特開 2024-120937 マトリックスメタロプロテアーゼ１のモノクローナル抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024120937

(43)【公開日】2024-09-05

(54)【発明の名称】マトリックスメタロプロテアーゼ１のモノクローナル抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/40 20060101AFI20240829BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240829BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240829BHJP

【ＦＩ】

C07K16/40 ZNA

C12N15/13

G01N33/53 D

G01N33/543 541Z

G01N33/543 545A

G01N33/543 521

C07K16/40

【審査請求】有

【請求項の数】2

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024101735

(22)【出願日】2024-06-25

(62)【分割の表示】P 2022547314の分割

【原出願日】2020-02-27

(71)【出願人】

【識別番号】522308901

【氏名又は名称】エスアンドティー バイオメッド カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】張雅▲テイ▼

(72)【発明者】

【氏名】余兆松

(72)【発明者】

【氏名】王俊勝

(72)【発明者】

【氏名】呉淑芳

(72)【発明者】

【氏名】陳致儒

(72)【発明者】

【氏名】劉晏君

(57)【要約】

【課題】マトリックスメタロプロテアーゼ１のモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】モノクローナル抗体は、ｉ）配列番号１、７、及び１３からなる群から選択されるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２、８、及び１４からなる群から選択されるＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号３、９、及び１５からなる群から選択されるＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する。モノクローナル抗体はまた、ｉ）配列番号４、１０、及び１６からなる群から選択されるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５、１１、及び１７からなる群から選択されるＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号６、１２、及び１８からなる群から選択されるＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、及びその相補的ポリヌクレオチド配列もまた提供される。検出キット及び検出方法も提供され、検出キットはマトリックスメタロプロテアーゼ１のモノクローナル抗体を含む。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）配列番号１、７、及び１３からなる群から選択されるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２、８、及び１４からなる群から選択されるＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号３、９、及び１５からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域配列、並びに
ｉ）配列番号４、１０、及び１６からなる群から選択されるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５、１１、及び１７からなる群から選択されるＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号６、１２、及び１８からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域配列
を含む、モノクローナル抗体。

【請求項2】

前記重鎖可変領域配列は配列番号１、２、及び３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域配列は配列番号４、５、及び６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項3】

前記重鎖可変領域配列は配列番号７、８、及び９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域配列は配列番号１０、１１、及び１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項4】

前記重鎖可変領域配列は配列番号１３、１４、及び１５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域配列は配列番号１６、１７、及び１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項5】

請求項１のアミノ酸配列をコードするか、又は請求項１のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列と相補的な配列を有する、ポリヌクレオチド。

【請求項6】

モノクローナル抗体Ａを含み、前記モノクローナル抗体Ａは、配列番号１、２、及び３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４、５、及び６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、検出キット。

【請求項7】

酵素免疫測定法試薬キット、金コロイド免疫測定法テストストリップ、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項６に記載の検出キット。

【請求項8】

前記酵素免疫測定法試薬キットはモノクローナル抗体Ｂを含み、
前記モノクローナル抗体Ｂは、
配列番号７、８、及び９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１０、１１、及び１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項７に記載の検出キット。

【請求項9】

前記モノクローナル抗体Ｂは発色基に結合している、請求項８に記載の検出キット。

【請求項10】

前記金コロイド免疫測定法テストストリップは、
配列番号１３、１４、及び１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号１６、１７、及び１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むモノクローナル抗体Ｃを含む、
請求項７に記載の検出キット。

【請求項11】

前記金コロイド免疫測定法テストストリップは前記モノクローナル抗体Ａをさらに含み、前記金コロイド免疫測定法テストストリップにおける前記モノクローナル抗体Ａは金粒子に連結している、請求項６又は請求項１０に記載の検出キット。

【請求項12】

請求項６に記載の検出キットを用いて試料中のマトリックスメタロプロテアーゼ１を検出することを含む、
マトリックスメタロプロテアーゼ１をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法。

【請求項13】

前記試料は体液又は血液を含む、請求項１２に記載の検出方法。

【請求項14】

前記体液は口腔分泌物又は呼吸器分泌物を含む、請求項１３に記載の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ＭＭＰ－１、及び口腔がんの検出方法、特に、ＭＭＰ－１モノクローナル抗体、ＭＭＰ－１モノクローナル抗体を含む検出キット、及び検出キットを用いる検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

世界保健機関の統計によると、毎年５２９，０００人以上の口腔がんの新規患者が診断されている。発症率の上昇により、患者数は２０３５年までに年間８５６，０００人に達すると予測される。台湾では、衛生福利部国民健康署（以下、国民健康署という）からの２０１６年の死亡原因の統計によると、口腔がん、中咽頭がん、及び下咽頭がんは、男性の全ての悪性腫瘍の中で４番目に多い死亡原因であった。約７，０００人の人々が毎年この疾患であると新たに診断され、約３，０００人の人々が死亡する。２０１２年～２０１６年の間のステージＩ～ＩＶの口腔がん患者の生存率は、それぞれ７９．９％、７１．０％、５６．５％、及び３５．６％であった。早期に検出された場合は、生存率は改善されることになる。

【0003】

現在のところ、口腔粘膜スクリーニングは口腔がんの臨床評価のための重要な方法であり、病変部での組織生検の結果が診断の根拠として用いられる。しかしながら、現在のところ、口腔粘膜スクリーニングは専門の口腔衛生従事者（例えば、歯科医、口腔衛生士、歯科療法士、口腔衛生療法士など）により行われる必要があり、多くの地域では、専門の口腔衛生従事者の不足により口腔がんの診断は遅れている。したがって、試料中の腫瘍マーカー（バイオマーカー）が存在するか否かを分析することが可能であれば、口腔がんの早期診断率は改善され得る。

【0004】

現在、口腔がんの日常的な同定のための腫瘍マーカーは存在していない。２０１６年のProceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS)における報告によると、マトリックスメタロプロテアーゼ1（ＭＭＰ－１）が質量分析による定量分析により定量化され、患者の唾液試料と対照の唾液試料の間のＭＭＰ－１の発現の差が８３倍もの大きさであった（他の分子の差は－１．３倍～５．５倍であった）ことが示されており、ＭＭＰ－１が口腔がんの腫瘍マーカーとして最も可能性のある分子である。

【0005】

ＭＭＰ－１に対する既存の質量分析による定量分析法は多数の試料の日常的な定量分析には適していないので、口腔がんのスクリーニングのためのＭＭＰ－１に対する検出キットの開発が期待されている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示のいくつかの実施形態は、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体を提供する。重鎖可変領域配列は、ｉ）配列番号１、７、及び１３からなる群から選択されるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２、８、及び１４からなる群から選択されるＣＤＲ２、並びにｉｉｉ）配列番号３、９、及び１５からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む。軽鎖可変領域配列は、ｉ）配列番号４、１０、及び１６からなる群から選択されるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５、１１、及び１７からなる群から選択されるＣＤＲ２、並びにｉｉｉ）配列番号６、１２、及び１８からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は配列番号１、２、及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域配列は配列番号４、５、及び６のアミノ酸配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は配列番号７、８、及び９のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域配列は配列番号１０、１１、及び１２のアミノ酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は配列番号１３、１４、及び１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域配列は配列番号１６、１７、及び１８のアミノ酸配列を含む。

【0010】

本開示のいくつかの実施形態はポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは、前述のアミノ酸配列をコードするか、又は前述のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列と相補的な配列を有する。

【0011】

本開示のいくつかの実施形態は検出キットを提供する。検出キットはモノクローナル抗体Ａを含み、モノクローナル抗体Ａは重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は配列番号１、２、及び３のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は配列番号４、５、及び６のアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、検出キットは、酵素免疫測定法試薬キット、金コロイド免疫測定法テストストリップ、又はこれらの組み合わせをさらに含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、酵素免疫測定法試薬キットは、モノクローナル抗体Ｂを含む。モノクローナル抗体Ｂは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は配列番号７、８、及び９のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は配列番号１０、１１、及び１２のアミノ酸配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体Ｂは発色基に結合している。

【0015】

いくつかの実施形態では、金コロイド免疫測定法テストストリップはモノクローナル抗体Ｃを含む。モノクローナル抗体Ｃは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域は配列番号１３、１４、及び１５のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は配列番号１６、１７、及び１８のアミノ酸配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、金コロイド免疫測定法テストストリップはモノクローナル抗体Ａをさらに含み、金コロイド免疫測定法テストストリップにおけるモノクローナル抗体Ａは金粒子に連結している。

【0017】

本開示のいくつかの実施形態は、マトリックスメタロプロテアーゼ1をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法を提供し、この方法は、前述の検出キットを用いて試料中のマトリックスメタロプロテアーゼ1を検出することを含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、試料は体液又は血液を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、体液は口腔分泌物又は呼吸器分泌物を含む。

【0020】

本開示の前述の及び他の目的、特徴、利点、及び実施形態をより明瞭に理解するため、添付の図面の説明は以下の通りである。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A】本開示の一実施形態における、酵素免疫測定法を用いたＭＭＰ－１に対する自己産生モノクローナル抗体の結合能力試験の比較グラフを示す図である。

【図1B】本開示の一実施形態における、酵素免疫測定法を用いたＭＭＰ－１に対する自己産生モノクローナル抗体の結合能力試験の比較グラフを示す図である。

【図2A】本開示の一実施形態における、酵素免疫測定法により測定された正常ヒト唾液試料中の濃度プロファイルを示す図であり、モノクローナル抗体の至適な４組のペアが酵素免疫測定法の捕捉抗体及び検出抗体としてそれぞれ用いられた。

【図2B】本開示の一実施形態における、酵素免疫測定法により測定された口腔がん患者唾液試料中の濃度プロファイルを示す図であり、モノクローナル抗体の至適な４組のペアが酵素免疫測定法の捕捉抗体及び検出抗体としてそれぞれ用いられた。

【図3A】本開示の一実施形態における、金コロイド免疫測定法テストストリップの模式図を示す図である。

【図3B】本開示の一実施形態における、金コロイド免疫測定テストストリップにより得られた等級を示す比色カードの模式図を示す図である。

【図4】本開示の一実施形態における、金コロイド免疫測定法テストストリップと酵素免疫測定法試薬キットの相互比較の散布図を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本開示を詳細且つ完全に説明するために本開示の実施態様及び具体的実施形態を例示的な説明と共に示すが、これらは本開示の具体的実施形態の実施又は使用のための唯一の形態ではない。本明細書に開示される実施形態は、有利な方法で互いに組み合わされても置換されてもよく、追加の説明を伴わずに、ある実施形態に他の実施形態が加えられてもよい。以下の説明では、以下の実施形態の完全な理解を可能にするために多数の具体的詳細が詳細に説明されることになる。しかしながら、本開示の実施形態は、これらの具体的詳細なしでも実施されてもよい。

【0023】

本明細書では、文脈上、別段の具体的な定めがない限り、「不定冠詞」及び「定冠詞」は、１または複数を意味し得る。本明細書で使用される「含む」、「含有する」、「有する」、及び類似の用語は、記載された特徴、領域、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は構成要素を示すが、他の特徴、領域、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は構成要素を排除するものではないことがさらに理解されるだろう。

【0024】

本明細書に開示される方法を例示するために以下に一連の操作又はステップが説明されるが、操作又はステップの順番は制限するものとして解釈されない。例えば、ある操作又はステップは異なる順番で、及び／又は他のステップと同時に実施されてもよい。また、本開示の実施形態を実施するために全ての例示される操作、ステップ、及び／又は特徴が必要とされるとは限らない。さらに、本明細書に記載される操作及びステップのそれぞれは、複数のサブステップ及び作用を含み得る。

【0025】

本明細書では、「ＣＤＲ」（相補性決定領域）は、抗原が抗体と接触する領域であり、抗体の可変領域の一部である。一般に、抗体の可変領域には３つのＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が存在している。

【0026】

本明細書では、「誘導配列」とは、ヌクレオチド配列の３’末端又は５’末端で改変された配列をいう。

【0027】

本開示のいくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ－１）を認識するモノクローナル抗体が提供される。重鎖可変領域配列は、ｉ）配列番号１、７、及び１３からなる群から選択されるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号２、８、及び１４からなる群から選択されるＣＤＲ２、並びにｉｉｉ）配列番号３、９、及び１５からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む。軽鎖可変領域配列は、ｉ）配列番号４、１０、及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列であるＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号５、１１、及び１７からなる群から選択されるＣＤＲ２、並びにｉｉｉ）配列番号６、１２、及び１８からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は配列番号１、２、及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域配列は配列番号４、５、及び６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は配列番号７、８、及び９のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域配列は配列番号１０、１１、及び１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は配列番号１３、１４、及び１５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域配列は配列番号１６、１７、及び１８のアミノ酸配列を含む。

【0029】

本開示のいくつかの実施形態ではポリヌクレオチドが提供され、このポリヌクレオチドは、前述のアミノ酸配列をコードするか、又は前述のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列と相補的な配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは誘導配列をさらに含んでいてもよい。

【0030】

本開示のいくつかの実施形態では検出キットが提供される。検出キットは、体液（例えば、口腔分泌物又は呼吸器分泌物）又は血液などの臨床試料を検出するために用いられてもよい。検出キットはモノクローナル抗体Ａを含む。モノクローナル抗体Ａの重鎖可変領域は配列番号１、２、及び３のアミノ酸配列を含み、モノクローナル抗体Ａの軽鎖可変領域は配列番号４、５、及び６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体Ａの重鎖可変領域は配列番号１であるＣＤＲ１、配列番号２であるＣＤＲ２、及び配列番号３であるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、モノクローナル抗体Ａの軽鎖可変領域は配列番号４であるＣＤＲ１、配列番号５であるＣＤＲ２、及び配列番号６であるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、検出キットは、酵素免疫測定法試薬キット、金コロイド免疫測定法テストストリップ、又はこれらの組み合わせを含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、酵素免疫測定法試薬キットは、捕捉抗体としてのモノクローナル抗体Ａを用いるサンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法（サンドイッチＥＬＩＳＡ）を使用する。ある実施形態では、免疫測定法試薬キットはモノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを含み、モノクローナル抗体Ａは捕捉抗体として機能し、モノクローナル抗体Ｂは発色基に結合しており、且つ検出抗体として機能する。モノクローナル抗体Ｂの重鎖可変領域は配列番号７、８、及び９のアミノ酸配列を含み、モノクローナル抗体Ｂの軽鎖可変領域は配列番号１０、１１、及び１２のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、モノクローナル抗体Ｂの重鎖可変領域は配列番号７であるＣＤＲ１、配列番号８であるＣＤＲ２、及び配列番号９であるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、モノクローナル抗体Ｂの軽鎖可変領域は配列番号１０であるＣＤＲ１、配列番号１１であるＣＤＲ２、及び配列番号１２であるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、発色基は、蛍光基又は化学発光基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））を含む。

【0033】

注目すべき点は、本開示のいくつかの実施形態では、１１種類のモノクローナル抗体の自己産生のため、及び酵素免疫測定法試薬キットにおいて用いられ得るモノクローナル抗体ペア（捕捉抗体：モノクローナル抗体Ａ、及び検出抗体：モノクローナル抗体Ｂ）を選別するための免疫源としてヒト組換えＭＭＰ－１（全長ＭＭＰ－１）を使用することが開示されるということであり、これは、ＭＭＰ－１への結合能力の著しい低下、臨床試料の検出においてしばしば生じる高いバックグラウンド値、及び感度の不足など、発色基に結合しているモノクローナル抗体に由来する制限を克服し、（ＭＭＰ－１の検出さえできないことがある）他のペアと比較して良好な感度を有する。さらに、そのようなペアはモノクローナル抗体がＭＭＰ－１に結合する能力と関連していないことが強調されるべきである。本開示のいくつかの実施形態のモノクローナル抗体ペアは、捕捉抗体として用いられる市販の抗体（免疫源はＭＭＰ－１の２０番目～４６９番目のアミノ酸である）、免疫源としてプロテアーゼ不活性型ＭＭＰ－１を用いて産生された他のモノクローナル抗体、免疫源としてＭＭＰ－１断片（例えば、ＭＭＰ－１の１００番目～３００番目のアミノ酸の任意の断片、又はプロテアーゼ不活性断片）を用いて産生された他のポリクローナル抗体などの他の抗体ペアと比較して高い感度を有することは言及する価値がある。

【0034】

いくつかの実施形態では、金コロイド免疫測定法テストストリップは、重なり合った金コロイドパッド及びアッセイプレートを含み、金コロイドパッドには検出抗体－金粒子複合体を含む金コロイドパッド溶液が噴霧されており、アッセイプレートの表面はニトロセルロース膜を有しており、その上に捕捉抗体を含む溶液が測定線として塗布される。ある実施形態では、金コロイド免疫測定法テストストリップは、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｃを含み、モノクローナル抗体Ａは金粒子に連結している検出抗体として用いられ、モノクローナル抗体Ｃは捕捉抗体として用いられる。モノクローナル抗体Ｃの重鎖可変領域は配列番号１３、１４、及び１５のアミノ酸配列を含み、モノクローナル抗体Ｃの軽鎖可変領域は配列番号１６、１７、及び１８のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、モノクローナル抗体Ｃの重鎖可変領域は配列番号１３であるＣＤＲ１、配列番号１４であるＣＤＲ２、及び配列番号１５であるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号１６であるＣＤＲ１、配列番号１７であるＣＤＲ２、及び配列番号１８であるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。

【0035】

注目すべき点は、本開示のいくつかの実施形態では、金コロイド免疫測定法テストストリップにおいて用いられ得るモノクローナル抗体ペア（捕捉抗体：モノクローナル抗体Ｃ、及び検出抗体：モノクローナル抗体Ａ）が、免疫測定法試薬キットにおいて用いられ得るモノクローナル抗体ペアから選別され、検出抗体が金粒子に連結することに成功していくつかのモノクローナル抗体が金粒子に連結できないという問題を克服し、いくつかの組み合わせが他の組み合わせと比べて良好な感度を有するということである。さらに、酵素免疫測定法試薬キットにおいて最良の感度を有するペアは、金コロイド免疫測定法テストストリップにおいては最良の感度を有しない可能性があることも明らかになった。すなわち、ある検出系における抗体ペアが他の検出系に適用される場合、実際の試験により感度の良い点と悪い点を検証する必要が依然としてあり、既存の既知の検出系と正の相関関係が必ずしもあるわけではない。

【0036】

本開示のいくつかの実施形態ではＭＭＰ－１の検出方法が提供される。この方法は、前述の検出キットを用いて試料中のＭＭＰ－１を検出することを含む。例えば、ＭＭＰ－１の存在／非存在又は含有量の検出は、酵素免疫測定法試薬キット、金コロイド免疫測定法テストストリップ、又はこれらの組み合わせの発色の存在／非存在、又は発色の値に関する定量化（例えば、光学濃度の値（ＯＤ値））により決定され得る。いくつかの実施形態では、試料は体液（例えば、口腔分泌物又は呼吸器分泌物）又は血液を含む。いくつかの実施形態では、検出キットは、定量化のために酵素免疫測定法試薬キットを用いることができ、迅速スクリーニングのために金コロイド免疫測定法テストストリップを用いることができるので、定性的結果及び定量的結果の両方を同時に得ることができる。

【0037】

ＭＭＰ－１が口腔がんの検出インデックスとして用いられ得るので、本開示のいくつかの実施形態により提供されるＭＭＰ－１の検出キット及び検出方法は、口腔がんのスクリーニングのために同時に用いられ得る。そのような適用は専門の口腔医療従事者により行われる必要がなく、これにより、スクリーニングの需要が増加し、口腔がん患者の診断が加速され、治療の可能性が改善され得る。

【実施例0038】

本開示の種々の実施形態により提供されるＭＭＰ－１のモノクローナル抗体、ポリヌクレオチド、検出キット、及び検出方法をさらに説明するため、以下の実施例を実施した。以下の実施形態は例示目的のためにのみ提供されるものであり、本開示を限定することを意図していないことに留意すべきである。

【0039】

実施形態１．モノクローナル抗体の開発プロセス
最初に、プロテアーゼ活性を保持しているヒトＭＭＰ－１組み換えタンパク質を免疫源として用いて、マウスの免疫応答を介してマウスＭＭＰ－１モノクローナル抗体細胞株を開発し、１１のマウスモノクローナル抗体細胞株を選別し、細胞液を回収及び精製して各モノクローナル抗体を得て、１－８Ａ１２株、４－２６株、６－２株、２０－４株、３０－２２株、３１－３４株、４４－２８株、５７－４１株、６１－２４株、７３－１株、及び７９－４株と名付けた。

【0040】

実施形態２－１．ＭＭＰ－１検出のための酵素免疫測定法試薬キット：各モノクローナル抗体がＭＭＰ－１に結合する能力の試験
各モノクローナル抗体がＭＭＰ－１に特異的に結合可能であるか否かを試験するため、前述の１１種類のモノクローナル抗体株を段階希釈した後、直接ＥＬＩＳＡを用いてモノクローナル抗体のヒト組換えＭＭＰ－１への結合を試験した。結果を図１Ａに示す。

【0041】

図１Ａは、各モノクローナル抗体はＭＭＰ－１に特異的に結合可能であり、これらのモノクローナル抗体はＭＭＰ－１に対する異なる結合能力を有し、結合能力の順番は、強いものから弱いものの順に、６－２株＞７３－１株＞１－８Ａ１２株＞４－２６株＞２０－４株＞３１－３４株＞４４－２８株＞６１－２４株＞３０－２２株＞５７－４１株＞７９－７株であったことを示した。

【0042】

さらに、モノクローナル抗体が酵素免疫測定法における抗体検出として使用可能であるか否か、すなわち、モノクローナル抗体が発色基に結合された後でも依然としてＭＭＰ－１に結合する能力を有しているか否かを試験するために、各モノクローナル抗体をＨＲＰに結合した後、前述の図１Ａと同じ方法でＭＭＰ－１の結合能力試験を行った。結果を図１Ｂに示す。

【0043】

図１Ｂは、ＨＲＰに結合した後の各モノクローナル抗体が、ヒト組換えＭＭＰ－１に特異的に結合する能力を依然として有していたことを示した。しかしながら、図１Ａと比較して、ＨＲＰに結合しているモノクローナル抗体はヒト組換えＭＭＰ－１に対する結合能力においてわずかな変化を示し、順番は、強いものから弱いものの順に、７３－１－ＨＲＰ＞４－２６－ＨＲＰ＝６－２－ＨＲＰ＞４４－２８－ＨＲＰ＞３１－３４－ＨＲＰ＞１－８Ａ１２－ＨＲＰ＞２０－４－ＨＲＰ＞６１－２４－ＨＲＰ＞５７－４１－ＨＲＰ＞３０－２２－ＨＲＰ＞７９－７－ＨＲＰであった。

【0044】

実施形態２－２．ＭＭＰ－１検出のための酵素免疫測定法試薬キット：抗体ペアのスクリーニング
前述の１１種類のモノクローナル抗体株を、それぞれ酵素免疫測定法試薬キットの捕捉抗体及び（ＨＲＰに結合している）検出抗体として用いて、ペア試験（paired test）を行った。理論上１１×１０＝１１０ペアの組み合わせが生成され得るが、３種類のモノクローナル抗体株がペア試験において極めて非効果的であったため排除された。実際、合計で９２の組み合わせのペア試験が完了し、ＭＭＰ－１を検出可能な至適ペアが選別された。

【0045】

１－８Ａ１２株を例とした各ペアの試験プロセスは以下のように説明される。（１）捕捉抗体として１－８Ａ１２株及び検出抗体としての４－２６－ＨＲＰを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。捕捉抗体は４種類の濃度を有し、検出抗体は６種類の濃度を有していた。１セットのペアが２４種類の条件で試験されたことになる。ヒト組換えＭＭＰ－１を含む溶液（試料の値）とヒト組換えＭＭＰ－１を含まない溶液（バックグラウンドの値）のＯＤ値の差（試料の値－バックグラウンドの値）をこれら２４種類の条件の下で計算した。値が大きいほど、抗体ペアが検出可能なＭＭＰ－１に結合する能力は高くなる。（２）前述のステップ１にしたがって９２の組み合わせのペア試験を完了した。結果を以下の表１に示す。表１の値は、ペア試験における各ペアのＯＤ値の差の最大値である。

【0046】

【表1】

【0047】

表１は、ペア試験においてより強いシグナル（より大きな差）を有するモノクローナル抗体ペアは、個々のモノクローナル抗体のＭＭＰ－１の結合能力と絶対的な相関関係がなかったこと示した。すなわち、酵素免疫測定法試薬キットに適した至適抗体ペアは、個々のモノクローナル抗体のＭＭＰ－１の結合能力により決定することはできず、実際のペア試験で選別される必要があった。

【0048】

実施形態２－３．ＭＭＰ－１検出のための酵素免疫測定法試薬キット：各抗体ペアの濃度標準曲線
実施形態２－２の結果にしたがって、（表２に示される）１２組の抗体ペアについてサンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、各抗体ペアから検出化可能なヒト組換えＭＭＰ－１濃度標準曲線の範囲を得た。結果を表３に示す。

【0049】

【表2】

【0050】

【表3】

【0051】

表３の結果は、ヒト組換えＭＭＰ－１の試験濃度範囲が０．０１～２．５ｎｇ／ｍｌの場合、各ペアのＯＤ値はＭＭＰ－１濃度の上昇と共に増加したことを示した。

【0052】

次に、各抗体ペアにより検出可能な標準曲線の濃度範囲を回収率を用いて評価し、回収率８０～１２０を信頼できる範囲であると設定した。この信頼できる範囲内である濃度はアスタリスク（^＊）で示される。結果は、１２組の抗体ペアの標準曲線の濃度範囲は異なっており、いくつかのペアは低濃度で負の値を有していることからバックグラウンドの値が高く、低濃度試料の検出をもたらさなかったことを示した。

【0053】

実施形態２－４．ＭＭＰ－１検出のための酵素免疫測定法試薬キット：臨床唾液試料中の内在性ＭＭＰ－１の検出
次に、抗体ペアがヒト組換えＭＭＰ－１に加えて臨床唾液試料中の内在性ＭＭＰ－１を検出可能であるか否かを確認するため、実施形態２－３の１２組の抗体ペアを用いて既知の内在性ＭＭＰ－１含有量（含有量はマルチプレックスＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳで分析した）の８種類の唾液試料を検出した。結果を表４に示す。

【0054】

【表4】

【0055】

結果は、１２組の抗体ペアの全てが唾液試料中の内在性ＭＭＰ－１の検出が可能であり、前記ペアの大部分により検出されるＭＭＰ－１含有量は実際の含有量と一致していることから１２組の抗体ペアが唾液試料中のＭＭＰ－１の検出に対する十分な特異性も有していたことを示した。表４の結果にしたがって、良好な感度を有する２番、４番、５番、及び１０番をさらなる評価のために選択した。

【0056】

臨床応用の実現可能性を評価するため、正常な健康な人からの１５種類の臨床唾液試料（健康対照、ＨＣ）及び口腔がん患者からの２５種類の臨床唾液試料（口腔扁平細胞腫瘍、ＯＳＣＣ）を採取し、次に、酵素免疫測定法実験のために５倍に希釈した。結果を図２Ａ（正常ヒト群）及び図２Ｂ（口腔がん患者群）に示す。追加のデータ分析を図２Ａ及び図２Ｂを用いて行った。

【0057】

結果は４組の抗体ペアの測定値が正常ヒト群及び口腔がん患者群の両方において有意に相関していた（スピアマンのρ＝０．９５３～０．９８８）ことを示しており、さらに、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析は前記４組の抗体ペアが内在性ＭＭＰ－１の検出に適していた（ＲＯＣの曲線下面積（ＲＯＣのＡＵＣ）＝０．９３７～０．９６７）ことを示した。ＲＯＣ分析による得られた前記４組の感度及び特異性を表５に要約する。

【0058】

【表5】

【0059】

表５にしたがって、ＭＭＰ－１酵素免疫測定法試薬キットの調製のために、高い感度を有する４番の抗体ペアを選択した。

【0060】

実施形態２－５．ＭＭＰ－１検出のための酵素免疫測定法試薬キット：機能試験
米国臨床検査標準委員会により出版されているGlobal Laboratory Standards for a Healthier Worldにしたがって、４番の抗体ペアを用いてＭＭＰ－１酵素免疫測定法試薬キットについての機能試験を行った。結果は以下のようであった。

【0061】

１．感度分析（基準Ｅｐ１７－Ａ２を参照）：ブランク限界（ＬｏＢ）は５７．４０ｐｇ／ｍｌであり、検出限界（ＬｏＤ）は１１７．０２ｐｇ／ｍｌであった。
２．線形分析（基準Ｅｐ０６－Ａを参照）：最良非線形多項式は３次回帰であり、濃度は１４０～８，０００ｐｇ／ｍｌの間に線形に分布した（非線形性≦５％）。
３．精度分析（基準Ｅｐ０５－Ａ３を参照）：繰り返し精度の平均ＣＶ（％）は４．８０９％であり、試験室内精度の平均ＣＶ（％）は９．５６９％であった。

【0062】

実施形態３－１．ＭＭＰ－１検出のための金コロイド免疫測定法テストストリップ：抗体マッチングの組み合わせの選択
次に、ＭＭＰ－１検出のための金コロイド免疫測定法テストストリップに適した抗体の組み合わせを見出すために自己産生モノクローナル抗体をさらに試験した。金コロイドパッド１１０及びアッセイプレート１２０を含む金コロイド免疫測定法テストストリップ１の模式図である図３Ａを参照されたい。金コロイドパッド１１０及びアッセイプレート１２０は互いに積み重ねられてもよく、例えば、金コロイドパッド１１０がアッセイプレート１２０の上に重ねられるか、又はアッセイプレート１２０が金コロイドパッド１１０の上に重ねられた。検出抗体－金粒子複合体を含む金コロイドパッド溶液１１１が金コロイドパッド１１０上に噴霧されており、アッセイプレート１２０の表面はニトロセルロース膜で覆われており、捕捉抗体を含む溶液を前記ニトロセルロース膜上にコーティングすることにより測定線１２２が形成された。さらに、内部対照抗体を含む溶液を前記ニトロセルロース膜上に添加した。これは内部対照線１２１として機能し得た。試験中、試料は検出抗体－金粒子複合体を含む金コロイドパッド１１０に添加され、試料は免疫クロマトグラフィーにより金コロイドパッド１１０からアッセイプレート１２０上のニトロセルロース膜まで移動した。ＭＭＰ－１が検出抗体－金粒子複合体に結合した場合、前記検出抗体－金粒子複合体に結合したＭＭＰ－１を測定ライン１２２上の捕捉抗体が捕捉して、凝集して橙色から赤色のシグナル（金粒子の色）を形成することになる。したがって、試験結果は、測定ライン１２２が着色されたか否かにより判断可能であった。

【0063】

抗体マッチングの組み合わせを選択するために、実施形態２－４で良好な感度を有していた４組の抗体ペア（２番、４番、５番、１０番）において用いられたモノクローナル抗体である１－８Ａ１２株、６－２株、２０－４株、３１－３４株、及び７３－１株をペアにして以下のように試験した。

【0064】

最初に、５種類の抗体をナノスケールの金粒子（直径１００ｎｍ未満）と反応させて「検出抗体－金粒子複合体」を形成した。しかしながら、１－８Ａ１２株及び７３－１株は金粒子と十分に反応しなかったので、金粒子は前記検出抗体に連結できなかった。したがって、６－２－金粒子、２０－４－金粒子、及び３１－３４－金粒子のみがヒト組換えＭＭＰ－１とペアにされ、合計１０組の組み合わせであった。結果を表６に示す。

【0065】

【表6】

【0066】

表６によると、組み合わせＣは良好な感度を達成することができたので、次の臨床試料試験のために組み合わせＣが選択された。

【0067】

実施形態３－２．ＭＭＰ－１検出のための金コロイド免疫測定法テストストリップ：臨床試料の試験
上記組み合わせＣを含む金コロイド免疫測定法テストストリップによる臨床試料の検出実現可能性を評価するため、２１５種類の唾液試料を試験して、酵素免疫測定法により相互比較した。

【0068】

金コロイド免疫測定法テストストリップについては、図３Ｂを参照のこと。試料の反応度を、比色カードに対してスコア化した。比色カードは、測定線１２２の色の強さにしたがって、０～５点に分けられた。比色カードを用いて、０、０～１（０．５）、１、１～２（１．５）、２、２～３（２．５）、３、３～４（３．５）、４、４～５（４．５）、５、５より大きい（５．５）の合計１２の等級にスコア化した。次に、比色カードの等級と酵素免疫測定法により測定されたＭＭＰ－１の濃度とのＸ－Ｙ分布図を作成した。結果を図４に示す。

【0069】

図４は、金コロイド免疫測定法テストストリップの結果及び酵素免疫測定法の結果が正に相関しており、相関分析結果はＲ＝０．８７１（ｐ＜０．０００１）であったことを示した。すなわち、組み合わせＣを含む金コロイド免疫測定法テストストリップは、臨床唾液試料中のＭＭＰ－１の検出に使用可能であった。

【0070】

まとめると、本開示の実施形態は、臨床試料中の内在性ＭＭＰ－１の検出に効果的な検出方法を開示する。検出方法は、４番のモノクローナル抗体ペア（捕捉抗体：３１－３４株、検出抗体：７３－１株）を用いる酵素免疫測定法試薬、及び組み合わせＣ（捕捉抗体：１－８Ａ１２株、検出抗体：３１－３４株）のモノクローナル抗体ペアを用いる金コロイド免疫測定法テストストリップを少なくとも含む。各モノクローナル抗体のアミノ酸配列、主な特徴、及び対応する配列番号を以下の表７に示す。

【0071】

【表7】

【0072】

実施形態４．対照群の結果との比較
実施形態２～３の開発プロセスにおいて、各検出のための捕捉抗体としていくつかの対照群も用いられ、自己産生された１－８Ａ１２が検出抗体として用いられ、検出結果は同時に比較及び分析された。市販の抗体（７番）、免疫源としてＭＭＰ－１ペプチド断片を用いて産生されたポリクローナル抗体（１番～４番）、免疫源としてプロテアーゼ不活性型ＭＭＰ－１を用いて産生されたポリクローナル抗体（５番～６番）、及び免疫源としてプロテアーゼ不活性型ＭＭＰ－１を用いて産生された他のマウスモノクローナル抗体（８番～１６番）の合計１６種類の抗体を含む、対照群の抗体を表８に示す。

【0073】

【表8】

【0074】

比較結果は、抗体の大部分は、直接ＥＬＩＳＡの段階においてヒト組換えＭＭＰ－１に効率的に結合可能であったが、ペア形成のプロセスに入ると、多くのペアの非特異的結合が非常に高く、それらの感度は一般に不十分であったことを示した。捕捉抗体としての対照群及び検出抗体としての自己産生抗体のペアにおいて、最良のペアは市販抗体ＭＡＢ９０１と１－８Ａ１２－ＨＲＰであったが、その濃度標準曲線の範囲（表９Ａ）及び唾液試料中のＭＭＰ－１の検出における効率（表９Ｂ）は、自己産生抗体ペアのものより劣っていた。したがって、本開示の実施形態において選別されたペアは、捕捉抗体が、市販抗体、免疫源としてプロテアーゼ不活性型ＭＭＰ－１を用いて産生されたモノクローナル抗体、又は免疫源としてＭＭＰ－１断片を用いるポリクローナル抗体を用いる抗体ペアと比較して、より感度が高かった。

【0075】

【表9】

【0076】

【表10】

【0077】

配列表

【表11】

【0078】

【表12】

【0079】

【表13】

【0080】

【表14】

【0081】

【表15】

【0082】

【表16】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【配列表】

2024120937000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-07-11

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

モノクローナル抗体Ｂ又はモノクローナル抗体Ｃを含む、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ１に結合するモノクローナル抗体であって、
前記モノクローナル抗体Ｂは、
ｉ）配列番号７のＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号８のＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号９のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域配列、並びに
ｉ）配列番号１０のＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号１２のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域配列
を含み、
前記モノクローナル抗体Ｃは、
ｉ）配列番号１３のＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１４のＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号１５のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域配列、並びに
ｉ）配列番号１６のＣＤＲ１、ｉｉ）配列番号１７のＣＤＲ２、及びｉｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域配列
を含む、
前記モノクローナル抗体。

【請求項2】

請求項１のモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。