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特開2024-120036ヒト白血球抗原によって提示されるランダム化ペプチドライブラリー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024120036
(43)【公開日】2024-09-03
(54)【発明の名称】ヒト白血球抗原によって提示されるランダム化ペプチドライブラリー
(51)【国際特許分類】
C40B 40/10 20060101AFI20240827BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240827BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240827BHJP
C07K 14/74 20060101ALI20240827BHJP
C12N 15/81 20060101ALN20240827BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240827BHJP
【ＦＩ】
C40B40/10
C12N1/19 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/74
C12N1/19
C40B40/10 ZNA
C12N15/81 100Z
C12N15/63 Z
【審査請求】有
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024099147
(22)【出願日】2024-06-19
(62)【分割の表示】P 2021536664の分割
【原出願日】2019-08-30
(31)【優先権主張番号】62/726,060
(32)【優先日】2018-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】521084518
【氏名又は名称】スリーティー バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ジー，マーヴィン
(72)【発明者】
【氏名】シベナー，リア
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびそれらが認識するｐＨＬＡを同定する新しい方法を提供する。
【解決手段】複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－抗原ポリペプチド複合体を含む抗原スクリーニングライブラリーであって、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、（ａ）ＨＬＡポリペプチドと、（ｂ）特定のアミノ酸配列を含み、かつＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合するために選択されるランダム化抗原ポリペプチドと、（ｃ）β２－ミクログロブリンポリペプチドとを含む抗原スクリーニングライブラリーが記載されている。これらのライブラリーを使用して、選択されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用してそれを刺激することができる抗原ポリペプチドを決定することができる。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－抗原ポリペプチド複合体を含む抗原スクリーニングライブラリーであって、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、（ａ）ＨＬＡポリペプチドと、（ｂ）特定のアミノ酸配列を含み、かつＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合するために選択されるランダム化抗原ポリペプチドと、（ｃ）β２－ミクログロブリンポリペプチドとを含む抗原スクリーニングライブラリーが記載されている。これらのライブラリーを使用して、選択されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用してそれを刺激することができる抗原ポリペプチドを決定することができる。
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書または図面に実質的に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／７２６，０６０号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／７２６，０６０号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞は感染および癌への応答に関与する適応免疫応答にとって極めて重要である。Ｔ細胞は外来病原体由来ならびに自己免疫の場合のように自己由来のタンパク質を認識する。これらのタンパク質の断片（例えばペプチド）はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子によって提示され、かつＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してＴ細胞によって認識される。
【0003】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩのＨＬＡ分子は、主として自己抗原などの細胞によって産生された内因性抗原だけでなくウイルスタンパク質由来のペプチドなどの外来細胞内抗原をもより小さいペプチドに処理することにより生成されたペプチドを提示する。ペプチドがＨＬＡペプチド結合溝に結合すると、ＭＨＣクラスＩのＨＬＡ分子はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用してそれを刺激する。ＭＨＣクラスＩは３つの主要な遺伝子座Ａ、ＢおよびＣを有し、各遺伝子座は多くの対立遺伝子に分けられている。対立遺伝子は所与の遺伝子座にある遺伝子のＤＮＡ配列を指し、通常は少なくとも４桁の数（例えばＡ＊２４：０２）で表され、最初の文字は遺伝子座を示し、１番目の数字は対立遺伝子群（もしくは種類）を定め、２番目の数字は対立遺伝子群内の特異的タンパク質を定める。２番目および３番目の数字は付加することができ、それらはサイレントコーディングバリアントおよびノンコーディングバリアントをそれぞれ示す。
【0004】
特異的ペプチド－ＨＬＡ複合体（ｐＨＬＡ）を認識するとＴ細胞は活性化された状態になり、（１）細胞傷害性になり、（２）サイトカインを分泌し、かつ／または（３）他の免疫細胞を動員することができる。外来もしくは自己ペプチド、ＨＬＡ分子およびＴＣＲ間のこの複雑な相互作用は、免疫系が分子レベルで認識された病原体にどのように応答するかを特定する上で中核となる。免疫応答中のこの複雑な相互作用における最大の難問の１つは、認識されるペプチドの同一性に関するＴＣＲの特異性を理解することである。ＴＣＲおよびそれらが認識するｐＨＬＡを同定する新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－抗原ポリペプチド複合体を含む抗原スクリーニングライブラリーであって、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、（ａ）ペプチド結合溝を含むＨＬＡポリペプチドと、（ｂ）配列番号１～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、かつＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合するランダム化抗原ポリペプチドと、（ｃ）ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドとを含む抗原スクリーニングライブラリーが提供される。
【0006】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるリストから選択されるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるリストから選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５種の異なるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥ ＨＬＡポリペプチドの全てを含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、配列番号４２７～４５５のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも８７．５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＨＬＡポリペプチドを含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、少なくとも約１０５種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む少なくとも約１０５種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡポリペプチド、ランダム化抗原ポリペプチドおよびβ２－ミクログロブリンポリペプチドは単一のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドは第１の柔軟なポリペプチドリンカーおよび第２の柔軟なポリペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にある。これらの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーはＨＬＡポリペプチドをランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーはＨＬＡポリペプチドをβ２－ミクログロブリンポリペプチドから分離する。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にある。これらの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーはＨＬＡポリペプチドをランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーはＨＬＡポリペプチドをβ２－ミクログロブリンポリペプチドから分離する。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。これらの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーはランダム化抗原ポリペプチドをβ２－ミクログロブリンポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーはβ２－ミクログロブリンポリペプチドをＨＬＡポリペプチドから分離する。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。これらの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーはＨＬＡポリペプチドをβ２－ミクログロブリンポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーはランダム化抗原ポリペプチドをＨＬＡポリペプチドから分離する。いくつかの実施形態では、β２－ミクログロブリンポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のランダム化抗原ポリペプチドのＮ末端にある。これらの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーはＨＬＡポリペプチドをランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーはランダム化抗原ポリペプチドをβ２－ミクログロブリンポリペプチドから分離する。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のランダム化抗原ポリペプチドのＣ末端にある。これらの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーはβ２－ミクログロブリンポリペプチドをランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーはランダム化抗原ポリペプチドをＨＬＡポリペプチドから分離する。
【0010】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の各ＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいない。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでおらず、かつ複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいる。いくつかの実施形態では、エピトープタグはＦＬＡＧタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、ＨＩＳ－タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＶＳＶｇタグまたはＶ５タグを含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体はそれぞれ膜テザリングドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜テザリングドメインはＡｇａ２を含む。いくつかの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーは複数の細胞で発現される。
【0012】
いくつかの実施形態では、複数の細胞は複数の酵母細胞である。いくつかの実施形態では、複数の酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＥＢＹ１００菌株の複数の酵母細胞である。
【0013】
いくつかの実施形態では、複数の細胞の各細胞は特異的ＨＬＡ－抗原複合体を発現する。
【0014】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－抗原ポリペプチド複合体を含む抗原スクリーニングライブラリーであって、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、ペプチド結合溝を含むＨＬＡポリペプチドと、配列番号１～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、かつＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合するランダム化抗原ポリペプチドとを含む抗原スクリーニングライブラリーが提供される。
【0015】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるリストから選択されるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるリストから選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５種の異なるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥ ＨＬＡポリペプチドの全てを含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、配列番号４２７～４５５のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも８７．５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＨＬＡポリペプチドを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、少なくとも約１０５種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む少なくとも約１０５種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡポリペプチド、ランダム化抗原ポリペプチドおよびβ２－ミクログロブリンポリペプチドは単一のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドは、ＨＬＡポリペプチドをランダム化抗原ポリペプチドから分離する第１の柔軟なポリペプチドリンカーをさらに含む。これらの実施形態のいくつかでは、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＮ末端にある。これらの実施形態のいくつかでは、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にある。
【0019】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の各ＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいない。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでおらず、かつ複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいる。いくつかの実施形態では、エピトープタグはＦＬＡＧタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、ＨＩＳ－タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＶＳＶｇタグまたはＶ５タグを含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体はそれぞれ膜テザリングドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜テザリングドメインはＡｇａ２を含む。いくつかの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーは複数の細胞で発現される。
【0021】
いくつかの実施形態では、複数の細胞は複数の酵母細胞である。いくつかの実施形態では、複数の酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエのＥＢＹ１００菌株の複数の酵母細胞である。
【0022】
いくつかの実施形態では、複数の細胞の各細胞は特異的ＨＬＡ－抗原複合体を発現する。
【0023】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、複数の抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体を含む抗原スクリーニングライブラリーが提供される、抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体。これらの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーは、配列番号１～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、かつＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合するランダム化抗原ポリペプチドと、ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドとをさらに含む。これらの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーは１つ以上の酵母細胞によって構成的に発現され、かつペプチド結合溝を含む複数のＨＬＡポリペプチドもさらに含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるリストから選択されるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるリストから選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５種の異なるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥ ＨＬＡポリペプチドの全てを含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、配列番号４２７～４５５のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも８７．５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むＨＬＡポリペプチドを含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、複数の抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体は、少なくとも約１０５種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む少なくとも約１０５種の異なる抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドおよびβ２－ミクログロブリンポリペプチドは単一のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドは第１の柔軟なポリペプチドリンカーをさらに含む。これらの実施形態のいくつかでは、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にある。これらの実施形態のいくつかでは、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。
【0028】
いくつかの実施形態では、複数の抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体の各抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体はエピトープタグを含んでいない。いくつかの実施形態では、複数の抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体の少なくとも１つの抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体はエピトープタグを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでおらず、かつ複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいる。いくつかの実施形態では、エピトープタグはＦＬＡＧタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、ＨＩＳ－タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＶＳＶｇタグまたはＶ５タグを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体はそれぞれ膜テザリングドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜テザリングドメインはＡｇａ２を含む。いくつかの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーは複数の細胞で発現される。
【0030】
いくつかの実施形態では、複数の細胞は複数の酵母細胞である。いくつかの実施形態では、複数の酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエのＥＢＹ１００菌株の複数の酵母細胞である。
【0031】
いくつかの実施形態では、複数の細胞の各細胞は特異的抗原ポリペプチド－ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体を発現する。
【0032】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、本技術に係る抗原スクリーニングライブラリーをコードする複数の核酸が提供される。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体のＨＬＡポリペプチドは、配列番号４５６～４８４のいずれか１つと少なくとも約８５％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％相同な核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体のランダム化抗原ポリペプチドは配列番号２１０～４２６のいずれか１つに示されている核酸によってコードされる。
【0034】
いくつかの実施形態では、複数の核酸は複数の細胞によって発現される。
【0035】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、本技術に係る抗原スクリーニングライブラリーを発現する複数の細胞が提供される。
【0036】
いくつかの実施形態では、複数の細胞は複数の酵母細胞である。いくつかの実施形態では、複数の酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエのＥＢＹ１００菌株の複数の細胞である。いくつかの実施形態では、複数の細胞の各細胞は特異的ＨＬＡ－抗原複合体をコードする複数の核酸の１つの核酸を含む。
【0037】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、本技術に係る複数の細胞をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と接触させることを含む抗原を選択する方法が提供される。
【0038】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは基板に固定化されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは細胞によって発現される。
【0039】
いくつかの実施形態では、この選択を２、３、４または５サイクル繰り返す。
【0040】
いくつかの実施形態では、抗原はポリペプチド抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は天然に生じないポリペプチド抗原である。いくつかの実施形態では、抗原はヒトにおいて天然に生じないポリペプチド抗原である。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1A】本技術のいくつかの実施形態に係る酵母細胞に結合されるＨＬＡ抗原ポリペプチド構築物の概略図を示す。
【図1B】本技術のいくつかの実施形態に係る細胞にテザリングされたＨＬＡ抗原ポリペプチド構築物の例示的かつ非限定的な実施形態を示す。
【図2】本技術のいくつかの実施形態に係る特異的Ｔ細胞受容体と相互作用する特異的ランダム化抗原ポリペプチドを選択するためのプロセスの例示的かつ非限定的な図を示す。
【図3A】例示的ｐＹＡＬベクターのマップである。
【図3B】例示的ｐＣＴベクターのマップである。
【図4】本技術のいくつかの実施形態に係る複数のアロタイプのための酵母表面でのペプチド－ＨＬＡ（ｐＨＬＡ）発現のフローサイトメトリーによる特性評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【0042】
本明細書にはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のためのポリペプチドリガンドの選択および／または同定にとって有用な抗原スクリーニングライブラリーが記載されている。多くの場合に本抗原スクリーニングライブラリーは、新規なＴＣＲ抗原および／または新規なエピトープであってもよい内因性ＴＣＲ抗原および非内因性ＴＣＲ抗原の両方を含むＴＣＲリガンドとして、ヒトＴ細胞と相互作用し、かつそれを刺激することができるポリペプチド抗原を発見するために有用である。そのような新規な抗原および／または新規なエピトープは、少なくとも例えば消耗またはアネルギー化された状態になっている場合があるＴ細胞上の１つ以上のＴＣＲを刺激し、かつ癌、腫瘍または慢性ウイルス感染に対する免疫応答を復活させるのに有用である。従って本開示は、ＨＬＡを介したペプチド認識に制限されるＴＣＲの特異性および一般的な認識特性を決定するための所与のＨＬＡの文脈における、ランダム化ペプチド抗原ライブラリーなどのペプチドライブラリーディスプレイを含む。
【0043】
本明細書に記載されている方法論を用いて発現されると、ランダム化ペプチド抗原ライブラリーは細胞の表面で発現されているＨＬＡ分子によって提示することができる。一般にこれらのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を提示する細胞は、宿主の免疫系の正常な抗原提示細胞ではなく、限定されるものではないが昆虫細胞、酵母細胞および細菌細胞などのＨＬＡ－抗原ポリペプチドをコードする核酸で容易に形質転換、トランスフェクト、形質導入および／または電気穿孔することができる細胞である。いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーは酵母細胞によって発現される。少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４または１０１５種の異なるポリペプチド抗原をコードするプラスミドの混合物および１種または複数種のいずれかの異なるＨＬＡ分子を酵母細胞に形質転換する。本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーによる形質転換後に、次いでＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体ライブラリーを発現する酵母細胞を、ベイトとして機能するＴＣＲまたは１つ以上の抗原結合ドメインを有する他の巨大分子と接触させる。ＴＣＲは、（１）細胞によって発現させるか、あるいは（２）組換えにより産生し、かつ任意に多量体化し、かつ／またはビーズなどの固体構造上に、あるいはストレプトアビジンまたはストレプトアビジン結合デキストラン（選択試薬と呼ぶ）などのタンパク質足場を介して固定化させる。ＴＣＲ選択試薬と相互作用するＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を発現する細胞は適当なモダリティによって選択することができ、２、３、４、５、６、７回またはそれ以上の濃縮ラウンド後に（例えばサイクルで）、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする核酸を濃縮された細胞から抽出することができ、濃縮されたポリペプチド抗原を決定するためにシークエンシングを行うことができる。濃縮されたポリペプチド抗原は所与のＴＣＲと相互作用する構造的属性を定める。
【0044】
いくつかの実施形態では、本開示は複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む抗原スクリーニングライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、（ａ）ペプチド結合溝を含むＨＬＡポリペプチドと、（ｂ）配列番号１～１９４のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、かつＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合するために選択されるランダム化抗原ポリペプチドと、（ｃ）ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドとを含む。本明細書では、ランダム化ペプチド抗原の誘導体およびそのライブラリー、その組成物、その医薬組成物およびその使用も提供される。本明細書では、本明細書に開示されている１つ以上のランダム化ペプチド抗原ライブラリーおよびその誘導体をコードする核酸配列、ならびに１つ以上の細胞において１つ以上のランダム化ペプチド抗原ライブラリー、そのペプチドおよびその誘導体を発現させるための方法も提供される。
【0045】
本明細書において提供される実施例に示されているように、ランダム化ペプチド抗原ライブラリーを設計した（実施例１）。これは核酸構築物（図１Ａ）および酵母細胞などの細胞にテザリングされたペプチド構築物（図１Ｂ）を含む。ｐＨＬＡの発現は酵母ディスプレイ（ＹＤ）系を用いて特性評価および検証した（実施例２）。これらのｐＨＬＡはＴＣＲと相互作用することができ、相互作用が生じているか否かの決定は、本明細書に記載されている１つ以上のプロセスを用いて決定することができ、例えば図２に示されているようなプロセスを用いて行った。ｐＨＬＡの発現はフローサイトメトリーによって検証し（実施例２、レベル１）、候補のアロタイプに合致するＴＣＲを用いて本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーをスクリーニングすることによりさらに機能的に検証することができる（実施例２、レベル２）。
【0046】
本発明の以下の説明は単に本開示の様々な実施形態を例示するためのものである。従って考察されている具体的な修正は本開示の範囲に対する限界として解釈されるべきではない。本開示の範囲を逸脱することなく様々な均等形態、変更形態および修正形態を考案することができ、かつ当然ながらそのような同等の実施形態は本明細書に含めることができることは当業者に明らかであろう。
【0047】
本明細書に列挙されている全ての参考文献はそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。方法および装置は本明細書では例として提供されており、本開示を限定するものではない。
【0048】
特定の定義
以下の説明では、様々な実施形態の完全な理解を提供するためにいくつかの特定の詳細が示されている。但し当業者であれば、提供されている実施形態はこれらの詳細を含めることなく実施できることを理解するであろう。特に文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語ならびに「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその語尾変化は非限定的かつ包括的な意味で、すなわち「～を含むが、それ（ら）に限定されない」ものとして解釈されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されている単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「前記（その）（ｔｈｅ）」は、その文脈が明らかにそうでないことを示していない限り複数の指示対象を含む。「または」という用語は一般にその文脈が明らかにそうでないことを示していない限り「および／または」を含む意味で用いられることにも留意すべきである。さらに本明細書において提供される見出しは単に便宜のためのものであり、特許請求されている実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
以下の説明では、様々な実施形態の完全な理解を提供するためにいくつかの特定の詳細が示されている。但し当業者であれば、提供されている実施形態はこれらの詳細を含めることなく実施できることを理解するであろう。特に文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語ならびに「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその語尾変化は非限定的かつ包括的な意味で、すなわち「～を含むが、それ（ら）に限定されない」ものとして解釈されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されている単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「前記（その）（ｔｈｅ）」は、その文脈が明らかにそうでないことを示していない限り複数の指示対象を含む。「または」という用語は一般にその文脈が明らかにそうでないことを示していない限り「および／または」を含む意味で用いられることにも留意すべきである。さらに本明細書において提供される見出しは単に便宜のためのものであり、特許請求されている実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
【0049】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はアミノ酸残基のポリマーを指すために同義で使用され、かつ最小長さに限定されないが、アミノ酸残基の数が指定されている場合がある（例えば、９ｍｅｒは９つのアミノ酸残基である）。ポリペプチドは、天然および／または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含んでもよい。この用語はポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアリル化、アセチル化およびリン酸化などを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはタンパク質が所望の活性を維持する限り天然の配列に関して修飾を含んでいてもよい。これらの修飾は部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであってもよく、あるいはＰＣＲ増幅に起因するタンパク質またはエラーを産生する宿主の突然変異などによる偶発的なものであってもよい。
【0050】
「酸性残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な酸性残基としてはＤおよびＥが挙げられる。
【0051】
「アミド残基」という用語は、酸性基のアミド誘導体を含む側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸を指す。例示的な残基としてはＮおよびＱが挙げられる。
【0052】
「芳香族残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な芳香族残基としてはＦ、ＹおよびＷが挙げられる。
【0053】
「塩基性残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な塩基性残基としてはＨ、ＫおよびＲが挙げられる。
【0054】
「親水性残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な親水性残基としてはＣ、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＱが挙げられる。
【0055】
「非機能性残基」という用語は、酸性基、塩基性基または芳香族基を欠く側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な非機能性アミノ酸残基としてはＭ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌおよびノルロイシン（Ｎｌｅ）が挙げられる。
【0056】
「中性の疎水性残基」という用語は、塩基性基、酸性基または極性基を欠く側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な中性の疎水性アミノ酸残基としてはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、ＭおよびＦが挙げられる。
【0057】
「極性の疎水性残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な極性の疎水性アミノ酸残基としてはＴ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、ＱおよびＮが挙げられる。
【0058】
「疎水性残基」という用語は、塩基性基または酸性基を欠く側鎖を有するＤもしくはＬ体のアミノ酸残基を指す。例示的な疎水性アミノ酸残基としてはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、ＱおよびＮが挙げられる。
【0059】
参照ポリペプチド配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、必要であれば最大配列同一性パーセントを達成するために配列をアライメントし、かつギャップを導入した後のどんな保存的置換も配列同一性の一部とみなすことのない参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合である。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するという目的のためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアあるいは核酸配列のために適当な他のソフトウェアを用いる公知である様々な方法で達成することができる。比較される配列の長さ全体にわたって最大のアライメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、配列をアライメントするのに適当なパラメータを決定することができる。但し、本明細書における目的のためのアミノ酸配列同一性値％は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成する。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社によって構築され、そのソースコードは米国著作権局（ワシントン、２０５５９）にユーザー文書と共に提出されており、ここでは米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であるか、あるいはそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変動しない。
【0060】
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂとのアミノ酸配列同一性％（代わりとして所与のアミノ酸配列Ｂと何％かのアミノ酸配列同一性を有するか含む所与のアミノ酸配列Ａと表すことができる）は、１００×分数Ｘ／Ｙ（式中、ＸはＡおよびＢのそのプログラムのアライメントにおける配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２による完全な一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である）のように計算する。当然のことながらアミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％はＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくはならない。特段の記載がない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性値％は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフに記載されているように得る。
【0061】
本明細書で使用される「相同な」、「相同性」または「相同性パーセント」という用語は、参照配列に対する核酸配列を記述するために本明細書で使用される場合、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９３において見られるように修正されているＫａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０によって記述された式を用いて決定することができる。そのような式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０の基本的な局所アライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み込まれている。配列の相同性パーセントは、本出願の出願日の時点で最新版のＢＬＡＳＴを用いて決定することができる。
【0062】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、脊椎動物、例えば哺乳類の抗原／ＭＨＣ結合ヘテロダイマータンパク質産物、すなわちヒトＴＣＲα、β、γおよびδ鎖を含むＴＣＲ遺伝子複合体を指す。例えばヒトＴＣＲβ遺伝子座の完全な配列はＲｏｗｅｎ １９９６によって公表されているようにシークエンシングされており、ヒトＴＣＲ遺伝子座はシークエンシングおよび再シークエンシングされており、例えばＭａｃｋｅｌｐｒａｎｇ ２００６を参照されたく、Ａｒｄｅｎ １９９５におけるＴ細胞受容体可変遺伝子セグメントファミリーの一般的な分析を参照されたく、それらのそれぞれの内容が本公報において提供および参照されている配列情報のために参照により特に本明細書に組み込まれる。
【0063】
「ベイト」は、本技術の抗原に結合するＴＣＲまたは「１つ以上の抗原結合ドメインを有する他の巨大分子」を指す。１つ以上の抗原結合ドメインを有する他の巨大分子は、抗体、ＤＡＲＰｉｎまたは、アプタマーなどの合成分子である。抗原結合ドメインは、本技術のＨＬＡ－ペプチド複合体のうちの１つ以上またはＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸などのペプチドに結合する。
【0064】
核酸またはポリヌクレオチドに関する「外因性」は、その核酸が組換え核酸構築物の一部であるかその自然環境に存在しないことを示す。例えば外因性核酸はある生物種から別の生物種の中に導入された配列、すなわち異種核酸であってもよい。典型的にはそのような外因性核酸は組換え核酸構築物を介して他の生物種の中に導入される。また外因性核酸は生物にとって天然のものであり、かつその生物の細胞の中に再導入された配列であってもよい。天然配列を含む外因性核酸は多くの場合、外因性核酸に連結された非天然配列、例えば組換え核酸構築物において天然配列に隣接している非天然制御配列の存在によって天然に生じる配列から区別することができる。また安定に形質転換された外因性核酸は典型的には天然配列が存在する位置以外の位置に組み込まれている。例えば遺伝的組換えを用いて外因性要素が構築物に付加されていてもよい。遺伝的組換えは、遺伝情報の新規なセットをコードするＤＮＡの新しい分子を形成するためのＤＮＡ鎖の切断および再結合である。
【0065】
本明細書で使用される「約」という用語は１０％の範囲内で規定された量に近い量を指す。
【0066】
ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の構造的特性
複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含むランダム化ペプチド抗原ライブラリーなどの抗原スクリーニングライブラリーが本明細書に開示されている。本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は最小限に少なくとも３つの構成要素、すなわち（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）のＨＬＡ分子、および（ｃ）β２－ミクログロブリンを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）のランダム化抗原ポリペプチドは、特異的種類のＨＬＡ分子に結合するためのアンカー残基として機能する少なくとも１つまたは複数の保存された残基を有してランダム化されている。例示的なものであって限定的なものではないが、ランダム化抗原ポリペプチド抗原およびそれらが会合するＨＬＡ型が表１に示されており、かつ配列番号１～１９４によって与えられており、表２に示されており、かつ配列番号１９５～２０９によって与えられている。いくつかの実施形態では、ランダム化ポリペプチド抗原は、限定されるものではないが配列番号１～１９４および配列番号１９５～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％または１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ランダム化ポリペプチド抗原は、配列番号１～１９４および配列番号１９５～２０９のいずれか１つに示されている配列のいずれか１つと同一の配列を含む。本開示内では、配列番号１～１９４および配列番号１９５～２０９のいずれか１つのＮ末端から切断されたかＣ末端から切断された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸を有するランダム化ポリペプチド抗原切断も想定される。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＨＬＡ分子はＨＬＡポリペプチドであり、かつペプチド結合溝を含む。発現されるといくつかの実施形態では（ａ）のランダム化抗原ポリペプチドは、ペプチド結合溝において（ｂ）のＨＬＡポリペプチドに結合する。
複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含むランダム化ペプチド抗原ライブラリーなどの抗原スクリーニングライブラリーが本明細書に開示されている。本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は最小限に少なくとも３つの構成要素、すなわち（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）のＨＬＡ分子、および（ｃ）β２－ミクログロブリンを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）のランダム化抗原ポリペプチドは、特異的種類のＨＬＡ分子に結合するためのアンカー残基として機能する少なくとも１つまたは複数の保存された残基を有してランダム化されている。例示的なものであって限定的なものではないが、ランダム化抗原ポリペプチド抗原およびそれらが会合するＨＬＡ型が表１に示されており、かつ配列番号１～１９４によって与えられており、表２に示されており、かつ配列番号１９５～２０９によって与えられている。いくつかの実施形態では、ランダム化ポリペプチド抗原は、限定されるものではないが配列番号１～１９４および配列番号１９５～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％または１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ランダム化ポリペプチド抗原は、配列番号１～１９４および配列番号１９５～２０９のいずれか１つに示されている配列のいずれか１つと同一の配列を含む。本開示内では、配列番号１～１９４および配列番号１９５～２０９のいずれか１つのＮ末端から切断されたかＣ末端から切断された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸を有するランダム化ポリペプチド抗原切断も想定される。いくつかの実施形態では、（ｂ）のＨＬＡ分子はＨＬＡポリペプチドであり、かつペプチド結合溝を含む。発現されるといくつかの実施形態では（ａ）のランダム化抗原ポリペプチドは、ペプチド結合溝において（ｂ）のＨＬＡポリペプチドに結合する。
【表1】
【表2】
【0067】
いくつかの実施形態では、本開示の抗原スクリーニングライブラリーは、少なくとも表４に提供されている、少なくとも限定されるものではないが配列番号２１０～４１１のヌクレオチド配列によってコードされる（ｂ）ランダム化抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原スクリーニングライブラリーは、少なくとも表５に提供されている、少なくとも限定されるものではないが配列番号４１２～４２６のヌクレオチド配列によってコードされる（ｂ）ランダム化抗原ポリペプチドを含む。（ｂ）のランダム化抗原ポリペプチドをコードする核酸は縮重塩基配列によってコードされており、あらゆるアミノ酸を縮重塩基配列に対応する所与の位置においてコードするのを有効に可能にする。各ランダム化抗原ポリペプチドは、ランダム化抗原ポリペプチドが特定のＨＬＡ型とより効率的に相互作用するのを可能にする制限された縮重コードまたは特異的配列によってコードされる少なくとも１つの保存されたアンカー位置を有する。ランダム化抗原ポリペプチドごとに少なくとも１つの保存されたアンカー位置を有することにより、完全にランダム化された抗原ポリペプチドとのＨＬＡ複合体の形成と比較して、ランダム化抗原ポリペプチドとＨＬＡとの複合体の形成の効率を高める。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドの１、２または３個のアミノ酸残基は一定である。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチド抗原は、限定されるものではないが配列番号２１０～４１１および配列番号４１２～４２６のいずれか１つに示されているアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％または１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチド抗原は、配列番号２１０～４１１および配列番号４１２～４２６のいずれか１つに示されている配列のいずれか１つと同一の配列を含む。本開示内では、配列番号２１０～４１１および配列番号４１２～４２６のいずれか１つのＮ末端から切断されたかＣ末端から切断された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸を有するランダム化抗原ポリペプチドの抗原ポリペプチド切断も想定される。
【0068】
いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドのアミノ酸残基は２、３または４つの異なるアミノ酸によって異なる。例えば表１を参照すると、ＨＬＡ－Ａ２に結合するランダム化抗原ポリペプチドの２番目および最後の位置は、「ロイシンまたはメチオニン」および「ロイシン、メチオニンまたはバリン」をそれぞれ含む。
【0069】
上の表１および表２の中のアミノ酸配列はランダムなアミノ酸残基（‘Ｘ’）を含み、残基に位置する明示的に定められたアミノ酸をまとめてアンカー位置と呼ぶ。ライブラリー設計において指定されるアンカー位置は、例えば表３に示されているアミノ酸置換に基づいて変更することができる。当業者であれば、表１および表２のアミノ酸配列におけるＸ残基の可能な置換は限定されず、かつ本開示の範囲から逸脱することなくさらなる置換を含むことができることを理解するであろう。例えばアミノ酸置換を使用して、ＨＬＡの結合または本明細書に記載されているライブラリーのメンバーの制約または拡大に寄与するペプチド配列の重要な残基を同定することができる。
【0070】
保存的修飾によりそのような修飾がなされるペプチドの特性と同様の機能的および化学的特性を有するペプチドを産生する。対照的にペプチドの機能的および／または化学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシートもしくはヘリックス立体構造としての置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）分子のサイズを維持することに対するそれらの効果において著しく異なるアミノ酸配列における置換を選択することにより達成してもよい。
【0071】
例えば「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対して影響が少ないか全く影響しないような天然アミノ酸残基の非天然残基による置換を含んでもよい。さらに「アラニンスキャニング突然変異誘発」（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発について考察しているＭａｃＬｅｎｎａｎ １９９８およびＳａｓａｋｉ＆Ｓｕｔｏｈ １９９８を参照）について以前に記載されているように、ポリペプチド内のあらゆる天然残基をアラニンで置換してもよい。
【0072】
所望のアミノ酸置換（保存的であるか非保存的であるかは問わない）は、そのような置換が望まれる際に当業者によって決定することができる。例示的なアミノ酸置換は表３に示されている。
【表3】
【0073】
特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、典型的には生物系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる天然に生じないアミノ酸残基も包含する。
【0074】
上記「特定の定義」の箇所に記載されているように、天然に生じる残基は配列の修飾のために有用であり得る共通の側鎖特性に基づいてクラスに分けてもよい。例えば非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの別のクラスからのメンバーとの置換を含んでもよい。そのような置換された残基は、非ヒト相同分子種と相同なペプチドの領域の中または当該分子の非相同な領域の中に導入されていてもよい。また鎖配向に影響を与えるという目的のためにＰまたはＧを用いて修飾を行ってもよい。
【0075】
そのような修飾を行う際は、アミノ酸の疎水性指標を考慮してもよい。各アミノ酸にはそれらの疎水性および電荷特性に基づいて疎水性指標が割り当てられている。これらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（－０．４）、トレオニン（－０．７）、セリン（－０．８）、トリプトファン（－０．９）、チロシン（－１．３）、プロリン（－１．６）、ヒスチジン（－３．２）、グルタミン酸（－３．５）、グルタミン（－３．５）、アスパラギン酸（－３．５）、アスパラギン（－３．５）、リジン（－３．９）およびアルギニン（－４．５）である。
【0076】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える際のアミノ酸疎水性指標の重要性は当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２）。特定のアミノ酸を同様の疎水性指標もしくはスコアを有する他のアミノ酸の代わりの用いてもよく、それが同様の生物活性をなお保持することは公知である。疎水性指標に基づいて置換を行う際は、その疎水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、それが±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【0077】
親水性に基づいて同様のアミノ酸の置換を有効に行うことができることも当該技術分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性すなわちタンパク質の生物学的特性と相関している。
【0078】
以下の親水性値：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（－０．４）、プロリン（－０．５±１）、アラニン（－０．５）、ヒスチジン（－０．５）、システイン（－１．０）、メチオニン（－１．３）、バリン（－１．５）、ロイシン（－１．８）、イソロイシン（－１．８）、チロシン（－２．３）、フェニルアラニン（－２．５）、トリプトファン（－３．４）がアミノ酸残基に割り当てられている。同様の親水性値に基づいて置換を行う際は、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、それが±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。また親水性に基づいてエピトープを一次アミノ酸配列から同定してもよい。これらの領域を「エピトープのコア領域（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ）」ともいう。
【0079】
当業者であれば周知の技術を用いて上記配列に示されているポリペプチドの好適なバリアントを決定することができるであろう。活性を破壊することなく変化させることができる分子の好適な領域を特定するために、当業者であれば活性のために重要であると考えられていない領域を標的にすることができるであろう。例えば、同じ生物種または他の生物種からの同様の活性を有する同様のポリペプチドが公知である場合、当業者であればペプチドのアミノ酸配列を同様のペプチドと比較することができるであろう。そのような比較により、同様のポリペプチドの中で保存されている分子の残基および一部を同定することができる。当然のことながらそのような同様のペプチドに対して保存されていないペプチドの領域における変化はペプチドの生物活性および／または構造に悪影響を与える可能性は低い。当業者であれば、比較的保存された領域であっても活性を保持しながら化学的に類似したアミノ酸を天然に生じる残基の代わりに使用することができること（保存的アミノ酸残基置換）も知っている。従って生物活性または構造のために重要であり得る領域であっても、生物活性を破壊したりペプチド構造に悪影響を与えたりすることなく保存的アミノ酸置換に供することができる。
【0080】
さらに当業者であれば、活性または構造のために重要な同様のペプチドにおいて残基を同定する構造－機能研究を再考することができる。そのような比較を考慮して、同様のペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者であれば、ペプチドのそのような予測される重要なアミノ酸残基のために化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができるであろう。
【0081】
当業者は、同様のポリペプチドにおけるその構造に関連して３次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。その情報を考慮して当業者であれば、その３次元構造に関するペプチドのアミノ酸残基のアライメントを予測することができるであろう。当業者であれば、タンパク質の表面にあることが予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与している場合があるため、そのような残基に対して過激な変化を行わないことを選択することができるであろう。さらに当業者であれば、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む試験バリアントを作製することができるであろう。次いで、当業者に公知の活性アッセイを用いてそのバリアントをスクリーニングすることができる。そのようなデータを使用して好適なバリアントに関する情報を収集することができる。例えば、特定のアミノ酸残基への変化により破壊された望ましくない低下した活性、すなわち好適でない活性が生じたことを発見した場合、そのような変化を有するバリアントは回避されるであろう。言い換えると、そのような日常的な実験から収集された情報に基づいて当業者は、単独または他の突然変異と組み合わせたさらなる置換を回避すべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【0082】
多くの科学的文献は二次構造の予測に専念してきた（例えば、Ｍｏｕｌｔ １９９６；Ｃｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ １９７４ａ；Ｃｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ １９７４ｂ；Ｃｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ １９７８ａ；Ｃｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ １９７８ｂ；およびＣｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ １９７９を参照）。さらに、二次構造を予測するのを補助するためのコンピュータプログラムが現在入手可能である。二次構造を予測する１つの方法は相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％超の配列同一性または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は同様の構造的トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展により、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の潜在的な折り畳みの数を含む二次構造の予測可能性が向上している（Ｈｏｌｍ＆Ｓａｎｄｅｒ １９９９）。所与のポリペプチドまたはタンパク質には限られた数の折り畳みが存在すること、および構造の臨界数が解明されると構造予測は劇的に正確性が増すことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ １９９７）。
【0083】
二次構造を予測するさらなる方法としては「スレッディング法」（Ｊｏｎｅｓ １９９７；Ｓｉｐｐｌ＆Ｆｌｏｃｋｎｅｒ １９９６）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ １９９１；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ １９８７； Ｇｒｉｂｓｋｏｖ １９９０）、および「進化的関連解析（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ＆Ｓａｎｄｅｒ １９９９；Ｂｒｅｎｎｅｒ １９９７）が挙げられる。
【表4】
【表5】
【0084】
ランダム化抗原ポリペプチドの利点の１つは、縮重塩基コードを有する単一の核酸が大量の異なるランダム化抗原ポリペプチドを潜在的に発現させることができ、これにより任意の１つのスクリーニング実験により特定のＴＣＲと相互作用する１つ以上のランダム化抗原ポリペプチドを同定する機会が高まるという点にある。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドをコードする核酸は、少なくとも１×１０４、少なくとも１×１０５、少なくとも１×１０６、少なくとも１×１０７、少なくとも１×１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも１×１０１０、少なくとも１×１０１１、少なくとも１×１０１２、少なくとも１×１０１３、少なくとも１×１０１４または少なくとも１×１０１５種の異なるランダム化ポリペプチド抗原をコードすることができる。
【0085】
ＨＬＡ分子の結合溝の中に結合するペプチド抗原は一般に制限された長さ範囲である。クラスＩのＨＬＡ分子に結合するポリペプチドの大部分は８、９、１０または１１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ分子に結合し、かつ本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を形成するランダム化抗原ポリペプチドは８～１１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは８～１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは９アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドは１１アミノ酸長である。
【0086】
本明細書に記載されているＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の別の構成要素は、ＨＬＡポリペプチドなどのＨＬＡ分子である。本開示の目的のために、ＨＬＡ分子はクラスＩ主要組織適合性分子である。いくつかの実施形態では、本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体（ＨＬＡ－抗原複合体）の複数のＨＬＡポリペプチドは、以下の遺伝子座および対立遺伝子：Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体の中の各ＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるＨＬＡポリペプチドの群から選択されるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるＨＬＡポリペプチドの群から選択される少なくとも５、１０、１５、２０または２５種の異なるＨＬＡポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原複合体は、Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥからなるＨＬＡポリペプチドの群の中のＨＬＡポリペプチドの全てを含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体のＨＬＡポリペプチドのアミノ酸配列は、表６に示されているアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態ではＨＬＡポリペプチドは、限定されるものではないが配列番号４２７～４５５のいずれか１つに示されているアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態ではＨＬＡポリペプチドは、配列番号４２７～４５５のいずれか１つに示されている配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド結合溝を含むＨＬＡポリペプチドの一部は配列番号２５１～２７９のいずれか１つと同一であり、かつ非ペプチド結合溝残基は配列番号４２７～４５５のいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。本開示内では、配列番号４２７～４５５のいずれか１つのＮ末端から切断されたかＣ末端から切断された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸を有するＨＬＡポリペプチド切断も想定される。
【表6】
【0088】
ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体のＨＬＡポリペプチドは表７に示されているいずれかの核酸によってコードすることができる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡポリペプチドは、少なくとも限定されるものではないが配列番号４５６～４８４などの表７に列挙されている核酸配列のいずれか１つと少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同な核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡポリペプチドは配列番号４５６～４８４のいずれか１つに示されている配列と同一の核酸配列によってコードされる。
【表7】
【0089】
いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は少なくとも約１０５種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。１０５種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の構成要素はまとめて少なくとも約１０５種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は少なくとも約１０７種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。１０７種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の構成要素はまとめて少なくとも約１０７種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は少なくとも約１０９種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。１０９種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の構成要素はまとめて少なくとも約１０９種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は少なくとも約１０１１種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。１０１１種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の構成要素はまとめて少なくとも約１０１１種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、細胞の表面でＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体と相互作用して安定化するβ２－ミクログロブリンポリペプチドをさらに含む。ヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４０３９に示されている。いくつかの実施形態では、本開示のヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４０３９として開示されているヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドと少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有するヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドの機能的な天然に生じるバリアントである。
【0091】
本開示は複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチドの抗原スクリーニングライブラリーも含み、ここではβ２－ミクログロブリンは細胞によって構成的に発現される。いくつかの実施形態では、β２－ミクログロブリンは第１の核酸によってコードされ、ランダム化抗原ポリペプチドは第２の核酸によってコードされ、かつＨＬＡポリペプチドは第３の核酸によってコードされる。他の実施形態では、β２－ミクログロブリンは第１の核酸によってコードされ、かつランダム化抗原ポリペプチドおよびＨＬＡポリペプチドは第２の核酸によってコードされる。第１の核酸によってコードされる場合、β２－ミクログロブリンは第２の核酸または第３の核酸の前後で細胞の中に形質導入、トランスフェクトまたは形質転換することができる。
【0092】
本開示のいくつかの実施形態では、β２－ミクログロブリンを当業者に公知の技術を用いて本抗原スクリーニングライブラリーのランダム化抗原ポリペプチドの少なくとも１つに融合させる。これらの実施形態では、ＨＬＡポリペプチドは本抗原スクリーニングライブラリーの構成要素であってもそうでなくてもよい。本開示の他の実施形態では、ＨＬＡポリペプチドの少なくとも１つを当業者に公知の技術を用いて本抗原スクリーニングライブラリーのランダム化抗原ポリペプチドの少なくとも１つに融合させる。これらの実施形態では、β２－ミクログロブリンは、ランダム化抗原ポリペプチドおよびＨＬＡポリペプチドなどの本抗原スクリーニングライブラリーの他の構成要素を発現するように形質導入、トランスフェクトまたは形質転換されている細胞によって発現させることができる。本明細書に記載されている他の実施形態と同様に、β２－ミクログロブリンは細胞によって構成的に発現される。これらの実施形態のいくつかでは、当該細胞は酵母細胞である。他の実施形態では、β２－ミクログロブリンは、ランダム化抗原ポリペプチドおよびＨＬＡポリペプチドなどの本抗原スクリーニングライブラリーの他の構成要素を発現するように形質導入、トランスフェクトまたは形質転換されている細胞よって発現されない。これらの実施形態のいくつかでは、当該細胞は哺乳類の細胞である。
【0093】
本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）ＭＨＣ ＩのＨＬＡ分子および（ｃ）β２－ミクログロブリン特徴に加えて、本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は（ｄ）シグナル配列、（ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかまたは全ての間のポリペプチドリンカー、（ｆ）膜テザリングドメイン、および任意に（ｇ）ＦＬＡＧタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓ－タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＶＳＶｇタグ、Ｖ５タグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ、ＯＬＬＡＳタグ、Ｔ７タグ、Ｓ－ＴａｇＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、ＴＫ１５タグ、Ｆｃタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｔｙタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＮＥタグ、Ｅタグ、Ｃ－タグおよび／またはＡｖｉＴａｇなどのエピトープタグをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいない。但しいくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原複合体のそれぞれの少なくとも１つまたは複数は、エピトープに特異的な抗体を用いたＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つの発現の確認を可能にするエピトープタグを含む。いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原複合体のそれぞれはエピトープタグを含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、膜テザリングドメインは、膜テザリングドメインをＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の１つ以上の他の特徴（（ａ）～（ｅ）および（ｇ））から分離するポリペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の特徴（（ａ）～（ｇ））は単一のポリペプチドとして発現される。いくつかの実施形態では、（ｂ）ＨＬＡ分子（例えばＨＬＡポリペプチド）、（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、および（ｃ）β２－ミクログロブリンポリペプチドは単一のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）ＨＬＡポリペプチドおよび（ａ）ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチドとして発現され、（ｃ）β２－ミクログロブリンは別々に発現される。例えば（ｃ）β２－ミクログロブリンは、（ａ）ランダム化抗原ポリペプチドおよび（ｂ）ＨＬＡポリペプチドを発現する同じ核酸によってコードされる別個のポリペプチドから供給するか、別個の核酸から供給するか、あるいは当該細胞によって内因的に産生させることができる。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドはＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドはβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドはＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドはβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドはＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドはβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。いくつかの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドはＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドはβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。
【0095】
（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）のＨＬＡ分子、および（ｃ）β２－ミクログロブリンは、第１の柔軟なポリペプチドリンカー、第２の柔軟なポリペプチドリンカー、第３の柔軟なポリペプチドリンカー、第４の柔軟なポリペプチドリンカー、第５の柔軟なポリペプチドリンカー、またはそれ以外の柔軟なポリペプチドリンカーなどの少なくとも１つの柔軟なポリペプチドリンカーによって分離させることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの柔軟なポリペプチドリンカーは約３～約１００アミノ酸残基長、約５～約８０アミノ酸残基長、約１０～約７０アミノ酸残基長、約３～約１００アミノ酸残基長、約２０～約６０アミノ酸残基長の範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、当該リンカーは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基長であってもよい。いくつかの実施形態では、当該リンカーは、式（ＧＧＧＧＳ）Ｘ（式中、Ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）のグリシンリンカーまたはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、当該リンカーは好適にはトロンビン切断部位などのプロテアーゼ切断部位を含むことができる。
【0096】
いくつかの実施形態では、本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を分泌経路を介して細胞表面に導くシグナルポリペプチドを含む。このシグナルペプチドは小胞体において切断され、細胞表面に位置している場合はＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体によって発現されない。シグナル配列は、内因性ＨＬＡリーダー配列または免疫グロブリンリーダー配列などの異なる分泌もしくは膜貫通分子から移入された異種リーダー配列などの任意の好適な配列であってもよい。
【0097】
ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）タンパク質からのアンカードメインおよび／または内部反復を有する酵母タンパク質（ＰＩＲタンパク質）からのドメインなどの膜テザリングドメインをさらに含む。この膜テザリングドメインは、膜貫通ドメインまたは細胞表面タンパク質と相互作用するドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、膜テザリングドメインは、酵母Ａｇａ２、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ａｇａ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、ＹＣＲ８９ｗおよびＴｉｒ１ｐからなる群から選択されるＧＰＩタンパク質および／または酵母Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ２ｐ、Ｐｉｒ３ｐ、Ｐｉｒ４ｐおよびＰｉｒ５ｐからなる群から選択されるＰＩＲタンパク質の少なくとも１つのアンカードメインを含む。膜ドメインテザリングの非限定的な例は図１Ｂに提供されている。
【0098】
他の実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の本抗原スクリーニングライブラリーの構成要素は２つ以上のポリペプチドとして発現され、かつ複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の本抗原スクリーニングライブラリーの構成要素を互いから分離する切断配列を含む。例えば、ランダム化ペプチド抗原は切断配列によってＨＬＡポリペプチドおよび／またはベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドから分離されている。別の例として、ＨＬＡペプチドはヌクレオチドでコード化された切断配列によってベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドから分離されている。いくつかの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーの構成要素は２つ以上の切断配列によって分離されている。好適な切断配列は当業者に公知であり、限定されるものではないが、自己切断ペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｆ２ＡおよびＥ２Ａ）、タンパク質切断部位（３Ｃ部位、トロンビン部位、ＴＥＶ部位、因子Ｘａ部位およびＥＫＴ部位）ならびに配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。
【0099】
いくつかの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーおよび／またはＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、本明細書に記載されている核酸で容易にトランスフェクト、形質導入、電気穿孔または形質転換することができる１つ以上の細胞によって発現させることができる。いくつかの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーおよび／またはＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は複数の細胞で発現される。いくつかの実施形態では、複数の細胞の各細胞は、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の特異的ＨＬＡ－抗原複合体および／または本抗原スクリーニングライブラリーの別の構成要素を発現する。いくつかの実施形態では、核酸または複数の核酸は本抗原スクリーニングライブラリーおよび／またはＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする。いくつかの実施形態では、本抗原スクリーニングライブラリーおよび／またはＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は原核細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を発現する細胞は真核細胞を含む。いくつかの実施形態では、真核細胞は酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエの細胞である。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエは菌株ＥＢＹ１００のものである。サッカロマイセス・セレビシエの核酸による形質転換は、その効率が少なくとも１０７、１０８、１０９または１０１０種の形質転換体を産生するのに十分である限り標準的な方法によって達成することができる。
【0100】
上記本抗原スクリーニングライブラリーの複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体に加えて、本技術は、上記のものとは異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を有する少なくとも２つまたはそれ以上の抗原スクリーニングライブラリーも含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、上記複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体よりも少ない構成要素および／またはそれとは異なる少なくとも１つの構成要素を有する。例えばいくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、（ａ）ペプチド結合溝を有するＨＬＡポリペプチド、および（ｂ）ＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合する配列番号１～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含むランダム化抗原ポリペプチドも含むことができる。これらの実施形態では、ＨＬＡポリペプチドおよびランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチドを含む。またこれらの実施形態では、単一のポリペプチドは、ＨＬＡポリペプチドをランダム化抗原ポリペプチドから分離する第１の柔軟なポリペプチドリンカーをさらに含む。第１の柔軟なポリペプチドリンカーによって分離された単一のポリペプチドで発現された場合、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあるか、あるいはランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にある。
【0101】
別の例として、いくつかの実施形態では、本技術の抗原スクリーニングライブラリーは、（ａ）１つ以上の酵母細胞によって構成的に発現され、かつペプチド結合溝を含むＨＬＡポリペプチドと、（ｂ）複数のベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド－抗原ポリペプチド複合体とを含む。これらの実施形態では、複数のベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド複合体は、配列番号１～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、かつＨＬＡポリペプチドのペプチド結合溝に特異的に結合するランダム化抗原ポリペプチドと、（ｃ）ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドとを含む。これらの実施形態では、ランダム化抗原ポリペプチドおよびβ２－ミクログロブリンポリペプチドは単一のポリペプチドを含む。またこれらの実施形態では、単一のポリペプチドは、ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドをランダム化抗原ポリペプチドから分離する第１の柔軟なポリペプチドリンカーをさらに含む。第１の柔軟なポリペプチドリンカーによって分離された単一のポリペプチドで発現された場合、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にあるか、あるいはランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。
【0102】
ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする核酸
本抗原スクリーニングライブラリーのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする核酸も本明細書に開示されている。本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする核酸は最小限に、（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）ＭＨＣ ＩのＨＬＡ分子、および（ｃ）β２－ミクログロブリンをコードする。１つ以上の核酸によってコードされる本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）ＭＨＣ ＩのＨＬＡ分子および（ｃ）β２－ミクログロブリン特徴に加えて、本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、（ｄ）シグナル配列、（ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかまたは全ての間のポリペプチドリンカー、（ｆ）膜テザリングドメイン、および任意に（ｇ）ＦＬＡＧタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、ＨＩＳ－タグ、赤血球凝集素タグ、ＶＳＶｇタグ、Ｖ５タグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ、ＯＬＬＡＳタグ、Ｔ７タグ、Ｓ－タグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、ＴＫ１５タグ、Ｆｃタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｔｙタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＮＥタグ、Ｅタグ、Ｃ－タグおよび／またはＡｖｉＴａｇなどのエピトープタグをコードする核酸をさらに含む（図１Ａおよび図１Ｂ）。
本抗原スクリーニングライブラリーのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする核酸も本明細書に開示されている。本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする核酸は最小限に、（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）ＭＨＣ ＩのＨＬＡ分子、および（ｃ）β２－ミクログロブリンをコードする。１つ以上の核酸によってコードされる本ランダム化ペプチド抗原ライブラリーのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の（ａ）ランダム化抗原ポリペプチド、（ｂ）ＭＨＣ ＩのＨＬＡ分子および（ｃ）β２－ミクログロブリン特徴に加えて、本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、（ｄ）シグナル配列、（ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかまたは全ての間のポリペプチドリンカー、（ｆ）膜テザリングドメイン、および任意に（ｇ）ＦＬＡＧタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、ＨＩＳ－タグ、赤血球凝集素タグ、ＶＳＶｇタグ、Ｖ５タグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ、ＯＬＬＡＳタグ、Ｔ７タグ、Ｓ－タグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、ＴＫ１５タグ、Ｆｃタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｔｙタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＮＥタグ、Ｅタグ、Ｃ－タグおよび／またはＡｖｉＴａｇなどのエピトープタグをコードする核酸をさらに含む（図１Ａおよび図１Ｂ）。
【0103】
いくつかの実施形態では、（ｆ）膜テザリングドメインをコードする核酸は、（ｅ）膜テザリングドメインをＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の他の特徴から分離する１つ以上のポリペプチドリンカーをさらにコードしてもよい。いくつかの実施形態では、当該核酸は、全ての３つの特徴が単一の核酸上でコードされる場合、（ａ）ＨＬＡポリペプチドを（ｂ）ランダム化抗原ポリペプチドおよび（ｃ）β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離する１つ以上の柔軟なポリペプチドリンカーをコードする。
【0104】
いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドをコードする核酸は、第１の柔軟なポリペプチドリンカーおよび第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチドをさらに含み、ここでは第１の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をβ２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離する。いくつかの実施形態では発現されると、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にある。
【0105】
いくつかの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をβ２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離する。いくつかの実施形態では発現されると、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にある。
【0106】
いくつかの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をβ２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離する。いくつかの実施形態では発現されると、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。
【0107】
いくつかの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をβ２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、β２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離する。いくつかの実施形態では発現されると、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にある。
【0108】
いくつかの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をβ２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離する。いくつかの実施形態では発現されると、β２－ミクログロブリンポリペプチドは単一のポリペプチド上のＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のランダム化抗原ポリペプチドのＮ末端にある。
【0109】
いくつかの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をβ２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離する。いくつかの実施形態では発現されると、ランダム化抗原ポリペプチドは単一のポリペプチド上のβ２－ミクログロブリンのＣ末端にあり、かつＨＬＡポリペプチドは単一のポリペプチド上のランダム化抗原ポリペプチドのＣ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、β２－ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列は、ランダム化抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をＨＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から分離する。
【0110】
他の実施形態では、複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の本抗原スクリーニングライブラリーの構成要素は単一の核酸によってコードされるにも関わらず２種以上のポリペプチドとして発現される。これらの実施形態では、ヌクレオチドコード化切断配列は複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の本抗原スクリーニングライブラリーの構成要素を互いから分離する。例えば発現されるとランダム化ペプチド抗原は、切断配列によってＨＬＡポリペプチドおよび／またはベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドから分離される。別の例として、発現されるとＨＬＡペプチドは、ヌクレオチドコード化切断配列によってベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチドから分離される。これらの実施形態では、ＨＬＡポリペプチドの一部は複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の本抗原スクリーニングライブラリーの他の構成要素とは別々に発現され、別々に発現された場合、細胞内のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の他の構成要素と自然に対をなす。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体のランダム化抗原ポリペプチドは配列番号２１０～４１１のいずれか１つに示されている核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体のＨＬＡポリペプチドは配列番号２１０～４１１のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同な核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体のランダム化抗原ポリペプチドは配列番号４１２～４２６のいずれか１つに示されている核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原複合体のＨＬＡポリペプチドは配列番号２８０～３０８のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同な核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列番号２１０～４１１および４１２～４２６の核酸の１つ以上などの当該核酸の１つ以上は複数の細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、複数の細胞の各細胞はＨＬＡ－抗原複合体をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞は複数の酵母細胞である。いくつかの実施形態では、複数の酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエのＥＢＹ１００菌株の複数の細胞である。
【0112】
ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の１種以上の構成要素をコードする核酸は外因性核酸または外因性ベクターなどの核酸またはベクターにより複数の細胞に送達することができる。好適な外因性核酸および外因性ベクターとしては、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、トランスポゾンおよびウイルスベクターが挙げられる。これらの外因性核酸および外因性ベクターは、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の１種以上の構成要素をコードする核酸の複製を可能にし、細胞または他の生物の一部がＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の１種以上の構成要素をコードする核酸を発現するのを可能にするための抗生物質選択を可能にする構成要素、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の１種以上の構成要素をコードする核酸を発現している酵母形質転換体を選択するための酵母の独立栄養を補う遺伝子、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の原核生物もしくは真核生物発現のためのプロモーターまたはエンハンサー、ポリアデニル化部位、あるいは形質転換された細胞の可視化を可能にするマーカー遺伝子をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする核酸を含む核酸は誘導プロモーターを含む。
【0113】
ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体およびそのような複合体をコードする核酸を使用する方法は最小限に、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を発現する複数の細胞などの１つ以上の細胞をＴＣＲと接触させる工程と、ＴＣＲと相互作用する１つ以上の細胞を選択する工程とを含む。選択は、例えばＴＣＲと相互作用するＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を発現している１つ以上の細胞を捕捉するための「パニング工程」においてＴＣＲを使用し、かつＴＣＲと相互作用しないＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を発現していない１つ以上の細胞などのあらゆる相互作用していない細胞を洗い流すことにより行うことができる。ＴＣＲと相互作用したランダム化抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を明らかにするために、相互作用している細胞からの核酸を回収してシークエンシングすることができる。さらなる選択ラウンドのためにこれらの核酸を１つ以上の異なる細胞の中に再トランスフェクト、形質転換または形質導入することができる。１、２、３、４、５回またはそれ以上の回数などの任意の回数の選択ラウンドのために（例えばサイクルで）この方法を繰り返して、ＴＣＲと強力に相互作用するＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を濃縮することができる。
【0114】
本開示において使用することができるシークエンシングプラットフォームとしては、限定されるものではないが、パイロシークエンシング、ＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法、１分子シークエンシング、第２世代シークエンシング、ナノポアシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシングまたはハイブリダイゼーションによるシークエンシングが挙げられる。好ましいシークエンシングプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）およびＨｅｌｉｃｏｓ社（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎすなわち「ＤＧＥ」）から市販されているものである。「次世代」シークエンシング法としては、限定されるものではないが、以下の会社によって商品化されているものが挙げられる：１）４５４／Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社（限定されるものではないが、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ２００５ならびに米国特許第７，２４４，５５９号、第７，３３５，７６２号、第７，２１１，３９０号、第７，２４４，５６７号、第７，２６４，９２９号および第７，３２３，３０５号に記載されている方法および装置が挙げられる）、２）Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）（米国特許第７，５０１，２４５号、第７，４９１，４９８号および第７，２７６，７２０号ならびに米国特許出願公開第２００６／００２４７１１号、第２００９／００６１４３９号、第２００８／００８７８２６号、第２００６／０２８６５６６号、第２００６／００２４７１１号、第２００６／００２４６７８号、第２００８／０２１３７７０号および第２００８／０１０３０５８号に記載されているようなもの）、３）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（例えば、ＳＯＬｉＤシークエンシング）、４）Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（例えば、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ Ｇ．００７シークエンシング）、５）Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（米国特許第５，７５０，３４１号、第６，３０６，５９７号および第５，９６９，１１９号に記載されているようなもの）、６）Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国特許第７，４６２，４５２号、第７，４７６，５０４号、第７，４０５，２８１号、第７，１７０，０５０号、第７，４６２，４６８号、第７，４７６，５０３号、第７，３１５，０１９号、第７，３０２，１４６号および第７，３１３，３０８号ならびに米国特許出願公開第２００９／００２９３８５号、第２００９／００６８６５５号、第２００９／００２４３３１号および第２００８／０２０６７６４号に記載されているようなもの）。
【0115】
方法
本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を使用して特異的ＴＣＲなどのＴＣＲに結合する抗原を選択または濃縮する方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では本方法は、トランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド酵母細胞ライブラリーなどの１つ以上のトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド細胞ライブラリーを用いてＨＬＡ抗原ポリペプチド複合体を発現する複数の細胞などの１つ以上の細胞をＴＣＲと接触させる工程を含む抗原を選択する工程を含む。本明細書に記載されている方法は、１つ以上のトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド酵母細胞ライブラリーを構築するための方法を含む。
本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を使用して特異的ＴＣＲなどのＴＣＲに結合する抗原を選択または濃縮する方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では本方法は、トランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド酵母細胞ライブラリーなどの１つ以上のトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド細胞ライブラリーを用いてＨＬＡ抗原ポリペプチド複合体を発現する複数の細胞などの１つ以上の細胞をＴＣＲと接触させる工程を含む抗原を選択する工程を含む。本明細書に記載されている方法は、１つ以上のトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド酵母細胞ライブラリーを構築するための方法を含む。
【0116】
１つ以上のトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド酵母細胞ライブラリーの構築後に、本方法は、栄養欠乏酵母培地によりそれぞれがＨＬＡ－抗原ポリペプチドの少なくとも１つを発現している増殖中の酵母細胞の１つ以上の培養物の限定された希釈を含む限界希釈法を用いて１つ以上のトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド酵母細胞ライブラリーを検証する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、希釈した酵母培養物からの酵母を計数し、かつ少なくとも約１０６、１０７、１０８または１０９種の固有のＨＬＡ－抗原ポリペプチド配列（例えばクローン）の多様性によりＨＬＡ－抗原ポリペプチド酵母細胞ライブラリーを推定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、酵母細胞によるエピトープタグの発現を測定して１０６、１０７、１０８または１０９種のクローンのいずれかが酵母細胞表面に提示されるか否かを決定する。例えばエピトープタグの発現は複数の酵母細胞における総ＨＬＡ－抗原ポリペプチド発現の代替値として決定することができ、かつ発現パーセントを計算することができる。いくつかの実施形態では、発現パーセントはＨＬＡ－抗原ポリペプチド配列ライブラリーに対する特定のＨＬＡ－抗原ポリペプチドを発現している酵母細胞の数の推定値である。
【0117】
図２を参照すると、酵母などの複数の細胞２０１を本開示のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をコードする複数の核酸２０２で形質転換、トランスフェクトまたは電気穿孔することができる。ＨＬＡ－抗原ペプチド複合体をコードする複数の核酸を発現している複数の細胞をトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド細胞ライブラリー２０３と呼ぶ。トランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド細胞ライブラリー２０３を細胞増殖により拡張し、複数の細胞によるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体２０４の発現を当該技術分野で知られている方法、例えばガラクトース、ラクトースまたはイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導させる。ＴＣＲと相互作用するＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を発現している細胞をそのＴＣＲ２０５を用いてポジティブ選択する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは基板に固定化されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは１つの細胞または複数の細胞によって発現される。図２に示されているこの選択プロセスは、ＴＣＲと相互作用する１つもしくは少ない数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体に到達するために、１、２、３、４、５回またはそれ以上の回数などの任意の回数の選択ラウンドのために繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体はポリペプチド抗原を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原はヒトにおいて天然に生じないポリペプチド抗原などの天然に生じないポリペプチド抗原である。各選択ラウンド後または最終選択ラウンド後に選択された細胞２０５から抽出された核酸に対して、ディープシークエンシングまたは次世代シークエンシング反応を行うことができる。
【0118】
いくつかの実施形態では、図２に示されているような本開示の方法を用いて少なくとも１×１０４、少なくとも１×１０５、少なくとも１×１０６、少なくとも１×１０７、少なくとも１×１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも１×１０１０、少なくとも１×１０１１、少なくとも１×１０１２、少なくとも１×１０１３、少なくとも１×１０１４または少なくとも１×１０１５種超の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体をスクリーニングする。いくつかの実施形態では、本開示の方法により１０４、１０３、１０２、１０、９、８、７、６、５、４、３または２種未満の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を同定する。いくつかの実施形態では、１、２、３、４または５回の選択ラウンド後に残っている９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、１０、９、８、７、６、５、４、３または２種未満の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４または５回の選択ラウンド後に残っている９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体内に１０、９、８、７、６、５、４、３または２種未満の異なる抗原ポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４または５回の選択ラウンド後に残っている９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は単一のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４または５回の選択ラウンド後に残っている９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、単一のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体内に単一抗原ポリペプチド配列を含む。
【0119】
本明細書に記載されているＨＬＡ－抗原ポリペプチド配列ライブラリーなどのナイーブ酵母ライブラリーの発現は最小限に、ＨＬＡ－Ａ１（Ｇｅｅ ２０１８ｂ）によって提示される単一長さ９ｍｅｒのペプチドのために抗原ポリペプチド配列ライブラリー内の総抗原ポリペプチド配列の約１５％を発現し、かつＨＬＡ－Ａ２（Ｇｅｅ ２０１８ａ）によって提示される混合長さのペプチド（例えば、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ、１２ｍｅｒ）を有する抗原ポリペプチド配列ライブラリーにおいて約５％未満の単一長さのペプチド（例えば８ｍｅｒ）を発現する。８ｍｅｒ長さのペプチドを有する抗原ポリペプチド配列ライブラリーの約５％未満の単一長さの発現にも関わらず、単離されたＴＣＲはインビトロでの共培養アッセイ（Ｇｅｅ ２０１８ａ）において、ＴＣＲを刺激した抗原ポリペプチド配列ライブラリーからの８ｍｅｒ抗原を標的にする。これらの抗原ポリペプチド配列ライブラリーをスクリーニングし、公知の特異性のＴＣＲに対するペプチドを単離する（Ｇｅｅ ２０１８ａ）。機能的ライブラリーのために必要な最小レベルの発現はまだ決定されていないが、データは１５％未満の発現により本明細書に記載されている方法を用いた場合に有用な抗原ポリペプチド配列ライブラリーを得ることができることを示している。
【0120】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＴＣＲと相互作用するポリペプチド抗原を同定する工程をさらに含む。例えばポリペプチド抗原と相互作用しているＴＣＲを決定するための方法は、以下の工程のいずれかを含むことができる。
１．作製およびＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体構築物の設計：いくつかの実施形態では工程（１）は、限定されるものではないが、１つ以上のＤＮＡ構築物を作製することおよび／または天然に生じるタンパク質配列、合成タンパク質配列またはそれらの組み合わせを有する１つ以上のＨＬＡポリペプチドを提示するための設計を含む。
２．酵母発現によるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体構築物の試験発現：いくつかの実施形態では工程（２）は、限定されるものではないが、１つ以上の電気もしくは化学的にコンピテントな酵母をＨＬＡポリペプチドなどの目的のＨＬＡを含む単一のペプチドまたはペプチドのライブラリーをコードするプラスミドで形質転換することを含む。プラスミドは、Ａｇａ２のＮ末端から酵母タンパク質を提示するように単一のペプチド構築物またはペプチド構築物のライブラリーのために設計する。いくつかの実施形態では発現確認は、エピトープタグ（例えば、Ｖ５、ＶＳＶｇ、ｃ－Ｍｙｃ、ＨＡ）の抗体染色、あるいは単一のペプチド－ＨＬＡ構築物またはペプチド－ＨＬＡ構築物のライブラリーを提示している酵母の蛍光性ＴＣＲテトラマー、ダイマーもしくはデキストラマー染色を含むことができる。
３．ＨＬＡ提示のための任意の検証工程：いくつかの実施形態では工程（３）は、限定されるものではないが、工程（２）の単一のペプチド－ＨＬＡ構築物またはペプチド－ＨＬＡ構築物のライブラリーを提示している酵母のエピトープタグまたは蛍光性ＴＣＲテトラマー、ダイマーもしくはデキストラマー染色の抗体ベースの染色を含む。いくつかの実施形態では検証は、公知の特異性を有するＴＣＲによりペプチド－ＨＬＡ構築物を染色すること、あるいはＨＬＡによって提示される多様なペプチドライブラリーを選択することも含むことができる。
４．提示のためにＨＬＡを再設計するための任意の工程：いくつかの実施形態では工程（４）は、限定されるものではないが、変異性ポリメラーゼによるランダム突然変異誘発、その後の化学的および／または電気的にコンピテントな酵母の中への電気穿孔を含む。本技術の１つのライブラリーおよび／または複数のライブラリーを発現している酵母細胞は、目的のＴＣＲに基づく磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による細胞分離により選択する。いくつかの実施形態では、単離された酵母クローンをシークエンシングまたはディープシークエンシングして、目的の抗原性ペプチドを適切に提示するあらゆる機能的ＨＬＡ突然変異体を同定する。いくつかの実施形態では、構築物またはライブラリーが不適切に提示されている場合に工程（４）を含める。
５．ペプチド－ＨＬＡライブラリーの作製：いくつかの実施形態では工程（５）は、限定されるものではないが、ランダムコード化ペプチドリガンドまたは明示的コード化ペプチドリガンドを含む。例えばランダムコード化ペプチドリガンドまたは明示的コード化ペプチドリガンドは、各ＨＬＡ対立遺伝子が呈することができるそのペプチドへの嗜好に基づいて各ＨＬＡ対立遺伝子のために一意的に設計されている。いくつかの実施形態では工程（５）は、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応から遺伝物質を生成することも含む。
６．目的のＴＣＲによるペプチド－ＨＬＡライブラリーの選択：いくつかの実施形態では工程（６）は、限定されるものではないが、繰り返しのＭＡＣＳベースもしくはＦＡＣＳベースの選択を含む。例えば目的のＴＣＲまたは１つ以上の抗原結合ドメインを有する他の巨大分子はベイトとして機能し、磁気ビーズ、ストレプトアビジン、デキストランまたは多量体化のために適した他の基板上で多量体化することができる。いくつかの実施形態では、１回以上の選択ラウンドからの結果は、ＴＣＲにより１つ以上の酵母細胞を物理的に単離することを含む。単離後に酵母を増殖させ、タンパク質発現のために再誘導する。これらの繰り返しのラウンドにより結合している酵母集団を濃縮する。
７．ディープシークエンシングおよびデータ分析：このプロセスは、酵母ライブラリーの遺伝情報を抽出し、選択し、かつ選択されたライブラリーからのペプチドの性質を同定するために産物をシークエンシングすることを含むことができる。次いでこれらのデータを分析してＴＣＲの潜在的標的を同定し、かつ／またはＴＣＲの特異性に関する予測を行うためにアルゴリズムの中に提供する。
１．作製およびＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体構築物の設計：いくつかの実施形態では工程（１）は、限定されるものではないが、１つ以上のＤＮＡ構築物を作製することおよび／または天然に生じるタンパク質配列、合成タンパク質配列またはそれらの組み合わせを有する１つ以上のＨＬＡポリペプチドを提示するための設計を含む。
２．酵母発現によるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体構築物の試験発現：いくつかの実施形態では工程（２）は、限定されるものではないが、１つ以上の電気もしくは化学的にコンピテントな酵母をＨＬＡポリペプチドなどの目的のＨＬＡを含む単一のペプチドまたはペプチドのライブラリーをコードするプラスミドで形質転換することを含む。プラスミドは、Ａｇａ２のＮ末端から酵母タンパク質を提示するように単一のペプチド構築物またはペプチド構築物のライブラリーのために設計する。いくつかの実施形態では発現確認は、エピトープタグ（例えば、Ｖ５、ＶＳＶｇ、ｃ－Ｍｙｃ、ＨＡ）の抗体染色、あるいは単一のペプチド－ＨＬＡ構築物またはペプチド－ＨＬＡ構築物のライブラリーを提示している酵母の蛍光性ＴＣＲテトラマー、ダイマーもしくはデキストラマー染色を含むことができる。
３．ＨＬＡ提示のための任意の検証工程：いくつかの実施形態では工程（３）は、限定されるものではないが、工程（２）の単一のペプチド－ＨＬＡ構築物またはペプチド－ＨＬＡ構築物のライブラリーを提示している酵母のエピトープタグまたは蛍光性ＴＣＲテトラマー、ダイマーもしくはデキストラマー染色の抗体ベースの染色を含む。いくつかの実施形態では検証は、公知の特異性を有するＴＣＲによりペプチド－ＨＬＡ構築物を染色すること、あるいはＨＬＡによって提示される多様なペプチドライブラリーを選択することも含むことができる。
４．提示のためにＨＬＡを再設計するための任意の工程：いくつかの実施形態では工程（４）は、限定されるものではないが、変異性ポリメラーゼによるランダム突然変異誘発、その後の化学的および／または電気的にコンピテントな酵母の中への電気穿孔を含む。本技術の１つのライブラリーおよび／または複数のライブラリーを発現している酵母細胞は、目的のＴＣＲに基づく磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による細胞分離により選択する。いくつかの実施形態では、単離された酵母クローンをシークエンシングまたはディープシークエンシングして、目的の抗原性ペプチドを適切に提示するあらゆる機能的ＨＬＡ突然変異体を同定する。いくつかの実施形態では、構築物またはライブラリーが不適切に提示されている場合に工程（４）を含める。
５．ペプチド－ＨＬＡライブラリーの作製：いくつかの実施形態では工程（５）は、限定されるものではないが、ランダムコード化ペプチドリガンドまたは明示的コード化ペプチドリガンドを含む。例えばランダムコード化ペプチドリガンドまたは明示的コード化ペプチドリガンドは、各ＨＬＡ対立遺伝子が呈することができるそのペプチドへの嗜好に基づいて各ＨＬＡ対立遺伝子のために一意的に設計されている。いくつかの実施形態では工程（５）は、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応から遺伝物質を生成することも含む。
６．目的のＴＣＲによるペプチド－ＨＬＡライブラリーの選択：いくつかの実施形態では工程（６）は、限定されるものではないが、繰り返しのＭＡＣＳベースもしくはＦＡＣＳベースの選択を含む。例えば目的のＴＣＲまたは１つ以上の抗原結合ドメインを有する他の巨大分子はベイトとして機能し、磁気ビーズ、ストレプトアビジン、デキストランまたは多量体化のために適した他の基板上で多量体化することができる。いくつかの実施形態では、１回以上の選択ラウンドからの結果は、ＴＣＲにより１つ以上の酵母細胞を物理的に単離することを含む。単離後に酵母を増殖させ、タンパク質発現のために再誘導する。これらの繰り返しのラウンドにより結合している酵母集団を濃縮する。
７．ディープシークエンシングおよびデータ分析：このプロセスは、酵母ライブラリーの遺伝情報を抽出し、選択し、かつ選択されたライブラリーからのペプチドの性質を同定するために産物をシークエンシングすることを含むことができる。次いでこれらのデータを分析してＴＣＲの潜在的標的を同定し、かつ／またはＴＣＲの特異性に関する予測を行うためにアルゴリズムの中に提供する。
【0121】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本明細書に記載されているトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド細胞ライブラリーおよびＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の抗原は、所与のＴＣＲと共に使用することができる。例えばＴＣＲまたは１つ以上の抗原結合ドメインを有する他の巨大分子はポジティブセレクターすなわちベイトであり、抗原（例えばＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体）に結合すると、その同種抗原を同定する。本明細書に記載されているＴＣＲは天然または外因性（例えば組換え型）であり、かつ一次Ｔ細胞、不死化Ｔ細胞または非Ｔ細胞などの細胞によって発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはカラム、ポリスチレンプレートまたはマルチウェルプレートのウェルまたはビーズなどの固体担体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはビーズ上に固定化された複数のＴＣＲとして多量体化されている。例えばＴＣＲは、限定されるものではないが磁気ビーズ、ストレプトアビジンまたはデキストラン上に多量体化させることができる。
本明細書に記載されているトランスジェニックＨＬＡ－抗原ポリペプチド細胞ライブラリーおよびＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の抗原は、所与のＴＣＲと共に使用することができる。例えばＴＣＲまたは１つ以上の抗原結合ドメインを有する他の巨大分子はポジティブセレクターすなわちベイトであり、抗原（例えばＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体）に結合すると、その同種抗原を同定する。本明細書に記載されているＴＣＲは天然または外因性（例えば組換え型）であり、かつ一次Ｔ細胞、不死化Ｔ細胞または非Ｔ細胞などの細胞によって発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはカラム、ポリスチレンプレートまたはマルチウェルプレートのウェルまたはビーズなどの固体担体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはビーズ上に固定化された複数のＴＣＲとして多量体化されている。例えばＴＣＲは、限定されるものではないが磁気ビーズ、ストレプトアビジンまたはデキストラン上に多量体化させることができる。
【0122】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは目的のＴＣＲの少なくとも１つまたは複数の結合するドメイン、例えばＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δを含む可溶性タンパク質である。可溶性タンパク質は一本鎖またはヘテロダイマーであってもよい。いくつかの実施形態では可溶性ＴＣＲは、１つのポリペプチドのＣ末端におけるビオチンアクセプターペプチド配列の付加によって修飾されている。アクセプターペプチドにおけるビオチン化後にＴＣＲを多量体化させるか、ビオチン結合パートナー、例えばアビジン、ストレプトアビジン、トラプタビジン（ｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ）、ニュートラアビジンなどに結合させることにより基板に追加することができる。いくつかの実施形態では、ビオチン結合パートナーは検出可能なラベル、例えば蛍光体、質量ラベルなどを含むことができ、あるいは粒子、例えば常磁性粒子に結合させることができる。ＴＣＲに結合されたリガンドの選択は、当該技術分野で知られているようなフローサイトメトリーおよび磁気選択などにより行うことができる。
【0123】
参照により本明細書に組み込まれる上記材料および／またはあらゆる他の材料が本開示と矛盾する場合、本開示が優先される。
【0124】
以下の実施例は本開示の技術のさらなる代表的な実施形態を提供する。
【実施例0125】
以下の実施例は本技術の実施形態をさらに例示するために提供されており、本技術の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の実施形態またはその特徴が言及されている場合、それは単に例示のためのものであり、特に記載がない限り本技術を限定するものではない。当業者であれば、本発明力を行使せず、かつ本技術の範囲から逸脱することなく同等の手段を開発することができるであろう。当然のことながら本技術の境界内に留まっている限り、本明細書に記載されている手順において多くの変形を行うことができる。そのような変形は本開示の技術の範囲内に含まれることが意図されている。従って本開示の技術の実施形態は以下の代表的な実施例に記載されている。
【0126】
実施例１：抗原ポリペプチドライブラリーの設計
本実施例は、ポリペプチド抗原ＨＬＡ複合体と共に使用するための本開示の抗原ライブラリーの設計について説明する。各ＨＬＡ対立遺伝子のためにアンカー残基を設計および選択するための例示的なアルゴリズムは以下のとおりであり、ｗｗｗ．ＩＥＤＢ．ｏｒｇ／：などのウェブサイトからのエピトープリガンドに結合する公知のＨＬＡのデータを使用する。
本実施例は、ポリペプチド抗原ＨＬＡ複合体と共に使用するための本開示の抗原ライブラリーの設計について説明する。各ＨＬＡ対立遺伝子のためにアンカー残基を設計および選択するための例示的なアルゴリズムは以下のとおりであり、ｗｗｗ．ＩＥＤＢ．ｏｒｇ／：などのウェブサイトからのエピトープリガンドに結合する公知のＨＬＡのデータを使用する。
【0127】
工程１：数百のペプチドまたは数千のペプチドを含み得る所与の対立遺伝子に結合するポリペプチドのリストをダウンロードする。
【0128】
工程２：ダウンロードした公知のペプチドに基づくペプチドの位置ごとに残基の頻度行列を構築する。
【0129】
工程３：各位置における上位４つの残基のカットオフを使用することにより、ライブラリー設計のために「アンカー」の組成を選択する。
【0130】
実施例２：ｐＨＬＡライブラリーの電気穿孔
本実施例は、酵母細胞を全てのＨＬＡアロタイプを有し、かつアミノ酸長８～１１（８ｍｅｒ～１１ｍｅｒ）のペプチドを使用している本開示の例示的な抗原ライブラリーをコードする核酸で電気穿孔する工程について記載している。本実施例では、酵母細胞をＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の抗原ライブラリー（ｐＨＬＡライブラリー）をコードする核酸で電気穿孔した。
本実施例は、酵母細胞を全てのＨＬＡアロタイプを有し、かつアミノ酸長８～１１（８ｍｅｒ～１１ｍｅｒ）のペプチドを使用している本開示の例示的な抗原ライブラリーをコードする核酸で電気穿孔する工程について記載している。本実施例では、酵母細胞をＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の抗原ライブラリー（ｐＨＬＡライブラリー）をコードする核酸で電気穿孔した。
【0131】
酵母表面でのｐＨＬＡの発現のための電気穿孔方法は以下のとおりである。
【0132】
０日目：
１．増殖中の酵母培養物を拡張するために３つの２．５Ｌバッフル付フラスコおよび１つの２５０ｍＬバッフル付フラスコを高圧滅菌する。
２．バクトペプトン、グルコースおよび酵母抽出物を含む酵母ペプトンデキストロース培地（ＹＰＤ）を調製する。
３．２つのＥＢＹ１００酵母培養物５ｍｌを調製して３０℃で一晩振盪させる。
４．ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩまたはＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化されるｐＹＡＬ＿３Ｔプラスミド（１０μｇ）の制限酵素ならびに配列番号２１０～４１１のライブラリーを含むインサート（５０μｇ）を調製する。ｐＹＡＬ＿３Ｔベクター（配列番号４８５）はｐＣＴベクター（配列番号４８６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の誘導体であり（表８）、それらのマップは図３Ａおよび図３Ｂに提供されている。ｐＹＡＬ＿３ＴおよびｐＣＴの特徴は表９および表１０にそれぞれ含まれている。ｐＹＡＬ＿３Ｔは少なくともｐＨＬＡライブラリーのＣ末端にある提示タンパク質足場（Ａｇａ２）の配向、ヒトのＢ２Ｍの付加および連結リンカーによってｐＣＴとは異なる。ｐＹＡＬ＿３Ｔについては記載されている（Ｇｅｅ ２０１８ａ）。
１．増殖中の酵母培養物を拡張するために３つの２．５Ｌバッフル付フラスコおよび１つの２５０ｍＬバッフル付フラスコを高圧滅菌する。
２．バクトペプトン、グルコースおよび酵母抽出物を含む酵母ペプトンデキストロース培地（ＹＰＤ）を調製する。
３．２つのＥＢＹ１００酵母培養物５ｍｌを調製して３０℃で一晩振盪させる。
４．ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩまたはＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化されるｐＹＡＬ＿３Ｔプラスミド（１０μｇ）の制限酵素ならびに配列番号２１０～４１１のライブラリーを含むインサート（５０μｇ）を調製する。ｐＹＡＬ＿３Ｔベクター（配列番号４８５）はｐＣＴベクター（配列番号４８６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の誘導体であり（表８）、それらのマップは図３Ａおよび図３Ｂに提供されている。ｐＹＡＬ＿３ＴおよびｐＣＴの特徴は表９および表１０にそれぞれ含まれている。ｐＹＡＬ＿３Ｔは少なくともｐＨＬＡライブラリーのＣ末端にある提示タンパク質足場（Ａｇａ２）の配向、ヒトのＢ２Ｍの付加および連結リンカーによってｐＣＴとは異なる。ｐＹＡＬ＿３Ｔについては記載されている（Ｇｅｅ ２０１８ａ）。
【表8】
【表9】
【表10】
【0133】
１日目：２つの酵母培養物のそれぞれ１００μｌを５ｍＬの新鮮なＹＰＤに添加することにより０日目の工程３からの２つの酵母培養物を継代し、３０℃で一晩振盪させる。
【0134】
２日目：
１．１日目からの一晩培養物の光学濃度（ＯＤ）を測定する。
２．２．５Ｌバッフル付フラスコ中のＹＰＤを用いて、工程１からのＯＤ０．３の酵母培養物３００ｍＬにより新しい培養物を調製する。
３．３ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／１Ｍ １，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を調製する。
４．１５ｍＬの２Ｍ酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）を調製する
５．培養物を１．６～２．０のＯＤまで増殖させる。
６．３ｍＬのＴｒｉｓ／ＤＴＴを添加する。
７．１５ｍＬの２Ｍ ＬｉＡｃ／ＴＥを添加する。
８．２２５毎分回転数（ｒｐｍ）で振盪しながら培養物を３０℃で１５分間増殖させる。
９．培養物を３０００×ｇで３分間遠心分離する。
１０．そのペレットを５０ｍＬの冷たいＥ緩衝液の中に再懸濁する。
１１．工程１０からの懸濁液を３０００×ｇおよび４℃で３分間遠心分離する。
１２．工程１０および工程１１を２回繰り返す。
１３．残留する緩衝液を除去する。
１４．ペレットを６００μＬのＥ緩衝液に再懸濁する。
１５．０日目の工程４からの５０μｇのインサートおよび１０μｇの消化したプラスミドを添加し、緩衝液、インサート、プラスミドおよび酵母の総体積を約１ｍＬにしなければならない。
１６．工程１５からの１５０μＬの懸濁液を氷冷した２ｍｍギャップの電気穿孔用キュベットの中に等分する。
１７．各キュベットを２．５ｋＶで電気穿孔する。時定数は３～４ｍｓ１でなければならない。
１８．３つの１ｍＬ体積の冷たいＹＰＤを添加し、次いで総体積をＹＰＤにより２００ｍＬにする。
１９．電気穿孔した酵母を２５０ｍＬバッフル付フラスコ内で３０℃および２２５ｒｐｍで１時間培養する。
２０．培養物を３５００×ｇで３分間遠心分離して酵母細胞ペレットを形成し、上澄みをデカントし、酵母細胞ペレットを１０ｍＬのＳＤＣＡＡ（ｐＨ４．５のアミノ酸を含まないが硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸一水和物を含む酵母ニトロゲンベースも含むデキストロースカザミノ酸）の中に再懸濁する。
１．１日目からの一晩培養物の光学濃度（ＯＤ）を測定する。
２．２．５Ｌバッフル付フラスコ中のＹＰＤを用いて、工程１からのＯＤ０．３の酵母培養物３００ｍＬにより新しい培養物を調製する。
３．３ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／１Ｍ １，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を調製する。
４．１５ｍＬの２Ｍ酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）を調製する
５．培養物を１．６～２．０のＯＤまで増殖させる。
６．３ｍＬのＴｒｉｓ／ＤＴＴを添加する。
７．１５ｍＬの２Ｍ ＬｉＡｃ／ＴＥを添加する。
８．２２５毎分回転数（ｒｐｍ）で振盪しながら培養物を３０℃で１５分間増殖させる。
９．培養物を３０００×ｇで３分間遠心分離する。
１０．そのペレットを５０ｍＬの冷たいＥ緩衝液の中に再懸濁する。
１１．工程１０からの懸濁液を３０００×ｇおよび４℃で３分間遠心分離する。
１２．工程１０および工程１１を２回繰り返す。
１３．残留する緩衝液を除去する。
１４．ペレットを６００μＬのＥ緩衝液に再懸濁する。
１５．０日目の工程４からの５０μｇのインサートおよび１０μｇの消化したプラスミドを添加し、緩衝液、インサート、プラスミドおよび酵母の総体積を約１ｍＬにしなければならない。
１６．工程１５からの１５０μＬの懸濁液を氷冷した２ｍｍギャップの電気穿孔用キュベットの中に等分する。
１７．各キュベットを２．５ｋＶで電気穿孔する。時定数は３～４ｍｓ１でなければならない。
１８．３つの１ｍＬ体積の冷たいＹＰＤを添加し、次いで総体積をＹＰＤにより２００ｍＬにする。
１９．電気穿孔した酵母を２５０ｍＬバッフル付フラスコ内で３０℃および２２５ｒｐｍで１時間培養する。
２０．培養物を３５００×ｇで３分間遠心分離して酵母細胞ペレットを形成し、上澄みをデカントし、酵母細胞ペレットを１０ｍＬのＳＤＣＡＡ（ｐＨ４．５のアミノ酸を含まないが硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸一水和物を含む酵母ニトロゲンベースも含むデキストロースカザミノ酸）の中に再懸濁する。
【0135】
２日目：力価を決定する
１．９９０μＬのＳＤＣＡＡを４つのエッペンドルフ管のそれぞれに添加する。
２．上記工程２０からの１０μＬを９９０μＬのＳＤＣＡＡを含む１つの管に添加する。
３．１００μＬの１０４溶液を９９０μＬのＳＤＣＡＡのみを含む管の中にピペットで移す。
４．１００μＬの１０５溶液を９９０μＬのＳＤＣＡＡのみを含む管の中にピペットで移す。
５．１００μＬの１０６溶液を９９０μＬのＳＤＣＡＡのみを含む管の中にピペットで移す。
６．工程２～５における１００μＬの各希釈物を別個のＳＤＣＡＡプレートの上に広げ、３０℃で３日間インキュベートする。プレート上のコロニーを計数して力価を決定する。工程２からの計数したコロニーはライブラリー×１０４の多様性を表す。工程３からの計数したコロニーはライブラリー×１０５の多様性を表す。工程４からの計数したコロニーはライブラリー×１０６の多様性を表す。工程５からの計数したコロニーはライブラリー×１０７の多様性を表す。
７．４９０ｍＬのｐＨ４．５のＳＤＣＡＡを工程２０からの残りの細胞懸濁液に添加し、３０℃で一晩培養する。
１．９９０μＬのＳＤＣＡＡを４つのエッペンドルフ管のそれぞれに添加する。
２．上記工程２０からの１０μＬを９９０μＬのＳＤＣＡＡを含む１つの管に添加する。
３．１００μＬの１０４溶液を９９０μＬのＳＤＣＡＡのみを含む管の中にピペットで移す。
４．１００μＬの１０５溶液を９９０μＬのＳＤＣＡＡのみを含む管の中にピペットで移す。
５．１００μＬの１０６溶液を９９０μＬのＳＤＣＡＡのみを含む管の中にピペットで移す。
６．工程２～５における１００μＬの各希釈物を別個のＳＤＣＡＡプレートの上に広げ、３０℃で３日間インキュベートする。プレート上のコロニーを計数して力価を決定する。工程２からの計数したコロニーはライブラリー×１０４の多様性を表す。工程３からの計数したコロニーはライブラリー×１０５の多様性を表す。工程４からの計数したコロニーはライブラリー×１０６の多様性を表す。工程５からの計数したコロニーはライブラリー×１０７の多様性を表す。
７．４９０ｍＬのｐＨ４．５のＳＤＣＡＡを工程２０からの残りの細胞懸濁液に添加し、３０℃で一晩培養する。
【0136】
３日目：２４時間後に工程８からの継代のＯＤを測定する。そのＯＤは少なくとも５でなければならない。総体積が５００ｍＬのＳＤＣＡＡにおいて培養物をＯＤが１になるまで継代する。
【0137】
４日目：総体積が５００ｍＬのＳＤＣＡＡにおいてＯＤが１になるまで細胞を継代する。
【0138】
５日目：２日目からの工程１８を行ってから７２時間後に、ＳＧＣＡＡ（ｐＨ４．５のアミノ酸を含まないが硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸一水和物を含む酵母ニトロゲンベースも含むガラクトースカザミノ酸）を誘導する。
【0139】
レシピ：
１）Ｅ緩衝液、５００ｍｌ
－０．６ｇのトリス塩基
－９１．０９ｇのソルビトール（１Ｍ）
－５００ｍｌの最終体積までｄｄＨ２Ｏ中に７３．５０ｍｇのＣａＣｌ２（１ｍＭ；１Ｍの原液を調製することを考慮）（ｐＨ７．５まで）。０．２２μｍの膜で濾過
２）１Ｍ Ｔｒｉｓ／１Ｍ ＤＴＴ、３ｍｌ
－３ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に０．４６２ｇの１，４－ジチオスレイトール（濾過によって滅菌）
３）２Ｍ ＬｉＡｃ／ＴＥ溶液（１５ｍｌ）
－１０ｍＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に１．９８ｇのＬｉＡｃ（濾過によって滅菌）
１）Ｅ緩衝液、５００ｍｌ
－０．６ｇのトリス塩基
－９１．０９ｇのソルビトール（１Ｍ）
－５００ｍｌの最終体積までｄｄＨ２Ｏ中に７３．５０ｍｇのＣａＣｌ２（１ｍＭ；１Ｍの原液を調製することを考慮）（ｐＨ７．５まで）。０．２２μｍの膜で濾過
２）１Ｍ Ｔｒｉｓ／１Ｍ ＤＴＴ、３ｍｌ
－３ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に０．４６２ｇの１，４－ジチオスレイトール（濾過によって滅菌）
３）２Ｍ ＬｉＡｃ／ＴＥ溶液（１５ｍｌ）
－１０ｍＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に１．９８ｇのＬｉＡｃ（濾過によって滅菌）
【0140】
実施例３：ｐＨＬＡ発現の特性評価
本実施例は、実施例２の電気穿孔した酵母細胞表面でのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の発現を特性評価する工程について説明する。これらの発現測定は、酵母細胞の表面に提示されたペプチド－ＭＨＣのレベルを決定し、かつランダム酵母ディスプレイライブラリーの機能性を示すためのＦＡＣＳ分析を含む。酵母表面でのｐＨＬＡの発現についての特性評価方法は以下のとおりである。
本実施例は、実施例２の電気穿孔した酵母細胞表面でのＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体の発現を特性評価する工程について説明する。これらの発現測定は、酵母細胞の表面に提示されたペプチド－ＭＨＣのレベルを決定し、かつランダム酵母ディスプレイライブラリーの機能性を示すためのＦＡＣＳ分析を含む。酵母表面でのｐＨＬＡの発現についての特性評価方法は以下のとおりである。
【0141】
材料
１．実施例２からの酵母ライブラリー
２．ＰＢＳＭ（１×ＰＢＳ、１ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４；濾過済）
３．抗ｍｙｃ（ＦＩＴＣ蛍光体結合）抗体
４．９６ウェルのＵ底プレート
任意：
５．抗Ｖ５（６４７蛍光体結合）抗体
６．抗ＨＡ（ＢＶ４２１蛍光体結合）抗体
７．抗ＶＳＶ（ＰＥ蛍光体結合）抗体
１．実施例２からの酵母ライブラリー
２．ＰＢＳＭ（１×ＰＢＳ、１ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４；濾過済）
３．抗ｍｙｃ（ＦＩＴＣ蛍光体結合）抗体
４．９６ウェルのＵ底プレート
任意：
５．抗Ｖ５（６４７蛍光体結合）抗体
６．抗ＨＡ（ＢＶ４２１蛍光体結合）抗体
７．抗ＶＳＶ（ＰＥ蛍光体結合）抗体
【0142】
細胞の調製
１．ＮａｎｏＤｒｏｐで酵母培養物の光学濃度を測定する。０～１のＯＤ６００の読み取りは１：２０の培養物：ＳＤＣＡＡ希釈で２０℃で２～３日間誘導した培養物では線形範囲にある。
２．酵母培養物の試料を９６ウェルプレートのウェルの中に移す。約１０のＯＤ６００を有する酵母培養物の場合は２５μＬの培養物を使用する。単色および染色されていない対照を含める。
３．ＰＢＳＭを２００μｌの最終体積まで各ウェルに添加する。
４．９６ウェルプレートを２５００×ｇで２分間遠心分離する。
５．上澄みを除去する。
１．ＮａｎｏＤｒｏｐで酵母培養物の光学濃度を測定する。０～１のＯＤ６００の読み取りは１：２０の培養物：ＳＤＣＡＡ希釈で２０℃で２～３日間誘導した培養物では線形範囲にある。
２．酵母培養物の試料を９６ウェルプレートのウェルの中に移す。約１０のＯＤ６００を有する酵母培養物の場合は２５μＬの培養物を使用する。単色および染色されていない対照を含める。
３．ＰＢＳＭを２００μｌの最終体積まで各ウェルに添加する。
４．９６ウェルプレートを２５００×ｇで２分間遠心分離する。
５．上澄みを除去する。
【0143】
染色細胞
１．各細胞ペレットを１００μｌのＰＢＳＭに再懸濁する。
２．必要に応じて１μｌの抗体を添加する。
３．光から保護された状態（例えば暗い状態）で４℃で３０分間インキュベートする。
１．各細胞ペレットを１００μｌのＰＢＳＭに再懸濁する。
２．必要に応じて１μｌの抗体を添加する。
３．光から保護された状態（例えば暗い状態）で４℃で３０分間インキュベートする。
【0144】
細胞の洗浄およびｐＨＬＡ発現の決定
１．９６ウェルプレートを２５００×ｇで２分間遠心分離する。
２．上澄みを除去する。
３．各ペレットを２００μｌのＰＢＳＭに再懸濁する。
４．９６ウェルプレートを２５００×ｇで２分間遠心分離する。
５．上澄みを除去する。
６．各ペレットを２００μｌのＰＢＳＭに再懸濁する。
７．ＣｙｔｏＦｌｅｘを用いて各ウェル内の試料を分析する。
１．９６ウェルプレートを２５００×ｇで２分間遠心分離する。
２．上澄みを除去する。
３．各ペレットを２００μｌのＰＢＳＭに再懸濁する。
４．９６ウェルプレートを２５００×ｇで２分間遠心分離する。
５．上澄みを除去する。
６．各ペレットを２００μｌのＰＢＳＭに再懸濁する。
７．ＣｙｔｏＦｌｅｘを用いて各ウェル内の試料を分析する。
【0145】
結果：ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体（配列番号８、１１、１４、１８、２１＋２４、２８、３２、３６、４０～４４、４７、５０、５３、５６、６５、７５、６９、７７＋８０、８９、９５、９９、１０２＋１０６、１０８、１１１＋１１４、１１７＋１２０、１２４および１２５のペプチド）の発現をフローサイトメトリーにより決定し、それが図４に示されている。ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体によって発現されるエピトープタグを標的にする抗体を使用して電気穿孔した酵母細胞を染色した。ＦＩＴＣ－Ａ染色はｃ－Ｍｙｃタグを発現しているＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体に対応している。抗体－エピトープタグの結合をｐＨＬＡ発現を決定するためのプロキシとして使用し、それは図４に示されているように配列番号５６の場合の８．９９％から配列番号１７７＋１８０の場合の２６．３％の発現までの範囲であった。
【0146】
実施例４：ｐＨＬＡ発現の機能的検証
本実施例は、候補ＴＣＲにより実施例２の電気穿孔した酵母細胞表面でのｐＨＬＡの発現を機能的に検証する工程について説明する。候補ＴＣＲがアロタイプに合致している場合にｐＨＬＡの期待される標的抗原を最大６つのライブラリーから同定することができる。酵母表面でのｐＨＬＡの発現の機能的検証方法は以下のとおりである：
本実施例は、候補ＴＣＲにより実施例２の電気穿孔した酵母細胞表面でのｐＨＬＡの発現を機能的に検証する工程について説明する。候補ＴＣＲがアロタイプに合致している場合にｐＨＬＡの期待される標的抗原を最大６つのライブラリーから同定することができる。酵母表面でのｐＨＬＡの発現の機能的検証方法は以下のとおりである：
【0147】
本明細書に開示されているようなＨＬＡ－抗原ポリペプチド配列ライブラリーは最小限に、ＨＬＡ－Ａ１（Ｇｅｅ ２０１８ｂ）によって提示される単一長さ９ｍｅｒのペプチドの場合は約２５％の総抗原ポリペプチド配列を発現し、かつＨＬＡ－Ａ２（Ｇｅｅ ２０１８ａ）によって提示される混合長さのペプチド（例えば、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ）の場合は約５％未満の単一長さのペプチド（例えば８ｍｅｒ）を発現する。８ｍｅｒ長さのペプチドを有するＨＬＡ－抗原ポリペプチド配列の約５％未満の単一長さのペプチドの発現にも関わらず、目的の単離されたＴＣＲはＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体からの８ｍｅｒの抗原を標的にする。目的の単離されたこれらのＴＣＲは、インビトロ共培養アッセイにおいて１つ以上のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体によって刺激された（Ｇｅｅ ２０１８ａ；その中の図５Ｃおよび図７Ａを参照）。ＨＬＡ－抗原ポリペプチドライブラリーをスクリーニングし、公知の特異性のＴＣＲに結合するペプチドを単離した（Ｇｅｅ ２０１８ａ）。本開示の機能的ＨＬＡ－抗原ポリペプチドライブラリーのために必要な最小レベルの発現はまだ決定されていないが、データは１５％未満の発現により本明細書に記載されている方法を用いた場合に有用なＨＬＡ－抗原ポリペプチドライブラリーを得ることができることを示している。
【0148】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に図示および記載されているが、そのような実施形態は単なる一例として提供されていることが当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく数多くの変形、変更および置換を当業者は思いつくであろう。当然のことながら本明細書に記載されている本発明の実施形態に対する様々な代替形態を本発明を実施する際に用いてもよい。
【0149】
本明細書において参照されている全ての公報、特許出願、発行特許およびそれ以外の文献は、個々の公報、特許出願、発行特許またはそれ以外の文献の内容全体が参照により組み込まれるために具体的かつ個々に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる本文に含まれている定義は本開示における定義と矛盾する場合には除外される。
【0150】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－抗原ポリペプチド複合体を含む抗原スクリーニングライブラリーであって、前記ＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、
ａ）ペプチド結合溝を含むＨＬＡポリペプチドと、
ｂ）配列番号１～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、かつ前記ＨＬＡポリペプチドの前記ペプチド結合溝に特異的に結合するランダム化抗原ポリペプチドと、
ｃ）ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド
を含み、
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体は、配列番号４２７～４５５のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含み、かつ
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体は、
Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｂ５７、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥの各ＨＬＡポリペプチドを含む、抗原スクリーニングライブラリー。
ａ）ペプチド結合溝を含むＨＬＡポリペプチドと、
ｂ）配列番号１～２０９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含み、かつ前記ＨＬＡポリペプチドの前記ペプチド結合溝に特異的に結合するランダム化抗原ポリペプチドと、
ｃ）ベータ２（β２）ミクログロブリンポリペプチド
を含み、
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体は、配列番号４２７～４５５のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含み、かつ
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体は、
Ａ３、Ａ１１、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２６、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３３、Ａ６８、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ４０、Ｂ４４、Ｂ５１、Ｂ５３、Ｂ５７、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＥの各ＨＬＡポリペプチドを含む、抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項2】
前記複数のＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体は、少なくとも約１０５種の異なるランダム化抗原ポリペプチドを含む少なくとも約１０５種の異なるＨＬＡ－抗原ポリペプチド複合体を含む、請求項１に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項3】
前記ＨＬＡポリペプチド、前記ランダム化抗原ポリペプチドおよび前記β２－ミクログロブリンポリペプチドは、単一のポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項4】
前記単一のポリペプチドは、第１の柔軟なポリペプチドリンカーおよび第２の柔軟なポリペプチドリンカーをさらに含む、請求項３に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項5】
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記ランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離するか、
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記ランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離するか、
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記β２－ミクログロブリンポリペプチドを前記ＨＬＡポリペプチドから分離するか、
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記ＨＬＡポリペプチドから分離するか、
前記β２－ミクログロブリンポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ランダム化抗原ポリペプチドのＮ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記ランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離するか、または、
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ランダム化抗原ポリペプチドのＣ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記β２－ミクログロブリンポリペプチドを前記ランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記ＨＬＡポリペプチドから分離する、請求項４に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドのＮ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記ランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離するか、
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＮ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記β２－ミクログロブリンポリペプチドを前記ＨＬＡポリペプチドから分離するか、
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドのＣ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記ＨＬＡポリペプチドから分離するか、
前記β２－ミクログロブリンポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ＨＬＡポリペプチドのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ランダム化抗原ポリペプチドのＮ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ＨＬＡポリペプチドを前記ランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記β２－ミクログロブリンポリペプチドから分離するか、または、
前記ランダム化抗原ポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記β２－ミクログロブリンのＣ末端にあり、かつ前記ＨＬＡポリペプチドは前記単一のポリペプチド上の前記ランダム化抗原ポリペプチドのＣ末端にあり、任意に、前記第１の柔軟なポリペプチドリンカーは前記β２－ミクログロブリンポリペプチドを前記ランダム化抗原ポリペプチドから分離し、かつ第２の柔軟なポリペプチドリンカーは前記ランダム化抗原ポリペプチドを前記ＨＬＡポリペプチドから分離する、請求項４に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項6】
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体の各ＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいないか、
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含むか、または、
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでおらず、かつ前記複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいる、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含むか、または、
前記複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでおらず、かつ前記複数のＨＬＡ－抗原複合体の少なくとも１つのＨＬＡ－抗原複合体はエピトープタグを含んでいる、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項7】
前記エピトープタグはＦＬＡＧタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、ＨＩＳ－タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＶＳＶｇタグまたはＶ５タグを含む、請求項６に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項8】
前記ＨＬＡ－抗原複合体はそれぞれ膜テザリングドメインを含み、任意に、前記膜テザリングドメインはＡｇａ２を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項9】
前記抗原スクリーニングライブラリーは複数の細胞で発現される、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項10】
前記複数の細胞は複数の酵母細胞である、請求項９に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項11】
前記複数の酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＥＢＹ１００菌株の複数の酵母細胞である、請求項１０に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【請求項12】
前記複数の細胞の各細胞は特異的ＨＬＡ－抗原複合体を発現する、請求項１０または１１に記載の抗原スクリーニングライブラリー。
【手続補正書】
【提出日】2024-08-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】