に注射して他方の眼に注射しないか、または片方の眼にＡＡＶを注射して反対側の眼に対照（ＢＳＳ）注射を行った。多発性疾患を呈する３例は、上側頭象限を標的とするＡＡＶを両側に注射し、他方、外科的小疱の外側の網膜領域は内部対照として機能した（表１）。
ＡＡＶ２を介した網膜下遺伝子増強治療の概念実証を評価するために、２２のｃＢｅｓｔ眼に２７～６９週でヒトＶＭＤ２プロモーターによって駆動されるイヌ（ｃＢＥＳＴ１）またはヒト（ｈＢＥＳＴ１）導入遺伝子を注射した［０．１～５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ範囲のベクター力価または平衡塩類溶液（ＢＳＳ）対照］（表１）。開示されたｒＡＡＶ粒子を作製するために使用されるｈＢＥＳＴ１およびｃＢＥＳＴ１異種核酸を含む例示のＡＡＶベクターのマップをそれぞれ図１３および１４に示す。種々の段階の限局性または多発性網膜剥離を示すｃＢｅｓｔイヌに、ＡＡＶを片側に注射して他方の眼に注射しないか、または片方の眼にＡＡＶを注射して反対側の眼に対照（ＢＳＳ）注射を行った。多発性疾患を呈する３例は、上側頭象限を標的とするＡＡＶを両側に注射し、他方、外科的小疱の外側の網膜領域は内部対照として機能した（表１）。
【0089】
代表的な結果は、５２週齢でｃＢＥＳＴ１の網膜下注射を受けた右眼の進行した中心網膜剥離（ＥＭ３５６－ＯＤ）（図３Ａ）を示す複合ヘテロ接合（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）イヌから示されるが（図３Ｂ、左パネル）、他方の眼には注射しなかった（ＥＭ３５６－ＯＳ）（図９Ａ～９Ｆ）。両眼は、臨床的におよびin vivoイメージングによってモニタリングした。疾患の逆転は、注射後（ｐ．ｉ．）４週に注射した眼で最初に明らかになり、４３および２４５週ｐ．ｉ．に示されているように、長期間持続的な効果を保持した（図３Ｂ）。網膜下マクロ剥離（ｎ＝１３眼）内に自家蛍光物質の広範な蓄積を示した進行性疾患のこの症例および他の症例では、高自家蛍光シグナルは、ＡＡＶ注射後数ヶ月間は依然として検出可能であったが、経時的に徐々に弱まった（図３Ｂ、挿入パネル）。非侵襲的イメージングに基づいて、ＡＡＶ－ＢＥＳＴ１処置領域内の限局性病変ならびに中心外病変の両方が４～１２週ｐ．ｉ．で解消し、局所的な網膜再付着はその後も安定したままであった（表１）。ＡＡＶで処置した眼のいずれにも炎症反応の証拠はなく、縦方向のin vivo評価では、ＲＰＥまたは神経網膜への悪影響は明らかにならなかった。
【0090】
ｈＢＥＳＴ１によるＡＡＶを介した処置もまた、病変の逆転および長期的な疾患の修正をもたらした（ｎ＝１３眼）。ｃＢｅｓｔイヌ（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊）からの代表的なin vivoイメージング結果およびＩＨＣ評価（図３Ｃおよび３Ｄ）は、処置前に存在した初期の両側性病変が、研究の眼（study eye）（ＥＭＣ３－ＯＳ）をＡＡＶ－ｈＢＥＳＴ１（２×１０１１ｖｇ／ｍＬ）で処置した後に消失したことを示したが（図３Ｄ）、ＢＳＳを注射した反対側の対照眼（ＥＭＣ３－ＯＤ）の病変は拡大し続けた（図３Ｃ）。眼底検査に基づいて、説明した例ならびに他のすべての場合において、ベクターまたはＢＳＳ送達に関連する一過性の網膜剥離は、２４～４８時間ｐ．ｉ．以内に解消した。しかしながら、ＢＳＳを注射した網膜病変は、早くも１週ｐ．ｉ．で再発し、自然の疾患経過に沿って進行した（図３Ｃ）。これは、ｈＢＥＳＴ１遺伝子治療後の最初の６週以内に初期病変およびより進行した病変の両方が解消し、その後処置領域が無病のままであったＡＡＶ処置眼とは明確に対照的であった（図３Ｄ）。ＲＰＥおよびＰＲ特異的なマーカーを使用した眼科検査およびＩＨＣ評価では、２０７週ｐ．ｉまで網膜に悪影響は見られなかった（図３、１０および１１）。特に重要なことは、網膜保存ｐ．ｉ．の評価が、錐体－ＭＶおよびアクチン細胞骨格レスキューの拡張を含む、ＲＰＥ－ＰＲ界面での網膜構造の顕著な回復を明らかにしたことであり、これは、イヌまたはヒトのＢＥＳＴ１導入遺伝子のいずれかによるベクターで処置した小疱領域に対応する（図３Ｃおよび３Ｄ、下のパネルおよび図１０および１１）。性別間で臨床写真またはＡＡＶ－ＢＥＳＴ１処置への応答に差異は見られなかった。
【0091】
網膜は、野生型対照およびｃＢｅｓｔの未処置の眼と比較して、３つのｃＢｅｓｔモデル［ｃｍｒ１（Ｒ２５＊／Ｒ２５＊）、ｃｍｒ１／ｃｍｒ３（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）、およびｃｍｒ３（Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ）］でＡＡＶ－ｈＢＥＳＴ１処置後に保存した。ｃＢｅｓｔ眼に２７週齢（ｃｍｒ１）、４５週齢（ｃｍｒ１／ｃｍｒ３）、または６３週齢（ｃｍｒ３）でＡＡＶ－ｈＢＥＳＴ１（２×１０１１ｖｇ／ｍＬ）を注射し、それぞれ１０３週、５１週、または２０７週ｐ．ｉ．でＩＨＣによって評価した（図１０）。処置領域内に明らかな異常は２０７週ｐ．ｉ．まで検出されなかった。すべての処置した眼（ＥＺＲＩＮ）の網膜下腔に突出しているＲＰＥ頂端拡張に注意されたい。未処置のｃＢｅｓｔ対照（右端のパネル）は、ＲＰＥ頂端微絨毛の欠如、ＲＰＥ肥大（ＥＺＲＩＮ、ＲＰＥ６５）、および網膜下腔の自家蛍光沈着物とともにＲＰＥ単層内のリポフスチン顆粒の蓄積を示す。
【0092】
代表的な共焦点顕微鏡写真を、ＡＡＶ－ｈＢＥＳＴ１注射（２．５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）の７９週後のｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）網膜を示し、ＢＥＳＴ１（ＲＰＥ、より暗い色）およびＳＬＣ１６Ａ１（ＲＰＥ、より明るい色）で二重標識されている図１１Ａに示す。外科的小疱領域（図１１Ｂ）から、隣接する境界域領域（図１１Ｃ）を通って、注射ゾーンの外側の隣接範囲（図１１Ｄ）に向かう断面の概観を図１１Ｂ～１１Ｄに示す。拡大画像で強調されているように、ＲＰＥ－ＰＲ界面構造の回復の程度とＢＥＳＴ１導入遺伝子の発現との間に直接的な相関関係が観察された。増強されたＢＥＳＴ１を有する処置領域内のＲＰＥ頂端突起の顕著な拡張が観察された（図１１Ｂ）；ＢＥＳＴ１の斑状分布（個々のＲＰＥ細胞内の弱い赤色シグナル）およびＲＰＥ－ＰＲ微小剥離に関連する小疱境界域における痕跡の微絨毛［ｃ－ＭＶ（明るい矢印）および桿体－ＭＶ（より暗い矢印）］の存在（図１１Ｃ）；処置ゾーンの外側でのＢＥＳＴ１発現およびＲＰＥ頂端突起の両方の不在下での網膜下病変の形成（図１１Ｄ）。スカラップ状で精巧でないＲＰＥ頂端表面および大量の細胞内沈着物は、ｃＢｅｓｔ変異ＲＰＥ内の顆粒状凝集体として現れた（図１１Ａ、上部パネル、非注射；図１１Ｄ、拡大）。剥離ゾーンでは、網膜下腔に潜り込む細胞デブリ（星印）はミュラーグリアに対応し、ストレスに応じた網膜のリモデリングを反映する。［スケールバー、１００μｍ（上）および１０μｍ（図１１Ａ～１１Ｄ）。］
【0093】
遺伝子治療による光調節した微小剥離の修正。
検眼鏡検査的に検出可能な網膜剥離のない網膜領域に対するＢＥＳＴ１遺伝子増強治療の結果を理解するために、ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離を網膜下小疱の内外で組織分布的に測定した。ｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）イヌの６９週齢での対照網膜下ＢＳＳ注射による代表的な結果は、８７週齢で画像化されたすべての網膜を覆う均一な微小剥離を示した（図４Ａ）。平均微小剥離範囲（ＷＴ眼で行われた共存測定から差し引かれたＢＳＳ注射変異イヌのＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離）は、上方網膜で１１．６μｍ、下方網膜で１６．７μｍであり（図４Ｂ）、未注射のｃＢｅｓｔ眼で一貫していた。他方、網膜下ＡＡＶ遺伝子治療は、処置領域のＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の大幅な短縮をもたらした。ＥＭＣ３－ＯＳ、ＥＭＬ４－ＯＳ、およびＬＨ２１－ＯＳは、約２×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価を有するヒトＢＥＳＴ１導入遺伝子を使用した遺伝子治療で処置された３つの遺伝子型の結果を示す（図４Ａおよび表１）。いずれの場合も、処置された小疱のＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の大幅な短縮があった。注目すべきことに、総網膜剥離（より暗い色）は、処置領域の外側でのみ検出可能であった（図４Ａ）。定量的測定は、微小剥離の完全な改善を示し、ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離は網膜下の遺伝子治療で処置された上方網膜領域および下方網膜領域の両方でＷＴレベルに戻ったが（図４Ｂ、塗りつぶされた記号）、処置小疱から離れた網膜領域ではそうならなかった（図４Ｂ、塗りつぶされていない記号）。
検眼鏡検査的に検出可能な網膜剥離のない網膜領域に対するＢＥＳＴ１遺伝子増強治療の結果を理解するために、ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離を網膜下小疱の内外で組織分布的に測定した。ｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）イヌの６９週齢での対照網膜下ＢＳＳ注射による代表的な結果は、８７週齢で画像化されたすべての網膜を覆う均一な微小剥離を示した（図４Ａ）。平均微小剥離範囲（ＷＴ眼で行われた共存測定から差し引かれたＢＳＳ注射変異イヌのＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離）は、上方網膜で１１．６μｍ、下方網膜で１６．７μｍであり（図４Ｂ）、未注射のｃＢｅｓｔ眼で一貫していた。他方、網膜下ＡＡＶ遺伝子治療は、処置領域のＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の大幅な短縮をもたらした。ＥＭＣ３－ＯＳ、ＥＭＬ４－ＯＳ、およびＬＨ２１－ＯＳは、約２×１０１１ｖｇ／ｍＬの力価を有するヒトＢＥＳＴ１導入遺伝子を使用した遺伝子治療で処置された３つの遺伝子型の結果を示す（図４Ａおよび表１）。いずれの場合も、処置された小疱のＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離の大幅な短縮があった。注目すべきことに、総網膜剥離（より暗い色）は、処置領域の外側でのみ検出可能であった（図４Ａ）。定量的測定は、微小剥離の完全な改善を示し、ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離は網膜下の遺伝子治療で処置された上方網膜領域および下方網膜領域の両方でＷＴレベルに戻ったが（図４Ｂ、塗りつぶされた記号）、処置小疱から離れた網膜領域ではそうならなかった（図４Ｂ、塗りつぶされていない記号）。
【0094】
網膜下遺伝子治療の有効領域は、手術時に形成された小疱を超えて拡張し、境界域領域を含むことがしばしば示される。遺伝子治療に成功したｃＢｅｓｔイヌでは、境界域領域もあったが、これまでに典型的に遭遇したものよりも定性的に大きいように見えた（図４Ａ）。最も極端な例のいくつかでは、網膜全体の微小剥離の前処置マップが、境界域拡張の程度を示すために必要であることがわかった。例えば、ＥＭＬ９－ＯＤは、２９週齢で、視線に沿って最も極端であり、総網膜剥離を伴ういくつかの領域を含む網膜全体の微小剥離を示した（図４Ｃ）。遺伝子治療は６９週で行った。８７週で、画像化された網膜全体にわたる微小剥離、ならびに総網膜剥離の大部分が消失し（図４Ｃ）、定量的測定は、上方および下方の網膜の位置において、正常またはより薄いＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離を示した（図４Ｄ）。重要なことに、ＩＳ／ＯＳ－ＲＰＥ／Ｔ距離は、注射時に形成された小疱に対応する網膜の位置、ならびに同じ眼の鼻網膜制御領域で大幅な改善を示した。境界域拡張のこの極端な例は、最初の小疱よりも実質的により離れた部位でのＲＰＥの形質導入をもたらした、ｃＢｅｓｔ眼の微小剥離を介したベクターのより大きな拡散によって説明される可能性がある。比較のために、区切られた境界域拡張を使用したより典型的な例を示す。３７週齢のＥＭＬ１３－ＯＳは、網膜全体に、側頭網膜においておよび視線に沿って特に顕著である微小剥離を示した；視線に沿っていくつかの総網膜剥離もあった（図４Ｅ）。遺伝子治療は４５週で行った。８１週齢では、視神経の上方および下方の網膜側頭の両方が微小剥離およびマクロ剥離を欠いていたが、未処置の鼻網膜は微小剥離を保持し、多数のマクロ剥離を形成した（図４Ｅ）。定量的結果は、ＥＭＬ９－ＯＤとは異なり、鼻網膜に到達しなかった処置効果を確認した（図４Ｆ）。
【0095】
網膜変性に対する遺伝子治療の潜在的な結果を理解するために、ＯＮＬの厚さを処置した眼全体にマッピングした（図８Ｂ）。微小剥離の消失を示す処置した網膜領域はまた、正常なＯＮＬの厚さに対応する傾向があるが、微小剥離を保持する未処置の領域は、超厚または正常、またはいくつかの領域では、薄化したＯＮＬを示す傾向があった（図８Ｂ）。要約すると、イヌベストロフィノパチーにおけるＡＡＶを介した遺伝子増強治療は、総網膜剥離の持続的な逆転、ＲＰＥとＰＲとの間の密接な接触の再確立、およびＯＮＬの厚さの正常値への復帰を促進するようである。
【0096】
ヒト常染色体劣性ベストロフィノパチー：構造および機能。
ＢＥＳＴ１変異イヌにおける成功した遺伝子治療の臨床トランスレーションを容易にするために、常染色体劣性ベストロフィノパチー（ＡＲＢ）のヒト病態生理学をよりよく理解し、前述の検眼鏡検査的に検出可能な総病変を超えた網膜全体の疾患の分布に関する洞察を得るための研究を行った。２人の患者からのデータを示す（図５Ａ～５Ｇ）：Ｐ１は、二アレルＢＥＳＴ１変異（ｃ．３４１Ｔ＞Ｃ／ｃ．４００Ｃ＞Ｇ）を有し、２０／１００の最良の矯正視力を有する３９歳の女性であったが、Ｐ２は、ＢＥＳＴ１において二アレル変異（ｃ．９５Ｔ＞Ｃ／ｃ．１０２Ｃ＞Ｔ）を有し、２０／６０視力を有する３６歳の男性であった。両方の患者において、変異アレルは臨床的に発症していない親と分離した。それらが含むリポフスチン顆粒の自然な自家蛍光を利用するＲＰＥ健康状態の超ワイドイメージングは、相対的な高または低自家蛍光および局所的な不均一性の領域からなる広範囲かつ豊富な異常を示した。注目すべきことに、より健康な鼻末梢網膜を区別する鼻中央周辺網膜において明確な移行ゾーン（図５Ａ、矢印）があった。
ＢＥＳＴ１変異イヌにおける成功した遺伝子治療の臨床トランスレーションを容易にするために、常染色体劣性ベストロフィノパチー（ＡＲＢ）のヒト病態生理学をよりよく理解し、前述の検眼鏡検査的に検出可能な総病変を超えた網膜全体の疾患の分布に関する洞察を得るための研究を行った。２人の患者からのデータを示す（図５Ａ～５Ｇ）：Ｐ１は、二アレルＢＥＳＴ１変異（ｃ．３４１Ｔ＞Ｃ／ｃ．４００Ｃ＞Ｇ）を有し、２０／１００の最良の矯正視力を有する３９歳の女性であったが、Ｐ２は、ＢＥＳＴ１において二アレル変異（ｃ．９５Ｔ＞Ｃ／ｃ．１０２Ｃ＞Ｔ）を有し、２０／６０視力を有する３６歳の男性であった。両方の患者において、変異アレルは臨床的に発症していない親と分離した。それらが含むリポフスチン顆粒の自然な自家蛍光を利用するＲＰＥ健康状態の超ワイドイメージングは、相対的な高または低自家蛍光および局所的な不均一性の領域からなる広範囲かつ豊富な異常を示した。注目すべきことに、より健康な鼻末梢網膜を区別する鼻中央周辺網膜において明確な移行ゾーン（図５Ａ、矢印）があった。
【0097】
桿体および錐体の機能は、視力喪失の組織分布および網膜構造異常へのその対応をよりよく理解するために、水平経線に沿って高密度でサンプリングした。両方の患者は、長期の暗順応眼の中心部で桿体媒介感受性の深い（＞３ｌｏｇ）喪失を示した；両方の患者の側頭野（鼻網膜）および１人の患者の乳頭周囲領域における桿体機能の相対的な保存があった（図５Ｂ、上部パネル）。驚くべきことに、明順応した眼の錐体媒介機能は、中程度の喪失（＜１ｌｏｇ）または正常またはほぼ正常な結果のみを示した（図５Ｂ、下部パネル）。視野の全範囲にわたってサンプリングした桿体および錐体機能は、これらの知見を実証かつ拡張し、強い眼間対称性を示した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ＡＲＢを有する２人の患者の両眼の桿体感受性喪失（ＲＳＬ）および錐体感受性喪失（ＣＳＬ）マップ。重度のＲＳＬの大きく対称的な中心領域は、側頭野で比較的保持された機能に囲まれていた。錐体機能への影響は比較的少なく、ＣＳＬは視野全体で比較的均一である。生理学的盲点は、側頭野の１２°にある黒色の四角として示されている。
【0098】
中心窩を横断する水平経線に沿った網膜積層異常を評価するために、ＯＣＴを用いた断面イメージングを行った（図５Ｃ）。ＯＣＴイメージングの時点では、一貫した露光履歴はなかった。両方の患者は、中心網膜の大部分にわたって外側網膜の光受容体ＩＳ／ＯＳのレベルでＯＮＬの有意な喪失および異常を示した。さらに、Ｐ２は網膜内嚢胞腔およびＲＰＥからの中心網膜の剥離を示した。これはおそらく網膜下液の蓄積によるものである。網膜積層は、乳頭周囲領域（図５Ｃ、暗い色の長方形）において、および鼻の中央周辺の移行を超えて（図５Ｃ、明るい色の長方形）、相対的な正常化を示した。２つの関心領域の分析は、検出可能であるが異常に薄化したＯＮＬ、および検出可能なＩＳ／ＯＳおよび錐体外側セグメント先端（ＣＯＳＴ）を示し、これは両方の患者で低いピークシグナルを伴った（図５Ｄおよび５Ｅ）。Ｐ１では、ＥＬＭからＩＳ／ＯＳまでの距離およびＩＳ／ＯＳからＣＯＳＴまでの距離は正常なものと同等であった。ＣＯＳＴの遠位に低散乱層があるように見え、ＲＰＥは超厚のものに見えた（図５Ｄ、中央のパネル）。Ｐ２では、ＥＬＭからＩＳ／ＯＳまでは正常よりも短く見えたが、ＩＳ／ＯＳからＣＯＳＴまでの距離は正常なものと同等であった。ＣＯＳＴからＲＯＳＴ／ＲＰＥまでの距離は、不明瞭な低散乱層が介在しているため、正常なものよりも長く見えた；ＲＰＥは、厚さが正常なものと同等であるように見えた（図５Ｄ、右パネル）。Ｐ１の鼻中央周辺領域の外側網膜の分析は、ＥＬＭからＩＳ／ＯＳ、ＩＳ／ＯＳからＣＯＳＴ、およびＣＯＳＴからＲＯＳＴ／ＲＰＥの距離が正常なものよりも大きく、ＲＰＥの厚さが正常なものに匹敵することを示した（図５Ｅ、中央パネル）。Ｐ２の特徴は、Ｐ１と正常なものとの間の中間に現れた（図５Ｅ、右パネル）。
【0099】
これらの細胞層間のレチノイド移動の動態に対する外側網膜およびＲＰＥのレベルでの構造異常の影響を理解するために、暗順応試験を行った。図５Ｄに示す乳頭周囲の位置では、Ｐ１の暗順応閾値は桿体媒介であったが、１．３ｌｏｇ単位上昇した（図５Ｆ）。露光後２２．５分までに、Ｐ１の結果はプラトー上で錐体媒介のままでであったが、正常なものは既に最終的な暗順応閾値の１ｌｏｇ単位以内であった。５０分までに、Ｐ１桿体の結果は依然として１ｌｏｇ上昇したが、正常な回復は完了した（図５Ｆ）。図５Ｅに示す中央周辺の鼻網膜の位置では、Ｐ２の暗順応閾値は、桿体媒介性であり、正常なものと比較して約０．５ｌｏｇ単位上昇した（図５Ｇ）。露光後１４．５分までに、桿体機能の最初の証拠があったが、これは正常なものの１１分の錐体－桿体破壊よりも徐々に遅くなった。桿体の回復率は正常なものと同様であった（図５Ｇ）。要約すると、乳頭周囲の遺伝子座でのＰ１の桿体暗順応動態は非常に遅い時間経過を示したが、中央周辺の遺伝子座でのＰ２の桿体機能の暗順応動態は正常なものに近かった（図５Ｆおよび５Ｇ）。
【0100】
ＲＰＥは、網膜下腔の代謝的に活性な環境を維持する上で重要な役割を果たす。隣接する網膜層との動的な関係により、ＲＰＥ特異的遺伝子の変異は、隣接する感覚ニューロンに悪影響を及ぼし、視覚機能の喪失およびＰＲ変性をもたらすことがよくある。ＢＥＳＴ１の変異は、細胞内カルシウムの異常なレベルに応答して、経上皮イオンおよび体液輸送を妨害することが知られている。異常なＲＰＥカルシウムシグナル伝達は、Ｃａ２＋感受性タンパク質の発現および相互作用の変化を通じて他の経路の調節異常をもたらすとも考えられている。ｃＢｅｓｔの知見に基づくと、かかるタンパク質の１つは、ＲＰＥ頂端ＭＶの形成および適切な成熟に必須な膜－細胞骨格リンカーであるＥＺＲＩＮである。ＥＺＲＩＮの膜－Ｆ－アクチン架橋機能の活性化は、Ｃａ２＋トランジェントに直接応答して発生し、Ｅｚｒｉｎ－ＫＯマウスはＲＰＥ ＭＶの生成の大幅な減少を示すことが実証されている。ＢＥＳＴ１変異ＲＰＥに見られるＲＰＥ頂端ＭＶの明らかな未発達は、これらの知見と一致している。さらに、他のＩＲＤモデルとの比較ＩＨＣ評価は、微絨毛鞘に関連するこれらの主要な構造変化が、ＢＥＳＴ１変異によって引き起こされる原発性ＲＰＥチャネル病に特異的であり、錐体機能障害および変性に続発しないことを示した。
【0101】
ＲＰＥ頂端突起の構造要素は、非運動性の腸の微絨毛のものとは大きく異なる。ＲＰＥの頂端微絨毛に収縮性タンパク質（ミオシンなど）が存在すること、および細胞付着部位に典型的に見られる分子も、ＲＰＥが神経網膜に積極的に付着し、張力をかけていることを示唆している。ｃＢｅｓｔのＲＰＥ－ＰＲ界面での適切な微絨毛鞘の不足、したがってＰＲ ＯＳへのこれらの突起による物理的および静電的支持の不在は、接着力を弱め、網膜全体のＲＰＥ－ＰＲ複合体の分離につながると予想されるであろう。疾患の最も初期の段階でｃＢｅｓｔに見られる下にあるＲＰＥからのＰＲ層の微小剥離は、このプロセスと一致するであろう。さらに、ＲＰＥ頂端突起における収縮要素の存在、およびそれらが色素遊走が起こった細胞から進化したという事実は、ＭＶがＰＲ ＯＳと嵌合する間、活発な収縮が可能であり、概日食作用活性を促進する運命にあることを示している。単一のＲＰＥ細胞は、網膜の位置およびパッキング密度に応じて、約３０～５０のＰＲを収容できる；微絨毛の精巧なネットワークにより、各ＲＰＥ細胞はかかる高い代謝負荷を日常的に処理することができる。プロテオミクスプロファイリングからの洞察は、この議論を裏付けている。ＲＰＥとＰＲ ＯＳとの間の水、イオン、および代謝物の効率的な輸送の中心となる多数のチャネルタンパク質およびトランスポーター（例として、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）とともに、ＲＰＥ頂端ＭＶに沿って発現されるレチノイドプロセシングタンパク質の濃縮画分がある。ＲＰＥ細胞のサイズの組織分布的な差異を考え、この研究で定量化したＭＶの密度および長さを考慮すると、ＭＶ拡張は単一のＲＰＥ細胞の機能表面を中心網膜で２０～３０倍拡大し、これは以前の見積もりと一致している。この数は、最も密集したＰＲに直面しながら、脱落したＰＯＳのより高い代謝回転率に適応した黄斑領域の小さなＲＰＥ細胞ではさらに高くなる（約５０倍）。ＢＥＳＴ１変異ＲＰＥの総頂端表面領域のかかる劇的な減少は、代謝物のプロセシングの慢性的な遅延につながり、網膜下腔において適切な細胞体積ならびに化学組成および生理学的ｐＨレベルの両方を維持するＲＰＥの能力を停止させる。これらの要因は網膜の接着に必須であるため、ＲＰＥ輸送システムに制限があると、静水圧のバランスが変化し、ＲＰＥ－ＰＲ複合体の浸透圧弾性（osmoelastic）特性が低下し、その後神経網膜から分離する。実際、ヒトおよびイヌのベストロフィノパチーにおける原発性漿液性剥離は、最も高い代謝活性の中心領域である中心窩で最初に明らかになる。構造的に無傷の網膜でＣＯＳを楕円体までしっかりと包み込む、高範囲のＲＰＥ頂端突起がないことは、この錐体に富む構造が、ベストロフィノパチーにおけるその原発性剥離に対する偏向を説明するであろう。ＭＶとの摩擦相互作用に対するほぼ排他的な依存性があるであろう。これは、ｃＢｅｓｔでの所見と一致しており、網膜中心窩野のイヌ中心窩様領域内の限局性の前卵黄様病変の形成、および網膜下剥離に対する他の中心錐体に富む領域（視線など）の感受性も記録している。
【0102】
薄暗く中程度の光強度に曝露したときのｃＢｅｓｔの微小剥離の主な拡大は予想外の結果であった。正常な眼では、露光は網膜下腔の分子組成を変化させることが知られている。外側セグメントの長さの変化、網膜下腔の水和、ＲＰＥ頂端ＭＶに沿ったアクチン染色の増加、および外側セグメントの光指向性など、露光によって正常な外側網膜に測定可能な構造変化が生じるという証拠もある。しかしながら、正常な変化のすべては、ｃＢｅｓｔで測定したものよりも大幅に小さい。例えば、ｃＢｅｓｔの光によって駆動される網膜下腔の約１８μｍの拡張と比較して、正常なヒトの眼は約１μｍの変化を示し、正常なマウスの眼は外側網膜で約４μｍの変化を示した。ヒトＡＲＢは最近認識されたばかりであり、最も初期の疾患段階に関する文献は限られている。劣性ｃＢｅｓｔ疾患は、ヒトの優性および劣性の両方のベストロフィノパチーに対する表現型の類似性を有しているようである。ベスト病（ＢＶＭＤ）を有する患者では、卵黄様または後期病変を囲む網膜領域、または前卵黄様段階の疾患の網膜の構造的特徴に関していくつかの論争があった。いくつかの研究は、ＲＰＥ－ＰＲ界面のレベルで軽微な異常を示したが、他からの結果は、検出可能な構造上の欠陥を支持しなかった。この論争の原因は、遺伝子型、使用した種々の方法論的アプローチの解決、またはイメージングに先行する光の履歴であり得る。実際、光依存性の網膜外側の変化は、本明細書に開示のものなどの方法を使用してＢＶＭＤに記載されている；それでも、患者の変化の大きさはｃＢｅｓｔよりも小さかった（約２μｍ）。しかしながら、一般に、光刺激に対する影響を受けた網膜の異常な応答は、眼電図の光のピーク／暗闇の谷の比率が著しく低下していることに関連し得る（すべてのベスト病患者（発症前のベスト病患者でさえ）で一貫した知見）。
【0103】
重要なことに、ｃＢｅｓｔの微小剥離およびマクロ剥離の両方が光受容体の健康に悪影響を及ぼした：微小剥離の領域は超厚ＯＮＬに対応する傾向があったのに対し、総マクロ剥離を伴う大きな病変はＯＮＬの薄化を示した。本明細書で使用したサンプリング方法では、マクロ剥離を伴うより小さな病変を評価できなかった。ＯＮＬはすべての桿体および錐体の核を含み、動物モデルおよびヒトの眼のドナーでの古典的な研究は、一般に、疾患の進行に伴ってＯＮＬが薄化することを示している。ＯＮＬの肥厚を示す網膜疾患の最も初期の段階のいくつかはあまり知られておらず、これは、in vivoイメージング方法の進歩によってのみ測定可能になった。ヒト研究は、網膜疾患の初期段階でかかるＯＮＬの肥厚を以前に示した。網膜ストレスに関連するＯＮＬ肥厚の動物研究でも証拠がある。顕微鏡で調べたときにｃＢｅｓｔのマッピングされたＯＮＬの超厚領域は、ＰＲ核の数が対照に匹敵することを示し、ＯＮＬ内のより大きな核間間隔を示唆しており、アポトーシスの閾値を下回る網膜ストレスのレベルに対応している可能性がある。他方、総網膜剥離は、より大きな網膜ストレスおよび進行性の変性を引き起こし得る。
【0104】
ＢＥＳＴ１変異に関連する光受容体および視力の喪失を防ぐために、マクロ剥離および微小剥離を伴う網膜領域を対象とした網膜下の遺伝子増強治療を行った。結果は、ＡＡＶを介したＢＥＳＴ１遺伝子の増強が安全であり、臨床的に明らかな病変を逆転させ、びまん性微小剥離を改善し、超厚ＯＮＬの正常化をもたらすことを示した。さらに、遺伝子治療は、限局性および多発性の両方の症状を伴う３つの異なるＢＥＳＴ１遺伝子型で成功し、処置効果の長期的な持続性を確認した。分子レベルでは、イヌならびにヒトのＢＥＳＴ１導入遺伝子が、ＲＰＥ－ＰＲ複合体の並置を修正し、この重要な界面の細胞構築を回復する能力を確認した。この研究は、常染色体劣性疾患の初期ならびにより進行した段階がこの治療でアプローチするのが賢明であることを示唆している。常染色体Ｂｅｓｔ１変異を有する患者に由来するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来ＲＰＥモデルを利用したさらなる研究は、遺伝子増強アプローチがＢＶＭＤ患者にも有益であるかどうかを決定するであろう。
【0105】
成功した遺伝子増強治療の臨床トランスレーションを容易にするために、それらの網膜全体の疾患への洞察を得るためにＡＲＢ患者を研究した。すべてではないが、ほとんどの以前の説明と一致して、ＡＲＢ患者の網膜疾患は黄斑をはるかに超えて中末梢（midperiphery）にまで拡大した。正面および断面のイメージングと桿体および錐体機能の網膜部位マッピングは、これまで強調されていなかった特徴である、中央周辺の網膜における疾患から健康への明確な移行の存在を示した。疾患領域内では、網膜構造の重度の異常が桿体機能の重度の喪失と関連していた；意外にも、錐体機能は比較的保持されていた。中心網膜内の桿体機能障害はまた、レチノイドサイクルの極端な遅延と関連していたが、より健康な周辺部は、レチノイドのほぼ正常な再循環を示した。光受容体色素に１１－ｃｉｓ－網膜発色団を提供する少なくとも２のレチノイドサイクルがある。標準的なレチノイドサイクルはＲＰＥで機能し、桿体および錐体ＰＲの発色団を生成する。他方、網膜レチノイドサイクルは、錐体の特定の使用のために網膜内の発色団を再生すると考えられている。ベスト病における異常なＲＰＥ－ＰＲ界面は、標準的なＲＰＥレチノイドサイクルからの発色団の送達に影響を与える可能性が最も高いであろう；網膜レチノイドサイクルは比較的影響を受けない可能性があり、したがって錐体機能のより大きな保持を説明する。
【0106】
要約すると、本明細書に開示されているように、ＲＰＥ－ＰＲ界面でのベストロフィノパチーの病態生理学への新しい分子の寄与を驚くべきことに明らかにした。疾患の最も初期の発現を発見した―露光によって増強されたびまん性微小剥離は、in vivoイメージングによって容易に検出できた。ＡＡＶを介したＢＥＳＴ１増強遺伝子治療は、全体的に明らかな病変および微小剥離の両方を逆転させ、ＲＰＥ－ＰＲ界面の細胞構築を回復させた。ＡＲＢ患者の評価は、ＰＲ変性から予想されるものを超える網膜部位分布および構造的および機能的欠陥の特性を示した。かかる視覚機能障害は、ベストロフィノパチーを発症する患者へのＢＥＳＴ１遺伝子増強治療の適用の成功により改善することが期待され得る。
【0107】
例２
例２のベクター技術は、ＲＮＡ干渉を使用して、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡ（変異コピーおよび正常コピーの両方）の発現を抑制するように設計した。これらのベクターは、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡを正常なＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡに同時に置き換えて、正常なタンパク質のみを生成する。当該技術は、アデノ随伴ウイルスを使用して、ＢＥＳＴ１遺伝子のイントロンのないコピーに加えて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の生成につながる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の遺伝子を送達する。ＢＥＳＴ１遺伝子は、そのリーディングフレームにサイレント変異があるため、ｓｉＲＮＡに対して耐性がある。２つのｓｈＲＮＡ、したがって２つの改変したヒトＢＥＳＴ１遺伝子を設計した。両方のＢＥＳＴ１遺伝子は、ヒトＶＭＤ２プロモーターの６２３ｂｐフラグメントによって駆動される。ＢＥＳＴ１ ｃＤＮＡの前には合成イントロンがあり、その後にポリアデニル化配列があり、どちらもＳＶ４０ウイルスに由来する。１つのケースでは、ｓｈＲＮＡ０５はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）Ｈ１プロモーターによって駆動され、他方のケースでは、ｓｈＲＮＡ７４４はｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動される。６つのチミジンの配列は、各ｓｈＲＮＡの終止配列として機能する。これらの活性なｓｈＲＮＡを特定するために、９つの潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列をスクリーニングした。
例２のベクター技術は、ＲＮＡ干渉を使用して、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡ（変異コピーおよび正常コピーの両方）の発現を抑制するように設計した。これらのベクターは、内因性ＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡを正常なＢＥＳＴ１ ｍＲＮＡに同時に置き換えて、正常なタンパク質のみを生成する。当該技術は、アデノ随伴ウイルスを使用して、ＢＥＳＴ１遺伝子のイントロンのないコピーに加えて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の生成につながる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の遺伝子を送達する。ＢＥＳＴ１遺伝子は、そのリーディングフレームにサイレント変異があるため、ｓｉＲＮＡに対して耐性がある。２つのｓｈＲＮＡ、したがって２つの改変したヒトＢＥＳＴ１遺伝子を設計した。両方のＢＥＳＴ１遺伝子は、ヒトＶＭＤ２プロモーターの６２３ｂｐフラグメントによって駆動される。ＢＥＳＴ１ ｃＤＮＡの前には合成イントロンがあり、その後にポリアデニル化配列があり、どちらもＳＶ４０ウイルスに由来する。１つのケースでは、ｓｈＲＮＡ０５はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）Ｈ１プロモーターによって駆動され、他方のケースでは、ｓｈＲＮＡ７４４はｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動される。６つのチミジンの配列は、各ｓｈＲＮＡの終止配列として機能する。これらの活性なｓｈＲＮＡを特定するために、９つの潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列をスクリーニングした。
【0108】
ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子配列は以下のとおりである。
ｓｈＲＮＡ０５およびｓｈＲＮＡ７４４をコードする異種核酸、ならびに開示されたｒＡＡＶ粒子を生成するために使用される脱標的化配列（例として、配列番号１０または１１の１つ）を含むｈＢＥＳＴ１遺伝子を含む例示のＡＡＶベクターのマップをそれぞれ図１５および１６に示す。両方の配列はＶＭＤ２プロモーターによって駆動される。
【化5】
【0109】
いくつかの態様において、開示は、配列番号２のヌクレオチド配列に加えて、この配列の最初のシトシンの直前の追加のヌクレオチドを含むセンス鎖を含むｓｈＲＮＡ０５センス鎖を提供する。ある態様において、この追加のヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）を含む。
いくつかの態様において、開示は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含むｓｈＲＮＡ０５を提供する。
いくつかの態様において、開示は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含むｓｈＲＮＡ０５を提供する。
【0110】
ｐｏｌ ＩＩＩ Ｈ１プロモーター、ｓｈＲＮＡ０５、および終止配列をコードするベクターの領域に対応する例示の遺伝子配列は、以下の通りである：
（配列番号２０）。この配列は、スクリーニングを容易にし、ｓｈＲＮＡ０５の開始部位がＨ１プロモーターＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡ）の２５ヌクレオチド下流に位置することを保証するためのＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ部位（ｇｇａｔｃｃ）をさらに含む。したがって、いくつかの態様において、この配列（および／またはその相補体）を含む核酸によってコードされるｓｈＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ０５）は、宿主細胞において転写される（例として、対象において、例えば、ヒト対象において、ベクターで処置される）。いくつかの態様において、２以上の異なるｓｈＲＮＡ（例として、異なる開始部位および／または終止部位を有し、例えば、１つまたは２つの追加のまたはより少ないヌクレオチドによってｓｈＲＮＡ０５とは異なる）が、宿主細胞において転写される。
【化6】
【0111】
図１７は、ＶＭＤ２プロモーターが細胞培養においてうまく機能することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）またはＶＭＤ２プロモーターを使用してＧＦＰまたはＢｅｓｔ１を発現するプラスミドでトランスフェクトした。タンパク質ライセートをポリアクリルアミドゲルで分離し、ベストロフィン（Ｂｅｓｔ１）の発現をウェスタンブロットで検出し、ベータチューブリンの発現に対して正規化して、ゲルの負荷が均一であることを示した。図１８Ａおよび１８Ｂは、Ｂｅｓｔ１特異的ｓｉＲＮＡが機能的であることを示す。ＢＥＳＴ１を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔのトランスフェクションは、ベストロフィン（Ｂｅｓｔ１）タンパク質の７５％の減少をもたらした。２０ｎＭ ｓｉＲＮＡを使用し、トランスフェクションの４８時間後に細胞を分析した。ウェスタンブロット（図１８Ａ）、ＢＥＳＴ１のノックダウンを、Ｂｅｓｔ１とチューブリンとの間のバンド強度の標準化によって比較した（Ｂｅｓｔ１／チューブリン）（図１８Ｂ）。図１９Ａおよび１９Ｂは、Ｂｅｓｔ１ ｓｈＲＮＡが活性であることを示す：ＨＥＫ２９３Ｔ－ＢＥＳＴ１細胞に、４μｇの示されたプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。ＢＥＳＴ１の発現をウェスタンブロットによって決定した（図１９Ａ）。ＢＥＳＴ１のノックダウンを、Ｂｅｓｔ１とチューブリンとの間のバンド強度の標準化によって比較した（Ｂｅｓｔ１／チューブリン）（図１９Ｂ）。図２０は、Ｂｅｓｔ１の脱標的化を示す。サイレント変異（コドンの３番目の位置の塩基変化）を使用して、Ｂｅｓｔ１ ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ標的部位を除去した。開示されている例は、ｓｈＲＮＡ７４４用である。配列番号１５～１７は、上から下への配列に対応する。
【0112】
材料および方法
イヌＢＥＳＴ１モデルおよびin vivo網膜イメージング。
ホモ接合型（ｃ．７３Ｃ＞Ｔ）（ｐ．Ｒ２５＊／Ｒ２５＊）または（ｃ．１３８８ｄｅｌＣ）（ｐ．Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ）またはｃＢＥＳＴ１（ＧＢ＊ＮＭ＿００１０９７５４５）の二アレル（ｃ．７３Ｃ＞Ｔ／１３８８ｄｅｌＣ）（ｐ．Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）変異のいずれかを保有する両性（１２Ｍおよび６Ｆ）のｃＢｅｓｔ変異イヌ（ｎ＝１８）が含まれていた。マルチパネルの図に注釈を付けやすくするために、３つの遺伝子型をそれぞれｃｍｒ１、ｃｍｒ３、およびｃｍｒ１／ｃｍｒ３と呼ぶ。当該研究は、対照の交雑種のイヌ（ｎ＝１２；７Ｍおよび５Ｆ）と比較して行った（表１）。すべての動物は、網膜疾患研究施設（ＲＤＳＦ）で飼育および維持した。研究は、ＮＩＨの実験動物の管理および使用に関するガイドの推奨事項に厳密にしたがって、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科学研究協会の声明に準拠して行った。プロトコルは、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された（ＩＡＣＵＣ番号８０４９５６および８０３４２２）。正面および網膜の断面イメージングは、前述のように全身麻酔下でイヌを使用して行った。
イヌＢＥＳＴ１モデルおよびin vivo網膜イメージング。
ホモ接合型（ｃ．７３Ｃ＞Ｔ）（ｐ．Ｒ２５＊／Ｒ２５＊）または（ｃ．１３８８ｄｅｌＣ）（ｐ．Ｐ４６３ｆｓ／Ｐ４６３ｆｓ）またはｃＢＥＳＴ１（ＧＢ＊ＮＭ＿００１０９７５４５）の二アレル（ｃ．７３Ｃ＞Ｔ／１３８８ｄｅｌＣ）（ｐ．Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）変異のいずれかを保有する両性（１２Ｍおよび６Ｆ）のｃＢｅｓｔ変異イヌ（ｎ＝１８）が含まれていた。マルチパネルの図に注釈を付けやすくするために、３つの遺伝子型をそれぞれｃｍｒ１、ｃｍｒ３、およびｃｍｒ１／ｃｍｒ３と呼ぶ。当該研究は、対照の交雑種のイヌ（ｎ＝１２；７Ｍおよび５Ｆ）と比較して行った（表１）。すべての動物は、網膜疾患研究施設（ＲＤＳＦ）で飼育および維持した。研究は、ＮＩＨの実験動物の管理および使用に関するガイドの推奨事項に厳密にしたがって、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科学研究協会の声明に準拠して行った。プロトコルは、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された（ＩＡＣＵＣ番号８０４９５６および８０３４２２）。正面および網膜の断面イメージングは、前述のように全身麻酔下でイヌを使用して行った。
【0113】
ヒト対象。
明順応および２色暗順応機能は、中心視野全体で２°間隔（水平および垂直経線に沿って中心６０°）で、および視野全体で１２°間隔で測定した。暗順応条件下での光受容体の媒介は、５００ｎｍと６５０ｎｍとの刺激間の感受性の差異によって決定した。暗順応動態は、ＬＥＤベースの暗順応計（Roland Consult）および臨床短波長自家蛍光イメージングデバイス（２５％レーザー出力；Spectralis HRA；Heidelberg Engineering）からの短時間（３０秒）の中程度の露光を使用して、これまでに記載された技法（９２～９４）と同様に評価した。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を使用して、網膜全体の層状構造を分析した。網膜断面は、スペクトルドメイン（ＳＤ）ＯＣＴシステム（RTVue-100；Optovue）で記録した。取得後のデータ分析は、カスタムプログラム（MATLAB 7.5；MathWorks）で行った。記録および分析技法はこれまでに記載されている（３０、３１、９４）。網膜の特徴を特定するために、縦反射プロファイル（ＬＲＰ）を使用した。共焦点走査型レーザー検眼鏡（Spectralis HRA；Heidelberg Engineering）を使用して、これまでに記載されたように（９５）、正面画像を記録し、短波長低照度自家蛍光イメージング（ＳＷ－ＲＡＦＩ）でＲＰＥの健康状態を推定した。すべての画像は高速モード（３０°×３０°の四角形のフィールドまたは５０°の円形のフィールド）で取得した。
明順応および２色暗順応機能は、中心視野全体で２°間隔（水平および垂直経線に沿って中心６０°）で、および視野全体で１２°間隔で測定した。暗順応条件下での光受容体の媒介は、５００ｎｍと６５０ｎｍとの刺激間の感受性の差異によって決定した。暗順応動態は、ＬＥＤベースの暗順応計（Roland Consult）および臨床短波長自家蛍光イメージングデバイス（２５％レーザー出力；Spectralis HRA；Heidelberg Engineering）からの短時間（３０秒）の中程度の露光を使用して、これまでに記載された技法（９２～９４）と同様に評価した。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を使用して、網膜全体の層状構造を分析した。網膜断面は、スペクトルドメイン（ＳＤ）ＯＣＴシステム（RTVue-100；Optovue）で記録した。取得後のデータ分析は、カスタムプログラム（MATLAB 7.5；MathWorks）で行った。記録および分析技法はこれまでに記載されている（３０、３１、９４）。網膜の特徴を特定するために、縦反射プロファイル（ＬＲＰ）を使用した。共焦点走査型レーザー検眼鏡（Spectralis HRA；Heidelberg Engineering）を使用して、これまでに記載されたように（９５）、正面画像を記録し、短波長低照度自家蛍光イメージング（ＳＷ－ＲＡＦＩ）でＲＰＥの健康状態を推定した。すべての画像は高速モード（３０°×３０°の四角形のフィールドまたは５０°の円形のフィールド）で取得した。
【0114】
イヌＢＥＳＴ１モデルおよびin vivo網膜イメージング。
視神経、網膜血管、注射小疱の境界、網膜切開部位、および他の局所的な変化などの眼底の特徴を描写するために、３０°および５５°の直径のレンズを使用して、近赤外照明（８２０ｎｍ）による反射率の重複する正面画像を取得した（Spectralis HRA + OCT）。カスタムプログラム（MATLAB 7.5；MathWorks）を使用して、個々の写真を網膜全体のパノラマにデジタルステッチした。短波長の自家蛍光および反射率のイメージングを使用して、タペータムおよび色素性ＲＰＥの境界の輪郭を描いた。スペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）は、網膜の広い領域にわたってオーバーラップ（３０°×２５°）ラスタースキャンを使用して行った。ＯＣＴデータの取得後処理は、カスタムプログラム（MATLAB 7.5）を使用して行った。網膜全体の組織分布的分析では、各ラスタースキャンの統合後方散乱強度を使用して、近赤外反射（ＮＩＲ）画像によって形成された網膜全体のモザイクに表示される網膜の特徴に対する正確な位置および方向を配置した。登録されたすべてのラスタースキャンを形成する個々のＬＲＰは、視神経を中心とする直交座標系の規則的な間隔のビン（１°×１°）に割り当てた；各ビンのＬＲＰを調整し、平均化した。ＯＰＬ、ＥＬＭ、ＩＳ／ＯＳ、およびＲＰＥ／Ｔに対応する網膜内のピークおよび境界は、各ＬＲＰに沿った後方散乱シグナルの強度および勾配の両方の情報を使用してセグメント化した。ＯＮＬの厚さの組織分布的マップはＯＰＬからＥＬＭまでの距離から生成し、ＩＳ／ＯＳからＲＰＥ／Ｔの厚さのマップはこれらのピーク間の距離から生成した。すべての組織分布的結果について、血管、視神経乳頭、小疱、タペータム境界、および中心窩様領域の位置（２４）を参照用に重ね合わせた。まず、ＷＴイヌのマップを視神経乳頭の中心に登録し、回転させて中心窩様領域を一致させ、平均ＷＴ組織分布のマップを導出した。ｃＢｅｓｔ変異イヌの中心窩様領域は、視神経乳頭、主要な上方血管、およびタペータムの境界のアライメントによって変異体の眼にＷＴテンプレートを重ね合わせることによって決定した。次に、ｃＢＥＳＴ１変異マップを視神経の中心および推定された中心窩様領域によってＷＴマップに登録し、差異マップを導出した。差異マップは、各眼の処置小疱の内外でサンプリングした。光への曝露と網膜外側構造の変化との間の関係を、２つのアプローチによって評価した。眼のサブセットでは、断面ＯＣＴイメージングを各実験セッションの初期に行い、最初に明るい短波長光による自家蛍光イメージングを行い、続いてさらにＯＣＴイメージングを行った。かかるセッションの初期に取得したＯＣＴ記録は、正確な露光を定量化することはできなかったが、遅く取得した記録と比較して、より少ない光に曝露された網膜からのものであると考えられた。８つの眼の別のサブセットでは、ＯＣＴ記録は、終夜の暗順応後に行い、ｃＳＬＯからの短波長露光の短い間隔に続いて暗い部屋で連続的に行った。３つの眼では、益々大きくなる５つの露光を使用した：Ｌ１：レーザー、２０％；期間、６０秒；Ｌ２：レーザー、２５％；期間、３０秒；Ｌ３：レーザー、５０％；期間、３０秒；Ｌ４：レーザー、１００％；期間、３０秒；Ｌ５：レーザー、１００％；期間、３００秒。３つの目では、Ｌ４およびＬ５のみを使用した。２つの追加の目では、Ｌ５のみを使用して、２４時間にわたって光を介した微小剥離の回復を追跡した。標準的（１００％）レーザー設定は、波長４８８ｎｍで３３０μＷ・ｃｍ－２のヒト網膜放射照度に対応すると推定されている（９８）。両方のアプローチにおいて、分析用に選択された領域は、研究開始前のｃＳＬＯによる眼底の近赤外イメージングに基づいており、臨床的に明らかなマクロ剥離が位置付けられる領域を除外した。
視神経、網膜血管、注射小疱の境界、網膜切開部位、および他の局所的な変化などの眼底の特徴を描写するために、３０°および５５°の直径のレンズを使用して、近赤外照明（８２０ｎｍ）による反射率の重複する正面画像を取得した（Spectralis HRA + OCT）。カスタムプログラム（MATLAB 7.5；MathWorks）を使用して、個々の写真を網膜全体のパノラマにデジタルステッチした。短波長の自家蛍光および反射率のイメージングを使用して、タペータムおよび色素性ＲＰＥの境界の輪郭を描いた。スペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）は、網膜の広い領域にわたってオーバーラップ（３０°×２５°）ラスタースキャンを使用して行った。ＯＣＴデータの取得後処理は、カスタムプログラム（MATLAB 7.5）を使用して行った。網膜全体の組織分布的分析では、各ラスタースキャンの統合後方散乱強度を使用して、近赤外反射（ＮＩＲ）画像によって形成された網膜全体のモザイクに表示される網膜の特徴に対する正確な位置および方向を配置した。登録されたすべてのラスタースキャンを形成する個々のＬＲＰは、視神経を中心とする直交座標系の規則的な間隔のビン（１°×１°）に割り当てた；各ビンのＬＲＰを調整し、平均化した。ＯＰＬ、ＥＬＭ、ＩＳ／ＯＳ、およびＲＰＥ／Ｔに対応する網膜内のピークおよび境界は、各ＬＲＰに沿った後方散乱シグナルの強度および勾配の両方の情報を使用してセグメント化した。ＯＮＬの厚さの組織分布的マップはＯＰＬからＥＬＭまでの距離から生成し、ＩＳ／ＯＳからＲＰＥ／Ｔの厚さのマップはこれらのピーク間の距離から生成した。すべての組織分布的結果について、血管、視神経乳頭、小疱、タペータム境界、および中心窩様領域の位置（２４）を参照用に重ね合わせた。まず、ＷＴイヌのマップを視神経乳頭の中心に登録し、回転させて中心窩様領域を一致させ、平均ＷＴ組織分布のマップを導出した。ｃＢｅｓｔ変異イヌの中心窩様領域は、視神経乳頭、主要な上方血管、およびタペータムの境界のアライメントによって変異体の眼にＷＴテンプレートを重ね合わせることによって決定した。次に、ｃＢＥＳＴ１変異マップを視神経の中心および推定された中心窩様領域によってＷＴマップに登録し、差異マップを導出した。差異マップは、各眼の処置小疱の内外でサンプリングした。光への曝露と網膜外側構造の変化との間の関係を、２つのアプローチによって評価した。眼のサブセットでは、断面ＯＣＴイメージングを各実験セッションの初期に行い、最初に明るい短波長光による自家蛍光イメージングを行い、続いてさらにＯＣＴイメージングを行った。かかるセッションの初期に取得したＯＣＴ記録は、正確な露光を定量化することはできなかったが、遅く取得した記録と比較して、より少ない光に曝露された網膜からのものであると考えられた。８つの眼の別のサブセットでは、ＯＣＴ記録は、終夜の暗順応後に行い、ｃＳＬＯからの短波長露光の短い間隔に続いて暗い部屋で連続的に行った。３つの眼では、益々大きくなる５つの露光を使用した：Ｌ１：レーザー、２０％；期間、６０秒；Ｌ２：レーザー、２５％；期間、３０秒；Ｌ３：レーザー、５０％；期間、３０秒；Ｌ４：レーザー、１００％；期間、３０秒；Ｌ５：レーザー、１００％；期間、３００秒。３つの目では、Ｌ４およびＬ５のみを使用した。２つの追加の目では、Ｌ５のみを使用して、２４時間にわたって光を介した微小剥離の回復を追跡した。標準的（１００％）レーザー設定は、波長４８８ｎｍで３３０μＷ・ｃｍ－２のヒト網膜放射照度に対応すると推定されている（９８）。両方のアプローチにおいて、分析用に選択された領域は、研究開始前のｃＳＬＯによる眼底の近赤外イメージングに基づいており、臨床的に明らかなマクロ剥離が位置付けられる領域を除外した。
【0115】
網膜下注射および術後手順。
ヒトＶＭＤ２プロモーターの制御下でｃＢＥＳＴ１またはｈＢＥＳＴ１導入遺伝子のいずれかを送達する組換えＡＡＶ２／２の網膜下注射（４６）を、これまでに公開された手順（４６、８２、９７）にしたがって全身麻酔下で行った。ベクター作製および検証については、これまでに詳しく記載されている（４６）。ウイルスベクター溶液の５０～１８０μＬの範囲の注射量（力価範囲０．１～５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）（表１）を、硝子体切除を伴わない経硝子体アプローチを介した手術顕微鏡による直接視覚化下で、カスタム改変されたRetinaJect網膜下注射器（SurModics）（９７）を使用して網膜下に送達した。眼圧の上昇を防ぐために、注射直後に前眼房穿刺を行った。注射直後に、網膜下小疱の形成を眼底写真（RetCam Shuttle; Clarity Medical Systems）によって記録した。すべての場合において、外科的小疱は平らになり、網膜は２４～４８時間ｐ．ｉ．以内に再付着した。生体顕微鏡検査、間接検眼鏡検査、および眼底写真撮影を含む眼科検査は、注射～エンドポイント評価の時間間隔を通じて定期的に（２４時間、４８時間、および５日間ｐ．ｉ．、次いで最初の２カ月間は毎週、これに続きその後は毎月の眼科検査）行った。術後管理はこれまでに記載されたように行った（４６）。
ヒトＶＭＤ２プロモーターの制御下でｃＢＥＳＴ１またはｈＢＥＳＴ１導入遺伝子のいずれかを送達する組換えＡＡＶ２／２の網膜下注射（４６）を、これまでに公開された手順（４６、８２、９７）にしたがって全身麻酔下で行った。ベクター作製および検証については、これまでに詳しく記載されている（４６）。ウイルスベクター溶液の５０～１８０μＬの範囲の注射量（力価範囲０．１～５×１０１１ｖｇ／ｍＬ）（表１）を、硝子体切除を伴わない経硝子体アプローチを介した手術顕微鏡による直接視覚化下で、カスタム改変されたRetinaJect網膜下注射器（SurModics）（９７）を使用して網膜下に送達した。眼圧の上昇を防ぐために、注射直後に前眼房穿刺を行った。注射直後に、網膜下小疱の形成を眼底写真（RetCam Shuttle; Clarity Medical Systems）によって記録した。すべての場合において、外科的小疱は平らになり、網膜は２４～４８時間ｐ．ｉ．以内に再付着した。生体顕微鏡検査、間接検眼鏡検査、および眼底写真撮影を含む眼科検査は、注射～エンドポイント評価の時間間隔を通じて定期的に（２４時間、４８時間、および５日間ｐ．ｉ．、次いで最初の２カ月間は毎週、これに続きその後は毎月の眼科検査）行った。術後管理はこれまでに記載されたように行った（４６）。
【0116】
組織学的および免疫組織化学的評価。
ex vivo分析のための眼組織は、これまでに記載されたように収集した（２４、９９）。動物福祉を改善し、不快感を最小限に抑えるためにあらゆる努力をした。すべてのex vivo評価で、ｃＢｅｓｔおよび対照（ＷＴ）の眼は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、最適な切断温度の媒体に包埋し、これまでに報告されたように処理した（９９）。組織学的評価は、標準的なヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して行い、すべての免疫組織化学的実験は、確立されたプロトコル（４６、９９）にしたがって厚さ１０μｍの凍結切片で行った。簡単に説明すると、網膜凍結切片を１×ＰＢＳ／０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、室温で１時間ブロッキングし、一次抗体とともに終夜インキュベートした（表２）。多色標識では、一次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ファロイジン（Thermo Fisher Scientific）またはＰＮＡ－ＡＦ６４７（L32460；Molecular Probes）と組み合わせ、これに続き、対応する二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）と１時間インキュベートした。スライドを落射蛍光または透過型光学顕微鏡（Axioplan；Carl Zeiss Meditec）で検査し、デジタル画像をSpot 4.0カメラ（Diagnostic Instruments）で収集した。
ex vivo分析のための眼組織は、これまでに記載されたように収集した（２４、９９）。動物福祉を改善し、不快感を最小限に抑えるためにあらゆる努力をした。すべてのex vivo評価で、ｃＢｅｓｔおよび対照（ＷＴ）の眼は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、最適な切断温度の媒体に包埋し、これまでに報告されたように処理した（９９）。組織学的評価は、標準的なヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して行い、すべての免疫組織化学的実験は、確立されたプロトコル（４６、９９）にしたがって厚さ１０μｍの凍結切片で行った。簡単に説明すると、網膜凍結切片を１×ＰＢＳ／０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、室温で１時間ブロッキングし、一次抗体とともに終夜インキュベートした（表２）。多色標識では、一次抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ファロイジン（Thermo Fisher Scientific）またはＰＮＡ－ＡＦ６４７（L32460；Molecular Probes）と組み合わせ、これに続き、対応する二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）と１時間インキュベートした。スライドを落射蛍光または透過型光学顕微鏡（Axioplan；Carl Zeiss Meditec）で検査し、デジタル画像をSpot 4.0カメラ（Diagnostic Instruments）で収集した。
【表2】
【0117】
共焦点顕微鏡および画像分析。
共焦点画像は、ＴＣＳ－ＳＰ５共焦点顕微鏡システム（Leica Microsystems）またはＡ１Ｒレーザー走査型共焦点顕微鏡（Nikon Instruments）で取得した。錐体関連ＭＶ（錐体－ＭＶ）のカウントを取得するために、各関心領域（ＲＯＩ）が１５５μｍの長さの２つの隣接するフィールドを、６週齢のｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）および同齢のＷＴ対照からの両眼の１の網膜象限（側頭、上方、下方、および鼻）当たり１０の網膜切片（ｎ＝８０ＲＯＩ／眼）において視神経乳頭から４ｍｍで画像化した。画像スタックは０．２５μｍのＺステップで取得し、Huygensデコンボリューションソフトウェアバージョン１７．０４（Scientific Volume Imaging）でデコンボリューションした。デコンボリューションしたすべての画像を、Leica LAS X 3Dレンダリングモジュールでレンダリングし、錐体－ＭＶを手動でカウントした。錐体－ＭＶおよび桿体－ＭＶの両方の長さは、最大投影画像からLeica LAS Xソフトウェア内で評価した。データをMicrosoft Excelで分析し、Prismソフトウェアバージョン７（GraphPad）を使用して定量化した。
共焦点画像は、ＴＣＳ－ＳＰ５共焦点顕微鏡システム（Leica Microsystems）またはＡ１Ｒレーザー走査型共焦点顕微鏡（Nikon Instruments）で取得した。錐体関連ＭＶ（錐体－ＭＶ）のカウントを取得するために、各関心領域（ＲＯＩ）が１５５μｍの長さの２つの隣接するフィールドを、６週齢のｃＢｅｓｔ（Ｒ２５＊／Ｐ４６３ｆｓ）および同齢のＷＴ対照からの両眼の１の網膜象限（側頭、上方、下方、および鼻）当たり１０の網膜切片（ｎ＝８０ＲＯＩ／眼）において視神経乳頭から４ｍｍで画像化した。画像スタックは０．２５μｍのＺステップで取得し、Huygensデコンボリューションソフトウェアバージョン１７．０４（Scientific Volume Imaging）でデコンボリューションした。デコンボリューションしたすべての画像を、Leica LAS X 3Dレンダリングモジュールでレンダリングし、錐体－ＭＶを手動でカウントした。錐体－ＭＶおよび桿体－ＭＶの両方の長さは、最大投影画像からLeica LAS Xソフトウェア内で評価した。データをMicrosoft Excelで分析し、Prismソフトウェアバージョン７（GraphPad）を使用して定量化した。
【0118】
参考文献
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【0119】
他の態様
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替の特徴によって置換ることができる。よって、特に明記しない限り、開示される各特徴は、同等または同様の特徴の一般的なシリーズの例にすぎない。
上記の記載から、当業者は、本開示の必須の特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な利用および条件に適合させるために開示の様々な変更および改変を行うことができる。よって、他の態様もまた請求項内にある。
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替の特徴によって置換ることができる。よって、特に明記しない限り、開示される各特徴は、同等または同様の特徴の一般的なシリーズの例にすぎない。
上記の記載から、当業者は、本開示の必須の特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な利用および条件に適合させるために開示の様々な変更および改変を行うことができる。よって、他の態様もまた請求項内にある。
【0120】
均等物
いくつかの発明の態様が、本明細書に記載され、説明されているが、当業者は、本明細書に記載の、機能を実施するための、および／または、結果および／または１以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に把握するであろうし、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および立体配置は、例示的であることを意味すること、および、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または立体配置は、発明の教示が使用される特定の出願（単数または複数）に依存するであろうということを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識するか、または、ルーチンな実験法を使用するだけでこれを確かめることができるであろう。したがって、上記の態様は、一例としてのみ提示されること、および添付の請求項およびそれに対する均等物の範囲内で、発明の態様は、具体的に記載されおよび特許請求される以外に実施され得ることが理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書に記載の、各々の個々の特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法に関する。加えて、かかる特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法の２以上の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
いくつかの発明の態様が、本明細書に記載され、説明されているが、当業者は、本明細書に記載の、機能を実施するための、および／または、結果および／または１以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に把握するであろうし、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および立体配置は、例示的であることを意味すること、および、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または立体配置は、発明の教示が使用される特定の出願（単数または複数）に依存するであろうということを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識するか、または、ルーチンな実験法を使用するだけでこれを確かめることができるであろう。したがって、上記の態様は、一例としてのみ提示されること、および添付の請求項およびそれに対する均等物の範囲内で、発明の態様は、具体的に記載されおよび特許請求される以外に実施され得ることが理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書に記載の、各々の個々の特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法に関する。加えて、かかる特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法の２以上の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【0121】
すべての定義は、本明細書に定義され、使用される場合、辞書の定義、参照によって組み込まれる文献における定義、および／または定義される用語の通常の意味に優先することが理解されるべきである。
本明細書に開示の、すべての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して、参照により組み込まれ、いくつかのケースにおいて、文献の全体を包含し得る。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書および請求項に使用されるとき、それとは反対であることが明確に示されない限り、「少なくとも１の」を意味すると理解されるべきである。
本明細書に開示の、すべての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して、参照により組み込まれ、いくつかのケースにおいて、文献の全体を包含し得る。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書および請求項に使用されるとき、それとは反対であることが明確に示されない限り、「少なくとも１の」を意味すると理解されるべきである。
【0122】
句「および／または」は、本明細書および請求項に使用されるとき、そのように結合された要素、すなわち、いくつかのケースにおいて結合的に存在し、他のケースにおいて分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」とともに列挙される複数の要素は、同じ様式（すなわち、そのように結合された要素の「１以上」）で解釈されるべきである。具体的に同定されるこれらの要素に関連するか関連しないかに関わらず、「および／または」節によって具体的に同定される要素以外の、他の要素は任意に存在してもよい。よって、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」への参照は、「含む(comprising)」などのオープンエンドの言語と併せて使用されるとき、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様において、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）；もう１つの態様において、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）；等々を指し得る。
【0123】
本明細書および請求項に使用されるとき、「または」は、上に定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとし、すなわち、要素の数またはリストのうち、少なくとも１を含むが、１より多いものも含み、任意に、追加の列挙されていない項目を含む。「のうち１つのみ」または「のうち正確に１つ」、または、請求項において使用されるときの「からなる」などの、それとは反対であることが明確に示される用語のみが、要素の数またはリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般に、用語「または」は、本明細書に使用されるとき、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうち正確に１つ」などの、排他性の用語が先行するときにのみ、排他的代替（すなわち、「一方または他方」であるが両方ではない）を示すと解釈されるものとする。「から本質的になる」は、請求項において使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【0124】
本明細書および請求項に使用されるとき、句「少なくとも１の」は、１以上の要素のリストを参照して、要素のリスト中の要素の任意の１以上から選択される少なくとも１の要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素およびすべての要素の少なくとも１を含む必要はなく、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に同定されている要素に関連するかしないかに関わらず、句「少なくとも１」が参照する要素のリスト内に具体的に同定される要素以外の要素が任意に存在してもよいことを可能にする。よって、非限定例として、「ＡおよびＢの少なくとも１」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１」）は、一態様において、少なくとも１のＡ（任意に１より多いＡを含む）、Ｂが存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様において、少なくとも１のＢ（任意に１より多いＢを含む）、Ａが存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）；もう１つの態様において、少なくとも１のＡ（任意に１より多いＡを含む）、および少なくとも１のＢ（任意に１より多いＢを含む）（および任意に他の要素を含む）；等々を指し得る。
【0125】
それとは反対であることが明確に示されない限り、１より多いステップまたは行為を含む、本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が記載される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
請求項において、および上記明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保有する（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、「保持する（holding）」、「から構成される（composed of）」等などのすべての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、これを含むが、これに限定されないことを意味することが理解されるべきである。移行句「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、合衆国特許庁特許審査便覧セクション２１１１．０３に表されるように、それぞれ、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例として、「含む」）を使用するこの文献において記載される態様はまた、代替の態様において、オープンエンドの移行句によって記載される特徴「からなる」および「から本質的になる」として企図されることが理解されるべきである。例えば、開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、開示はまた、代替の態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」を企図する。
請求項において、および上記明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保有する（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、「保持する（holding）」、「から構成される（composed of）」等などのすべての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、これを含むが、これに限定されないことを意味することが理解されるべきである。移行句「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、合衆国特許庁特許審査便覧セクション２１１１．０３に表されるように、それぞれ、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例として、「含む」）を使用するこの文献において記載される態様はまた、代替の態様において、オープンエンドの移行句によって記載される特徴「からなる」および「から本質的になる」として企図されることが理解されるべきである。例えば、開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、開示はまた、代替の態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」を企図する。
【図1A-D】
【図2A-C】
【図2D-F】
【図3A-B】
【図3C-D】
【図4A-B】
【図4C-F】
【図5A-C】
【図5D-G】
【図6A-D】
【図7】
【図8A-B】
【図9A-F】
【図10】
【図11A-D】
【図12A-B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A-B】
【図19A-B】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】