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特開2024-119848サイズ排除クロマトグラフィー及び多角度光散乱技術を使用した遺伝子療法ウイルス粒子のキャラクタリゼーション
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024119848
(43)【公開日】2024-09-03
(54)【発明の名称】サイズ排除クロマトグラフィー及び多角度光散乱技術を使用した遺伝子療法ウイルス粒子のキャラクタリゼーション
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20240827BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240827BHJP
C12N 7/00 20060101ALN20240827BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
C12Q1/06
C12N7/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024083411
(22)【出願日】2024-05-22
(62)【分割の表示】P 2022519130の分割
【原出願日】2020-09-25
(31)【優先権主張番号】62/907,509
(32)【優先日】2019-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/043,571
(32)【優先日】2020-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】506136483
【氏名又は名称】バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バート ヴィカース
(72)【発明者】
【氏名】ベルギグ ジェフリー イェフダ
(72)【発明者】
【氏名】マッキントッシュ ニコル ルイーズ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ウイルス粒子の力価を推定し、ウイルス粒子の完全性を判定し、且つウイルス粒子においてカプシドに封入されたＤＮＡの量を推定するためにも有用な方法を提供する。
【解決手段】ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化する方法であって、カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；前記ＳＥＣ分析から、前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化することの少なくとも１つを決定するステップとを含む方法である。
【選択図】なし
【解決手段】ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化する方法であって、カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；前記ＳＥＣ分析から、前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化することの少なくとも１つを決定するステップとを含む方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化する方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ分析から、
前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、
前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び
前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ分析から、
前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、
前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び
前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
【請求項2】
前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ナノメートル（ｎｍ）及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてウイルス粒子を同定することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
カプシドの構造的完全性をモニタする方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
【請求項5】
前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてウイルス粒子を同定することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記カプシドの構造的完全性に基づいて、２５℃における時間長さの前記試料の貯蔵安定性を決定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び／又は定量化する方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物の試料をＳＥＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、
前記調製物中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記調製物中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、前記カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び／又は
前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物の試料をＳＥＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、
前記調製物中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記調製物中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、前記カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び／又は
前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
【請求項9】
前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてインタクトなｒＡＡＶ粒子を同定することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における前記画分による光吸収及び多角度光散乱分析（ＭＡＬＳ）を使用した前記画分による光散乱の強度の少なくとも１つを測定することとを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがない前記ウイルス粒子及び／又は前記カプシドのサイズ分布を動的光散乱分析によって決定することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
前記ウイルス粒子の前記サイズ分布は、前記ウイルス粒子の回転半径（Ｒｇ）及び／又は流体力学半径（Ｒｈ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を前記定量化することは、被包されたベクターゲノムがない前記ウイルス粒子及び／又は前記カプシドのＲｇ及びＲｈを動的光散乱分析によって決定することを含み、Ｒｇ対Ｒｈの比は、前記調製物中のウイルス粒子のパーセンテージ濃度と相関する、請求項８に記載の方法。
【請求項15】
カプシドの構造的完全性をモニタする方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
【請求項16】
前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてインタクトなｒＡＡＶ粒子を同定することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における前記画分による光吸収及びＭＡＬＳを使用した前記画分による光散乱の強度を測定することとの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
前記カプシドの構造的完全性に基づいて、２５℃における時間長さの前記試料の貯蔵安定性を決定することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項20】
前記定量化するステップ及び決定するステップは、検量線を必要としない、請求項８～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス粒子又はレンチウイルスウイルス粒子である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
ＳＥＣ又はＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析前に、前記試料又は複数の試料を分析超遠心法によって分析して、封入されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドを同定することを更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９０７，５０９号明細書及び２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５７１号明細書の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の全体が参照により本明細書に援用される。
本願は、２０１９年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９０７，５０９号明細書及び２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５７１号明細書の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
本開示は、アデノ随伴ウイルス及びレンチウイルス粒子などのウイルス粒子をキャラクタリゼーションするための、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は多角度光散乱技術と併せたサイズ排除クロマトグラフィーの使用に関する。開示される方法は、ウイルス粒子の力価を推定し、ウイルス粒子の完全性を判定し、且つウイルス粒子においてカプシドに封入されたデオキシリボ核酸の量を推定するためにも有用である。
【背景技術】
【0003】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及び他の一部の霊長類種に感染する小型で複製欠損性の非エンベロープ型動物ウイルスである。例えば、ＡＡＶがヒト疾患を引き起こさないと見られており、穏和な免疫応答を誘導すること、及びＡＡＶベクターが分裂細胞と静止細胞との両方に感染することができ、宿主細胞ゲノムに組み込まれないことを含む、ＡＡＶの幾つかの特徴により、このウイルスは、遺伝子療法による治療用タンパク質の送達に魅力的な媒体となっている。
【0004】
ＡＡＶは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する２５ｎｍのサイズ範囲のウイルス粒子ファミリーからなる。ＡＡＶは、非エンベロープ型ウイルスであり、約４．７キロベース（ｋｂ）長の一本鎖ＤＮＡゲノムを封入する３つの異なるウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）でできた正二十面体タンパク質外殻を備えている（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １４，８６－１００，２０１４）。比較的安全であり、且つ遺伝子発現が長期にわたるため、現在、非臨床段階及び臨床段階の両方で様々な遺伝子療法プログラムに種々の血清型の組換えＡＡＶベクターが用いられている。現在、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を用いる遺伝子療法試験は、世界中で１５０件が第Ｉ相、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相段階で進行中であり、それらのうち、第ＩＩＩ相臨床試験のものがあり、それらの６件は、米国で行われている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｅｄｉａ．ｃｏｍ／ｗｉｌｅｙ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）。長期の臨床使用向けにこうしたウイルス粒子を大規模に作成するため、幾つかの精製方法が開発されており、著しい成功を収めている（Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ６，６７８－６８６，２００２、Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０，１８３－１９２，２００７、Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０，１０１３－１０２１，２００９、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２５，２１２－２２２，２０１４、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ３，１６００２，２０１６）。しかしながら、プロセス開発全体及び最終的な精製後ＡＡＶ薬物製品に存在するあらゆる変数を考慮するロバストな分析論の開発は、依然として発展途上の分野である。
【0005】
組換えレンチウイルス（ｒＬＶ）は、アデノシンデアミナーゼ欠損症（Ｆａｒｉｎｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ，２０１４）、β－サラセミア、鎌状赤血球症（Ｎｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、重症複合型免疫不全症、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患（Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）及び幾つかのリソソーム蓄積障害（Ｒａｓｔａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）などの遺伝性疾患の治療のため、異種トランス遺伝子（即ちレンチウイルス（ＬＶ）にとって天然でない遺伝子）を造血幹細胞に送達するのに有用である。
【0006】
ＬＶ属は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する。ＬＶは、宿主における疾患発症までの長い潜伏期を特徴とし、「遅い」を意味するラテン語「ｌｅｎｔｅ（レンテ）」に因んでその名称が付けられた（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。レンチウイルスカプシドの徹底的な最適化を通して、初期遺伝子送達後に複製不能となる非病原性レンチウイルスベクターの作製が成功したことにより、ＬＶベクターバイオ療法の安全及び効率が確立されている。こうしたベクターの大多数は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするものであり、ＨＩＶは、円錐形のカプシド中に配列された２，０００個のｐ２４タンパク質の外被を有する２つの一本鎖ＲＮＡコピーからなる（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。カプシドの完全性は、ｐ１７マトリックスによって更に保護され、これは、全てほぼ球形の直径約１２０ｎｍのリン脂質エンベロープに包まれている（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。このウイルス粒子は、大型のメガダルトンサイズ範囲であるため、この粒子による最大８．５ｋｂの大型ゲノムの被包が可能となる（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）３１。この一本鎖ＲＮＡゲノムは、長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接する、５つがウイルスの生存及び機能に不可欠なものであり、４つがアクセサリー遺伝子である９つの遺伝子をコードする（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。遺伝子療法を目的に設計される組換えＬＶベクターでは、ほとんどの場合、リン脂質エンベロープが水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープに置き換えられ、ＶＳＶ－Ｇは、遍在的に発現するリポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を認識するため、従って多様な細胞型におけるベクター形質導入が可能となる（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。加えて、ベクターの安全性を強化するためにウイルスのアクセサリー遺伝子が除去され、治療用遺伝子発現カセットに置き換えられる。通常の感染過程は、糖タンパク質がそのそれぞれの細胞膜受容体によってベクターエンベロープに付着した後の受容体介在性エンドサイトーシス又は膜融合による細胞侵入を伴う（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。細胞侵入後、ゲノムの脱外被及び放出された一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）の逆転写が続く。次に、新規に合成されたｃＤＮＡが核に輸送され、そこで宿主ゲノムに組み込まれる。ＬＶベクターの合理的設計を強化するには、この感染性が関わるステップの詳細の理解が不可欠である。しかしながら、これらのステップの多くの側面は、十分に理解されていない。
【0007】
特に重要性のある領域の１つは、ＬＶ感染過程のゲノム脱外被ステップである。重要なことに、送達されたリボ核酸（ＲＮＡ）の逆転写は、ゲノム脱外被が成功したときに限り起こる（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。従って、ＬＶベクターの細胞形質導入効率は、一部にはその脱外被効率に依存すると考えることが妥当であり得る。現在まで、ＬＶゲノム脱外被に関して確実に分かっていることは、ほとんどない。しかしながら、ｐＨを下げる局所的な変化が脱外被過程を促進すると推測されている（Ｍｉｌｏｎｅ ａｎｄ Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２，１５２９－１５４１，２０１８）。更に、ＬＶの生物学的特性と物理的特性との間の関係を評価するための生物物理学的ツールの使用及びキャラクタリゼーション方法に関して、利用できる文献が限られている。
【0008】
遺伝子療法プログラムでは、遺伝子コピー数の存在と、タンパク質発現及び潜在的な有害作用との間の線形性が示されている８～１０。従って、遺伝子療法プログラムの成功は、投薬後の安全性及び有効性アウトカムに大きく依存し、次に、これは、ＡＡＶベクターの力価決定及びキャラクタリゼーション方法の精密さ及び正確さに依存する。電子顕微鏡法、動的光散乱法、分析超遠心法（ＡＵＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの種々の方法は、サイズ、凝集傾向、安定性、空のカプシドに対するフルカプシドの量、それぞれカプシド及びベクターゲノム力価を含め、精製カプシド粒子の種々の属性の経過を追跡するために別個に利用されている。遺伝子療法分野では、これらの方法がしばらく用いられているが、既存の方法には、それぞれ低いスループットから高い変動性まで及ぶ固有の関連する限界がある。
【0009】
過去には、アデノウイルス調製物のベクターゲノム及びカプシドタンパク質含有分を定量化するため、バルク光学濃度測定が試験されている（Ｍａｉｚｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６，１１５－１２５，１９６８、Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，７４９８－７５０９，１９９６、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９５，２８４－２８８．，２００２）。その後、同様の概念を適用して、比較的単純な構造のＡＡＶ２カプシド粒子のベクターゲノム及びカプシドタンパク質含有分が定量化された（Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ７，１２２－１２８，２００３）。結果は、ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡのような既存の方法と比較したとき、良好な類似性を示したが、１つの大きい限界は、タンパク質、核酸及び緩衝液成分など、同じＵＶ範囲で吸収し得る溶液中の外因性不純物の有意な効果であった。その上、この方法は、カプシド溶液のバルク測定であるため、外因性不純物及びカプシド凝集体の量を別々に推定することが不可能であった。これらの潜在的限界及びこの方法がカプシド内の封入されたゲノムを特異的に定量化できなかったという事実に起因して、この方法の利用は、大学の研究室及び非臨床試験に限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
遺伝子療法ウイルス粒子のキャラクタリゼーションのためのより効率の高いハイスループット技法が必要とされている。例えば、ウイルス濃度が未知又は決定困難である試料中のウイルス粒子をカウントし、且つウイルスのサイズ分布を決定する能力のある正確な方法が必要とされている。本明細書に開示される方法は、極めて信頼性が高いものであり、高速且つ自動化されたウイルス粒子のサイズ分布分析及び定量化を実現する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本明細書では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は多角度光散乱（ＭＡＬＳ）技術と組み合わせたＳＥＣの分離能力を利用して、ウイルス粒子カプシドサイズ、高次カプシド凝集体、カプシドに封入されていないデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びタンパク質不純物の存在、カプシドの完全性、軽いカプシドの量、カプシドタンパク質及びカプシドに封入されたＤＮＡの分子質量、カプシド力価並びにゲノム力価をモニタするハイスループット及び多目的のキャラクタリゼーション方法が提供される。本方法は、屈折計及び光散乱法を併用した、それぞれ紫外線（ＵＶ）２８０ナノメートル（ｎｍ）及びＵＶ ２６０ｎｍにおけるカプシドタンパク質及びカプシドに封入されたＤＮＡの吸光度特性を利用することにより、単回のランでＡＡＶカプシドの複数の属性をモニタする。ウイルス濃度が未知又は決定困難である試料中のウイルス粒子をカウントし、且つウイルスのサイズ分布を決定する能力のある正確な方法は、極めて望ましい。ウイルス試料中のかかる特性のキャラクタリゼーションは、より多くの情報を提供するため、ウイルス調製条件の最適化及び安定調製物の同定に関連する開発時間を短縮することを促進し得る。ウイルス粒子をそのサイズ別に分離すると、凝集したウイルス粒子の量の推定が可能となり、より正確なウイルスカウントが得られる。凝集したウイルス粒子を分離すれば、その凝集状態（１凝集体当たりの個別のビリオンの数及び凝集体の幾何学的構造）を特徴付けることができる。
【0012】
本開示は、ＳＥＣ及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーを多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）とともに使用する、ＡＡＶ及びＬＶ粒子などのウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化する方法、プロセス及びシステムを提供する。
【0013】
サイズを基準とする分離技法であるＳＥＣは、固定相の細孔から大型種が部分的に排除されることに基づいて、高次凝集体を単量体種から分離するという利点を有する。この方法は、インフルエンザ粒子のような大きいＶＬＰ（ウイルス様粒子）の場合に用いられており、それらの分子のＵＶ吸光度特性を用いてその溶出プロファイルをモニタする（Ｖａｊｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １４６５，１１７－１２５．，２０１６、Ｗｅｉｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０７，４５－５３，２０１４、Ｌａｇｏｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３２，８－１１，２０１６、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３３，１１４３－１１５０，２０１５、Ｌａｄｄ Ｅｆｆｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ３４，１２５９－１２６７，２０１６）。この技法の有用性は、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）及び屈折率（ＲＩ）検出器と併用した場合に更に高まり得る。ＭＡＬＳは、ＳＥＣ又はフィールドフローフラクショネーションと連動して、ポリマー並びにタンパク質バイオ治療薬の絶対分子量、サイズ、立体構造及び分布の決定に広く用いられている（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５６，７６－８５，２００６、Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２７２，１－４０，１９９３、Ｚｉｎｏｖｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ １１，３２５９－３２６８，２０１８、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ ２５，９７３－９７９，２０１８、Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ８９９，４０３－４２３，２０１２、Ｍｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５０１，４－２２，２０１６）。最近になって、幾つかの研究により、他の特性に加えて、光散乱法も溶液中のＶＬＰの定量化に使用され得ることが示されている（Ｓｔｅｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １４８７，８９－９９，２０１７、ＭｃＥｖｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２７，５４７－５５４，２０１１、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４４，１２２－１３２，２００７、Ｍａｋｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２，９１－９９，２０１５）。
【0014】
ｐＨの関数としてのＬＶベクター構造及び安定性を包括的に特徴付けるための、様々な生物物理学的ツールと組み合わせたＳＥＣ－ＭＡＬＳキャラクタリゼーション方法の開発及び使用も記載される。注目すべきことに、記載されるＳＥＣ－ＭＡＬＳ方法は、検量線を必要とすることなく、ＬＶ粒子を直接定量化し、且つそこでＬＶ粒子力価を推定する迅速な且つ再現性のある方法であると特定される。加えて、提案されるゲノム脱外被機構と一致して、本発明者らの結果は、酸性条件下でのＬＶカプシドの不安定化を実証する。
【0015】
一態様において、様々な実施形態の方法、プロセス及びシステムは、カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物の試料をＳＥＣによって分析するステップと、ＳＥＣ分析からウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化するステップとを含む。キャラクタリゼーション及び定量化は、調製物中のウイルス粒子の凝集を定量化すること、調製物中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化することを含む。ＳＥＣ分析は、試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画するステップと、ウイルス粒子の特性を測定するステップと、ウイルス粒子をキャラクタリゼーションするステップとを含む。測定は、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することを含む。改良形態では、キャラクタリゼーションステップは、画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、画分の少なくとも１つにおいてＡＡＶなどのウイルス粒子を同定することを含む。様々な実施形態において、様々な実施形態の方法、プロセス及びシステムは、ＳＥＣ分析前に、試料を分析超遠心法によって分析して、カプシドに封入されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドを同定するステップを更に含む。
【0016】
別の態様において、様々な実施形態の方法、プロセス及びシステムは、カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物の試料をＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析するステップと、ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析からウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化するステップとを含む。キャラクタリゼーション及び定量化は、調製物中のウイルス粒子の凝集を定量化すること、調製物中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化することを含む。ＳＥＣ分析は、試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画するステップと、ウイルス粒子の特性を測定するステップと、ウイルス粒子をキャラクタリゼーションするステップとを含む。測定は、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することを含む。改良形態では、キャラクタリゼーションステップは、画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、画分の少なくとも１つにおいてＡＡＶなどのウイルス粒子を同定することを含む。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画するステップと、ウイルス粒子の特性を測定するステップと、ウイルス粒子をキャラクタリゼーションするステップとを含む。測定は、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における画分による光吸収及びＭＡＬＳを使用した画分による光散乱の強度を含む。様々な実施形態において、本方法、プロセス及びシステムは、調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドのサイズ分布を動的光散乱分析によって決定するステップを更に含む。ウイルス粒子のサイズ分布は、ウイルス粒子の回転半径（Ｒｇ）及び／又は流体力学半径（Ｒｈ）を含み得る。様々な実施形態において、様々な実施形態の、調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化することは、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドのＲｇ及びＲｈを動的光散乱分析によって決定することを含み得、Ｒｇ対Ｒｈの比は、調製物中のウイルス粒子のパーセンテージ濃度と相関する。様々な実施形態において、様々な実施形態の方法、プロセス及びシステムは、ＳＥＣ又はＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析前に、試料を分析超遠心法によって分析して、カプシドに封入されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドを同定するステップを更に含む。
【0017】
別の態様下では、様々な実施形態の方法、プロセス及びシステムは、カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物からの複数の試料をＳＥＣによって分析するステップと、ＳＥＣ分析から、試料の各々におけるカプシドの構造的完全性をモニタするステップとを含む。試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾される。例えば、特性は、２５℃における時間長さの試料の貯蔵である。また、試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、カプシドの構造的完全性の変化と相関する。ＳＥＣ分析は、試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画するステップと、ウイルス粒子の特性を測定するステップと、ウイルス粒子をキャラクタリゼーションするステップとを含む。測定は、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することを含む。改良形態では、キャラクタリゼーションステップは、画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、画分の少なくとも１つにおいてＡＡＶなどのウイルス粒子を同定することを含む。様々な実施形態において、本方法、プロセス及びシステムは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析前に、複数の試料を分析超遠心法によって分析して、カプシドに封入されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドを同定するステップを更に含む。
【0018】
別の態様下では、様々な実施形態の方法、プロセス及びシステムは、カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物からの複数の試料をＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析するステップと、ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、試料の各々におけるカプシドの構造的完全性をモニタするステップとを含む。試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾される。例えば、特性は、摂氏２５度（℃）における時間長さの試料の貯蔵である。また、試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、カプシドの構造的完全性の変化と相関する。ＳＥＣ分析は、試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画するステップと、ウイルス粒子の特性を測定するステップと、ウイルス粒子をキャラクタリゼーションするステップとを含む。測定は、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することを含む。改良形態では、キャラクタリゼーションステップは、画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、画分の少なくとも１つにおいてＡＡＶなどのウイルス粒子を同定することを含む。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画するステップと、ウイルス粒子の特性を測定するステップと、ウイルス粒子をキャラクタリゼーションするステップとを含む。測定は、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における画分による光吸収及びＭＡＬＳを使用した画分による光散乱の強度を含む。様々な実施形態において、本方法、プロセス及びシステムは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析前に、複数の試料を分析超遠心法によって分析して、カプシドに封入されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドを同定するステップを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【0020】
【図2A-F】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ及び２Ｆは、サイズ排除クロマトグラフィーＵＶ吸光度値からの力価計算のグラフである。図２Ａは、重いＡＡＶ試料の２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ吸光度プロファイルを示す。図２Ｂは、軽いＡＡＶ試料の２８０ｎｍ及び２６０ｎｍ吸光度プロファイルを示す。図２Ｃは、カプシド力価に当てはめた線形回帰モデルを示す。図２Ｄは、軽いカプシドの含有率の関数としてのＶｇ力価を示す（ｎ＝３）。図２Ｅは、それぞれ指数及び線形回帰モデルへの当てはめの、軽いカプシドの含有率の関数としてのＵＶ吸光度値から計算したカプシド力価の過小推定及びＶｇ力価の過大推定を示す（ｎ＝３）。図２Ｆは、軽いカプシドの関数としての２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ吸光度比への多項式回帰モデルの当てはめを示す（ｎ＝３）。
【0021】
【0022】
【図4A-D】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、多角度光散乱法がカプシド及び被包されたＤＮＡの質量及びモル質量を測定し、力価の計算を可能にすることを明らかにするグラフである。図４Ａは、カプシドタンパク質及び被包されたＤＮＡのモル質量と併せた重いＡＡＶ試料の光散乱クロマトグラムである。図４Ｂは、カプシドタンパク質及び被包されたＤＮＡのモル質量と併せた軽いＡＡＶ試料の光散乱クロマトグラムである。図４Ｃは、軽いカプシドの含有率の関数としての、それぞれカプシド及び被包されたＤＮＡの質量への線形回帰モデルの当てはめを示す（ｎ＝３）。図４Ｄは、軽いカプシドの含有率の関数としての、それぞれカプシド及び被包されたＤＮＡのモル質量への線形回帰モデルの当てはめを示す（ｎ＝３）。
【0023】
【図5A-D】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄは、多角度光散乱法力価計算における軽い及び中間のカプシドへの考慮を示すグラフである。図５Ａは、軽いカプシドの含有率に伴う多角度光散乱法からのタンパク質分率の傾向を示す（ｎ＝３）。図５Ｂは、軽いカプシドの予想割合に対する光散乱法質量から計算した重いカプシドの割合の線形回帰モデルへの当てはめのプロットを示す（ｎ＝３）。図５Ｃは、軽いカプシドの関数としてのベクターカプシド及びベクターゲノム力価への線形回帰モデルの当てはめを示す（ｎ＝３）。図５Ｄは、０～１００％の軽いカプシドを含有する試料の予想値に対する多角度光散乱法から計算したカプシド／ベクターゲノム比の線形回帰モデルへの当てはめを示す（ｎ＝３）。
【0024】
【0025】
【図7A-F】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ及び７Ｆは、重い及び軽いカプシドの熱安定性のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を示すグラフである。図７Ａは、２５℃から９５℃まで１０度間隔でインキュベートした重いカプシドの試料の２８０ｎｍ吸光度プロファイルを示す。図７Ｂは、２５℃から９５℃まで１０度間隔でインキュベートした軽いカプシドの試料の２８０ｎｍ吸光度プロファイルを示す。図７Ｃは、温度の関数としての重い及び軽いカプシドの単量体２８０ｎｍピーク吸光度パーセンテージへのボルツマンシグモイド回帰モデルの当てはめを示す（ｎ＝３）。重いカプシドのモデルのＶ５０値（５０．０３℃）を縦の点線で示す。図７Ｄは、温度の関数としての重い及び軽いカプシドの単量体ピークＡ６０／Ａ２８０を示す（ｎ＝３）。重いカプシドのデータへのボルツマンシグモイド回帰モデルの当てはめのＶ５０値（６１．２２℃）を縦の点線で示す。図７Ｅは、温度の関数としての単量体の重い及び軽いカプシド種の流体力学半径（Ｒｈ）及び回転半径（Ｒｇ）を示す（ｎ＝３）。図７Ｆは、温度の関数としての重い及び軽いカプシドのタンパク質及びカプシドに封入されたＤＮＡのモル質量を示す（ｎ＝３）。重いカプシドのＤＮＡデータへのボルツマンシグモイド回帰モデルの当てはめのＶ５０値（５７．８９℃）を縦の点線で示す。
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【図25A-B】図２５Ａ及び２５Ｂは、ＬＶ粒子のＳＥＣ－ＭＡＬＳ ｐＨ安定性分析を提供する。図２５Ａは、ｐＨ４．００、ｐＨ７．４０及びｐＨ１０．００で透析したＬＶ粒子をトリプリケートで２５μＬ注入した後に得られた、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって検出した平均ＳＥＣ溶出プロファイルを提供する。カプシドの溶出は、注入後約１７分に観察されるピークによって表される。ｐＨ７．００ ＬＶ粒子のＳＥＣプロファイルと比較すると、ｐＨ４．００ ＬＶピークは、ほぼ無視できるほどのみである一方、ｐＨ１０．００ピークは、増大している。図２５Ｂは、上述のＳＥＣプロファイルに見られるのと同じ傾向を示す平均ＭＡＬＳピークプロファイルを提供する。
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【図31A-D】図３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ及び３１Ｄは、内部蛍光及び円偏光二色性を用いた空及びフルのｒＡＡＶ５カプシドの初期熱安定性分析を提供する。図３１Ａは、空及びフルのカプシドの代表的な内部蛍光曲線の一次導関数を示し、両方のカプシドとも、そのタンパク質が約９０℃の融解温度を示し、ＤＳＣによって決定される以前に報告されたＡＡＶ５融解温度と一致する。図３１Ｂは、２１０ｎｍ及び２７０ｎｍの吸光度の差を示す、空及びフルのカプシドの代表的な遠紫外ＣＤスペクトルを提供する。空のカプシドのスペクトルで観察される約２１０ｎｍの顕著な極小は、フルカプシドのタンパク質よりも空のカプシドのタンパク質の方が、αヘリックス立体構造が多いことを示している。フルカプシドによって被包されたＤＮＡは、２７０ｎｍの吸収を示し、これは、ＤＮＡを被包しない空のカプシドでは見られなかった。図３１Ｃは、温度の関数としての２２０ｎｍでのＣＤ楕円率をモニタすることによって求めた、空及びフルのカプシドの融解曲線の比較を提供する。約９０℃の両方のカプシド型の融解温度を縦の点線で示す一方、フルカプシドにおいてのみ観察される二相性イベントの始まりを矢印で示す。図３１Ｄは、温度の関数としての２７０ｎｍでのＣＤ楕円率をモニタすることによって求めた、空及びフルのカプシドの融解曲線の比較を提供する。この場合にもやはり、縦の点線で示す両方のカプシド型の融解温度は、９０℃である一方、矢印は、もっぱらフルカプシドにおける融解温度より前に観察される二相性イベントを示す。
【0051】
【図32A-D】図３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ及び３２Ｄは、空及びフルのｒＡＡＶ５カプシドのＳＥＣ－ＭＡＬＳ熱安定性分析を提供する。図３２Ａは、２５℃から９５℃まで１０℃間隔でインキュベートした空のカプシドをトリプリケートで注入した後に得られた、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって検出した平均ＳＥＣ溶出プロファイルを提供する。カプシドの溶出は、注入後約１１分に観察される突出ピークによって表される。空のカプシドのＳＥＣプロファイルは、比較的一定のままであり、７５℃まで主ピークサイズの低下が限られており、続いてタンパク質カプシドの融解に起因して８５℃～９５℃で急激に下降する。図３２Ｂは、それぞれの温度でインキュベートしたフルカプシドをトリプリケートで注入した後に得られた平均ＳＥＣ ＵＶ ２８０ｎｍ溶出プロファイルを提供する。フルカプシドのＳＥＣプロファイルの変化は、４５℃で始まり、４５℃～６５℃に突出ピークサイズの下落が観察される。図３２Ｃは、温度の関数としてのカプシドの完全性の下降を示すため測定し、プロットした、空及びフルの両方のカプシドの主ＵＶピークのパーセンテージを提供する。図３２Ｄは、ＵＶピークパーセンテージに見られるのと同じ傾向を反映する、空及びフルの両方のカプシドの主ＭＡＬＳピークのパーセンテージを提供する。
【0052】
【0053】
【図34A-C】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４Ｃは、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ色素を使用した空及びフルのｒＡＡＶ５カプシドの外部蛍光分析を提供する。図３４Ａは、外部蛍光アッセイスキームを提供する。図３４Ｂは、温度の関数としてのフルカプシドと混合したＳＹＢＲ ｇｏｌｄ色素の蛍光スペクトルを示す。図３４Ｃは、フル及び空の両方のカプシドについて蛍光曲線下総面積を測定し、温度の関数としてプロットしたものを示す。フルカプシドについて二相性の当てはめが得られたが、空のカプシドは、このプロットに関していかなる傾向も示さなかった。縦の点線は、フルカプシドについて観察されるとおりの、これらの２つの転移温度の最大値の半分を表す。
【0054】
【0055】
【図36A-D】図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ及び３６Ｄは、ＤＮＡ負荷量がｒＡＡＶ５カプシドの完全性に及ぼす効果を決定するための外部蛍光分析を提供する。図３６Ａ及び図３６Ｃは、供給源Ａ及び供給源Ｂからのカプシドについて、様々なサイズの被包されたＤＮＡを有するカプシドと混合したＳＹＢＲ ｇｏｌｄ色素の蛍光スペクトルを得て、曲線下面積を計算し、温度の関数としてプロットしたものを提供する。図３６Ｂ及び図３６Ｄは、供給源Ａ及び供給源Ｂからのカプシドについて、被包されたゲノムのサイズの関数としてのｒＡＡＶ５カプシド転移温度の統計的に有意な差を示す棒グラフを提供する。被包されたゲノムのサイズが増加するにつれて、カプシド破壊の指標である転移温度が低下する。
【0056】
【図37A-D】図３７Ａ、３７Ｂ、３７Ｃ及び３７Ｄは、ＤＮＡ負荷量の増加がｒＡＡＶ５カプシドの完全性に及ぼす効果を確立するためのＳＥＣ分析を提供する。試料２カプシド（図３７Ａ）、試料４カプシド（図３７Ｂ）及び試料６カプシド（図３７Ｃ）を２５℃、５５℃及び７５℃に３０分間供したＳＥＣプロファイル。試料は、本明細書の図２２のアルカリゲル像によって示されるとおりのカプシドの漸増ＤＮＡ負荷量に基づいて選択した。全ての試料が２５℃（一様なｒＡＡＶ５カプシドピーク）及び７５℃（元のピークの１０％未満）で同様のプロファイルを呈した一方、５５℃で得られた試料のプロファイルは、その被包されたゲノムのサイズに基づく３つの試料の各々で、カプシドの各々について異なる転移温度に基づいて変化した。
【発明を実施するための形態】
【0057】
本明細書では、ＳＥＣ又はＳＥＣ－ＭＡＬＳの使用を通して、ＡＡＶ又はＬＶなどのウイルス粒子の生物物理学的キャラクタリゼーションを実現した。詳細には、こうした方法を用いて、調製物中のウイルス粒子の凝集を定量化し、調製物中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化し、カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量を決定し、調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化し、調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドのサイズ分布を決定し、且つカプシドの構造的完全性をモニタした。
【0058】
また、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、ＣＤ、ＤＬＳ及び蛍光の使用を通して、ＡＡＶ（非エンベロープ型）又はＬＶ（エンベロープ型）粒子の生物物理学的キャラクタリゼーションを実現することにより、カプシド構造を評価した。詳細には、これらの方法を用いて、ウイルス粒子サイズ及びウイルスカプシド不安定化を決定した。カプシドの完全性とｐＨとの間には、正の相関がある。加えて、高イオン化条件は、ＬＶカプシドを安定化させる役割を果たす。最後に、ＡＡＶカプシドの熱安定性の調節において、被包されたゲノムのサイズが担う役割が同定された。これらの生物物理学的ツール（ＳＥＣ及びＭＡＬＳ）を組み合わせた使用は、遺伝子療法に使用されるウイルスベクターの包括的なキャラクタリゼーション及び構造－機能の解明のための有効な手段としての役割を果たす。
【0059】
一般的技法
本方法の実施には、特に指示されない限り、当業者の技能の範囲内にある細胞生物学、分子生物学、細胞培養、ウイルス学などの従来技術が用いられることになる。これらの技法は、既刊の文献に十分に開示されており、特にＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｅｌｉｓ Ｊ．Ｅ．“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）及びＢａｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５４：１３１－１４３（１９９５）が参照される。更に、本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、それらの方法が関係する分野の当業者の技術水準を指し示すものであり、本明細書によって全体として参照により援用される。
本方法の実施には、特に指示されない限り、当業者の技能の範囲内にある細胞生物学、分子生物学、細胞培養、ウイルス学などの従来技術が用いられることになる。これらの技法は、既刊の文献に十分に開示されており、特にＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｅｌｉｓ Ｊ．Ｅ．“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）及びＢａｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５４：１３１－１４３（１９９５）が参照される。更に、本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、それらの方法が関係する分野の当業者の技術水準を指し示すものであり、本明細書によって全体として参照により援用される。
【0060】
定義
本開示全体を通して、以下の段落に定義される幾つかの用語が用いられる。
本開示全体を通して、以下の段落に定義される幾つかの用語が用いられる。
【0061】
本明細書では、本技術の実施形態を説明及び特許請求するために、包含する、含有する又は有するなどの非限定的な用語の同義語として、オープンエンド形式の用語「含む」が使用されるが、実施形態は、あるいは、「からなる」又は「から本質的になる」など、より限定的な用語を用いて説明してもよい。
【0062】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、値に適用されるとき、計算又は測定が値の僅かな不正確さを許容することを指示する（値の正確さに向けた何らかの手法を伴う；その値に近似的に又は合理的に近い；ほぼ）。何らかの理由のため、「約」によってもたらされるその不正確さが当技術分野におけるその通常の意味で理解される以外の場合、本明細書で使用されるとおりの「約」は、少なくともかかるパラメータの通常の測定又は使用方法から起こり得るばらつきを指示する。
【0063】
本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」は、挙げられている関連する項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。
【0064】
用語「ウイルス粒子」又は「ビリオン」は、タンパク質外被を有するＲＮＡ又はＤＮＡコアを指し、ウイルスに応じて、コア及びタンパク質は、外側のエンベロープを含み得る。例示的ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子、ＬＶ粒子、アデノウイルス粒子、アルファウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、レトロウイルス粒子及びワクシニアウイルス粒子である。
【0065】
用語「カプシド粒子」は、ＲＮＡ又はＤＮＡコアを含むことも又は含まないこともあるタンパク質外被を指す。例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡコアを含有しないカプシド粒子は、空の若しくは軽いカプシド粒子又は空の若しくは軽いカプシドと記載することもできる。ＲＮＡ又はＤＮＡコアを含有するカプシド粒子は、ウイルスの種類（例えば、外側エンベロープを有しないウイルス）に応じて、フルのカプシド粒子若しくはウイルス粒子又はビリオンと記載することもできる。
【0066】
本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶウイルスゲノムにとって異種の転写調節エレメント、即ち１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーに作動可能に連結されたタンパク質コード配列（好ましくは機能性の治療用タンパク質コード配列；例えばＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＰＡＨ）が隣接するＡＡＶ ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列及びＡＡＶ ３’ＩＴＲ並びに所望によりポリアデニル化配列及び／又はタンパク質コード配列のエクソン間に挿入された１つ以上のイントロンを有する、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸を指す。一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルス粒子のゲノムに存在する核酸を指し、本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかであり得る。かかる一本鎖核酸のサイズは、塩基単位で提供される。二本鎖ＡＡＶベクターは、プラスミド、例えばｐＵＣ１９のＤＮＡに存在する核酸又はＡＡＶベクター核酸の発現又は移入に使用される二本鎖ウイルス、例えばバキュロウイルスのゲノムを指す。かかる二本鎖核酸のサイズは、塩基対（ｂｐ）単位で提供される。
【0067】
「ＡＡＶビリオン」、又は「ＡＡＶウイルス粒子」、又は「ＡＡＶベクター粒子」、又は「ＡＡＶウイルス」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、本明細書に記載されるとおりのカプシドに封入されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターとで構成されるウイルス粒子を指す。この粒子が異種ポリヌクレオチド（即ちトランス遺伝子など、野生型ＡＡＶゲノム以外の、哺乳類細胞に送達しようとするポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と称される。従って、ＡＡＶベクター粒子の作製には、必然的にＡＡＶベクターの作製が含まれ、このように、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含まれる。
【0068】
用語「レンチウイルス」は、一群の複合レトロウイルスを指す一方、用語「組換えレンチウイルス」は、複製できないが、培養細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）で産生させることができ、且つ遺伝子を目的の細胞に送達することができるように操作された、レンチウイルスゲノム（ＨＩＶ－１ゲノムなど）に由来する組換えウイルスを指す。
【0069】
用語「ベシクロウイルス」は、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のマイナスセンス一本鎖レトロウイルスの属を指す。
【0070】
用語「エンベロープタンパク質」は、いずれの種及び細胞型をウイルスが形質導入できるかを決定付ける、ウイルスの表面にある膜貫通タンパク質を指す。
【0071】
用語「シュードタイプ化」は、ウイルスの任意の成分を異種ウイルスからの成分に置き換えることを指す。詳細には、「シュードタイプ化」は、野生型エンベロープと異なるエンベロープを含むために変化した向性を有する組換えウイルスを意味する。シュードタイプ化したレンチウイルスの場合、それは、非レンチウイルス起源又はレンチウイルスの異なる種若しくは亜種、例えば別のウイルスを起源とするか、或いは細胞起源の異種エンベロープを有するレンチウイルスであるか、又は別のウイルスを起源とするか若しくは細胞起源の別の細胞膜タンパク質によってエンベロープが置き換えられているレンチウイルスである。
【0072】
用語「ＶＳＶエンベロープ」は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）と呼ばれるラブドウイルスからのエンベロープタンパク質を指す。多くの場合、このタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質とも称され、ここで、「Ｇ」は、糖タンパク質を意味する。ラブドウイルスのエンベロープタンパク質は、グリコシル化されている唯一のラブドウイルスタンパク質である。
【0073】
「サイズ排除クロマトグラフィー」（ＳＥＣ）は、「ゲルろ過クロマトグラフィー」としても知られ、ゲルを通したろ過により、分子をそのサイズに基づいて分離するクロマトグラフィー法を指す。
【0074】
用語「分画」又は「分画すること」は、ＳＥＣゲルマトリックス内での様々な分子量の分子の分離を指す。この分離方法では、目的の分子がゲルの分画範囲内になければならない。用語「画分」は、ＳＥＣゲルマトリックスから溶出した分子のピークを指す。
【0075】
用語「流量」は、単位時間当たりでＳＥＣカラムの所与の断面積を通過する流体の容積を指す。一般には、中程度の流量が最も高い分解能を提供する。流量は、使用する媒体の種類に特異的である。中程度の流量では、分子が固定相の全表面積にわたって十分に接触する時間があるため、小さい分子量種が細孔に入り込むことが可能であり、結果として異なる分子量種の分配が向上する。流量が遅過ぎると、それがカラム中を移動するにつれてピーク又はバンドが拡散し過ぎることになるため、分解能が低下することになる。
【0076】
「多角度光散乱法」（ＭＡＬＳ）は、試料によって複数の角度に散乱した光を測定するための技法を指す。この技法は、溶液中の分子がどの程度光を散乱させるかを検出することにより、その絶対モル質量及び平均サイズを決定するのに有用である。「多角度」という用語は、例えば、特定の選択された角度を含むある範囲にわたって動く単一の検出器又は特定の角度位置に固定された検出器のアレイによって測定されるとおりの、異なる個別の角度での散乱光の検出を指す。ＭＡＬＳ測定値は、概して、散乱強度又は散乱放射照度として表される。
【0077】
「屈折率増分」又は「ｄｎ／ｄｃ」は、ウイルス粒子、カプシド又はベクターゲノムに伴う屈折率の変化を示す定数である。屈折率増分をスネルの法則に用いると、屈折率（ＲＩ）から濃度が測定される。例えば、タンパク質のｄｎ／ｄｃは、０．１８５であり、ＤＮＡのｄｎ／ｄｃは、０．１７０である。屈折率増分は、ＡＵＣによって決定することができる。
【0078】
「吸光係数」、「モル吸光係数」又は「ε」は、化学種又は物質が特定の波長の光をどの程度強く吸収するかの尺度である。吸光係数をランベルト・ベールの法則に用いると、ある波長（例えば、２８０ｎｍ）の吸光度から濃度が測定される。例えば、ＡＡＶ５カプシドの吸光係数は、１．７９であり、例示的ベクターゲノムの吸光係数は、１７．０である。
【0079】
空のウイルス粒子は、「空のカプシド」又は「軽いカプシド」とも称され、ウイルスゲノムＤＮＡを少量のみ含有するか又は全く含有しないウイルス粒子を指す。典型的には、ＡＡＶ又はＬＶベクター作製時に形成される空のカプシドである。これらの空のウイルス粒子は、クロマトグラフィー精製時にゲノム含有ベクター粒子と共精製され得、空のカプシドが過剰にあると、吸光度によるベクターゲノム濃度の単純な決定が交絡する。
【0080】
カプシド粒子（Ｃｐ）力価は、１ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を指す。
【0081】
ベクターゲノム（Ｖｇ）力価は、１ミリリットル当たりのウイルスゲノムの数を指す。この力価は、ＵＶ２６０／ＵＶ２８０におけるウイルス粒子吸光度の比によって決定され得る。高度に精製したＡＡＶ調製物の吸光度（Ａ２６０）は、ベクターＤＮＡの分子量及びカプシドタンパク質の量に依存する。
【0082】
「回転半径（Ｒｇ）」は、「二乗平均平方根半径」としても知られ、ＭＡＬＳによって測定したときの溶液中のウイルス粒子の絶対モル質量測定値を指す。この測定値は、ウイルス粒子における分子のコアから各質量要素までの質量加重平均距離によって決定される。Ｒｇは、動的光散乱分析によって決定することができる。
【0083】
「流体力学半径（Ｒｈ）」は、観測下にあるウイルス粒子と同じ速度で拡散する均等な剛体球の半径である。Ｒｈは、ＭＡＬＳ検出器で動的光散乱法によって測定される。ウイルス粒子の溶液は、「剛体球」として存在しないため、決定されるＲｈは、溶液中のウイルス粒子がとる見かけのサイズを反映する。Ｒｈは、動的光散乱分析によって決定することができる。
【0084】
ウイルス粒子のキャラクタリゼーション方法
本開示は、ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ技法を利用した組み合わせ方法を提供する。これらの方法は、ＡＡＶ及びＬＶ粒子の複数の属性を定量化するロバストで直接的な手法を提供する。これらの方法は、カプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの吸光度及び光散乱特性を利用して、溶液中のカプシド粒子（ｃｐ）及びカプシドに封入されたベクターゲノム（ｖｇ）の総含有率を推測する。更に、これらの方法は、ウイルス粒子及びカプシドに封入されたベクターゲノムの平均分子質量、ウイルス粒子のサイズ分布及び凝集プロファイル、外因性ＤＮＡの量、カプシドの完全性並びに精製ＡＡＶ又はＬＶ調製物中の空のウイルス粒子のフルのウイルス粒子に対する比を決定する。現在、同じ情報量の生成に複数の技法が用いられているが、正確さ及び精密さが様々である。本開示の方法は、カプシド粒子及びカプシドに封入されたベクターゲノムの内部特性を利用するものであり、それは、決定的に重要な情報を提供し、且つＡＡＶ又はＬＶ溶液の多くの物理的特徴を１回のランで、高精度に、試料の操作を最小限に抑えて定量化する。これらの方法を通して生成されたデータを直交技法と比較したところ、結果は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳアッセイによってＡＡＶ又はＬＶの様々な質的属性を迅速に且つ高精度で決定可能であることを実証している。新規適用を伴うこの十分に確立された方法は、ＡＡＶ遺伝子療法の分野における製品開発及びプロセス分析の強力なツールである。
本開示は、ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ技法を利用した組み合わせ方法を提供する。これらの方法は、ＡＡＶ及びＬＶ粒子の複数の属性を定量化するロバストで直接的な手法を提供する。これらの方法は、カプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの吸光度及び光散乱特性を利用して、溶液中のカプシド粒子（ｃｐ）及びカプシドに封入されたベクターゲノム（ｖｇ）の総含有率を推測する。更に、これらの方法は、ウイルス粒子及びカプシドに封入されたベクターゲノムの平均分子質量、ウイルス粒子のサイズ分布及び凝集プロファイル、外因性ＤＮＡの量、カプシドの完全性並びに精製ＡＡＶ又はＬＶ調製物中の空のウイルス粒子のフルのウイルス粒子に対する比を決定する。現在、同じ情報量の生成に複数の技法が用いられているが、正確さ及び精密さが様々である。本開示の方法は、カプシド粒子及びカプシドに封入されたベクターゲノムの内部特性を利用するものであり、それは、決定的に重要な情報を提供し、且つＡＡＶ又はＬＶ溶液の多くの物理的特徴を１回のランで、高精度に、試料の操作を最小限に抑えて定量化する。これらの方法を通して生成されたデータを直交技法と比較したところ、結果は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳアッセイによってＡＡＶ又はＬＶの様々な質的属性を迅速に且つ高精度で決定可能であることを実証している。新規適用を伴うこの十分に確立された方法は、ＡＡＶ遺伝子療法の分野における製品開発及びプロセス分析の強力なツールである。
【0085】
現在、同じ情報量の生成に複数の技法が用いられているが、正確さ及び精密さが様々である。本開示の方法は、ウイルス粒子及びカプシドに封入されたベクターゲノムの内部特性を利用するものであり、それは、決定的に重要な情報を提供し、且つＡＡＶ又はＬＶ溶液の多くの物理的特徴を１回のランで、高精度に、試料の操作を最小限に抑えて定量化する。
【0086】
ウイルスベクターの中間産物及び最終産物の両方の包括的な生物物理学的キャラクタリゼーションは、生物医学的適用に向けたその合理的設計及び開発において極めて重要である。更に、生物物理学的ツールは、ウイルスベクター構造－機能関係の解明に用いることができる。結果的に、本研究におけるＬＶ試料を用いた初期の取り組みでは、ＬＶキャラクタリゼーション方法の開発に焦点を置き、ここで、方法－設計原理の中心は、生物物理学的ツールを使用して、ＬＶ粒子の不均一性、サイズ及び力価を含めたパラメータをリアルタイムで定性的及び定量的に測定することにあった。
【0087】
現在、ＳＥＣは、ゲルろ過クロマトグラフィーとしても知られ、産業部門の主力として、生物学的治療薬を最小限のコスト及び労力で迅速に再現性よく評価するために広く用いられている。ＳＥＣは、試料中の生物学的分子の不均一性、分布及び凝集に関する情報を提供する強力な技法である。ＳＥＣは、溶液中の分子を溶液中でそのサイズ又は重量別に分離し、大きい種ほど、小さい種と比べてカラムから速く溶出する。
【0088】
一般に、ＳＥＣゲルは、特定のサイズ分布の細孔を含む球状のビーズからなる。種々のサイズの分子がマトリックス内の細孔に取り込まれるか又はそれから排除されると、分離が起こる。小さい分子は、細孔内に拡散し、そのサイズに応じてカラムを通したその流れが遅くなる一方、大きい分子は、細孔に入り込まず、カラムの空隙容量に溶出される。結果的に、分子がカラムを通過するにつれて、分子は、そのサイズに基づいて分離され、分子量（ＭＷ）が減少する順に溶出される。
【0089】
動作条件及びゲル選択は、適用及び所望の分解能に依存する。ＳＥＣによって行われる分離でよく用いられる２つの種類は、分画及び脱塩（又は緩衝液交換）である。分離の分解能は、粒径、細孔径、流量、カラム長さ及び直径並びに試料容積に依存する。一般に、粒径が小さいほど、分解能が高くなる。細孔径が媒体の排除限界及び分画範囲を制御する。分解能は、カラム長さとともに増加し、カラム直径が増加すると、カラム容積又は総容積が大きくなるため、カラムの能力が増加する。次に、カラム溶出液がＵＶ検出器により、この場合には溶液中のタンパク質が吸収する光の波長である２８０ｎｍで検出される。このツールは、ウイルス試料の評価において多くの利点を提供するが、重要な難点は、それが提供するデータの定性対定量的性質である。しかしながら、これは、ＳＥＣを定量的生物物理学的ツールと組み合わせることにより増強され得る。
【0090】
カラムの充填は、分解能にとって決定的に重要であり；過充填のカラムでは、ビーズの細孔がつぶれるため、分解能が下がり得る。充填不足のカラムでは、細孔の外側の混合容積が増加するため、ピークの幅が広がり、分解能が低くなる。カラムの最上部に排除容積があると、試料がカラムベッドに入る前に拡散するため、「バンドの広がり」が起こり、即ち幅が広いピークとなり、分解能が大きく低下し得る。カラムの最上部にある排除容積は、次に、分子がカラムを通して移動するにつれて分解能の損失が増大するため、場合により最も重要な考慮事項である。
【0091】
本開示の方法において使用し得る例示的カラムとしては、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｅｐａｘ ＳＥＣ １０００カラム（Ｓｅｐａｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ＸＫ２６／６０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅ）ｑＥＶサイズ排除カラム（Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。ＡＡＶ又はＬＴの分離に選択されるカラムは、１００キロダルトン（ｋＤａ）～１０メガダルトン（ＭＤａ）範囲又は１０～４０ｎｍの流体力学的サイズのタンパク質を分離することが可能である。
【0092】
ＳＥＣでのＡＡＶ又はＬＴ粒子の溶出プロファイルを分析すると、約ＵＶ２６０：ＵＶ２８０での１番目及び２番目のピークが外因性ＤＮＡであり、３番目のピークがウイルス粒子の二量体に相当し、４番目のピークが単量体ウイルス粒子に相当し、５番目のピークが低分子ヌクレオチド及び緩衝液成分に相当することが示される。ＳＥＣでは、ＡＡＶ及びＬＶベクター試料の定性的分析が可能であるが、遺伝子療法ベクターを定量的に評価できない点は、この方法の実質的な欠陥である。これらの定量的分析測定は、総ウイルス粒子数及びサイズを含め、ウイルスベクターの生物物理学的パラメータを有効に理解するために重要である。従って、ＡＡＶ又はＬＶ生物物理学的キャラクタリゼーション方法の開発では、利用可能なデータの範囲を広げる手段としてＳＥＣをＭＡＬＳと併用することについて評価した。
【0093】
本研究では、ＳＥＣカラムから溶出する生物学的分子を直接定量化するためのＳＥＣのＭＡＬＳとの併用である。溶液中の分子によって散乱した光を複数の角度で測定するＭＡＬＳは、散乱光の強度を用いて、光を散乱させる分子の分子量、サイズ及び数を引き出す。光散乱の原理上、ＭＡＬＳピークの強度は、光を散乱させる分子の重量の平方と等しいことが記述される。
【0094】
多角度静的光散乱法と併せたサイズ排除クロマトグラフィーは、本明細書では「ＳＥＣ－ＭＡＬＳ」と称される。ＳＥＣは、分子を流体力学的容積に基づいて分離するが、正確な質量の決定には、参照標準の組との類似性に依存する。ＭＡＬＳは、散乱光の強度及び角度依存を用いて溶液中の分子の絶対モル質量及びサイズ（二乗平均平方根半径、ｒｇ）を測定する。ＭＡＬＳシステムの角度の数は、２個の角度～最大で２０個の角度で様々であり得るが、ここで、散乱は、各角度で同時に検出される。いずれの光散乱検出器（単一角度又は多角度）も分子量を測定することができるが、散乱角の関数として光散乱データを入手する主な利点は、Ｒｇ又は二乗平均平方根（ＲＭＳ）半径を計算して分子のサイズを求めることができる点である。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験でＳＥＣ及びＭＡＬＳを組み合わせると、いずれか一方の方法単独と比べてより正確な質量測定が可能となる。動的光散乱法（ＤＬＳ）検出器とも称されるインライン準弾性光散乱法（ＱＥＬＳ）では、流体力学半径の測定が可能である。
【0095】
ＬＶ及びＡＡＶ粒子は、サイズが大きく、理論的には多量の光を散乱させることが可能であるため、ＭＡＬＳは、ＬＶ及びＡＡＶ粒子分析において魅力的なツールとなる。ＭＡＬＳの別の利点は、それが絶対的な方法として検量線の作成を必要としないことである。Ｓｔｅｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．２０１７；１４８７：８９－９９）によって以前に概説された、ウイルス様粒子をキャラクタリゼーションする方法を出発点として用いて、ＬＶ粒子を生物物理学的に分析するＳＥＣ－ＭＡＬＳ方法を開発した。これを本明細書で開示する。注目すべきことに、本開示の方法は、ＡＡＶ又はＬＶ粒子の定性的及び定量的評価を可能にしたのみならず、ＬＶ粒子力価を迅速に推定する新規の再現性のある方法を提供した。
【0096】
本開示の方法のいずれにおいても、ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、ＡＡＶ又はＬＶの分子量の決定に少なくとも２角度、少なくとも３角度、少なくとも４角度、少なくとも５角度、少なくとも６角度、少なくとも７角度、少なくとも８角度、少なくとも９角度、少なくとも１０角度、少なくとも１１角度、少なくとも１２角度、少なくとも１３角度、少なくとも１４角度、少なくとも１５角度、少なくとも１６角度、少なくとも１７角度、少なくとも１８角度、少なくとも１９角度、少なくとも２０角度を用いて実施される。
【0097】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、約０．１ｍｌ／ｍｌ～１．５ｍｌ／分の範囲の流量、又は約０．３ｍｌ／分～約１．０ｍｌ／分の範囲の流量、又は０．３ｍｌ／分～約０．５ｍｌ／分の範囲の流量、又は０．５ｍｌ／分～約１．０ｍｌ／分の範囲の流量で実施される。例えば、ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、約０．１ｍｌ／分、約０．２ｍｌ／分、約０．３ｍｌ／分、約０．４ｍｌ／分、約０．５ｍｌ／分、約０．６ｍｌ／分、約０．７ｍｌ／分、約０．８ｍｌ／分、約０．９ｍｌ／分、約１．０ｍｌ／分、約１．１ｍｌ／分、約１．２ｍｌ／分、約１．３ｍｌ／分、約１．４ｍｌ／分、約１．５ｍｌ／分、約１．６ｍｌ／分、約１．７ｍｌ／分、約１．８ｍｌ／分、約１．９ｍｌ／分、約２．０ｍｌ／分の流量で実施される。
【0098】
組換えＡＡＶ粒子
本明細書で使用されるとき、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、共感染するヘルパーウイルスによって特定の機能が提供される細胞においてのみ成長する。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型は、１３種ある。ＡＡＶの一般的な情報及びレビューについては、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８；及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照することができる。しかしながら、様々な血清型が構造的にも機能的にも遺伝子レベルでさえ非常に近縁であることは、周知であるため、これらの同じ原理を更なるＡＡＶ血清型に適用可能であろうことは、十分に予想される（例えば、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．のＢｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４；及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、いずれのＡＡＶ血清型も、見かけ上、相同なｒｅｐ遺伝子によって媒介される極めてよく類似した複製特性を呈し；及びいずれも、３つの関連するカプシドタンパク質を担持する。その近縁度は、ヘテロ二重鎖解析によって更に示唆され、この解析では、血清型間でのゲノムの長さに沿った広範なクロスハイブリダイゼーション；及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する、末端に存在する類似の自己アニーリングセグメントが明らかとなっている。感染パターンが類似していることも、各血清型の複製機能が同様の調節制御下にあることを示唆している。
本明細書で使用されるとき、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、共感染するヘルパーウイルスによって特定の機能が提供される細胞においてのみ成長する。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型は、１３種ある。ＡＡＶの一般的な情報及びレビューについては、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８；及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照することができる。しかしながら、様々な血清型が構造的にも機能的にも遺伝子レベルでさえ非常に近縁であることは、周知であるため、これらの同じ原理を更なるＡＡＶ血清型に適用可能であろうことは、十分に予想される（例えば、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．のＢｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４；及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、いずれのＡＡＶ血清型も、見かけ上、相同なｒｅｐ遺伝子によって媒介される極めてよく類似した複製特性を呈し；及びいずれも、３つの関連するカプシドタンパク質を担持する。その近縁度は、ヘテロ二重鎖解析によって更に示唆され、この解析では、血清型間でのゲノムの長さに沿った広範なクロスハイブリダイゼーション；及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する、末端に存在する類似の自己アニーリングセグメントが明らかとなっている。感染パターンが類似していることも、各血清型の複製機能が同様の調節制御下にあることを示唆している。
【0099】
「ｒＡＡＶビリオン」、又は「ｒＡＡＶウイルス粒子」、又は「ｒＡＡＶベクター粒子」、又は「ＡＡＶウイルス」は、少なくとも１つのカプシド又はＣａｐタンパク質と、本明細書に記載されるとおりのカプシドに封入されたｒＡＡＶベクターゲノムとで構成されるウイルス粒子を指す。この粒子が異種ポリヌクレオチド（即ちトランス遺伝子など、野生型ＡＡＶゲノム以外の、哺乳類細胞に送達しようとするポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」又は単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。従って、ＡＡＶベクター粒子の作製には、必然的にｒＡＡＶベクターの作製が含まれ、このように、ベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子内に含まれる。
【0100】
治療上有効なＡＡＶ粒子又は治療用ＡＡＶウイルスは、細胞に感染する能力を有し、感染した細胞は、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質等）を（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現することになる。この限りにおいて、治療上有効なＡＡＶ粒子は、種々の特性を有するカプシド又はベクターゲノム（ｖｇ）を有するＡＡＶ粒子を含み得る。例えば、治療上有効なＡＡＶ粒子は、種々の翻訳後修飾を含むカプシドを有し得る。他の例では、治療上有効なＡＡＶ粒子は、種々のサイズ／長さ、プラス鎖又はマイナス鎖配列、種々のフリップ（５’ＩＴＲ）／フロップ（３’ＩＴＲ）ＩＴＲ構成（例えば、５’ＩＴＲ／３’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ／５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ／３’ＩＴＲ、５’ＩＴＲ／５’ＩＴＲ等）、種々の数のＩＴＲ（１つ、２つ、３つ等）又はトランケーションを含むｖｇを有し得る。例えば、ＡＡＶ感染細胞では、５’末端トランケーション及び３’末端トランケーションを有する核酸間でオーバーラップのある相同組換えが起こり、大きいタンパク質をコードする「完全な」核酸が作成され、従って機能性の完全長遺伝子が再構成される。治療上有効なＡＡＶ粒子は、「重い」又は「フルの」カプシドとも称される。
【0101】
例として、治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むＡＡＶビリオン、ＡＡＶウイルス粒子、ＡＡＶベクター粒子又はＡＡＶウイルスを指す「治療用ＡＡＶウイルス」は、インビボでのタンパク質の補充又は補給に使用することができる。「治療用タンパク質」は、対応する内因性タンパク質の活性の損失又は低下を補充又は補償する生物学的活性を有するポリペプチドである。例えば、機能性フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療用タンパク質である。従って、例えば、ＰＫＵに罹患している対象の治療用医薬品に組換えＡＡＶ ＰＡＨウイルスを使用することができる。医薬品は、静脈内（ＩＶ）投与によって投与され得、医薬品の投与により、対象の血流中において、対象の神経伝達物質代謝産物又は神経伝達物質レベルを変化させるのに十分なＰＡＨタンパク質の発現が生じる。所望により、医薬品は、ＡＡＶ ＰＡＨウイルスの投与に付随する任意の肝毒性の予防及び／又は治療のための予防用及び／又は治療用コルチコステロイドも含み得る。予防用又は治療用コルチコステロイド治療を含む医薬品は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍｇ／日又はそれを超えるコルチコステロイドを含み得る。予防用又は治療用コルチコステロイドを含む医薬品は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間又はそれを超える連続期間にわたって投与され得る。ＰＫＵ療法は、所望により、チロシンサプリメントも含み得る。
【0102】
治療的に効果のないＡＡＶ粒子は、細胞に感染する能力がないか、又は治療的に効果のないＡＡＶ粒子に感染した細胞は、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質等）を（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現することができない。治療的に効果のないＡＡＶ粒子は、カプシドの単位用量当たりの有効性を低下させる一因となり得るものであり、重い／フルのカプシドが有効量となるように患者に導入する外来性タンパク質の量を増加させる必要が生じるため、免疫応答のリスクが増加し得る。治療的に効果のないＡＡＶ粒子は、種々の特性を有するカプシド又はｖｇを有するＡＡＶ粒子を含むことができ、「部分的にフルの」カプシド及び空のカプシド又は部分的にフルのカプシドと空のカプシドとの両方を含む「軽い」カプシドと称される。例えば、空のカプシドは、ｖｇを有しないか、又は定量化不能なｖｇ濃度を有する。空のカプシドも種々のカプシド特性を有し得る。いかなる特定の理論にも拘束されることはないが、重い／フルのカプシドは、部分的にフルのカプシド又は空のカプシドとその電荷及び／又は密度が異なる。
【0103】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれ複製及びカプシド形成タンパク質をコードする遺伝子である。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、現在まで調査がなされた全てのＡＡＶ血清型に見出されており、本明細書及び引用文献に記載されている。野生型ＡＡＶでは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、概して、ウイルスゲノム中で互いに隣接して見られ（即ち、これらは、隣接又は重複する転写単位として一体に「カップルになっている」）、これらは、概して、ＡＡＶ血清型間で保存されている。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、個別に且つまとめて「ＡＡＶパッケージング遺伝子」とも称される。ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐ及びアデノヘルパー機能の存在下でＡＡＶベクターをパッケージングする能力及び標的細胞受容体に結合する能力を有するＣａｐタンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、特定のＡＡＶ血清型に由来するアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質をコードする。
【0104】
ＡＡＶの作製に用いられるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。概して、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで高い相同性のあるゲノム配列を有し、類似した遺伝機能の組を提供し、本質的に物理的及び機能的に均等なビリオンを産生し、且つ事実上同一の機構によって複製及び集合する。ＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の考察について。（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９９７）ｖｏｌ．７１，ｐｐ．６８２３－６８３３；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８３）ｖｏｌ．４５，ｐｐ．５５５－５６４；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９９９）ｖｏｌ．７３，ｐｐ．１３０９－１３１９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９９８）ｖｏｌ．７２，ｐｐ．３０９－３１９；及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（２０００）ｖｏｌ．７４，ｐｐ．８６３５－８６４７を参照されたい）。
【0105】
既知のＡＡＶ血清型は、いずれもゲノム構成が極めてよく類似している。ＡＡＶのゲノムは、約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満の線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。非構造Ｒｅｐタンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質のユニークなコードヌクレオチド配列に逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接する。ＶＰタンパク質がカプシドを形成する。末端１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二重鎖が形成され得るように構成される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役割を果たす。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ ５２及びＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。開示されるベクターに用いられるＩＴＲは、関連するｃａｐ遺伝子と同じ血清型に対応し得るか又は異なり得る。特に好ましい実施形態において、開示されるベクターに用いられるＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型に対応し、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ５血清型に対応する。
【0106】
一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、Ｓｆ９又はＨＥＫ細胞など、特定の細胞型における発現のため、発現制御配列に作動可能に連結される。本明細書では、昆虫宿主細胞又は哺乳類宿主細胞で外来性遺伝子を発現させるための当業者に公知の技法を用いることができる。分子操作の方法論及び昆虫細胞におけるポリペプチドの発現については、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８６）Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ（１９９１）Ｉｎ Ｐｒｏｋｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７－１５２；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ（１９９２）Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ（１９９２）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．（１９９５）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３９；米国特許第４，７４５，０５１号明細書；米国特許出願公開第２００３１４８５０６号明細書；及び国際公開第０３／０７４７１４号パンフレット（これらの全ては、全体として参照により援用される）に記載されている。ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写に特に好適なプロモーターは、例えば、多角体プロモーターである。しかしながら、昆虫細胞で活性のある他のプロモーターが当技術分野において公知であり、例えばｐ１０、ｐ３５又はＩＥ－１プロモーター及び上記の参考文献に記載される更なるプロモーターも企図される。
【0107】
異種タンパク質を発現させるための昆虫細胞の使用について、ベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクターなどの核酸をかかる細胞に導入する方法及びかかる細胞を培養下に維持する方法と同様に十分に裏付けられている（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ Ｊ（１９９５）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）ｖｏｌ．６３，ｐｐ．３８２２－３８２８；Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）ｖｏｌ．８８，ｐｐ．４６４６－４６５０；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９９２）ｖｏｌ．６６，ｐｐ．６９２２－６９３０；Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（１９９６）ｖｏｌ．２１９，ｐｐ．３７－４４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（２０００）ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．３８２－３９３；及び米国特許第６，２０４，０５９号明細書を参照されたい）。一部の実施形態では、昆虫細胞においてＡＡＶをコードする核酸コンストラクトは、昆虫細胞適合性ベクターである。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、本明細書で使用されるとき、昆虫又は昆虫細胞の増殖性形質転換又はトランスフェクションの能力を有する核酸分子を指す。例示的な生物学的ベクターには、プラスミド、線状核酸分子及び組換えウイルスが含まれる。それが昆虫細胞適合性である限り、任意のベクターを用いることができる。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫細胞にベクターが永久的に存在する必要はなく、一過性のエピソームベクターも包含される。ベクターは、公知の任意の手段、例えば細胞の化学的処理、電気穿孔又は感染によって導入することができる。一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター又はプラスミドである。より好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスであり、即ち、コンストラクトは、バキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びその使用方法については、昆虫細胞の分子操作に関する上記の引用文献に記載されている。
【0108】
バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープ型ＤＮＡウイルスであり、その２つのメンバーは、細胞培養下での組換えタンパク質の産生について周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、環状二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有し、特定の細胞への大型ゲノム内容物の送達が可能となるように操作することができる。ベクターとして使用されるウイルスは、概して、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多カプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）又はカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（Ｂｍ）ＮＰＶである）。
【0109】
バキュロウイルスは、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞を感染させるためによく使用される。詳細には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号明細書；Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）；欧州特許第１２７，８３９号明細書；欧州特許第１５５，４７６号明細書；Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）；Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）；Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ（１９８７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）に記載されるとおり達成することができる。タンパク質産生に使用することのできる多くのバキュロウイルス株及び変異体並びに対応する許容性昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ（１９８８），Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）に記載されている。
【0110】
組換えＡＡＶの作製方法
本開示は、昆虫又は哺乳類細胞において組換えＡＡＶを作製するための材料及び方法を提供する。一部の実施形態において、ウイルスコンストラクトは、プロモーターと、１つ以上の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にする、プロモーターの下流にある制限部位とを更に含み、ここで、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置する。一部の実施形態において、ウイルスコンストラクトは、制限部位の下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に転写後調節エレメントを更に含む。一部の実施形態において、ウイルスコンストラクトは、制限部位に挿入され、且つプロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを更に含み、このポリヌクレオチドは、目的のタンパク質のコード領域を含む。当業者が理解するであろうとおり、本方法では、組換えＡＡＶを作製するためのウイルスコンストラクトとして、本願に開示されるＡＡＶベクターの任意の１つを使用することができる。
本開示は、昆虫又は哺乳類細胞において組換えＡＡＶを作製するための材料及び方法を提供する。一部の実施形態において、ウイルスコンストラクトは、プロモーターと、１つ以上の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にする、プロモーターの下流にある制限部位とを更に含み、ここで、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置する。一部の実施形態において、ウイルスコンストラクトは、制限部位の下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に転写後調節エレメントを更に含む。一部の実施形態において、ウイルスコンストラクトは、制限部位に挿入され、且つプロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを更に含み、このポリヌクレオチドは、目的のタンパク質のコード領域を含む。当業者が理解するであろうとおり、本方法では、組換えＡＡＶを作製するためのウイルスコンストラクトとして、本願に開示されるＡＡＶベクターの任意の１つを使用することができる。
【0111】
一部の実施形態において、ヘルパー機能は、アデノウイルス又はバキュロウイルスヘルパー遺伝子を含む１つ以上のヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスによって提供される。アデノウイルス又はバキュロウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例としては、限定はされないが、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡが挙げられ、これらは、ＡＡＶパッケージングのためのヘルパー機能を提供することができる。
【0112】
ＡＡＶのヘルパーウイルスは、当技術分野において公知であり、例えばアデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）及びヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスが挙げられる。ＡＡＶのヘルパーウイルスの例としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号明細書（この開示は、参照により本明細書に援用される）に記載されるＳＡｄＶ－１３ヘルパーウイルス及びＳＡｄＶ－１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）が挙げられる。当業者は、ＡＡＶに十分なヘルパー機能を提供することができるＡＡＶの任意のヘルパーウイルス又はヘルパープラスミドを本明細書で使用し得ることを理解するであろう。
【0113】
一部の実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、プラスミドに存在する。このプラスミドは、ｃａｐ遺伝子と同じ血清型に対応しても又はしなくてもよいＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を更に含み得る。本明細書では、組換えＡＡＶを作製するために、任意のＡＡＶ血清型（限定はされないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３及びこれらの任意の変異体を含む）からのｃａｐ遺伝子及び／又はｒｅｐ遺伝子を使用することができる。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３又はこれらの変異体のカプシドをコードする。
【0114】
一部の実施形態において、昆虫又は哺乳類細胞に、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルス、ウイルスコンストラクト及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトすることができ；及びコトランスフェクション後の様々な時点で組換えＡＡＶウイルスを回収することができる。例えば、組換えＡＡＶウイルスは、コトランスフェクション後約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間又はこれらの２つの時点のいずれかの間の時点で回収することができる。
【0115】
組換えＡＡＶは、感染性組換えＡＡＶの作製に好適である、当技術分野において公知の任意の従来方法を用いて作製することもできる。一部の例では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子作製に必要な成分の一部を安定に発現する昆虫又は哺乳類細胞を用いることによって作製され得る。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）を細胞のゲノムに組み込み得る。次に、昆虫又は哺乳類細胞をヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス又はバキュロウイルス）並びに５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ（及び必要に応じて異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターと共感染することができる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、組換えＡＡＶの大規模作製に好適であることである。別の非限定的な例として、パッケージング細胞へのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の導入には、プラスミドよりむしろ、アデノウイルス又はバキュロウイルスが使用され得る。更に別の非限定的な例として、５’及び３’ＡＡＶ ＬＴＲを含有するウイルスベクター並びにｒｅｐ－ｃａｐ遺伝子が両方とも産生株細胞のＤＮＡに安定に組み込まれ得、ヘルパー機能が野生型アデノウイルスによって提供されることにより、組換えＡＡＶが作製され得る。
【0116】
ＡＡＶ作製に使用される細胞型
開示されるＡＡＶベクターを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ又は生物学的産物の作製が可能であり、且つ培養下に維持することのできる任意の無脊椎動物細胞型を使用して作製することができる。例えば、使用される昆虫細胞株は、ＳＦ９、ＳＦ２１、ＳＦ９００＋などのスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエ細胞株、カ細胞株、例えばヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株、家畜カイコ細胞株、例えばカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）細胞株、Ｈｉｇｈ ５細胞などのイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞株又はアスカラファ・オドラタ（Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ）細胞株などの鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞株からのものであり得る。好ましい昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ ５、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５及びＡｏ３８を含め、バキュロウイルスに感染し易い昆虫種からの細胞である。
開示されるＡＡＶベクターを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ又は生物学的産物の作製が可能であり、且つ培養下に維持することのできる任意の無脊椎動物細胞型を使用して作製することができる。例えば、使用される昆虫細胞株は、ＳＦ９、ＳＦ２１、ＳＦ９００＋などのスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエ細胞株、カ細胞株、例えばヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株、家畜カイコ細胞株、例えばカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）細胞株、Ｈｉｇｈ ５細胞などのイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞株又はアスカラファ・オドラタ（Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ）細胞株などの鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞株からのものであり得る。好ましい昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ ５、Ｓｆ９、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５及びＡｏ３８を含め、バキュロウイルスに感染し易い昆虫種からの細胞である。
【0117】
バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープ型ＤＮＡウイルスであり、その２つのメンバーは、細胞培養下での組換えタンパク質の産生について周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、環状二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有し、特定の細胞への大型ゲノム内容物の送達が可能となるように操作することができる。ベクターとして使用されるウイルスは、概して、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多カプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）又はカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（Ｂｍ－ＮＰＶ）である（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
【0118】
バキュロウイルスは、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞を感染させるためによく使用される。詳細には、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号明細書；Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８６）；欧州特許第１２７，８３９号明細書；欧州特許第１５５，４７６号明細書；Ｖｌａｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）；Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）；Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ（１９８７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）に記載されるとおり達成することができる。タンパク質産生に使用することのできる多くのバキュロウイルス株及び変異体並びに対応する許容性昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８６）；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ（１９８５）及びＭｃＫｅｎｎａ（１９８９）に記載されている。
【0119】
別の態様において、本開示の方法は、ＡＡＶの複製又は生物学的産物の産生が可能であり、且つ培養下に維持することのできる任意の哺乳類細胞型で実施する。使用される好ましい哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ １０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５細胞であり得る。
【0120】
組換えレンチウイルス粒子
本開示は、ヒトＣＤ３４＋細胞などの造血幹細胞の形質導入を可能にする、ウイルスエンベロープタンパク質と組み合わせたレンチウイルス遺伝子療法ベクターを含む組換えウイルスを提供する。一実施形態において、本開示は、レラブドウイルスエンベロープタンパク質の結合ドメインを含む異種エンベロープにパッケージングされたレンチウイルス遺伝子ベクターで構成される組換えレンチウイルス又はそれに由来するアミノ酸配列を提供する。開示されるレンチウイルスベクターは、最低でも、レンチウイルス５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列、宿主細胞への送達用分子及びレンチウイルス３’ＬＴＲ配列の機能性の一部分である。所望により、ベクターは、Ψ（プサイ）カプシド形成配列、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列又は均等な若しくは同様の機能を提供する配列を更に含み得る。宿主細胞への送達のためベクターで運ばれる異種分子は、限定なしに、ポリペプチド、タンパク質、酵素、炭水化物、化学的部分又は核酸分子であって、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含み得る核酸分子を含む任意の所望の物質であり得る。一実施形態において、異種分子は、例えば、突然変異遺伝子の修正のために、ヒト染色体に特定の遺伝子修飾を導入する核酸分子である。別の望ましい実施形態において、異種分子は、所望のタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素又は別の産物をコードする核酸配列と、コードされる産物の宿主細胞での転写及び／又は翻訳を指示し、且つコードされる産物の宿主細胞での発現を可能にする調節配列とを含むトランス遺伝子を含む。好適な産物及び調節配列は、以下で更に詳細に考察する。しかしながら、ベクターで運ばれ、開示されるウイルスによって送達される異種分子の選択は、本開示の限定ではない。
本開示は、ヒトＣＤ３４＋細胞などの造血幹細胞の形質導入を可能にする、ウイルスエンベロープタンパク質と組み合わせたレンチウイルス遺伝子療法ベクターを含む組換えウイルスを提供する。一実施形態において、本開示は、レラブドウイルスエンベロープタンパク質の結合ドメインを含む異種エンベロープにパッケージングされたレンチウイルス遺伝子ベクターで構成される組換えレンチウイルス又はそれに由来するアミノ酸配列を提供する。開示されるレンチウイルスベクターは、最低でも、レンチウイルス５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列、宿主細胞への送達用分子及びレンチウイルス３’ＬＴＲ配列の機能性の一部分である。所望により、ベクターは、Ψ（プサイ）カプシド形成配列、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列又は均等な若しくは同様の機能を提供する配列を更に含み得る。宿主細胞への送達のためベクターで運ばれる異種分子は、限定なしに、ポリペプチド、タンパク質、酵素、炭水化物、化学的部分又は核酸分子であって、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含み得る核酸分子を含む任意の所望の物質であり得る。一実施形態において、異種分子は、例えば、突然変異遺伝子の修正のために、ヒト染色体に特定の遺伝子修飾を導入する核酸分子である。別の望ましい実施形態において、異種分子は、所望のタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素又は別の産物をコードする核酸配列と、コードされる産物の宿主細胞での転写及び／又は翻訳を指示し、且つコードされる産物の宿主細胞での発現を可能にする調節配列とを含むトランス遺伝子を含む。好適な産物及び調節配列は、以下で更に詳細に考察する。しかしながら、ベクターで運ばれ、開示されるウイルスによって送達される異種分子の選択は、本開示の限定ではない。
【0121】
レンチウイルスベクター及び組換えウイルスの構築のため、本明細書に記載されるレンチウイルスエレメントを選択する際、任意の好適なレンチウイルス及び任意の好適なレンチウイルス血清型又は株からの配列を容易に選択し得る。好適なレンチウイルスとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。本明細書に提供される例では、ＨＩＶに由来するベクターの使用を説明している。しかしながら、ＦＩＶ及び非ヒト起源の他のレンチウイルスも特に望ましいものであり得る。開示されるコンストラクトに使用される配列は、学術的な、非営利の（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）又は商業的なレンチウイルス供給源に由来し得る。あるいは、配列は、公的にアクセス可能な電子データベースに掲載されている配列を含め、公開されているウイルス配列を参照して、遺伝子工学技術を用いて組換えで作製されるか又は従来技術を用いて合成してもよい（例えば、Ｇ．Ｂａｒｏｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＴＨＥ ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＡＮＡＬＹＳＩＳ，ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ＆ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３－２８５（１９８０））。
【0122】
レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクター中に存在するゲノムの逆転写を可能にし、ｃＤＮＡを生成し、且つＲＮＡ配列の発現を可能にするのに十分な量のレンチウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列を含む。好適には、これらの配列は、ベクターの５’末端の最も端に位置する５’ＬＴＲ配列及びベクターの３’末端の最も端に位置する３’ＬＴＲ配列の両方を含む。これらのＬＴＲ配列は、選択のレンチウイルス又は交差反応性レンチウイルスにとって天然のインタクトなＬＴＲであり得るか、又はより望ましくは修飾されたＬＴＲであり得る。
【0123】
レンチウイルスＬＴＲに対する様々な修飾が記載されている。１つの特に望ましい修飾は、Ｈ．Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：８１５０－８１５７（Ｏｃｔ．１９９８）にＨＩＶについて記載されるなどの自己不活性化ＬＴＲである。これらのＨＩＶ ＬＴＲでは、５’ＬＴＲのＵ３領域が強力な異種プロモーター（例えば、ＣＭＶ）に置き換えられ、且つ３’ＬＴＲのＵ３領域に１３３ｂｐの欠失が作られる。従って、逆転写すると、３’ＬＴＲの欠失が５’ＬＴＲに移り、ＬＴＲの転写不活性化が起こる。ＨＩＶの完全ヌクレオチド配列は、公知であり、Ｌ．Ｒａｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．３１３（６０００）：２７７－２８４（１９８５）を参照されたい。更に別の好適な修飾は、Ｕ３領域の完全欠失を伴うものであり、従って、５’ＬＴＲは、強力な異種プロモーター、Ｒ領域及びＵ５領域のみを含み；及び３’ＬＴＲは、ポリＡを含む領域であるＲ領域のみを含むことになる。更に別の実施形態では、５’ＬＴＲのＵ３及びＵ５の両方の領域の欠失が行われ、３’ＬＴＲがＲ領域のみを含む。これら及び他の好適な修飾は、ＨＩＶ及び／又は選択された別のレンチウイルスの同等の領域に当業者によって容易に操作され得る。
【0124】
所望により、レンチウイルスベクターは、５’レンチウイルスＬＴＲ配列の下流にΨ（プサイ）パッケージングシグナル配列を含み得る。所望により、ＬＴＲ配列とΨ配列の直ちに上流との間に１つ以上のスプライス供与部位が位置し得る。本開示によれば、ｇａｇ配列とのオーバーラップを除去し、且つパッケージングを向上させるため、Ψ配列が修飾され得る。例えば、ｇａｇコード配列の上流に終止コドンが挿入され得る。Ψ配列に対する他の好適な修飾は、当業者によって操作され得る。かかる修飾は、本開示の限定ではない。
【0125】
１つの好適な実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＬＴＲ及びΨ配列の下流に位置するレンチウイルスＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列を含む。好適には、ＲＲＥ配列は、最低でも約２７５～約３００ｎｔの天然レンチウイルスＲＲＥ配列及びより好ましくは少なくとも約４００～約４５０ｎｔのＲＲＥ配列を含む。所望により、ＲＲＥ配列は、ｇａｇ／ｐｏｌの発現及び細胞核へのその輸送に役立つ別の好適なエレメントによって置換され得る。例えば、他の好適な配列としては、メーソン・ファイザーウイルスのＣＴエレメント又はウッドチャック肝炎ウイルス調節後エレメント（ＷＰＲＥ）を挙げることができる。あるいは、ｇａｇ及びｇａｇ／ｐｏｌポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく核局在化が修飾されるように、ｇａｇ及びｇａｇ／ｐｏｌをコードする配列を変化させ得る。好適な方法が当業者に容易に明らかであろう。
【0126】
細胞及び宿主において所望の遺伝子産物を得るために転写、翻訳及び／又は発現が必要なトランス遺伝子又は別の核酸配列の設計には、コードされる産物の発現を促進するため目的のコード配列に作動可能に連結される適切な配列が含まれ得る。「作動可能に連結」された配列には、目的の核酸配列と連続する発現制御配列と、目的の核酸配列をトランスで又は離れて制御する役割を果たす発現制御配列との両方が含まれる。
【0127】
発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を亢進させる配列（即ちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を亢進させる配列；及び必要に応じてタンパク質分泌を亢進させる配列が含まれる。多くの発現制御配列 － 天然、構成的、誘導性及び／又は組織特異的 － が当技術分野において公知であり、所望の発現の種類に応じて遺伝子の発現をドライブするために利用され得る。真核細胞について、発現制御配列は、典型的には、プロモーター、エンハンサー、例えば免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス等に由来するものなど、及びスプライス供与・受容部位を含み得るポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、概して、トランス遺伝子配列の後ろ、３’レンチウイルスＬＴＲ配列の前に挿入される。最も好適には、トランス遺伝子又は他の分子を担持するレンチウイルスベクターは、ＬＴＲ配列を提供するレンチウイルス、例えばＨＩＶのポリＡを含む。しかしながら、開示されるコンストラクトに含めるために他のポリＡ供給源を容易に選択し得る。一実施形態において、ウシ成長ホルモンポリＡが選択される。レンチウイルスベクターは、望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列とトランス遺伝子との間に位置したイントロンも含み得る。１つの可能なイントロン配列は、ＳＶ－４０にも由来し、ＳＶ－４０ Ｔイントロン配列と称される。ベクターに使用し得る別のエレメントは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写物から２つ以上のポリペプチドを産生するために使用される。ＩＲＥＳ配列を使用すれば、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生し得る。これら及び他のよく使用されるベクターエレメントの選択は、従来どおりであり、多くのかかる配列が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．及びそこに引用される、例えば３．１８～３．２６及び１６．１７～１６．２７頁にある文献並びにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）。
【0128】
一実施形態では、高度に構成的な発現が所望されることになる。有用な構成的プロモーターの例示としては、限定なしに、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（所望によりＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（所望によりＣＭＶエンハンサーとともに）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦｌαプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。外因的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターも有用であり、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６－３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２－５１８（１９９８）も参照されたい）、ＲＵ４８６誘導性システム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２－４４１（１９９７））及びラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５－２８７２（１９９７））が挙げられる。これに関連して有用であり得る他の種類の誘導性プロモーターは、具体的な生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって又は複製細胞においてのみ調節されるものである。
【0129】
別の実施形態では、トランス遺伝子のための天然プロモーターが使用されることになる。天然プロモーターは、トランス遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきことが所望されるときに好ましいものとなり得る。天然プロモーターは、トランス遺伝子の発現が時間的若しくは発生的に、又は組織特異的な方式において、又は特定の転写刺激に応答して調節される必要があるときに使用され得る。更なる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋコンセンサス配列など、他の天然発現制御エレメントも天然の発現を模倣するために使用され得る。トランス遺伝子の別の実施形態には、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたトランス遺伝子が含まれる。
【0130】
全ての発現制御配列が、可能な全てのトランス遺伝子を発現するように等しく良好に機能するとは限らない。しかしながら、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、これらの発現制御配列間で選択を行い得る。当業者により、本願によって提供される指針を用いて、好適なプロモーター／エンハンサー配列が選択され得る。かかる選択は、ルーチンの事項であり、分子又はコンストラクトの限定ではない。例えば、目的のコード配列に作動可能に連結され、トランス遺伝子、ベクター及び開示される組換えウイルスに挿入され得る１つ以上の発現制御配列を選択し得る。本明細書に教示されるか又は当技術分野において教示されるとおりのレンチウイルスベクターのパッケージング方法の１つに従った後、好適な細胞をインビトロ又はインビボで感染させ得る。細胞中のベクターのコピー数は、サザンブロッティング又は定量的ＰＣＲによってモニタされ得る。ＲＮＡ発現レベルは、ノーザンブロッティング又は定量的ＲＴ－ＰＣＲによってモニタし得る。発現レベルは、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ又は遺伝子産物の生物学的活性試験によってモニタされ得る。従って、トランス遺伝子によってコードされる具体的な産物に特定の発現制御配列が好適であるかどうかを容易にアッセイし、最適な発現制御配列を選定し得る。あるいは、例えば炭水化物、ポリペプチド、ペプチド等、送達する分子の発現が不要である場合、発現制御配列がレンチウイルスベクター又は他の分子の一部を形成する必要はない。
【0131】
所望により、レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知のものなど、他のレンチウイルスエレメントを含み得、その多くは、レンチウイルスパッケージング配列との関連で以下に記載される。しかしながら、注目すべきことに、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスエンベロープタンパク質をアセンブルする能力を欠いている。かかるレンチウイルスベクターは、ＲＲＥに対応するエンベロープ配列の一部分を含むが、他のエンベロープ配列を欠いているものであり得る。しかしながら、より望ましくは、複製能のあるウイルスを生じさせる組換えイベントが起こる可能性を実質的に排除するため、レンチウイルスベクターは、いずれの機能性レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする配列も欠いている。
【0132】
従って、開示されるレンチウイルスベクターは、最低でも、レンチウイルス５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列と、（所望により）Ψ（プサイ）カプシド形成配列と、宿主細胞への送達用分子と、レンチウイルス３’ＬＴＲ配列の機能性の一部分とを含む。望ましくは、ベクターは、ＲＲＥ配列又はその機能均等物を更に含む。好適には、レンチウイルスベクターは、ウイルスへのパッケージングのため、任意の好適な手段、例えばレンチウイルスベクターを含む「ネイキッド」ＤＮＡ分子のトランスフェクション又は上記に記載した他のレンチウイルスエレメント及び調節エレメント並びにベクターに一般的に見られる任意の他のエレメントを含み得るベクターによって宿主細胞に送達される。「ベクター」とは、それに担持された配列又は分子を細胞に送達する能力を有する任意の好適な媒体であり得る。例えば、ベクターは、限定なしに、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス等の中から容易に選択し得る。レンチウイルスを作製する本開示の方法における使用には、プラスミドが特に望ましい。選択されたベクターは、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技法、高速ＤＮＡコートペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含め、任意の好適な方法によって送達され得る。本開示によれば、レンチウイルスベクターは、以下に記載される方法を用いて異種（即ち非レンチウイルス）エンベロープにパッケージングされて、組換えウイルスを形成する。
【0133】
ＬＶエンベロープタンパク質
レンチウイルスベクターがパッケージングされるエンベロープは、好適には、レンチウイルスエンベロープタンパク質を含まず、少なくとも１つの異種エンベロープタンパク質の結合ドメインを含む。一実施形態において、エンベロープは、全体がラブドウイルス糖タンパク質に由来し得るか、又は第２のウイルスのエンベロープタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドとインフレームで融合した、結合ドメインを含むラブドウイルスエンベロープの断片（ラブドウイルスポリペプチド若しくはペプチド）を含み得る。代替形態では、エンベロープは、以下で考察するＣＤ３４＋細胞形質導入決定基に由来する配列を含むウイルスエンベロープタンパク質を含み得る。別の実施形態では、エンベロープは、全体がアレナウイルス糖タンパク質又はその断片に由来し得る。
レンチウイルスベクターがパッケージングされるエンベロープは、好適には、レンチウイルスエンベロープタンパク質を含まず、少なくとも１つの異種エンベロープタンパク質の結合ドメインを含む。一実施形態において、エンベロープは、全体がラブドウイルス糖タンパク質に由来し得るか、又は第２のウイルスのエンベロープタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドとインフレームで融合した、結合ドメインを含むラブドウイルスエンベロープの断片（ラブドウイルスポリペプチド若しくはペプチド）を含み得る。代替形態では、エンベロープは、以下で考察するＣＤ３４＋細胞形質導入決定基に由来する配列を含むウイルスエンベロープタンパク質を含み得る。別の実施形態では、エンベロープは、全体がアレナウイルス糖タンパク質又はその断片に由来し得る。
【0134】
エンベロープタンパク質又はそのポリペプチド若しくはペプチド（例えば、結合ドメイン）をコードする配列を提供するラブドウイルスは、ベシクロウイルス亜科の任意の好適な血清型、例えばＶＳＶ－Ｇ（インディアナ）、モレトン（Ｍｏｒｒｅｔｏｎ）、マラバ（Ｍａｒａｂａ）、コカル（Ｃｏｃａｌ）、アラゴア（Ａｌａｇｏａ）、カラジャス（Ｃａｒａｊａｓ）、ＶＳＶ－Ｇ（アリゾナ）、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）、ＶＳＶ－Ｇ（ニュージャージー）又はピリー（Ｐｉｒｙ）に由来し得る。エンベロープタンパク質をコードする配列は、ウイルス供給源への遺伝子工学技術の適用、化学合成技法、組換え産生又はこれらの組み合わせを含め、任意の好適な手段によって入手され得る。所望のウイルス配列の好適な供給源は、当技術分野において周知であり、種々の学術的な、非営利の、商業的な供給源及び電子データベース経由が挙げられる。配列を入手する方法は、本開示の限定ではない。望ましい一実施形態において、異種エンベロープ配列は、ヒトＣＤ３４＋細胞の形質導入を媒介することができる全てのエンベロープタンパク質に見られるが、ヒトＣＤ３４＋細胞の形質導入を媒介しないものに見られない３１アミノ酸ヒトＣＤ３４＋細胞形質導入決定基に由来する。
【0135】
従って、一実施形態において、エンベロープタンパク質は、インタクトなラブドウイルス糖タンパク質である。あるいは、３１アミノ酸ヒトＣＤ３４＋細胞形質導入決定基の範囲内に位置する、ラブドウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合ドメインを最低でも含む、選択されたラブドウイルスの断片を利用することが望ましい場合もある。好適には、このラブドウイルスタンパク質断片は、第２の非レンチウイルスエンベロープタンパク質又はその断片に直接又は間接的にリンカーを介して融合される。この融合タンパク質は、得られるエンベロープタンパク質のパッケージング、収率及び／又は精製の向上に望ましいものであり得る。第２の非レンチウイルスエンベロープタンパク質又はその断片は、最低でも膜ドメインを含む。望ましい一実施形態では、３１アミノ酸ヒトＣＤ３４＋細胞形質導入決定基のトランケート型断片がＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質に融合される。本開示にかかるなおも他の融合（キメラ）タンパク質は、当業者により作成され得る。
【0136】
別の実施形態において、エンベロープタンパク質は、インタクトなアレナウイルスエンベロープタンパク質又はアレナウイルスエンベロープ糖タンパク質の結合ドメインを最低でも含む、選択されたアレナウイルスエンベロープタンパク質の断片である。好適には、このアレナウイルスタンパク質断片は、第２の非レンチウイルスエンベロープタンパク質又はその断片に直接又は間接的にリンカーを介して融合される。この融合タンパク質は、得られるエンベロープタンパク質のパッケージング、収率及び／又は精製の向上に望ましいものであり得る。第２の非レンチウイルスエンベロープタンパク質又はその断片は、最低でも膜ドメインを含む。
【0137】
アレナウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）に対する防御中和抗体免疫は、最小限であり、即ち、感染によって生じる再感染に対する抗体媒介性防御は、たとえあったとしても最小限であることになる。この特徴により、アレナウイルスエンベロープタンパク質を含むベクターでは、繰り返し免疫することが可能になる。ヒト集団では、アレナウイルスに対する既存の免疫は、低いか又は無視できる程度である。加えて、アレナウイルスは、概して非細胞溶解性であり（細胞破壊性でない）、一定の条件下では、動物において疾患を誘発することなく長期抗原発現を維持し得る。
【0138】
アレナウイルスエンベロープタンパク質は、ラッサウイルス、ルナウイルス、ルヨウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、モバラウイルス、モペイアウイルス、イッピーウイルス、アマパリウイルス、フレクサルウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラチノウイルス、マチュポウイルス、オリベロスウイルス、パラナウイルス、ピチンデウイルス、ピリタルウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、タミアミウイルス、ベアキャニオンウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルス、メリノウォークウイルス、メネクレ（Ｍｅｎｅｋｒｅ）ウイルス、モロゴロウイルス、グバグルーブ（Ｇｂａｇｒｏｕｂｅ）ウイルス、コドコ（Ｋｏｄｏｋｏ）ウイルス、クサマウス属（Ｌｅｍｎｉｓｃｏｍｙｓ）ウイルス、コビトハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｉｎｕｔｏｉｄｅｓ）ウイルス、ランク（Ｌｕｎｋ）ウイルス、ジアロ（Ｇｉａｒｏ）ウイルス及びウェンチョウ（Ｗｅｎｚｈｏｕ）ウイルス、パタワ（Ｐａｔａｗａ）ウイルス、パンパウイルス、トントクリークウイルス、アルパワヨウイルス、カタリーナウイルス、スキナータンク（Ｓｋｉｎｎｅｒ Ｔａｎｋ）ウイルス、レアル・デ・カトルセウイルス、ビッグブラッシータンクウイルス、カタリーナウイルス及びオコソコアウトラ・デ・エスピノサウイルスからのものであり得る。
【0139】
組換えレンチウイルスの作製方法
組換えレンチウイルスは、複製欠損であり、従って、このウイルスは、必要な構成成分が単一の細胞に提供されている「プロデューサー細胞株」で作製される。本明細書で使用されるとき、用語「プロデューサー細胞株」は、パッケージング細胞株と、パッケージングシグナルを含むトランスファーベクターコンストラクトとを含む、組換えレトロウイルス粒子の産生能を有する細胞株を指す。感染性ウイルス粒子及びウイルスストック溶液の作製は、従来技術を用いて行われ得る。ウイルスストック溶液の調製方法は、当技術分野において公知であり、例えばＹ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８－６３３及びＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０－５１１３によって解説されている。感染性ウイルス粒子は、従来技術を用いてパッケージング細胞から回収され得る。例えば、感染粒子は、当技術分野において公知のとおり、細胞溶解又は細胞培養液の上清の回収によって回収することができる。所望により、回収されたウイルス粒子は、必要に応じて精製され得る。好適な精製技法は、当業者に周知である。
組換えレンチウイルスは、複製欠損であり、従って、このウイルスは、必要な構成成分が単一の細胞に提供されている「プロデューサー細胞株」で作製される。本明細書で使用されるとき、用語「プロデューサー細胞株」は、パッケージング細胞株と、パッケージングシグナルを含むトランスファーベクターコンストラクトとを含む、組換えレトロウイルス粒子の産生能を有する細胞株を指す。感染性ウイルス粒子及びウイルスストック溶液の作製は、従来技術を用いて行われ得る。ウイルスストック溶液の調製方法は、当技術分野において公知であり、例えばＹ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８－６３３及びＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０－５１１３によって解説されている。感染性ウイルス粒子は、従来技術を用いてパッケージング細胞から回収され得る。例えば、感染粒子は、当技術分野において公知のとおり、細胞溶解又は細胞培養液の上清の回収によって回収することができる。所望により、回収されたウイルス粒子は、必要に応じて精製され得る。好適な精製技法は、当業者に周知である。
【0140】
プロデューサー細胞株の作成には、３つ又は４つの別個のプラスミドシステムが使用される。４プラスミドシステムは、３つのヘルパープラスミドと、１つのトランスファーベクタープラスミドとを含む。例えば、Ｇａｇ－Ｐｏｌ発現カセットは、構造タンパク質及び酵素をコードする。別のカセットは、ベクターゲノムの核外移行に必要なアクセサリータンパク質であるＲｅｖをコードする。第３のカセットは、ベシクロウイルス又はアレナウイルスエンベロープタンパク質など、標的細胞へのレンチウイルス粒子の侵入を可能にする異種エンベロープタンパク質をコードする。トランスファーベクターカセットは、ベクターゲノムそれ自体をコードするものであり、粒子への取り込みのためのシグナルと、トランス遺伝子発現をドライブする内部プロモーターとを担持している。トランスファーベクターは、異種トランス遺伝子を担持し、標的細胞、例えばＣＤ３４＋細胞に移入される唯一の遺伝子材料である。３プラスミドシステムは、ｇａｇ－ｐｏｌ及びエンベロープ機能をコードする２つのヘルパープラスミドと、トランスファーベクターカセットとを含む。Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．３：１６０１７，２０１６を参照されたい。
【0141】
これらの複数の構成的発現カセットは、プロデューサー細胞に一過性又は安定にトランスフェクトされる。一実施形態において、必要な構成成分が持続的且つ構成的に産生されるプロデューサー細胞株である。プロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２９３ＦＴ、２９３ＳＦ－３Ｆ６、ＳＯＤｋ１細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＨｔＴＡ－１細胞、ＳＴＡＲ細胞、ＲＤ－ＭｏｌＰａｃｋ細胞、Ｗｉｎ－Ｐａｃ、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣＳ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞及び２１１Ａ細胞であり得る。市販のレンチウイルスパッケージングシステム、例えばＬｅｎｔｉＳｕｉｔｅキット（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｌｅｎｔｉ－Ｘパッケージングシステム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、ＶｉｒａＳａｆｅパッケージングシステム（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＶｉｒｏＰｏｗｅｒレンチウイルスパッケージングミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＭｉｓｓｉｏｎレンチウイルスパッケージングミックス（Ｍｉｌｌａｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）がある。
【0142】
別の実施形態において、プロデューサー細胞株は、パッケージング機能を発現させるための誘導性発現カセットを含む。例えば、テトラサイクリン誘導性発現システムを用いて、ＴＥＴ－Ｏｆｆシステム及びＴＥＴ－Ｏｎシステムを含む産生株細胞が作成される。加えて、エクジソン誘導性システムが使用される。
【0143】
レンチウイルスの作製は、ペトリ皿、Ｔ－フラスコ、マルチトレイシステム（Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋｓ）又はＨＹＰＥＲＦｌａｓｋで成長させる表面接着細胞を使用して実施される。最適なコンフルエンスで（５０％未満）、従来のリン酸Ｃａプロトコル又は最近になって開発されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法のいずれかを用いて細胞をトランスフェクトする。使用される他の効率的なカチオン性トランスフェクション剤としては、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ｆｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ＬＶ－ＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ）又は２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）が挙げられる。
【0144】
あるいは、レンチウイルスの作製は、振盪フラスコ、ガラスバイオリアクター、ステンレス鋼バイオリアクター、ｗａｖｅバッグ及びディスポーザブル撹拌槽を使用して、浮遊培養物を用いて実施される。浮遊培養物は、リン酸Ｃａ又はカチオン性ポリマー及び線状ポリエチレンイミンを使用してトランスフェクトされる。細胞は、電気穿孔を用いてもトランスフェクトされる。
【0145】
レンチウイルスの精製は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）又は膜ベースのクロマトグラフィーを用いたろ過／清澄化、濃縮／ダイアフィルトレーションなど、膜処理ステップ及び／又はイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーベースの処理ステップなど、クロマトグラフィー処理ステップを用いて行われる。レンチウイルスの精製には、これらの処理の任意の組み合わせが用いられる。混入したＤＮＡを分解するためのベンゾナーゼ／ＤＮアーゼ処理は、下流プロトコルの一部であるか、又はベクター作製時に実施されるかのいずれかである。
【0146】
精製は、３相で行われる：（ｉ）捕捉が、粗製の細胞培養物又は清澄化した細胞培養物のいずれかからの標的分子の最初の精製であり、これが主要な汚染物質の排除につながる。（ｉｉ）中間精製は、捕捉段階と仕上げ段階との間の清澄化したフィードに対して実施されるステップからなり、これにより特定の不純物（タンパク質、ＤＮＡ及びエンドトキシン）が除去されることになり、（ｉｉｉ）仕上げは、微量汚染物質及び不純物の除去を目的とする最終ステップであり、製剤化又は包装に好適な形態の、活性のある安全な産物が後に残る。汚染物質は、多くの場合、標的分子に対するコンフォーマー、微量の他の不純物又は疑わしい漏出産物である。１つ又は複数の中間精製及び最終仕上げステップには、任意の種類のクロマトグラフィー及び限外ろ過処理が用いられる。
【0147】
レンチウイルスを精製するための例示的な標準処理としては、以下が挙げられる。ｉ）細胞及び残屑の除去のため、フロンタルろ過（０．４５μｍ）又は遠心で行われ、ｉｉ）Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ又はＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの陰イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー（ヘパリン）でキャプチャークロマトグラフィーが行われ、ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィーで仕上げが行われ、ｉｖ）タンジェンシャルフローろ過又は超遠心法で濃度及び緩衝液交換が行われ、ｖ）ベンゾナーゼでＤＮＡの削減が行われ、及びｖｉ）０．２μｍフィルタで滅菌が行われる。Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．３：１６０１７，２０１６を参照されたい。
【0148】
過去１０年間にわたり、複数のグループがＡＡＶカプシドの熱安定性を評価してきた。被包されたゲノムのサイズは、カプシドの熱安定性に影響を及ぼすことが示されているが、それ以来、一部では別の結論が出ている。重要なことに、これらの相反する結論は、異なる生物物理学的ツールを用いて導き出された。示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）は、ＡＡＶカプシドの熱安定性の決定法としてよく用いられている。しかしながら、ＤＳＦが測定するのは、単にカプシドタンパク質が融解する温度である。カプシドタンパク質の融解は、確かにカプシドの分解を表しているものの、カプシドの構造的完全性がその融解イベントよりはるかに前に失われていた可能性がある。従って、この方法は、ＡＡＶカプシドの熱安定性を真に評価する有効な手段ではないという議論があり得る。しかしながら、ＤＳＦで使用される色素（典型的にはＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）を、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄなど、ＤＮＡに結合する色素に交換した場合、カプシドタンパク質融解よりむしろ、カプシド破壊及びＤＮＡ漏出を評価することができる。この方法は、従って、カプシドの完全性を判定する一層正確な手段を提供する。この方法を用いて、様々な一本鎖ゲノムサイズの外被をなすｒＡＡＶ５カプシドを判定し、ゲノムサイズとカプシドの熱安定性との間に逆相関が見出された。更に、これらの結果は、幅広い生物物理学的ツールを用いて裏付けられた。結果的に、本研究は、被包されるゲノムのサイズがＡＡＶ５カプシドの熱安定性の調節において役割を果たすと結論付ける。今後、本研究は、遺伝子療法に使用されるウイルスベクターの包括的キャラクタリゼーション及び構造－機能の解明に複数の生物物理学的ツールを使用する必要があることを明らかにする。
【0149】
以下に示す例を考察することにより、本開示の他の態様及び利点が理解されるであろう。
【実施例0150】
実施例１：サイズ排除クロマトグラフィー及び多角度光散乱法によるアデノ随伴ベクターの包括的キャラクタリゼーション及び定量化
【0151】
材料及び方法
緩衝液
全てのＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験において、イソクラティッククロマトグラフィーの移動相として１０％ＥｔＯＨ含有１．８×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用した。この緩衝液のストック溶液は、ダルベッコＰＢＳ（１０×）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）及び２００プルーフＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）であった。緩衝液は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の精製水で調製し、０．２μｍポリエーテルスルホン膜（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）でろ過した。
緩衝液
全てのＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験において、イソクラティッククロマトグラフィーの移動相として１０％ＥｔＯＨ含有１．８×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用した。この緩衝液のストック溶液は、ダルベッコＰＢＳ（１０×）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）及び２００プルーフＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）であった。緩衝液は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の精製水で調製し、０．２μｍポリエーテルスルホン膜（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）でろ過した。
【0152】
ＡＡＶ５重い及び軽いカプシドの作製及び精製
本研究では、「フル」、「部分的にフル」及び「空」のように、カプシド種におけるＤＮＡパッケージングの程度を表す用語は、それぞれ科学的に許容できる「重い」、「中間の」及び「軽い」という表現に置き換えられる。この術語法は、精製されたＡＡＶ調製物がどの程度詰まっているかについて、そのカプシドに封入されたＤＮＡのサイズに基づく差があり、「空の」カプシドでもＤＮＡが全くないわけではないことを示す先行研究に基づく（Ｔｏｒｉｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６，３６３－３６９（１９７０）、ｄｅ ｌａ Ｍａｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５，３１９４－３２０３（１９８０）、Ｌｉｐｐｓ ａｎｄ Ｍａｙｏｒ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ５８ Ｐｔ １，６３－７２（１９８２））。ＳＦ９昆虫細胞系から、バキュロウイルスベースのＡＡＶカプシド作製及び精製プロセスの既発表の方法を応用し、標準化することにより、コンストラクト１及び２と称されるｒＡＡＶカプシドを作成した（Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １２，１２１７－１２２５（２２０５）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７，１８８８－１８９６（２００９））。図１に示されるとおり、分析超遠心法によって分析したとき、最終的な精製ＡＡＶカプシド材料が含有する軽いカプシドは、０％であった。本研究に使用した軽いカプシド材料は、分析超遠心法によって確認したカプシド精製の副産物であった。
本研究では、「フル」、「部分的にフル」及び「空」のように、カプシド種におけるＤＮＡパッケージングの程度を表す用語は、それぞれ科学的に許容できる「重い」、「中間の」及び「軽い」という表現に置き換えられる。この術語法は、精製されたＡＡＶ調製物がどの程度詰まっているかについて、そのカプシドに封入されたＤＮＡのサイズに基づく差があり、「空の」カプシドでもＤＮＡが全くないわけではないことを示す先行研究に基づく（Ｔｏｒｉｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６，３６３－３６９（１９７０）、ｄｅ ｌａ Ｍａｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５，３１９４－３２０３（１９８０）、Ｌｉｐｐｓ ａｎｄ Ｍａｙｏｒ，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ５８ Ｐｔ １，６３－７２（１９８２））。ＳＦ９昆虫細胞系から、バキュロウイルスベースのＡＡＶカプシド作製及び精製プロセスの既発表の方法を応用し、標準化することにより、コンストラクト１及び２と称されるｒＡＡＶカプシドを作成した（Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １２，１２１７－１２２５（２２０５）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７，１８８８－１８９６（２００９））。図１に示されるとおり、分析超遠心法によって分析したとき、最終的な精製ＡＡＶカプシド材料が含有する軽いカプシドは、０％であった。本研究に使用した軽いカプシド材料は、分析超遠心法によって確認したカプシド精製の副産物であった。
【0153】
ＡＡＶ重い及び軽いカプシド調製物
以前記載されている方法を用いて、重い及び軽いカプシド材料のＣｐ及びＶｇ総力価をカプシドＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲによって定量化した（Ｍａｙｇｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３７，１９３－２０４（２００６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ １９，１８７－１９３（２０１３））。分析前に、ＮａＣｌ、プルロニック酸及び糖を含有するｐＨ７．４０の独自のリン酸塩ベースの緩衝液で重い及び軽いカプシドを２．００ｅ１３Ｃｐ／ｍＬの最終濃度となるように希釈した。材料は、全て－８０℃で保存し、実験前に室温（約２２～２５℃）で解凍した。次に、容積基準で材料を合わせ、全ての試料について２．００ｅ１３Ｃｐ／ｍＬの最終濃度の０％～１００％の軽いカプシドを含有する一連の試料を作成した。
以前記載されている方法を用いて、重い及び軽いカプシド材料のＣｐ及びＶｇ総力価をカプシドＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲによって定量化した（Ｍａｙｇｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３７，１９３－２０４（２００６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ １９，１８７－１９３（２０１３））。分析前に、ＮａＣｌ、プルロニック酸及び糖を含有するｐＨ７．４０の独自のリン酸塩ベースの緩衝液で重い及び軽いカプシドを２．００ｅ１３Ｃｐ／ｍＬの最終濃度となるように希釈した。材料は、全て－８０℃で保存し、実験前に室温（約２２～２５℃）で解凍した。次に、容積基準で材料を合わせ、全ての試料について２．００ｅ１３Ｃｐ／ｍＬの最終濃度の０％～１００％の軽いカプシドを含有する一連の試料を作成した。
【0154】
サイズ排除クロマトグラフィー
全てのＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験について、Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００カラム（４．６×３００ｍｍ）及びガードカラム（Ｓｅｐａｘ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用した。カラムは、ＰＢＳ（２×）＋１０％ＥｔＯＨのイソクラティック移動相によって０．２ｍＬ／分で１２時間平衡化した。流量を３時間かけて１ｍＬ／分までゆっくりと増加させた後、５０μＬの試料をカラムにロードした。固定相及び移動相は、４℃の自動熱制御型１２９０バイアルサンプラー及びバイナリポンプからなるＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に入れた。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるカラム溶出液のＵＶ吸光度を多波長ダイオードアレイ検出器によって検出した。ＨＰＬＣシステムの制御及びＵＶ吸光度データの分析には、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ＯｐｅｎＬａｂ ＬＣシステムソフトウェア、バージョン２．１．１．１３を使用した。注入後のステップは、全て２５℃で実施した。
全てのＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験について、Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００カラム（４．６×３００ｍｍ）及びガードカラム（Ｓｅｐａｘ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用した。カラムは、ＰＢＳ（２×）＋１０％ＥｔＯＨのイソクラティック移動相によって０．２ｍＬ／分で１２時間平衡化した。流量を３時間かけて１ｍＬ／分までゆっくりと増加させた後、５０μＬの試料をカラムにロードした。固定相及び移動相は、４℃の自動熱制御型１２９０バイアルサンプラー及びバイナリポンプからなるＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に入れた。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるカラム溶出液のＵＶ吸光度を多波長ダイオードアレイ検出器によって検出した。ＨＰＬＣシステムの制御及びＵＶ吸光度データの分析には、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ＯｐｅｎＬａｂ ＬＣシステムソフトウェア、バージョン２．１．１．１３を使用した。注入後のステップは、全て２５℃で実施した。
【0155】
多角度光散乱分析
ＬＣシステムの下流に多角度光散乱（ＭＡＬＳ）システムを結合した。ＭＡＬＳ信号は、ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ １８角度静的光散乱（ＳＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を組込みのＱＥＬＳ動的光散乱（ＤＬＳ）検出器及びＯｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ屈折率（ＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）と併せることによって検出した。ＵＶ、ＲＩ及びＭＡＬＳデータの取得及び分析には、Ａｓｔｒａ ７．３．１ソフトウェアを使用した。
ＬＣシステムの下流に多角度光散乱（ＭＡＬＳ）システムを結合した。ＭＡＬＳ信号は、ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ １８角度静的光散乱（ＳＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を組込みのＱＥＬＳ動的光散乱（ＤＬＳ）検出器及びＯｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ屈折率（ＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）と併せることによって検出した。ＵＶ、ＲＩ及びＭＡＬＳデータの取得及び分析には、Ａｓｔｒａ ７．３．１ソフトウェアを使用した。
【0156】
ＭＡＬＳは、溶液中の分子によって散乱した光の強度を用いて光散乱種のモル質量、サイズ及び数を引き出す。フローモードで解析される各カプシド種について、ＳＬＳ強度の角度及び濃度依存が検出器によって測定され、ＡＳＴＲＡのＺｉｍｍの式（１）に用いられた（Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２７２，１－４０（１９９３））。
［Ｋｃ／Ｒθ］＝（（１／Ｍ）＋２Ａ２ｃ）｛１＋（１６π２（Ｒｇ）２／３λ２）ｓｉｎ２（θ／２）｝ （１）
式中、Ｒθは、過剰レイリー比であり、ｃは、カプシド濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、θは、散乱角であり、Ｍは、各カプシド粒子のモル質量観測値であり、Ａ２は、第２ビリアル係数であり、λは、溶液中におけるレーザー光の波長（６５８ｎｍ）であり、Ｒｇは、タンパク質の回転半径であり、及びＫは、以下の式２：
Ｋ＝［４π２ｎ２（ｄｎ／ｄｃ）２］／Ｎ０λ４ （２）
によって定義され、式中、ｎは、溶媒の屈折率であり、ｄｎ／ｄｃは、溶液中のカプシドの屈折率増分であり、及びＮ０は、アボガドロ数（６．０２×１０２３ｍｏｌ－１）である。
［Ｋｃ／Ｒθ］＝（（１／Ｍ）＋２Ａ２ｃ）｛１＋（１６π２（Ｒｇ）２／３λ２）ｓｉｎ２（θ／２）｝ （１）
式中、Ｒθは、過剰レイリー比であり、ｃは、カプシド濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、θは、散乱角であり、Ｍは、各カプシド粒子のモル質量観測値であり、Ａ２は、第２ビリアル係数であり、λは、溶液中におけるレーザー光の波長（６５８ｎｍ）であり、Ｒｇは、タンパク質の回転半径であり、及びＫは、以下の式２：
Ｋ＝［４π２ｎ２（ｄｎ／ｄｃ）２］／Ｎ０λ４ （２）
によって定義され、式中、ｎは、溶媒の屈折率であり、ｄｎ／ｄｃは、溶液中のカプシドの屈折率増分であり、及びＮ０は、アボガドロ数（６．０２×１０２３ｍｏｌ－１）である。
【0157】
高度に希釈したカプシド溶液について、ここで、（ｃ→０）のとき、式１は、直線方程式（３）に変形される。
［Ｋｃ／Ｒθ］＝（（１／Ｍ）＋｛１＋（（１６π２（Ｒｇ）２／３λ２）ｓｉｎ２（θ／２））｝ （３）
［Ｋｃ／Ｒθ］＝（（１／Ｍ）＋｛１＋（（１６π２（Ｒｇ）２／３λ２）ｓｉｎ２（θ／２））｝ （３）
【0158】
従って、ｓｉｎ２（θ／２）に対する［Ｋｃ／Ｒθ］のプロットから、１６π２（Ｒｇ）２／３Ｍλ２によって定義される傾き及び１／Ｍとしてのｙ切片を有する直線が求められることになる。式３を用いて、式４及び式５により定義されるとおりの、１８ ＳＬＳ検出器によって取得されたデータに関する大域的分析を用いたＡＡＶカプシドについての加重平均分子量（Ｍｗ）及びＲｇを求めた。
Ｍｗ＝Σ（ｃｉＭｉ）／Σｃｉ （４）
Ｒｇ＝Σ（ｃｉＲｇｉ）／Σｃｉ （５）
式中、溶出プロファイル中ｉ番目のスライスにおいて、ｃｉは、タンパク質濃度であり、Ｍｉは、モル質量観測値であり、及びＲｇｉは、回転半径観測値である。
Ｍｗ＝Σ（ｃｉＭｉ）／Σｃｉ （４）
Ｒｇ＝Σ（ｃｉＲｇｉ）／Σｃｉ （５）
式中、溶出プロファイル中ｉ番目のスライスにおいて、ｃｉは、タンパク質濃度であり、Ｍｉは、モル質量観測値であり、及びＲｇｉは、回転半径観測値である。
【0159】
入射レーザービームに対して９０°に置かれたＷｙａｔｔ ＱＥＬＳ検出器により、ＡＡＶベクターの各溶出種の流体力学半径（Ｒｈ）を決定した。Ｒｈデータは、動的光散乱（ＤＬＳ）強度変動の時間及び濃度依存関係を測定し、ＡＳＴＲＡの組込みの式（６）に非線形最小二乗回帰分析を用いて繰り返し当てはめることにより生成される。式６から得られたΓ値を用いることにより、組込みの式（７）を用いて各溶出カプシド種の並進拡散係数（Ｄｔ）を計算し、最後にそれを用いてストークス・アインシュタインの式（８）に当てはめることによりＲｈを計算した（Ｗａｎｇ，Ｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ｍｏｎｉｔｏｒ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ １９（２０１３）：１８７、Ｋｏｐｐｅｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，４８１４－４８２０（１９７２）、Ｂｅｒｎｅ，Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７６））。
Ｇ（τ）＝αＥｘｐ（－２Гτ）＋β （６）
Ｄｔ＝［（Гλ２）／（１６π２ｎ２ｓｉｎ２θ／２）］ （７）
Ｒｈ＝［（ｋＢＴ）／（６πηＤｔ）］ （８）
Ｇ（τ）＝αＥｘｐ（－２Гτ）＋β （６）
Ｄｔ＝［（Гλ２）／（１６π２ｎ２ｓｉｎ２θ／２）］ （７）
Ｒｈ＝［（ｋＢＴ）／（６πηＤｔ）］ （８）
【0160】
Ｇ（τ）は、ＤＬＳ強度変動Ｉの自己相関関数であり、αは、遅延時間０における自己相関関数の初期振幅であり、Γは、自己相関関数の減衰速度定数であり、τは、自己相関関数の遅延時間であり、及びβは、ベースラインオフセット（遅延時間無限大における自己相関関数の値）である。λは、溶液中におけるレーザー光の波長（６５８ｎｍ）であり、及びｎは、溶媒の屈折率であり、及びθは、散乱角（９０°）である。最後に、ｋＢは、ボルツマン定数（１．３８×１０－２３ＪＫ－１）であり、Ｔは、絶対温度であり、及びηは、溶媒粘度である。
【0161】
ここで報告されるＲｈは、式９によって定義されるとおりの加重平均値を表す。
Ｒｈ＝Σ（ｃｉＲｈ，ｉ）／Σｃｉ （９）
式中、溶出プロファイル中ｉ番目のスライスにおいて、ｃｉは、タンパク質濃度であり、及びＲｈ，ｉは、流体力学半径観測値である。
Ｒｈ＝Σ（ｃｉＲｈ，ｉ）／Σｃｉ （９）
式中、溶出プロファイル中ｉ番目のスライスにおいて、ｃｉは、タンパク質濃度であり、及びＲｈ，ｉは、流体力学半径観測値である。
【0162】
ＡＳＴＲＡにおいて、Ｗｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ検出器によって測定されるとおりの溶媒に対する屈折率（Δｎ）の変化から、式１０を用いて各カプシド種の溶出プロファイルに沿ったカプシド濃度（ｃ）が自動的に定量化された。
ｃ＝（Δｎ）／（ｄｎ／ｄｃ） （１０）
式中、ｄｎ／ｄｃは、溶液中におけるＡＡＶベクターの屈折率増分である。
ｃ＝（Δｎ）／（ｄｎ／ｄｃ） （１０）
式中、ｄｎ／ｄｃは、溶液中におけるＡＡＶベクターの屈折率増分である。
【0163】
ベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質と、カプシドに封入されたＤＮＡとの組み合わせであるため、ＭＡＬＳから直接入手されるモル質量及び濃度は、タンパク質－ＤＮＡの組み合わせの複合体を表す。カプシドタンパク質及びカプシドに封入されたＤＮＡの寄与を別々に計算するため、全てのデータセットにＡＳＴＲＡの組込みのタンパク質コンジュゲート方法を適用した。Ｍ．Ｋｕｎｉｔａｎｉ ｅｔ．ａｌ．から応用し、更に改変したこの方法は、２つの異なる濃度検出器からの情報、ＲＩ及び２８０ｎｍのＵＶを用いることにより、連立方程式を用いてカプシドタンパク質からタンパク質－ＤＮＡ複合体の総濃度を決定する（Ｋｕｎｉｔａｎｉ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ５８８．１－２（１９９１）：１２５－１３７、Ｃｈｕ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ．Ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｃｏｕｒｉｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２００７）。この方法は、ＲＩ（及びＵＶ）の反応が、タンパク質カプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡからの反応の総和であるという仮定の下で機能する。式１１を用いることにより、カプシドタンパク質からの質量分率（ｘ）の関数としてタンパク質－ＤＮＡ複合体（Ｖ）の組み合わせｄｎ／ｄｃを計算する。
式中、ＣＰ及びＤＮＡの添え字は、それぞれカプシドタンパク質及びカプシドに封入されたＤＮＡの０．１８５及び０．１７０の固有ｄｎ／ｄｃ値を表す。次に、式１２を用いることにより、屈折率の変化（Δｎ）に基づいてタンパク質－ＤＮＡ複合体の濃度（ＣｄＲＩ）を計算する。
【数1】
【数2】
【0164】
同様に、式１３を用いることにより、カプシドタンパク質からの質量分率（ｘ）の関数としてのタンパク質－ＤＮＡ複合体の組み合わせ吸光係数（εｖ）を計算する。
【数3】
【0165】
式中、εｃｐ及びεＤＮＡは、それぞれカプシドタンパク質及びカプシドに封入されたＤＮＡの１．７９０ｍＬ／ｍｇ・ｃｍ及び１７．０００ｍＬ／ｍｇ・ｃｍの固有の吸光係数を表す。カプシドタンパク質について、この係数は、ＶＰタンパク質に基づいて、それらの１：１：１０比を仮定して決定した。次に、式１４を用いることにより、Ａ２８０吸光度に基づいてタンパク質－ＤＮＡ複合体の濃度を計算する。
【数4】
【0166】
最後に、ＵＶ及びＲＩによって計算したタンパク質－ＤＮＡ複合体の濃度が等しいため、次に、Ａｓｔｒａは、式１５を用いてカプシドタンパク質の質量を解くことができる。
【数5】
【0167】
カプシドタンパク質からの質量分率が分かると、ＡＡＶカプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの物理的属性を独立に測定することが可能となる。ＡＡＶ試料分析前に、ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）［２ｍｇ／ｍＬ］を用いて光散乱検出器を標準化した。
【0168】
分析超遠心法
試料分析には、吸光度及びレイリー干渉（ＲＩ）光学系を備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ ＡＵＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用した。エポンセンターピースが入った２セクター試料セルに試料をロードした。次に、８ホールローターに細胞をロードした。試料の温度を２時間以上にわたって２０℃に平衡化させた。温度平衡化後、試料に対して１０，０００ｒｐｍで１０～１２時間にわたって沈降速度遠心を実施し、機器の最大検出率でスキャンを収集した。
試料分析には、吸光度及びレイリー干渉（ＲＩ）光学系を備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ ＡＵＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用した。エポンセンターピースが入った２セクター試料セルに試料をロードした。次に、８ホールローターに細胞をロードした。試料の温度を２時間以上にわたって２０℃に平衡化させた。温度平衡化後、試料に対して１０，０００ｒｐｍで１０～１２時間にわたって沈降速度遠心を実施し、機器の最大検出率でスキャンを収集した。
【0169】
プログラムＳｅｄｆｉｔに実装されているとおりのｃ（ｓ）法（これは、以前にＡＡＶカプシド分析に利用されている）でデータを分析した（Ｋｕｎｉｔａｎｉ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ５８８．１－２（１９９１）：１２５－１３７、Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐｅｔｅｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ７８．３（２０００）：１６０６－１６１９）。簡潔に言えば、Ｓｅｄｆｉｔは、扇形区画内での拡散及び沈降を記述する基本式、ラムの式（１２）の数値解でデータを直接モデル化する。
∂ｃ／∂ｔ＝［（∂２ｃ／∂ｒ２）＋１ｒ（∂ｃ／∂ｒ）］－ｓω２［ｒ（∂ｃ／∂ｒ）＋２ｃ］ （１２）
式中、ｃは、ＡＡＶ総濃度であり、ｔは、時間であり、Ｄは、拡散定数であり、ｒは、半径であり、ｓは、沈降係数であり、及びωは、ローター回転速度である。式の右辺の２つの項は、２つの競合する力：拡散及び沈降を記述する。拡散の力は、分子運動によって駆動され、均一な溶質の溶液に向かって移動する。沈降の力は、加わる重力場によって駆動され、溶質をセルの底に運ぶ。
∂ｃ／∂ｔ＝［（∂２ｃ／∂ｒ２）＋１ｒ（∂ｃ／∂ｒ）］－ｓω２［ｒ（∂ｃ／∂ｒ）＋２ｃ］ （１２）
式中、ｃは、ＡＡＶ総濃度であり、ｔは、時間であり、Ｄは、拡散定数であり、ｒは、半径であり、ｓは、沈降係数であり、及びωは、ローター回転速度である。式の右辺の２つの項は、２つの競合する力：拡散及び沈降を記述する。拡散の力は、分子運動によって駆動され、均一な溶質の溶液に向かって移動する。沈降の力は、加わる重力場によって駆動され、溶質をセルの底に運ぶ。
【0170】
データ解析
データプロットは、全てＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン８．２．１を用いて作成した。
データプロットは、全てＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン８．２．１を用いて作成した。
【0171】
結果
サイズ排除クロマトグラフィーによるＡＡＶキャラクタリゼーション及び力価推定
ＡＡＶ試料をＳＥＣによって分離し、得られた溶出プロファイルを、ＵＶ（２６０及び２８０ｎｍ）、ＭＡＬＳ及びＲＩ検出器からなる多検出器システムによってモニタした。カラムにより、単量体ＡＡＶカプシド種（約１１．５分で溶出）は、二量体（約１０．５分で溶出）、高次多量体（１０分未満で溶出）及びより小さいヌクレオチド不純物並びに緩衝液成分（１２分を超えて溶出）と有効に分離された（図１Ａ及び図１Ｂ）。２８０及び２６０ｎｍの吸光度をモニタすることにより、そのＡ２６０／Ａ２８０比に基づくそのタンパク質及びＤＮＡ含有率に関して、異なるカプシド種に対応する各溶出ピークを特徴付けた。単量体の重いカプシドは、約１．３４の一貫したＡ２６０／Ａ２８０比を有した一方、軽いカプシドは、約０．６の比を有した。初期の溶出ピークに、１．７を超えるＡ２６０／Ａ２８０比を示す、インタクトなカプシドの外側にあるＤＮＡが検出された（図１Ａ及び図１Ｂ）。
サイズ排除クロマトグラフィーによるＡＡＶキャラクタリゼーション及び力価推定
ＡＡＶ試料をＳＥＣによって分離し、得られた溶出プロファイルを、ＵＶ（２６０及び２８０ｎｍ）、ＭＡＬＳ及びＲＩ検出器からなる多検出器システムによってモニタした。カラムにより、単量体ＡＡＶカプシド種（約１１．５分で溶出）は、二量体（約１０．５分で溶出）、高次多量体（１０分未満で溶出）及びより小さいヌクレオチド不純物並びに緩衝液成分（１２分を超えて溶出）と有効に分離された（図１Ａ及び図１Ｂ）。２８０及び２６０ｎｍの吸光度をモニタすることにより、そのＡ２６０／Ａ２８０比に基づくそのタンパク質及びＤＮＡ含有率に関して、異なるカプシド種に対応する各溶出ピークを特徴付けた。単量体の重いカプシドは、約１．３４の一貫したＡ２６０／Ａ２８０比を有した一方、軽いカプシドは、約０．６の比を有した。初期の溶出ピークに、１．７を超えるＡ２６０／Ａ２８０比を示す、インタクトなカプシドの外側にあるＤＮＡが検出された（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【0172】
以前には、変性したＡＡＶ２カプシドのＣｐ及びＶｇ力価が、ＵＶベースのバルク光学濃度法を用いて推定されている１１。ここで、高度に精製したカプシド又は変性したカプシドを必要としないであろう一層高度な力価推定方法として、ＳＥＣ法を評価した。２８０及び２６０ｎｍのＡＡＶ吸光度値をＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎの単量体及び二量体ピーク面積のドロップライン積分で入手した。Ａ２８０及びＡ２６０ピーク面積測定値は、表Ａに示されるとおり高い再現性を示し［ＣＶＡ２８０＝０．３６％、ＣＶＡ２６０＝０．４１％］、それぞれＣｐ及びＶｇのロードした量に伴う線形的傾向が見られた（データは示さず）。
【表1】
【0173】
ＳＥＣアッセイの再現性及び線形性の高さから、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲによるＣｐ及びｑＰＣＲ力価が既知のＡＡＶカプシド材料から作成した標準曲線（図３Ａ及び図３Ｂ）を用いて、未知の試料のＣｐ及びＶｇ力価を計算した。これらの標準曲線（ここで、ｙは、吸光度に等しく、ｘは、力価負荷に等しい）により、既知の吸光度値及び直線傾向線の傾きから未知の力価を計算することが可能になる。具体的には、未知の試料のＣｐ力価を計算するには、単に試料のＡ２８０単量体及び二量体ピーク面積を傾向線の傾き（２．５２７ｅ０９、図３Ａ）で除し、注入量を乗じるのみでよい（式１３）。
【数6】
【0174】
【0175】
この方法を用いて、０～１００％の軽いカプシドを含有するＡＡＶ試料のＣｐ及びＶｇ力価を計算した。ＳＥＣアッセイは、単量体ＡＡＶカプシドを高次又は低次の不純物と分離するが、軽いカプシドを重いカプシドと分離することはない。結果的に、両方の力価について、軽いカプシドの含有率の関数としての線形的な減少が観察され、Ｒ２＞０．９９９であった（図２Ｃ及び図２Ｄ）。軽いカプシドの増加に伴うＶｇ力価の線形的な下降が予想される一方、類似したＣｐ力価の下落は、カプシドに封入されたベクターゲノムがＡ２８０ピーク面積に及ぼす影響を示している。このようにゲノムが２８０ｎｍにおける重いカプシドの吸光度に寄与する結果、見かけ上Ｃｐ力価が高くなり、タンパク質カプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡがそれぞれＡ２８０及びＡ２６０ピーク面積にのみ寄与するというアッセイの仮定の誤りが浮かび上がる。現行のフォーマットでのこの方法は、Ａ２８０及びＡ２６０の畳み込みによって制限されるが、両方のコンストラクトのＣｐ及びＶｇ力価の誤差は、それぞれ７％未満（過小推定）及び３％（過大推定）であり、試料は、最大１０％の軽いカプシドを含有した（図２Ｅ）。それぞれ１６％及び３６％を上回る軽いカプシドを含有する試料に限り、Ｃｐ及びＶｇ力価の誤差は、１０％に達した（図２Ｅ）。ＳＥＣアッセイの高い精度を考えると、この誤差は、依然として、最大約５０％の軽いカプシドを含む試料でも、広く用いられているＰＣＲ及びＥＬＩＳＡの力価決定法のばらつきの範囲内である（Ｆａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，１－７（２０１２）、Ｋｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０，１７－２４（２００７）、Ｄｏｒａｎｇｅ ａｎｄ Ｌｅ Ｂｅｃ，Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，１１９－１２９（２０１８）。更に、ＵＶ吸光度を用いて、Ａ２６０／Ａ２８０ピーク面積比から、重いカプシドに対する軽いカプシドの相対的割合を推定した。０～１００％の軽いカプシドを含有するＡＡＶ試料のＡ２６０／Ａ２８０比を計算し、軽いカプシドの含有率の関数としてプロットした（図２Ｆ）。得られたプロットは、三次多項式モデルが最良に当てはまる。この多項式回帰モデルにより、ＡＡＶ試料の軽いカプシドの割合を単純にそのＡ２６０／Ａ２８０値から計算することが可能となる。Ａ２６０及びＡ２８０の畳み込みは、力価計算に補正係数を適用することによって軽減され得るが、本発明者らは、以下に記載するとおり、ＭＡＬＳをＳＥＣと併用すると、この欠点を回避する一層直接的な手法がもたらされることを見出した。
【0176】
サイズ排除クロマトグラフィーを多角度光散乱とともに用いたＡＡＶキャラクタリゼーション及び力価推定
ＭＡＬＳは、以前にも、ウイルス粒子の直接的な定量化及び追加のキャラクタリゼーションを提供するため、ＳＥＣ及び他の分離技法と併用されている（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，４８１４－４８２０（１９７２））。ＳＥＣと異なり、ＭＡＬＳは、絶対的な方法であり、Ａ２８０及びＡ２６０の畳み込みに制限されない。簡潔に言えば、ＭＡＬＳは、溶液中における濃度及びサイズの関数としての種によって散乱した光の検出を伴う。次に、ＡＳＴＲＡソフトウェアは、散乱光の角度を用いて散乱種の物理的属性を定量化する。ＡＳＴＲＡのタンパク質コンジュゲート分析機能は、タンパク質及びＤＮＡの内部特性を用いて、重い及び軽いＡＡＶ試料についてのカプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの質量及びモル質量を計算する（図４Ａ及び図４Ｂ）。従って、カプシドの完全性、凝集及び物理的特徴の詳細な要約が得られる。タンパク質コンジュゲート機能を用いて、０～１００％の軽いカプシドを含有するＡＡＶ試料のカプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの質量及びモル質量を測定した。仮定したとおり、カプシド質量は、約６マイクログラム（μｇ）で一定であった一方、ＤＮＡ質量は、軽いカプシドの含有率の関数として約１．７から０．１４μｇに線形的に減少し、Ｒ２＞０．９９９であった（図４Ｃ）。同様に、カプシドモル質量は、約３６５０キロダルトン（ｋＤａ）で一貫して保たれた一方、カプシドに封入されたＤＮＡのモル質量は、約１０００ｋＤＡから１００ｋＤＡに線形的に減少し、Ｒ２＞０．９９７であった（図４Ｄ）。ＭＡＬＳｍから導き出されたカプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの質量及びモル質量を用いて、式１５及び式１６（式中、ＮＡは、アボガドロ数（６．０２３ｅ２３）である）でＣｐ及びＶｇ力価を計算した。
ＭＡＬＳは、以前にも、ウイルス粒子の直接的な定量化及び追加のキャラクタリゼーションを提供するため、ＳＥＣ及び他の分離技法と併用されている（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，４８１４－４８２０（１９７２））。ＳＥＣと異なり、ＭＡＬＳは、絶対的な方法であり、Ａ２８０及びＡ２６０の畳み込みに制限されない。簡潔に言えば、ＭＡＬＳは、溶液中における濃度及びサイズの関数としての種によって散乱した光の検出を伴う。次に、ＡＳＴＲＡソフトウェアは、散乱光の角度を用いて散乱種の物理的属性を定量化する。ＡＳＴＲＡのタンパク質コンジュゲート分析機能は、タンパク質及びＤＮＡの内部特性を用いて、重い及び軽いＡＡＶ試料についてのカプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの質量及びモル質量を計算する（図４Ａ及び図４Ｂ）。従って、カプシドの完全性、凝集及び物理的特徴の詳細な要約が得られる。タンパク質コンジュゲート機能を用いて、０～１００％の軽いカプシドを含有するＡＡＶ試料のカプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの質量及びモル質量を測定した。仮定したとおり、カプシド質量は、約６マイクログラム（μｇ）で一定であった一方、ＤＮＡ質量は、軽いカプシドの含有率の関数として約１．７から０．１４μｇに線形的に減少し、Ｒ２＞０．９９９であった（図４Ｃ）。同様に、カプシドモル質量は、約３６５０キロダルトン（ｋＤａ）で一貫して保たれた一方、カプシドに封入されたＤＮＡのモル質量は、約１０００ｋＤＡから１００ｋＤＡに線形的に減少し、Ｒ２＞０．９９７であった（図４Ｄ）。ＭＡＬＳｍから導き出されたカプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡの質量及びモル質量を用いて、式１５及び式１６（式中、ＮＡは、アボガドロ数（６．０２３ｅ２３）である）でＣｐ及びＶｇ力価を計算した。
【数8】
【数9】
【0177】
これらの式を用いると、コンストラクト１重いカプシド材料のＣｐ及びＶｇ力価は、それぞれ１．９０８ｅ１３Ｃｐ／ｍＬ及び１．９０６ｅ１３Ｖｇ／ｍＬと計算され、Ｃｐ／Ｖｇ比は、１．００であった。これらの値は、上記で式１３及び式１４を用いて得られた値（それぞれ１．９９ｅ１３Ｃｐ／ｍＬ及び２．０１ｅ１３Ｖｇ／ｍＬ）と同等である。式１５は、軽いカプシドの含有率に依存しないが、式１６は、ＡＡＶ試料が含有する軽いカプシドが０％であることを仮定する。結果的に、軽い及び中間のカプシドを含む試料の正確なＶｇ力価を計算するには、相対的なカプシドの含有率を考慮して補正する必要がある。
【0178】
軽い及び中間のカプシドについてのＳＥＣ－ＭＡＬＳ推定及び補正
ＳＥＣカラムから軽い及び重いカプシドが共溶出するため、正確な力価を得るために、それらの相対的な割合を決定することが必要となる。ＳＥＣ－ＭＡＬＳでは、複数の方式で相対的カプシドの含有率を計算することが可能である。Ａ２６０／Ａ２８０ピーク面積に加えて、ＭＡＬＳから導き出されるタンパク質分率（タンパク質ＤＮＡ複合体質量に対する相対的なカプシドタンパク質質量）により、軽いカプシドの含有率の推定が可能となる。タンパク質分率は、軽いカプシドの含有率に伴って線形的に変化する傾向を示し、軽いカプシドが０％から１００％になると、０．７７から０．９８に増加したことから（両方のコンストラクトについてＲ２＞０．９９）（図５Ａ）、これを使用してＶｇ力価への軽いカプシドの寄与分を補正することができる。精製後でも、軽いカプシドを含まないＡＡＶベクター調製物が重いカプシドのみを含有するとは限らない（Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐｅｔｅｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ７８．３（２０００）：１６０６－１６１９）。ＡＡＶ調製物は、ＡＵＣによってモニタしたとき、重いカプシドと軽いカプシドとの間に沈降する様々なサイズのゲノムを含むカプシドからなることが公知である（図１）。これらの中間のカプシドが存在することにより、カプシドに封入されたＤＮＡのモル質量測定値（１．０３ｅ０６ｋＤａ、図４Ｄ）は、理論値（約１．５０ｅ０６ｋＤａ）よりも低くなる。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ力価計算において軽い及び中間のカプシドを考慮するため、０％軽いＡＡＶ５試料からのカプシドに封入されたＤＮＡのモル質量測定値をその理論値で除すことにより、カプシドのパッキング効率を決定した（式１７）。
ＳＥＣカラムから軽い及び重いカプシドが共溶出するため、正確な力価を得るために、それらの相対的な割合を決定することが必要となる。ＳＥＣ－ＭＡＬＳでは、複数の方式で相対的カプシドの含有率を計算することが可能である。Ａ２６０／Ａ２８０ピーク面積に加えて、ＭＡＬＳから導き出されるタンパク質分率（タンパク質ＤＮＡ複合体質量に対する相対的なカプシドタンパク質質量）により、軽いカプシドの含有率の推定が可能となる。タンパク質分率は、軽いカプシドの含有率に伴って線形的に変化する傾向を示し、軽いカプシドが０％から１００％になると、０．７７から０．９８に増加したことから（両方のコンストラクトについてＲ２＞０．９９）（図５Ａ）、これを使用してＶｇ力価への軽いカプシドの寄与分を補正することができる。精製後でも、軽いカプシドを含まないＡＡＶベクター調製物が重いカプシドのみを含有するとは限らない（Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐｅｔｅｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ７８．３（２０００）：１６０６－１６１９）。ＡＡＶ調製物は、ＡＵＣによってモニタしたとき、重いカプシドと軽いカプシドとの間に沈降する様々なサイズのゲノムを含むカプシドからなることが公知である（図１）。これらの中間のカプシドが存在することにより、カプシドに封入されたＤＮＡのモル質量測定値（１．０３ｅ０６ｋＤａ、図４Ｄ）は、理論値（約１．５０ｅ０６ｋＤａ）よりも低くなる。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ力価計算において軽い及び中間のカプシドを考慮するため、０％軽いＡＡＶ５試料からのカプシドに封入されたＤＮＡのモル質量測定値をその理論値で除すことにより、カプシドのパッキング効率を決定した（式１７）。
【数10】
【0179】
次に、パッキング効率（ＰＥ）を用いることにより、式１８で重いカプシドの比率を決定した。
【数11】
【0180】
これらの式を用いて、０～１００％の軽いカプシドを含有するＡＡＶ試料の重いカプシドの含有率を計算した。既知の軽いカプシドの含有率の関数としての重いカプシドのパーセンテージ測定値のプロットを線形回帰モデルに当てはめ、Ｒ２＞０．９９であった（図５Ｂ）。重いカプシドの含有率が分かったことに伴い、Ｃｐ力価に重いカプシドの比率を乗じることにより、更に正確なＶｇ力価が得られた。しかしながら、この計算は、依然として試料中の軽いカプシドがいかなるゲノムも有しないことを前提とする。軽いカプシドは、真に空であるわけではなく（図４Ｃ及び図４Ｄ）、そのカプシドに封入されたＤＮＡがＶｇ力価の値を歪める。これを防ぐため、軽いＡＡＶ試料のＶｇ力価を、式１９を用いて計算した。
【数12】
【0181】
次に、Ｖｇ力価の値に対する軽いカプシドのゲノムの寄与分を、式２０を用いて既知の軽いカプシドの比率で補正した。
【数13】
【0182】
最後に、これらの計算を一緒にして、相対的な重い及び軽いカプシドの含有率を反映するように補正したＶｇ力価を、式２１を用いて得た。
【数14】
【0183】
両方のコンストラクトについて、ＭＡＬＳによって導き出されるＣｐ及び補正後Ｖｇ力価を軽いカプシドの関数としてプロットした。Ｃｐ値は、一定のままであった一方、Ｖｇ力価は、軽いカプシドの含有率の増加に伴って線形的に減少した（図５Ｃ）。補正後Ｖｇ力価で試料Ｃｐ／Ｖｇ比を計算し、予想値の関数としてプロットした（図５Ｄ）。Ｃｐ／Ｖｇ測定値及び予想値は、Ｒ２＞０．９９で線形相関を実証した。各試料について計算したＣｐ及びＶｇ力価の予想値との差の平均を図５Ａ及び図５Ｂにまとめる。ＳＥＣ－ＵＶのみから導き出された力価と対照的に、ＳＥＣ－ＭＡＬＳでは力価の正確さが向上し、最大８０％の軽いカプシドでスパイクした試料において予想値との差は、４％未満であった。９０～１００％の軽いカプシドを含む試料中では、Ｖｇ力価の差がより大きいことが観察された。これらの差は、様々なサイズの軽いカプシドのゲノムの絶対吸光係数及びｄｎ／ｄｃ値を推定することが困難であることに起因する可能性がある。計算には、代わりに理論的なゲノム全体の吸光係数及びｄｎ／ｄｃ値を使用し、そのため、９０～１００％の軽いカプシドを含有する試料への適用性が低くなる。
【0184】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳによる徹底的ＡＡＶカプシド分析
ＳＥＣ－ＭＡＬＳの実際的な適用を実証するため、２５℃～９５℃の範囲の温度でインキュベートした重い及び軽いＡＡＶ試料を分析した。試料は、それぞれの各温度で３０分間インキュベートした後、直接ＳＥＣカラムに注入した。重い材料（図７Ａ）及び軽い材料（図７Ｂ）について、ＳＥＣ Ａ２６０（データは示さず）及びＡ２８０溶出プロファイルを用いて様々なカプシド形態（例えば、単量体、二量体等）並びに外因性タンパク質及び核酸不純物を観察した。重い及び軽いカプシドについて、温度の関数としての単量体ピーク面積も計算した（図７Ｃ）。ピーク面積の変化は、試料の生物物理学的変化と相関したことから、これをカプシドの完全性及び安定性の評価に用いることができる。重いカプシドについて、温度が増加すると、６．５分の時点でＡＡＶ単量体ピークが減少し、核酸ピークが増加した（Ａ２６０／Ａ２８０＞１．７）。一方、軽いカプシドは、高温での熱的安定性がはるかに高いことが分かり、カプシドに封入されたＤＮＡからの内部圧力によってカプシドの不安定性が引き起こされるという考えが裏付けられた（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７，２９９４－３００２（２０１３）、Ｉｖａｎｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４，９６０３－９６０８（２００７））。軽いカプシド及び重いカプシドの両方のＵＶプロファイルで観察された傾向は、ＭＡＬＳ溶出プロファイルとよく類似していた（データは示さず）。ＳＥＣ溶出プロファイルに観察された変化がカプシドの不安定化及びゲノム放出を表したものであるかどうかを評価するため、温度の関数としてのＡ２６０／Ａ２８０比をモニタした。２５℃では、重いカプシド及び軽いカプシドのＡ２６０／Ａ２８０比は、それぞれ１．３４及び０．６であった（図７Ｄ）。温度が増加するにつれて、重いカプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０比が５５～６５℃で変曲して０．８まで減少した一方、軽いカプシドは、一定のままであった。Ａ２６０／２８０比の減少は、カプシドに封入されたＤＮＡの量の減少を示すものであり、これは、３分に約２のＡ２６０／Ａ２８０比を有する遊離ＤＮＡピークの増加が現れることによって更に裏付けられる（図７Ａ）。これを更に探るため、ＭＡＬＳを用いて、温度に伴うサイズ分布及び可能性のあるカプシド破壊をモニタした。温度の上昇に伴う単量体の重い及び軽いカプシド種の流体力学半径（Ｒｈ）及び回転半径（Ｒｇ）を評価した。軽いカプシドのＲｈ及びＲｇが一定のままであった一方、重いカプシドについて、温度の上昇に伴って両方の半径が増加することが分かった（図７Ｅ）。ＭＡＬＳによってサイズ及びばらつきの両方の増加が測定されたことは、Ａ２８０及びＡ２６０／２８０によって観察された不安定化を更に裏付けている。興味深いことに、タンパク質コンジュゲート分析では、重い及び軽いカプシドについてカプシドタンパク質のモル質量は、一定のままであった一方、重いカプシドのカプシドに封入されたＤＮＡのモル質量は、温度の関数として減少したことが確認された（図７Ｆ）。これらの結果は、Ａ２８０によって観察された外因性ＤＮＡと併せて、４５℃を上回るときのカプシド構造の破壊及びＤＮＡ漏出のイベントを裏付けている。更に、結果は、重い粒子と比較した軽いＡＡＶカプシドの熱安定性の増加など、ＡＡＶの生物物理学的変化の解明におけるＳＥＣ－ＭＡＬＳの有用性を実証している。
ＳＥＣ－ＭＡＬＳの実際的な適用を実証するため、２５℃～９５℃の範囲の温度でインキュベートした重い及び軽いＡＡＶ試料を分析した。試料は、それぞれの各温度で３０分間インキュベートした後、直接ＳＥＣカラムに注入した。重い材料（図７Ａ）及び軽い材料（図７Ｂ）について、ＳＥＣ Ａ２６０（データは示さず）及びＡ２８０溶出プロファイルを用いて様々なカプシド形態（例えば、単量体、二量体等）並びに外因性タンパク質及び核酸不純物を観察した。重い及び軽いカプシドについて、温度の関数としての単量体ピーク面積も計算した（図７Ｃ）。ピーク面積の変化は、試料の生物物理学的変化と相関したことから、これをカプシドの完全性及び安定性の評価に用いることができる。重いカプシドについて、温度が増加すると、６．５分の時点でＡＡＶ単量体ピークが減少し、核酸ピークが増加した（Ａ２６０／Ａ２８０＞１．７）。一方、軽いカプシドは、高温での熱的安定性がはるかに高いことが分かり、カプシドに封入されたＤＮＡからの内部圧力によってカプシドの不安定性が引き起こされるという考えが裏付けられた（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７，２９９４－３００２（２０１３）、Ｉｖａｎｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４，９６０３－９６０８（２００７））。軽いカプシド及び重いカプシドの両方のＵＶプロファイルで観察された傾向は、ＭＡＬＳ溶出プロファイルとよく類似していた（データは示さず）。ＳＥＣ溶出プロファイルに観察された変化がカプシドの不安定化及びゲノム放出を表したものであるかどうかを評価するため、温度の関数としてのＡ２６０／Ａ２８０比をモニタした。２５℃では、重いカプシド及び軽いカプシドのＡ２６０／Ａ２８０比は、それぞれ１．３４及び０．６であった（図７Ｄ）。温度が増加するにつれて、重いカプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０比が５５～６５℃で変曲して０．８まで減少した一方、軽いカプシドは、一定のままであった。Ａ２６０／２８０比の減少は、カプシドに封入されたＤＮＡの量の減少を示すものであり、これは、３分に約２のＡ２６０／Ａ２８０比を有する遊離ＤＮＡピークの増加が現れることによって更に裏付けられる（図７Ａ）。これを更に探るため、ＭＡＬＳを用いて、温度に伴うサイズ分布及び可能性のあるカプシド破壊をモニタした。温度の上昇に伴う単量体の重い及び軽いカプシド種の流体力学半径（Ｒｈ）及び回転半径（Ｒｇ）を評価した。軽いカプシドのＲｈ及びＲｇが一定のままであった一方、重いカプシドについて、温度の上昇に伴って両方の半径が増加することが分かった（図７Ｅ）。ＭＡＬＳによってサイズ及びばらつきの両方の増加が測定されたことは、Ａ２８０及びＡ２６０／２８０によって観察された不安定化を更に裏付けている。興味深いことに、タンパク質コンジュゲート分析では、重い及び軽いカプシドについてカプシドタンパク質のモル質量は、一定のままであった一方、重いカプシドのカプシドに封入されたＤＮＡのモル質量は、温度の関数として減少したことが確認された（図７Ｆ）。これらの結果は、Ａ２８０によって観察された外因性ＤＮＡと併せて、４５℃を上回るときのカプシド構造の破壊及びＤＮＡ漏出のイベントを裏付けている。更に、結果は、重い粒子と比較した軽いＡＡＶカプシドの熱安定性の増加など、ＡＡＶの生物物理学的変化の解明におけるＳＥＣ－ＭＡＬＳの有用性を実証している。
【0185】
考察
ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、ＡＡＶカプシドの多岐にわたる物理的属性のキャラクタリゼーションのための単純で忠実度の高い方法である。これは、標準曲線を用いずにＡＡＶ Ｃｐ及びＶｇ力価を測定する簡単明瞭なシングルメソッド手法をもたらし、軽いカプシドの重いカプシドに対する比率を決定する複数の方法を提供する。カプシド及びそのカプシドに封入されたＤＮＡに固有の吸光度、光散乱及び屈折特性を利用することにより、生のＳＥＣ－ＭＡＬＳデータをカプシド属性の有意味な定量化に集約することができる。それが提供するその使い勝手のよさ、再現性及び情報の豊富さのため、それは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳがＡＡＶキャラクタリゼーションに利用可能な極めて万能なツールの１つであることがほぼ間違いない。
ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、ＡＡＶカプシドの多岐にわたる物理的属性のキャラクタリゼーションのための単純で忠実度の高い方法である。これは、標準曲線を用いずにＡＡＶ Ｃｐ及びＶｇ力価を測定する簡単明瞭なシングルメソッド手法をもたらし、軽いカプシドの重いカプシドに対する比率を決定する複数の方法を提供する。カプシド及びそのカプシドに封入されたＤＮＡに固有の吸光度、光散乱及び屈折特性を利用することにより、生のＳＥＣ－ＭＡＬＳデータをカプシド属性の有意味な定量化に集約することができる。それが提供するその使い勝手のよさ、再現性及び情報の豊富さのため、それは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳがＡＡＶキャラクタリゼーションに利用可能な極めて万能なツールの１つであることがほぼ間違いない。
【0186】
ＡＡＶカプシドのＣｐ及びＶｇ力価は、通常、カプシドＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲを用いて独立に測定されるが、これらは、時間がかかり、且つばらつきが大きい方法であり得るため、より正確で精密な力価決定方法の必要性が浮かび上がる（Ｆａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，１－７（２０１２）、Ｋｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０，１７－２４（２００７）、Ｄｏｒａｎｇｅ ａｎｄ Ｌｅ Ｂｅｃ，Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，１１９－１２９（２０１８）。光学濃度を用いて報告されるＶｇ力価は、ｑＰＣＲと比べるとばらつきが最大１対数分だけ少ない（Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ７，１２２－１２８（２００３））。光学濃度は、Ｃｐ力価及びＶｇ力価の両方を測定可能な単純なアッセイであるものの、タンパク質及び核酸不純物によって結果が歪み得る。別のＵＶ分光光度法として、ＳＥＣは、光学濃度の利点を保ちつつ、カラムでカプシドを不純物と分離するという追加の利点を有する。従って、ＡＡＶ試料を高度に精製しなくても、ＳＥＣによって正確な力価が得られる。更に、ＳＥＣによれば、アッセイ間精度が１％未満となり、ｑＰＣＲの約１６％と比較して実質的に向上する（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５，１１５－１２５（２０１４）、Ｐａｖｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ ４０８，６７－７５（２０１６）、Ｐａｃｏｕｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５，１３７５－１３８６（２０１７））。ＳＥＣ法の制限は、カラムからの軽いカプシドと重いカプシドとの共溶出である。結果として、軽いカプシドの含有率によっては、Ａ２６０及びＡ２８０の畳み込みによる力価誤差が増加する。しかしながら、ＳＥＣ Ｖｇ力価の誤差がｑＰＣＲの通例のばらつき（約１５～２０％）に達するのは、５０％を超える軽いカプシドを含有する試料のみである。これらの方法は、力価の計算に標準曲線が必要であるという共通の制限も共有する。軽いカプシドの存在に関する補正係数を用いてその吸光度寄与分を考慮し、ＳＥＣから導き出される力価の正確さを向上させることができるが、その作業は、本研究の範囲外である。本研究は、ＳＥＣをＭＡＬＳと組み合わせると、これらの制限が取り除かれることを示す。ＭＡＬＳ測定は、Ａ２６０及びＡ２８０の畳み込みの影響を受けず、及び絶対的な方法として、ＭＡＬＳは、標準曲線を必要としない。ｄｄＰＣＲも、標準曲線の必要なしに、アッセイ内及びアッセイ間精度を、それぞれｑＰＣＲの５．３５％及び１６．５％と比較したときに２．２１％及び８％未満まで改善することが示されている（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５，１１５－１２５（２０１４）、Ｐａｖｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ ４０８，６７－７５（２０１６）、Ｐａｃｏｕｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５，１３７５－１３８６（２０１７））。しかしながら、ＳＥＣ－ＭＡＬＳと異なり、ｄｄＰＣＲ法は、Ｃｐ力価及びＶｇ力価の両方を他の物理的カプシド属性と併せて測定することができない。ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、試料操作、標準曲線又は大きい労力を要するプロトコルの必要なしに、２０分のランで精密さが向上した正確なＣｐ及びＶｇ力価を提供する。加えて、同じ方法から、カプシドの完全性及び安定性のような生物物理学的特徴もモニタすることができる。
【0187】
ある種のスイスアーミーナイフのような方法であるＳＥＣ－ＭＡＬＳは、多機能のＡＡＶキャラクタリゼーション手法である。これは、ＡＡＶ製品開発及びプロセス分析の強力なツールとして登場した。本研究は、工業用及び学術的プラットフォームを横断するウイルスベクターの生物物理学的キャラクタリゼーションに向けたＳＥＣ－ＭＡＬＳの開発及び応用可能性を明らかにする。
【0188】
実施例２：サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）技法によるアデノ随伴ウイルス粒子の分布分析及び定量化の改良
【0189】
材料及び方法
試料調製
分析的サイズ排除クロマトグラフィー：分析的ＳＥＣ分析には、Ｓｅｐａｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＳｅｐａｘ ＳＥＣ １０００カラム（７．８ｍｍ内径×３００ｍｍ長さ）を使用した。このカラムは、高純度の、機械的安定性が強化されたシリカに化学的に結合した、一様な親水性の中性ナノメートル厚さ薄膜を実現するＳｅｐａｘ独自の表面技術を利用している。このＳｅｐａｘ独自の表面技術により、薄膜形成化学を十分に制御することが可能となり、その結果、高いカラム間再現性が得られる。薄膜の化学結合の性質及び最大限の結合密度がＳＲＴ ＳＥＣ相に有益に作用し、高い安定性をもたらす。一様な表面被膜により、高い効率での分離が可能となる。ＳＥＣ－１００、ＳＥＣ－１５０、ＳＥＣ３００、ＳＥＣ－５００、ＳＥＣ－１０００及びＳＥＣ－２０００について、ＳＲＴパッキングの分散が狭い球状シリカ粒子は、公称細孔径がそれぞれ１００Å、１５０Å、３００Å、５００Å、１，０００Å及び２，０００Åである。これらの特別に設計された大きい細孔容積（ＳＲＴ ＳＥＣ－１５０、３００及び５００について約１．３５ｍＬ／ｇ及びＳＲＴ ＳＥＣ－１００、１０００及び２０００について約１．０ｍＬ／ｇ）により、大きい分離容量が可能となり、高い分離分解能につながる。ＳＲＴ ＳＥＣカラムは独自のスラリー技法で充填され、カラム効率が最大となる一様で安定した充填床密度を実現する。
試料調製
分析的サイズ排除クロマトグラフィー：分析的ＳＥＣ分析には、Ｓｅｐａｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＳｅｐａｘ ＳＥＣ １０００カラム（７．８ｍｍ内径×３００ｍｍ長さ）を使用した。このカラムは、高純度の、機械的安定性が強化されたシリカに化学的に結合した、一様な親水性の中性ナノメートル厚さ薄膜を実現するＳｅｐａｘ独自の表面技術を利用している。このＳｅｐａｘ独自の表面技術により、薄膜形成化学を十分に制御することが可能となり、その結果、高いカラム間再現性が得られる。薄膜の化学結合の性質及び最大限の結合密度がＳＲＴ ＳＥＣ相に有益に作用し、高い安定性をもたらす。一様な表面被膜により、高い効率での分離が可能となる。ＳＥＣ－１００、ＳＥＣ－１５０、ＳＥＣ３００、ＳＥＣ－５００、ＳＥＣ－１０００及びＳＥＣ－２０００について、ＳＲＴパッキングの分散が狭い球状シリカ粒子は、公称細孔径がそれぞれ１００Å、１５０Å、３００Å、５００Å、１，０００Å及び２，０００Åである。これらの特別に設計された大きい細孔容積（ＳＲＴ ＳＥＣ－１５０、３００及び５００について約１．３５ｍＬ／ｇ及びＳＲＴ ＳＥＣ－１００、１０００及び２０００について約１．０ｍＬ／ｇ）により、大きい分離容量が可能となり、高い分離分解能につながる。ＳＲＴ ＳＥＣカラムは独自のスラリー技法で充填され、カラム効率が最大となる一様で安定した充填床密度を実現する。
【0190】
５０μＬ試料をＳｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００カラム（固定相と称される）に注入し、ＰＢＳ（２×）＋１０％ＥｔＯＨのイソクラティック溶出緩衝液（移動相と称される）によって１ｍＬ／分の流量で溶出した。固定相及び移動相は、自動熱制御型１２９０バイアルサンプラーとバイナリポンプとからなるＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に入れた。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるカラム溶出液のＵＶ吸光度を多波長ダイオードアレイ検出器によって検出し、且つＨＰＬＣシステムの制御及びＵＶ吸光度データの分析には、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ＯｐｅｎＬａｂ ＬＣシステムソフトウェアを使用した。いずれも注入後に２２～２５℃で実施した。
【0191】
多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）：多角度光散乱法分析は、ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ １８角度検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＯｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実施した。ＭＡＬＳデータの取得及び分析には、Ａｓｔｒａソフトウェアを使用した。
【0192】
分析超遠心法（ＡＵＣ）：全ての試料の分析には、吸光度及びレイリー干渉（ＲＩ）光学系を備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ ＡＵＣを使用した。データは、プログラムＳｅｄｆｉｔに実装されるとおりのｃ（ｓ）法で分析した。Ｓｅｄｆｉｔでは、ｃ（ｓ）分布を積分することにより、個別のピークの沈降係数、信号平均沈降係数及び種の相対量が確立された。
【0193】
カプシド及びベクターゲノム含有率の計算：カプシド及びベクターゲノム濃度は、以下の式に基づいて計算した。
【0194】
【数15】
【0195】
【数16】
【数17】
【数18】
【0196】
結果
ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによるＡＡＶ粒子のキャラクタリゼーション及び定量化
ＳＥＣ－ＭＡＬＳシステム：ＳＥＣ－ＭＡＬＳシステムは、ＨＰＬＣシステム、サイズ排除カラム、ＵＶ検出器、ＭＡＬＳ検出器及び示差ＲＩ検出器を含む。
ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによるＡＡＶ粒子のキャラクタリゼーション及び定量化
ＳＥＣ－ＭＡＬＳシステム：ＳＥＣ－ＭＡＬＳシステムは、ＨＰＬＣシステム、サイズ排除カラム、ＵＶ検出器、ＭＡＬＳ検出器及び示差ＲＩ検出器を含む。
【0197】
ＳＥＣシステム（即ちＳＥＣ－ＨＰＬＣシステム）の例は、溶媒及び試料の供給源に流体接続したサイズ排除カラム、サイズ排除カラム中に溶媒及び試料を流す能力のあるポンプ及びサイズ排除カラムからの溶出物の光吸収を測定する能力のある吸光度検出器を含む。
【0198】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳシステムの例、ここでは１つ又は複数のサイズ排除カラムを含むＳＥＣ－ＨＰＬＣシステムがＵＶ検出器、ＭＡＬＳ検出器及び示差ＲＩ検出器に流体接続している。動作時、初めに、試料は、１つ又は複数のサイズ排除カラムを含むＳＥＣ－ＨＰＬＣシステムを通して流れる。次に、ＳＥＣ－ＨＰＬＣシステムからの溶出物がＵＶ検出器、ＭＡＬＳ検出器及び示差ＲＩ検出器に流れる。
【0199】
ＡＡＶ粒子を含有する試料のＳＥＣ又はＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いた分析では、短時間（例えば、２０分以内）でＡＡＶ粒子の特性を特徴付け、ＡＡＶ粒子の力価を定量化することができる。更に、ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳの両方は、ばらつきが最小限である、複数のアッセイに関して直交性の技法であり、ハイスループット方式で高速且つ効率的に処理及び長期安定性に関する情報を提供し、且つ異なる画分を別々に収集及び分析することが可能である。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析によってキャラクタリゼーションし得る特性の例としては、ＡＡＶ粒子の凝集プロファイルの視覚化、インタクトなカプシドの外側にあるか又はその中に封入されていない核酸の濃度の推定、カプシドの構造的完全性の検査、試料中のＡＡＶ粒子（即ち重いカプシド）及び空のカプシド（即ち軽いカプシド）の割合の推定、ＡＡＶ粒子の粒径分布（例えば、体積基準の粒径又は球体の直径／半径）の決定、カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量の計算が挙げられる。力価定量化の例としては、カプシド力価及びベクターゲノム力価の定量化が挙げられる。同じ情報を取得しようとすれば、分析超遠心法（ＡＵＣ）、電子顕微鏡法（ＥＭ）、動的光散乱分析（ＤＬＳ）、蛍光分析、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及びドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）など、相当な数の従来技術を用いなければならないであろう。
【0200】
ＡＡＶ調製物のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析：ＳＥＣは、その名称が示すとおり、溶液中の分子をサイズ別に分離する。Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００カラムを使用したＡＡＶ５カプシド粒子の分離について、５０μＬ試料をカラム（固定相と称される）に注入することによってモニタし、ＰＢＳ（２×）＋１０％ＥｔＯＨのイソクラティック溶出緩衝液（移動相と称される）によって１ｍＬ／分の流量で溶出した。固定相及び移動相は、自動熱制御型１２９０バイアルサンプラーとバイナリポンプとからなるＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｒｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に入れた。ＵＶ、ＭＡＬＳ及びＲＩ検出器を用いてカラム溶出液をモニタした。図８Ａに示されるとおり、得られた不均一性、分布及び凝集プロファイルは、異なる検出器によって捕捉された。
【0201】
図８Ａは、２６０ｎｍ波長で測定した試料の代表的なＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。このプロファイルは、多くの吸光度単位（ＡＵ）ピークを示し、各ピークが異なる産物又は成分を表す。例えば、図８Ａに示されるとおり、主ピーク（即ちピーク４番）は、試料中の単量体カプシドを表す。三量体及び二量体カプシドなどのカプシド凝集体は、ピーク２番及び３番によって表される。ピーク１番は、細胞からの高分子量核酸を表し、ピーク５番は、低分子ヌクレオチド及び緩衝液成分を表す。
【0202】
カラムからの試料溶出後、２６０及び２８０ｎｍのＵＶ吸光度を記録して溶出プロファイルを入手する（図８Ａ）。特徴的な主ピークが溶出した後、続いて主ピークの左側及び右側にある、それより小さいピークが溶出する。この溶出プロファイルは、約１１．５分の特徴的な大きいピークと、主ピークの左側及び右側にある微小ピークとを特徴とする。溶液中の種がサイズの減少する順にカラムから溶出することは、明らかであり、ＡＡＶ５単量体カプシド種が高次種並びに他の外因性タンパク質及びＤＮＡ不純物と分離される。ＳＥＣカラムは、キャラクタリゼーションのためピークを別々に画分収集する能力を提供する。各ピークを別々に分離し、ＡＵＣ、ＰＣＲ及びＭＡＬＳのような様々な技法によって特徴付けて、溶出ピークのアイデンティティを確定した。図８Ａに示されるとおり、データから、目的の遺伝子を被包する優勢な単量体カプシド集団が存在し、更に、二量体及び多量体形態のカプシドが外因性ＤＮＡ及び低分子ヌクレオチド断片とともに存在することが確認された。
【0203】
図８Ｂは、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ波長で測定した試料の別の代表的なＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。
【0204】
この方法では、２６０及び２８０ｎｍの両方の溶出プロファイルをモニタすることは、試料中にある様々な形態のカプシド（単量体及びより高次の凝集体）並びに任意の外因性タンパク質又はＤＮＡベースの不純物の存在を観察するための優れたツールとなる（図８Ｂ）。単量体カプシド種の２６０／２８０比は、バッチ間において約１．３４で一定であることが観察され、ＤＮＡ又はＤＮＡタンパク質複合体のような他の種も、単量体カプシドより高い一貫した比を示すことが分かった。
【0205】
図８Ｂのプロファイルは、図８Ｂのプロファイルが単量体カプシドを表す主ピークを示す点で図８Ａのプロファイルと同様である。加えて、２６０ｎｍ波長における吸光度測定によってピークの核酸濃度が定量化され、２８０ｎｍ波長における吸光度測定によってピークのタンパク質濃度が定量化される。２６０ｎｍ／２８０ｎｍ ＡＵ比を同定することにより、ピークによって表される産物を特徴付けることができる。例えば、図８Ｂの主ピークは、１．３４の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ ＡＵ比を有し、単量体ＡＡＶ粒子を表す。図８Ｂは、１．１３の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ ＡＵ比を呈する凝集したＡＡＶ粒子（例えば、二量体ＡＡＶ粒子）、１．７５及び２の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ ＡＵ比を呈する外因性核酸並びに２．４の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ ＡＵ比を呈する低分子ヌクレオチド及び緩衝液成分も示す。従って、単量体ＡＡＶ粒子は、１．１３より大きく、１．７５より小さい範囲の２６０ｎｍ／２８０ｎｍ ＡＵ比を呈し得る。
【0206】
【0207】
この方法は、例えば、主ピーク面積の変化を時間の関数としてモニタし、試料安定性の経過を追うことができるため、安定性の指標を得るアッセイとして利用することができる。小規模の加速安定性試験を２５℃で１ヵ月間にわたって実施したところ、この方法の安定性適用を裏付ける原理証明データが得られた。このデータは、時間の関数としての外因性ＤＮＡピークの２倍の増加及び対応する単量体ピーク面積の下落を示した。詳細には、ＡＡＶ試料を２５℃で０、１、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日間貯蔵し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって個別に分析した。貯蔵時間が長くなるほど、図９Ａに示されるとおり、単量体ＡＡＶ粒子の％ピーク面積が減少し、図９Ｃに示されるとおり、外来性核酸の％ピーク面積が増加した。詳細には、外来性デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ピークの％ピーク面積は、線形的に約２倍に増加した。これは、カプシドの安定性の変化を示唆している。図９Ｂに示されるとおり、二量体ＡＡＶ粒子の％ピーク面積は、貯蔵時間が長くなっても実質的に変化しなかった。
【0208】
ＡＡＶ調製物のＭＡＬＳ分析：ＡＡＶ調製物からの試料をＭＡＬＳによって分析した。上記に指摘したとおり、ＳＥＣ－ＨＰＬＣシステムからの溶出物は、ＵＶ検出器、ＭＡＬＳ検出器及び示差ＲＩ検出器に流れる。
【0209】
ＵＶ及び示差ＲＩ検出器を用いると、核酸及びタンパク質濃度測定値が提供される。
【0210】
示差ＲＩ検出器の測定値から試料中のタンパク質及び核酸の濃度を計算するには、タンパク質及び核酸（即ちＤＮＡ）の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）を用いる。タンパク質及び核酸の屈折率増分は、下記のとおり提供される。
【数19】
【0211】
カプシド及びベクターの吸光係数（ε）を用いて、ＵＶ検出器によって測定したときの２８０ｎｍの試料の吸光度測定値から濃度を計算する。吸光係数は、空のカプシド及び被包されていないベクターゲノムの複数の吸光度測定値から求められる。例えば、ＡＡＶ５カプシド及びベクターゲノムの吸光係数は、下記のとおり提供される。
【数20】
【0212】
屈折率及びＵＶ吸光度の両方の測定値を用いることにより、試料中のカプシド及びベクターゲノムの質量を計算することができる。
【0213】
以下の式を適用することにより、屈折率の変化からカプシド及びベクターゲノムの質量を計算する。
【数21】
【数22】
【0214】
Δｎは、示差ＲＩ検出器によって検出されるとおりの屈折率の変化である。
【0215】
（ｄｎ／ｄｃ）ｖは、ＡＡＶベクターの屈折率増分である。
【0216】
（ｄｎ／ｄｃ）ｃｐは、カプシドの屈折率増分である。
【0217】
（ｄｎ／ｄｃ）ＤＮＡは、ベクターゲノムの屈折率増分である。
【0218】
ｘは、カプシドの質量分率である。
【0219】
以下の式を適用することにより、吸光度の変化からカプシド及びベクターゲノムの質量を計算する。
【数23】
【数24】
【0220】
Ａ２８０は、ＵＶ検出器によって検出されるとおりの吸光度である。
【0221】
εｖは、ＡＡＶベクターの吸光係数である。
【0222】
Ｌは、光路長である。
【0223】
εｃｐは、カプシドの吸光係数である。
【0224】
εＤＮＡは、ベクターゲノムの吸光係数である。
【0225】
ｘは、カプシドの質量分率である。
【0226】
以下の式に示されるとおり、屈折率及びＵＶ吸光度から導き出される計算値は、互いに相関する。
【数25】
【数26】
【0227】
ＭＡＬＳ検出器は、静的光散乱法を用いてＡＡＶ粒子のモル質量及び濃度を測定する。以下の式に示されるとおり、０°で散乱する光は、ＡＡＶ粒子のモル質量及び質量濃度に正比例する。
【数27】
【0228】
Ｉ（θ）散乱は、光散乱の強度である。
【0229】
Ｍは、ＡＡＶ粒子のモル質量である。
【0230】
ｃは、ＡＡＶ粒子の濃度である。
【0231】
ｄｎ／ｄｃは、ＡＡＶ粒子の屈折率増分である。
【0232】
ＭＡＬＳ検出器は、動的光散乱によって粒子の平均サイズも測定することができる。動的光散乱では、散乱角に伴う散乱光の変化は、散乱させる分子の平均サイズに比例する。粒子の平均サイズは、流体力学半径（Ｒｈ）及び回転半径（Ｒｇ）の測定値を含む。Ｒｈは、観測下の分子と同じ速度で拡散する均等な剛体球の半径と理解される。Ｒｇは、分子の中心から分子内の各質量要素までの質量加重平均距離と理解される。
【0233】
図１０の（Ａ）及び（Ｂ）は、カプシド及びカプシドに封入されたＤＮＡのモル質量を示す。図１０の（Ａ）及び（Ｂ）に示されるピークは、図８Ａ及び図８Ｂに示されるピークと相関し、ここで、主ピークは、単量体ＡＡＶ粒子を表し、小さいピークは、ＡＡＶ粒子凝集体を表す。図１０の（Ａ）及び（Ｂ）は、単量体ＡＡＶ粒子の粒径が実質的に一様であることも示す。図１０の（Ｃ）及び図１１は、ＡＡＶ粒子の粒径及び分子量を示す。ＡＡＶ粒子の特性のキャラクタリゼーションに加えて、この情報は、ＡＡＶ調製物の力価の定量化にも有用である。図１１でも指摘されるとおり、試料中の軽いカプシドの割合は、分析超遠心法によって０％であることが確認された。
【0234】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析による調製物のＡＡＶ力価の定量化：試料が空のカプシドを含まないと仮定して、以下の式を用いてカプシド及びベクター濃度を計算することができる。
【数28】
【数29】
【0235】
【0236】
空のカプシドを含む調製物のＡＡＶ力価の定量化：図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃは、試料中の核酸の総質量が空のカプシド濃度の増加とともに線形的に減少することを明らかにしている。特に、図１３Ｃは、空のカプシド濃度の増加とともに線形的に減少する核酸画分の総質量を示す一方、図１３Ａ及び図１３Ｂは、空のカプシドの量の増加及びフルカプシドの量の低下とともにタンパク質分率が増加し、タンパク質画分の総質量は同じままであることを示す。空のカプシドの濃度が核酸の総質量に効果を有するため、出発材料中の空のカプシドの割合を決定しなければならない。
ベクターゲノムの重量をカプシドの重量と合わせると、ＡＡＶ粒子の総分子量に等しい。例えば、カプシド分子量が３．７３×１０６キロダルトン（ｋＤａ）であり、４．９キロベース（ｋｂ）のベクターゲノムの分子量が１．５３×１０６ｋＤａであるＡＡＶ粒子は、５．２３×１０６ｋＤａの理論的分子量を有する。しかし、図１４Ａに示されるとおり、ＡＡＶ粒子の分子量測定値は、４．７１×１０６ｋＤａである。図１４Ｂ及び図１４Ｃにも示されるとおり、カプシド及び４．９ｋｂベクターゲノムの分子量測定値は、３．７３×１０６ｋＤＡ及び０．９６×１０６ｋＤａである。
ベクターゲノムの重量をカプシドの重量と合わせると、ＡＡＶ粒子の総分子量に等しい。例えば、カプシド分子量が３．７３×１０６キロダルトン（ｋＤａ）であり、４．９キロベース（ｋｂ）のベクターゲノムの分子量が１．５３×１０６ｋＤａであるＡＡＶ粒子は、５．２３×１０６ｋＤａの理論的分子量を有する。しかし、図１４Ａに示されるとおり、ＡＡＶ粒子の分子量測定値は、４．７１×１０６ｋＤａである。図１４Ｂ及び図１４Ｃにも示されるとおり、カプシド及び４．９ｋｂベクターゲノムの分子量測定値は、３．７３×１０６ｋＤＡ及び０．９６×１０６ｋＤａである。
【0237】
【0238】
分子量の理論値と計算値との相違に取り組むために、ＡＡＶ粒子のパッケージング効率に注目することができる。例えば、４．９ｋｂベクターゲノムの分子量計算値（即ち０．９６メガダルトン（ＭＤａ）及びＡＡＶ粒子の理論的パッケージング限界（即ち４．７ｋｂベクターゲノムの理論的分子量又は１．４４ＭＤａ）に基づいてパッケージング効率を決定するため、以下の式が提供される。
【数30】
【0239】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって決定されるパッケージング効率の予測がつかないことを所与として、以下の式は、試料中の空のカプシドに関する補正を提供する。
【数31】
【0240】
以下の式から、カプシド及びベクター濃度が計算される。
【数32】
【0241】
図１７Ａは、試料中のフルカプシド（即ちＡＡＶ粒子）の総濃度が空のカプシド濃度の増加とともに線形的に減少することを明らかにしている。特に、図１７Ｃは、空のカプシド濃度の増加とともにベクターゲノム濃度が線形的に減少することを示す一方、図１７Ｂは、空のカプシド濃度が増加してもカプシド濃度が同じままであることを示す。
【0242】
異なる試料のサイズ分布の分子量の分析：図１８Ａは、空のカプシドの関数としてカプシドの分子量は一定のままであったが、カプシドに封入されたベクターゲノムの分子量が変化したことを明らかにしている。図１８Ｂは、カプシドのＲｈが一定であることと、Ｒｇが試料中の空のカプシドのパーセント濃度に依存することとを明らかにしている。
【0243】
これらの計算に基づいて、図１９に示されるとおり、空のカプシドのパーセント濃度の推定値を決定することができる。図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ及び図２０Ｄに示されるとおり、これらの推定値は、従来のアッセイと同等である。
【0244】
実施例３：遺伝子療法に用いられるウイルスカプシドの生物物理学的安定性研究
【0245】
材料及び方法
緩衝液成分は、全てＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入した。緩衝液は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシステム（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）の精製水で調製し、０．２μｍポリエーテルスルホン膜（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）でろ過した。
緩衝液成分は、全てＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入した。緩衝液は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシステム（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）の精製水で調製し、０．２μｍポリエーテルスルホン膜（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）でろ過した。
【0246】
ウイルス試料：インハウスのレンチウイルス（ＬＶ）ｐＨ試験試料は、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するクエン酸塩（ｐＨ４．００）、リン酸塩（ｐＨ６．００及びｐＨ８．００）、トリス（ｐＨ７．４０）又は炭酸塩（ｐＨ１０．００）緩衝液で透析した一方、レンチウイルス塩試験試料は、所望の塩濃度（０～１Ｍ）の２ｍＭ ＭｇＣｌ２含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４０）で透析した。透析は、全て０．１ｍＬ、２０ｋＤＡ分子量カットオフＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）ＭＩＮＩ透析装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で１５分の時間をかけて実施した。この方法では、試料が僅かに希釈されたが、透析装置によるＬＶ粒子のサイズ又は構造の変化は、認められなかった（データは示さず）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）試料は、内部プロセス開発ランから入手するか（以下で「供給源Ａ」と称する）、又はＶｉＧｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から取得した（以下で「供給源Ｂ」と称する）。
【0247】
ＬＶ生物物理学的キャラクタリゼーション方法開発：予備的ＳＥＣ実験のため、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬカラム（３００．０ｍｍ×７．８ｍｍ内径）に１００μＬのＬＶ試料を注入し、２×ＰＢＳ、ｐＨ７．４０緩衝液を使用して０．３００ｍＬ／分の流量でイソクラティック溶出を行った。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ＯｐｅｎＬａｂ ＬＣシステムソフトウェアを用いると、時間に応じて溶出画分が自動的に回収され、１７～４１分で各画分について２分間回収された。方法の最適化には、２つのカラム、３つの流量及び９つの緩衝液の評価が含まれ、表Ｂにまとめた。予備実験に使用したＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬカラムを選択し、トリス緩衝液移動相（２０ｍＭトリス、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４０）で０．３００ｍＬ／分の流量とした。実験は、全て２２～２５℃で実施した。
【表2】
【0248】
サイズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱法の併用（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）：自動熱制御型１２９０バイアルサンプラーとバイナリポンプとからなるＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＳＥ－ＨＰＬＣ実験を実施した。２８０ｎｍ及び２６０ｎｍのＵＶ吸光度を多波長ダイオードアレイ検出器によって検出し、且つＨＰＬＣシステムの制御及びＵＶ吸光度データの分析には、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ＯｐｅｎＬａｂ ＬＣシステムソフトウェアを使用した。本発明者らのＬＣシステムと併用して、ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ １８角度検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＯｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってＭＡＬＳ信号を検出した。ＭＡＬＳデータの取得及び分析には、Ａｓｔｒａ ７．１．２ソフトウェアを使用した。レンチウイルス実験について、２５μＬの試料をＴＳＫＧｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬカラムにトリス緩衝液移動相で０．３ｍＬ／分の流量として注入した（上記に記載されるとおり）。試料は、全てフリーザーから出して２５℃で解凍した後に直接注入した。いずれも注入後に２２～２５℃で実施した。アデノ随伴ウイルス粒子実験について、２５μＬの試料を注入し、イソクラティック溶出に２×ＰＢＳ＋１０％ ＥｔｏＨを使用して、１ｍＬ／分の流量を適用した。試料は、全て注入前にフリーザーから出して３７℃で解凍した。いずれも注入後に２２～２５℃で実施した。
【0249】
遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）分光法：２５℃でサーモスタット制御された、６位置キュベットホルダーを備えたＪａｓｃｏ Ｊ－１５００分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ、ＯＫ、ＵＳＡ）を使用して遠紫外ＣＤスペクトルを収集した。レンチウイルス実験について、０．１ｍｍ経路長キュベットに３０μＬの試料をロードした一方、アデノ随伴ウイルス実験について、１ｍｍ経路長キュベットに１７０μＬの試料をロードした。データは、全て１９０ｎｍ～２５０ｎｍ波長範囲において０．２ｎｍの分解能、走査速度５０ｎｍ／分、応答時間４秒及び帯域幅２ｎｍで収集した。提示されるスペクトルは、１０回の連続した測定の平均値である。
【0250】
動的光散乱法（ＤＬＳ）：ＵＮｃｌｅオールインワン生物調製物安定性スクリーニングプラットフォーム（ＵＮｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、Ｆｒｅｅｆｏｒｍモード下で設計した段階的温度ランプの経過にわたるＤＬＳ測定値を記録した。このフリーフォーム法は、可能な限り短い時間で２５～９５℃まで２度ずつ増分する測定が実現するように設計した。Ｕｎｉウェルに８．８μＬの試料をロードした後、直接測定した。各試料について各５秒で４回のＤＬＳ測定を取った。試料は、全てトリプリケートで測定した。
【0251】
内部カプシド蛍光：ＵＮｃｌｅ機器の「Ｔｍ＆Ｔａｇｇ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｏｎａｌ ＤＬＳ」アプリケーションを使用して、露出したトリプトファン又はチロシンカプシドタンパク質残基の内部蛍光を記録した。４７３ｎｍの波長のレーザー励起光を使用して、５００～７００ｎｍの波長の蛍光発光スペクトルを記録した。Ｕｎｉウェルに８．８μＬの試料をロードし、２５から９５℃まで２．５℃ずつ増分する段階的熱ランプで加熱した。試料は、全てトリプリケートで測定した。
【0252】
外部カプシド蛍光：ＵＮｃｌｅ機器の「Ｔｍ Ｗｉｔｈ ＳＹＰＲＯ」アプリケーションを使用して、試料の外部蛍光を記録した。リン酸緩衝液で推奨ワーキング濃度に希釈したＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を各試料に加えた後、直ちに８．８μＬ Ｕｎｉウェルにロードした。内部蛍光実験で使用したのと同じ励起／発光波長及び温度プログラムに従った。測定は、全てトリプリケートで行った。温度の関数としての蛍光強度をボルツマン方程式に当てはめて、最も低い変性温度を決定した。転移温度値は、転移の中点又は変曲点に対応する。
【0253】
アルカリアガロースゲル電気泳動：被包されたゲノムのサイズ分布を０．８％アガロースゲル電気泳動によりＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色剤（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で染色し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃイメージングシステムを使用してＵＶ光下で視覚化して確認した。アガロースゲルは、０．８ｇ ＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロースを１００ｍＬ １×アルカリ性緩衝液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解して調製した。電気泳動前、１．０Ｅ＋１１ｖｇの試料を１．５μＬ １０％ＳＤＳ（Ａｍｂｉｏｎ）及び７．５μＬ ６×アルカリ性ゲルローディング色素（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）に加え、１×アルカリ性緩衝液で２５μＬにした。トリプリケートのランのために、７．８μＬの１ｋｂラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を６．３μＬ １０％ＳＤＳ、３０μＬ ６×アルカリ性ローディング色素及び３０．９５μＬの１×アルカリ性緩衝液に加えた。１８μＬの試料及びラダーをゲルにロードし、それを、５２Ｖ／ｃｍを用いて３．５時間分離させた後、中和緩衝液（１Ｍトリス－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４０）による１０分間の洗浄を３回行った。ゲル上のＤＮＡをＧｅｌＲｅｄ溶液（３０μＬ ＧｅｌＲｅｄ、２０ｍＬ中和緩衝液、１８０ｍＬ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏ）で３０分間染色し、続いてＭｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏによる１０分間の洗浄を３回行った。ＤＮＡは、ＣｈｅｍｉｄｏｃイメージングシステムでＧｅｌＲｅｄ読み取り設定を用いて視覚化した。
【0254】
結果
サイズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱の併用によるレンチウイルス粒子の定性的及び定量的キャラクタリゼーション
Ｓｔｅｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１４８７：８９－９９，２０１７）において以前に概説されている、ウイルス様粒子をキャラクタリゼーションする方法を出発点として用いて、ＬＶ粒子を生物物理学的に分析するＳＥＣ－ＭＡＬＳ方法を開発した。この方法により、ＬＶ粒子を定性的及び定量的に評価することが可能となり、ＬＶ粒子力価を迅速に推定するための新規の再現性のある方法が提供された。
サイズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱の併用によるレンチウイルス粒子の定性的及び定量的キャラクタリゼーション
Ｓｔｅｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１４８７：８９－９９，２０１７）において以前に概説されている、ウイルス様粒子をキャラクタリゼーションする方法を出発点として用いて、ＬＶ粒子を生物物理学的に分析するＳＥＣ－ＭＡＬＳ方法を開発した。この方法により、ＬＶ粒子を定性的及び定量的に評価することが可能となり、ＬＶ粒子力価を迅速に推定するための新規の再現性のある方法が提供された。
【0255】
１００μＬの粗ＬＶ試料及び精製ＬＶ試料の両方をＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬカラムに注入することにより、予備的ＳＥＣ実験を実施した（図２１）。ｐＨ７．４０の２×ＰＢＳを溶出緩衝液として使用し、０．３ｍＬ／分の流量を適用した。ＳＥＣ溶出プロファイル、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって検出される。画分１～１２は、精製ＬＶ試料の注入後に収集されたものであり、丸で囲んだ画分をｐ２４及びｄｄＰＣＲ分析に選択した。これらの分析により、１９分の目盛り辺りにあるピークによって表される、カラムの空隙容量中に溶出するＬＶ粒子の存在が確認された。２５～４５分の残りのピークは、タンパク質又は核酸試料不純物を表す。
【0256】
粗ＬＶ ＳＥＣプロファイルの初期検査から、実質的な試料不均一性が明らかとなり、２５～４０分の溶出時間のピークの分解能は、最小限であった。しかしながら、精製ＬＶ ＳＥＣプロファイルでは、これらのピークが著しく低下した。メガダルトンサイズ範囲というＬＶの大きさを考えれば、ＬＶ粒子は、１９分の目盛り辺りの初期ピークによって表される、保持されない大型分子が溶出するところであるカラムの空隙容量内に溶出するであろうことが予想された。実際に、この時点で溶出するＬＶ粒子の存在は、精製ＬＶ注入の様々な溶出画分（図１～３、図６及び図９）のｐ２４及びドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析によって確認された（表Ｃ）。
【表3】
【0257】
選択された画分のｐ２４ ＥＬＩＳＡ分析から、空隙容量ピークに対応した、２番目の画分のｐ２４濃度が最も高いことが明らかになった（図２１及び表Ｃ）。これらの結果と一致して、ｄｄＰＣＲ画分分析により、画分２及び３のＬＶ ＲＮＡ濃度が最も高いことが確認され（表Ｄ）、空隙容量ピークにおけるＬＶ粒子の溶出が更に裏付けられた。２５～４５分の残りのＵＶピークは、残留タンパク質及び核酸不純物の溶出を表すものと考えられる。約１９分後に溶出する１番目のピークによって表されるＬＶ溶出の同定に伴い、続く方法開発は、分解能の亢進及びこのピークと残りの不純物ピークとの分離に焦点を置いた。
【0258】
ＬＶクロマトグラフィー法を最適化するために、様々なカラム、流量及び緩衝液（表Ｂにまとめる、実施例１）を評価した。カラムスクリーニングを行ったが、他の試料不純物の溶出との空隙容量における有効なＬＶ分離のため、予備実験に使用した元のＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬカラムを最終的に選択した。加えて、流量が０．３００ｍＬ／分を超えて増加すると、ＬＶベクターと不純物溶出との間の時間が短くなり、ピーク分離が最小限になることが分かった（データは示さず）。結果として、予備実験で適用した元の０．３００ｍＬ／分流量も選択して先に進めた。カラムへのベクターの吸着を最小限に抑えつつ、ＬＶベクター安定性を最大化することを目的として緩衝液をスクリーニングした。この均衡を見出すことは、ウイルスベクタークロマトグラフィーの最適化において大きい課題となる。ＬＶ試料添加剤は、ベクター構造を安定化させる役割を果たし得る一方、添加剤は、ベクター－カラム疎水性相互作用に対して効果を発揮し、従ってカラムへのベクター吸着に影響を与えることもある。
【0259】
本研究では、緩衝液成分としてＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２及びスクロースを評価した。細胞質ゾルのｐＨに対応するｐＨ７．４０が好ましいため、異なるｐＨ値は、スクリーニングしなかった。リン酸塩が金属イオンなどの試料添加剤と相互作用し易いことを所与として、緩衝液としては、予備実験で使用したＰＢＳよりむしろトリスも評価した。この緩衝液スクリーニングプロセスにより、３つの注目すべき観察結果が明らかになった。第一に、移動相にエタノールを加えると、最小限（約１０％）でもＬＶ ＵＶピーク信号が大幅に低下したことから（データは示さず）、アルコールの存在下では、ＬＶベクターは、分解、凝集又は沈殿する傾向があり得ることが示唆される。第二に、カラムへのＬＶベクターの吸着を防止するには、ＮａＣｌ濃度が３００ｍＭ未満のときのＬＶ ＵＶピーク信号の喪失及び試料ピーク保持の増加からも明らかなとおり、少なくとも３００ｍＭのＮａＣｌが必要であった（図２２）。第三に、ＭｇＣｌ２はＵＶ吸光度信号に影響を与えなかったが、移動相にスクロースが存在すると、相当量の吸着及びピーク保持が生じた（データは示さず）。これらの観察結果に照らせば、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬカラムに０．３００ｍＬ／分の流量で適用されるｐＨ７．４０の３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭトリス緩衝液は、全ての続くＬＶクロマトグラフィー実験に選択されるパラメータであった。
【0260】
ＬＶ生物物理学的キャラクタリゼーション方法を開発して、利用可能なデータの範囲を広げる手段としてＳＥＣをＭＡＬＳと併用することについて評価した。上記に概説したクロマトグラフィーパラメータに従い、４０μＬの精製ＬＶをトリプリケートで別々の日に注入して、平均ＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルを入手した（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。ＳＥＣ ＵＶプロファイルには、４つの識別可能なピークが観察されたが（図２３Ａ）、ＭＡＬＳ溶出プロファイルには、１つの優勢なピークのみが観察され、注目すべきことに、これは、ＬＶ ＳＥＣ溶出ピークに対応した（図２３Ｂ）。
【0261】
ＬＶ粒子は、その大きいメガダルトンサイズに起因して光をかなり散乱すると予想される。そのため、理論的には、ＬＶ粒子の溶出は、大きいＭＡＬＳピーク（１７分の目盛り辺り）によって表されることになる。実際、ＳＥＣ溶出プロファイルには、空隙容量ピークに対応するそのようなピークが存在し、この時点でのＬＶ粒子の溶出を示す先に報告したｐ２４及びｄｄＰＣＲ結果が更に裏付けられる。加えて、ＳＥＣ溶出プロファイルには、不純物ピーク（ピーク２～４）に対応するＭＡＬＳピークがなく、それらの不純物が小さいタンパク質又は核酸不純物であり、あまり多くの光を散乱させることができないことが指摘される。
【0262】
優勢なＭＡＬＳピークのモル質量分析では、ＭＡＬＳピークの前半にかけたモル質量の下落によって指示されるとおり、カラムの空隙容量にＬＶベクター粒子とともに溶出する高次種の存在が示された。このデータは、空隙容量ピークの後半によって表される２番目の溶出画分にｐ２４及びＬＶ ＲＮＡコピーの大多数を検出したｐ２４及びｄｄＰＣＲ分析に対応する（図２１及び表Ｃ）。重要なことに、優勢なＭＡＬＳピークの後半の初期定量分析では、この時点で溶出する粒子は、ＬＶ粒径の文献値と一致する平均分子量及び半径を有すること明らかになった（表Ｄ）。ＳＥＣ、ｐ２４、ｄｄＰＣＲ及びＭＡＬＳ分析結果は、全てが空隙容量ピークの後半にＬＶ粒子の溶出を示したことに伴い、続く方法開発は、ＭＡＬＳ数密度手順を利用して、この時間フレームで溶出するＬＶ粒子の力価推定を実現することに焦点を置いた。
【表4】
【0263】
ＬＶ溶出ピークが同定されたことに伴い、線形性試験によってＭＡＬＳによるＬＶ粒子の定量化を評価した。１０μＬ、２０μＬ、４０μＬ及び８０μＬのＬＶ試料容積をトリプリケートで別々の日に注入し、ＭＡＬＳ数密度手順を用いて評価した。ＭＡＬＳピークは、注入量に比例し（図２４Ａ）、且つ初期ＭＡＬＳ分析及び文献値と一致して、１７分辺りに溶出したＬＶ粒子の平均分子量及び半径は、それぞれ１．２７Ｅ＋０８±０．０６Ｄａ（ｎ＝１０）及び６２．５０±３ｎｍ（ｎ＝１２）であった。ＭＡＬＳ検出器によって分析したＬＶ粒子のサイズは、注入間で一貫性を保ったが、検出された粒子の数は、試料容積とともに線形的に増加した（表Ｅ）。線形モデルの確認は、１０μＬ～８０μＬのＬＶ試料注入量間で９５％信頼区間とともにＦ検定統計によって達成され、傾き平均値は、１．０×１０５であり、切片平均値は、１．１×１０－５であり、及び相関係数平均値は、０．９９４７であった（図２４Ｂ）。従って、先に進めると、試料不均一性及び分子量分布などの定性的試料情報と、溶液中のウイルス粒子の定量的情報、即ち直径、分子量及び数密度との両方を得るための有用な生物物理学的ツールとして、ＳＥＣ－ＭＡＬＳが確立された。注目すべきことに、ウイルス粒子の直接的な定量化が可能であり、検量線が不要なこのＭＡＬＳ数密度手順は、ウイルス粒子力価を迅速に推定する新規の信頼性の高い方法であることが示された。
【表5】
【0264】
レンチウイルスのｐＨ安定性研究
ＳＥＣ－ＭＡＬＳベースの方法を開発し、それがＬＶ粒子を定性的及び定量的に判定する有用な手段であることが実証されたため、それを続くＬＶ ｐＨ安定性研究に適用した。ＬＶ試料をそれぞれのｐＨ緩衝液で透析した後、上記に記載した線形性試験と同じ条件下で直接注入した。幅広いｐＨ範囲が網羅されるように、ｐＨ４．００、７．４０及び１０．００でのＬＶのＳＥＣ溶出プロファイルをモニタした。先述のとおり、インハウスｄｄＰＣＲ及びｐ２４分析により、注入後約１７分のこのカラムからのＬＶの溶出が確認された。注目すべきことに、ｐＨ４．００でのＬＶ粒子のＳＥＣ溶出プロファイルでは、ＬＶ ２８０ｎｍ ＵＶ主ピークがほぼ完全に失われた（図２５Ａ）。更に、ｐＨ１０．００でのＬＶ粒子の溶出プロファイルでは、ｐＨ７．００と比較して、このピークが拡大した（図２５Ａ）。これと同じ傾向がＭＡＬＳプロファイルにも映し出されており（図２５Ｂ）、ＬＶ ＭＡＬＳ突出ピークがｐＨ１０．００プロファイルでは拡大し、ｐＨ４．００プロファイルでは急減した。これらの観察結果と一致して、ＭＡＬＳ粒子数及びサイズ分析（表Ｆ）では、それぞれｐＨ７．４０及び１０．００と比較してｐＨ４．００で粒子数が約１５～約２０分の１に減少したことが明らかになった。加えて、ｐＨ４．００の粒子流体力学半径は、一貫して保たれていた一方、ｐＨ４．００粒子の分子量は、文献値の約３分の１であった（表Ｆ）。ｐＨ７．４０及び１０．００でのＬＶ粒子のサイズは、一貫していた一方、ｐＨ１０．００での粒子数は、ｐＨ１０．００ ＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルで観察されたピークサイズの増加と一致して約１倍増加した（表Ｆ、図２５Ａ及び図２５Ｂ）。これらの結果から、低ｐＨでベクターが分解されるのみならず、恐らく高ｐＨでベクターの完全性が維持されることが示唆された。
ＳＥＣ－ＭＡＬＳベースの方法を開発し、それがＬＶ粒子を定性的及び定量的に判定する有用な手段であることが実証されたため、それを続くＬＶ ｐＨ安定性研究に適用した。ＬＶ試料をそれぞれのｐＨ緩衝液で透析した後、上記に記載した線形性試験と同じ条件下で直接注入した。幅広いｐＨ範囲が網羅されるように、ｐＨ４．００、７．４０及び１０．００でのＬＶのＳＥＣ溶出プロファイルをモニタした。先述のとおり、インハウスｄｄＰＣＲ及びｐ２４分析により、注入後約１７分のこのカラムからのＬＶの溶出が確認された。注目すべきことに、ｐＨ４．００でのＬＶ粒子のＳＥＣ溶出プロファイルでは、ＬＶ ２８０ｎｍ ＵＶ主ピークがほぼ完全に失われた（図２５Ａ）。更に、ｐＨ１０．００でのＬＶ粒子の溶出プロファイルでは、ｐＨ７．００と比較して、このピークが拡大した（図２５Ａ）。これと同じ傾向がＭＡＬＳプロファイルにも映し出されており（図２５Ｂ）、ＬＶ ＭＡＬＳ突出ピークがｐＨ１０．００プロファイルでは拡大し、ｐＨ４．００プロファイルでは急減した。これらの観察結果と一致して、ＭＡＬＳ粒子数及びサイズ分析（表Ｆ）では、それぞれｐＨ７．４０及び１０．００と比較してｐＨ４．００で粒子数が約１５～約２０分の１に減少したことが明らかになった。加えて、ｐＨ４．００の粒子流体力学半径は、一貫して保たれていた一方、ｐＨ４．００粒子の分子量は、文献値の約３分の１であった（表Ｆ）。ｐＨ７．４０及び１０．００でのＬＶ粒子のサイズは、一貫していた一方、ｐＨ１０．００での粒子数は、ｐＨ１０．００ ＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルで観察されたピークサイズの増加と一致して約１倍増加した（表Ｆ、図２５Ａ及び図２５Ｂ）。これらの結果から、低ｐＨでベクターが分解されるのみならず、恐らく高ｐＨでベクターの完全性が維持されることが示唆された。
【表6】
【0265】
ｐＨがＬＶ粒子分解に及ぼす効果を包括的に評価するため、円偏光二色性（ＣＤ）を用いて、ｐＨがＬＶ二次構造に及ぼす効果を決定した。ＣＤスペクトルは、光及びキラル分子の累積的な相互作用から生じる。各タンパク質は、特定のＣＤシグネチャを有し、これは、主にタンパク質の全体的な三次元構造の影響を受ける。このため、ＣＤは、タンパク質二次構造の分析に有用なツールとなる。更に、αヘリックス及びβシートなどのタンパク質の二次構造要素は、特徴的なＣＤ信号を有する。αヘリックス優勢な構造は、約２１０ｎｍ及び２２０ｎｍの２つの極小によって特徴付けられる一方、優勢にβシートからなる構造は、約２２０ｎｍの１つの極小によって特徴付けられる。ｐＨ７．４０でのＬＶ粒子のＣＤデータは、αヘリックス優勢な立体構造を示唆している（図２６）。ＬＶ ｐＨ試料のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析と一致して、このαヘリックス立体構造は、ｐＨ４．００のＬＶ粒子で完全に失われており、完全なベクター分解が示唆される。しかしながら、ｐＨ１０．００のＬＶ粒子では、ベクタータンパク質の立体構造は、保持されており、高ｐＨがＬＶベクターの完全性を保護する役割を果たすという考えを裏付けている。
【0266】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ及びＣＤの両方のデータの結果が一貫してｐＨとＬＶ粒子の完全性との間の正の相関を示唆していることに伴い、温度の増加に伴うＬＶ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）をモニタすることにより、ｐＨの関数としてのＬＶ粒子の熱安定性を評価した。ＤＬＳは、溶液中に懸濁された粒子が拡散する速度を測定する。こうした粒子は、大きい粒子が小さい粒子よりも緩徐に拡散することを定めるブラウン運動を起こす。ＤＬＳは、粒子が拡散する速度に基づいて粒子のサイズを近似する。タンパク質のアンフォールディングは、その凝集と関連付けられるため、ＤＬＳ融解曲線を用いてＬＶ粒子の融点を決定することができる。換言すれば、ＬＶ粒子のタンパク質がアンフォールディングするにつれて、粒子が凝集し、まとまって光を散乱し、それがＤＬＳ機器によって１つの大きい粒子として認識される。従って、粒径の急な増加は、温度に伴うタンパク質のアンフォールディングを示している。注目すべきことに、ｐＨ４．００での透析後に直接ＤＬＳ判定した粒子は、ＤＬＳ機器の検出限界（＞１０００ｎｍ直径）を超えて既に凝集していた。このため、ｐＨ６．００、７．４０及び１０．００で透析したＬＶ粒子のＤＬＳ融解曲線を報告する（図２７Ａ及び図２７Ｂ）。これらの結果から、ｐＨ６．００のＬＶ粒子の熱的安定性が最も低く、融解温度が約４７℃であり、続いてｐＨ７．４０のものであり、融解温度が約５３℃であり、及び最後にｐＨ１０．００が約６１℃であったことが示された（図２７Ｂ）。興味深いことに、ｐＨ６．００及び７．４０のＬＶ粒子は、融解直後にＤＬＳ機器の検出上限に達したが、ｐＨ１０．００のＬＶ粒子がこの上限に達することはなかった（図２７Ａ）。従って、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、ＣＤ及びＤＬＳによって評価したとき、ＬＶ粒子の完全性は、３つ全ての技法から得られた結果が低ｐＨでのベクター分解及び高ｐＨでのベクター維持を示唆するとおり、ｐＨと直接相関するように見える。
【0267】
レンチウイルス塩安定性研究
ｐＨに加えて、ｐＨの関数としてのＬＶ粒子安定性について、同じＳＥＣ－ＭＡＬＳベースの方法及び生物物理学的ツールを用いて評価した。ＬＶ試料をそれぞれの塩緩衝液で透析した後、上記に記載した線形性及びｐＨ試験と同じクロマトグラフィー条件下で直接注入した。０ｍＭ、３００ｍＭ及び１Ｍ ＮａＣｌにおけるＬＶのＳＥＣ溶出プロファイルをモニタした。興味深いことに、ｐＨ安定性試験と異なり、塩濃度の関数としてのＬＶ試料ＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルに大きい差は観察されなかった（図２８Ａ及び図２１Ｂ）。同様に、優勢なＭＡＬＳピーク間の分子重量の傾向は、イオン化条件間で一貫していた（図２８Ｂ）。加えて、３つ全てのイオン化条件でＭＡＬＳによって決定されたＬＶ粒子のサイズは、文献値と一致しており、塩濃度の増加とともにＬＶ粒子数が僅かに増加した。
ｐＨに加えて、ｐＨの関数としてのＬＶ粒子安定性について、同じＳＥＣ－ＭＡＬＳベースの方法及び生物物理学的ツールを用いて評価した。ＬＶ試料をそれぞれの塩緩衝液で透析した後、上記に記載した線形性及びｐＨ試験と同じクロマトグラフィー条件下で直接注入した。０ｍＭ、３００ｍＭ及び１Ｍ ＮａＣｌにおけるＬＶのＳＥＣ溶出プロファイルをモニタした。興味深いことに、ｐＨ安定性試験と異なり、塩濃度の関数としてのＬＶ試料ＳＥＣ－ＭＡＬＳプロファイルに大きい差は観察されなかった（図２８Ａ及び図２１Ｂ）。同様に、優勢なＭＡＬＳピーク間の分子重量の傾向は、イオン化条件間で一貫していた（図２８Ｂ）。加えて、３つ全てのイオン化条件でＭＡＬＳによって決定されたＬＶ粒子のサイズは、文献値と一致しており、塩濃度の増加とともにＬＶ粒子数が僅かに増加した。
【表7】
【0268】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いると、塩濃度がＬＶ粒子分解に及ぼす効果は、明らかでなかったが、ＣＤを用いて、イオン強度とともにＬＶ二次構造が変化したかどうかを見た。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ結果と一致して、３つ全てのイオン化条件でＬＶ粒子についてαヘリックス優勢な構造が観察されたことから（図２９）、塩濃度がＬＶ粒子の完全性に対していかなる即時的な効果も及ぼさないことが更に示唆される。
【0269】
イオン化条件は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ及びＣＤによって観察したとき、ＬＶ粒子の完全性に対していかなる即時的な効果も及ぼさなかったが、ＬＶ粒子の熱安定性に対するその効果を、ＤＬＳ熱ランプを用いて評価した。興味深いことに、ＬＶ粒子の熱安定性は、塩濃度とともに増加することが分かった。０ｍＭ、３００ｍＭ及び１Ｍ ＮａＣｌで透析したＬＶ粒子のＤＬＳ融解曲線を報告する（図３０Ａ）。これらの結果から、０ｍＭ ＮａＣｌのＬＶ粒子の熱的安定性が最も低く、融解温度が約５０℃であり、続いて３００ｍＭ ＮａＣｌのものであり、融解温度が約５３℃であり、及び最後に１Ｍ ＮａＣｌが約６３℃であったことが示された（図３０Ｂ）。従って、ＬＶ粒子は、低イオン化条件で安定性が低く、高い塩濃度は、凝集傾向を減少させる一方、ＬＶ粒子安定性を増加させる役割を果たすように見える。
【0270】
アデノ随伴ウイルス５型熱的完全性研究
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて、被包されたゲノムのサイズがＡＡＶカプシドの熱安定性に及ぼす役割を研究した。この技法では、アンフォールディングしたタンパク質の疎水性領域に結合する蛍光色素（多くの場合にＳＹＰＲＯ－ｏｒａｎｇｅ（商標））の存在下でカプシドを加熱する。カプシドタンパク質がアンフォールディングするにつれて、その疎水性ポケットが露出し、色素の結合が可能となり、蛍光が増加する。従って、蛍光の増加は、温度に伴うタンパク質のアンフォールディングの指標となる。この技法を用いて、被包されたゲノムのサイズに関係なく、ＡＡＶ５カプシドの融解温度は、約８９℃と報告されている。実際、類似の方法を用いると、空（被包されているゲノムがない）及びフル（ゲノムが被包されている）のｒＡＡＶ５カプシドの融解温度は、これらの報告と一致した（図３１Ａ）。これらの結果は、カプシドタンパク質のトリプトファン及びチロシン残基の内部蛍光を測定して入手した。タンパク質がアンフォールディングするにつれて、そのトリプトファン及びチロシン残基の溶媒への露出が増し、それによってその蛍光が増加する。従って、ＤＳＦと同様に、内部蛍光の増加は、温度に伴うタンパク質のアンフォールディングを意味する。これらの初期結果は、カプシドの熱安定性の決定においてゲノムサイズが意味を有さないことを裏付けるように見えたが、その後間もなく、ＣＤを用いて、逆のことを裏付ける結果が達成された。空及びフルのカプシドの初期の代表的な遠紫外ＣＤスペクトルは、２１０ｎｍ及び２７０ｎｍで差を示した（図３１Ｂ）。空のカプシドのＣＤスペクトルは、顕著な２１０ｎｍの極小がある、αヘリックス優勢な立体構造を示唆する曲線を呈し、それと比較して、フルカプシドは、むしろβシートを指し示す２２０ｎｍに極小のある曲線を有した。意外ではないが、フル－カプシドのＣＤスペクトルは、ＤＮＡが光を吸収する２７０ｎｍでの吸収を示し、これは、空のカプシドで観察されないものであった。注目すべきことに、空及びフルの両方のカプシドについてＣＤで入手された融解温度は、以前の報告と一致したが、フルカプシドについて、空のカプシドに見られない二相性の融解曲線が観察された（図３１Ｃ及び図３１Ｄ）。この二相性の曲線は、２２０ｎｍ（図３１Ｃ）及び２７０ｎｍ（図３１Ｄ）でＣＤ楕円率をモニタしたときに観察された。これらの結果から、軽いカプシドと比較したフルカプシドの熱的完全性に関して更なる研究が必要となった。
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて、被包されたゲノムのサイズがＡＡＶカプシドの熱安定性に及ぼす役割を研究した。この技法では、アンフォールディングしたタンパク質の疎水性領域に結合する蛍光色素（多くの場合にＳＹＰＲＯ－ｏｒａｎｇｅ（商標））の存在下でカプシドを加熱する。カプシドタンパク質がアンフォールディングするにつれて、その疎水性ポケットが露出し、色素の結合が可能となり、蛍光が増加する。従って、蛍光の増加は、温度に伴うタンパク質のアンフォールディングの指標となる。この技法を用いて、被包されたゲノムのサイズに関係なく、ＡＡＶ５カプシドの融解温度は、約８９℃と報告されている。実際、類似の方法を用いると、空（被包されているゲノムがない）及びフル（ゲノムが被包されている）のｒＡＡＶ５カプシドの融解温度は、これらの報告と一致した（図３１Ａ）。これらの結果は、カプシドタンパク質のトリプトファン及びチロシン残基の内部蛍光を測定して入手した。タンパク質がアンフォールディングするにつれて、そのトリプトファン及びチロシン残基の溶媒への露出が増し、それによってその蛍光が増加する。従って、ＤＳＦと同様に、内部蛍光の増加は、温度に伴うタンパク質のアンフォールディングを意味する。これらの初期結果は、カプシドの熱安定性の決定においてゲノムサイズが意味を有さないことを裏付けるように見えたが、その後間もなく、ＣＤを用いて、逆のことを裏付ける結果が達成された。空及びフルのカプシドの初期の代表的な遠紫外ＣＤスペクトルは、２１０ｎｍ及び２７０ｎｍで差を示した（図３１Ｂ）。空のカプシドのＣＤスペクトルは、顕著な２１０ｎｍの極小がある、αヘリックス優勢な立体構造を示唆する曲線を呈し、それと比較して、フルカプシドは、むしろβシートを指し示す２２０ｎｍに極小のある曲線を有した。意外ではないが、フル－カプシドのＣＤスペクトルは、ＤＮＡが光を吸収する２７０ｎｍでの吸収を示し、これは、空のカプシドで観察されないものであった。注目すべきことに、空及びフルの両方のカプシドについてＣＤで入手された融解温度は、以前の報告と一致したが、フルカプシドについて、空のカプシドに見られない二相性の融解曲線が観察された（図３１Ｃ及び図３１Ｄ）。この二相性の曲線は、２２０ｎｍ（図３１Ｃ）及び２７０ｎｍ（図３１Ｄ）でＣＤ楕円率をモニタしたときに観察された。これらの結果から、軽いカプシドと比較したフルカプシドの熱的完全性に関して更なる研究が必要となった。
【0271】
熱への曝露に伴う完全性について、空のカプシドとフルカプシドとの間に差があるかどうかを確かめるため、ＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いて、２５℃～９５℃の範囲において１０℃間隔でインキュベートした両方のタイプのカプシドを評価した。カプシド試料をそれぞれの温度毎に３０分間インキュベートした後、２×ＰＢＳ＋１０％ＥｔＯＨ移動相で１．０ｍＬ／分の流量として直接注入した。２５℃でインキュベートした後、両方のカプシドタイプとも、注入後１１分辺りに優勢な２８０ｎｍ ＵＶピーク（図３２Ａ及び図３２Ｂ）及び対応するＭＡＬＳピーク（図示せず）のある一様なＳＥＣプロファイルを呈した。このプロファイルは、空及びフルの両方のカプシドについて、３５℃でインキュベートした後も変わらないままであったが、続く注入における熱の増加とともに、２つの極めて異なる傾向が観察された（図３２Ａ、図３２Ｂ及び図３２Ｃ）。空のカプシドについて、４５℃から７５℃まで優勢なカプシドピークの段階的な約１５％の低下が観察された（図３２Ａ及び図３２Ｃ）。８５℃でインキュベートした後、主ピークのパーセンテージは、元の約６５％に下落し、次に９５℃でインキュベートした後、ほぼ０％まで急落した（図３２Ａ及び図３２Ｃ）。全く対照的に、フルカプシドの主ピークは、４５℃でインキュベートした後に約２０％下落し、次に６５℃までに元の約１０％まで急落した（図３２Ｂ及び図３２Ｃ）。空及びフルの両方のカプシドのＵＶプロファイルで観察された傾向は、ＭＡＬＳ溶出プロファイルとよく類似していた（データは示さず）。核酸は、２６０ｎｍの光を吸収する一方、タンパク質は、２８０ｎｍを吸収するため、２６０ｎｍと２８０ｎｍとのＵＶ溶出プロファイルの曲線下面積を比較して２６０：２８０比を求めることは、タンパク質－ＤＮＡカプシド複合体のキャラクタリゼーションにおいて有用なツールであり得る。温度の関数としてこの比をモニタすることにより、空のカプシドにないフルカプシドにおける興味深い転移が明らかになった。予想どおり、フルカプシドの当初の２６０：２８０比は、その被包されているゲノムに起因して、２５℃で軽いカプシドよりもはるかに高かった（約１．４対約０．６）（図３２Ｄ）。しかしながら、空のカプシドの２６０：２８０比は、７５℃まで一定のままであったが、フルカプシドについて、６０℃辺りにこの比の下落が観察された（図３２Ｄ）。これらの結果から、フルカプシドにおける被包されたＤＮＡの量がこの温度で減少したことが指摘され、カプシド構造の破壊及び続くＤＮＡ漏出の可能性が示唆された。これを更に探るため、ＭＡＬＳタンパク質コンジュゲート手順を用いて、空及びフルの両方のカプシドのタンパク質及び被包されたＤＮＡの分子量を温度の関数として別々にモニタした。この分析により、空及びフルの両方のカプシドについてタンパク質カプシドの分子量が２５℃から６５℃まで一定のままであるのに対して（図３３Ａ）、重いカプシドの被包されたＤＮＡの分子量は、温度の関数として減少する（図３３Ｂ）ことが確認された。これらの結果から、ゲノムを含有するカプシドは、１）空のカプシドの破壊、及び２）カプシドタンパク質の融解よりもはるかに早い温度で破壊され、その被包されたＤＮＡがこぼれ出すという考えが裏付けられた。重要なことに、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによって判定したときのフルカプシドの熱安定性で観察された傾向は、ＣＤ融解曲線で観察された二相性イベントと一致していたことから、９０℃辺りでカプシドタンパク質が融解するはるかに前にカプシド破壊が起こる転移温度が存在することが指摘される。
被包されたゲノムの存在がカプシドの安定性に影響を与えるという考えを裏付けるエビデンスを得て、ゲノムサイズが熱的完全性に及ぼす効果を更に厳密にモニタするため、様々な一本鎖ゲノムサイズの外被をなすｒＡＡＶ５カプシドを判定した。カプシドタンパク質が９０℃で融解する前にカプシドの完全性が実際に損なわれた場合、ＤＮＡが溶液中に放出されるはずである。従って、カプシドの分解をモニタするため、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸色素を用いて外部カプシド蛍光をモニタした。この方法の背後にある前提には、カプシドから溶液中に吐き出されたＤＮＡにＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素が結合することが含まれている（図３４Ａ）。カプシドが壊れるにつれて、より多くのＤＮＡがＳＹＢＲ ｇｏｌｄに結合することが可能となり、蛍光曲線の強度が増加する。従って、カプシド融解温度（ＤＳＦ及び内部蛍光によって評価されるとおり）よりむしろ外部蛍光曲線を用いると、カプシドの破壊をモニタすることができる。この方法を試験するため、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ色素と混合したフル及び空の両方のｒＡＡＶ５カプシドの蛍光を２５℃から９５℃まで測定した。予想どおり、フルカプシドの蛍光曲線は、温度とともに増加し（図３４Ｂ）、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ色素が吐き出されたＤＮＡに結合したことが示された一方、空のカプシドの蛍光曲線は、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄが結合するＤＮＡがないことに起因して、無視できる程度であった（データは示さず）。蛍光曲線下面積を温度の関数としてプロットすることにより、重いカプシドについて特徴的な傾向及び転移温度が観察され、これは、ＣＤ熱融解で観察された傾向と一致した（図３４Ｃ）。空のカプシドについて何らの傾向も観察されなかった（図３４Ｃ）。これらの結果は、約５５℃のカプシド破壊が起こる転移温度の存在を更に示している。この方法を用いて、様々な一本鎖ゲノムサイズの外被をなすｒＡＡＶ５カプシドを判定し、被包されたゲノムのサイズの関数としてのカプシドの転移温度に感知可能な差があるかどうかを決定した。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素と混合した、ゲノムサイズが増加する順の様々な一本鎖ゲノムの外被をなすカプシド試料１～７（図３５Ａ）の外部蛍光を温度の関数として評価した。顕著なことに、カプシド転移温度は、ゲノムサイズと逆相関した（図３６Ａ及び図３６Ｂ）。即ち、カプシド試料１～７間で転移温度の線形傾向が観察され、転移温度は、試料１のカプシドが最も高く、試料７のカプシドが最も低かった。これらの結果は、大きいゲノムの外被をなすカプシドが、小さいゲノムの外被をなすカプシドよりも熱的安定性が低いことを示している。
被包されたゲノムの存在がカプシドの安定性に影響を与えるという考えを裏付けるエビデンスを得て、ゲノムサイズが熱的完全性に及ぼす効果を更に厳密にモニタするため、様々な一本鎖ゲノムサイズの外被をなすｒＡＡＶ５カプシドを判定した。カプシドタンパク質が９０℃で融解する前にカプシドの完全性が実際に損なわれた場合、ＤＮＡが溶液中に放出されるはずである。従って、カプシドの分解をモニタするため、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸色素を用いて外部カプシド蛍光をモニタした。この方法の背後にある前提には、カプシドから溶液中に吐き出されたＤＮＡにＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素が結合することが含まれている（図３４Ａ）。カプシドが壊れるにつれて、より多くのＤＮＡがＳＹＢＲ ｇｏｌｄに結合することが可能となり、蛍光曲線の強度が増加する。従って、カプシド融解温度（ＤＳＦ及び内部蛍光によって評価されるとおり）よりむしろ外部蛍光曲線を用いると、カプシドの破壊をモニタすることができる。この方法を試験するため、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ色素と混合したフル及び空の両方のｒＡＡＶ５カプシドの蛍光を２５℃から９５℃まで測定した。予想どおり、フルカプシドの蛍光曲線は、温度とともに増加し（図３４Ｂ）、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ色素が吐き出されたＤＮＡに結合したことが示された一方、空のカプシドの蛍光曲線は、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄが結合するＤＮＡがないことに起因して、無視できる程度であった（データは示さず）。蛍光曲線下面積を温度の関数としてプロットすることにより、重いカプシドについて特徴的な傾向及び転移温度が観察され、これは、ＣＤ熱融解で観察された傾向と一致した（図３４Ｃ）。空のカプシドについて何らの傾向も観察されなかった（図３４Ｃ）。これらの結果は、約５５℃のカプシド破壊が起こる転移温度の存在を更に示している。この方法を用いて、様々な一本鎖ゲノムサイズの外被をなすｒＡＡＶ５カプシドを判定し、被包されたゲノムのサイズの関数としてのカプシドの転移温度に感知可能な差があるかどうかを決定した。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素と混合した、ゲノムサイズが増加する順の様々な一本鎖ゲノムの外被をなすカプシド試料１～７（図３５Ａ）の外部蛍光を温度の関数として評価した。顕著なことに、カプシド転移温度は、ゲノムサイズと逆相関した（図３６Ａ及び図３６Ｂ）。即ち、カプシド試料１～７間で転移温度の線形傾向が観察され、転移温度は、試料１のカプシドが最も高く、試料７のカプシドが最も低かった。これらの結果は、大きいゲノムの外被をなすカプシドが、小さいゲノムの外被をなすカプシドよりも熱的安定性が低いことを示している。
【0272】
ゲノムサイズがｒＡＡ５カプシドの完全性に及ぼす効果を更に評価するため、試料２、４及び６からのカプシド（広範囲のゲノムサイズを包含する）の熱安定性をＳＥＣ－ＭＡＬＳで評価した。カプシド試料を２５℃、５５℃及び７５℃で３０分間インキュベートした後、ＳＥＣ－１０００ Ｓｅｐａｘカラムに２×ＰＢＳ＋１０％ＥｔＯＨ移動相で１．０ｍＬ／分の流量として直接注入した。２５℃でインキュベートした後、全てのカプシドが一様なＳＥＣプロファイルを呈し、注入後１１分辺りに優勢な２８０ｎｍ ＵＶピーク（図３７Ａ、図３７Ｂ及び図３７Ｃ）及び対応するＭＡＬＳピーク（図示せず）があった。しかしながら、５５℃でインキュベートした後、これらの３つのカプシド試料の各々の間に優勢なＵＶピークの面積の差が観察された（図３７Ａ、図３７Ｂ及び図３７Ｃ）。試料２カプシド（最も小さいゲノムの外被）について、主ＵＶピークの約２９％の低下が観察された一方、試料４カプシドについて約３８％の低下が観察され、試料６カプシド（最も大きいゲノムの外被）について、約７３％の大幅な低下が観察された（図３７Ｄ）。７５℃でインキュベートした後、３つのカプシドの全ての主ＵＶピークは、元の約１０％未満に下落した。これらの結果は、３つのカプシド構造がいずれも７５℃より前に壊れたが、カプシド破壊の発生が、その被包されたゲノムのサイズによって調節されるとおり、３つ全てについて異なったことを示している。
【0273】
例示的な実施形態が上記に記載されているが、これらの実施形態が本発明の可能な全ての形態を記載することは意図されない。むしろ、本明細書で使用される文言は、限定でなく、むしろ説明の文言であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更形態がなされ得ることが理解される。加えて、様々な実施形態の特徴を組み合わせて、本発明の更なる実施形態を形成し得る。
【図1】
【図2A-B】
【図2C-D】
【図2E-F】
【図3A-B】
【図4A-B】
【図4C-D】
【図5A-B】
【図5C-D】
【図6A-B】
【図7A-B】
【図7C-D】
【図7E-F】
【図8A】
【図8B】
【図9A-C】
【図10A-C】
【図11】
【図12】
【図13A-C】
【図14A-C】
【図15】
【図16】
【図17A-C】
【図18A-B】
【図19】
【図20A-D】
【図21】
【図22】
【図23A-B】
【図24A-B】
【図25A-B】
【図26】
【図27A-B】
【図28A-B】
【図29】
【図30A-B】
【図31A-D】
【図32A-D】
【図33A-B】
【図34A-C】
【図35A-B】
【図36A-D】
【図37A-D】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化する方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ分析から、
前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、
前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び
前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ分析から、
前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、
前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び
前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0273】
例示的な実施形態が上記に記載されているが、これらの実施形態が本発明の可能な全ての形態を記載することは意図されない。むしろ、本明細書で使用される文言は、限定でなく、むしろ説明の文言であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更形態がなされ得ることが理解される。加えて、様々な実施形態の特徴を組み合わせて、本発明の更なる実施形態を形成し得る。
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化する方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ分析から、
前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、
前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び
前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
[２] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ナノメートル（ｎｍ）及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態１に記載の方法。
[３] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてウイルス粒子を同定することを更に含む、実施形態２に記載の方法。
[４] カプシドの構造的完全性をモニタリングする方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタリングするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
[５] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態４に記載の方法。
[６] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてウイルス粒子を同定することを更に含む、実施形態５に記載の方法。
[７] 前記カプシドの構造的完全性に基づいて、２５℃における時間長さの前記試料の貯蔵安定性を決定することを含む、実施形態４に記載の方法。
[８] ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び／又は定量化する方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物の試料をＳＥＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、
前記調製物中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記調製物中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、前記カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び／又は
前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
[９] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態８に記載の方法。
[１０] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてインタクトなｒＡＡＶ粒子を同定することを更に含む、実施形態９に記載の方法。
[１１] 前記ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における前記画分による光吸収及び多角度光散乱分析（ＭＡＬＳ）を使用した前記画分による光散乱の強度の少なくとも１つを測定することとを含む、実施形態８に記載の方法。
[１２] 前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがない前記ウイルス粒子及び／又は前記カプシドのサイズ分布を動的光散乱分析によって決定することを更に含む、実施形態８に記載の方法。
[１３] 前記ウイルス粒子の前記サイズ分布は、前記ウイルス粒子の回転半径（Ｒｇ）及び／又は流体力学半径（Ｒｈ）である、実施形態１２に記載の方法。
[１４] 前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を前記定量化することは、被包されたベクターゲノムがない前記ウイルス粒子及び／又は前記カプシドのＲｇ及びＲｈを動的光散乱分析によって決定することを含み、Ｒｇ対Ｒｈの比は、前記調製物中のウイルス粒子のパーセンテージ濃度と相関する、実施形態８に記載の方法。
[１５] カプシドの構造的完全性をモニタリングする方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタリングするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
[１６] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態１５に記載の方法。
[１７] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてインタクトなｒＡＡＶ粒子を同定することを更に含む、実施形態１６に記載の方法。
[１８] 前記ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における前記画分による光吸収及びＭＡＬＳを使用した前記画分による光散乱の強度を測定することとの少なくとも１つを含む、実施形態１５に記載の方法。
[１９] 前記カプシドの構造的完全性に基づいて、２５℃における時間長さの前記試料の貯蔵安定性を決定することを含む、実施形態１５に記載の方法。
[２０] 前記定量化するステップ及び決定するステップは、検量線を必要としない、実施形態８～１９のいずれかに記載の方法。
[２１] 前記ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス粒子又はレンチウイルスウイルス粒子である、実施形態１～２０のいずれかに記載の方法。
[２２] ＳＥＣ又はＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析前に、前記試料又は複数の試料を分析超遠心法によって分析して、封入されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドを同定することを更に含む、実施形態１～２１のいずれかに記載の方法。
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び定量化する方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ分析から、
前記試料中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記試料中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、
前記カプシド及び／又はベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び
前記試料中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
[２] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ナノメートル（ｎｍ）及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態１に記載の方法。
[３] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてウイルス粒子を同定することを更に含む、実施形態２に記載の方法。
[４] カプシドの構造的完全性をモニタリングする方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタリングするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
[５] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態４に記載の方法。
[６] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてウイルス粒子を同定することを更に含む、実施形態５に記載の方法。
[７] 前記カプシドの構造的完全性に基づいて、２５℃における時間長さの前記試料の貯蔵安定性を決定することを含む、実施形態４に記載の方法。
[８] ウイルス粒子をキャラクタリゼーション及び／又は定量化する方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子の調製物の試料をＳＥＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱法（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）によって分析するステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、
前記調製物中の前記ウイルス粒子の凝集を定量化すること、
前記調製物中の核酸及び／又はタンパク質不純物の濃度を定量化すること、前記カプシド及びベクターゲノムの重量平均分子量を決定すること、及び／又は
前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を定量化すること
の少なくとも１つを決定するステップと
を含む方法。
[９] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態８に記載の方法。
[１０] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてインタクトなｒＡＡＶ粒子を同定することを更に含む、実施形態９に記載の方法。
[１１] 前記ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における前記画分による光吸収及び多角度光散乱分析（ＭＡＬＳ）を使用した前記画分による光散乱の強度の少なくとも１つを測定することとを含む、実施形態８に記載の方法。
[１２] 前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがない前記ウイルス粒子及び／又は前記カプシドのサイズ分布を動的光散乱分析によって決定することを更に含む、実施形態８に記載の方法。
[１３] 前記ウイルス粒子の前記サイズ分布は、前記ウイルス粒子の回転半径（Ｒｇ）及び／又は流体力学半径（Ｒｈ）である、実施形態１２に記載の方法。
[１４] 前記調製物中における、被包されたベクターゲノムがないウイルス粒子及びカプシドの濃度を前記定量化することは、被包されたベクターゲノムがない前記ウイルス粒子及び／又は前記カプシドのＲｇ及びＲｈを動的光散乱分析によって決定することを含み、Ｒｇ対Ｒｈの比は、前記調製物中のウイルス粒子のパーセンテージ濃度と相関する、実施形態８に記載の方法。
[１５] カプシドの構造的完全性をモニタリングする方法であって、
カプシド内に被包されたベクターゲノムを有するウイルス粒子を含む調製物からの複数の試料をＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析するステップであって、前記試料の各々は、他と異なる特性を有するように修飾されている、ステップと；
前記ＳＥＣ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析から、前記試料の各々における前記カプシドの構造的完全性をモニタリングするステップと
を含み、前記試料間のタンパク質及び核酸濃度の変化は、前記カプシドの構造的完全性の変化と相関する、方法。
[１６] 前記ＳＥＣ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、約２６０ｎｍ及び約２８０ｎｍの波長における画分による光吸収を測定することとを含む、実施形態１５に記載の方法。
[１７] 前記画分の少なくとも１つが、１．１３～１．７５未満の、第１の波長対第２の波長（第１の波長：第２の波長）の吸光度比を呈するとき、前記画分の前記少なくとも１つにおいてインタクトなｒＡＡＶ粒子を同定することを更に含む、実施形態１６に記載の方法。
[１８] 前記ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画することと、画分の屈折率、紫外スペクトル内の波長における前記画分による光吸収及びＭＡＬＳを使用した前記画分による光散乱の強度を測定することとの少なくとも１つを含む、実施形態１５に記載の方法。
[１９] 前記カプシドの構造的完全性に基づいて、２５℃における時間長さの前記試料の貯蔵安定性を決定することを含む、実施形態１５に記載の方法。
[２０] 前記定量化するステップ及び決定するステップは、検量線を必要としない、実施形態８～１９のいずれかに記載の方法。
[２１] 前記ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス粒子又はレンチウイルスウイルス粒子である、実施形態１～２０のいずれかに記載の方法。
[２２] ＳＥＣ又はＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析前に、前記試料又は複数の試料を分析超遠心法によって分析して、封入されたベクターゲノムがないウイルス粒子及び／又はカプシドを同定することを更に含む、実施形態１～２１のいずれかに記載の方法。
【外国語明細書】