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特開2024-120633アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤およびその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024120633
(43)【公開日】2024-09-05
(54)【発明の名称】アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤およびその利用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/05 20060101AFI20240829BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240829BHJP
A61K 31/69 20060101ALI20240829BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240829BHJP
【ＦＩ】
A61K31/05
A61K45/00
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K31/69
A61P35/02 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023027556
(22)【出願日】2023-02-24
(71)【出願人】
【識別番号】591060289
【氏名又は名称】岐阜市
(74)【代理人】
【識別番号】100179578
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 和弘
(74)【代理人】
【識別番号】100195062
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 涼子
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 智史
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZC201
4C084ZC202
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA43
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC20
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA17
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZB26
4C206ZB27
4C206ZC20
4C206ZC75
(57)【要約】
【課題】プロテアソーム阻害剤におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できる技術を提供する。
【解決手段】アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、アジュバント組成物は、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて対象に投与されて用いられ、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害活性を有し、がんの治療または予防に用いられる医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤とアスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤とを含み、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む。
【選択図】図１
【解決手段】アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、アジュバント組成物は、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて対象に投与されて用いられ、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害活性を有し、がんの治療または予防に用いられる医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤とアスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤とを含み、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤であって、
Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む、
アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤。
Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む、
アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤。
【請求項2】
アジュバント組成物であって、
プロテアソーム阻害剤と組み合わせて対象に投与されて用いられ、
Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、
アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害活性を有する、
アジュバント組成物。
プロテアソーム阻害剤と組み合わせて対象に投与されて用いられ、
Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、
アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害活性を有する、
アジュバント組成物。
【請求項3】
請求項２に記載のアジュバント組成物において、
固形がんの治療または予防に用いられる、
アジュバント組成物。
固形がんの治療または予防に用いられる、
アジュバント組成物。
【請求項4】
がんの治療または予防に用いられる医薬組成物であって、
プロテアソーム阻害剤と、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤とを含み、
前記アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、
Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む、
医薬組成物。
プロテアソーム阻害剤と、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤とを含み、
前記アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、
Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
一般に、抗がん剤としてプロテアソーム阻害剤が用いられることがある。しかしながら、認可されているプロテアソーム阻害剤の種類が少ないことや、多発性骨髄腫等の血液がんにしか適用されていないこと、プロテアソーム阻害剤の耐性化等、現状において複数の問題がある。プロテアソーム阻害剤の耐性獲得や、固形がんに対する有効性が高くないことの原因として、プロテアソーム構成因子の代償的合成促進（Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋ）が関与している可能性が指摘されている。
【0003】
プロテアソーム構成因子の代償的合成促進とは、正常時にはプロテアソームによる分解を受ける小胞体膜貫通型転写因子Ｎｒｆ１が、プロテアソーム機能低下時には分解を免れ、プロセシングによって活性化され、核内に移動してプロテアソーム構成因子の発現を誘導することをいう（例えば、非特許文献１）。非特許文献２では、Ｎｒｆ１の切断酵素がアスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２（DNA Damage Inducible 1 Homolog 2）であることが報告されている。また、非特許文献３には、ＮｅｌｆｉｎａｖｉｒがＤＤＩ２阻害活性を有することと、プロテアソーム阻害剤の作用増強効果を示すこととが開示されている。他方、非特許文献４では、Ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒがプロテアソーム阻害活性を有することにより、Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを強めてしまうことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】S Radhakrishnan et al., Mol Cell, 2010 Apr 9;38(1):17-28
【非特許文献2】S Koizumi et al., eLife, 2016
【非特許文献3】D Fassmannova et al., Cancers, 2020 May; 12(5): 1065
【非特許文献4】Y Gu et al., Cell Signal, 2020 Nov;7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
Ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒは、ＤＤＩ２の活性を阻害する一方でプロテアソーム阻害活性を有するため、Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋの根本的解決には至らない。このため、ＤＤＩ２の活性を阻害することができ、かつ、プロテアソーム阻害剤におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できる技術の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
【0007】
（１）本発明の一形態によれば、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤が提供される。このアスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む。この形態のアスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤によれば、ＤＤＩ２の活性を阻害することができ、かつ、プロテアソーム阻害剤におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できる技術を提供できる。
【0008】
（２）本発明の他の形態によれば、アジュバント組成物が提供される。このアジュバント組成物は、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて対象に投与されて用いられ、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害活性を有する。この形態のアジュバント組成物によれば、ＤＤＩ２の活性を阻害することができ、かつ、プロテアソーム阻害剤におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できるので、プロテアソーム阻害剤の作用を増強できる。
【0009】
（３）上記（２）に記載のアジュバント組成物は、固形がんの治療または予防に用いられてもよい。この形態のアジュバント組成物によれば、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて固形がんの治療または予防に用いられるので、固形がんに対する治療または予防効果を高めることができる。
【0010】
（４）本発明の他の形態によれば、がんの治療または予防に用いられる医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤と、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤とを含み、前記アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む。この形態の医薬組成物によれば、ＤＤＩ２の活性を阻害することができ、かつ、プロテアソーム阻害剤におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できるので、プロテアソーム阻害剤の作用を増強できる。この結果として、がんに対する治療または予防効果を高めることができる。
【0011】
なお、本開示は、種々の形態で実現することが可能であり、例えば、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤の生産方法、アジュバント組成物の生産方法、プロテアソーム阻害剤の作用増強化合物、プロテアソーム阻害剤の作用増強化合物の生産方法、プロテアソーム機能代償機構抑制化合物、プロテアソーム機能代償機構抑制化合物の生産方法、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌのアスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤としての利用、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌのアジュバント組成物としての利用等の形態で実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
一般に、プロテアソーム阻害剤は、細胞におけるプロテアソーム機能を阻害して細胞死を誘導できるため、抗がん剤として利用されている。アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２（DNA Damage Inducible 1 Homolog 2）は、プロテアソーム阻害剤処理時において、小胞体膜貫通型転写因子Ｎｒｆ１（Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor 1）を切断して活性型Ｎｒｆ１を生じさせる。活性型Ｎｒｆ１は、核内に移動してプロテアソーム構成因子の発現を誘導する。以下の説明では、プロテアソーム機能低下時に引き起こされる代償的プロテアソーム活性化を、「Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋ」とも呼ぶ。本願発明者は、鋭意研究を進めることにより、ＨｅｘｅｓｔｒｏｌがＤＤＩ２阻害活性を有し、かつ、プロテアソーム阻害活性を有さないことを見出した。すなわち、本願発明者は、上記３種類の化合物が、ＤＤＩ２阻害活性を有し、かつ、Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【0014】
本開示の一実施形態によれば、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤が提供される。このアスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む。Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌは、下記式（１）で示される構造を有する。
【0015】
【化1】
【0016】
本開示の他の形態によれば、アジュバント組成物が提供される。このアジュバント組成物は、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて対象に投与されて用いられ、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含み、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害活性を有する。
【0017】
本開示において、「アジュバント組成物」とは、他の物質と組み合わせて投与されることにより、かかる他の物質の作用を増強することのできる組成物を意味する。本開示のアジュバント組成物は、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて対象に投与されることにより、プロテアソーム阻害剤の作用を増強する。より具体的には、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌが、プロテアソーム阻害活性を有さず、ＤＤＩ２のみを特異的に阻害することができるため、プロテアソーム阻害剤の投与に起因するＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できる。本開示のアジュバント組成物は、がんの治療または予防に用いられることが想定され、特に、難治性固形がんを含めた固形がんの治療または予防に好適する。
【0018】
本開示において、「プロテアソーム阻害剤」とは、プロテアソームの活性を阻害することのできる組成物を意味する。プロテアソーム阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、ボルテゾミブ（Bortezomib）、カルフィルゾミブ（Carfilzomib）、イキサゾミブ（Ixazomib）、ポマリドミド、パビノスタット、エロツズマブ、ダラツムマブ、マリゾミブ、ラクタシスチン等が挙げられる。プロテアソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブまたはイキサゾミブであることが好ましく、ボルテゾミブであることがより好ましい。
【0019】
がんの種類としては、特に限定されず、種々の腹膜播種がん、胃がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等の固形がん、並びに骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、膠芽腫、多形性膠芽腫、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。がんの種類としては、難治性のがん、特に、抗がん剤に対して耐性を有する難治性がんであってもよく、難治性固形がんであってもよい。
【0020】
本開示おける「治療」には、無増悪生存期間（ＰＦＳ）延長、全生存期間（ＯＳ）の延長、無病生存（ＤＦＳ）の延長、無進行期間（ＴＴＰ）の延長、無イベント生存（ＥＦＳ）の延長、無再発生存（ＲＦＳ）の延長、がん細胞数の減少、腫瘍サイズの低下、腫瘍の成長の抑制（遅延または停止）、腫瘍の転移の抑制（遅延または停止）、再発の抑制（防止または遅延）、がんと関連する一つまたは複数の症状の緩和のうち少なくとも１つの効果を生じさせることが含まれる。また、本開示における「予防」には、がんの発症の防止、およびがんの発症の遅延が含まれる。
【0021】
本開示における対象には、例えば、がんの患者や、がんが疑われる者等が含まれる。がんの患者としては、複数種のがんを発症している患者であってもよく、プロテアソーム阻害剤または他の抗がん剤による化学療法前および化学療法後のいずれの患者であってもよく、外科手術前および外科手術後のいずれの患者であってもよく、免疫療法前および免疫療法後のいずれの患者であってもよく、放射線療法前および放射線療法後のいずれの患者であってもよい。また、対象の性別や年齢も特に限定されない。対象の動物種は、主に哺乳動物である。かかる哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ等が挙げられる。
【0022】
「組み合わせて投与される」とは、同じまたは異なる剤形における化合物の同時投与、あるいは化合物の別々の投与（例えば、逐次的投与）を含む。より具体的には、１つの製剤中に複数の成分を配合した配合剤の形態で投与されてもよく、別々の製剤として投与されてもよい。別々の製剤として投与される場合には、同時投与および時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、アジュバント組成物を先に投与し、プロテアソーム阻害剤を後に投与してもよいし、プロテアソーム阻害剤を先に投与し、アジュバント組成物を後に投与してもよい。それぞれの投与方法は同じであってもよく、異なっていてもよい。また、本開示のアジュバント組成物は、プロテアソーム阻害剤が対象において耐性化される前に適用されてもよく、耐性化された後に適用されてもよい。
【0023】
本開示のアジュバント組成物は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌおよび薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化されていてもよい。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤、注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤であってもよい。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定されてもよい。担体または添加剤としては、特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体や、賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【0024】
本開示の他の形態によれば、がんの治療または予防に用いられる医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤と、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤とを含み、アスパラギン酸プロテアーゼＤＤＩ２阻害剤は、Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌを含む。この医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤と上述のＤＤＩ２阻害剤との組み合わせに相当する。この医薬組成物において、プロテアソーム阻害剤と上述のＤＤＩ２阻害剤とは、互いに別々に製剤化された二剤の形態であってもよく、混合されて製剤化された一剤の形態であってもよい。製剤化の態様としては、上述のアジュバント組成物の製剤化で述べたような態様であってもよい。
【0025】
本開示におけるＤＤＩ２阻害剤、アジュバント組成物および医薬組成物によれば、プロテアソーム阻害剤の投与に起因するＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できるので、プロテアソーム阻害剤の耐性克服を図ることができる。また、本開示のＤＤＩ２阻害剤、アジュバント組成物および医薬組成物は、低分子医薬であるため、抗体医薬と比較して生産が容易であり、生産コストの上昇を抑制できる。この結果として、抗体医薬と比較して薬価を抑えることができるので、患者の治療機会の向上に寄与できる。
【実施例0026】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0027】
１．実験材料および方法
（１）実験材料
多発性骨髄腫Ｕ９３７細胞は、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。膀胱がんＴ２４細胞は、理化学研究所バイオリソース研究センターより入手した。ＧＣ（ゲムシタビン／シスプラチン）耐性Ｔ２４細胞（以下、「Ｔ２４ＧＣ細胞」とも呼ぶ）は、Ｔ２４細胞に対し、ＧＣ濃度を０μＭから１０μＭまで徐々に上げてＧＣに対する感受性を低下させることにより樹立した。なお、以下の説明において詳細記載のない試薬については、特級または生化学用として市販されているものを用いた。
（１）実験材料
多発性骨髄腫Ｕ９３７細胞は、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。膀胱がんＴ２４細胞は、理化学研究所バイオリソース研究センターより入手した。ＧＣ（ゲムシタビン／シスプラチン）耐性Ｔ２４細胞（以下、「Ｔ２４ＧＣ細胞」とも呼ぶ）は、Ｔ２４細胞に対し、ＧＣ濃度を０μＭから１０μＭまで徐々に上げてＧＣに対する感受性を低下させることにより樹立した。なお、以下の説明において詳細記載のない試薬については、特級または生化学用として市販されているものを用いた。
【0028】
（２）細胞培養
Ｕ９３７、Ｔ２４細胞およびＴ２４ＧＣ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２条件下の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。増殖培地としては、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ、Sigma-Aldrich社製）、１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｇ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（Merck Millipore社製）、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ（ナカライテスク社製）および１０ｍＭ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid緩衝液（ｐＨ７．０）を含むＲＰＭＩ（Roswell park memorial institute）１６４０（富士フイルム和光純薬工業社製）を用いた。Ｔ２４細胞およびＴ２４ＧＣ細胞の剥離には、０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．０２％ ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ（Dulbecco's phosphate-buffered saline、日水製薬社製）（ｐＨ７．４）を用いた。
Ｕ９３７、Ｔ２４細胞およびＴ２４ＧＣ細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２条件下の炭酸ガスインキュベーター内で培養した。増殖培地としては、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ、Sigma-Aldrich社製）、１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｇ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（Merck Millipore社製）、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ（ナカライテスク社製）および１０ｍＭ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid緩衝液（ｐＨ７．０）を含むＲＰＭＩ（Roswell park memorial institute）１６４０（富士フイルム和光純薬工業社製）を用いた。Ｔ２４細胞およびＴ２４ＧＣ細胞の剥離には、０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．０２％ ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ（Dulbecco's phosphate-buffered saline、日水製薬社製）（ｐＨ７．４）を用いた。
【0029】
（３）ウエスタンブロット解析
処理した細胞をＤＰＢＳ（Dulbecco's phosphate-buffered saline、日水製薬社製）（ｐＨ７．４）で２回洗浄後、セルスクレイパーを用いて細胞を剥離した。なお、ＤＰＢＳは、０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．０２％ ＥＤＴＡを含む。回収した細胞をＤＰＢＳで洗浄後、８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ tris (hydroxymethyl) aminomethaneを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、その後、ソニケーションにより細胞膜を破壊した。細胞破砕液を遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間、４℃）し、その上清を細胞抽出液とした。１０％、１２．５％、１５％のいずれかのポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離後、ゲル上のタンパク質を電気的にＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜（Merck Millipore社製）に転写した。ＰＶＤＦ膜は、１％ ＢＳＡ（bovine serum albumin）を用いてブロッキング後、各一次抗体とhorseradish peroxidase（ＨＲＰ）標識マウス二次抗体（#1031-05、SouthernBiotech社製）と順次反応させた。一次抗体として、抗Ｎｒｆ１抗体（#12936-1-AP、Proteintech社製）、抗ＤＤＩ２抗体（#CSB-PA732937、Cusabio Biotech社製）、抗β－ａｃｔｉｎ抗体（#281-98721、富士フイルム和光純薬工業社製）を用いた。ECL enhanced chemiluminescence detection kit（GEヘルスケア社製）またはImmunoStar Zeta（富士フイルム和光純薬工業社製）を用いた化学発光法により、抗体反応性タンパク質を検出した。得られた各バンドの発光強度を、画像解析処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊ（National Institute of Health製）を用いて定量化した。
処理した細胞をＤＰＢＳ（Dulbecco's phosphate-buffered saline、日水製薬社製）（ｐＨ７．４）で２回洗浄後、セルスクレイパーを用いて細胞を剥離した。なお、ＤＰＢＳは、０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎおよび０．０２％ ＥＤＴＡを含む。回収した細胞をＤＰＢＳで洗浄後、８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ tris (hydroxymethyl) aminomethaneを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、その後、ソニケーションにより細胞膜を破壊した。細胞破砕液を遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間、４℃）し、その上清を細胞抽出液とした。１０％、１２．５％、１５％のいずれかのポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離後、ゲル上のタンパク質を電気的にＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜（Merck Millipore社製）に転写した。ＰＶＤＦ膜は、１％ ＢＳＡ（bovine serum albumin）を用いてブロッキング後、各一次抗体とhorseradish peroxidase（ＨＲＰ）標識マウス二次抗体（#1031-05、SouthernBiotech社製）と順次反応させた。一次抗体として、抗Ｎｒｆ１抗体（#12936-1-AP、Proteintech社製）、抗ＤＤＩ２抗体（#CSB-PA732937、Cusabio Biotech社製）、抗β－ａｃｔｉｎ抗体（#281-98721、富士フイルム和光純薬工業社製）を用いた。ECL enhanced chemiluminescence detection kit（GEヘルスケア社製）またはImmunoStar Zeta（富士フイルム和光純薬工業社製）を用いた化学発光法により、抗体反応性タンパク質を検出した。得られた各バンドの発光強度を、画像解析処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊ（National Institute of Health製）を用いて定量化した。
【0030】
（４）定量ＰＣＲ
ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、RNAzol RT Reagent試薬（Molecular Research Center Inc.製）を用いて抽出した。抽出されたｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ReverTra Ace qPCR RT kit（東洋紡社製）を用いて、３７℃、３０分間および９８℃、５分間インキュベートし、逆転写反応を行うことで、一本鎖ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。調製したｃＤＮＡ（１μｇ）を鋳型とし、Thunderbird SYBR qPCR Mix（東洋紡社製）を用いて定量ＰＣＲを行った。定量ＰＣＲに用いた特異的プライマーの配列を、配列番号とともに以下の表１に示す。定量ＰＣＲ装置 CFX96 Deep Well Real-Time System（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の温度条件は、９５℃／３０秒の熱処理後、９５℃／１５秒、５５℃／１分を１サイクルとして、４０サイクルの熱処理とした。なお、内標準物質として、ヒトβ－ａｃｔｉｎのｃＤＮＡを増幅した。
ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、RNAzol RT Reagent試薬（Molecular Research Center Inc.製）を用いて抽出した。抽出されたｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ReverTra Ace qPCR RT kit（東洋紡社製）を用いて、３７℃、３０分間および９８℃、５分間インキュベートし、逆転写反応を行うことで、一本鎖ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。調製したｃＤＮＡ（１μｇ）を鋳型とし、Thunderbird SYBR qPCR Mix（東洋紡社製）を用いて定量ＰＣＲを行った。定量ＰＣＲに用いた特異的プライマーの配列を、配列番号とともに以下の表１に示す。定量ＰＣＲ装置 CFX96 Deep Well Real-Time System（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の温度条件は、９５℃／３０秒の熱処理後、９５℃／１５秒、５５℃／１分を１サイクルとして、４０サイクルの熱処理とした。なお、内標準物質として、ヒトβ－ａｃｔｉｎのｃＤＮＡを増幅した。
【0031】
【表1】
【0032】
（５）細胞生存率の測定
増殖培地に懸濁したＴ２４ＧＣ細胞を、９６－ｗｅｌｌ ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ中に２×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬずつ播種し、その後、ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。抗生物質と２％ ＦＢＳ（Sigma-Aldrich社製）とを含む培地に交換した後に、培地中に、試料として各濃度のＢＴＺ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）および各濃度のＨＥＸ（Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌ）を添加し、さらに２４時間培養した。対照群として、ＤＭＳＯ（Dimethylsulfoxide）を添加した細胞を調製した。次に、血清不含およびフェノールレッド不含培地に交換し、５０μＭ ｒｅｓａｚｕｒｉｎ（Sigma-Aldrich社製）を添加した後に、３７℃で２－４時間培養した後、ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、波長５７０ｎｍおよびリファレンス波長である５９５ｎｍの吸光度を測定した。細胞生存率（％）は、以下の式により算出した。
細胞生存率（％）＝（Ｓ－Ａ）／（Ｂ－Ａ）×１００
（式中、Ｓは、試料と細胞とを添加したｗｅｌｌの吸光度であり、Ａは、培地のみを添加したｗｅｌｌの吸光度であり、Ｂは、ＤＭＳＯと細胞とを添加したｗｅｌｌの吸光度である。）
増殖培地に懸濁したＴ２４ＧＣ細胞を、９６－ｗｅｌｌ ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ中に２×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬずつ播種し、その後、ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。抗生物質と２％ ＦＢＳ（Sigma-Aldrich社製）とを含む培地に交換した後に、培地中に、試料として各濃度のＢＴＺ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）および各濃度のＨＥＸ（Ｈｅｘｅｓｔｒｏｌ）を添加し、さらに２４時間培養した。対照群として、ＤＭＳＯ（Dimethylsulfoxide）を添加した細胞を調製した。次に、血清不含およびフェノールレッド不含培地に交換し、５０μＭ ｒｅｓａｚｕｒｉｎ（Sigma-Aldrich社製）を添加した後に、３７℃で２－４時間培養した後、ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、波長５７０ｎｍおよびリファレンス波長である５９５ｎｍの吸光度を測定した。細胞生存率（％）は、以下の式により算出した。
細胞生存率（％）＝（Ｓ－Ａ）／（Ｂ－Ａ）×１００
（式中、Ｓは、試料と細胞とを添加したｗｅｌｌの吸光度であり、Ａは、培地のみを添加したｗｅｌｌの吸光度であり、Ｂは、ＤＭＳＯと細胞とを添加したｗｅｌｌの吸光度である。）
【0033】
２．実験内容および結果
＜実験１：ＤＤＩ２阻害活性の確認実験＞
ＨＥＸおよびＮＦＶのＤＤＩ２阻害活性について、多発性骨髄腫Ｕ９３７細胞を用いて確認した。５μＭ ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ（ＮＦＶ）または２５μＭ ＨＥＸ存在下において１００ｎＭ ＢＴＺで細胞を処理し、２４時間培養した。対照区として、１００ｎＭ ＢＴＺのみで細胞を処理したものと、ＤＭＳＯを用いて細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。また、ＨＥＸの濃度依存性を確認するために、０μＭ、５μＭ、１５μＭ、２５μＭ ＨＥＸ存在下において１００ｎＭ ＢＴＺで細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。培養後の細胞についてウェスタンブロッティングを行い、Ｎｒｆ１、ＤＤＩ２およびβ－Ａｃｔｉｎの発現量を確認した。さらに、各サンプルにおけるタンパク質のバンド密度の比率を、ＤＭＳＯで処理した対照細胞におけるバンド密度に対して正規化し、平均±標準偏差で表した。なお、「＊＊」は、ＢＴＺ単独処理細胞に対し１％有意水準において有意差があることを示す。
＜実験１：ＤＤＩ２阻害活性の確認実験＞
ＨＥＸおよびＮＦＶのＤＤＩ２阻害活性について、多発性骨髄腫Ｕ９３７細胞を用いて確認した。５μＭ ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ（ＮＦＶ）または２５μＭ ＨＥＸ存在下において１００ｎＭ ＢＴＺで細胞を処理し、２４時間培養した。対照区として、１００ｎＭ ＢＴＺのみで細胞を処理したものと、ＤＭＳＯを用いて細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。また、ＨＥＸの濃度依存性を確認するために、０μＭ、５μＭ、１５μＭ、２５μＭ ＨＥＸ存在下において１００ｎＭ ＢＴＺで細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。培養後の細胞についてウェスタンブロッティングを行い、Ｎｒｆ１、ＤＤＩ２およびβ－Ａｃｔｉｎの発現量を確認した。さらに、各サンプルにおけるタンパク質のバンド密度の比率を、ＤＭＳＯで処理した対照細胞におけるバンド密度に対して正規化し、平均±標準偏差で表した。なお、「＊＊」は、ＢＴＺ単独処理細胞に対し１％有意水準において有意差があることを示す。
【0034】
図１は、実験１の結果を示す説明図である。図１では、ウェスタンブロッティングの結果および切断型Ｎｒｆ１の割合を示すグラフが示されている。ウェスタンブロッティングの結果によれば、ＢＴＺ単独処理では、Ｎｒｆ１の発現が増大し、プロテアーゼによって切断された切断型Ｎｒｆ１が多く認められた。また、ＢＴＺとＨＥＸとの併用処理では、ＢＴＺと既存のＤＤＩ２阻害剤であるＮＦＶとの併用処理と同様に、切断型Ｎｒｆ１よりも分子量の大きい全長型Ｎｒｆ１の発現が認められた。このため、ＨＥＸは、ＮＦＶと同様にＤＤＩ２阻害活性を有するといえる。また、ＨＥＸの濃度が高いほど、全長型Ｎｒｆ１よりも切断型Ｎｒｆ１の割合が小さくなる傾向にあった。
【0035】
＜実験２：Ｕ９３７細胞におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋに及ぼす影響の確認実験＞
Ｕ９３７細胞におけるＢＴＺ誘導性Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋに及ぼすＨＥＸの影響を確認した。ＢＴＺ単独処理、ＢＴＺとＮＦＶとの併用処理、ＢＴＺとＨＥＸとの併用処理、ＨＥＸ単独処理のそれぞれの試験区について、２４時間培養を行った。ＢＴＺ濃度は１００ｎＭとし、ＮＦＶ濃度は５μＭとし、ＨＥＸ濃度は２５μＭとした。対照区として、ＤＭＳＯを用いて細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。定量ＰＣＲ法を用いて、Ｎｒｆ１のｍＲＮＡ発現量（遺伝子発現量）と、プロテアソーム構成因子であるＰＳＭＢ５およびＰＳＭＢ７のｍＲＮＡ発現量とを求めた。
Ｕ９３７細胞におけるＢＴＺ誘導性Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋに及ぼすＨＥＸの影響を確認した。ＢＴＺ単独処理、ＢＴＺとＮＦＶとの併用処理、ＢＴＺとＨＥＸとの併用処理、ＨＥＸ単独処理のそれぞれの試験区について、２４時間培養を行った。ＢＴＺ濃度は１００ｎＭとし、ＮＦＶ濃度は５μＭとし、ＨＥＸ濃度は２５μＭとした。対照区として、ＤＭＳＯを用いて細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。定量ＰＣＲ法を用いて、Ｎｒｆ１のｍＲＮＡ発現量（遺伝子発現量）と、プロテアソーム構成因子であるＰＳＭＢ５およびＰＳＭＢ７のｍＲＮＡ発現量とを求めた。
【0036】
図２は、実験２の結果を示す説明図である。図２では、Ｎｒｆ１遺伝子発現量とＰＳＭＢ５遺伝子発現量とＰＳＭＢ７遺伝子発現量とが、対照区を１００％とした場合の相対値としてそれぞれ示されている。なお、「＊」および「＊＊」は、対照区に対しそれぞれ１％有意水準および５％有意水準において有意差があることを示し、「＃＃」は、ＢＴＺ単独処理区に対し１％有意水準において有意差があることを示している。また、単独処理における「ＮＳ」は、対照区に対し５％有意水準において有意差があることを示し、併用処理における「ＮＳ」は、ＢＴＺ単独処理区に対し５％有意水準において有意差があることを示している。
【0037】
図２に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、ＢＴＺ処理によってＮｒｆ１遺伝子の発現が増大するところ、ＮＦＶを併用することによって、その発現誘導がさらに増強された。これに対し、ＨＥＸを併用することによっては、Ｎｒｆ１遺伝子発現を低下させなかったが、Ｎｒｆ１遺伝子の発現誘導の増強は認められなかった。また、ＢＴＺ処理によってＰＳＭＢ５遺伝子およびＰＳＭＢ７遺伝子の発現がそれぞれ増大するところ、ＮＦＶを併用することによっても、その発現誘導は抑制されなかった。これに対し、ＨＥＸを併用することによっては、ＰＳＭＢ５遺伝子およびＰＳＭＢ７遺伝子の発現が有意に抑制された。これらの結果から、ＨＥＸは、プロテアソーム活性を有さない化合物であることが示唆された。すなわち、ＨＥＸは、ＤＤＩ２の活性を阻害することができ、かつ、プロテアソーム阻害剤におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できることが示唆された。
【0038】
＜実験３：Ｔ２４ＧＣ細胞におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋに及ぼす影響の確認実験＞
Ｔ２４ＧＣ細胞におけるＢＴＺ誘導性Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋに及ぼすＨＥＸの影響を確認した。Ｔ２４ＧＣ細胞は、難治性固形がんのモデル細胞である。ＢＴＺ単独処理、ＢＴＺとＮＦＶとの併用処理、ＢＴＺとＨＥＸとの併用処理、ＨＥＸ単独処理のそれぞれの試験区について、２４時間培養を行った。ＢＴＺ濃度は１００ｎＭとし、ＮＦＶ濃度は５μＭとし、ＨＥＸ濃度は２５μＭとした。対照区として、ＤＭＳＯを用いて細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。定量ＰＣＲ法を用いて、Ｎｒｆ１のｍＲＮＡ発現量（遺伝子発現量）と、プロテアソーム構成因子であるＰＳＭＢ１、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ４およびＰＳＭＢ５のｍＲＮＡ発現量とを求めた。
Ｔ２４ＧＣ細胞におけるＢＴＺ誘導性Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋに及ぼすＨＥＸの影響を確認した。Ｔ２４ＧＣ細胞は、難治性固形がんのモデル細胞である。ＢＴＺ単独処理、ＢＴＺとＮＦＶとの併用処理、ＢＴＺとＨＥＸとの併用処理、ＨＥＸ単独処理のそれぞれの試験区について、２４時間培養を行った。ＢＴＺ濃度は１００ｎＭとし、ＮＦＶ濃度は５μＭとし、ＨＥＸ濃度は２５μＭとした。対照区として、ＤＭＳＯを用いて細胞を処理したものについても、同様に培養を行った。定量ＰＣＲ法を用いて、Ｎｒｆ１のｍＲＮＡ発現量（遺伝子発現量）と、プロテアソーム構成因子であるＰＳＭＢ１、ＰＳＭＢ２、ＰＳＭＢ３、ＰＳＭＢ４およびＰＳＭＢ５のｍＲＮＡ発現量とを求めた。
【0039】
図３は、実験３の結果を示す説明図である。図３では、Ｎｒｆ１遺伝子発現量とＰＳＭＢ１～５遺伝子発現量とが、対照区を１００％とした場合の相対値としてそれぞれ示されている。なお、「＊＊」は、対照区に対し１％有意水準において有意差があることを示し、「＃＃」は、ＢＴＺ単独処理区に対し１％有意水準において有意差があることを示している。また、単独処理における「ＮＳ」は、対照区に対し５％有意水準において有意差があることを示し、併用処理における「ＮＳ」は、ＢＴＺ単独処理区に対し５％有意水準において有意差があることを示している。
【0040】
図３に示す結果から、以下のことがわかった。すなわち、実験２のＵ９３７細胞における結果と同様に、Ｔ２４ＧＣ細胞においても、ＨＥＸがＢＴＺ誘導性Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを有意に抑制していた。より詳細には、ＢＴＺにＮＦＶを併用することによって、Ｎｒｆ１遺伝子の発現誘導が増強されるのに対し、ＨＥＸの併用によっては、Ｎｒｆ１遺伝子の発現誘導の増強は認められなかった。また、ＢＴＺ処理によってＰＳＭＢ１～ＰＳＭＢ５遺伝子発現がそれぞれ誘導され、ＮＦＶの併用によってもその発現誘導が抑制されなかったのに対し、ＨＥＸの併用によって発現が有意に抑制された。これらの結果からも、ＨＥＸは、プロテアソーム阻害剤におけるＢｏｕｎｃｅ ｂａｃｋを抑制できることが示唆される。
【0041】
＜実験４：抗がん活性増強効果の確認実験＞
Ｔ２４ＧＣ細胞を用いて、ＨＥＸによるＢＴＺの抗がん活性増強効果を確認した。まず、上述の方法により、Ｔ２４ＧＣ細胞の細胞生存率を測定した。その後、ＢＴＺとＨＥＸとの併用の相乗性を、ＣｏｍｐｕＳｙｎプログラムを用いて評価した。
Ｔ２４ＧＣ細胞を用いて、ＨＥＸによるＢＴＺの抗がん活性増強効果を確認した。まず、上述の方法により、Ｔ２４ＧＣ細胞の細胞生存率を測定した。その後、ＢＴＺとＨＥＸとの併用の相乗性を、ＣｏｍｐｕＳｙｎプログラムを用いて評価した。
【0042】
【産業上の利用可能性】
【0043】
本開示のＤＤＩ２阻害剤によれば、既存のＤＤＩ２阻害剤であるＮＦＶとは異なり、Ｂｏｕｎｃｅ ｂａｃｋ誘導を起こさずに、プロテアソーム阻害剤の作用増強を行うことができるため、アジュバント薬として有用である。例えば、本開示のＤＤＩ２阻害剤をアジュバント薬として用いることにより、抗がん剤の耐性克服を図ることができ、また、抗がん剤の臨床利用の適用範囲を拡大できる。
【0044】
本発明は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例中の技術的特徴は、上述の課題の一部または全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部または全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】