特開 2024-12078 ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用新規バイオマーカーおよびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024012078

(43)【公開日】2024-01-25

(54)【発明の名称】ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用新規バイオマーカーおよびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20240118BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240118BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240118BHJP

   C12Q 1/6841 20180101ALI20240118BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20240118BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240118BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240118BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240118BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6841 Z

C12Q1/6837 Z

G01N33/53 M

G01N33/53 D

G01N33/50 P

G01N33/68

C12N15/09 Z

【審査請求】有

【請求項の数】21

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023075073

(22)【出願日】2023-04-28

(31)【優先権主張番号】10-2022-0086734

(32)【優先日】2022-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2023-0046214

(32)【優先日】2023-04-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ＡＮＮＡＬＳ ｏｆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３３，Ｓ１２５－Ｓ１２６に公開された「Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ，ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（ＮＥＯ－ＰＡＴＨ）ｉｎ ＨＥＲ２＋ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ」及びポスタープレゼンテーション「Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ，ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（ＮＥＯ－ＰＡＴＨ，ＫＣＳＧ－ＢＲ－１８－２３，ＮＣＴ０３８８１８７８）ｉｎ ＨＥＲ２＋ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ」

(71)【出願人】

【識別番号】512250119

【氏名又は名称】サムスン ライフ パブリック ウェルフェア ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100154922

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 允辰

(72)【発明者】

【氏名】キョン・ヒ・パク

(72)【発明者】

【氏名】ヨン・ヒ・パク

(72)【発明者】

【氏名】ウン・ヤン・パク

(72)【発明者】

【氏名】ジ・ヨン・キム

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB01

2G045CB03

2G045CB07

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2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB01

2G045FB02

2G045FB03

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

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4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

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4B063QS34

4B063QS36

(57)【要約】

【課題】本発明が解決しようとする課題は、ＨＥＲ２陽性乳癌治療の予後を予測する手段を提供することである。
【解決手段】本発明は、ＲＡＤ２１遺伝子を検出する製剤を含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物に関する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＡＤ２１遺伝子を検出する製剤を含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物。

【請求項2】

前記ＨＥＲ２陽性乳癌治療は、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２陽性早期乳癌患者を対象にするものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記先行抗癌化学療法は、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）またはアルブミン結合パクリタキセル（Ｎａｂ－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）；ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）；およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）またはペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を投与するものである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記製剤は、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異、ＲＡＤ２１遺伝子のＲＮＡ発現レベル、またはこれらの組み合わせを検出するものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異は、単一ヌクレオチド変異；１～５０個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、またはこれらの組み合わせ；およびコピー数変異からなる群より選択された１種以上である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記製剤は、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡに結合するプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記組成物は、ＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定する製剤をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物は、ＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定する製剤をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記製剤は、ＨＥＲ２またはＰＤＬ１遺伝子、またはそのタンパク質に結合するプライマー、プローブ、アンチセンスヌクレオチド、抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡおよびアプタマーからなる群より選択された１種以上である、請求項７または８に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物は、ＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａ遺伝子からなる群より選択された１種以上のＲＮＡ発現レベルを測定する製剤をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記製剤は、ＲＮＡ配列に結合するプライマーまたはプローブである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

請求項１、７、８および１０のいずれか１項に記載の組成物を含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用キット。

【請求項13】

ａ）被験者から分離された生物学的試料からＲＡＤ２１遺伝子を検出するステップと、
ｂ）前記検出されたＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベル、ＲＮＡ発現レベル、またはこれらの組み合わせを対照群と比較するステップとを含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後を予測するための情報の提供方法。

【請求項14】

前記ａ）ステップの被験者は、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２陽性早期乳癌患者である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記先行抗癌化学療法は、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）またはアルブミン結合パクリタキセル（Ｎａｂ－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）；ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）；およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）またはペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を投与するものである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ａ）ステップの生物学的試料は、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、尿および組織からなる群より選択された１種以上である、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記ａ）またはｂ）ステップの後、
ａ－１）前記生物学的試料においてＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定するステップと、
ｂ－１）前記測定されたＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを対照群と比較するステップとをさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項18】

前記ａ）またはｂ）ステップの後、
ａ－２）前記生物学的試料においてＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定するステップと、
ｂ－２）前記測定されたＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを対照群と比較するステップとをさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項19】

前記ａ）またはｂ）ステップの後、
ａ－３）前記生物学的試料においてＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａ遺伝子からなる群より選択された１種以上のＲＮＡ発現レベルを測定するステップと、
ｂ－３）前記測定された遺伝子のＲＮＡ発現レベルを対照群と比較するステップとをさらに含むものである、請求項１３に記載の方法。

【請求項20】

前記遺伝子のＤＮＡ突然変異レベル、遺伝子またはＲＮＡの発現レベル、またはタンパク質の発現レベルは、蛍光核酸混成化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、クロマチン免疫沈降（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、核酸分解酵素保護分析（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＤＮＡまたはＲＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロット、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）、放射線免疫分析（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、免疫拡散（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｎｃｅ）およびタンパク質マイクロアレイからなる群より選択された１種以上の方法で測定されるものである、請求項１３、１７、１８または１９に記載の方法。

【請求項21】

前記対照群と比較するステップにおいて、対照群対比の被験者において下記のｉ）およびｉｉ）の１つ以上と下記のｉｉｉ）～ｖ）の１つ以上とを満足する場合、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の治療予後が良いと判別するものである、請求項１３、１７、１８または１９に記載の方法：
ｉ）ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベルが底い；
ｉｉ）ＲＡＤ２１遺伝子のＲＮＡ発現レベルが底い；
ｉｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高い；
ｉｖ）ＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高い；および
ｖ）ＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａ遺伝子からなる群より選択された１種以上のＲＮＡ発現レベルが低い。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用新規バイオマーカーおよびその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

乳癌は、ホルモン受容体（ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＲ）とヒト上皮細胞成長因子受容体２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ＨＥＲ２）のタンパク質の発現に基づいてＨＲ＋ＨＥＲ２－、ＨＲ＋ＨＥＲ２＋、ＨＲ－ＨＥＲ２＋およびＴＮＢＣ（ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）の４つのＩＨＣ（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）タイプに分類され、ＲＮＡ発現量に基づいて分子タイプを分けるＰＡＭ５０ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇを適用してＬｕｍｉｎａｌ Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ、Ｈｅｒ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ、Ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅおよびＮｏｒｍａｌ－ｌｉｋｅの５つの分子タイプに分けられ、このようなタイプによって臨床的特性と抗癌治療に対する反応が異なって現れる。ＨＥＲ２の増幅または過発現を有するＨＥＲ２陽性乳癌（ＨＥＲ２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）は、全体乳癌の１５～２５％を占め、再発率が高くて予後が悪い方である。ＨＥＲ２陽性乳癌において、ＨＥＲ２は、乳癌の予後を予測するためのバイオマーカーや治療の標的として活用される。ＦＤＡで承認されたＨＥＲ２標的治療剤であるトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）はＨＥＲ２に対するヒト化単クローン抗体で、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の無病生存率および全体生存率を改善させることが知られている。しかし、一部の患者だけがトラスツズマブの単独治療に反応し、多くの患者が持続的な治療に対して耐性を有するので、このようなトラスツズマブの限界を克服するために、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）など他のＨＥＲ２標的治療剤や細胞毒性抗癌剤、免疫抗癌剤などを併用する多様な治療戦略が試みられている。

【0003】

乳癌の抗癌治療法としては、大きく、根治的抗癌化学療法（先行抗癌化学療法または補助抗癌化学療法）と、緩和的（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ）抗癌化学療法とに分けられる。このうち、先行抗癌化学療法（ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）は、腫瘍を除去できなかったり、手術範囲が過度に大きい時、手術できる水準まで腫瘍を低減したり、病期（ｓｔａｇｅ）を低下させるための手術前の療法で、良い予後を期待することができる。ＨＥＲ２陽性早期乳癌（ＨＥＲ２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）の場合、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、トラスツズマブおよびペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）を併用するＴＣＨＰ療法により病理学的完全寛解（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の比率を６０％以上に高めた。ＴＣＨＰ療法は、毒性調節が可能であるが、好中球減少熱（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｆｅｖｅｒ）、神経毒性（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、腎毒性（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、嘔吐（ｅｍｅｓｉｓ）、下痢（ｄｉａｒｒｈｅａ）など等級（Ｇｒａｄｅ）３または４の危険度の高い異常反応（ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔ）を示すというデメリットがある。したがって、患者ごとに治療に対する反応が異なるため、正確な予後予測のためには、乳癌の分子タイプと臨床結果の関連性に対する評価が必要であり、特に各タイプ別乳癌の予後に影響を及ぼす分子的因子に関する研究の実行が必ず要求される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】韓国登録特許第１０－１９６０４３１号

【特許文献2】韓国登録特許第１０－２３３８５１０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物およびキットを提供することを目的とする。

【0006】

また、本発明は、ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後を予測するための情報の提供方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物
本発明の一態様は、ＲＡＤ２１遺伝子を検出する製剤を含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物を提供する。

【0008】

本発明で使用された「ＨＥＲ２陽性乳癌」は、一般的な癌細胞よりＨＥＲ２が多く発見されるタイプで、進行が他の乳癌より早く攻撃的であることが特徴である。ＨＥＲ２陽性早期乳癌の場合、腫瘍の大きさが２ｃｍ以下であり、脇リンパ節に転移がないもので、ＨＥＲ２標的治療剤を使用すれば治療予後が良い方であり、完治率も高いことが知られている。腫瘍の大きさが２ｃｍを超えたりリンパ節の転移があれば、手術前に標的治療剤治療を施すが、この時、癌が完全に消える場合を病理学的完全寛解（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ｐＣＲ）という。

【0009】

本発明で使用された「治療」は、乳癌の成長、増殖または転移抑制のために通常使用される療法を意味し、標的治療剤や細胞毒性抗癌剤、免疫抗癌剤を単独または併用した場合をすべて含む。一般的な抗癌治療としては、手術前に抗癌剤を投与して腫瘍の大きさを低減する先行抗癌化学療法、根治的切除術（完全切除）後、微細残存癌が残っている可能性が高くて、癌の再発防止を目的として手術後に投与する補助抗癌化学療法、疾病の進行を遅らせたり緩和させて患者の生活の質を良くし、窮極的に生存期間を伸ばすための緩和的抗癌化学療法などがある。

【0010】

本発明の一具体例によれば、前記ＨＥＲ２陽性乳癌治療は、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２陽性早期乳癌患者を対象にするものであってもよい。

【0011】

本発明の一具体例によれば、前記先行抗癌化学療法は、ＨＥＲ２標的治療剤を単独で使用するか、細胞毒性抗癌剤、免疫抗癌剤などの抗癌剤と併用するものであってもよい。

【0012】

前記ＨＥＲ２標的抗癌剤としては、ダコミチニブ（Ｄａｃｏｍｉｔｉｎｉｂ）、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ネラチニブ（Ｎｅｒａｔｉｎｉｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ツカチニブ（Ｔｕｃａｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（Ｌａｐａｔｉｎｉｂ）などがあるが、これらに限定されるものではない。

【0013】

前記細胞毒性抗癌剤としては、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、アルブミン結合パクリタキセル（Ｎａｂ－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）などがあるが、これらに限定されるものではない。

【0014】

前記免疫抗癌剤としては、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）などがあるが、これらに限定されるものではない。

【0015】

より具体的には、前記先行抗癌化学療法はＴＡＨＰ療法で、ドセタキセル、パクリタキセルまたはアルブミン結合パクリタキセル；トラスツズマブ；ペルツズマブ；およびアテゾリズマブ、ニボルマブまたはペムブロリズマブを投与するものであってもよい。
本発明で使用された「予後」は、まだ診断されなかったり、診断された個体を対象に、治療前／後の個体の再発、転移、薬物反応性、耐性などの有無を判断することを意味する。本発明では、ＨＥＲ２陽性乳癌患者、より具体的には、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２陽性早期乳癌患者において薬物治療前にバイオマーカーとしてＲＡＤ２１遺伝子、より具体的には、ＲＡＤ２１遺伝子の突然変異の有無および／またはＲＮＡ発現レベルを確認して治療に対する反応が良いかを予測することを意味し、病理学的完全寛解（ｐＣＲ）を用いて予後を予測することができる。ここで、「バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」とは、一般的に生物学的試料から検出可能な物質であって、生体の変化を知ることができるポリペプチド、タンパク質、核酸、遺伝子、脂質、糖脂質、糖タンパク質、糖などのような有機生体分子をすべて含む。

【0016】

本発明によるＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物は、バイオマーカーであるＲＡＤ２１遺伝子を検出するための製剤が要求される。

【0017】

本発明の一具体例によれば、前記製剤は、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異、ＲＡＤ２１遺伝子のＲＮＡ発現レベル、またはこれらの組み合わせを検出するものであってもよい。

【0018】

本発明の一具体例によれば、前記ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異は、ＲＡＤ２１遺伝子の核酸塩基配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において、ｉ）単一ヌクレオチド変異；ｉｉ）１～５０個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、またはこれらの組み合わせ；およびｉｉｉ）コピー数変異からなる群より選択された１種以上であってもよい。

【0019】

本発明で使用された「突然変異または変異」は、遺伝体において塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を意味する。前記変異は、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）などを含むことができる。ここで、置換は、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸が他の塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸に変化する変更を意味する。挿入は、他の塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸が追加される変更を意味する。欠失は、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸が除去される変更を意味する。

【0020】

本発明で使用された「単一ヌクレオチド変異（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔ、ＳＮＶ）」は、遺伝体上で１つの塩基またはヌクレオチドの差を示す配列の変更または変異を意味し、様々な人の遺伝体の同じ位置で特定の塩基１つが他の塩基に変化して他の形質で表現されることを意味する一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と混用できる。前記１～５０個のヌクレオチド欠失または挿入は、遺伝体上で１～５０個以上の連続的または非連続的塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の差を示す配列の変更または変異を意味する。このようなヌクレオチド変異は、３個の塩基配列で構成される１つのアミノ酸にも影響を及ぼすことができ、塩基の差が特定の疾患に対する感受性、疾患の発現様相、治療剤反応性など個人間の差を示すのに寄与することができる。

【0021】

本発明で使用された「コピー数変異（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｎｔ、ＣＮＶ）」は、参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と比較した時、反復する配列数の差を示す１ｋｂ以上の長さの変異区間をいい、コピー数の差によって特定の疾患に対する感受性、疾患の発現様相、治療剤反応性など個人間の差を示すのに寄与することができる。

【0022】

このようなＤＮＡ突然変異の有無は、塩基配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）または増幅反応により検出可能である。

【0023】

本発明の実施例では、ＴＡＨＰ療法を受けたＨＥＲ２陽性早期乳癌患者の薬物治療前の腫瘍組織を用いてＤＮＡおよびＲＮＡシーケンシングを実施した結果、野生型ＲＡＤ２１遺伝子を有する場合（７８％）が、ＲＡＤ２１遺伝子の突然変異、より具体的には、コピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）が６以上増加したコピー数変異（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）を有する場合（２４％）に比べてｐＣＲ比率が著しく高く、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異の有無および／またはＲＮＡ発現レベルだけでもＨＥＲ２陽性早期乳癌の治療予後に対する予測性能が高く（ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐ、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．６９０；ＲＡＤ２１＿ａｍｐ、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．７３３；ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．７４９）、正確度に優れた予測モデルを形成した。

【0024】

本発明の一具体例によれば、前記ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異を検出する製剤は、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡに相補的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドからなる群より選択された１種以上であってもよい。

【0025】

また、本発明の一具体例によれば、前記ＲＡＤ２１遺伝子のＲＮＡ発現レベルを検出または測定する製剤は、ＲＡＤ２１遺伝子のＲＮＡに相補的に結合するプライマーまたはプローブであってもよい。

【0026】

本発明によるＲＡＤ２１遺伝子を検出する製剤を含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物は、予測正確度を向上させるように、ＲＡＤ２１のほか、他のバイオマーカーを活用することができる。

【0027】

本発明の一具体例によれば、前記組成物は、ＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定する製剤をさらに含むものであってもよい。

【0028】

本発明の一実施例では、ＴＡＨＰ療法を受けたＨＥＲ２陽性早期乳癌患者の薬物治療前に確保した腫瘍組織を用いてタンパク質の発現レベルを測定した結果、ＨＥＲ２ ３＋の場合（７１％）が、ＨＥＲ２ ２＋の場合（１３％）に比べてｐＣＲ比率が著しく高く、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異の有無と共に、ＨＥＲ２の発現の有無によりＨＥＲ２陽性早期乳癌の治療予後に対する予測性能が高く（ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．８０７）、正確度に優れた予測モデルを形成した。

【0029】

また、本発明の一具体例によれば、前記組成物は、ＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定する製剤をさらに含むものであってもよい。

【0030】

前記ＰＤＬ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）は、癌細胞の表面や造血細胞にあるタンパク質で、癌細胞の表面にあるＰＤＬ１がＴ細胞の表面にあるＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １）と結合してＴ細胞の癌細胞攻撃を回避するようにする。

【0031】

本発明の一実施例では、ＴＡＨＰ療法を受けたＨＥＲ２陽性早期乳癌患者の薬物治療開始前に確保した腫瘍組織を用いてタンパク質の発現レベルを測定した結果、ＰＤＬ１陽性の場合（１００％）が、ＰＤＬ１陰性の場合（５５％）に比べてｐＣＲ比率が著しく高く、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異の有無および／またはＲＮＡ発現レベルと共に、ＨＥＲ２および／またはＰＤＬ１発現の有無によりＨＥＲ２陽性早期乳癌の治療予後に対する予測性能がより向上し（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ＋ＰＤＬ１、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．７５７；ＲＡＤ２１＿ａｍｐ＋ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１＋ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．７８８；ＲＡＤ２１＿ａｍｐ＋ＨＥＲ２、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．８０７；ＲＡＤ２１＿ａｍｐ＋ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．８３９）、正確度に優れた予測モデルを形成した。

【0032】

このようなＨＥＲ２またはＰＤＬ１の発現レベルを測定するためには、当該遺伝子またはそのタンパク質の発現量を測定できる製剤が要求される。
本発明の一具体例によれば、前記ＨＥＲ２またはＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定する製剤は、ＨＥＲ２またはＰＤＬ１遺伝子、またはそのタンパク質にそれぞれ相補的または特異的に結合するセンスおよびアンチセンスプライマー、プローブ、アンチセンスヌクレオチド、抗体、オリゴペプチド、リガンド、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群より選択された１種以上であってもよい。

【0033】

また、本発明の一具体例によれば、前記組成物は、ＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａ遺伝子からなる群より選択された１種以上のＲＮＡ発現レベルを測定する製剤をさらに含むものであってもよい。

【0034】

前記１０種の遺伝子は、本発明の一実施例により、ＨＥＲ２陽性乳癌患者のうち、ｐＣＲグループ対比、ｎｏｎ－ｐＣＲグループで統計的に有意な発現量の差を示すものとして選定された遺伝子である。

【0035】

本発明の一実施例では、ＴＡＨＰ療法を受けたＨＥＲ２陽性早期乳癌患者の薬物治療開始前に確保した腫瘍組織を用いて１０種の遺伝子のＲＮＡ発現レベルを測定した結果、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異の有無および／またはＲＮＡ発現レベルと共に、ＨＥＲ２および／またはＰＤＬ１発現の有無、および／または１０種の遺伝子のＲＮＡ発現レベルによりＨＥＲ２陽性早期乳癌の治療予後に対する予測性能がより向上し（ＲＡＤ２１＿ａｍｐおよび／またはＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓを含む、ＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＝０．７３４～０．９１８）、正確度に優れた予測モデルを形成した。

【0036】

このような１０種の遺伝子の発現レベルを測定するためには、当該遺伝子のＲＮＡ発現量を測定できる製剤が要求される。

【0037】

本発明の一具体例によれば、前記１０種の遺伝子のＲＮＡ発現レベルを測定する製剤は、各遺伝子のＲＮＡにそれぞれ相補的に結合するプライマーまたはプローブであってもよい。

【0038】

本発明で使用された「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、短い自由３末端水酸化基を有する核酸配列で、相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対を形成することができ、鋳型鎖コピーのための開始地点として機能する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を意味する。前記プライマーは、適切な緩衝溶液および温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡ重合酵素または逆転写酵素）のための試薬および異なる４つのヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。プライマー対は、７個～５０個のヌクレオチド配列を有するセンス（ｓｅｎｓｅ）およびアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）オリゴヌクレオチドで構成され、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本性質を変化させないレベルで１５～３０個のヌクレオチド配列を有することができる。

【0039】

本発明で使用された「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、自然の、または変形されたモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）または連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線状オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含み、標的ヌクレオチド配列に特異的に混成化することができ、自然的に存在するか、または人為的に合成されたものである。

【0040】

このようなプライマー、プローブおよびアンチセンスヌクレオチドは、必要な場合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって直接的にまたは間接的に検出可能な標識を含むことができる。前記検出可能な標識は、検出可能な信号を発生させる標識物質であって、蛍光物質、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５などのような物質を含む検出可能な信号を発生させることができる標識物質であってもよい。前記検出可能な標識は、核酸の混成化結果を確認することができる。

【0041】

本発明で使用された「抗体」は、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明では、ＨＥＲ２またはＰＤＬ１タンパク質に特異的に結合する抗体を意味し、単クローン抗体、多クローン抗体および組換え抗体をすべて含む。ここで、「特異的に結合する」とは、結合によって標的物質の存在の有無を検出できる程度に、他の物質に比べて標的物質に対する結合力に優れていることを意味する。また、前記抗体は、２個の全長の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）および２個の全長の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどであってもよい。

【0042】

前記抗体は、当業界にて公知の技術により容易に製造できる。例えば、単クローン抗体は、当業界にて広く公知のハイブリドーマ方法（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｍｅｔｈｏｄ）ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎｒａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６：５１１－５１９参照）、またはファージ抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１－５９７，１９９１）技術を用いて製造できる。多クローン抗体は、標的タンパク質抗原を動物に注射し、動物から採血して抗体を含む血清を得る方法によって生産することができる。このような多クローン抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌなどの動物から製造可能である。

【0043】

前記方法で製造された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの方法を用いて分離および精製することができる。

【0044】

ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用キット
本発明の一態様は、前記組成物を含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用キットを提供する。
本発明で使用された「ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用キット」は、検査対象者またはＨＥＲ２陽性乳癌患者、より具体的には、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２陽性早期乳癌患者から分離された生物学的試料により予後を予測できる物質を意味し、これにより検査対象者の治療予後を迅速、正確かつ簡便に診断することができる。本発明では、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異の有無および／またはＲＮＡ発現レベルを検出または測定する製剤を単独で含むか、またはこれと共に、ＨＥＲ２またはＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベル、および／または前記１０種の遺伝子のＲＮＡ発現レベルを測定する製剤をさらに含むことができる。

【0045】

前記キットは、通常の遺伝子発現、遺伝子突然変異（例えば、コピー数変異）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）発現およびタンパク質の定量分析に基づいた診断キットを制限なく含むことができる。
本発明の一具体例によれば、前記キットは、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）キット、ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）キット、ＤＮＡまたはＤＮＡチップキット、ＮＧＳ（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）キット、タンパク質チップキットおよびタンパク質アレイキットからなる群より選択された１種以上であってもよい。

【0046】

例えば、前記キットがＰＣＲ増幅過程に適用される場合、本発明のキットは、選択的にＰＣＲ増幅に必要な試薬、例えば、緩衝液、ＤＮＡ重合酵素、ＤＮＡ重合酵素補助因子およびｄＮＴＰｓを含むことができ、前記キットが免疫分析に適用される場合、本発明のキットは、選択的に二次抗体および標識の基質を含むことができる。また、本発明によるキットは、上記の試薬成分を含む多数の別のパッケージングまたはコンパートメントとして作製され、本発明のキットは、ＤＮＡチップを行うために必要な必須要素を含む診断用キットであってもよい。ＤＮＡチップキットは、遺伝子またはその断片に相当するｃＤＮＡがプローブに付着している基板、および蛍光標識プローブを作製するための試薬、製剤、酵素などを含むことができる。また、基板は、定量対照群遺伝子またはその断片に相当するｃＤＮＡを含むことができる。

【0047】

ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後を予測するための情報の提供方法
本発明の他の態様は、ａ）被験者から分離された生物学的試料からＲＡＤ２１遺伝子を検出するステップと、ｂ）前記検出されたＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベル、ＲＮＡ発現レベル、またはこれらの組み合わせを対照群と比較するステップとを含むＨＥＲ２陽性乳癌治療予後を予測するための情報の提供方法を提供する。

【0048】

前記ａ）およびｂ）ステップについて詳しく説明し、前述した内容と共通した内容は、過度の複雑性を回避するためにその記載を省略する。

【0049】

前記ａ）ステップは、ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後に対する検査が必要な個体または対象者から生物学的試料を採取して、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベルおよび／またはＲＮＡ発現レベルを測定する過程である。

【0050】

本発明の一具体例によれば、前記ａ）ステップの被験者は、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２陽性早期乳癌患者であってもよい。

【0051】

より具体的には、前記先行抗癌化学療法は、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）またはアルブミン結合パクリタキセル（Ｎａｂ－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）；ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）；およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）またはペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を投与するものであってもよい。

【0052】

本発明の一具体例によれば、前記ａ）ステップの生物学的試料は、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、尿および組織からなる群より選択された１種以上であってもよい。

【0053】

前記生物学的試料は、ＨＥＲ２陽性乳癌に対する薬物治療前に確保したものが好ましく、生物学的試料から癌細胞の遺伝子変異の有無および分子（例えば、核酸、タンパク質）の発現レベルを正確に測定するためには、癌組織を用いることが好ましい。

【0054】

前記ｂ）ステップは、生物学的試料で測定されたＲＡＤ２１遺伝子の特定変異の有無および／またはＲＮＡ発現レベルに基づいて被験者または個体のＨＥＲ２陽性乳癌治療に対する予後を予測する過程である。

【0055】

本発明の一具体例によれば、前記ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異は、ＲＡＤ２１遺伝子配列において単一ヌクレオチド変異；１～５０個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、またはこれらの組み合わせ；およびコピー数変異からなる群より選択された１種以上であってもよい。

【0056】

また、本発明によるＨＥＲ２陽性乳癌治療予後を予測するための情報の提供方法は、前記ＲＡＤ２１遺伝子のほか、ＨＥＲ２；ＰＤＬ１；および／またはＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａからなる群より選択された１つ以上の遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルをさらに測定するステップを含むことができる。

【0057】

より具体的には、前記ａ）またはｂ）ステップの後、ａ－１）前記生物学的試料においてＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定するステップと、ｂ－１）前記測定されたＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを対照群と比較するステップとをさらに含むものであってもよい。

【0058】

また、前記ａ）またはｂ）ステップの後、ａ－２）前記生物学的試料においてＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを測定するステップと、ｂ－２）前記測定されたＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルを対照群と比較するステップとをさらに含むものであってもよい。

【0059】

さらに、前記ａ）またはｂ）ステップの後、ａ－３）前記生物学的試料においてＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａ遺伝子からなる群より選択された１種以上のＲＮＡ発現レベルを測定するステップと、ｂ－３）前記測定された遺伝子のＲＮＡ発現レベルを対照群と比較するステップとをさらに含むものであってもよい。

【0060】

本発明の一具体例によれば、前記ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベルは、蛍光核酸混成化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、クロマチン免疫沈降（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）などにより分析できるが、これに限定されるものではない。

【0061】

より具体的には、前記ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異、特にコピー数変異は、ＮＧＳにより測定可能であり、例えば、全長遺伝体シーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、全長エキソームシーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、標的遺伝子パネルシーケンシング（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｐａｎｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの方法で測定できるが、これに限定されるものではない。

【0062】

前記ＮＧＳは、数十万個の反応を同時に行う多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）能力があり、少量のサンプルでもシーケンシングが可能である。ＮＧＳは、商用化された技術により具体的な適用手法がやや異なるが、一般的に、クローン増幅（ｃｌｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、大量並列シーケンシングおよびＳａｎｇｅｒ方法と作用機序が異なる新しい塩基配列決定法を用いる。商用化技術としては、２００７年にＲｏｃｈｅが発売した４５４ＧＳ改良型ＦＬＸ ｍｏｄｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、２００６年にＩｌｌｕｍｉｎａが発売したＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＨｉＳｅｑ、２００７年にＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが発売したＳＯＬｉＤなどがある。このような３つのプラットフォームは、共通して、複雑なライブラリーの構築とクローニング過程を捨ててクローン増幅技術を採用しており、一度に大量処理できる大量並列方式（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術を採用し、循環シーケンシング（ｃｙｃｌｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による合成信号読出（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）で塩基配列を決定して煩雑な電気泳動過程を排除した。また、ｓｈｏｔｇｕｎ方式を用いて読出された短いリード（ｒｅａｄ）をコンピュータで配列して重複した部分を見つけて全体を完成するアルゴリズムを用いる。ＮＧＳは、臨床的に遺伝子パネル検査、エキソームシーケンシング、全長遺伝体シーケンシング、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）検出、血液ベース腫瘍検査（ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｔｕｍｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）、非侵襲的出生前検査（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ）、ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）検査、免疫グロブリン遺伝子組換え（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）検査、ＲＮＡシーケンシング、ＤＮＡメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）検査、クロマチン免疫沈降（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、ＣｈＩＰ）シーケンシング、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）シーケンシングなどに用いられる。

【0063】

本発明の一具体例によれば、前記遺伝子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の発現レベルは、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、核酸分解酵素保護分析（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＤＮＡまたはＲＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロット、サザーンブロット、次世代塩基配列分析（ＮＧＳ）などの方法で測定できるが、これに限定されるものではない。

【0064】

また、本発明の一具体例によれば、前記遺伝子のタンパク質の発現レベルは、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）、放射線免疫分析（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、免疫拡散（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｎｃｅ）、タンパク質マイクロアレイなどの方法で測定できるが、これに限定されるものではない。

【0065】

このように検出または測定されたＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベルおよび／またはＲＮＡ発現レベル、ＨＥＲ２および／またはＰＤＬ１遺伝子またはタンパク質の発現レベル、および／または１０種の遺伝子のＲＮＡ発現レベルは対照群、より具体的には、健常者の試料と遺伝子の変異レベルおよび／または発現レベルを比較分析して、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の治療予後を予測することができる。

【0066】

本発明の一具体例によれば、前記対照群と比較するステップにおいて、対照群対比の被験者において下記のｉ）およびｉｉ）の１つ以上と下記のｉｉｉ）～ｖ）の１つ以上とを満足する場合、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の治療予後が良いと判別するものであってもよい。
ｉ）ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベルが底い；
ｉｉ）ＲＡＤ２１遺伝子のＲＮＡ発現レベルが底い；
ｉｉｉ）ＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高い；
ｉｖ）ＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高い；および
ｖ）ＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａ遺伝子からなる群より選択された１種以上のＲＮＡ発現レベルが低い。

【0067】

ここで、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベルが低いというのは、突然変異のうちコピー数変異が６未満であるかないことを意味し、ＲＡＤ２１遺伝子のＲＮＡ発現レベルが低いというのは、遺伝子を暗号化するＤＮＡで転写されたｍＲＮＡ発現量が少ないことを意味し、ＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高いというのは、タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現量が多いこと（具体的には、３＋以上）を意味し、これはＨＥＲ２遺伝子のＤＮＡ突然変異（例えば、コピー数変異）によるものであってもよく、ＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高いというのは、タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子を発現すること（陽性、ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を意味し、前記１０種の遺伝子のＲＮＡ発現レベルが低いというのは、各遺伝子を暗号化するＤＮＡで転写されたｍＲＮＡ発現量が少ないことを意味する。

【0068】

より具体的には、前記被験者が、対照群に比べて、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異レベルおよび／またはＲＮＡ発現レベルが低くかつＨＥＲ２遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高いか、ＰＤＬ１遺伝子またはそのタンパク質の発現レベルが高いか、および／またはＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａ遺伝子からなる群より選択された１種以上のＲＮＡ発現レベルが低い場合には、ＨＥＲ２陽性早期乳癌の治療予後が良いと予測することができ、予測性能および正確度が向上できる。

【発明の効果】

【0069】

本発明では、ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用新規バイオマーカーを提示することにより、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２早期陽性乳癌患者を対象に前記バイオマーカーを検出または測定できるＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用組成物およびキットを提供することができ、ひいては、患者の薬物治療予後を迅速かつ正確に判別して患者に合わせた治療法を選択することができる。

【図面の簡単な説明】

【0070】

【図1】本発明の一実施例によるＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用候補バイオマーカー８個（ＤＮＡマーカー；ＲＡＤ２１、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＥＲＢＢ２、ＲＮＡマーカー；Ｌｕｍｉｎａｌ、およびタンパク質マーカー；ＨＲ、ＨＥＲ２およびＰＤＬ１）に対するフィッシャーの正確検定分析（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）の結果である。

【図2】本発明の一実施例による候補バイオマーカー８個の組み合わせに対する一般化線形模型（ＧＬＭ）のＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ（Ｌｅａｖｅ－Ｏｎｅ－Ｏｕｔ Ｃｒｏｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ａｒｅａｄ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）および予測誤差（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｅｒｒｏｒ）を示すグラフである。

【図3】本発明の一実施例によるＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用バイオマーカー単独（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）または組み合わせ（ＨＥＲ２＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐおよびＨＥＲ２＋ＰＤＬ１＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）に対するＲＯＣ曲線（ｃｕｒｖｅ）を示す図である。

【図4】本発明の一実施例によるＲＡＤ２１遺伝子のコピー数変異（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）とＲＮＡ発現レベル（ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ）との間の関連性に対するフィッシャーの正確検定分析（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）の結果である。

【図5】本発明の一実施例によるＤＮＡマーカー（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）、タンパク質マーカー（ＨＥＲ２およびＰＤＬ１）およびＲＮＡマーカー（ＡＮＫＲＤ５０＿ｅｘｐｒｓ、ＣＯＸ６Ｃ＿ｅｘｐｒｓ、ＤＥＲＬ１＿ｅｘｐｒｓ、ＦＬＮＢ＿ｅｘｐｒｓ、ＧＰＲＣ５Ａ＿ｅｘｐｒｓ、ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ、ＲＮＦ１３９＿ｅｘｐｒｓ、ＳＡＭＤ８＿ｅｘｐｒｓ、ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ｅｘｐｒｓ、ＳＱＬＥ＿ｅｘｐｒｓおよびＴＴＣ３９Ａ＿ｅｘｐｒｓ）の組み合わせに対する一般化線形模型（ＧＬＭ）のＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ（Ｌｅａｖｅ－Ｏｎｅ－Ｏｕｔ Ｃｒｏｓｓ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ａｒｅａｄ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）および予測誤差（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｅｒｒｏｒ）を示すグラフである。

【図6】本発明の一実施例によるＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用ＲＮＡマーカー単独（ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ）またはＤＮＡマーカー、タンパク質マーカーおよびＲＮＡマーカーの組み合わせ（ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ｅｘｐｒｓ＋ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐおよびＴＴＣ３９Ａ＿ｅｘｐｒｓ＋ＳＱＬＥ＿ｅｘｐｒｓ＋ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ｅｘｐｒｓ＋ＤＥＲＬ１＿ｅｘｐｒｓ＋ＡＮＫＲＤ５０＿ｅｘｐｒｓ＋ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）に対するＲＯＣ曲線（ｃｕｒｖｅ）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0071】

以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例示的に提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるものではない。

【実施例0072】

実施例１．ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用バイオマーカー候補選定
１－１．患者検体準備
２０１９年５月から２０２０年５月まで先行抗癌化学療法を受けたＨＥＲ２陽性早期乳癌患者６７人を募集し、そのうち６５人が完治手術（ｃｕｒａｔｉｖｅ ｓｕｒｇｅｒｙ）を受けた。最後の患者が完治手術を受けた２０２０年１０月末にデータ収集を終了した。先行抗癌化学療法はＴＡＨＰ療法で、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）を６回周期で投与した。

【0073】

６７人のうちＨＲ陽性の場合が３２人であり、中位年齢（Ｍｅｄｉａｎ ａｇｅ）は５２歳（範囲３３－７４歳）であった。ＴＡＨＰ療法前の患者生検では１３人の患者（１９．７％）がＳＰ１４２ ＡｂによるＰＤＬ１陽性であった。全体的に病理学的完全寛解（ｐＣＲ）比率は６１．２％（４１／６７）であり、不完全寛解（ｎｏｎ－ｐＣＲ）比率は３５．８％（２４／６７）であった。１人の患者はＴＡＨＰ療法中に再発して手術を受けられなかった。好中球減少症（Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）は１３人（１９．４％）から発見されたが、好中球減少性発熱（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｆｅｖｅｒ）は５人（７．５％）から発見された。また、最もありふれた免疫関連毒性である発疹（ｒａｓｈ）が４３人（６４．２％、Ｇｒａｄｅ３の患者１人を含む）、脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）が１人（Ｇｒａｄｅ３）、免疫関連肝炎が２人（Ｇｒａｄｅ２およびＧｒａｄｅ３）、肺炎が６人（Ｇｒａｄｅ３またはＧｒａｄｅ４ではない）、そして甲状腺機能障害が６人となったが、全体的に高い完全寛解比率と中間程度のひどくない毒性を示した。

【0074】

腫瘍組織は、すべての患者からＴＡＨＰ療法を受ける前に（Ｔ１；ｎ＝６３、ｐＣＲ４０人およびｎｏｎ－ｐＣＲ２３人）、そして手術後の病理学的完全寛解が現れない患者（ｎｏｎ－ｐＣＲ）の残留腫瘍組織（Ｔ３；ｎ＝１５）から収集した。収集された腫瘍組織を用いてＤＮＡおよびＲＮＡシーケンシングと免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施して候補バイオマーカーを選定した。

【0075】

１－２．ＤＮＡマーカー選定
腫瘍組織からＤＮＡを抽出して、ＮＧＳによりＤＮＡマーカーを選定した。まず、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出されたｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｏｔｇｕｎ ｌｉｂｒａｒｙを作製し、プローブハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）後、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ○Ｒ ＣＤｘ（Ｆ１ＣＤｘ）パネルを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ○Ｒ ＨｉＳｅｑ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍでディープシーケンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を進行させた。シーケンシング後には、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ ＣＤｘ^ＴＭ自体ソフトウェアを用いて、ＳＮＶ、Ｉｎｄｅｌ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ＋ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、ＣＮＶ、融合（ｆｕｓｉｏｎ）などのＤＮＡ変異を分析した。品質（Ｑｕａｌｉｔｙ）の低い細胞は除外し、ＭＡＦ（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）が５％以上の変異のみ（ホットスポット突然変異（ｈｏｔｓｐｏｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の場合、ＭＡＦ１％以上）報告した。遺伝体の特徴とｐＣＲ達成との間の関連性は、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）による濃縮テスト（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）に対するフィッシャーの正確検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）で分析した。突然変異のうちコピー数増幅（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、正常配列（ｐｒｏｃｅｓｓ－ｍａｔｃｈｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較してコピー数が６以上の場合をいう（ＰＭＡ Ｐ１７００１９：ＦＤＡ Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ Ｄａｔａ参照）。ｐ値＜０．０５の場合、統計的に有意なものと見なした。

【0076】

その結果、図１を参照すれば、ＤＮＡマーカー３２個のうち、ＲＡＤ２１コピー数増幅（ｎ＝１７、ｐ＝０．０００２）、ＭＹＣコピー数増幅（ｎ＝１３、ｐ＝０．００９５）およびＭＹＣ経路（ＭＹＣ．ｐａｔｈｗａｙ）突然変異（ＭＹＣコピー数増幅またはＭＹＣＮ突然変異）（ｎ＝１４、ｐ＝０．００９５）が、ｐＣＲグループ（ｎ＝４０）に比べてｎｏｎ－ｐＣＲグループ（ｎ＝２３）でより良く検出された。特に突然変異がない野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＷＴ）ＲＡＤ２１は、他のマーカーに比べてｐＣＲ比率が７８％で高い水準を示した。

【0077】

そして、ＨＥＲ２を暗号化するＥＲＢＢ２遺伝子の場合、ＥＲＢＢ２コピー数増幅（ｎ＝５９、ｐ＝０．１３３８）は２つのグループ間の有意な差がないが、ＥＲＢＢ２およびＭＹＣに対する同時増幅（ｃｏ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は不完全寛解（ｎｏｎ－ｐＣＲ）グループ（ｐ＝０．０１６８７）で頻度高く検出された。

【0078】

１－３．ＲＮＡマーカー選定
腫瘍組織からＲＮＡを抽出して、ＮＧＳによりＲＮＡマーカーを選定した。まず、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ＵＳＡ）（凍結組織用）またはＰｒｏｍｅｇａ Ｒｅｌｉａ Ｐｒｅｐ ＦＦＰＥ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）（ＦＦＰＥ組織用）を用いて腫瘍組織から総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を抽出し、ＲＮＡ無欠性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を用いて測定した。全体遺伝子の発現様相を分析するために全長転写体シーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施した。製造会社の指針に従い、ＲＮＡシーケンシングライブラリーはＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ａｃｃｅｓｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）を用いて作製された。そして、ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）を用いてｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを進行させてＲＮＡライブラリーをシーケンシングリード（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄ）に変換し、ＦＡＳＴＱファイルを生成した。ＦＡＳＴＱファイルから品質の不良なｒｅａｄを除去した後、ＳＴＡＲソフトウェア（ｖ２．５．２ｂ）を用いてシーケンシングリードをヒト標準遺伝体（ｈｕｍａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ、ｈｇ１９）に整列（ａｌｉｇｎ）し、ＲＳＥＭソフトウェア（ｖ１．３）を用いて各遺伝子別の発現量（リードｃｏｕｎｔおよびＴＰＭ）を測定した。遺伝子の発現量資料ベースでｇｅｎｅｆｕ Ｒ ｐａｃｋａｇｅを用いて研究用ＰＡＭ５０ ｓｕｂｔｙｐｅを予測した。

【0079】

その結果、図１を参照すれば、ＨＲであるエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体を発現する内腔腫瘍のＬｕｍｉｎａｌ（ＰＡＭ５０ ｓｕｂｔｙｐｅのうち、Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ ｓｕｂｔｙｐｅに属する患者）では、ｐＣＲグループとｎｏｎ－ｐＣＲグループとの間の有意な差がないが、ｎｏｎ－Ｌｕｍｉｎａｌ（ＰＡＭ５０ ｓｕｂｔｙｐｅのうち、Ｈｅｒ２－ｅｎｒｉｃｈｅｄ、Ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅおよびＮｏｒｍａｌ－ｌｉｋｅ ｓｕｂｔｙｐｅに属する患者）では、ｎｏｎ－ｐＣＲグループに比べてｐＣＲグループで高く検出された。

【0080】

１－４．タンパク質マーカー選定
腫瘍組織でＩＨＣを実施してタンパク質マーカーを選定した。通常の方法によって各組織から細胞表面受容体ＥＲ、ＰＲおよびＨＥＲ２とＰＤＬ１タンパク質を染色し、１人の病理科医師が一括分析した。ＰＤＬ１陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）の有無は、免疫細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）の免疫反応性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が癌領域で１％以上の場合、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と判定した。

【0081】

その結果、図１を参照すれば、従来のＨＥＲ２陽性乳癌のマーカーであるＨＲおよびＨＥＲ２が検出され、ＰＤＬ１も検出された。

【0082】

実施例２．候補バイオマーカーに対する予測モデル分析I
実施例１で選定された候補ＤＮＡマーカーＲＡＤ２１、ＭＹＣ、ＭＹＣＮおよびＥＲＢＢ２、ＲＮＡマーカーＬｕｍｉｎａｌ、そしてタンパク質マーカーＨＲ、ＨＥＲ２およびＰＤＬ１を対象に単一マーカーまたはマーカーの組み合わせに対する一般化線形模型（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ、ＧＬＭ）のロジスティック回帰分析（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を実施して予測モデルを構築した。その結果は下記表１および図２に示した。マーカーの性能評価では、指標としてＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）を用い、ＬＯＯＣＶ（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）方法を適用してＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ≧０．７でかつ正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）が高く、予測誤差（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｅｒｒｏｒ）が低い最小個数のマーカーを用いたモデルを選定した。

【0083】

結果として、単一マーカーとしてＲＡＤ２１＿ａｍｐを用いたモデルでは、従来の臨床マーカーであるＨＲまたはＨＥＲ２モデルに比べて予測性能に優れ、ＲＡＤ２１＿ａｍｐと共に、ＨＥＲ２、追加的にＰＤＬ１を含むモデルでその予測性能がさらに向上した（図３参照）。

【表1】

【0084】

このような結果は、ＲＡＤ２１が先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２早期陽性乳癌患者を対象に薬物治療予後を予測するためのバイオマーカーとして活用されて、ＲＡＤ２１遺伝子のＤＮＡ突然変異、特にコピー数増幅がなかったり、コピー数が６未満の場合、薬物治療予後が良いと予測することができ、同時にＨＥＲ２および／またはＰＤＬ１のタンパク質の発現レベルが高い場合、その予測正確度に優れていることを示唆する。

【0085】

実施例３．ＨＥＲ２陽性乳癌治療予後予測用ＲＮＡマーカー候補選定
実施例１と同一の患者検体および腫瘍組織を用いて、ＮＧＳにより新しいＲＮＡマーカーを選定した。ＲＮＡシーケンシングは実施例１－３と同様の方法で行われた。

【0086】

ｐＣＲの有無による発現量に差が生じる遺伝子を選別するために、ＤＥＧ分析を実施した。遺伝子発現量（ＴＰＭ）をｌｏｇ２に変換した後、ｐＣＲグループ対比のｎｏｎ－ｐＣＲグループで統計的に有意に発現が高い遺伝子（ＤＥＧ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ）を選別した。ｔ検定を用いてｎｏｎ－ｐＣＲグループで統計的に有意に発現量が高く（ｐ値＜０．０１）、グループ間の発現量の差が大きく（ｌｏｇ２ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ＞０．０５）、平均発現量が高い（ｌｏｇ２ＴＰＭ＞３）遺伝子を選定した。計１６，７２６個の遺伝子を分析して、前述した基準を満足する２２個を候補バイオマーカーとして選定し、その結果は下記表２に示した。

【表2】

【0087】

一方、選定された候補ＲＮＡマーカーにもＲＡＤ２１遺伝子が含まれていて、ＲＡＤ２１遺伝子に対してＤＮＡ突然変異とＲＮＡ発現との間の相関関係を分析した。

【0088】

ＤＮＡシーケンシングとＲＮＡシーケンシングの結果がすべて確保された患者５７人を対象に、ＲＡＤ２１遺伝子のコピー数変異の有無とＲＮＡ発現量の中位値を基準としてＲＮＡ発現レベルの差（高発現／低発現）で区分し、これらの関連性はフィッシャーの正確検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）で分析した（一致率７７％、ｐ値＝６．８４３ｅ－０６）。その結果は下記表３および図４に示した。

【表3】

結果として、ＲＡＤ２１遺伝子のコピー数変異を有する場合、ＲＮＡの発現レベルも高いが、ＲＮＡの発現レベルが高いからといって必ずしもコピー数変異を有してはいなかった。したがって、ＲＡＤ２１遺伝子のコピー数変異とＲＮＡ発現レベルとの間の関連性は統計的に有意でないため、ＲＡＤ２１に対するＤＮＡマーカー（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）とＲＮＡマーカー（ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ）は個別的なマーカーとして使用可能であることを確認した。

【0089】

実施例４．候補バイオマーカーに対する予測モデル分析II
ＨＥＲ２陽性乳癌患者の治療予後を予測するためのモデルの性能を向上させるために、実施例２で選定されたＤＮＡマーカーＲＡＤ２１（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）とタンパク質マーカーＨＥＲ２およびＰＤＬ１に、実施例３で選定されたＲＮＡマーカー２２個を追加して、一般化線形模型（ＧＬＭ）のロジスティック回帰分析（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を実施して新しい予測モデルを構築した。ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐを含む患者６３人のうち、ＤＮＡシーケンシングとＲＮＡシーケンシング結果がすべて確保された患者５７人を対象に分析した。ＤＮＡシーケンシング結果は突然変異の有無で、ＲＮＡシーケンシング結果は遺伝子の発現量でモデルに投入し、ロジスティック回帰分析でｆｏｒｗａｒｄ／ｂａｃｋｗａｒｄ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎにより最適なマーカーの組み合わせを選定した。マーカーの性能評価では、指標としてＡＵＣを用い、ＬＯＯＣＶ方法を適用してＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ≧０．７でかつ正確度が高く、予測誤差が低い最小個数のマーカーを用いたモデルを選定した。そして、候補ＲＮＡマーカーのうち、個別マーカーとして性能がＬＯＯＣＶ．ＡＵＣ＞０．７であるか、またはＤＮＡマーカーに個別マーカーを追加した時、ＡＵＣが０．０５以上向上した遺伝子１１個を最終的にＲＮＡマーカーとして選定した。

【0090】

ＤＮＡマーカーＲＡＤ２１（ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）、タンパク質マーカーＨＥＲ２およびＰＤＬ１、およびＲＮＡマーカーＡＮＫＲＤ５０、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＥＲＬ１、ＦＬＮＢ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＲＡＤ２１（ＲＡＤ２１＿ｅｘｐｒｓ）、ＲＮＦ１３９、ＳＡＭＤ８、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＱＬＥおよびＴＴＣ３９Ａの単独または組み合わせに対する予測モデルを下記表４および図５に示した。

【表4A】

【表4B】

【表4C】

【0091】

その結果、ＤＮＡマーカー、タンパク質マーカーおよびＲＮＡマーカーをすべて含むｅ４３モデル（ＴＴＣ３９Ａ＿ｅｘｐｒｓ＋ＳＱＬＥ＿ｅｘｐｒｓ＋ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ｅｘｐｒｓ＋ＤＥＲＬ１＿ｅｘｐｒｓ＋ＡＮＫＲＤ５０＿ｅｘｐｒｓ＋ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）が最も高いＡＵＣを示し、ＲＮＡマーカーのうち、ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ｅｘｐｒｓのみを含むｅ３３モデル（ＳＥＲＰＩＮＥ１＿ｅｘｐｒｓ＋ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１＋ＲＡＤ２１＿ａｍｐ）がＬＯＯＣＶ．ＡＵＣを基準として最も良い性能を示した（図６参照）。

【0092】

このような結果は、ＲＡＤ２１遺伝子、特にＤＮＡ突然変異の有無と共に、ＤＮＡマーカーおよびＲＮＡマーカーを用いることにより、先行抗癌化学療法を適用可能なＨＥＲ２早期陽性乳癌患者の薬物治療予後をより正確に予測できることを示唆する。

【0093】

これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【外国語明細書】