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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024119861
(43)【公開日】2024-09-03
(54)【発明の名称】Ｗｎｔヘキサペプチドの液相合成
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240827BHJP
C07K 1/02 20060101ALI20240827BHJP
C07K 1/10 20060101ALI20240827BHJP
C07K 1/16 20060101ALN20240827BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
C07K1/02
C07K1/10
C07K7/06 ZNA
C07K1/16 ZNA
C07K1/16
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024084499
(22)【出願日】2024-05-24
(62)【分割の表示】P 2021509841の分割
【原出願日】2019-08-19
(31)【優先権主張番号】18189699.4
(32)【優先日】2018-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】520144543
【氏名又は名称】ウントレサーチ・エービー
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】デニス・ヘンリックセン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】いくつかの一般的な形態のがんにおける腫瘍の拡散予防のための薬物候補であるＷｎｔヘキサペプチドＦｏｘｙ-５及びその保護された誘導体と保護されたペプチド断片を提供する。
【解決手段】ａ）ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３及びＰＧ４は水素等の保護基であり、ＰＧ５は塩基感受性保護基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片である。
【選択図】なし
【解決手段】ａ）ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３及びＰＧ４は水素等の保護基であり、ＰＧ５は塩基感受性保護基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ２は水素、又はアセトニド（シュードプロリン、ΨＭｅ、ＭｅＰｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ３は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ５はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ４は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片。
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ２は水素、又はアセトニド（シュードプロリン、ΨＭｅ、ＭｅＰｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ３は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ５はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ４は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片。
【請求項2】
ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１である、請求項１に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
【請求項3】
ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２である、請求項１に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
【請求項4】
ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１である、請求項１に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたテトラペプチド断片。
【請求項5】
Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（キートリペプチド-２＊、ＫＴ-２＊）である、請求項１又は２に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
【請求項6】
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ（キートリペプチド-１＊、ＫＴ-１＊）である、請求項１又は３に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
【請求項7】
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕである、請求項１又は４に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたテトラペプチド断片。
【請求項8】
固体である、請求項１～７のいずれか一項に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたペプチド断片。
【請求項9】
結晶形態である、請求項８に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたペプチド断片。
【請求項10】
Ｆｏｘｙ-５の保護誘導体であるＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを製造する液相法であって、前記方法は、
ａ．ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（ＫＤ-２ｃ）とカップリングしてテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得、続いてＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングすること、
ｂ．トリペプチドＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）とカップリングすること、
ｃ．トリペプチドＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすること、又は
ｄ．テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）をＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、ＰＧ５はホルミル又はＦｍｏｃのような塩基感受性保護基である、方法。
ａ．ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（ＫＤ-２ｃ）とカップリングしてテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得、続いてＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングすること、
ｂ．トリペプチドＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）とカップリングすること、
ｃ．トリペプチドＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすること、又は
ｄ．テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）をＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、ＰＧ５はホルミル又はＦｍｏｃのような塩基感受性保護基である、方法。
【請求項11】
ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕをＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）に変換する液相法であって、前記方法は、
ＰＧ５がホルミルの場合、
ｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、
又は、
ＰＧ５がＦｍｏｃのような塩基感受性保護基の場合、
ｉｉ．ヘキサペプチドＰＧ６－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕからＰＧ５を除去し、続いてギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得、
ｉｉｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、
を含み、続いて、
ａ．必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
ｂ．必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法。
ＰＧ５がホルミルの場合、
ｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、
又は、
ＰＧ５がＦｍｏｃのような塩基感受性保護基の場合、
ｉｉ．ヘキサペプチドＰＧ６－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕからＰＧ５を除去し、続いてギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得、
ｉｉｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、
を含み、続いて、
ａ．必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
ｂ．必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般にポリペプチドの合成に関し、より具体的には、ＷｎｔヘキサペプチドＦｏｘｙ-５の液相合成に関する。本開示はさらに、新規なトリペプチド、テトラペプチド及びペンタペプチドの液相合成に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｆｏｘｙ-５は、ホルミル化された、Ｗｎｔ５ａ由来のヘキサペプチド及びＷｎｔ５ａミメティックで、潜在的な抗転移活性を有し、いくつかの一般的な形態のがんにおける腫瘍の拡散予防のための薬物候補として現在開発中である。
【0003】
Ｆｏｘｙ-５のアミノ酸配列は、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号１、図１）である。静脈内に投与すると、Ｆｏｘｙ-５はＷｎｔ５ａ受容体であるFrizzled-2及びFrizzled-5に結合して受容体を活性化し、Ｗｎｔ５ａ媒介性シグナル伝達を活性化する。Ｗｎｔ５ａシグナル伝達の増加は、内皮腫瘍細胞の遊走及び浸潤を阻害する可能性がある。
【0004】
Ｆｏｘｙ-５は、転移のリスクを低下させるために、結腸癌患者で認められる腫瘍組織におけるタンパク質Ｗｎｔ５ａの欠損を補うためのものである。ステージＩＩＩの結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者の近年の回顧的研究のサブ解析により、Ｗｎｔ５ａの発現が低い患者の割合は、ステージＩＩの結腸直腸癌患者における以前の研究で観察されたものより著しく高いことが示されている。ＣＲＣステージＩＩＩ腫瘍の患者は、主に原発性腫瘍に隣接するリンパ節における腫瘍細胞の存在によりステージＩＩの患者と異なっており、この為、より侵襲性で、より速く進行する。腫瘍ステージが低い患者では約４５％であるのに対し、ステージＩＩＩの患者の７０％近くでＷｎｔ５ａの量が少ないことが観察されている。これは、Ｗｎｔ５ａ発現量が疾患の経過に大いに影響するという仮説を支持する。
【0005】
薬物候補Ｆｏｘｙ-５の安全性プロファイル、薬物動態及び第２相の用量の決定を目的とした、Ｆｏｘｙ-５を用いた第１ｂ相試験に基づいて、現在、Ｆｏｘｙ-５の第２相臨床試験が行われており、ここで、結腸癌患者の治療は、手術が行われる前の診断時に開始される。治療は、最大１２週間、又は化学療法の開始まで継続することが予定されている。
【0006】
Ｆｏｘｙ-５及びその製造方法は、国際公開第２００６／１３００８２号に記載されている。これまでに実施された前臨床及び臨床研究のための有効活性成分（ＡＰＩ）は、古典的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）で製造されており、Ｆｏｘｙ-５は逐次１＋１＋１＋１＋１＋１経路で製造されている（図２参照）。
【0007】
アミノ酸配列Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨは、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）戦略により、Ｃ末端アミノ酸Ｌｅｕが結合した2-クロロトリチル樹脂上に構築される。合成は、ＳＰＰＳ反応器で行い、カップリング、アセチル化、及びN-α-脱保護を交互に行う。カップリングは、N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＤＭＦ／ジクロロメタン（ＤＣＭ）溶媒中で行う。活性化剤及び任意に塩基の存在下で、N-α-保護アミノ酸誘導体を樹脂に結合したアミノ酸にカップリングする。最後に、活性化剤を用いることなく、ギ酸活性エステルをカップリングする。
【0008】
カップリングが完了していない場合、カップリングを継続することができる、又は手順を繰り返すことができる。副生成物としてのアミノ酸の欠失を回避するために、系統的なアセチル化工程（キャッピング）をカップリング工程後に行い、又は再カップリング工程後に再カップリングを行う場合は、ＤＭＦ、無水酢酸及びピリジンを使用する。
【0009】
アセチル化に続いて、ＤＭＦによる樹脂の洗浄、ＤＭＦ中のピペリジンによるＦｍｏｃ基の開裂、及びその後のＤＭＦによる洗浄からなるN-α-脱保護工程を行う。不完全な開裂の場合、上記のN-α-脱保護工程を繰り返すことができる。各工程ごとに、溶媒及び／又は試薬を添加し、反応混合物を撹拌し、次いでろ過を行い、樹脂から溶媒及び／又は試薬を除去する。
【0010】
樹脂が完全なペプチド配列Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨを形成するまで、カップリング、アセチル化、及びN-α-脱保護工程を繰り返す。ギ酸活性エステルのカップリングの後、アセチル化は行わない。ペプチド樹脂をＤＭＦ及びＩＰＡで洗浄し、後に減圧下で乾燥することによってＳＰＰＳは完了する。
【0011】
樹脂からのペプチドの開裂及び側鎖保護基の開裂は、適切なスカベンジャー（例えば、水及びＥＤＴ）の存在下でペプチド樹脂をＴＦＡで処理することによって行われる。次いで、得られた粗ペプチドを、ＡＣＮ勾配溶離（ギ酸系及び酢酸系）による逆相カラムでの二次元分取ＨＰＬＣで精製する。
【0012】
十分な純度の画分を凍結乾燥する。凍結乾燥物をＨＰＬＣで分析し、設定された純度基準に適合しない場合には、必要に応じて、二次元分取ＨＰＬＣで再精製する。
【0013】
上述のＳＰＰＳアプローチでは、前臨床及び初期臨床研究のためには十分な物質を得ることができたが、次の段階の臨床試験及び最終的な商業目的のために、商品のコストを低減することができ、より大きなバッチのＦｏｘｙ-５を利用可能とすることができる大規模合成により適した合成が必要とされている。
【0014】
したがって、次の段階の臨床試験及び最終的な商業目的の両者のために、Ｆｏｘｙ-５をマルチキログラムの単位で提供することができる信頼できる合成経路が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、Ｆｏｘｙ-５の化学構造を示す。Ｆｏｘｙ-５は、ホルミル化されたＮ末端を有する６個のアミノ酸からなる直鎖状のペプチドである。光学活性アミノ酸残基は全てL-立体配置である。Ｆｏｘｙ-５の分子式はＣ２６Ｈ４２Ｎ６Ｏ１２Ｓ２で、分子量は６９４．８ｇ／ｍｏｌ（平均質量）である。
【図3】図３は、キートリペプチド１（ＫＴ-１）、すなわちＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ（上図）及びキートリペプチド１＊（ＫＴ-１＊）、すなわちＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙの化学構造を示す。光学活性アミノ酸残基は全てL-立体配置である。ＫＴ-１の分子式はＣ１６Ｈ２７Ｎ３Ｏ７Ｓで、分子量は４０５ｇ／ｍｏｌ（平均質量）である。
【図4】図４は、キートリペプチド２（ＫＴ-２）、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（上）及びキートリペプチド２＊（ＫＴ-２＊）、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－O-tert-Ｂｕ（下）の構造を示す。
【図7】図７は、キートリペプチド１（ＫＴ-１）をキートリペプチド２（ＫＴ-２）とカップリングし、その後、１）ロイシンメチルエステルをけん化し、２）tert-ブチル保護基及びトリチル保護基を脱保護することに基づく、Ｆｏｘｙ-５の形成のための３＋３戦略を示す。
【0016】
略語
Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル
Ｂｏｃ＝tert-ブチルオキシカルボニル
Ｆｏｒ＝ホルミル
Ｔｒｔ＝トリフェニルメチル（トリチル）
Ｃｂｚ＝カルボキシベンジル
ＤＣＨＡ＝ジシクロヘキシルアミン
ｔＢｕ＝tert-ブチル
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＤＭＦ＝N,N-ジメチルホルムアミド
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
Ｂｎ＝ベンジル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ＝トリイソプロピルシラン
ＨＯＢｔ＝1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＳｕ＝N-ヒドロキシスクシンイミド
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＨＯＡｔ＝1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
ＥＤＡＣ，ＨＣｌ＝1-エチル-3-(3’-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルアミン
ＤＩＰＥ＝ジイソプロピルエーテル
ＤＢＵ＝1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
アミノ酸略号：
Ｍｅｔ＝メチオニン
Ａｓｐ＝アスパラギン
Ｇｌｙ＝グリシン
Ｃｙｓ＝システイン
Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｆｏｘｙ-５＝Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ
Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル
Ｂｏｃ＝tert-ブチルオキシカルボニル
Ｆｏｒ＝ホルミル
Ｔｒｔ＝トリフェニルメチル（トリチル）
Ｃｂｚ＝カルボキシベンジル
ＤＣＨＡ＝ジシクロヘキシルアミン
ｔＢｕ＝tert-ブチル
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＤＭＦ＝N,N-ジメチルホルムアミド
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
Ｂｎ＝ベンジル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ＝トリイソプロピルシラン
ＨＯＢｔ＝1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＳｕ＝N-ヒドロキシスクシンイミド
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＨＯＡｔ＝1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
ＥＤＡＣ，ＨＣｌ＝1-エチル-3-(3’-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルアミン
ＤＩＰＥ＝ジイソプロピルエーテル
ＤＢＵ＝1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
アミノ酸略号：
Ｍｅｔ＝メチオニン
Ａｓｐ＝アスパラギン
Ｇｌｙ＝グリシン
Ｃｙｓ＝システイン
Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｆｏｘｙ-５＝Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ
【発明の概要】
【0017】
本開示は、「Ｆｏｘｙ-５」（すなわち、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）として知られるホルミル化されたヘキサペプチドを製造するためのいくつかの液相法、並びにその保護された誘導体を含む、その様々なトリ、テトラ、ペンタ及びヘキサペプチド断片を提供する。本明細書で提供される方法は、伝統的な固相合成に対していくつかの利点を有し、これらの利点としては、とりわけ、以下により詳細に記載するように、原料のコストが低いこと、中間体の精製が容易であること、ペプチド断片の組立てが容易であること、キラル純度が高いこと、及び商業的スケールアップへの順応性があることがあるが、これらに限定されるものではない。
したがって、本発明の主な目的は、Ｆｏｘｙ-５の拡張可能な合成経路を提供することである。さらなる目的は、医薬品の製造管理及び品質管理の基準（GMP）に沿った製造のために、この拡張可能な合成経路に適した中間体を特定することである。
したがって、本発明の主な目的は、Ｆｏｘｙ-５の拡張可能な合成経路を提供することである。さらなる目的は、医薬品の製造管理及び品質管理の基準（GMP）に沿った製造のために、この拡張可能な合成経路に適した中間体を特定することである。
【0018】
固相化学に伴うコスト及び非拡張性を考慮して、液相化学経路を開発することに焦点が当てられてきた。したがって、本開示は、断片カップリング戦略を用いて、Ｆｏｘｙ-５又はその中間体及び前駆体を製造する液相法を提供する。
【0019】
３つの異なるアプローチを試みた：
３つのジペプチドをカップリングしてヘキサペプチドを形成する２＋２＋２カップリング戦略、
２つのトリペプチドをカップリングする３＋３カップリング戦略、
テトラペプチドを順次伸長する４＋１＋１カップリング戦略、及び
トリペプチドを順次伸長する３＋１＋１＋１カップリング戦略。
３つのジペプチドをカップリングしてヘキサペプチドを形成する２＋２＋２カップリング戦略、
２つのトリペプチドをカップリングする３＋３カップリング戦略、
テトラペプチドを順次伸長する４＋１＋１カップリング戦略、及び
トリペプチドを順次伸長する３＋１＋１＋１カップリング戦略。
【0020】
２＋２＋２アプローチでは、３つの独立したキージペプチド、ＫＤ-１、ＫＤ-２及びＫＤ-３のカップリングよってＦｏｘｙ-５の主鎖を組み立てる。３つの異なるアプローチａ、ｂ及びｃが考案された（図５、図６及び図６ａ参照）。これら３つのジペプチドの液相合成に続いて、互いに結合する様式でヘキサペプチドを形成した。２＋２＋２アプローチにおける保護基戦略は、Ｎ末端保護基（Ｃｂｚ）の水素化分解、又はＮ末端保護基（Ｆｍｏｃ）の塩基触媒脱保護のいずれかに基づき、側鎖上の酸分解性保護基の使用を伴った。さらに、中間体は全て、液相化学によって入手することができた。２＋２＋２アプローチの３つの方法全てにおいて、ＭｅｔのN-ホルミル基は合成の最終段階で導入する。
【0021】
３＋３アプローチでは、２つのトリペプチドの液相カップリングによってＦｏｘｙ-５の主鎖を組み立てる。３＋３アプローチの第１のバージョンでは、キートリペプチドＫＴ-１及びＫＴ-２を使用し（図７）、ホルミル基は、早い段階から、すなわちトリペプチド断片ＫＴ-１の合成時に導入する。３＋３アプローチの第２のバージョンでは、ホルミル基を最初に導入し、２つの異なるトリペプチド断片、ＫＴ-１＊及びＫＴ-２＊のカップリングによってヘキサペプチド骨格を形成する（図７ａ）。
【0022】
本発明の第１の側面では、新規トリペプチドＭｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ及びその保護された誘導体、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ（キートリペプチド-１、ＫＴ-１）及びＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ（キートリペプチド-１＊、ＫＴ-１＊）を提供する。
【0023】
本発明の第２の側面では、新規トリペプチドＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ及びその保護された誘導体、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－O-Ｍｅ（キートリペプチド-２、ＫＴ-２）及びＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（キートリペプチド-２＊、ＫＴ-２＊）を提供する。
【0024】
本発明の第３の側面では、新規トリペプチド誘導体ＫＴ-１及びＫＴ-２のカップリングに基づいて、あるいは新規トリペプチド誘導体ＫＴ-１＊及びＫＴ-２＊のカップリングに基づいて、保護された形態のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を製造する方法を提供し、カップリングの後、全ての保護基の脱保護又はN-脱保護を行い、次いで、N-ホルミル化及び側鎖の最終的な脱保護を行って所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を製造してもよい。
【0025】
３＋１＋１＋１アプローチでは、トリペプチド断片ＫＴ-２又はＫＴ-２＊のいずれかと、アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｓｐ及びＭｅｔの保護された誘導体との連続液相カップリングによってＦｏｘｙ-５の主鎖を構築し、保護された形態のＦｏｘｙ-５又はヘキサペプチドＭｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨを形成する。全体的な脱保護又はN-脱保護、その後のN-ホルミル化及び側鎖の最終的な脱保護により、所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を製造する。
【0026】
本発明の第４の側面では、新規トリペプチド誘導体ＫＴ-２又はＫＴ-２＊とアミノ酸Ｇｌｙ、Ａｓｐ及びＭｅｔの保護された誘導体との連続カップリングに基づく、保護された形態のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５の製造する方法を提供し、この一連のカップリングの後に（個別の出発トリペプチドに応じて）全体的な脱保護又はN-脱保護を行い、その後N-ホルミル化及び側鎖の最終的な脱保護を行って所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を製造してもよい。
【発明を実施するための形態】
【0027】
上記概要の項で述べたように、Ｆｏｘｙ-５ヘキサペプチドを製造するための４つの異なる液相アプローチ、２＋２＋２経路（３つのバージョン）、３＋３経路（２つのバージョン）、４＋１＋１経路及び３＋１＋１＋１経路（２つのバージョン）を発明した。これらの戦略を以下でより詳細に検討する。
【0028】
２＋２＋２カップリング戦略
２＋２＋２経路Ａ（図５）
第１のキージペプチドＫＤ-１ａ（Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ）の合成は、市販のＢｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ及びＨＡｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅのカップリングから開始する。次いで、得られたジペプチドＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅのＣ末端を選択的に脱保護する。
２＋２＋２経路Ａ（図５）
第１のキージペプチドＫＤ-１ａ（Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ）の合成は、市販のＢｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ及びＨＡｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅのカップリングから開始する。次いで、得られたジペプチドＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅのＣ末端を選択的に脱保護する。
【0029】
次いで、Ｈ－Ｃｙｓ－ＯＨ及びアセトンからシステインアセトニドＨ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨを形成し、その後スクシンイミドエステルＣｂｚ－Ｇｌｙ－ＯＳｕとカップリングすることによって第２のキージペプチドＫＤ-２ａ（Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨ）を製造する。
【0030】
第３のジペプチドＫＤ-３ａ（Ｈ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）の合成は、市販の出発物質Ｃｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとＨ－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕのカップリングを伴う。その後、Ｐｄ／Ｃ上での水素添加によるＣｂｚの脱保護により、中間体ジペプチドＨ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを得る。
【0031】
３つのキージペプチドＫＤ-１ａ、ＫＤ-２ａ及びＫＤ-３ａからの経路ＡによるＦｏｘｙ-５の合成は、ジペプチドＫＤ-２ａ、Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨとＫＤ-３ａ、Ｈ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕをカップリングし、脱保護後、テトラペプチドＧｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）を得る。次いで、ジペプチドＫＤ-１ａ、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを、標準的なカップリング試薬の存在下で、テトラペプチドＧｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕとカップリングする。得られた保護されたヘキサペプチドを強酸で処理して、脱保護する。次いで、ホルミル化を行い、標的化合物Ｆｏｘｙ-５を粗製形態で得る。
【0032】
２＋２＋２経路Ｂ（図６）
第１のキージペプチドＫＤ-１ｂ（Ｃｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＳｕ）の合成は、対応するメチオニン誘導体からのスクシンイミドエステルＣｂｚ－Ｍｅｔ－ＯＳｕの形成を伴う。活性化されたエステルと市販のＨ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＨを塩基性条件下でカップリングすることにより、ジペプチドＣｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＨを得、次いでこれもＨＯＳｕで活性化し、第１のジペプチドＫＤ-１、Ｃｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＳｕを得る。
第１のキージペプチドＫＤ-１ｂ（Ｃｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＳｕ）の合成は、対応するメチオニン誘導体からのスクシンイミドエステルＣｂｚ－Ｍｅｔ－ＯＳｕの形成を伴う。活性化されたエステルと市販のＨ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＨを塩基性条件下でカップリングすることにより、ジペプチドＣｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＨを得、次いでこれもＨＯＳｕで活性化し、第１のジペプチドＫＤ-１、Ｃｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－ＯＳｕを得る。
【0033】
第２のキージペプチドＫＤ-２ｂ（Ｈ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－ＯＨ）の合成は、最初にシステインの側鎖をベンジル保護し、Ｈ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－ＯＨを得る。次いで、市販のスクシンイミド活性型グリシン構築ブロックＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＳｕをベンジル保護されたシステイン構築ブロックにカップリングし、Ｂｏｃを脱保護した後、所望のジペプチドＫＤ-２ｂ、Ｈ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－ＯＨを得る。
【0034】
第３のキージペプチドＫＤ-３ｂ（Ｈ－Ｇｌｕ（ＯＢｎ）－Ｌｅｕ－ＯＢｎ）は、活性化されたエステルＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｎ）－ＯＳｕと市販のＨ－Ｌｅｕ－ＯＢｎのカップリングによって形成する。
【0035】
３つのジペプチド断片ＫＤ-１ｂ、ＫＤ-２ｂ及びＫＤ-３ｂからの経路ＢによるＦｏｘｙ-５の合成は、保護されたキージペプチドＫＤ-１ｂ（Ｃｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－Ｏｓｕ）とＫＤ-２ｂ（Ｈ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－ＯＨ）をカップリングし、保護されたテトラペプチドＣｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－ＯＨ（配列番号１２）を得、その後、ＫＤ-３ｂ（Ｈ－Ｇｌｕ（ＯＢｎ）－Ｌｅｕ－ＯＢｎ）とカップリングし、Ｃｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－Ｇｌｕ（ＯＢｎ）－Ｌｅｕ－ＯＢｎ（配列番号１３）を得る。次いで、この保護されたヘキサペプチドを、Ｐｄ／Ｃによる水素化で脱保護し、ヘキサペプチドＭｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号１４）を得、最後にホルミル化して所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を粗製形態で得る。
【0036】
本明細書に記載のテトラペプチドＧｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号８）及びＭｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＯＨ（配列番号１１）並びにそれらの２つの保護された誘導体Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）及びＣｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－ＯＨ（配列番号１２）は新規化合物であることに留意されたい。同様に、保護されたヘキサペプチドＣｂｚ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＢｎ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｂｎ）－Ｇｌｕ（ＯＢｎ）－Ｌｅｕ－ＯＢｎ（配列番号１３）は新規化合物である。
【0037】
２＋２＋２経路Ｃ（図６ａ）
第１のキージペプチドＫＤ-１ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの合成を、市販のＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨとＨ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨをジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）でカップリングすることにより行った。
第１のキージペプチドＫＤ-１ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの合成を、市販のＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨとＨ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨをジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）でカップリングすることにより行った。
【0038】
第２のキージペプチドＫＤ-２ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨの合成は、この保護されたジペプチドが市販されているため不要であった。
【0039】
第３のキージペプチドＫＤ-３ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕの合成を、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ、ＨＯＢｔ及びＤＩＰＥＡの存在下、高度希釈ＤＣＭ中において市販のロイシンt-ブチルエステル塩酸塩をＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）とカップリングすることにより行った。
【0040】
３つのジペプチド断片ＫＤ-１ｃ、ＫＤ-２ｃ及びＫＤ-３ｃからの経路ＣによるＦｏｘｙ-５の合成を、保護されたキージペプチドＫＤ-３ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕと、ＫＤ-２ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨのカップリングにより開始し、テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得、これをＫＤ-１ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨと反応させて保護されたヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得、次いでＤＣＭ中のＤＢＵによりＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ及びＤＩＰＥＡの存在下でギ酸とカップリングし、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得た。
【0041】
この保護されたヘキサペプチド（配列番号１５）を、ＴＦＡ／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ／ＤＴＴ中に溶解し、撹拌することによって脱保護した（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基）。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を収率９７％（９．５ｇ）で固体として得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７．６％で得た。
【0042】
３＋３カップリング戦略（図７及び７ａ）
断片ＫＴ-１（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の合成は、グリシンのグリシンメチルエステルへの変換によって開始される。これを、市販のＦｍｏｃ－Ａｓｐ－（O-ｔＢｕ）とカップリングすると、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅを得ることができる。Ｆｍｏｃを脱保護し、その後、市販のＦｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨとカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅを得る。メチルエステルを加水分解し、所望の断片ＫＴ-１を得る。
断片ＫＴ-１（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の合成は、グリシンのグリシンメチルエステルへの変換によって開始される。これを、市販のＦｍｏｃ－Ａｓｐ－（O-ｔＢｕ）とカップリングすると、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅを得ることができる。Ｆｍｏｃを脱保護し、その後、市販のＦｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨとカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅを得る。メチルエステルを加水分解し、所望の断片ＫＴ-１を得る。
【0043】
必要に応じ、ホルミル基（又は別のアシル基）を後から導入することを可能にするために、断片ＫＴ-１の修飾型であるＫＴ-１＊（Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）も同様に製造する。この反応では、ジペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅのＦｍｏｃを最初に脱保護し、その後市販のＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨとカップリングする。
【0044】
断片ＫＴ-２（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ）の合成は、L-ロイシンをメチルエステルに変換することによって開始する。市販のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）とのアミド結合形成により、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅが得られる。脱保護及び市販のＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとのカップリングにより、所望の断片ＫＴ-２を得る。
【0045】
代替断片ＫＴ-２＊（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）の合成は、ロイシンt-ブチルエステル塩酸塩をＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）とカップリングし、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（すなわち、ＫＤ-３ｃ）を得る。ジペプチドを単離せず、（ＤＢＵによるＦｍｏｃの脱保護の後）Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨと直接カップリングし、所望の断片ＫＴ-２＊を得る。
【0046】
トリペプチド断片、ＫＴ-１及びＫＴ-２からのＦｏｘｙ-５の合成は、ＫＴ-２のＦｍｏｃの脱保護から始める。その後ＫＴ-１とカップリングしてＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅを得る。これを塩基性条件下でけん化することにより、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＨを得、tert-ブチル保護基及びトリチル保護基を脱保護し、所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を粗製形態で得る。
【0047】
あるいは（図７ａ）、トリペプチド断片ＫＴ-１＊及びＫＴ-２＊からのＦｏｘｙ-５の合成は、ＫＴ-２＊のＦｍｏｃの脱保護により開始する。その後ＫＴ-１＊とカップリングして、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得、ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、次いでギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨを得る。この（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基で）保護されたヘキサペプチドを脱保護し、粗Ｆｏｘｙ-５を得る。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７．６％で得た。
【0048】
４＋１＋１カップリング戦略
４＋１＋１カップリング戦略によるＦｏｘｙ-５の合成は、テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）とＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＦｍｏｃ－Ｍｅｔとの連続的カップリングで開始し、その後Ｆｍｏｃ除去、ホルミル化及び脱保護を行う。テトラペプチド自体は、上述したジペプチド断片ＫＤ-３ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕと、ＫＤ-２ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨのカップリングによって得る。
４＋１＋１カップリング戦略によるＦｏｘｙ-５の合成は、テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）とＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＦｍｏｃ－Ｍｅｔとの連続的カップリングで開始し、その後Ｆｍｏｃ除去、ホルミル化及び脱保護を行う。テトラペプチド自体は、上述したジペプチド断片ＫＤ-３ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕと、ＫＤ-２ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨのカップリングによって得る。
【0049】
テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）をＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとカップリングして保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１０）を得、その後Ｆｍｏｃ－メチオニンとカップリングして保護されたヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得る。次いで、ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、次いでギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得る。この保護されたヘキサペプチドを脱保護（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基）し、粗Ｆｏｘｙ-５を得る。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７．６％で得た。
【0050】
３＋１＋１＋１カップリング戦略（図８及び８ａ）
３＋１＋１＋１カップリング戦略によるＦｏｘｙ-５の合成は、断片ＫＴ-２（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと連続的にカップリングして保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号７）を得ることによって開始し、その後Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとカップリングして保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号９）を得、次いでホルミル－メチオニンとカップリングして保護された形態のＦｏｘｙ-５、すなわちＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号３）を得る。
３＋１＋１＋１カップリング戦略によるＦｏｘｙ-５の合成は、断片ＫＴ-２（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと連続的にカップリングして保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号７）を得ることによって開始し、その後Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとカップリングして保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号９）を得、次いでホルミル－メチオニンとカップリングして保護された形態のＦｏｘｙ-５、すなわちＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号３）を得る。
【0051】
Ｆｏｘｙ-５自体は、最終的に、上記の３＋３カップリング戦略と同じ戦略によって、すなわち、ロイシンメチルエステルをけん化してＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号４）を得、これからトリチル保護基及びtert-ブチル保護基を最終的に除去して粗Ｆｏｘｙ-５を得ることによって合成される。
【0052】
あるいは、３＋１＋１＋１カップリング戦略によるＦｏｘｙ-５の合成は、断片ＫＴ-２＊（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと連続的にカップリングして保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得ることによって開始し、その後Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとカップリングして保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１０）を得、次いでＦｍｏｃ－メチオニンとカップリングして保護されたヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得る。次いで、ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、次いでギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得る。この保護されたヘキサペプチドを脱保護（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基）し、粗Ｆｏｘｙ-５を得る。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７．６％で得た。
【0053】
トリペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－ＯＨ。並びに本明細書に記載の保護された誘導体、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅ及びＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨは新規化合物であることに留意されたい。同様に、トリペプチドＭｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ、並びに本明細書に記載の保護された誘導体、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯｔＢｕ及びＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ（ＫＴ-１＊）は新規化合物である。同様に、トリペプチドＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ、並びに本明細書に記載の保護された誘導体、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ、（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）及びＣｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＭｅは新規化合物である。
【0054】
テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号７）及びＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号９）及びＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１０）、並びに保護されたＦｏｘｙ-５誘導体Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号３）及びＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）は全て新規化合物であることにさらに留意されたい。
【0055】
したがって、本発明の別の側面では、
ａ）ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１は水素又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ２は水素又はアセトニド（シュードプロリン、ΨＭｅ、ＭｅＰｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ３は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ５はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ４は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ１及びＲ２は独立して水素又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片が提供される。
ａ）ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１は水素又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ２は水素又はアセトニド（シュードプロリン、ΨＭｅ、ＭｅＰｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ３は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ５はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ４は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ１及びＲ２は独立して水素又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片が提供される。
【0056】
好ましい態様では、ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１であり、ここで、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３及びＲ１は上記で定義されたとおりである、Ｆｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片が提供される。特に好ましい態様では、上記トリペプチド断片はＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅである。
【0057】
別の好ましい態様では、ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２であり、ここで、ＰＧ５、ＰＧ４及びＲ２は上記で定義されたとおりである、Ｆｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片が提供される。特に好ましい態様では、上記トリペプチド断片はＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯｔＢｕである。
【0058】
本発明のさらなる側面では、Ｆｏｘｙ-５の保護された誘導体であるＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを製造する液相法であって、上記方法は、
ａ．ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（ＫＤ-２ｃ）とカップリングしてテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得、続いてＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングすること、又は
ｂ．トリペプチドＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）とカップリングすること、又は
ｃ．トリペプチドＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすること、又は
ｄ．テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）をＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、ＰＧ５はホルミル又はＦｍｏｃのような塩基感受性保護基である、方法が提供される。
ａ．ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（ＫＤ-２ｃ）とカップリングしてテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得、続いてＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングすること、又は
ｂ．トリペプチドＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）とカップリングすること、又は
ｃ．トリペプチドＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすること、又は
ｄ．テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）をＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ５－Ｍｅｔと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、ＰＧ５はホルミル又はＦｍｏｃのような塩基感受性保護基である、方法が提供される。
【0059】
本発明は、さらなる側面において、ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕをＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）に変換する液相法であって、上記方法は、
ＰＧ５がホルミルの場合、
ｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得、又は、
ＰＧ５がＦｍｏｃのような塩基感受性保護基の場合、
ｉｉ．ヘキサペプチドＰＧ６－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕからＰＧ５を除去し、続いてギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得、
ｉｉｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、を含み、
続いて、
ａ．必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
ｂ．必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法を提供する。
ＰＧ５がホルミルの場合、
ｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得、又は、
ＰＧ５がＦｍｏｃのような塩基感受性保護基の場合、
ｉｉ．ヘキサペプチドＰＧ６－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕからＰＧ５を除去し、続いてギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得、
ｉｉｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、を含み、
続いて、
ａ．必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
ｂ．必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法を提供する。
【0060】
好ましい態様では、ＰＧ５はＦｍｏｃである。
【0061】
実験
２＋２＋２経路
実施例１ キージペプチドＫＤ-１ａ、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの製造
標的ジペプチドのメチルエステルＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅの合成を以下のように行った。Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（２．６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（乾燥）（２５ｍｌ）に溶解し、ＤＣＣ（２．２ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＨＯＡｔ（１．４ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。乾燥した１００ｍｌ丸底フラスコ中で、Ｈ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅ・ＨＣｌ（２．５ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（乾燥）（５０ｍｌ）中でＤＩＰＥＡ（１．８ｍｌ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）と混合した。双方の溶液を０℃に冷却した。１０分後、アスパラギン酸誘導体を含有する溶液をメチオニン溶液に滴下した。室温で７２時間反応させた。酸性水溶液（０．５Ｍクエン酸）及び塩基（飽和ＮａＨＣＯ３）による後処理後、得られた物質をＬＣＭＳで分析した。若干の溶媒シグナル（ＥｔＯＡｃ）及び不純物が観察されたが、シグナルは化合物Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅの構造に一致した。
２＋２＋２経路
実施例１ キージペプチドＫＤ-１ａ、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの製造
標的ジペプチドのメチルエステルＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅの合成を以下のように行った。Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（２．６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（乾燥）（２５ｍｌ）に溶解し、ＤＣＣ（２．２ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＨＯＡｔ（１．４ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。乾燥した１００ｍｌ丸底フラスコ中で、Ｈ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅ・ＨＣｌ（２．５ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（乾燥）（５０ｍｌ）中でＤＩＰＥＡ（１．８ｍｌ、１０．４ｍｍｏｌ、１．０当量）と混合した。双方の溶液を０℃に冷却した。１０分後、アスパラギン酸誘導体を含有する溶液をメチオニン溶液に滴下した。室温で７２時間反応させた。酸性水溶液（０．５Ｍクエン酸）及び塩基（飽和ＮａＨＣＯ３）による後処理後、得られた物質をＬＣＭＳで分析した。若干の溶媒シグナル（ＥｔＯＡｃ）及び不純物が観察されたが、シグナルは化合物Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅの構造に一致した。
【0062】
次の工程で、中間体メチルエステルＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＭｅ（３．５ｇ、８．１ｍｍｏｌ、１．０当量）を1,4-ジオキサン／ＭｅＯＨ（１４：１）（７５ｍｌ）に溶解し、新たに調製した３．６Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）（２．３ｍｌ、８．５ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。室温で１８時間撹拌して反応させ、反応混合物をサンプリングした。ＬＣＭＳ分析により、出発物質が完全に消費されたことが確認された。２．０３１分での主シグナル（７０面積％）は、標的分子Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを示した（Ｍ＝４２０ｇ／ｍｏｌ、実測値：ｍ／ｚ＋＝４２１［Ｍ＋Ｈ］＋、４４３［Ｍ＋Ｎａ］＋）を示した。Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－ＯＨとして同定できる副生成物が観察されたので、けん化反応の反応時間を短くする（１８時間未満）ことが推奨される。標的化合物であるキージペプチドＫＤ-１ａ（Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ）を収率６３％、７０面積％（ＬＣＭＳ）の純度で得た。
【0063】
実施例２ キージペプチドＫＤ-２ａ、Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨの製造
２５０ｍｌ丸底フラスコに、L-システイン塩酸塩一水和物（５．０ｇ、２８．５ｍｍｏｌ）及びアセトン（８０ｍｌ、１０８８ｍｍｏｌ）（実用品質）を添加した。次いで、反応物（０．３６Ｍ）を１．５時間加熱還流した。３０分後、白色懸濁液は粘性のあるスラリーに変化した。ろ過し、過剰のアセトンを除去して４．７ｇの白色非晶質固体を得た。１Ｈ ＮＭＲ分析により、約５０％の未反応システインが残留していることが示された。プロリンアセトニドの収率及び品質を改善するために、白色非晶質固体（４．７２ｇ）とアセトン（２００ｍｌ）を混合し、より薄い反応混合物（０．１４Ｍ）として再度処理した。懸濁液を２時間還流し、ゆっくりと室温に冷却し、次いで０℃で３０分間冷却した。氷冷懸濁液をｐ３ガラスフィルターでろ過し、アセトン（２×１０ｍｌ）ですすいだ。残留アセトンを真空中で除去した。所望のアセトニドＨ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨ（４．４ｇ、２７ｍｍｏｌ、収率９５％）を優れた収率及び純度で白色粉末として得た。生成物の１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）スペクトルは標的分子構造と一致し、出発物質Ｈ－Ｃｙｓ－ＯＨのシグナルは観察されなかった。
２５０ｍｌ丸底フラスコに、L-システイン塩酸塩一水和物（５．０ｇ、２８．５ｍｍｏｌ）及びアセトン（８０ｍｌ、１０８８ｍｍｏｌ）（実用品質）を添加した。次いで、反応物（０．３６Ｍ）を１．５時間加熱還流した。３０分後、白色懸濁液は粘性のあるスラリーに変化した。ろ過し、過剰のアセトンを除去して４．７ｇの白色非晶質固体を得た。１Ｈ ＮＭＲ分析により、約５０％の未反応システインが残留していることが示された。プロリンアセトニドの収率及び品質を改善するために、白色非晶質固体（４．７２ｇ）とアセトン（２００ｍｌ）を混合し、より薄い反応混合物（０．１４Ｍ）として再度処理した。懸濁液を２時間還流し、ゆっくりと室温に冷却し、次いで０℃で３０分間冷却した。氷冷懸濁液をｐ３ガラスフィルターでろ過し、アセトン（２×１０ｍｌ）ですすいだ。残留アセトンを真空中で除去した。所望のアセトニドＨ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨ（４．４ｇ、２７ｍｍｏｌ、収率９５％）を優れた収率及び純度で白色粉末として得た。生成物の１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）スペクトルは標的分子構造と一致し、出発物質Ｈ－Ｃｙｓ－ＯＨのシグナルは観察されなかった。
【0064】
その後、アセトニド中間体Ｈ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨ（１．０ｇ、６．２ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（２．６ｍｌ、１９ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。室温で１０分間撹拌した後、市販のＣｂｚ－Ｇｌｙ－ＯＳｕ（２．４ｇ、６．２ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、反応混合物を１８時間撹拌した。その間、混合物は懸濁液のままであった。
【0065】
反応混合物を、1,4-ジオキサン（１０．１１ｍｌ、１０．１１ｍｍｏｌ）中の４Ｍ塩酸の添加によりｐＨが４となるまで酸性化した。この時点で固体が沈殿し、これをろ過により集めた。残渣は主にＥｔ３Ｎ・ＨＣｌからなっていた。２５０ｍｌの水をろ液に添加し、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍｌ）で抽出した。次いで、合わせた有機相をブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、オフホワイト色の固体（１．５８ｇ）を得た。合わせた有機相のＬＣＭＳ分析により、ジペプチドＣｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨ（Ｍ＝３５２ｇ／ｍｏｌ、実測値：ｍ／ｚ－＝３５１［Ｍ－Ｈ］－、７０３［２Ｍ－Ｈ］－）を表す２．００３分の主シグナル（７７面積％）を確認した。１．７７９分（９面積％）でＣｂｚ－Ｇｌｙ－ＯＨが観察された（１．８８７分のスクシンイミドエステルＣｂｚ－Ｇｌｙ－ＯＳｕは観察されず、これは出発物質が加水分解されたことを示す）。
【0066】
次いで、水相をｐＨ＝１に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍｌ）で再度抽出した。合わせた有機相をブライン（３×５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、黄色がかった油状物（２．６０ｇ）を得た。ＬＣＭＳ分析により、２．００６分（６６面積％）の標的分子が確認された。主な副生成物のシグナルは１．７７８分（２０面積％）で観察され、Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－ＯＨに帰属された。得られたジペプチドＣｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨの収量は４．２ｇ（８３％、７０％ＬＣＭＳ純度に基づく）であった。主な不純物はＣｂｚ－Ｇｌｙ－ＯＨと同定された。
【0067】
実施例２ａ 代替ジペプチドＫＤ-１ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの製造
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＳｕは、国際公開第９０／０８７７３号に従って、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（１４．８７ｇ）、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ、５．５２ｇ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、８．２６ｇ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２００ｍｌ）中、０℃で３．５時間反応させることによりin situで調製した。沈殿したジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）をろ過により除去し、ＴＨＦろ液を、４０ｍｌの水酸化ナトリウムが添加された２２０ｍｌの１０：１水／ＴＨＦ中のＨ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ冷溶液に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、固体のクエン酸（２０ｇ）をＥｔＯＡｃ（６００ｍｌ）と共に添加した。ＥｔＯＡｃ層を分離し、１０％クエン酸及びブラインで洗浄し、乾燥（硫酸マグネシウム）した。ＥｔＯＡｃ溶液を蒸発させて残渣を得、これをＥｔＯＡｃ２００ｍｌに溶解し、ジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ、７．８４ｍｌ）で処理して、所望の生成物のＤＣＨＡ塩１７．９３ｇ、ｍｐ１５９～１６２℃を沈殿させた。
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＳｕは、国際公開第９０／０８７７３号に従って、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（１４．８７ｇ）、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ、５．５２ｇ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、８．２６ｇ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２００ｍｌ）中、０℃で３．５時間反応させることによりin situで調製した。沈殿したジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）をろ過により除去し、ＴＨＦろ液を、４０ｍｌの水酸化ナトリウムが添加された２２０ｍｌの１０：１水／ＴＨＦ中のＨ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ冷溶液に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、固体のクエン酸（２０ｇ）をＥｔＯＡｃ（６００ｍｌ）と共に添加した。ＥｔＯＡｃ層を分離し、１０％クエン酸及びブラインで洗浄し、乾燥（硫酸マグネシウム）した。ＥｔＯＡｃ溶液を蒸発させて残渣を得、これをＥｔＯＡｃ２００ｍｌに溶解し、ジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ、７．８４ｍｌ）で処理して、所望の生成物のＤＣＨＡ塩１７．９３ｇ、ｍｐ１５９～１６２℃を沈殿させた。
【0068】
実施例３ キージペプチドＫＤ-３ａ、Ｈ－Ｇｌｕ（ＯＢｎ）－Ｌｅｕ－ＯＢｎの製造
２５０ｍｌ丸底フラスコを使用し、市販のＣｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（５．０ｇ、１４．８ｍｍｏｌ、１．０当量）の冷却溶液にＨＯＡｔ（２．４ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、無水ＭｅＣＮ（２５ｍｌ）に溶解させたＤＣＣ（３．７ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１．２当量）と混合した。この溶液に、無水ＭｅＣＮ（５０ｍｌ）中においてＨ－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（３．３ｇ、１４．８ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＩＰＥＡ（２．５８ｍｌ、１４．８２ｍｍｏｌ）の混合物を添加した。得られた反応混合物（０．２ｍｏｌ）を０℃で撹拌し、１８時間かけて室温まで徐々に上昇させた。次いで、反応混合物を真空中で濃縮して、９．１ｇ（７０面積％のＨＰＬＣ純度に基づいて最大８３％の収率）の濃い黄色油状物を得、これは数時間放置するとゆっくりと凝固した。その一部（５．２ｇ）を５０ｍｌのＥｔＯＡｃに懸濁し、３０ｍｌの水を添加した。有機相を洗浄し、蒸発させ、２．９ｇの白色固体を得た。ＨＰＬＣでは、４．１０５分（７６面積％）に生成物のピークが示された。１Ｈ ＮＭＲの結果は標的分子と一致し、Ｃｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕが、計算収率５２％、クロマトグラフィーを行わずに平均純度７６％（ＨＰＬＣ分析に基づく）、収率６３％（１Ｈ ＮＭＲ分析に基づく純度９５％）で得られた。この物質をさらに精製することなく次の反応に用いた。
２５０ｍｌ丸底フラスコを使用し、市販のＣｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（５．０ｇ、１４．８ｍｍｏｌ、１．０当量）の冷却溶液にＨＯＡｔ（２．４ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、無水ＭｅＣＮ（２５ｍｌ）に溶解させたＤＣＣ（３．７ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１．２当量）と混合した。この溶液に、無水ＭｅＣＮ（５０ｍｌ）中においてＨ－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（３．３ｇ、１４．８ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＩＰＥＡ（２．５８ｍｌ、１４．８２ｍｍｏｌ）の混合物を添加した。得られた反応混合物（０．２ｍｏｌ）を０℃で撹拌し、１８時間かけて室温まで徐々に上昇させた。次いで、反応混合物を真空中で濃縮して、９．１ｇ（７０面積％のＨＰＬＣ純度に基づいて最大８３％の収率）の濃い黄色油状物を得、これは数時間放置するとゆっくりと凝固した。その一部（５．２ｇ）を５０ｍｌのＥｔＯＡｃに懸濁し、３０ｍｌの水を添加した。有機相を洗浄し、蒸発させ、２．９ｇの白色固体を得た。ＨＰＬＣでは、４．１０５分（７６面積％）に生成物のピークが示された。１Ｈ ＮＭＲの結果は標的分子と一致し、Ｃｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕが、計算収率５２％、クロマトグラフィーを行わずに平均純度７６％（ＨＰＬＣ分析に基づく）、収率６３％（１Ｈ ＮＭＲ分析に基づく純度９５％）で得られた。この物質をさらに精製することなく次の反応に用いた。
【0069】
最後に、完全な触媒のスクリーニング後、Noblyst Ｐｄ／Ｃ触媒type P1141を用いＣｂｚの脱保護を行い、標的ジペプチドＫＤ-３ａ、Ｈ－Ｇｌｕ（ＯＢｎ）－Ｌｅｕ－ＯＢｎを得た。この反応のために、Ｃｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（１．５ｇ、３．０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＯＨ（２０ｍｌ）に溶解し、パラジウム（Ｐｄ）（活性炭上１０％、Noblyst P1141）（５００ｍｇ、４７０μｍｏｌ、０．２当量）を添加した。この溶液に水素を１時間吹き込んだ。次いで、水素雰囲気（１気圧）下で１８時間撹拌して反応させた。ＨＰＬＣによる分析は、出発物質の完全な変換が示され、主に、３．３９１分のトルエンシグナル及び２．８４３分の標的分子シグナルが示された。反応混合物をＰ３ガラスフィルター中のセライトでろ過した。残渣をＭｅＯＨ（３×１ｍｌ）ですすぎ、ろ液を真空中で濃縮した。標的化合物ＨＧｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを黄色がかった油状物として、ＨＰＬＣ分析に基づいて、１．０２ｇ（収率９２％）及び９５面積％の純度で得た。得られた物質をそのまま次の反応に用いた。
【0070】
実施例３ａ 代替キージペプチドＫＤ-３ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕの製造
高度希釈（５０体積）ジクロロメタン中、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）及びＤＩＰＥＡ（５．０当量）の存在下で、５０ｇのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩と１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）を、最初は０～５℃で１時間、次いで１５～２０℃で１時間カップリングし、ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとの反応については、生成物の単離を省略し、水性後処理の後にジクロロメタン溶液を実施例４ａで直接使用した。
高度希釈（５０体積）ジクロロメタン中、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）及びＤＩＰＥＡ（５．０当量）の存在下で、５０ｇのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩と１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）を、最初は０～５℃で１時間、次いで１５～２０℃で１時間カップリングし、ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとの反応については、生成物の単離を省略し、水性後処理の後にジクロロメタン溶液を実施例４ａで直接使用した。
【0071】
実施例４ テトラペプチドＧｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）の製造
その後の反応は、ＤＣＣ及びＨＯＡｔの存在下で、ジペプチドＨ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ及びＣｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨのカップリングを伴った。
その後の反応は、ＤＣＣ及びＨＯＡｔの存在下で、ジペプチドＨ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ及びＣｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨのカップリングを伴った。
【0072】
カップリング反応は以下のように行った。Ｈ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（８９８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。次いで、ＤＣＣ（４９８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＨＯＡｔ（３２８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物にＣｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－ＯＨ（８５０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応混合物を撹拌し、１８時間かけて徐々に室温に温めた。
【0073】
反応混合物をＰ３ガラスフィルター中のセライトでろ過した。残渣をＤＭＦ（２×５ｍｌ）ですすいだ。ろ液に１００ｍｌの水を添加すると、乳白色のコロイド状溶液が形成された。ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）を添加した。相分離は非常に遅く、混合物に約２０ｇのＮａＣｌを添加すると、混合物はわずかに透明になり、透明な相が分離した。次いで、水相をＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）で２回抽出した。得られた水相をＬＣＭＳによる分析のためにサンプリングしたところ、生成物は含まれていなかった。合わせた有機相を標準的な手順に従って後処理し、１．４１ｇの黄色がかった油状物を得、これにＥｔ２Ｏを加えて共蒸発させると凝固して、オフホワイト色の嵩高い固体となった（１．４１ｇ、収率５８％、純度７０％に基づく）。ＬＣＭＳによる分析では、２．０３４分で約６面積％のＤＣＣが観察された（Ｍ＝２２４ｇ／ｍｏｌ、実測値：ｍ／ｚ＋＝２２５［Ｍ＋Ｈ］＋、４４９［Ｍ＋Ｎａ］＋）。２．２９７分で、未知の化合物が、ｍ／ｚ＋＝４５２、５７９（１６面積％）で観察された。標的分子Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕは、２．４０４分で観察された（７６面積％）（Ｍ＝７０６ｇ／ｍｏｌ、実測値：ｍ／ｚ＋＝７０７［Ｍ＋Ｈ］＋、７２９［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【0074】
次いで、Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕのＣｂｚの脱保護を、ジペプチドＣｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕの脱保護反応において前述したNoblyst P1141触媒を用いて行った。この反応のスクリーニング実験において良好な反応性を示したのでこの触媒を選択し、出発物質は１８時間の反応時間内に完全に変換された。したがって、これらの条件は、テトラペプチドＣｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕのＣｂｚの選択的脱保護にも適用した。テトラペプチド（Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）の水素化で満足いく反応速度を得るためには、ジペプチドＣｂｚ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕの場合よりも多くのＰｄ／Ｃを必要とすることが初期試験反応で示された。
【0075】
この反応では、Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（７００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＯＨ（１０ｍｌ）に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（Noblyst P1141、１０％（w/w） Ｐｄ、６０％Ｈ２Ｏ）（７００ｍｇ、４０μｍｏｌ、４ｍｏｌ％）を添加した。反応混合物を水素雰囲気（１気圧）下で撹拌した。反応中にＨＰＬＣ分析を行った。
【0076】
ＨＰＬＣによる分析では、５時間後に２３面積％の出発物質が依然として観察され、２４時間後には１２面積％の出発物質が残っていることが示された。そこで、Ｐｄ／Ｃ触媒（２００ｍｇ）を追加した。７２時間後、出発物質がほぼ完全に消費されたことがＨＰＬＣによる分析で示された（出発物質は０．８４面積％）。反応混合物をＰ３ガラスフィルター中のhyfloでろ過し、ＭｅＯＨ（３×５ｍｌ）ですすいだ。ろ液を真空中で濃縮して、５５０ｍｇの黄色がかった油状物を得た。ＨＰＬＣによる分析では、標的分子量（Ｍ＝５７２ｇ／ｍｏｌ、実測値：ｍ／ｚ＋＝５７３［Ｍ＋Ｈ］＋）の主シグナルが１．９２９分（８１面積％）に観察された。
【0077】
テトラペプチドＨ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ψＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（５５０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、収率７９％）を純度８０％（ＬＣＭＳに基づく）で得た。
【0078】
実施例４ａ 代替テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）の製造
ジペプチドＫＤ-３ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕのその後の反応を、上記（実施例３ａ）のジクロロメタン溶液を用いて行う。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（市販）とのカップリングを、ＤＩＰＥＡ（３当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で行って、保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得る。ＤＣＭ層を水及びブラインで洗浄し、１０～１５体積に濃縮し、次の段階（実施例５ａ）でそのまま使用する。
ジペプチドＫＤ-３ｃ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕのその後の反応を、上記（実施例３ａ）のジクロロメタン溶液を用いて行う。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（市販）とのカップリングを、ＤＩＰＥＡ（３当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で行って、保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得る。ＤＣＭ層を水及びブラインで洗浄し、１０～１５体積に濃縮し、次の段階（実施例５ａ）でそのまま使用する。
【0079】
実施例５ ヘキサペプチドＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号２）の製造
ヘキサペプチドＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを得るための、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとＨ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕとのペプチドカップリングを、１８時間、室温で、ＤＭＦ中カップリング試薬ＤＣＣ及び添加剤ＨＯＡｔの存在下で行った。
ヘキサペプチドＢｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを得るための、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとＨ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕとのペプチドカップリングを、１８時間、室温で、ＤＭＦ中カップリング試薬ＤＣＣ及び添加剤ＨＯＡｔの存在下で行った。
【0080】
この反応では、Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（２．０ｍｌ）に溶解し、氷浴中で冷却した。透明な溶液に、ＨＯＡｔ（６５ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＣＣ（９８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。１５分後、ＨＣｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（２７２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応混合物を室温までゆっくりと温めながら１８時間撹拌した。次いで、反応混合物を標準的な手順に従って後処理した。後処理したバッチのＬＣＭＳ分析の結果、２．７６０分の保持時間に標的分子Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを得た（Ｍ＝９７４ｇ／ｍｏｌ、実測値：ｍ／ｚ＋＝９７５［Ｍ＋Ｈ］＋、９９７［Ｍ＋Ｎａ］＋）。標的分子Ｂｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを、８４％の純度（ＬＣＭＳ）に基づいて収率７６％（４２０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）で、嵩高い白色固体として得た。
【0081】
実施例５ａ 代替ヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）の製造及びそのＦｏｘｙ-５への変換
実施例４ａで濃縮されたＤＣＭ溶液として得たＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を、ＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護する。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してＤＢＵを除去する。カラム処理後、ＤＩＰＥＡ（３．０当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．０当量）の存在下で、実施例２ａでＤＣＨＡ塩として得たＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（ＫＤ-１ｃ）とＤＣＭ溶液を反応させて（遊離後）、保護されたＦｏｘｙ-５誘導体 Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を粗製形態で得る。次いで、ＤＣＭ中のＤＢＵによりＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ及びＤＩＰＥＡの存在下でギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得た。この保護されたヘキサペプチドを、ＴＦＡ／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ／ＤＴＴに溶解し、撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を９０％を超える収率及び純度約９７％で得た。
実施例４ａで濃縮されたＤＣＭ溶液として得たＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を、ＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護する。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してＤＢＵを除去する。カラム処理後、ＤＩＰＥＡ（３．０当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．０当量）の存在下で、実施例２ａでＤＣＨＡ塩として得たＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（ＫＤ-１ｃ）とＤＣＭ溶液を反応させて（遊離後）、保護されたＦｏｘｙ-５誘導体 Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を粗製形態で得る。次いで、ＤＣＭ中のＤＢＵによりＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ及びＤＩＰＥＡの存在下でギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得た。この保護されたヘキサペプチドを、ＴＦＡ／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ／ＤＴＴに溶解し、撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を９０％を超える収率及び純度約９７％で得た。
【0082】
３＋３経路
実施例６ 断片ＫＴ-１（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）及びＫＴ-１＊（Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の製造
実施例６ａ トリペプチドＫＴ-１＊（Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の製造で、ホルミル－メチオニンの代わりにＦｍｏｃ－メチオニンを使用した例
グリシンメチルエステル（２５ｇ）を、ＤＩＰＥＡ（１．０当量）、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下、ＤＭＦ中でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨと反応させた。標準的な後処理の後、粗生成物を１５％ＥｔＯＡｃ／n-ヘキサンを用いてシリカゲルで精製した。この１ｇをＦｍｏｃ－Ｍｅｔとカップリングし、保護トリペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅ（２．０ｇ、７２．７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
実施例６ 断片ＫＴ-１（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）及びＫＴ-１＊（Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の製造
実施例６ａ トリペプチドＫＴ-１＊（Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の製造で、ホルミル－メチオニンの代わりにＦｍｏｃ－メチオニンを使用した例
グリシンメチルエステル（２５ｇ）を、ＤＩＰＥＡ（１．０当量）、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下、ＤＭＦ中でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨと反応させた。標準的な後処理の後、粗生成物を１５％ＥｔＯＡｃ／n-ヘキサンを用いてシリカゲルで精製した。この１ｇをＦｍｏｃ－Ｍｅｔとカップリングし、保護トリペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅ（２．０ｇ、７２．７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
【0083】
実施例６ｂ 断片ＫＴ-１（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨ）の製造
グリシンメチルエステルを、実施例６ａに概説した手順に従ってＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングし、保護ジペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅを得た。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、ＤＩＰＥＡ（１．０当量）、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で、ＤＣＭ中で市販のＦｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨとカップリングし、所望の断片ＫＴ-１を得た。
グリシンメチルエステルを、実施例６ａに概説した手順に従ってＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングし、保護ジペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＭｅを得た。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、ＤＩＰＥＡ（１．０当量）、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で、ＤＣＭ中で市販のＦｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨとカップリングし、所望の断片ＫＴ-１を得た。
【0084】
実施例７ 断片ＫＴ-２（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ）の製造
Ｆｍｏｃロイシン（２５０ｇ）をメタノールに溶解し、塩化チオニルで処理することにより定量的な収率でＦｍｏｃメチルロイシンに変換した。ジクロロメタン中のＤＢＵによるＦｍｏｃの脱保護により、所望のロイシンメチルエステル（７６ｇ、全収率７４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。次に、高度希釈ジクロロメタン中、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で、１０ｇのロイシンメチルエステルとＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）を、最初は０～５℃で１時間、次いで１５～２０℃で１時間カップリングし、ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（７．２ｇ、全収率５５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。次の工程におけるＦｍｏｃシステインとの反応では、生成物の単離を省略し、水性処理の直後にジクロロメタン溶液を使用した。ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅのその後の反応は、上述のジクロロメタン溶液を用いた。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして、断片ＫＴ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅを得た（６．６ｇ、２回のカップリング反応の全収率８８％）。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
Ｆｍｏｃロイシン（２５０ｇ）をメタノールに溶解し、塩化チオニルで処理することにより定量的な収率でＦｍｏｃメチルロイシンに変換した。ジクロロメタン中のＤＢＵによるＦｍｏｃの脱保護により、所望のロイシンメチルエステル（７６ｇ、全収率７４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。次に、高度希釈ジクロロメタン中、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で、１０ｇのロイシンメチルエステルとＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）を、最初は０～５℃で１時間、次いで１５～２０℃で１時間カップリングし、ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（７．２ｇ、全収率５５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。次の工程におけるＦｍｏｃシステインとの反応では、生成物の単離を省略し、水性処理の直後にジクロロメタン溶液を使用した。ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅのその後の反応は、上述のジクロロメタン溶液を用いた。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして、断片ＫＴ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅを得た（６．６ｇ、２回のカップリング反応の全収率８８％）。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
【0085】
実施例８ 代替トリペプチド断片Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２＊）の製造
高度希釈（５０体積）ジクロロメタン中、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）及びＤＩＰＥＡ（５．０当量）の存在下で、５０ｇのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩と１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）を、最初は０～５℃で１時間、次いで１５～２０℃で１時間カップリングし、ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。次の工程におけるＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとの反応については、生成物の単離を省略し、水性後処理の後にジクロロメタン溶液を直接使用した。ジペプチドＫＤ-３ｃのその後の反応は、上述のジクロロメタン溶液を用いて行った。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃの脱保護を行い、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）、ＨＯＢｔ（１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（５当量）の存在下、１．３当量のＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして粗トリペプチドＫＴ-２＊を得、これを、溶離剤としてＥｔＯＡｃ－ヘキサンを使用するシリカゲル（１００～２００）クロマトグラフィーによって精製し、トリペプチドＫＴ-２＊、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを白色固体（１４８ｇ、２回のカップリング反応の全収率６８％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
高度希釈（５０体積）ジクロロメタン中、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）及びＤＩＰＥＡ（５．０当量）の存在下で、５０ｇのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩と１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）を、最初は０～５℃で１時間、次いで１５～２０℃で１時間カップリングし、ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。次の工程におけるＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとの反応については、生成物の単離を省略し、水性後処理の後にジクロロメタン溶液を直接使用した。ジペプチドＫＤ-３ｃのその後の反応は、上述のジクロロメタン溶液を用いて行った。ＤＢＵを用いてＦｍｏｃの脱保護を行い、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）、ＨＯＢｔ（１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（５当量）の存在下、１．３当量のＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして粗トリペプチドＫＴ-２＊を得、これを、溶離剤としてＥｔＯＡｃ－ヘキサンを使用するシリカゲル（１００～２００）クロマトグラフィーによって精製し、トリペプチドＫＴ-２＊、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを白色固体（１４８ｇ、２回のカップリング反応の全収率６８％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
【0086】
７５ｇのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩を用い、上記反応を繰り返して２０８ｇのＫＴ-２＊を得た。
【0087】
実施例９ａ トリペプチド断片ＫＴ-１とＫＴ-２のカップリングとその後の脱保護によるＦｏｘｙ-５の製造
２つのトリペプチド断片、ＫＴ-１及びＫＴ-２からのＦｏｘｙ-５の合成は、ＫＴ-２のＦｍｏｃの脱保護から始める。その後、ＫＴ-１とカップリングし、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅを得る。次いで、塩基性条件下でけん化し、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＨを得、ｔＢｕ保護基及びトリチル保護基を脱保護し、所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を粗製形態で得る。
２つのトリペプチド断片、ＫＴ-１及びＫＴ-２からのＦｏｘｙ-５の合成は、ＫＴ-２のＦｍｏｃの脱保護から始める。その後、ＫＴ-１とカップリングし、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅを得る。次いで、塩基性条件下でけん化し、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＨを得、ｔＢｕ保護基及びトリチル保護基を脱保護し、所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を粗製形態で得る。
【0088】
実施例９ｂ トリペプチド断片ＫＴ-１＊及びＫＴ-２＊のカップリング、Ｆｍｏｃ除去、ホルミル化及び脱保護によるＦｏｘｙ-５の製造
２つのトリペプチド断片、ＫＴ-１＊及びＫＴ-２＊からのＦｏｘｙ-５の合成は、ＫＴ-２＊のＦｍｏｃの脱保護から始める。その後、ＫＴ-１＊とカップリングし、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得、ＤＣＭ中のＤＢＵでＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ及びＤＩＰＥＡの存在下でギ酸とカップリングし、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得た。この保護されたヘキサペプチドを、ＴＦＡ／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ／ＤＴＴ中に溶解し、撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を９０％を超える収率及び純度約９７％で得た。
２つのトリペプチド断片、ＫＴ-１＊及びＫＴ-２＊からのＦｏｘｙ-５の合成は、ＫＴ-２＊のＦｍｏｃの脱保護から始める。その後、ＫＴ-１＊とカップリングし、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得、ＤＣＭ中のＤＢＵでＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ及びＤＩＰＥＡの存在下でギ酸とカップリングし、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得た。この保護されたヘキサペプチドを、ＴＦＡ／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ／ＤＴＴ中に溶解し、撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を９０％を超える収率及び純度約９７％で得た。
【0089】
４＋１＋１経路
実施例１０ テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）とＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＦｍｏｃ－Ｍｅｔとの連続的カップリング、Ｆｍｏｃ除去、ホルミル化及び脱保護によるＦｏｘｙ-５の製造
実施例４ａで得たＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を、まずＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護する。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してＤＢＵを除去したが、これは望ましくないアスパルトイミド副生成物の形成を誘導することが以前の実験で分かっているためである。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとのカップリング前にＤＢＵを除去すると、アスパルトイミド形成が効果的に抑制される。シリカカラム処理後、ＤＣＭ溶液を、ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と反応させて、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）を得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
実施例１０ テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）とＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＦｍｏｃ－Ｍｅｔとの連続的カップリング、Ｆｍｏｃ除去、ホルミル化及び脱保護によるＦｏｘｙ-５の製造
実施例４ａで得たＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を、まずＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護する。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してＤＢＵを除去したが、これは望ましくないアスパルトイミド副生成物の形成を誘導することが以前の実験で分かっているためである。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとのカップリング前にＤＢＵを除去すると、アスパルトイミド形成が効果的に抑制される。シリカカラム処理後、ＤＣＭ溶液を、ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と反応させて、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）を得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
【0090】
次に、ペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）のＦｍｏｃの脱保護をＤＢＵで行い、ＤＩＰＥＡ（３．０当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．０当量）の存在下、溶媒としてのＤＣＭ－ＴＨＦ（５０体積＋１０体積）中でＦｍｏｃ－Ｍｅｔとカップリングして、保護されたヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を粗製形態で得た。
【0091】
実施例４のヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）のＦｍｏｃの脱保護を、ＤＣＭ（５０体積）中のＤＢＵで行い、その後ＥＤＣ・ＨＣｌ（４．０当量）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（４．０当量）及びＤＩＰＥＡ（４．０当量）の存在下でギ酸（３．０当量）とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を製造し、これを、ＴＦＡ（１０体積）／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ（ＴＩＳ、１．７体積）／ＤＴＴ（１．７当量）中に溶解し、１．５時間撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させることにより、粗生成物を固体として収率９７％（９．５ｇｒ）で得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７％で得た。
【0092】
３＋１＋１＋１経路
実施例１１ Ｆｏｘｙ-５に対する逐次液相アプローチの実行可能性
ＫＴ-２（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ）をＤＣＭ中でＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護し、その後ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと反応させて保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号７）を得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。粗生成物を、ＤＣＭ中のＤＢＵと類似の様式でさらに反応させて、Ｆｍｏｃを脱保護し、その後ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と反応させて、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号９）を得、これをシリカゲル精製及びメタノール中でのスラリー化後に白色固体として得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。ペンタペプチドのＦｍｏｃの脱保護はＤＢＵを用いて行い、ＤＩＰＥＡ（１．０当量）、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下、ＤＣＭ中で市販のＦｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨとカップリングすると、保護されたＦｏｘｙ-５誘導体Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号３）が得られ、これを塩基性条件下でけん化すると、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号４）が得られ、ｔＢｕ保護基及びトリチル保護基を脱保護し、所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を粗製形態で得る。
実施例１１ Ｆｏｘｙ-５に対する逐次液相アプローチの実行可能性
ＫＴ-２（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ）をＤＣＭ中でＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護し、その後ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと反応させて保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号７）を得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。粗生成物を、ＤＣＭ中のＤＢＵと類似の様式でさらに反応させて、Ｆｍｏｃを脱保護し、その後ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と反応させて、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号９）を得、これをシリカゲル精製及びメタノール中でのスラリー化後に白色固体として得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。ペンタペプチドのＦｍｏｃの脱保護はＤＢＵを用いて行い、ＤＩＰＥＡ（１．０当量）、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下、ＤＣＭ中で市販のＦｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨとカップリングすると、保護されたＦｏｘｙ-５誘導体Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（配列番号３）が得られ、これを塩基性条件下でけん化すると、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号４）が得られ、ｔＢｕ保護基及びトリチル保護基を脱保護し、所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を粗製形態で得る。
【0093】
実施例１２ Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）
実施例８で得たＫＴ-２＊（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）を、ＤＣＭ（５０体積）中でＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護し、その後１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを、ＤＩＰＥＡ（３当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で反応させて、保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得た。ＴＬＣにより良好な変換が観察され、ＤＣＭ層を水及びブラインで洗浄した。最終有機層を１０～１５体積に濃縮し、単離することなく次の段階でそのまま使用した。
実施例８で得たＫＴ-２＊（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）を、ＤＣＭ（５０体積）中でＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護し、その後１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを、ＤＩＰＥＡ（３当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で反応させて、保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得た。ＴＬＣにより良好な変換が観察され、ＤＣＭ層を水及びブラインで洗浄した。最終有機層を１０～１５体積に濃縮し、単離することなく次の段階でそのまま使用した。
【0094】
実施例１３ Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１０）
濃縮ＤＣＭ溶液として得たＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を、まずＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護した。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してＤＢＵを除去したが、これは望ましくないアスパルトイミド副生成物の形成を誘導することが以前の実験で分かっているためである。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとのカップリング前にＤＢＵを除去すると、アスパルトイミド形成が効果的に抑制される。シリカカラム処理後、ＤＣＭ溶液を、ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と反応させて、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）を得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
濃縮ＤＣＭ溶液として得たＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を、まずＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護した。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してＤＢＵを除去したが、これは望ましくないアスパルトイミド副生成物の形成を誘導することが以前の実験で分かっているためである。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとのカップリング前にＤＢＵを除去すると、アスパルトイミド形成が効果的に抑制される。シリカカラム処理後、ＤＣＭ溶液を、ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ，ＨＣｌ（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と反応させて、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）を得た。生成物を１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により同定した。
【0095】
上記反応を２回繰り返し、１４８ｇ及び２２０ｇの出発物質から、それぞれ１０７ｇ及び１６３ｇの生成物を得た（理論値の５８．１％及び５９．２％）。
【0096】
実施例１４ Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）
実施例１３で得たペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１０）のＦｍｏｃの脱保護を、ＤＢＵで行い、ＤＩＰＥＡ（３．０当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．０当量）の存在下、溶媒としてのＤＣＭ－ＴＨＦ（５０体積＋１０体積）中でＦｍｏｃ－Ｍｅｔとカップリングし、保護Ｆｏｘｙ-５誘導体Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を粗製形態で得た。溶離剤としてＤＣＭ／ＴＨＦを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製を行った。精製した生成物をＤＩＰＥ中でスラリー化して白色固体を得た。
実施例１３で得たペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１０）のＦｍｏｃの脱保護を、ＤＢＵで行い、ＤＩＰＥＡ（３．０当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．０当量）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．０当量）の存在下、溶媒としてのＤＣＭ－ＴＨＦ（５０体積＋１０体積）中でＦｍｏｃ－Ｍｅｔとカップリングし、保護Ｆｏｘｙ-５誘導体Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を粗製形態で得た。溶離剤としてＤＣＭ／ＴＨＦを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製を行った。精製した生成物をＤＩＰＥ中でスラリー化して白色固体を得た。
【0097】
精製は、様々な条件下、例えば、非溶媒による沈殿及びクロマトグラフィーで数回行った。最善の解決策は、ＤＩＰＥ中でのスラリー化が後に続くカラムクロマトグラフィーであることが見いだされ、これにより、２５ｇスケールでは収率７８％及び化学純度９５．４％で得た。
【0098】
実施例１５ Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）
実施例１４で得たヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）のＦｍｏｃの脱保護を、ＤＣＭ（５０体積）中のＤＢＵで行い、その後ＥＤＣ・ＨＣｌ（４．０当量）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（４．０当量）及びＤＩＰＥＡ（４．０当量）の存在下で、ギ酸（３．０当量）とカップリングし、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得た。
実施例１４で得たヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）のＦｍｏｃの脱保護を、ＤＣＭ（５０体積）中のＤＢＵで行い、その後ＥＤＣ・ＨＣｌ（４．０当量）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（４．０当量）及びＤＩＰＥＡ（４．０当量）の存在下で、ギ酸（３．０当量）とカップリングし、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得た。
【0099】
反応は、それぞれ４ｇ、１８ｇ及び１８ｇの出発物質から３回行い、収率７５～８３％及び化学純度６７．５～７７．２％で得た。
【0100】
実施例１６ Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５、配列番号１）
実施例１５で得たヘキサペプチド１４ｇをＴＦＡ（１０体積）／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ（ＴＩＳ）（ＴＩＳ、１．７体積）／ＤＴＴ（１．７当量）中に溶解し、１．５時間撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として収率９７％（９．５ｇ）で得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７％で得た。
実施例１５で得たヘキサペプチド１４ｇをＴＦＡ（１０体積）／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ（ＴＩＳ）（ＴＩＳ、１．７体積）／ＤＴＴ（１．７当量）中に溶解し、１．５時間撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として収率９７％（９．５ｇ）で得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７％で得た。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図6a】
【図7】
【図7a】
【図8】
【図8a】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）ＰＧ１－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ２は水素、又はアセトニド（シュードプロリン、ΨＭｅ、ＭｅＰｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ３は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ５はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ４は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片。
ｂ）ＰＧ５－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ４）－Ｇｌｙ－ＯＲ２
ｃ）ＰＧ１－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ２）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ３）－Ｌｅｕ－ＯＲ１
（式中、ＰＧ１は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ２は水素、又はアセトニド（シュードプロリン、ΨＭｅ、ＭｅＰｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ３は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ５はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ４は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ１～Ｃ６アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0100】
実施例１６ Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５、配列番号１）
実施例１５で得たヘキサペプチド１４ｇをＴＦＡ（１０体積）／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ（ＴＩＳ）（ＴＩＳ、１．７体積）／ＤＴＴ（１．７当量）中に溶解し、１．５時間撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として収率９７％（９．５ｇ）で得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７％で得た。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］ ａ）ＰＧ １ －Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １
ｂ）ＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ ４ ）－Ｇｌｙ－ＯＲ ２
ｃ）ＰＧ １ －Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １
（式中、ＰＧ １ は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ ２ は水素、又はアセトニド（シュードプロリン、Ψ Ｍｅ、Ｍｅ Ｐｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ ３ は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ ５ はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ ４ は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ １ 及びＲ ２ は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ １ ～Ｃ ６ アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片。
［２］ ＰＧ １ －Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １ である、［１］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［３］ ＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ ４ ）－Ｇｌｙ－ＯＲ ２ である、［１］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［４］ ＰＧ １ －Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １ である、［１］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたテトラペプチド断片。
［５］ Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（キートリペプチド-２ ＊ 、ＫＴ-２ ＊ ）である、［１］又は［２］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［６］ Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ（キートリペプチド-１ ＊ 、ＫＴ-１ ＊ ）である、［１］又は［３］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［７］ Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕである、［１］又は［４］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたテトラペプチド断片。
［８］ 固体である、［１］～［７］のいずれかに記載のＦｏｘｙ-５の保護されたペプチド断片。
［９］ 結晶形態である、［８］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたペプチド断片。
［１０］ Ｆｏｘｙ-５の保護誘導体であるＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを製造する液相法であって、前記方法は、
ａ．ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（ＫＤ-２ｃ）とカップリングしてテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得、続いてＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングすること、
ｂ．トリペプチドＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２ ＊ ）とカップリングすること、
ｃ．トリペプチドＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２ ＊ ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ ５ －Ｍｅｔと順次カップリングすること、又は
ｄ．テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）をＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ ５ －Ｍｅｔと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、ＰＧ ５ はホルミル又はＦｍｏｃのような塩基感受性保護基である、方法。
［１１］ ＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕをＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）に変換する液相法であって、前記方法は、
ＰＧ ５ がホルミルの場合、
ｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、又は、
ＰＧ ５ がＦｍｏｃのような塩基感受性保護基の場合、
ｉｉ．ヘキサペプチドＰＧ ６ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕからＰＧ ５ を除去し、続いてギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得、
ｉｉｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、
を含み、続いて、
ａ．必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
ｂ．必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法。
実施例１５で得たヘキサペプチド１４ｇをＴＦＡ（１０体積）／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ（ＴＩＳ）（ＴＩＳ、１．７体積）／ＤＴＴ（１．７当量）中に溶解し、１．５時間撹拌することによって（Ｔｒｔ基及びｔＢｕ基を）脱保護した。反応完了後、ＴＨＦ／ＭＴＢＥで沈殿させ、粗生成物を固体として収率９７％（９．５ｇ）で得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を純度９７％で得た。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］ ａ）ＰＧ １ －Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １
ｂ）ＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ ４ ）－Ｇｌｙ－ＯＲ ２
ｃ）ＰＧ １ －Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １
（式中、ＰＧ １ は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）若しくはＢｏｃのような保護基であり、ＰＧ ２ は水素、又はアセトニド（シュードプロリン、Ψ Ｍｅ、Ｍｅ Ｐｒｏ）、トリチル（Ｔｒｔ）から選択される保護基であり、ＰＧ ３ は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、ＰＧ ５ はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基感受性保護基であり、ＰＧ ４ は水素又はtert-ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、Ｒ １ 及びＲ ２ は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル（ｔＢｕ）のようなＣ １ ～Ｃ ６ アルキルである）
から選択されるＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）の保護されたペプチド断片。
［２］ ＰＧ １ －Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １ である、［１］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［３］ ＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯＰＧ ４ ）－Ｇｌｙ－ＯＲ ２ である、［１］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［４］ ＰＧ １ －Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯＲ １ である、［１］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたテトラペプチド断片。
［５］ Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（キートリペプチド-２ ＊ 、ＫＴ-２ ＊ ）である、［１］又は［２］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［６］ Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ（キートリペプチド-１ ＊ 、ＫＴ-１ ＊ ）である、［１］又は［３］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたトリペプチド断片。
［７］ Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（ＰＧ ２ ）－Ｇｌｕ（ＯＰＧ ３ ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕである、［１］又は［４］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたテトラペプチド断片。
［８］ 固体である、［１］～［７］のいずれかに記載のＦｏｘｙ-５の保護されたペプチド断片。
［９］ 結晶形態である、［８］に記載のＦｏｘｙ-５の保護されたペプチド断片。
［１０］ Ｆｏｘｙ-５の保護誘導体であるＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを製造する液相法であって、前記方法は、
ａ．ジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＤ-３ｃ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（ＫＤ-２ｃ）とカップリングしてテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）を得、続いてＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨとカップリングすること、
ｂ．トリペプチドＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２ ＊ ）とカップリングすること、
ｃ．トリペプチドＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（ＫＴ-２ ＊ ）をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ ５ －Ｍｅｔと順次カップリングすること、又は
ｄ．テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号６）をＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕ及びＰＧ ５ －Ｍｅｔと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、ＰＧ ５ はホルミル又はＦｍｏｃのような塩基感受性保護基である、方法。
［１１］ ＰＧ ５ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕをＦｏｘｙ-５（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ）に変換する液相法であって、前記方法は、
ＰＧ ５ がホルミルの場合、
ｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、又は、
ＰＧ ５ がＦｍｏｃのような塩基感受性保護基の場合、
ｉｉ．ヘキサペプチドＰＧ ６ －Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕからＰＧ ５ を除去し、続いてギ酸とカップリングして、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を得、
ｉｉｉ．Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号１５）を脱保護して、粗Ｆｏｘｙ-５を得ること、
を含み、続いて、
ａ．必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
ｂ．必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法。
【外国語明細書】