特開 2024-120011 斜面顕微鏡検査システムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024120011

(43)【公開日】2024-09-03

(54)【発明の名称】斜面顕微鏡検査システムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20240827BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240827BHJP

   G02B 21/06 20060101ALN20240827BHJP

   G02B 21/36 20060101ALN20240827BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G01N21/64 E

G02B21/06

G02B21/36

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024098349

(22)【出願日】2024-06-18

(62)【分割の表示】P 2021550252の分割

【原出願日】2020-02-26

(31)【優先権主張番号】62/859,516

(32)【優先日】2019-06-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/888,016

(32)【優先日】2019-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/811,174

(32)【優先日】2019-02-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】518390343

【氏名又は名称】カリコ ライフ サイエンシーズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー グレゴリー ヨーク

(72)【発明者】

【氏名】アルフレッド ミレット－シッキング

(57)【要約】

【課題】斜面顕微鏡検査システムおよび方法の提供。
【解決手段】斜面顕微鏡検査のためのシステムおよび方法が、開示される。斜面顕微鏡検査システムは、屈折率ｎ_０を有するサンプルを結像するように構成され、システムは、サンプルから放出される光を受光するように配列される第１の顕微鏡であって、第１の開口数ＮＡ_１≧ｎ_０およびｎ_０にほぼ等しい第１の屈折率ｎ_１を伴う第１の浸漬媒体のうちの少なくとも１つを有する第１の対物レンズを含む、第１の顕微鏡と、第２の対物レンズを含む第２の顕微鏡であって、第１と第２の顕微鏡の組み合わせは、拡大率Ｍ_ＲＲを伴うサンプルの中間画像を生成するように構成され、第２の対物レンズは、第２の開口数ＮＡ_２を有する、第２の顕微鏡と、中間画像上に集束され、第３の開口数を有する第３の対物レンズを含む第３の顕微鏡とを備える。
【選択図】図２Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

従来の光学顕微鏡検査は、広範囲の用途のための高分解能結像を提供する。例えば、生物学的サンプルが結像されている、ある状況では、通常、サンプルを通した軸方向に薄いスライスに対応する、光学的に区分化された画像を取得することが望ましい。光学的に区分化された結像の利点は、焦点外平面からの寄与の低減を通した改良された画像コントラストおよび３次元（３Ｄ）画像を生成する能力を含む。いわゆる「光シート」顕微鏡検査は、薄い光の「シート」がサンプルを照明するために使用される、光学的に区分化された結像技法である。本アプローチは、照明ビーム線量が、種々の他の従来の光学的に区分化された結像技法におけるものより低く、本アプローチが、したがって、サンプルにとって光毒性が著しく少ないため、多くの用途において、特に、生きている生物学的サンプルを結像するために有益である。その利点にもかかわらず、光シート顕微鏡検査は、２つの直交して位置付けられるレンズ、すなわち、光シートを送達するため（サンプルを照明するため）の一方のレンズと、画像を収集するための他方のレンズとを使用する、大部分の実装の扱いにくい性質に起因して、歴史的には、広く採用されてなかった。結果として生じる幾何学的制約に起因して、これらの実装は、典型的には、ガラススライド、皿、およびマルチウェルプレートを含む、多くの生物学的サンプル調製技法と互換性がない。

【0002】

３つの対物レンズが、像面を傾斜させ、それによって、サンプル中の斜面の合焦結像を達成するために使用される、斜面顕微鏡検査と称される、光シート顕微鏡検査の形態が、開発された。斜面顕微鏡検査は、サンプル中の斜面が、同一対物レンズを用いて、照明および結像されることを可能にし、したがって、標準的ガラススライドおよび他のサンプル調製技法と互換性がある一方、また、光学的に区分化された結像と関連付けられる、最小限の光漂白および光毒性の利点も留保する。斜面顕微鏡検査およびその実装の概念は、２００８年１２月８日のＣ． Ｄｕｎｓｂｙによる「Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ ｏｂｌｉｑｕｅ ｐｌａｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ， Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．２５）（本明細書では、「Ｄｕｎｓｂｙ」と称される）に説明される。Ｄｕｎｓｂｙに提示される斜面顕微鏡検査システムは、従来の光学的に区分化された顕微鏡検査方法に優る利点を提供した。しかしながら、光学システムの性能指数、具体的には、開口数（ＮＡ）は、本技法が多くの用途において有用であるためには低すぎる。例えば、従来の高分解能顕微鏡検査は、水性サンプルに関して、１．３３と同程度に高い開口数値を達成することができる一方、Ｄｕｎｓｂｙシステムは、水浸漬式の対物レンズに関して、わずか０．７４の理論的開口数値を達成する。

【0003】

Ｄｕｎｓｂｙに説明される斜面顕微鏡検査システムの修正は、２０１８年２月２８日にｂｉｏＲｘｉｖ上で印刷前論文として公開されたＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．の「Ｈｉｇｈ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ａｐｅｒｔｕｒｅ Ｅｐｉ－ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（本明細書では、「Ｙａｎｇ」と称される）によって提示されている。図１を参照すると、Ｙａｎｇシステムは、その中の水浸漬式の対物レンズ（Ｏ１）１１０がサンプル照明および蛍光収集の両方のために使用される、単一対物レンズの傾斜型落射照明式選択平面照明顕微鏡である。Ｙａｎｇによると、照明光シートは、Ｏ１の光学軸に対して６０度（°）の入射角度を有し、遠隔結像モジュールは、Ｏ２によって生成される中間画像がＯ３によって合焦して再結像されるように、３０°の角度に配列される、２つの対物レンズ（Ｏ２およびＯ３）１２０、１３０を含む。光１４０は、結像のために、検出器１６０上の光学系１５０によって集束される。Ｙａｎｇは、Ｏ２およびＯ３の傾斜された配列が、Ｏ２によって発生される光円錐の一部をＯ３の収集可能範囲から外に傾斜させるため、従来、開口数の損失を引き起こすことを開示している（例えば、Ｄｕｎｓｂｙシステムの場合のように）。Ｏ３がＯ２に対して傾斜される、高開口数システムに関して、Ｏ２の開口数が、Ｏ１の開口数の十分な被覆率を確実にするために十分に高いとき、以前の実装では、Ｏ３が、さらにより大きい収集円錐を有することは、非実践的であった。Ｙａｎｇは、遠隔結像モジュールのために不整合の対の対物レンズを選択し、Ｏ２のための空気対物レンズ（ＮＡ＝０．９）と、Ｏ３のための水浸漬式の対物レンズ（ＮＡ＝１．０）とを使用して、中間像面１７０に位置するカバーガラスを用いて、Ｏ２とＯ３との間の焦点空間を分離し、水を片側上に、空気を他側上に保つことによって、本問題に対処している。Ｙａｎｇによると、カバーガラスのｚ’位置は、球面収差を最小限にするように調節されることができ、Ｏ２の作業媒体（空気および水）とＯ３との間の屈折率差は、Ｏ２光円錐の角度を圧縮し、それによって、開口数損失を低減させる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｃ． Ｄｕｎｓｂｙ，”Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｙ ｏｂｌｉｑｕｅ ｐｌａｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ， Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．２５

【非特許文献2】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｈｉｇｈ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ａｐｅｒｔｕｒｅ Ｅｐｉ－ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

Ｙａｎｇシステムは、Ｄｕｎｓｂｙシステムのものよりはるかに高いが、依然として、従来の高分解能光学顕微鏡検査を使用して理論的に達成され得る、ＮＡ＝ｎ_０（＝水性サンプルに関して、１．３３）未満である、１．０６の開口数値を達成する。側面および実施形態は、従来の高分解能顕微鏡を用いて達成可能な理論的ＮＡ＝ｎ_０限界に接近する開口数値を達成する一方、また、ガラスカバースリップおよびマルチウェルプレートを含む、標準的ベンチ顕微鏡および一般的サンプル調製技法と併用され得る、光学的に区分化された結像ならびに便宜的かつ実践的実装配列と関連付けられる、利点（例えば、低減させられた光漂白および光毒性、改良された画像コントラスト、ならびに３Ｄ画像を生成する能力）を提供する、斜面顕微鏡検査システムを対象とする。故に、側面および実施形態は、広範囲の用途のために好適なほぼ妥協のない単一対物レンズ斜面顕微鏡検査のための解決策を提供し得る。

【0006】

一実施形態によると、斜面顕微鏡検査システムは、屈折率ｎ_０を有する、サンプルを結像するように構成され、本システムは、サンプルから放出される光を受光するように配列される、第１の顕微鏡であって、第１の開口数ＮＡ_１≧ｎ_０およびｎ_０にほぼ等しい第１の屈折率ｎ_１を伴う第１の浸漬媒体のうちの少なくとも１つを有する、第１の対物レンズを含む、第１の顕微鏡と、第２の対物レンズを含む、第２の顕微鏡であって、第１と第２の顕微鏡の組み合わせは、拡大率Ｍ_ＲＲを伴うサンプルの中間画像を生成するように構成され、第２の対物レンズは、第２の開口数ＮＡ_２を有し、中間画像は、第２の屈折率ｎ_２を有する、第２の浸漬媒体内に形成され、拡大率Ｍ_ＲＲは、第１および第２の浸漬媒体の屈折率の比率（ｎ_１／ｎ_２）にほぼ等しい、第２の顕微鏡と、中間画像上に集束され、第３の開口数を有する、第３の対物レンズを含む、第３の顕微鏡であって、第３の対物レンズは、第３の顕微鏡が、サンプル中の斜面に対応する、中間画像内の斜面を結像するような傾斜角度だけ、第２の対物レンズの光学軸に対して傾斜される、光学軸を有し、第２の顕微鏡からの実質的に全ての光を収集するように構成および配列される、第３の対物レンズとを備える。

【0007】

一実施例では、サンプルの屈折率は、１．３３～１．４１の範囲内である。一実施例では、第１の対物レンズは、シリコーン浸漬式のレンズである。別の実施例では、第１の開口数は、ＮＡ_１≧１．３５である。別の実施例では、第１の屈折率は、ｎ_１＝１．４１である。別の実施例では、第２の浸漬媒体は、第２の屈折率がｎ_２＝１．０であるような空気である。一実施例では、第２の開口数は、ＮＡ_２≧０．９５である。

【0008】

別の実施例では、第２の開口数と第２の屈折率の比率（ＮＡ_２／ｎ_２）は、第１の開口数と第１の屈折率の比率（ＮＡ_１／ｎ_１）を上回るまたはそれに等しい。

【0009】

一実施例では、傾斜角度は、顕微鏡検査システムの収集効率を最適化するように選択される。

【0010】

別の実施例では、第１の対物レンズは、グリセロール浸漬式のレンズである。

【0011】

別の実施例では、第３の開口数は、ＮＡ_３≧ｎ_２である。

【0012】

一実施例では、第３の対物レンズは、中実ガラス錐台を含む。別の実施例では、第３の対物レンズは、空気中に０～２０μｍの範囲内の作動距離を伴って構成される。

【0013】

一実施例では、斜面顕微鏡検査システムはさらに、光の入射ビームを提供し、サンプル中の斜面を照明するように配列される、光源を備え、照明される斜面は、結像されている斜面に対応する。一実施例では、光の入射ビームは、第１の対物レンズを通して指向される。別の実施例では、第３の顕微鏡は、傾斜角度を調節するために回転可能である。一実施例では、傾斜角度は、部分的に、照明光ビームの発散角度に基づいて選択される。

【0014】

第１の顕微鏡はさらに、第１のレンズを含んでもよく、第１の顕微鏡は、第１の拡大率Ｍ_１を有し、第２の顕微鏡はさらに、ｆ_ＴＬ２、Ｍ_ＲＲ＝Ｍ_１ ^＊Ｍ_２ ^－１＝（ｎ_１／ｎ_２）となるように第２の顕微鏡の拡大率Ｍ_２を設定するように選択される、焦点距離を有する、第２のレンズを含む。

【0015】

別の実施形態によると、屈折率ｎ_０を有する、サンプルを結像するように構成される、斜面顕微鏡検査システムは、サンプルから放出される光を受光するように配列される、第１の顕微鏡であって、第１の顕微鏡は、第１の開口数ＮＡ_１および第１の屈折率ｎ_１を伴う第１の浸漬媒体を有する、第１の対物レンズを含み、第１の対物レンズは、ＮＡ_１≧ｎ_０の第１の理想的条件とｎ_０にほぼ等しいｎ_１の第２の理想的条件との間の選択された妥協に基づいて構成される、第１の顕微鏡と、第２の空気浸漬式の対物レンズを含む、第２の顕微鏡であって、第１と第２の顕微鏡の組み合わせは、拡大率Ｍ_ＲＲ＝ｎ_１を伴うサンプルの中間画像を生成するように構成され、第２の空気浸漬式の対物レンズの第２の開口数ＮＡ_２は、第１の開口数と第１の屈折率の比率（ＮＡ_１／ｎ_１）を上回るまたはそれに等しいＮＡ_２の第３の理想的条件に接近するように選択される、第２の顕微鏡と、中間画像上に集束され、第３の開口数ＮＡ_３≧１を有する、第３の対物レンズを含む、第３の顕微鏡であって、第３の対物レンズは、第３の顕微鏡が、サンプル中の斜面に対応する、中間画像内の斜面を結像するような傾斜角度だけ、第２の対物レンズの光学軸に対して傾斜される、光学軸を有する、第３の顕微鏡とを備える。

【0016】

一実施例では、第１の対物レンズは、シリコーン浸漬式の対物レンズである。

【0017】

別の実施例では、傾斜角度は、顕微鏡検査システムの収集効率を最適化するように選択される。

【0018】

一実施例では、第３の対物レンズは、第２の空気浸漬式の対物レンズの視野と交差するように位置付けられる、中実ガラス錐台を含む。一実施例では、中実ガラス錐台は、面取りされた縁を有する。別の実施例では、中実ガラス錐台は、第２の空気浸漬式の対物レンズの視野に対応するサイズを有する、端部領域が、視野の中に挿入され、第２の空気浸漬式の対物レンズからの利用可能な光を収集することを可能にするように成形される。別の実施例では、第３の顕微鏡は、傾斜角度を調節するために回転可能である。

【0019】

別の実施形態は、サンプル中の斜面を結像するための顕微鏡検査システムを構成する方法を対象とし、顕微鏡検査システムは、第１の顕微鏡と、第２の顕微鏡と、第３の顕微鏡とを含む。本方法は、第１の対物レンズのための第１の理想的条件と第２の理想的条件との間で選定される妥協に基づいて、第１の顕微鏡のための第１の対物レンズを選択することであって、第１の理想的条件は、第１の対物レンズが第１の開口数ＮＡ_１≧ｎ_０を有することであって、ｎ_０は、サンプルの屈折率の推定値であって、第２の理想的条件は、第１の対物レンズが第１の屈折率

【化1】

を有する第１の浸漬媒体を有することであって、第１の対物レンズは、照明光シートをサンプルに指向し、サンプルからの放出光を収集するように構成される、ことと、第２の顕微鏡のための第２の対物レンズを選択することであって、第２の対物レンズは、第１の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集するように構成される、ことと、サンプル中の斜面を中間像面上に再結像するように第２の顕微鏡を構成することと、第３の顕微鏡のための第３の対物レンズを選択することであって、第３の対物レンズは、第２の対物レンズに対して中間像面の反対側上に位置付けられ、傾斜角度αに適応しながら、第２の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集するように構成される、ことと、第３の対物レンズの一次光学軸が第２の対物レンズの一次光学軸に対して傾斜角度αだけ回転されるように、第３の対物レンズを位置付けることとを含む。

【0020】

一実施例では、サンプル中の斜面を再結像するように第２の顕微鏡を構成することは、中間像面におけるサンプル中の斜面の画像の拡大率Ｍ_ＲＲが、条件：

【化2】

を充足させるように、第２の顕微鏡の拡大率Ｍ_２を構成することを含み、式中、Ｍ_１は、第１の顕微鏡の拡大率であって、ｎ_１は、第１の対物レンズの浸漬媒体の屈折率であって、ｎ_２は、第２の対物レンズの浸漬媒体の屈折率である。別の実施例では、第２の顕微鏡は、レンズを含み、第２の顕微鏡の拡大率を構成することは、レンズの焦点距離を選択することを含む。一実施例では、第２の対物レンズを選択することは、空気浸漬式の第２の対物レンズを選択することを含む。別の実施例では、第１の対物レンズを選択することは、シリコーン浸漬式の対物レンズを選択することを含む。別の実施例では、第１の対物レンズを選択することは、グリセロール浸漬式の対物レンズを選択することを含む。一実施例では、第３の対物レンズを選択することは、中実ガラス錐台を有する、第３の対物レンズを選択することを含む。別の実施例では、第３の対物レンズを位置付けることは、中実ガラス錐台の先端が第２の対物レンズの視野と交差するように、第３の対物レンズを位置付けることを含む。別の実施例では、第２の対物レンズを選択することは、ｎ_２を最小限にすることと、第２の対物レンズの第２の開口数ＮＡ_２が、条件：

【化3】

を満たすように選択することとを含む。

【0021】

一実施例では、本方法はさらに、部分的に、照明光シートの発散角度に基づいて、傾斜角度を調節することを含む。

【0022】

別の実施形態によると、傾斜された像面の高開口数低収差結像のための顕微鏡検査システムは、サンプルからの放出光を収集するように配列され、第１の開口数ＮＡ_１および第１の屈折率ｎ_１を伴う第１の浸漬媒体を有する、第１の対物レンズであって、第１の条件と第２の条件との間で選定される妥協に基づいて構成され、第１の条件は、

【化4】

であって、第２の条件は、

【化5】

であって、式中、ｎ_０は、サンプルの屈折率の推定値である、第１の対物レンズと、第２の開口数ＮＡ_２を有し、第１の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集するように位置付けられ、構成される、第２の対物レンズであって、第１と第２の対物レンズの組み合わせは、サンプルの中間画像を生成するように構成される、第２の対物レンズと、中間画像上に集束される第３の対物レンズであって、第３の対物レンズは、第３の対物レンズが中間画像内の傾斜された平面を結像するような傾斜角度だけ、第２の対物レンズの光学軸に対して傾斜される、光学軸を有し、さらに、第２の対物レンズの視野に対応するサイズを有する、端部領域が、視野の中に挿入され、傾斜角度に適応しながら、第２の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集することを可能にするように成形される、中実ガラス錐台を有する、第３の対物レンズとを備える。

【0023】

一実施例では、第１の対物レンズはさらに、照明光ビームをサンプルに送達するように構成および配列される。

【0024】

これらの例示的側面および実施形態のさらに他の側面、実施形態、ならびに利点は、下記に詳細に議論される。本明細書に開示される実施形態は、本明細書に開示される原理のうちの少なくとも１つと一貫した任意の様式において、他の実施形態と組み合わせられてもよく、「ある実施形態」、「いくつかの実施形態」、「ある代替実施形態」、「種々の実施形態」、「一実施形態」、または同等物の言及は、必ずしも、相互に排他的ではなく、説明される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも一実施形態では含まれてもよいことを示すように意図される。本明細書のそのような用語の表出は、必ずしも、全て同一実施形態を参照するわけではない。本明細書に説明される種々の側面および実施形態は、説明される方法または機能のいずれかを実施するための手段を含んでもよい。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
屈折率ｎ_０を有するサンプルを結像するように構成される斜面顕微鏡検査システムであって、
前記サンプルから放出される光を受光するように配列される第１の顕微鏡であって、前記第１の顕微鏡は、第１の開口数ＮＡ_１≧ｎ_０と、ｎ_０にほぼ等しい第１の屈折率ｎ_１を有する第１の浸漬媒体とのうちの少なくとも１つを有する第１の対物レンズを含む、第１の顕微鏡と、
第２の対物レンズを含む第２の顕微鏡であって、前記第１の顕微鏡と前記第２の顕微鏡との組み合わせは、拡大率Ｍ_ＲＲを有する前記サンプルの中間画像を生成するように構成され、前記第２の対物レンズは、第２の開口数ＮＡ_２を有し、前記中間画像は、第２の屈折率ｎ_２を有する第２の浸漬媒体内に形成され、前記拡大率Ｍ_ＲＲは、前記第１の浸漬媒体の前記屈折率と前記第２の浸漬媒体の前記屈折率との比率（ｎ_１／ｎ_２）にほぼ等しい、第２の顕微鏡と、
前記中間画像上に集束される第３の顕微鏡であって、前記第３の顕微鏡は、第３の開口数を有する第３の対物レンズを含み、前記第３の対物レンズは、前記第３の顕微鏡が、前記サンプル中の斜面に対応する前記中間画像内の斜面を結像するような傾斜角度だけ、前記第２の対物レンズの光学軸に対して傾斜させられる光学軸を有し、前記第３の対物レンズは、前記第２の顕微鏡からの実質的に全ての光を収集するように構成および配列される、第３の対物レンズと
を備える、システム。
（項目２）
前記サンプルの前記屈折率は、１．３３～１．４１の範囲内である、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目３）
前記第１の対物レンズは、シリコーン浸漬式のレンズである、項目２に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目４）
前記第１の開口数は、ＮＡ_１≧１．３５である、項目３に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目５）
前記第１の屈折率は、ｎ_１＝１．４１である、項目４に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目６）
前記第２の浸漬媒体は、前記第２の屈折率がｎ_２＝１．０であるような空気である、項目３に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目７）
前記第２の開口数は、ＮＡ_２≧０．９５である、項目６に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目８）
前記第２の屈折率に対する前記第２の開口数の比率（ＮＡ_２／ｎ_２）は、前記第１の屈折率に対する前記第１の開口数の比率（ＮＡ_１／ｎ_１）以上である、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目９）
前記傾斜角度は、前記顕微鏡検査システムの収集効率を最適化するように選択される、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１０）
前記第１の対物レンズは、グリセロール浸漬式のレンズである、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１１）
前記第３の開口数は、ＮＡ_３≧ｎ_２である、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１２）
前記第３の対物レンズは、中実ガラス錐台を含む、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１３）
前記第３の対物レンズは、空気中に０～２０μｍの範囲内の作動距離を伴って構成される、項目１２に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１４）
光の入射ビームを提供し、前記サンプル中の斜面を照明するように配列される光源をさらに備え、前記照明される斜面は、前記結像されている斜面に対応する、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１５）
前記光の入射ビームは、前記第１の対物レンズを通して指向される、項目１４に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１６）
前記第３の顕微鏡は、前記傾斜角度を調節するために回転可能である、項目１５に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１７）
前記傾斜角度は、部分的に、前記照明光ビームの発散角度に基づいて選択される、項目１６に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１８）
前記第１の顕微鏡はさらに、第１のレンズを含み、前記第１の顕微鏡は、第１の拡大率Ｍ_１を有し、前記第２の顕微鏡はさらに、Ｍ_ＲＲ＝Ｍ_１ ^＊Ｍ_２ ^－１＝（ｎ_１／ｎ_２）となるように前記第２の顕微鏡の拡大率Ｍ_２を設定するように選択される焦点距離ｆ_ＴＬ２を有する第２のレンズを含む、項目１に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目１９）
屈折率ｎ_０を有するサンプルを結像するように構成される、斜面顕微鏡検査システムであって、
前記サンプルから放出される光を受光するように配列される第１の顕微鏡であって、前記第１の顕微鏡は、第１の開口数ＮＡ_１と、第１の屈折率ｎ_１を有する第１の浸漬媒体とを有する第１の対物レンズを含み、前記第１の対物レンズは、ＮＡ_１≧ｎ_０の第１の理想的条件と、ｎ_１がｎ_０にほぼ等しいという第２の理想的条件との間の選択された妥協に基づいて構成される、第１の顕微鏡と、
第２の空気浸漬式の対物レンズを含む第２の顕微鏡であって、前記第１の顕微鏡と前記第２の顕微鏡との組み合わせは、拡大率Ｍ_ＲＲ＝ｎ_１を有する前記サンプルの中間画像を生成するように構成され、前記第２の空気浸漬式の対物レンズの第２の開口数ＮＡ_２は、ＮＡ_２が前記第１の屈折率に対する前記第１の開口数の比率（ＮＡ_１／ｎ_１）以上であるという第３の理想的条件に接近するように選択される、第２の顕微鏡と、
前記中間画像上に集束される第３の顕微鏡であって、前記第３の顕微鏡は、第３の開口数ＮＡ_３≧１を有する第３の対物レンズを含み、前記第３の対物レンズは、前記第３の顕微鏡が、前記サンプル中の斜面に対応する前記中間画像内の斜面を結像するような傾斜角度だけ、前記第２の対物レンズの光学軸に対して傾斜させられる光学軸を有する、第３の顕微鏡と
を備える、システム。
（項目２０）
前記第１の対物レンズは、シリコーン浸漬式の対物レンズである、項目１９に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目２１）
前記傾斜角度は、前記顕微鏡検査システムの収集効率を最適化するように選択される、項目１９に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目２２）
前記第３の対物レンズは、前記第２の空気浸漬式の対物レンズの視野と交差するように位置付けられる中実ガラス錐台を含む、項目１９に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目２３）
前記中実ガラス錐台は、面取りされた縁を有する、項目２２に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目２４）
前記中実ガラス錐台は、前記第２の空気浸漬式の対物レンズの前記視野に対応するサイズを有する端部領域が、前記視野の中に挿入され、前記第２の空気浸漬式の対物レンズからの利用可能な光を収集することを可能にするように成形される、項目２２に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目２５）
前記第３の顕微鏡は、前記傾斜角度を調節するために回転可能である、項目２２に記載の斜面顕微鏡検査システム。
（項目２６）
サンプル中の斜面を結像するための顕微鏡検査システムを構成する方法であって、前記顕微鏡検査システムは、第１の顕微鏡と、第２の顕微鏡と、第３の顕微鏡とを含み、前記方法は、
第１の対物レンズのための第１の理想的条件と第２の理想的条件との間で選定される妥協に基づいて、前記第１の顕微鏡のための第１の対物レンズを選択することであって、前記第１の理想的条件は、前記第１の対物レンズが第１の開口数ＮＡ_１≧ｎ_０を有することであり、ｎ_０は、前記サンプルの屈折率の推定値であり、前記第２の理想的条件は、前記第１の対物レンズが第１の屈折率

【化30】

を有する第１の浸漬媒体を有することであり、前記第１の対物レンズは、照明光シートを前記サンプルに指向し、前記サンプルからの放出光を収集するように構成される、ことと、
前記第２の顕微鏡のための第２の対物レンズを選択することであって、前記第２の対物レンズは、前記第１の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集するように構成される、ことと、
前記サンプル中の前記斜面を中間像面上に再結像するように前記第２の顕微鏡を構成することと、
前記第３の顕微鏡のための第３の対物レンズを選択することであって、前記第３の対物レンズは、前記第２の対物レンズに対して前記中間像面の反対側上に位置付けられ、傾斜角度αに適応しながら、前記第２の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集するように構成される、ことと、
前記第３の対物レンズの一次光学軸が前記第２の対物レンズの一次光学軸に対して前記傾斜角度αだけ回転させられるように、前記第３の対物レンズを位置付けることと
を含む、方法。
（項目２７）
前記サンプル中の前記斜面を再結像するように前記第２の顕微鏡を構成することは、前記中間像面における前記サンプル中の前記斜面の画像の拡大率Ｍ_ＲＲが条件：

【化31】

を充足させるように、前記第２の顕微鏡の拡大率Ｍ_２を構成することを含み、式中、Ｍ_１は、前記第１の顕微鏡の拡大率であり、ｎ_１は、前記第１の対物レンズの浸漬媒体の屈折率であり、ｎ_２は、前記第２の対物レンズの浸漬媒体の屈折率である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記第２の顕微鏡は、レンズを含み、前記第２の顕微鏡の前記拡大率を構成することは、前記レンズの焦点距離を選択することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記第２の対物レンズを選択することは、空気浸漬式の第２の対物レンズを選択することを含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記第１の対物レンズを選択することは、シリコーン浸漬式の対物レンズを選択することを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第１の対物レンズを選択することは、グリセロール浸漬式の対物レンズを選択することを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記第３の対物レンズを選択することは、中実ガラス錐台を有する第３の対物レンズを選択することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
前記第３の対物レンズを位置付けることは、前記中実ガラス錐台の先端が前記第２の対物レンズの視野と交差するように、前記第３の対物レンズを位置付けることを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記第２の対物レンズを選択することは、ｎ_２を最小限にすることと、前記第２の対物レンズの第２の開口数ＮＡ_２が、条件：

【化32】

を満たすように選択することとを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
部分的に前記照明光シートの発散角度に基づいて、前記傾斜角度を調節することをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３６）
傾斜された像面の高開口数低収差結像のための顕微鏡検査システムであって、
サンプルからの放出光を収集するように配列される第１の対物レンズであって、前記第１の対物レンズは、第１の開口数ＮＡ_１、および第１の屈折率ｎ_１を有する第１の浸漬媒体を有し、前記第１の対物レンズは、第１の条件と第２の条件との間で選定される妥協に基づいて構成され、前記第１の条件は、

【化33】

であり、前記第２の条件は、

【化34】

であり、ｎ_０は、前記サンプルの屈折率の推定値である、第１の対物レンズと、
第２の開口数ＮＡ_２を有する第２の対物レンズであって、前記第２の対物レンズは、前記第１の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集するように位置付けられ、構成され、前記第１の対物レンズと前記第２の対物レンズとの組み合わせは、前記サンプルの中間画像を生成するように構成される、第２の対物レンズと、
前記中間画像上に集束される第３の対物レンズであって、前記第３の対物レンズは、前記第３の対物レンズが前記中間画像内の傾斜された平面を結像するような傾斜角度だけ、前記第２の対物レンズの光学軸に対して傾斜させられる光学軸を有し、前記第３の対物レンズはさらに、前記第２の対物レンズの視野に対応するサイズを有する端部領域が、前記視野の中に挿入され、前記傾斜角度に適応しながら、前記第２の対物レンズからの実質的に全ての放出光を収集することを可能にするように成形される中実ガラス錐台を有する、第３の対物レンズと
を備える、顕微鏡検査システム。
（項目３７）
前記第１の対物レンズはさらに、照明光ビームを前記サンプルに送達するように構成および配列される、項目３６に記載の顕微鏡検査システム。

【図面の簡単な説明】

【0025】

少なくとも一実施形態の種々の側面が、付随の図を参照して下記に議論され、これは、正確な縮尺で描かれることを意図するものではない。図は、種々の側面および実施形態の例証ならびにさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書内に組み込まれ、その一部を構成するが、本開示の限定の定義として意図するものではない。図中では、種々の図に図示される、各同じまたはほぼ同じ構成要素は、同様の番号によって表される。明確性の目的のために、全ての構成要素が、全ての図において標識されていない。

【図1】図１は、斜面顕微鏡検査システムの一実施例の略図である。

【図2A】図２Ａは、本発明の側面による、斜面光シート顕微鏡検査システムの一実施例のための光収集経路を示す、機能ブロック図である。

【図2B】図２Ｂは、照明光経路の実施例を示す、斜面光シート顕微鏡検査システムの一部の一実施例の機能ブロック図である。

【図3】図３は、本発明の側面による、斜面光シート顕微鏡検査システム内の種々の顕微鏡の理論的収集角度と結果として生じる収集／放出経路開口数との間の関係を示す、略図である。

【図4】図４は、本発明の側面による、斜面光シート顕微鏡検査システムのための設計方法論の実施例を図示する、プロセスフロー図である。

【図5】図５は、照明光シートの実施例のパラメータを図示する、略図である。

【図6A】図６Ａ－Ｃは、本発明の側面による、図２Ａの顕微鏡検査システムの実施形態において使用され得る、第３の対物レンズの実施例の略図である。

【図6B】図６Ａ－Ｃは、本発明の側面による、図２Ａの顕微鏡検査システムの実施形態において使用され得る、第３の対物レンズの実施例の略図である。

【図6C】図６Ａ－Ｃは、本発明の側面による、図２Ａの顕微鏡検査システムの実施形態において使用され得る、第３の対物レンズの実施例の略図である。

【図7】図７は、本発明の側面による、顕微鏡検査システムを構成するための方法の一実施例のフロー図である。

【図8】図８は、本発明の側面による、図２Ａのシステムの一実施例の放出経路を示す、略図である。

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、図８のシステムの実施例の理論的モデルの角度光線伝送経路を示す、略図である。

【図10】図１０は、本発明の側面による、図８のシステムの実施例の放出経路を示す、略図である。

【図11】図１１は、本発明の側面による、図２Ａ、８、および１０のシステム内で使用され得る、第３の対物レンズの実施例を示す、略図である。

【図12A】図１２Ａ－Ｃは、本発明の側面による、図１１の第３の対物レンズの実施例を示す、略図である。

【図12B】図１２Ａ－Ｃは、本発明の側面による、図１１の第３の対物レンズの実施例を示す、略図である。

【図12C】図１２Ａ－Ｃは、本発明の側面による、図１１の第３の対物レンズの実施例を示す、略図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

側面および実施形態は、開口数または光学効率における最小限の収差および損失を伴って、高開口数において傾斜された平面を結像するための解決策を提供し、これは、様々な結像用途に適用されてもよい。ある側面および実施形態は、２つの付加的対物レンズを含み、サンプルの高分解能画像を生成する、結像モジュールとともに、単一対物レンズを使用して、サンプルを照明し、サンプルからの光を収集する、斜面顕微鏡検査システムを対象とする。本明細書で使用されるように、用語「対物レンズ（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）」は、レンズまたはミラー等の１つまたはそれを上回る光学要素を含む、光学モジュールを指し、本明細書では、用語「対物レンズ（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｓ）」と同義的に使用される。下記にさらに議論されるように、本明細書に開示される顕微鏡検査システムの実施形態は、従来の非光学的に区分化された（但し、高分解能である）顕微鏡によって設定される、ＮＡ＝ｎ_０（＝水性サンプル中１．３３）限界値に接近する１．２～１．３の範囲内の開口数（ＮＡ）値を達成し、Ｄｕｎｓｂｙ（わずか０．７４の理論的ＮＡ）およびＹａｎｇ（１．０６の実現されたＮＡ）に開示されるシステムに優る有意な分解能改良を提供し得る。

【0027】

図２Ａを参照すると、ある実施形態による、顕微鏡検査システムの一実施例の機能ブロック図が図示される。示されるように、顕微鏡検査システム２００は、顕微鏡モジュール２０２と、サンプル２０６を結像するように構成される、結像モジュール２０４とを含む。顕微鏡モジュール２０２は、第１の対物レンズ２１０（Ｏｂｊ_１）と、第１のレンズ２１２（ＴＬ_１）とを含み、これは、本明細書には、組み合わせて、「第１の顕微鏡」とも称される。図２Ａに示される実施例では、サンプル２０６は、第１の対物レンズ２１０の正面焦点面または物体像面（ＩＰ_０）に設置される、カバースリップ２０８上に調製される。しかしながら、他の実施例では、例えば、皿およびマルチウェルプレート等の他のサンプル調製技法も、使用されることができる。顕微鏡モジュール２０２は、ある実施例では、下記に議論されるように、結像モジュール２０４の含有および配列を通して斜面光シート顕微鏡検査システム２００に変換される、標準的顕微鏡であってもよい。第１の対物レンズ２１０は、照明ビーム２１６をサンプル２０６に指向することと、放出される光２２０をサンプル２０６から収集することとの両方のために使用される。図２Ａは、顕微鏡検査システム２００の光収集または結像経路のみを示す。完全性のために、図２Ｂは、照明経路を含む、顕微鏡モジュール２０２の配列の実施例を示す。

【0028】

図２Ｂを参照すると、例えば、レーザ等の光源２１４が、照明ビーム２１６を生成する。照明ビーム２１６は、ビーム結合デバイス２１８を使用して、第１の対物レンズ２１０の光学経路の中に結合され、第１の対物レンズ２１０によってサンプル２０６上に集束される。ある実施例では、ビーム結合デバイス２１８は、照明ビーム２１６を第１の対物レンズ２１０に向かって反射させ、サンプル２０６からの放出光２２０が通過することを可能にする、ビームスプリッタであってもよい。しかしながら、他の実施例では、本開示の利点を前提として、当業者によって理解されるであろうように、他の配列またはビーム結合デバイス２１８が、使用されてもよい。同様に、図２Ｂに示される実施例では、照明経路は、光源２１４からの照明ビーム２１６をビーム結合デバイス２１８に指向するように構成および配列される、レンズ２２２と、折畳するミラー２２４とを含む。しかしながら、他の実施例では、本開示の利点を前提として、当業者によって理解されるであろうように、任意の数および配列の光学要素（レンズまたはミラー）が、照明ビームを第１の対物レンズ２１０に指向するために使用されてもよい。ある実施例では、照明ビームを第１の対物レンズ２１０に指向する、光源２１４および光学要素（例えば、２１８、２２２、２２４）は、顕微鏡モジュール２０２の一部であってもよい。他の実施例では、これらの構成要素のうちの１つまたはそれを上回るものは、顕微鏡モジュール２０２と別個であってもよい、結像モジュール２０４内に含まれてもよい、もしくは結像モジュール２０４および／または顕微鏡モジュール２０２に結合され得る、別個のモジュールの一部であってもよい。

【0029】

再び図２Ａを参照すると、一実施形態では、結像モジュール２０４は、レンズ２２８（ＴＬ_２）と第２の対物レンズ２３０（Ｏｂｊ_２）の組み合わせを含む、第２の顕微鏡と、第３の対物レンズ２３２（Ｏｂｊ_３）と第３のレンズ２３４（ＴＬ_３）の組み合わせを含む、第３の顕微鏡とを含む。第１、第２、および第３のレンズ２１２、２２８、および２３４は、図２Ａでは、単一レンズとして表されるが、それぞれ、実践では、１つまたはそれを上回る光学要素（レンズまたはミラー）を使用して実装されてもよいことを理解されたい。結像モジュール２０４はさらに、検出器２２６を含む。第１のレンズ２１２と第２のレンズ２２８の組み合わせは、サンプル２０６から放出される光２２０（また、放出または放出光とも称される）を第１の対物レンズ２１０の背面焦点面（ＢＦＰ_１）から第２の対物レンズ２３０の背面焦点面（ＢＦＰ_２）に指向する。図２Ａに示される実施例では、第１および第２のレンズ２１２、２２８は、中継構成にあって、顕微鏡モジュール２０２は、第１の中間像面（ＩＰ_１）を第１および第２のレンズ２１２、２２８間に形成し、第２のレンズ２２８は、その像面からの光２２０を第２の対物レンズ２３０の背面焦点面（ＢＦＰ_２）に中継する。第３のレンズ２３４は、第３の対物レンズ２３２の背面焦点面（ＢＦＰ_３）からの光２２０を最終像面（ＩＰ_４）上に集束させ、そこで、検出器２２６によって受光され得る。図２Ａに示されるように、第２および第３の対物レンズ２３０、２３２は、第２の対物レンズ２３０の焦点面に形成される第２の中間像面（ＩＰ_２）が、第３の対物レンズ２３２の焦点面に形成される第３の中間像面（ＩＰ_３）に対して角度αだけ傾斜されるように、相互に対して傾斜されるように配列される。角度αは、本明細書では、第３の対物レンズ２３２の傾斜角度と称される。

【0030】

無収差顕微鏡検査システムの結像分解能は、開口数（ＮＡ）に比例する。したがって、達成される全体的開口数が高いほど、システムの結像分解能もより良好となる。側面および実施形態は、結像されているサンプル２０６およびサンプル２０６を照明するために使用される光シート（照明ビーム）２１６の種々の性質およびパラメータ、ならびに顕微鏡検査システム２００の実践的実装に関するある光学原理および機械的制約を考慮した、放出経路の非常に高い全体的開口数ＮＡ_ｅｍ（ＤｕｎｓｂｙまたはＹａｎｇのいずれかのシステムに関して達成可能なものより有意に高い）を達成するように顕微鏡検査システム２００を設計および構成するステップを対象とする。生きている生物学的サンプル２０６を結像するためのある具体的実施例は、下記に提示される。しかしながら、本明細書に開示される設計プロセスおよび原理は、結像されるべき任意のタイプのサンプルに適用されてもよい。

【0031】

顕微鏡検査システム２００の種々の重要なパラメータ間の関係およびそれに関する制約は、図３を参照して、かつ図２Ａの参照を継続して理解され得る。図３は、顕微鏡検査システム２００内の種々の顕微鏡の理論的収集角度と結果として生じる収集／放出経路開口数との間の関係を示す、略図である。図３では、軸３０２は、顕微鏡検査システム２００の一次光学軸に対応し、これはまた、第１および第２の対物レンズ２１０、２３０の一次光学軸である。軸３０４は、第３の対物レンズ２３２の傾斜された光学軸に対応し、これは、上記に議論されるように、一次光学軸３０２に対して角度αだけ傾斜される。個別の対物レンズ毎のサンプル／カバースリップ界面の開口数は、方程式（１）によって与えられ、式中、ｘ＝０、１、２、３である。

【数1】

方程式（１）では、ｎ_ｘは、サンプルまたは個別の対物レンズの浸漬媒体の屈折率であって、θ_ｘは、対応する界面または対物レンズによって定められる半角である。

【0032】

照明光シート２１６は、発散角度、Φ_ｅｘを有する。単一対物レンズ（第１の対物レンズ２１０）は、サンプル２０６を照明することと、サンプル２０６から放出される光２２０を収集することとの両方のために使用されるため、第１の対物レンズ２１０の収集角度θ_１の一部は、図３に示されるように、光シートΦ_ｅｘによって占有または「使い切られる」。図３は、光シートの縁が第１の対物レンズ２１０の収集円錐の縁と一致する、「最良の場合」を図示する（図３における同一縁線３０６から測定されたΦ_ｅｘおよびθ_１）。光シートが第１の対物レンズ２１０の収集円錐の内側に偏移される（すなわち、Φ_ｅｘによって定義された円錐の左縁が、図３では、右または時計回り方向に移動されるであろう）ことが、可能性として考えられるが、本配列は、ＮＡ_ｅｍ（放出を収集するために使用される第１の対物レンズ２１０の達成可能開口数ＮＡ_１の一部）に損失を引き起こす。

【0033】

Ｄｕｎｓｂｙによると、Ｄｕｎｓｂｙ顕微鏡検査システムの放出経路の結果として生じる全体的開口数のために達成可能な最大の潜在的開口数は、以下によって与えられる。

【数2】

照明および収集光ビーム２１６、２２０が、９０°分離される（相互に直交する）という仮定に基づいて、収集される放出の半角Φ_ｅｍは、図３から導出可能であって、Ｄｕｎｓｂｙによると、方程式（３）によって与えられる。

【数3】

しかしながら、下記にさらに解説されるように、ある側面および実施形態によると、顕微鏡検査システム２００は、Φ_ｅｍだけではなく、また、βも同様に収集するように構成されることができる。βは、Ｄｕｎｓｂｙシステム内で収集されなかったが、本発明の側面に基づく本明細書に開示される顕微鏡検査システム２００の実施形態では「回収される」、付加的放出される光を表す、収集角度である。したがって、ある側面によると、顕微鏡検査システム２００の実施形態では、以下となる。

【数4】

これは、第３の対物レンズ２３２が、ある実施形態では、第２の対物レンズ２３０からのほぼ全ての光を捕捉するように構成されることができるという認識に基づく。具体的には、下記にさらに議論されるように、第３の対物レンズ２３２は、第３の対物レンズ２３２の開口数ＮＡ_３が、第２の対物レンズ２３０の浸漬媒体の屈折率ｎ_２を超える（ＮＡ_３≧ｎ_２）ように構成されることができる。これは、放出／収集経路のための最大の潜在的全体的開口数ＮＡ_ｅｍを方程式（４）に与えられる形態に修正し、これは、回収された放出半角β／２を含み、Ｄｕｎｓｂｙによって以前に検討されたＮＡ_ｐｏｔ値より実質的に高い。図３から、以下が導出されることができる。

【数5】

【0034】

方程式（４）において使用されるパラメータΦ’_ｅｍは、以下によって与えられる。

【数6】

方程式（６）では、θ_ｍｉｎ＝ｍｉｎ（θ_１、θ_２）であって、これは、本発明のある側面による、ＮＡ_ｅｍに関する関連パラメータが、第１および第２の対物レンズ２１０、２３０からの２つの収集角度のより小さい方であるという認識を反映させる。前述から、方程式（４）は、以下のように書き直される。

【数7】

反射性損失を無視すると、顕微鏡検査システム２０４の収集効率Ｃは、少なくとも、実際の／結果として生じる放出経路開口数と第１の対物レンズ２１０の開口数の比率の二乗の大きさである。

【数8】

【0035】

上記に議論される原理に基づいて、顕微鏡検査システム２００の実施形態は、以下のプロセスおよび考慮点に従って、設計ならびに構成されることができる。図４は、ある側面による、斜面光シート結像顕微鏡検査システムを設計する方法内に含まれ得る、ステップおよび考慮点の実施例を図示する、プロセスフロー図である。当業者によって、本開示の利点を前提として、ステップは、図４に図示される順序で実施される必要はないことが理解されるであろう。図４の略図は、説明の明確性および利便性のために提供され、限定することを意図するものではない。本明細書に説明されるプロセスは、３つの顕微鏡がそれぞれ、全体的システムの文脈において検討されるとき、かつ任意の所与の実装において使用される光シート２１６およびサンプル２０６の性質に照らして、顕微鏡検査システム２００に、以前は達成不能であった結像性能および有用性を提供するように賢明に選択ならびに構成され得る、ある性質およびパラメータを有するという認識を活用する。

【0036】

ステップ４０２は、第１の対物レンズ２１０を選択または構成するステップを含む。

【0037】

平坦カバースリップを通した蛍光顕微鏡検査等のある用途では、サンプル２０６は、光２２０を全ての方向に放出し得、したがって、以下の条件：ｓｉｎθ_０＝１、が該当し、したがって、方程式（１）から、ＮＡ_０＝ｎ_０となり、式中、ｎ_０は、サンプル２０６の屈折率である。結果として、ある側面によると、第１の対物レンズ２１０は、ＮＡ_１≧ｎ_０を設定することによって、サンプル２０６から放出される光の全てを捕捉するように構成され得ることが認識される。加えて、高品質結像のために、第１の対物レンズは、サンプル媒体の屈折率（ｎ_０）と第１の対物レンズの浸漬媒体の屈折率（ｎ_１）との間に良好な整合が存在するように構成されるべきである。屈折率における不整合は、深度依存収差をサンプル２０６の結果として生じる画像内に引き起こす。したがって、ある側面によると、第１の対物レンズ２１０は、良好な屈折率整合と良好な収集円錐角度の両方を提供し、サンプル２０６から収集される光ならびに結像分解能および品質を最大限にするように構成されることができる。理想的には、第１の対物レンズ２１０は、ＮＡ_１≧ｎ_０およびｎ_１＝ｎ_０を伴って構成され得る。しかしながら、当業者は、本開示の利点を前提として、実践では、特に、複数の異なるサンプルに関して、これらの理想的条件の両方を同時に達成することが不可能であり得ることを理解するであろう。故に、ステップ４０２は、最大の実践的開口数が取得される一方、また、サンプルの予期される範囲のために屈折率における良好な整合を達成するように、これらの２つの条件の妥協に基づいて、第１の対物レンズ２１０のための構成を選択するステップを含んでもよい。したがって、ある実施例では、第１の対物レンズ２１０は、

【化6】

および

【化7】

を伴って構成され得る。

【0038】

さらに、ある実施形態によると、顕微鏡モジュール２０２は、第１のレンズ２１２および第１の対物レンズ２１０が、理想的レンズ挙動に近似する、完全無限遠補正レンズであるように構成されることができる。本配列は、最適遠隔再焦点化性能を提供する。

【0039】

最小限の収差を伴って、サンプル２０６中の限定されたボリューム内の任意の平面を再結像するために、サンプル２０６と第２の対物レンズ２３０の焦点面に形成される第２の中間像面（ＩＰ_２）との間の側方および軸方向拡大率は、等しくされる必要がある。本条件は、拡大率Ｍ_ＲＲがｎ_１／ｎ_２に等しいときに達成され、式中、ｎ_２は、第２の対物レンズ２３２の浸漬媒体の屈折率である。本原理は、再焦点化ルールと称される。Ｍ_ＲＲは、下記の方程式（９）によって与えられる。

【数9】

方程式９では、Ｍ_１は、顕微鏡モジュール２０２（第１の対物レンズ２１０と第１のレンズ２１２の組み合わせによって生成され、本明細書には、「第１の顕微鏡」とも称される）の拡大率であって、Ｍ_２は、第２のレンズ２２８と第２の対物レンズ２３０の組み合わせ（本明細書には、「第２の顕微鏡」とも称される）の拡大率である。上記に記載のように、第３の対物レンズ２３２と第３のレンズ２３４の組み合わせは、本明細書では、「第３の顕微鏡」と称され得る。第１、第２、および第３の顕微鏡毎に、個別の顕微鏡の拡大率Ｍ_ｘは、下記の方程式（１０）によって与えられ、式中、ｘ＝１、２、３である。

【数10】

方程式（１０）では、ｆ_ＴＬｘは、個別のレンズの焦点距離であって、ｆ_Ｏｂｊｘは、個別の対物レンズの焦点距離である。

【0040】

したがって、上記の方程式（９）から、再焦点化ルールは、以下のように規定されることができる。

【数11】

加えて、図２Ａを参照すると、ある側面および実施形態によると、さらなる条件が、適用されてもよい、すなわち、第２の対物レンズの背面焦点面（ＢＦＰ_２）は、方程式（１２）に従って定寸される。

【数12】

第１の背面焦点面から第２の背面焦点面への拡大率Ｍ_ＢＦＰは、第２のレンズ２２８および第１のレンズ２１２の焦点距離の比率によって与えられる。

【数13】

対物レンズのいずれかの背面焦点面の直径（ＢＦＰ_ｘ；ｘ＝１、２、３）は、以下に従って、対物レンズの対応する開口数および焦点距離に関連する。

【数14】

第１の顕微鏡のパラメータが、既知（例えば、ｆ_Ｏｂｊ１、ｄ_１、ｆ_ＴＬ１）である場合、第２の顕微鏡の構成要素およびパラメータは、ＢＦＰ_２を適切に位置付けるように選択または構成されることができる。したがって、ステップ４０４は、方程式（１１）に規定される再焦点化条件と方程式（１２）に記載される付加的条件の組み合わせを適用することによって、第２の対物レンズ２３０を選択または構成するステップを含んでもよい。これらの２つの条件をともに適用し、上記の方程式（１）を検討することは、以下の条件を与える。

【数15】

上記の方程式（１）から、方程式（１５）の条件は、同等に、以下のように記載されることができる。

【数16】

方程式（１６）に記載された条件は、第２の対物レンズ２３０が、第１の対物レンズ２１０からの全ての光の光線を捕捉し、それによって、顕微鏡検査システム２００の全体的開口数における任意の損失ならびに結像分解能および光学効率の関連付けられる損失を回避するための選好を表す。

【0041】

図４を参照すると、顕微鏡検査システム２００のための設計プロセスは、顕微鏡モジュール２０２を選択するステップ４０６を含んでもよい。上記に議論されるように、標準的／既存の顕微鏡スタンドが、選択されてもよく、好ましくは、理想的レンズ挙動に近似する完全に無限遠補正されたレンズである、第１のレンズ２１２および第１の対物レンズ２１０を有する。さらに、上記に議論されるように、顕微鏡モジュール２０２は、ステップ４０２において、第１の対物レンズ２１０が、結像されることが予期される典型的サンプルのための条件

【化8】

および

【化9】

を満たすように選択または構成されることができる。したがって、第１の対物レンズの焦点距離ｆ_Ｏｂｊ１および第１のレンズの焦点距離ｆ_ＴＬ１は、一次拡大率Ｍ_１を設定する。上記に議論されるように、ステップ４０４では、第２の対物レンズ２３０のパラメータは、再焦点化条件を課し、収差を最小限にするように構成されることができる。例えば、第２の対物レンズの焦点距離ｆ_Ｏｂｊ２および第２のレンズの焦点距離ｆ_ＴＬ２は、Ｍ_ＢＦＰのための固定された値を達成するために、方程式（１０）、（１１）、および（１５）によって制約され得る。距離ｄ_１は、特に、顕微鏡モジュール２０２が既存の顕微鏡スタンドである場合、容易に構成可能ではあり得ないが、他のパラメータが既知の距離ｄ_１に基づいて選択され得るように、正確に測定され得る。例えば、距離ｄ_２は、以下の関係を使用することによって、ＢＦＰ_１からＢＦＰ_２を結像するように調節されることができる。

【数17】

本アプローチは、斜面光シート顕微鏡検査システム２００の実施形態を様々な市販の顕微鏡モジュール２０２と互換性を持たせる。

【0042】

上記に議論されるように、ある実施形態によると、第３の対物レンズ２３２は、上記の方程式（７）に表される放出／収集経路のための最高の潜在的全体的開口数ＮＡ_ｅｍを維持するように、その開口数ＮＡ_３が第２の対物レンズ２３０の浸漬媒体の屈折率ｎ_２に等しいまたは超える（ＮＡ_３≧ｎ_２）ように構成される。本条件は、第３の対物レンズ２３２の収集効率を最大限にし、第３の対物レンズ２３２が第２の対物レンズ２３０からの全ての光を捕捉することが可能であることを確実にする（図４におけるステップ４０８）。しかしながら、大開口数は、概して、大きい関連付けられる円錐角度に起因して、顕微鏡のための短作動距離をもたらし、これは、実践的実装を非常に困難にし得る。ある実施例では、θ_１およびθ_２は、例えば、７０°を超え得る。したがって、ある側面によると、第３の対物レンズ２３２の開口数に関する要件は、ｎ_２を最小限にする一方、また、方程式（１５）に規定される条件を満たすことによって、低減させられることができる（図４におけるステップ４１０）。

【0043】

再び図２Ａを参照すると、サンプル２０６の斜面は、第３の対物レンズ２３２と第３のレンズ２３４の組み合わせによって再結像され、サンプル２０６の画像を最終像面ＩＰ_４に形成する。ステップ４２０では、全体的システム拡大率Ｍ_Ｔは、下記の方程式（１８）によって与えられ、そうでなければ、自由パラメータである、第３のレンズの焦点距離ｆ_ＴＬ３の適切な選択を通して、所望の値に設定されることができる。下記にさらに議論されるように、第３の対物レンズの焦点距離ｆ_Ｏｂｊ３は、第３の対物レンズ２３２のための光機械的仕様によって制約され得る。

【数18】

【0044】

光シート顕微鏡検査は、概して、典型的には、約１．３５～１．４０の範囲内のｎ_０の値を有し、約１．３７の平均屈折率を有し得る、生きている生物学的サンプル２０６を結像するために有用である。故に、典型的生きている生物学的サンプル２０６内で放出される、あらゆる可能性として考えられる光を捕捉するために、

【化10】

に設定する。これは、１．４０＜ＮＡ_ｏｉｌ＜１．４５の範囲内の典型的開口数であるように構成され得る、油浸漬式の対物レンズを使用することによって達成されることができる。しかしながら、第１の対物レンズ２１０のための油浸漬式の対物レンズを選択することは、レンズの浸漬媒体とサンプル２０６との間の屈折率不整合（ｎ_１≠ｎ_０）をもたらし、これは、画像分解能を著しく劣化させる、深度（ｚ）依存球面収差を生成する。上記に議論されるように、第１の対物レンズ２１０は、最大の有用な開口数を得ることと、良好な屈折率整合を維持することとの間の良好な妥協を達成することに基づいて、選択および構成されることができる。故に、ある実施形態では、シリコーン対物レンズが、第１の対物レンズ２１０のために選択される。この場合、ＮＡ_１＝ＮＡ_{ｓｉｌｉｃｏｎｅ}（例えば、ＮＡ_{ｓｉｌｉｃｏｎｅ}＝１．３５）であって、ｎ_１＝ｎ_{ｓｉｌｉｃｏｎｅ}＝１．４１である。平均ｎ_０＝１．３７を伴う、典型的生きている生物学的サンプル２０６に関して、第１の対物レンズ２１０のための本選択は、約０．０２の開口数におけるデルタ（ΔＮＡ）（上記に記載のように、好ましくは、ＮＡ_１≧ｎ_０であって、ここでは、本条件は、あまり満たされないが、デルタは、非常に小さく、サンプル２０６からのほぼ全ての利用可能な光が第１の対物レンズ２１０によって収集され得ることを意味する）と、最小限の深度依存収差を引き起こす、わずか０．０４の屈折率（Δｎ）におけるデルタまたは不整合とを提供する。したがって、本選択は、上記に従って、良好またはさらに最適な妥協を表し得る。比較のために、良好な水浸漬式の対物レンズは、ＮＡ_{ｗａｔｅｒ}＝１．２７およびｎ_{ｗａｔｅｒ}＝１．３３の値を有し、類似深度依存収差であるが、有意に低い収集能力（より低い開口数に起因して）をもたらす。さらに、上記に議論されるように、匹敵する油浸漬式の対物レンズは、開口数（例えば、ＮＡ_ｏｉｌ＝１．４５を伴う）を最大限にするが、屈折率における不整合に起因して、サンプル２０６中の深度における結像性能および関連付けられる立体情報を著しく劣化する、深度依存収差（典型的には、ｎ_ｏｉｌ＝１．５２であって、したがって、屈折率デルタは、約０．１５である）を引き起こす。したがって、ある実施形態による、第１の対物レンズ２１０のためのシリコーン対物レンズまたは類似中間浸漬屈折率レンズの選択は、水および油対物レンズに優る有意な利点を提供し得る。

【0045】

例えば、ある事例では、サンプル（生きている生物学的サンプル等）は、１．３３＜ｎ_０＜１．４１の範囲内の屈折率を有し得る。したがって、ＮＡ_１＝１．３５およびｎ_１＝１．４１を伴う、シリコーン対物レンズを選択することは、０．０２≦ΔＮＡ≦０．０６および０≦Δｎ≦０．０８の「誤差」または公差範囲を提供する。故に、この場合、

【化11】

（ΔＮＡの公差範囲内）および

【化12】

（Δｎの公差範囲内）であって、これらの公差範囲は、ある用途では、好ましい限界である。別の実施例では、第１の対物レンズ２１０は、ＮＡ_１＝１．３およびｎ_１＝１．４６を伴う、グリセロール浸漬式のレンズであってもよい。同一サンプル範囲に関して、本実施例は、０．０３≦ΔＮＡ≦０．１１および０．０５≦Δｎ≦０．１３の誤差範囲を提供する。シリコーン実施例ほど最適ではないが、第１の対物レンズのための本選択肢（グリセロールまたは類似材料）は、それにもかかわらず、

【化13】

および

【化14】

の所望の条件のために容認可能な妥協または容認可能な公差範囲を表し得る。対照的に、上記の公差範囲実施例からさらに逸脱する、第１の対物レンズ２１０のための選択肢は、依然として、生きている生物学的サンプルを結像するために動作し得るが、性能はさらに、低減させられ、多くの用途において、そのような選択肢を望ましくないものにする。

【0046】

いったん対物レンズ（例えば、シリコーン対物レンズ）が、第１の対物レンズ２１０のために選定されると、パラメータＮＡ_１およびｎ_１（例えば、ＮＡ_１＝１．３５およびｎ_１＝１．４１）が、把握される。したがって、本実施例に関して、方程式（１６）の条件を適用することは、第２の対物レンズの開口数と第２の対物レンズの屈折率の比率ＮＡ_２／ｎ_２≧０．９６を設定する。上記に議論されるように、収集効率を最大限にするためにＮＡ_３≧ｎ_２であることが好ましいため、ｎ_２を最小限にし、第３の対物レンズ２３２の開口数に関する要件を緩和することが望ましい。故に、第２の対物レンズ２３０は、ＮＡ_２＝０．９５を伴う、空気対物レンズ（ｎ_２＝１．０）であることができ、これは、第１の（シリコーン）対物レンズ２１０の角度範囲の９９％を再結像することが可能である（ａｓｉｎ（０．９５）／ａｓｉｎ（０．９６））。

【0047】

上記のプロセスおよび原理に従って設計ならびに構成される、顕微鏡検査システム２００の実施例は、収集効率において、ＤｕｎｓｂｙおよびＹａｎｇによって開示されるシステムによって達成され得るものに優る有意な改良を達成する。以下の実施例では、照明光ビーム２１６は、Ф_ｅｘ＝５°の発散角度を有すると仮定される。例えば、サンプル２０６がｎ_０＝１．３７を有すると仮定すると、その中の第１の対物レンズ２１０が、ＮＡ_１＝１．３５およびｎ_１＝１．４１を伴う、シリコーン浸漬式のレンズであって、第２の対物レンズが、ＮＡ_２＝０．９５およびｎ_２＝１．０を伴う、空気対物レンズである、顕微鏡検査システム２００の実施形態は、従来の高分解能顕微鏡検査を用いて達成可能な１．３７限界に非常に近い、ＮＡ_ｅｍ＝１．３２（上記の方程式（７）を適用する）を達成し、（反射性損失を無視して）収集効率は、９５％である。対照的に、Ｄｕｎｓｂｙは、はるかに低い全体的開口数および非常に低い収集効率を達成する、システムを開示する。例えば、Ｄｕｎｓｂｙは、その中の第１および第２の対物レンズが両方とも、理論的には、わずか０．７５の全体的開口数ＮＡ_ｐｏｔと、わずか６３％の収集効率とを有する、ＮＡ_１＝ＮＡ_２＝０．９５を伴う空気対物レンズである、システムを開示する。Ｄｕｎｓｂｙに開示される別の実施例は、第１の対物レンズのために水対物レンズ（ＮＡ_１＝１．２；ＮＡ_２＝０．９５）を使用するが、理論的には、わずか０．７４の全体的開口数ＮＡ_ｐｏｔを達成し、わずか３８％の非常に不良な収集効率を有する。同様に、Ｙａｎｇに開示される実施例も、本明細書に開示される顕微鏡検査システム２００の実施形態の性能に近いものを達成するものではない。例えば、Ｙａｎｇは、その中の第１の対物レンズが、ＮＡ_１＝１．２７を伴う、水対物レンズであって、第２の対物レンズが、ＮＡ_２＝０．９を伴う、空気対物レンズである、実施例を開示する。本実施例は、理論的には、１．１７の全体的システム開口数と、８５％の収集効率とを提供するが、上記に議論される顕微鏡検査システム２００の実施例より有意に低い。さらに、Ｙａｎｇは、実践では、本実施例は、実際には、わずか約１．０６の全体的システム開口数と、わずか約７０％の収集効率とを達成したことを開示している。本実施例によって実証されるように、Ｙａｎｇが、第２の対物レンズが第１の対物レンズからの本質的に全ての光を収集するように構成されることを確実にする利点を達成しなかったことは、着目に値する。

【0048】

第１および第２の対物レンズを選択ならびに構成するときに適用され得る、上記に議論される考慮点に加え、ある側面はさらに、第３の対物レンズ２３２の傾斜角度αが、最適化され得ることを認識する。方程式（１１）および（１５）の条件を適用することは、高い所望の開口数ＮＡ_２によって設定される、大円錐角度θ_２に起因して、短作動距離を有する、第２の対物レンズ２３０をもたらし得る。第３の対物レンズ２３２の光学軸が、第２の対物レンズ２３０の光学軸と平行（α＝０）であった場合、短作動距離は、問題を提示しないであろう。しかしながら、上記に議論されるように、第３の対物レンズ２３２の光学軸は、照明光シート２１６を含有する、平面を効果的に結像するように、第１および第２の対物レンズ２１０、２３０の光学軸に対して角度α（概して、非ゼロ）だけ傾斜される。故に、本発明のある側面は、これらの考慮点およびＮＡ_ｅｍを最大限にする目標に照らして、傾斜角度αおよび第３の対物レンズ２３２の性質を適切に選択することを対象とする（図４におけるステップ４１２、４１４、４１６）。

【0049】

図３を参照して上記に議論されるように、光シート２１６は、Ф_ｅｘの発散角度を有する。傾斜角度αは、光シート発散角度および第１の対物レンズ２１０の収集円錐の両方に関連し、方程式（１９）に従って計算されることができる。

【数19】

発散角度Ф_ｅｘ、したがって、傾斜角度αは、照明ビーム（光シート）２１６の種々の性質に関連する。図５は、光シート２１６の実施例のパラメータを図示する、略図である。本実施例では、光シートは、ガウスビームである。光シート２１６は、ω_０のビームウェストを有する。レイリー範囲Ｚ_Ｒは、それにわたってビームがω_０√２の幅まで発散する、距離である。ビームウェストω_０は、光シート２１６の波長λ_ｅｘおよびレイリー範囲の関数として表されることができる。

【数20】

さらに、

【数21】

【0050】

生物学的結像に関して、光シート２１６の波長のための典型的値は、０．５マイクロメートル（μｍ）であって、レーザ光源２１４を仮定すると、レイリー範囲Ｚ_Ｒは、典型的には、約５～５０μｍの範囲内である。したがって、ビームウェストω_０は、概して、約１～３μｍの範囲内であり得、発散角度Ф_ｅｘは、したがって、

【化15】

（実施例として、上記に議論される）と仮定すると、約２°～８°の範囲内であり得る。これらのパラメータならびに上記に議論される考慮点および実施例から判定されたθ_１ならびにθ_２の値を前提として、これらの実施例に関して、方程式（１９）は、傾斜角度αが約２０°～２６°の範囲内であり得ることを示す。例証として、その中のサンプル２０６が、ｎ_０＝１．３７、Ф_ｅｘ＝５°を伴う、生きている生物学的サンプルであって、第１の対物レンズ２１０が、ＮＡ_１＝１．３５およびｎ_１＝１．４１を伴う、シリコーン対物レンズである、以下の実施例を検討する。本実施例では、方程式（３）は、

【化16】

を与える。したがって、方程式（１８）を適用すると、本実施例は、

【化17】

を規定する。

【0051】

方程式（１９）に基づいて、光シート２１６が使用されることを前提として、予期される最大発散角度Ф_ｅｘは、傾斜角度αのための最大値を設定する。より高い傾斜角度を使用することは、放出経路収集角度Φ’_ｅｍ、したがって、また、ＮＡ_ｅｍを低減させ、明白な利点を伴わない。したがって、ある側面によると、使用されている光シート２１６の性質および第１の対物レンズ２１０の収集円錐角度θ_１を把握すると、傾斜角度αが、収集効率を最適化するように選定されることができる（ステップ４１２）。本側面は、ＤｕｎｓｂｙまたはＹａｎｇのいずれによっても利用されていない、光シート２１６ならびに第１および第２の対物レンズ２１０、２３０のパラメータに依存する（ひいては、上記に議論されるように、結像されるべきサンプル２０６に基づいて、最適化され得る）、傾斜角度のための最適範囲または値αが存在するという重要な認識を活用する。例えば、上記に記載のように、Ｙａｎｇは、第３の対物レンズの傾斜角度が３０°であることを開示している。しかしながら、本明細書に開示される原理および側面に照らして、傾斜角度のためのＹａｎｇの推奨される値が高すぎることが理解され得る。上記の方程式を適用すると、Ｙａｎｇに開示される他のパラメータ（例えば、Ｚ_Ｒ＝３５μｍ；Ф_ｅｘ＝３°）を前提として、傾斜角度のための最適値が、約２１°であって、Ｙａｎｇによって開示される値より有意に低いことが示され得る。

【0052】

上記に議論されるように、第２の対物レンズ２３０に関する制約は、高角度範囲（例えば、θ_２＞７０°）、したがって、（所与の既存のレンズ）短作動距離をもたらす。例えば、

【化18】

である場合、作動距離は、約２００μｍであり得る。第３の対物レンズ２３２がまた、高開口数を伴うレンズに典型的である、短作動距離を有する場合、これは、傾斜角度αに関する扱いにくい機械的制約を生成する。例えば、第３の対物レンズ２３２が、第２の対物レンズ２３０と同一パラメータ（例えば、

【化19】

およびｎ_２＝ｎ_３＝１．０）を伴う、空気対物レンズであることになる場合、２つの対物レンズは、

【化20】

において衝突し、これは、顕微鏡の動作を無効にするであろう。故に、ある側面および実施形態は、本問題を回避するように第３の対物レンズ２３２を構成するステップを対象とする。

【0053】

ある側面によると、第３の対物レンズ２３２の浸漬媒体は、角度範囲θ_３を低減させるために、比較的に高屈折率を有するように選択される。例えば、第３の対物レンズ２３２の浸漬媒体は、油状であってもよく、これは、典型的には、空気より有意に高い、１．４５～１．６５の範囲内の屈折率を有する。方程式（１）から、任意の所与の開口数に関して、対物レンズの屈折率が高いほど、角度範囲は、低くなる。角度範囲を低減させることは、ひいては、作動距離を増加させ、システムに関する機械的制約を緩和させ得る（図４におけるステップ４１４）。例えば、上記に議論される空気の第２の対物レンズより若干高い開口数（ＮＡ_３＝１およびＮＡ_２＝０．９５）と、所与の上記に与えられる範囲のより低い部分における屈折率とを有する、油状対物レンズを検討すると、最大角度範囲は、次いで、

【化21】

となる。本実施例に関して、作動距離は、典型的には、約４ｍｍ～８ｍｍの範囲内であり得る。

【0054】

ある実施形態によると、第３の対物レンズ２３２は、ガラス等のより高い屈折率を伴う材料を使用することと、非常に短またはさらにゼロ（「接触」）もしくはさらに負の作動距離を可能にする、機械的配列を有することとの両方であるように構成される（図４におけるステップ４１６）。一実施例では、第３の対物レンズ２３２は、適用可能な視野に合致し、上記に議論されるＮＡ_３≧ｎ_２の条件に基づいて要求される開口数に合致する受光角を伴って成形される、中実ガラス正面「錐台」とともに構成される。したがって、一実施例では、θ_{ｆｒｕｓｔｕｍ}＞θ_ｍａｘであって、θ_ｍａｘは、第３の対物レンズ２３２の開口数ＮＡ_３および第３の対物レンズの浸漬媒体の屈折率ｎ_３に基づいて規定される（方程式（１）に従って）、θ_３の値（ある実施例では、

【化22】

）である。これは、第３の対物レンズ２３２が、第２の対物レンズ２３０からの本質的に全ての光を収集することを可能にする一方、また、対物レンズ２と３との間の機械的衝突を伴わずに、斜面光シート顕微鏡検査システム２００のための最高の全体的放出経路開口数ＮＡ_ｅｍを達成するために、傾斜角度αの有意な範囲の調節、例えば、ガラス錐台のための最大４５°を可能にする。中実ガラス錐台または他の形状を含む、第３の対物レンズ２３２の種々の構成の実施例は、図６Ａ－６Ｃに示される。ガラス錐台は、円錐形形状である、または、例えば、二重に面取りされたノミ形状を有することができる。図６Ａは、中実半径方向錐台を伴う、第３の対物レンズ２３２の実施例を図示する。図６Ｂは、面取りを伴う中実半径方向錐台を伴う、第３の対物レンズ２３２の実施例を図示する。図６Ｃは、中実正方形錐台を伴う、第３の対物レンズ２３２の実施例を図示する。これらの実施例はそれぞれ、さらに下記に議論されるように、高開口数にわたって効率的光結合を可能にする。

【0055】

したがって、ある実施例では、第３の対物レンズ２３２は、ゼロまたはゼロに近い（例えば、空気中で約２０μｍ）作動距離を可能にするように成形される、中実ガラス錐台を含むことができる。ある実施例では、錐台は、約２００μｍ視野と、類似寸法を有する、ガラス先端とを有する。２０μｍ作動距離は、最大約８°の発散角度Ф_ｅｘを伴う光シート２１６が、空気中で第３の対物レンズ２３２の錐台の正面を交差し、したがって、直接、高開口数における第２の対物レンズ２３０の中に結合されることを可能にする。

【0056】

上記に議論されるように、傾斜角度αのための最適値または範囲は、部分的に、光シート２１６のパラメータに依存し得る。しかしながら、同一顕微鏡検査システム２００を使用して、種々の異なるサンプル２０６を結像することが望ましくあり得、異なる光シートパラメータは、異なるタイプのサンプルを結像するために好ましくあり得る。例えば、大サンプルは、大視野および弱発散ガウス光シート２１６を使用して、より良好に結像され得る。換言すると、この場合、最小限の傾斜角度α_ｍｉｎを伴うシステム２００を構成し、最小限の発散角度Ф_{ｅｘ＿ｍｉｎ}を伴う光シート２１６を使用することが好ましくあり得る。他方で、小サンプル２０６は、小視野および狭ビームウェスト（大傾斜角度α_ｍａｘおよび大発散角度Ф_{ｅｘ＿ｍａｘ}を意味する）を伴うガウス光シート２１６を使用して、より良好に結像され得る。また、非ガウス照明ビーム（例えば、ベッセルビームまたはさらに格子ビーム）を使用することが望ましくあり得る。故に、ある実施例では、結像モジュール２０４の一部は、傾斜角度αが異なるサンプル２０６のために動的に調節および最適化され得るように、少なくとも第３の対物レンズ２３２、第３のレンズ２３４、ならびに検出器２２６が、剛性物体として、第２の中間像面ＩＰ_２と第３の中間像面ＩＰ_３の交点を中心として回転することを可能にする、機械的アセンブリとともに構成されることができる（図４におけるステップ４１８）。

【0057】

図７は、上記に議論されるプロセスおよび考慮点に従って斜面顕微鏡検査システム２００を構成するためのアプローチを要約する、フロー図である。ステップ７０２および７０４は、顕微鏡検査システム２００内の第１の顕微鏡を選択／構成するステップを伴う。ステップ７０２は、ベース顕微鏡モジュール２０２が選択される、上記に議論されるステップ４０６に対応する。顕微鏡モジュール２０２は、埋設された第１のレンズ２１２を含み、したがって、パラメータｆ_ＴＬ１およびｄ_１は、本選択によって固定され得る。ステップ７０４では、顕微鏡モジュール２０２のための第１の対物レンズ２１０は、顕微鏡検査システム２００を使用して結像されることが予期されるサンプルのタイプに合致するように選択される。上記に議論されるように、サンプル２０６の屈折率は、変動し得るが、既知の用途（例えば、生物学的結像）を前提として、第１の対物レンズ２１０は、予期されるサンプルタイプの平均または近似屈折率をほぼ上回るまたはそれに等しい、開口数とともに選択されることができ、したがって、上記に議論されるように、

【化23】

を設定する。第１の対物レンズ２１０の選択は、パラメータｆ_Ｏｂｊ１を設定し、したがって、ステップ７０２と７０４の組み合わせは、第１の顕微鏡の拡大率Ｍ_１を固定する。

【0058】

ステップ７０６および７０８は、顕微鏡検査システム２００内の第２の顕微鏡を選択／構成するステップを伴う。ステップ７０６は、第２の対物レンズ２３０を選択するステップを含む。上記に議論されるように、第３の対物レンズ２３２に関する要件は、ｎ_２を最小限にすることによって緩和されることができる。パラメータｎ_２は、空気に関する１．０と油状材料に関する１．４超またはさらに高屈折率ガラス材料に関する最大２．０またはより高い値との間のいずれかで変動し得る。故に、第２の対物レンズのための空気対物レンズを選択するステップは、ｎ_２を最小限にする一方、また、方程式（１５）または（１６）に規定される条件を満たす。空気対物レンズは、１．０未満の開口数を有する。実践では、最良の空気対物レンズは、

【化24】

（

【化25】

に対応する）を有し得る。前述の制約内で第２の対物レンズ２３０を選択することは、パラメータｆ_Ｏｂｊ２を設定する。ステップ７０８は、上記の方程式（１１）に記載された遠隔再焦点化条件を達成するように第２の顕微鏡を構成するステップを含む。上記に議論されるように、Ｍ_１は、ステップ７０２および７０４において設定される。方程式（１０）から、Ｍ_２を設定するために使用され得る、唯一の自由パラメータは、ｆ_Ｏｂｊ２がステップ７０６において検討される条件によって設定されるため、ｆ_ＴＬ２である。したがって、ステップ７０８では、ｆ_ＴＬ２は、方程式（１１）の遠隔再焦点化条件を満たすように選択されることができる。結果として、第１および第２の顕微鏡内の唯一の残りの自由パラメータは、ここでは、ｄ_２となる。上記に議論されるように、ある実施例では、ｄ_２は、方程式（１７）に従って、最良結像性能を達成するように選択されてもよい。

【0059】

ステップ７１０および７１２は、顕微鏡検査システム２００内の第３の顕微鏡を選択／構成するステップを伴う。ステップ７１０は、第３の対物レンズ２３２を選択し、第２の対物レンズ２３０からの全て（または可能な限り多く）の光を収集し、上記に議論されるように、随意に、動的に調節可能であり得る、傾斜αを可能にするステップを含む。これらの条件の両方を達成するために、これが第３の対物レンズ２３２が傾斜αを伴っても第２の対物レンズ２３０からの全てまたはほぼ全ての光を収集することが可能である（すなわち、第３の対物レンズ２３２が、第２の対物レンズ２３０からの全てまたはほぼ全ての円錐角度＋αを捕捉することができる）ことを確実にするであろうため、ＮＡ_３≧ｎ_２を設定する。ある実施例によると、α傾斜を用いて光収集を達成することは、第２の対物レンズ２３０からの光円錐を捕捉する一方、また、αの回転／傾斜に適応するように位置付けられることを可能にするように機械的に構成される、対物レンズを使用することによって行われる。例えば、第３の対物レンズ２３２は、上記に議論されるように、面取りまたは他の成形された縁を伴う、中実ガラス錐台を含んでもよい。本構成は、第３の対物レンズ２３２が、第２の対物レンズの視野の中に延在することを可能にし（先鋭ガラス先端を使用して）、したがって、第２の対物レンズ２３０からの全てまたはほぼ全ての光を収集する一方、また、最大４５°の（または正確な設計に応じて、それを上回る）回転（α）を可能にする。ステップ７１０は、少なくともある程度まで、パラメータｆ_Ｏｂｊ３を設定する。したがって、ステップ７１２は、ｆ_ＴＬ３を設定し、検出器２２６のための正しい値において全体的システム拡大率Ｍ_Ｔを規定する（例えば、マルチピクセル検出器を使用するとき、ナイキストサンプリングを達成することによって）ように第３の顕微鏡を構成するステップを含んでもよい。

【0060】

ある実施形態によると、第１の中間像面ＩＰ_１は、図２Ｂに示されるように、光シート２１６のための挿入点として使用されることができる。加えて、ある実施形態では、光シート２１６のｘ－ｙ走査もまた、同期された立体結像を提供するために導入されることができる。第２の対物レンズ２３０はまた、画像を第２の中間像面ＩＰ_２に再集束させ、これが、次いで、第３の対物レンズ２３２によって第３の中間像面ＩＰ_３において収集されることによって、ｚ方向におけるボリュームを走査するために使用されてもよい。本アプローチを適用すると、ｘ－ｙ－ｚ走査を伴う、柔軟なボリュームオプションが、達成されることができる。例えば、ｘ－ｙ走査が、実施されることができ、ｚ方向における調節が、次いで、サンプル２０６中の異なる深度における別のボリュームを結像するために使用されることができる。したがって、顕微鏡検査システム２００の全体的立体容量または柔軟性は、増加されることができる。ある実施例では、傾斜角度αに起因して、サンプル２０６の画像の光学軸は、一次ｘ、ｙ、またはｚ軸のいずれにも該当し得ない。したがって、純ｘ－ｙ走査または純ｚ走査は、ボリュームがこれらの個々の軸を使用して収集されるにつれて、サンプル２０６に対する光シートビームウェストω_０の偏移をもたらし得る。しかしながら、ある実施例では、ｘ－ｙ走査は、ボリュームが、光シートビームウェストが、走査の間、視野上に心合されたままでで結像され、ボリューム全体を通して最適区分化および分解能を与える得るように、正しい振幅のｚ走査と組み合わせられてもよい。

【0061】

上記に議論されるように、ある実施例では、第３の対物レンズ２３２は、光シート２１６が、直接、高開口数における第２の対物レンズ２３０の中に結合されることを可能にする、ガラス錐台および先端とともに構成されることができる。これは、無ダイクロイック動作を可能にする（すなわち、図２Ｂにおけるビーム結合要素２１８は、排除されることができる）。加えて、第２の対物レンズ２３０が、上記に議論されるように、遠隔再集束化ｚ走査を介して立体画像を提供するために使用される、実施例では、本アプローチはまた、走査のための固有の同期を提供する。

【実施例0062】

以下は、標準的顕微鏡に結合され、顕微鏡を、サンプルにおいて１つのみの対物レンズを使用する、高開口数光シート顕微鏡に変換し得る、上記に議論される側面および実施形態に従って実装される、モジュールの実施例を提供する。

【0063】

図８は、本明細書に開示される側面および実施形態による、単一対物レンズ光シート顕微鏡の実施例の概念の例証である。一次対物レンズ／チューブレンズ対（赤色実線／円形は、対物レンズの背面焦点面（ＢＦＰ）を示す）は、３Ｄ生物学的サンプルを中間空間に結像する。走査システムは、本３Ｄ画像を別の中間空間に中継し、そこで、第２のチューブレンズ／対物レンズ対（青色破線ＢＦＰ）によって収集される。第２の対物レンズは、約１の拡大率において、サンプルの無収差３Ｄコピーを作成する。本仮想３Ｄサンプルは、次いで、一次像面に対して傾斜する、第３の傾斜された顕微鏡（緑色点線ＢＦＰ）を介して再結像される。光シートは、本傾斜された像面内の一次対物レンズの中に結合され（赤色実線ビーム）、単一対物レンズ光シート顕微鏡をもたらす。単一走査ミラーを急速に移動させることは、３Ｄボリュームを入手する。３つの対物レンズＢＦＰは、赤色実線、青色破線、および緑色点線円形によって示されるように、相互上に結像される。赤色実線円板は、ＢＦＰにおける光シート占有面積を示し、黄色実線領域は、システムの収集開口数を示す。本設計は、感知できるほどの量の黄色面積を犠牲にせず、ほぼ測定不能損失を分解能に伴う。

【0064】

図９Ａおよび８Ｂは、図２Ａのシステム内の対物レンズのための光線透過角度を示すことによって、本特徴をさらに図示する、略図である。具体的には、図９Ａおよび９Ｂは、一次（第１の）対物レンズ２１０（赤色ドット）、第３の対物レンズ２３２（緑色ドット）、および第１、第２、ならびに第３の対物レンズ（黄色ドット）の組み合わせの角度通過帯域を示す、理論的モデルを図示する。第２の対物レンズ２３０の角度通過帯域は、図９Ａおよび９Ｂでは不可視である。図９Ａおよび９Ｂは、図８の上部中心部分に示される赤色、青色、緑色、ならびに黄色円形領域の３Ｄ均等物である。図示される球体の表面上の各黄色ドットは、サンプル中の点源から、３つの対物レンズを通して伝搬し、検出器に到達し得る、光線角度を表す。各赤色ドットは、第１の対物レンズ（本実施例では、１．３５ＮＡシリコン）によって収集されるが、第２の対物レンズ（本実施例では、０．９５ＮＡ空気）によってクリッピングされる、光線を表す。各緑色ドットは、第３の対物レンズ（本実施例では、１．０ＮＡガラス）が、第２の対物レンズが生成した場合に収集し得る、光線を示す。黄色領域は、赤色領域をほぼ完全に充填し、システムが第１の対物レンズによって収集されるほぼ全ての光線を透過させることを実証する。本実施例では、第１の対物レンズによって収集される光線の＞９５％が、第２の対物レンズに通過することができ、第２の対物レンズによって収集される光線の＞９９％は、第３の対物レンズに通過し、約１．３３の開口数を提供することができる。

【0065】

全体的開口数に関する本数は、システム内の各対物レンズの設計によって影響されることに留意されたい。例えば、一次対物レンズが、１．３５の代わりに、ＮＡ＝１．３３を伴って選択された場合、第１の対物レンズによって収集される光線の＞９９％は、第２および第３の対物レンズに通過し得る。実践では、一次対物レンズの開口数の縁すれすれにおける光線は、収差を受け得、改良された分解能に寄与し得ない。したがって、規定された開口数（収集される光線）と有用な開口数（改良された分解能に寄与する光線）との間で区別することが有益であり得る。本明細書に開示されるシステムの実施例は、一次対物レンズの有用な開口数の＞９９％を捕捉し得る。さらに、第２の対物レンズを０．９６ＮＡ空気対物レンズと置換することによって、一次対物レンズの規定された１．３５ＮＡ光線の＞９９％が、収集され得る。

【0066】

図１０は、妥協されない時空間性能を伴う図８のシステムのための単純な低コスト設計の実施例を図示する。図１０は、本システムの実施例の構成要素の分解図を示す。ボックスＡは、単純対物レンズ／チューブレンズ対であって、標準的顕微鏡スタンドであってもよい。一次対物レンズは、生きている生物学的サンプルの深部まで高分解能において結像するために最適である、高開口数および中間屈折率を有するように選定される。ボックスＢは、走査中継器であって、ボリューム画像を迅速に取り込み得る、単一ガルバノミラーを伴う。ボックスＣは、ボックスＢとともに、ボックスＡの要件に完璧に合致する、別のチューブレンズ／対物レンズ対である。ボックスＤは、そうでなければシステム内に存在し得る、光機械的難点を解決する、特別に構成された対物レンズ／チューブレンズ対である。

【0067】

図１１は、ガラス先端を有する、ボックスＤの特別に構成された対物レンズ／チューブレンズ対の実施例（また、上記に議論される第３の対物レンズの実施例でもある）の例証である。図１２Ａ－Ｃはさらに、０～４５度の傾斜角度の範囲にわたって分解能における無視可能な損失および高透過率を伴って、約１００μｍに近い高分解能画像を平坦表面に抽出することを可能にする、光学性能および幾何学形状を有するように構成される、特別に構成されたガラス先端付き対物レンズの実施例の側面を図示する。図１２Ａは、０～４５度の傾斜角度の範囲を伴う平坦表面からわずか約１００μｍの傾斜された空気空間画像を収集するように特別に構成された対物レンズの本実施例の光機械的に結合される設計考慮点を示す、図面である。図１２Ｂは、特別に構成された対物レンズの実施例の対応するＣＡＤレンダリングであって、図１２Ｃは、レンズの実施例の写真である。下記の表１は、図１２Ａ－Ｃに対応するレンズの実施例に関する仕様を提供する。
表１

【表1】

【0068】

図１０のシステムの放出経路の実施例が、構築、整合、および試験され、試験データは、本システムが、同一の一次対物レンズを伴う従来の顕微鏡と比較して、分解能における測定可能損失を伴わずに、３０度傾斜された平面を結像することができることを示す。これらの結果を取得するために使用される図１０のシステムの実施例は、下記の表２に記載される光学系仕様に従って構成された。光学要素は、物理的配列の順序で（サンプルからカメラまでの）表２に列挙される。本システムは、単純落射構成において、４８８ｎｍレーザ励起を用いてＡｒｇｏｌｉｇｈｔ ＳＩＭスライドを結像するために使用された。レーザからのコヒーレント干渉／スペックルは、許容された。付加的Ｃｈｒｏｍａ ＥＴ５２５／５０放出フィルタが、クアッドバンドフィルタ（表２におけるアイテム１２）の直前に追加され、そうでなければ非常に広い、放出帯域を狭めた。画像スタックが、第２の対物レンズにおける閉ループ圧電アクチュエータを使用することによって入手された。ｘｙ段、一次対物レンズ、ガルバノ、および第３の対物レンズは、入手の間、定常のままであって、カメラ露光時間およびレーザ電力は、全体を通して一定に保たれた。
表２

【表2-1】

【表2-2】

【0069】

放出経路をベンチマークし、特別に構成された第３の対物レンズ（下記では、ＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ１．０レンズと称される）の実施例を評価するために、データが、以下の３つの構成において入手された。
１．Ｎｉｋｏｎ４０倍０．９５ＮＡ、傾斜＝０°：放出経路内の第３の対物レンズは、標準的遠隔再焦点化配列（傾斜を伴わずに軸方向に整合される）におけるＮｉｋｏｎ４０倍０．９５ＮＡ空気対物レンズであって、信頼性のあるシステムベンチマークを提供した。
２．ＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ１．０、傾斜＝０°：構成１のＮｉｋｏｎの第３の対物レンズは、構成１に直接匹敵するように、傾斜を伴わずに特別に構成された第３の対物レンズの実施例と置換された。
３．ＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ１．０、傾斜＝３０°：本システムの実施例が、構成１および２との比較のために、３０°の傾斜を伴う第３の対物レンズとして、ＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ．１．０レンズを使用して構成された。

【0070】

以下のＡｒｇｏｌｉｇｈｔ ＳＩＭスライド上の４つの異なるパターンが、結像のために使用された。
標的：１０μｍ間隔を伴う、同心リングの２４０μｍ径セット。各リングは、７５０ｎｍ分離された２つの線対から成る（最大視野において見るために良好）。
グリッド：１０μｍ間隔を伴う、１１０×１１０μｍ^２正方形グリッド。各線対は、７５０ｎｍ分離される（視野の中心のより高い品質部分を見るため、かつ視野平坦性および歪曲をチェックするために良好）。
ＳＩＭ線：範囲完全重複から３０ｎｍずつの３９０ｎｍの分離に及ぶ、１４本の線対（分解能を評価するために良好）。
３Ｄリング：Ｘ、Ｙ、およびＺにおいて５μｍ分離された９×９×９の３Ｄ立方のアレイのサブミクロン径リング（３Ｄ視野を評価するために良好）。

【0071】

データは、上記のパターンおよび特徴を結像して、上記に識別された３つのシステム構成毎に収集された。

【0072】

上記で識別された３つのシステム構成毎の上記の４つのパターンを結像することによって生成される試験データは、Ｎｉｋｏｎベースの遠隔再焦点化が従来の顕微鏡と同一分解能を提供することを示した。全てＮｉｋｏｎ対物レンズを使用すると、放出経路の遠隔再焦点化部分は、少なくとも２７０ｎｍ分解能を視野の中心において送達する。これは、標準的商業用ベースの一次対物レンズによって提供されるものと同一分解能である。第３の対物レンズとしてＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ１．０レンズを用いて構成される、遠隔再焦点化もまた、従来の顕微鏡と同一分解能を提供する。ＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ１．０レンズを第３のＮｉｋｏｎ対物レンズに代用することは、傾斜されていない遠隔再焦点化において２７０ｎｍ分解能を保存する。標的パターンの画像は、構成１および２の両方が、カメラセンサによって網羅される２４０×２４０μｍ^２視野を結像することが可能であって、線対が、約２００μｍまで可視であって、システムが設計された１００μｍ径視野を優に超えることを実証した。グリッドパターン結像は、高品質１１０×１１０μｍ^２視野を示し、線対は、全体を通して可視であって、最小限の歪曲であった。ＳＩＭ線結像は、視野の中心における２７０ｎｍ分解能を実証した。３Ｄリングパターンの画像スタックは、３Ｄ視野にわたる構成１および２の結像性能において定質的に区別可能な差異がなかったことを示した。

【0073】

さらに、ＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ１．０レンズを用いて構成される、遠隔再焦点化は、依然として、第３の顕微鏡の３０度傾斜を伴う従来の顕微鏡と同一分解能を与える。ＡＭＳ－ＡＧＹ ｖ１．０レンズを使用して、第３の顕微鏡は、３０度の角度まで傾斜され、入手された画像データは、システムが平行および垂直軸の両方上で２７０ｎｍ分解能を留保したことを実証した。レイリー基準によって、２７０ｎｍ分解能は、１．２の有効開口数に対応する。ｙｃｏｓ（α）（式中、αは、傾斜角度である）の再スケーリングが、傾斜によって引き起こされる画像ｙ－軸に沿った「伸展」を補正するために適用された、標的およびグリッドパターンの入手された画像スタックは、視野にわたって、構成１および２を用いて達成されるものと本質的に同一品質の高品質画像を生成する能力を実証した。同様に、ＳＩＭ線結像および３Ｄリングパターン結像性能は、ｙ－軸再スケーリングおよびｚｓｉｎ（α）剪断補正を適用後、傾斜されない構成から定質的に区別不可能であった。

【0074】

下記の表３－５は、表１に提供される仕様に基づく図１０のシステムの一部のためのいくつかの代替光学構成のための仕様を提供する。例えば、下記の表３は、一次対物レンズのための代替の実施例を提供する。
表３

【表3】

【0075】

ある実施例および用途では、ガルバノ走査は、必要とされない場合がある。下記の表４は、例えば、圧電を第２の対物レンズ上で使用して、ボリュームを取り込む、段階走査またはシステムを使用する、ハイコンテントスクリーニングシステム（または両方の組み合わせ）のために使用され得る、実施例を提供する。下記の表５は、表３に説明される代替一次対物レンズを使用し、ガルバノ走査が除去される、別の実施例を提供する。
表４

【表4】

表５

【表5】

【実施例0076】

実施例２：設計オプション
多くの用途は、拡大率、開口数、視野（ＦＯＶ）、および浸漬媒体（例えば、水）の異なる選択肢から利点を享受するであろう。下記の表６は、一次対物レンズ選択肢の付加的実施例を提供する。種々の走査領域および視野もまた、実装されてもよい。

【0077】

ガルバノ走査を伴わない実施形態は、より少ない光学系、効率がより高く、保守の観点からより容易であることに起因して、コストがより低くあり得る。無ガルバノは、段階走査を使用する、ハイコンテントスクリーニングシステムのために魅力的であり得る。サンプル走査は、広範囲にわたる探索、段階走査、または高スループットスクリーニング（すなわち、マルチウェルプレート）のための良好なオプションであり得る。ｚ範囲は、対物レンズ１の作動距離によって限定され得る。高速運動は、浸漬媒体を介して、サンプルに結合し得る。対物レンズ１走査は、一次対物レンズの作動距離を使用して、従来の集束のために良好であり得る。対物レンズ２走査は、遠隔空間を使用したサンプルから隔離された高速走査のために良好であり得る。ｚ範囲は、物体２および３の力学のいずれかによって、または遠隔再焦点化範囲によって光学的に限定され得る。対物レンズ３走査は、対物レンズ２走査に類似し得るが、傾斜された配列にある。

【0078】

１つの「走査」ガルバノを伴う実施形態では、ＦＯＶは、１つのみの軸上で対物レンズ３によって限定され得る。一次対物レンズは、走査軸上の視野を限定し得る。ガルバノ走査ユニットを追加することは、超高速走査を提供し、ＦＯＶを増加させる。典型的ガルバノステップおよび整定時間は、現代のｓＣＭＯＳチップの回転時間より短く、したがって、立体結像率は、カメラのデータ率（または利用可能な光子）のみによって限定される。

【0079】

２つの「ＸＹ」ガルバノを伴う実施形態では、ＦＯＶは、対物レンズ３によって限定され得ない。一次対物レンズが、視野を判定し得る。第２の（直交）ガルバノスキャナは、傾斜デバイスとして使用され、一次対物レンズの完全視野にアクセスすることができる。これは、単一フレーム内の完全視野を支援しない、光学列またはカメラチップを使用するとき、一次対物レンズのＦＯＶにアクセスするための魅力的かつ迅速な方法である。
表６

【表6】