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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024121427
(43)【公開日】2024-09-06
(54)【発明の名称】状態特定方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240830BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240830BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 100Z
C12Q1/686 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023028534
(22)【出願日】2023-02-27
(71)【出願人】
【識別番号】000006507
【氏名又は名称】横河電機株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】三森 裕示
(72)【発明者】
【氏名】田口 朋之
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS14
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】試料の状態を効果的に特定すること。
【解決手段】状態特定方法は、封入容器２０に、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入し、封入容器２０を密閉し、加熱し、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて、封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する内部状態を特定する。
【選択図】図１
【解決手段】状態特定方法は、封入容器２０に、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入し、封入容器２０を密閉し、加熱し、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて、封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する内部状態を特定する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
容器の内部状態を特定する状態特定方法であって、
前記容器に、試料を含む試料溶液および発泡成形されたビーズを封入する封入工程と、
前記容器を密閉し、加熱する加熱工程と、
前記ビーズの大きさの変化に基づいて、前記加熱工程における前記容器の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する前記内部状態を特定する特定工程と、
を含む状態特定方法。
前記容器に、試料を含む試料溶液および発泡成形されたビーズを封入する封入工程と、
前記容器を密閉し、加熱する加熱工程と、
前記ビーズの大きさの変化に基づいて、前記加熱工程における前記容器の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する前記内部状態を特定する特定工程と、
を含む状態特定方法。
【請求項2】
前記特定工程は、
前記ビーズの減縮によって、前記容器が加熱された前記温度が１３０℃以上であることを特定する、
請求項１に記載の状態特定方法。
前記ビーズの減縮によって、前記容器が加熱された前記温度が１３０℃以上であることを特定する、
請求項１に記載の状態特定方法。
【請求項3】
前記ビーズは、発泡ポリスチレンである、
請求項１に記載の状態特定方法。
請求項１に記載の状態特定方法。
【請求項4】
前記容器は、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）チューブである、
請求項１に記載の状態特定方法。
請求項１に記載の状態特定方法。
【請求項5】
前記試料溶液は、菌体を含む菌体培養液である、
請求項１から４のいずれか１項に記載の状態特定方法。
請求項１から４のいずれか１項に記載の状態特定方法。
【請求項6】
前記加熱工程によって前記菌体の細胞から抽出された核酸を精製する精製工程、
をさらに含む請求項５に記載の状態特定方法。
をさらに含む請求項５に記載の状態特定方法。
【請求項7】
前記加熱工程によって前記菌体の細胞から抽出された核酸を増幅する増幅工程、
をさらに含む請求項５に記載の状態特定方法。
をさらに含む請求項５に記載の状態特定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、状態特定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
菌体培養液を採取し、溶解補助剤を添加し、菌体培養液に含まれる菌体の細胞から核酸を高温高圧条件で抽出する技術（適宜、「高温高圧法」）が知られている。また、容器の加熱処理が必要な工程において、温度に応じて変色するプルシアンブルーやロイコ系色素等の色素の色調を確認することによって容器が加熱された際の温度（適宜、「加熱温度」、「加温」）を特定する技術が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特許第５６２４４８７号公報
【特許文献2】特開２０１３－１３２２９８号公報
【特許文献3】特開２００２－３２２３８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、上記技術では、容器に収容される菌体培養液の加熱温度等の内部状態を効果的に特定することは難しい。例えば、上記のプルシアンブルーの変色を確認する手法では、菌体の細胞から核酸が抽出可能な１４０℃付近よりも低い１２１℃付近で変色してしまうので、実際に１４０℃付近まで到達しているかを確認することが難しい。また、上記のロイコ系色素の変色を確認する手法では、７０℃付近で変色し、２０℃で元の色に色相が可逆的に変化するので、実際に１４０℃付近まで到達しているかを確認することが難しい。
【0005】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、試料の状態を効果的に特定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、容器の内部状態を特定する状態特定方法であって、前記容器に、試料を含む試料溶液および発泡成形されたビーズを封入する封入工程と、前記容器を密閉し、加熱する加熱工程と、前記ビーズの大きさの変化に基づいて、前記加熱工程における前記容器の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する前記内部状態を特定する特定工程と、を含む状態特定方法を提供する。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、試料の状態を効果的に特定することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】実施形態に係る加温加圧特定システムの構成例を示す図である。
【図2】実施形態に係る加温加圧確認実験の実験結果の一例を示す図である。
【図3】実施形態に係る温度および圧力の関係性の一例を示す図である。
【図4】実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験条件１の一例を示す図である。
【図5】実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験条件２の一例を示す図である。
【図6】実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験条件３の一例を示す図である。
【図7】実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果の一例を示す図である。
【図8】実施形態に係る加温加圧特定工程の流れの一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下に、本発明の一実施形態に係る状態特定方法を、図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態により限定されるものではない。
【0010】
〔実施形態〕
以下に、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の構成、各工程の詳細、各工程の流れを順に説明し、最後に実施形態の効果を説明する。
以下に、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の構成、各工程の詳細、各工程の流れを順に説明し、最後に実施形態の効果を説明する。
【0011】
〔１．加温加圧特定システム１００の構成〕
図１を用いて、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の構成を説明する。図１は、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の構成例を示す図である。以下では、加温加圧特定システム１００全体の構成例、加温加圧特定システム１００の工程例、加温加圧特定システム１００の効果の順に説明する。
図１を用いて、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の構成を説明する。図１は、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の構成例を示す図である。以下では、加温加圧特定システム１００全体の構成例、加温加圧特定システム１００の工程例、加温加圧特定システム１００の効果の順に説明する。
【0012】
（１－１．加温加圧特定システム１００全体の構成例）
加温加圧特定システム１００は、菌体培養容器１０、封入容器２０および加熱装置３０を有する。以下では、菌体培養容器１０、封入容器２０、加熱装置３０の順に説明する。
加温加圧特定システム１００は、菌体培養容器１０、封入容器２０および加熱装置３０を有する。以下では、菌体培養容器１０、封入容器２０、加熱装置３０の順に説明する。
【0013】
（１－１－１．菌体培養容器１０）
菌体培養容器１０は、菌体培養液Ｓを収容する容器である。菌体培養液Ｓは、菌体Ｃ等の微生物を培養する溶液である。なお、図１の例では、菌体培養容器１０は、栓の付いた三角フラスコであるが、菌体培養容器１０の形状、材質、容量等は限定されない。
菌体培養容器１０は、菌体培養液Ｓを収容する容器である。菌体培養液Ｓは、菌体Ｃ等の微生物を培養する溶液である。なお、図１の例では、菌体培養容器１０は、栓の付いた三角フラスコであるが、菌体培養容器１０の形状、材質、容量等は限定されない。
【0014】
（１－１－２．封入容器２０）
封入容器２０は、菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入する容器である。発泡ビーズＢは、発泡成形されたポリスチレン製のビーズである。図１の例では、封入容器２０は、マイクロチューブであるが、封入容器２０の形状、材質、容量等は限定されない。
封入容器２０は、菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入する容器である。発泡ビーズＢは、発泡成形されたポリスチレン製のビーズである。図１の例では、封入容器２０は、マイクロチューブであるが、封入容器２０の形状、材質、容量等は限定されない。
【0015】
（１－１－３．加熱装置３０）
加熱装置３０は、加熱用溶液Ｈを加熱する容器である。図１の例では、加熱装置３０は、ヒートブロックであるが、加熱装置３０の形状、材質、加熱方式等は限定されない。
加熱装置３０は、加熱用溶液Ｈを加熱する容器である。図１の例では、加熱装置３０は、ヒートブロックであるが、加熱装置３０の形状、材質、加熱方式等は限定されない。
【0016】
（１－１－４．その他）
図１に示した加温加圧特定システム１００には、複数の菌体培養容器１０、複数の封入容器２０または複数台の加熱装置３０が含まれてもよい。また、菌体培養容器１０は、封入容器２０と統合した構成であってもよい。
図１に示した加温加圧特定システム１００には、複数の菌体培養容器１０、複数の封入容器２０または複数台の加熱装置３０が含まれてもよい。また、菌体培養容器１０は、封入容器２０と統合した構成であってもよい。
【0017】
（１－２．加温加圧特定システム１００の工程例）
上記の加温加圧特定システム１００の工程例について説明する。以下では、発泡ビーズ挿入工程、菌体培養液採取工程、加熱工程、サイズ確認工程の順に説明する。なお、各工程は、異なる順序で実行することもできる。また、各工程のうち、省略される工程があってもよい。
上記の加温加圧特定システム１００の工程例について説明する。以下では、発泡ビーズ挿入工程、菌体培養液採取工程、加熱工程、サイズ確認工程の順に説明する。なお、各工程は、異なる順序で実行することもできる。また、各工程のうち、省略される工程があってもよい。
【0018】
（１－２－１．発泡ビーズ挿入工程）
第１に、加温加圧特定システム１００では、図１（１）に示す発泡ビーズ挿入工程を実施する。例えば、発泡ビーズ挿入工程では、発泡ポリスチレンの発泡ビーズＢを使用し、封入容器２０に発泡ビーズＢを挿入する。このとき、発泡ビーズ挿入工程では、封入容器２０に複数の発泡ビーズＢを挿入してもよい。
第１に、加温加圧特定システム１００では、図１（１）に示す発泡ビーズ挿入工程を実施する。例えば、発泡ビーズ挿入工程では、発泡ポリスチレンの発泡ビーズＢを使用し、封入容器２０に発泡ビーズＢを挿入する。このとき、発泡ビーズ挿入工程では、封入容器２０に複数の発泡ビーズＢを挿入してもよい。
【0019】
（１－２－２．菌体培養液採取工程）
第２に、加温加圧特定システム１００では、図１（２）に示す菌体培養液採取工程を実施する。例えば、菌体培養液採取工程では、菌体Ｃとして、大腸菌（Escherichia coli：E.coli）や黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus：S.aureus）を使用し、ＳＣＤ（Soybean Casein Digest）液体培地において３７℃で一晩培養した菌体培養液Ｓの一部を、滅菌済みのホールピペットを使用して封入容器２０に採取する。このとき、菌体培養液採取工程では、菌体Ｃの細胞の溶解を促進する溶解補助剤を封入容器２０にさらに添加してもよい。
第２に、加温加圧特定システム１００では、図１（２）に示す菌体培養液採取工程を実施する。例えば、菌体培養液採取工程では、菌体Ｃとして、大腸菌（Escherichia coli：E.coli）や黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus：S.aureus）を使用し、ＳＣＤ（Soybean Casein Digest）液体培地において３７℃で一晩培養した菌体培養液Ｓの一部を、滅菌済みのホールピペットを使用して封入容器２０に採取する。このとき、菌体培養液採取工程では、菌体Ｃの細胞の溶解を促進する溶解補助剤を封入容器２０にさらに添加してもよい。
【0020】
（１－２－３．加熱工程）
第３に、加温加圧特定システム１００では、図１（３）に示す加熱工程を実施する。例えば、加熱工程では、加熱装置３０を設定温度である１４０℃まで予熱し、封入容器２０を加熱装置３０に設置し、発泡ビーズＢおよび菌体培養液Ｓを封入した封入容器２０を１４０℃、４５秒間加熱する。
第３に、加温加圧特定システム１００では、図１（３）に示す加熱工程を実施する。例えば、加熱工程では、加熱装置３０を設定温度である１４０℃まで予熱し、封入容器２０を加熱装置３０に設置し、発泡ビーズＢおよび菌体培養液Ｓを封入した封入容器２０を１４０℃、４５秒間加熱する。
【0021】
（１－２－４．サイズ確認工程）
第４に、加温加圧特定システム１００では、図１（４）に示すサイズ確認工程を実施する。例えば、サイズ確認工程では、封入容器２０に挿入された発泡ビーズＢのサイズが減縮していることを目視によって確認し、封入容器２０内の菌体培養液Ｓが１３０℃以上に加熱されたことを確認する。このとき、サイズ確認工程では、封入容器２０の容量や内容物から推定される温度と圧力の関係式から、封入容器２０の内部に加えられた圧力を特定することもできる。
第４に、加温加圧特定システム１００では、図１（４）に示すサイズ確認工程を実施する。例えば、サイズ確認工程では、封入容器２０に挿入された発泡ビーズＢのサイズが減縮していることを目視によって確認し、封入容器２０内の菌体培養液Ｓが１３０℃以上に加熱されたことを確認する。このとき、サイズ確認工程では、封入容器２０の容量や内容物から推定される温度と圧力の関係式から、封入容器２０の内部に加えられた圧力を特定することもできる。
【0022】
（１－２－５．その他）
加温加圧特定システム１００では、加熱工程によって抽出された菌体Ｃの核酸を精製する核酸精製工程をさらに実施することができる。例えば、核酸精製工程では、加熱工程後の菌体培養液Ｓをカラムに注入し、溶出液を注入することによって、菌体Ｃから抽出した核酸を精製することができる。
加温加圧特定システム１００では、加熱工程によって抽出された菌体Ｃの核酸を精製する核酸精製工程をさらに実施することができる。例えば、核酸精製工程では、加熱工程後の菌体培養液Ｓをカラムに注入し、溶出液を注入することによって、菌体Ｃから抽出した核酸を精製することができる。
【0023】
加温加圧特定システム１００では、加熱工程によって抽出された菌体Ｃの核酸を増幅させる核酸増幅工程をさらに実施することができる。例えば、核酸増幅工程では、加熱工程後の菌体培養液ＳにＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）ミックスを添加し、ＰＣＲ反応を実施することによって、菌体Ｃから抽出した核酸を増幅することができる。
【0024】
（１－３．加温加圧特定システム１００の効果）
以下では、参考技術としての加温特定技術の概要、参考技術の改善点を順に説明した上で、加温加圧特定システム１００の効果について説明する。
以下では、参考技術としての加温特定技術の概要、参考技術の改善点を順に説明した上で、加温加圧特定システム１００の効果について説明する。
【0025】
（１－３－１．参考技術１の概要）
特許文献２に記載された参考技術１では、（Ａ）プルシアンブルー、（Ｂ）没食子酸プロピル等の没食子酸エステル、および（Ｃ）ジシアンジアミド、グルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸類、安息香酸等の芳香族カルボン酸類、ニコチン酸アミド等の酸アミド、デンプン等の糖類からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む湿熱加熱変色インジケーター組成物をインキ化して、レトルトパウチ食品の包装体表面に製造年月日や賞味期限等を印字する。そして、上記の参考技術１では、湿熱加熱変色インジケーター組成物は、加熱滅菌処理前は青色を呈するが、処理後は黒色を呈することで加熱滅菌処理を確認できる。
特許文献２に記載された参考技術１では、（Ａ）プルシアンブルー、（Ｂ）没食子酸プロピル等の没食子酸エステル、および（Ｃ）ジシアンジアミド、グルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸類、安息香酸等の芳香族カルボン酸類、ニコチン酸アミド等の酸アミド、デンプン等の糖類からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む湿熱加熱変色インジケーター組成物をインキ化して、レトルトパウチ食品の包装体表面に製造年月日や賞味期限等を印字する。そして、上記の参考技術１では、湿熱加熱変色インジケーター組成物は、加熱滅菌処理前は青色を呈するが、処理後は黒色を呈することで加熱滅菌処理を確認できる。
【0026】
（１－３－２．参考技術１の改善点）
参考技術１では、以下の改善点がある。第１に、参考技術１は、１２１℃における変色を確認するものである。しかしながら、特許文献１に記載された高温高圧法による核酸抽出技術に有効な処理温度は１４０℃程度であるので、１２１℃で変色してしまう参考技術１では、実際に１４０℃程度まで到達したかどうか確認できない。第２に、参考技術１は、色素が変色するために２０分程度の時間を要する。しかしながら、特許文献１に記載された高温高圧処理による核酸抽出技術の処理時間は数十秒であり、それ以上の処理を行うとゲノムＤＮＡが必要以上に分断されてしまい、その後のＰＣＲ反応による核酸増幅工程に影響する可能性が大きい。以上より、参考技術１は、菌体Ｃの核酸抽出を実施する高温高圧法において温度モニタリング手法として適用することは難しい。
参考技術１では、以下の改善点がある。第１に、参考技術１は、１２１℃における変色を確認するものである。しかしながら、特許文献１に記載された高温高圧法による核酸抽出技術に有効な処理温度は１４０℃程度であるので、１２１℃で変色してしまう参考技術１では、実際に１４０℃程度まで到達したかどうか確認できない。第２に、参考技術１は、色素が変色するために２０分程度の時間を要する。しかしながら、特許文献１に記載された高温高圧処理による核酸抽出技術の処理時間は数十秒であり、それ以上の処理を行うとゲノムＤＮＡが必要以上に分断されてしまい、その後のＰＣＲ反応による核酸増幅工程に影響する可能性が大きい。以上より、参考技術１は、菌体Ｃの核酸抽出を実施する高温高圧法において温度モニタリング手法として適用することは難しい。
【0027】
（１－３－３．参考技術２の概要）
特許文献３に記載された参考技術２では、酸で顕色化する可逆性色素からなる発色剤、所望する色相変化の温度域に融点を有するルイス酸からなる顕色剤、および増感剤の三成分を含有してなり、昇温すると発色し、降温すると消色して、可逆的な色相変化を示す感温性色相可逆組成物が提供される。上記の参考技術２では、適当な発色剤の例としてはロイコ系色素が、適当な顕色剤の例としては長鎖カルボン酸が、また適当な増感剤の例としては酸アミド類が、それぞれ挙げられる。
特許文献３に記載された参考技術２では、酸で顕色化する可逆性色素からなる発色剤、所望する色相変化の温度域に融点を有するルイス酸からなる顕色剤、および増感剤の三成分を含有してなり、昇温すると発色し、降温すると消色して、可逆的な色相変化を示す感温性色相可逆組成物が提供される。上記の参考技術２では、適当な発色剤の例としてはロイコ系色素が、適当な顕色剤の例としては長鎖カルボン酸が、また適当な増感剤の例としては酸アミド類が、それぞれ挙げられる。
【0028】
（１－３－４．参考技術２の改善点）
参考技術２では、以下の改善点がある。第１に、参考技術２では、ロイコ系色素は、７０℃で変色し、２０℃で元の色に色相が可逆的に変化する。しかしながら、特許文献１に記載された高温高圧法による核酸抽出技術に有効な処理温度は１４０℃程度であるので、７０℃で変色してしまう参考技術２では、実際に１４０℃程度まで到達したかどうか確認できない。第２に、参考技術２では、ロイコ系色素は、酸に反応して発色する特徴を持つので、色相変化が反応溶液の性状に左右される可能性があり、プロセスコントロールとして用いることが難しい。以上より、参考技術２は、菌体Ｃの核酸抽出を実施する高温高圧法において温度モニタリング手法として適用することは難しい。
参考技術２では、以下の改善点がある。第１に、参考技術２では、ロイコ系色素は、７０℃で変色し、２０℃で元の色に色相が可逆的に変化する。しかしながら、特許文献１に記載された高温高圧法による核酸抽出技術に有効な処理温度は１４０℃程度であるので、７０℃で変色してしまう参考技術２では、実際に１４０℃程度まで到達したかどうか確認できない。第２に、参考技術２では、ロイコ系色素は、酸に反応して発色する特徴を持つので、色相変化が反応溶液の性状に左右される可能性があり、プロセスコントロールとして用いることが難しい。以上より、参考技術２は、菌体Ｃの核酸抽出を実施する高温高圧法において温度モニタリング手法として適用することは難しい。
【0029】
（１－３－５．加温加圧特定システム１００の概要）
加温加圧特定システム１００では、封入容器２０に、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入し、封入容器２０を密閉した後に加熱し、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する封入容器２０の内部状態を特定する。また、加温加圧特定システム１００では、加熱によって菌体Ｃの細胞から抽出した核酸を精製する。また、加温加圧特定システム１００では、加熱によって菌体Ｃの細胞から抽出した核酸を増幅する。
加温加圧特定システム１００では、封入容器２０に、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入し、封入容器２０を密閉した後に加熱し、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する封入容器２０の内部状態を特定する。また、加温加圧特定システム１００では、加熱によって菌体Ｃの細胞から抽出した核酸を精製する。また、加温加圧特定システム１００では、加熱によって菌体Ｃの細胞から抽出した核酸を増幅する。
【0030】
（１－３－６．加温加圧特定システム１００の効果）
第１に、加温加圧特定システム１００は、密閉容器内の溶液の温度状態を漏れなく、かつ直接確認することが可能となる。すなわち、加温加圧特定システム１００は、封入容器２０に挿入した発泡ビーズＢが１３０℃以上で顕著に減縮するので、１２０℃より高温で実施される代表的な殺菌手法であるオートクレーブにおける温度モニタリング手法として適用することが期待できる。
第１に、加温加圧特定システム１００は、密閉容器内の溶液の温度状態を漏れなく、かつ直接確認することが可能となる。すなわち、加温加圧特定システム１００は、封入容器２０に挿入した発泡ビーズＢが１３０℃以上で顕著に減縮するので、１２０℃より高温で実施される代表的な殺菌手法であるオートクレーブにおける温度モニタリング手法として適用することが期待できる。
【0031】
第２に、加温加圧特定システム１００では、最高到達温度の確認が容易になる。すなわち、インジゲーターとして用いられている素材の中には、処理後に常温に戻した際に色が処理前の状態に戻ってしてしまうものもあるが、加温加圧特定システム１００では、発泡ビーズＢは高温高圧処理後に常温に戻した際にも１３０℃以上での最高到達温度での変化が保たれる、かつ目視によって確認できるので、簡便な温度モニタリング手法およびプロセスコントロールとして適用することが期待できる。
【0032】
第３に、加温加圧特定システム１００は、核酸抽出後の溶媒置換が不要になる。すなわち、加温加圧特定システム１００は、抽出後の細胞内容物をその後の工程で使用するにあたり、抽出物そのものやＰＣＲ酵素への影響がほとんどないので溶媒置換が不要であり、上記の高温高圧法のプロセスコントロールとして適用することが期待できる。
【0033】
〔２．加温加圧特定システム１００の各工程の詳細〕
図１に示した、容器の内部状態を特定する状態特定方法である加温加圧特定システム１００の各工程の詳細について説明する。以下では、実施形態に係る各工程について、菌体培養工程、発泡ビーズ挿入工程、菌体培養液採取工程、加熱工程、核酸精製工程、核酸増幅工程の順に説明する。
図１に示した、容器の内部状態を特定する状態特定方法である加温加圧特定システム１００の各工程の詳細について説明する。以下では、実施形態に係る各工程について、菌体培養工程、発泡ビーズ挿入工程、菌体培養液採取工程、加熱工程、核酸精製工程、核酸増幅工程の順に説明する。
【0034】
（２－１．菌体培養工程）
以下では、加温加圧特定システム１００の菌体培養液採取工程に先立って実施される、試料である菌体Ｃを培養する菌体培養工程について説明する。
以下では、加温加圧特定システム１００の菌体培養液採取工程に先立って実施される、試料である菌体Ｃを培養する菌体培養工程について説明する。
【0035】
（２－１－１．菌体培養工程の具体例）
例えば、菌体培養工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓにおいて、菌体Ｃを培養する。培養に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養工程では、菌体培養容器１０として滅菌したガラス製の栓付き三角フラスコを使用し、菌体Ｃを培養する。培養する菌体Ｃの一例について説明すると、菌体培養工程では、大腸菌や黄色ブドウ球菌を培養する。培養する条件の一例について説明すると、菌体培養工程では、ＳＣＤ液体培地において菌体Ｃを３７℃で一晩培養する。
例えば、菌体培養工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓにおいて、菌体Ｃを培養する。培養に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養工程では、菌体培養容器１０として滅菌したガラス製の栓付き三角フラスコを使用し、菌体Ｃを培養する。培養する菌体Ｃの一例について説明すると、菌体培養工程では、大腸菌や黄色ブドウ球菌を培養する。培養する条件の一例について説明すると、菌体培養工程では、ＳＣＤ液体培地において菌体Ｃを３７℃で一晩培養する。
【0036】
（２－１－２．菌体培養液Ｓの培養方法）
上記の菌体培養工程で使用される菌体培養液Ｓは、核酸を有する試料を培養することにより得られる。試料の培養方法は、特に限定されず、例えば、試料を捕集したフィルターを直接固体培地上に置き、フィルターを介して試料を培養する方法（固相培養）が挙げられる。また、試料の別の培養方法としては、例えば、液体培地または固体培地を水に溶解させた溶液の存在下で試料を培養する方法（液相培養）が挙げられる。また、使用する液体培地や固体培地の種類は、培養する試料の種類や生理的条件によって選択される。
上記の菌体培養工程で使用される菌体培養液Ｓは、核酸を有する試料を培養することにより得られる。試料の培養方法は、特に限定されず、例えば、試料を捕集したフィルターを直接固体培地上に置き、フィルターを介して試料を培養する方法（固相培養）が挙げられる。また、試料の別の培養方法としては、例えば、液体培地または固体培地を水に溶解させた溶液の存在下で試料を培養する方法（液相培養）が挙げられる。また、使用する液体培地や固体培地の種類は、培養する試料の種類や生理的条件によって選択される。
【0037】
（２－１－３．菌体培養液Ｓの試料）
上記の菌体培養工程において、処理対象である試料は、特に限定されない。例えば、処理対象である試料としては、微生物、微生物以外の動物細胞（例えば、昆虫細胞等）、植物細胞、マイコプラズマ、ウィルス等であってもよい。
上記の菌体培養工程において、処理対象である試料は、特に限定されない。例えば、処理対象である試料としては、微生物、微生物以外の動物細胞（例えば、昆虫細胞等）、植物細胞、マイコプラズマ、ウィルス等であってもよい。
【0038】
上記微生物としては、例えば、アシネトバクター（Acinetobacter）種、アクチノミセス（Actinomyces）種、アエロコッカス（Aerococcus）種、アエロモナス（Aeromonas）種、アルカリゲネス（Alcaligenes）種、バチルス（Bacillus）種、バクテリオデス（Bacteriodes）種、ボルデテラ（Bordetella）種、ブランハメラ（Branhamella）種、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）種、カンピロバクター（Campylobacter）種、カンジダ（Candida）種、カプノシトファギア（Capnocytophagia）種、クロモバクテリウム（Chromobacterium）種、クロストリジウム（Clostridium）種、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、クリプトコッカス（Cryptococcus）種、デイノコッカス（Deinococcus）種、エンテロコッカス（Enterococcus）種、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）種、エシェリシア（Escherichia）種、フラボバクテリウム（Flavobacterium）種、ゲメラ（Gemella）種、ヘモフィルス（Haemophilus）種、クレブシエラ（Klebsiella）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、ラクトコッカス（Lactococcus）種、レジオネラ（Legionella）種、ロイコノストック（Leuconostoc）種、リステリア（Listeria）種、ミクロコッカス（Micrococcus）種、マイコバクテリウム（Mycobacterium）種、ナイセリア（Neisseria）種、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）種、ノカルディア（Nocardia）種、オエルスコビア（Oerskovia）種、パラコッカス（Paracoccus）種、ペディオコッカス（Pediococcus）種、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）種、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）種、プロテウス（Proteus）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、ラーネラ（Rahnella）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種、ロドスピリルム（Rhodospirillum）種、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトミセス（Streptomyces）種、ストレプトコッカス（Streptococcus）種、ビブリオ（Vibrio）種、およびイェルシニア（Yersinia）種、メチロバクテリウム（Methylobacterium）種、ラルストニア（Ralstonia）種、スフィンゴモナス（Sphingomonas）種からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【0039】
上述した微生物の中には、生育状態によって芽胞や胞子といった形態をとる微生物が存在する。加温加圧特定システム１００において、処理対象である試料の形態は、特に限定されない。また、加温加圧特定システム１００において、処理対象である試料は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【0040】
（２－２．発泡ビーズ挿入工程）
以下では、加温加圧特定システム１００の菌体培養液採取工程の前後に実施される、封入容器２０に発泡成形されたビーズを封入する封入工程である発泡ビーズ挿入工程について説明する。
以下では、加温加圧特定システム１００の菌体培養液採取工程の前後に実施される、封入容器２０に発泡成形されたビーズを封入する封入工程である発泡ビーズ挿入工程について説明する。
【0041】
（２－２－１．発泡ビーズ挿入工程の具体例）
例えば、発泡ビーズ挿入工程では、封入容器２０に、発泡ポリスチレンである発泡ビーズＢを封入する。なお、発泡ビーズ挿入工程では、菌体培養液Ｓが採取された封入容器２０に、発泡ビーズＢを封入してもよい。
例えば、発泡ビーズ挿入工程では、封入容器２０に、発泡ポリスチレンである発泡ビーズＢを封入する。なお、発泡ビーズ挿入工程では、菌体培養液Ｓが採取された封入容器２０に、発泡ビーズＢを封入してもよい。
【0042】
（２－２－２．発泡ビーズＢ）
発泡ビーズＢの素材は、特に限定されない。すなわち、発泡ビーズＢは、所定の温度以上で減縮する発泡性の粒子であれば、上記の発泡ポリスチレンの他、発泡ポリウレタン、発泡ポリエチレン、発泡ポリプロピレン等の発泡性の素材であってもよい。
発泡ビーズＢの素材は、特に限定されない。すなわち、発泡ビーズＢは、所定の温度以上で減縮する発泡性の粒子であれば、上記の発泡ポリスチレンの他、発泡ポリウレタン、発泡ポリエチレン、発泡ポリプロピレン等の発泡性の素材であってもよい。
【0043】
また、発泡ビーズＢの色彩は、特に限定されない。すなわち、発泡ビーズＢは、目視によって視認できる色彩であれば、赤色、青色、黄色、白色等の色彩を有していてもよい。
【0044】
また、発泡ビーズＢの形状は、特に限定されない。すなわち、発泡ビーズＢは、５ｍｍ程度の球体であることが好ましいが、ＰＣＲチューブ等の封入容器２０に挿入可能な大きさであればよい。また、発泡ビーズＢは、一定範囲の粒径の微粒子であればよく、球体の他、楕円体、多面体であってもよいし、粒子の表面に凹凸があってもよいし、粒子を貫通する穴があってもよい。
【0045】
さらに、発泡ビーズＢは、加熱時にＰＣＲ反応等の生物学的反応を阻害するような溶出物を生じないことが好ましいが、特に限定されない。
【0046】
（２－３．菌体培養液採取工程）
以下では、加温加圧特定システム１００の菌体培養液採取工程の後に実施される、試料溶液である菌体培養液Ｓを封入する菌体培養液採取工程について説明する。
以下では、加温加圧特定システム１００の菌体培養液採取工程の後に実施される、試料溶液である菌体培養液Ｓを封入する菌体培養液採取工程について説明する。
【0047】
（２－３－１．菌体培養液採取工程の具体例）
例えば、菌体培養液採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓの一部を封入容器２０に採取する。採取に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養液採取工程では、採取する器具として滅菌したガラス製のホールピペットを使用し、封入容器２０として滅菌した栓のついたガラスチューブを使用し、菌体培養液Ｓを採取する。
例えば、菌体培養液採取工程では、菌体培養容器１０に収容される菌体培養液Ｓの一部を封入容器２０に採取する。採取に使用する器具の一例について説明すると、菌体培養液採取工程では、採取する器具として滅菌したガラス製のホールピペットを使用し、封入容器２０として滅菌した栓のついたガラスチューブを使用し、菌体培養液Ｓを採取する。
【0048】
（２－３－２．封入容器２０）
上記の菌体培養液採取工程において、封入容器２０は、特に限定されない。例えば、封入容器２０は、栓のついたガラスチューブの他、栓のついたプラスチックチューブ、ＰＣＲチューブ等のマイクロチューブ等であってもよい。また、封入容器２０は、密閉可能な構造であって、後述する加熱工程における１８０℃程度までの温度に対する耐久性があればよい。
上記の菌体培養液採取工程において、封入容器２０は、特に限定されない。例えば、封入容器２０は、栓のついたガラスチューブの他、栓のついたプラスチックチューブ、ＰＣＲチューブ等のマイクロチューブ等であってもよい。また、封入容器２０は、密閉可能な構造であって、後述する加熱工程における１８０℃程度までの温度に対する耐久性があればよい。
【0049】
（２－３－３．その他）
上記の菌体培養液採取工程において、菌体培養液Ｓは、封入容器２０に採取される前に前処理されたものであってもよい。例えば、菌体培養液Ｓは、酵素を添加して一定時間インキュベート（保温）した後の菌体Ｃを含む懸濁液であってもよい。また、菌体培養液Ｓは、遠心分離機によって遠心分離を実施し、培地成分を除去した後の菌体Ｃを含む懸濁液であってもよい。
上記の菌体培養液採取工程において、菌体培養液Ｓは、封入容器２０に採取される前に前処理されたものであってもよい。例えば、菌体培養液Ｓは、酵素を添加して一定時間インキュベート（保温）した後の菌体Ｃを含む懸濁液であってもよい。また、菌体培養液Ｓは、遠心分離機によって遠心分離を実施し、培地成分を除去した後の菌体Ｃを含む懸濁液であってもよい。
【0050】
（２－４．加熱工程）
以下では、加温加圧特定システム１００の発泡ビーズ挿入工程および菌体培養液採取工程の後に実施される、封入容器２０を密閉し、加熱し、試料である菌体Ｃの細胞から核酸を抽出する加熱工程について説明する。
以下では、加温加圧特定システム１００の発泡ビーズ挿入工程および菌体培養液採取工程の後に実施される、封入容器２０を密閉し、加熱し、試料である菌体Ｃの細胞から核酸を抽出する加熱工程について説明する。
【0051】
（２－４－１．加熱工程の具体例）
例えば、加熱工程では、菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入した封入容器２０に、菌体Ｃに細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、封入容器２０の蓋を閉めることによって密閉し、密閉した封入容器２０をヒートブロック等の加熱装置３０を用いて１４０℃、４５秒間加熱することによって、菌体Ｃの細胞から核酸を抽出する。
例えば、加熱工程では、菌体培養液Ｓおよび発泡ビーズＢを封入した封入容器２０に、菌体Ｃに細胞の溶解を促進する溶解補助剤を添加し、封入容器２０の蓋を閉めることによって密閉し、密閉した封入容器２０をヒートブロック等の加熱装置３０を用いて１４０℃、４５秒間加熱することによって、菌体Ｃの細胞から核酸を抽出する。
【0052】
（２－４－２．溶解補助剤の種類）
加温加圧特定システム１００の加熱工程では、水のみでも上記効果を発揮するが、試料から核酸をより効率的に抽出する目的で、水以外に、界面活性剤、アルカリ、酸、酸化還元剤およびタンパク質変性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶解補助剤を含むことが好ましい。溶解補助剤は、試料の膜構造を溶解させる能力を有する。溶解補助剤が試料の膜構造に作用することで、試料を破壊しやすくなり、試料から核酸をより効率的に抽出することができる。以下では、溶解補助剤の種類について説明する。
加温加圧特定システム１００の加熱工程では、水のみでも上記効果を発揮するが、試料から核酸をより効率的に抽出する目的で、水以外に、界面活性剤、アルカリ、酸、酸化還元剤およびタンパク質変性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶解補助剤を含むことが好ましい。溶解補助剤は、試料の膜構造を溶解させる能力を有する。溶解補助剤が試料の膜構造に作用することで、試料を破壊しやすくなり、試料から核酸をより効率的に抽出することができる。以下では、溶解補助剤の種類について説明する。
【0053】
（２－４－２－１．界面活性剤）
溶解補助剤として使用する界面活性剤は、例えばイオン性であってもよく、非イオン性であってもよい。非イオン性の界面活性剤としては、例えばオクチルフェノールエトキシレート（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）等が挙げられる。加温加圧特定システム１００の核酸抽出工程では、市販品のオクチルフェノールエトキシレートを用いることができ、例えばＳＩＧＭＡ社製のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ，ｎ＝１００）等が挙げられる。
溶解補助剤として使用する界面活性剤は、例えばイオン性であってもよく、非イオン性であってもよい。非イオン性の界面活性剤としては、例えばオクチルフェノールエトキシレート（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）等が挙げられる。加温加圧特定システム１００の核酸抽出工程では、市販品のオクチルフェノールエトキシレートを用いることができ、例えばＳＩＧＭＡ社製のＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ，ｎ＝１００）等が挙げられる。
【0054】
また、イオン性の界面活性剤は、陰イオン性であってもよく、陽イオン性であってもよく、両イオン性であってもよい。陰イオン性の界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：Sodium Dodecyl Sulfate）等が挙げられる。陽イオン性の界面活性剤としては、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ：Cetyltrimethylammonium Bromide）等が挙げられる。両イオン性の界面活性剤としては、例えばベタイン等が挙げられる。ここで、「ベタイン」とは、正電荷と負電荷とを同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷をもつ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物の総称のことである。ベタインの代表例としては、トリメチルグリシンが挙げられる。
【0055】
（２－４－２－２．アルカリ）
溶解補助剤として使用するアルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、または水酸化カリウム（ＫＯＨ）等が挙げられる。
溶解補助剤として使用するアルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、または水酸化カリウム（ＫＯＨ）等が挙げられる。
【0056】
（２－４－２－３．酸）
溶解補助剤として使用する酸としては、例えば塩酸（ＨＣｌ）、または硫酸（Ｈ２ＳＯ４）等が挙げられる。
溶解補助剤として使用する酸としては、例えば塩酸（ＨＣｌ）、または硫酸（Ｈ２ＳＯ４）等が挙げられる。
【0057】
（２－４－２－４．酸化還元剤）
溶解補助剤として使用する酸化還元剤としては、例えば過酸化水素水、β－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等が挙げられる。
溶解補助剤として使用する酸化還元剤としては、例えば過酸化水素水、β－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等が挙げられる。
【0058】
（２－４－２－５．タンパク質変性剤）
溶解補助剤として使用するタンパク質変性剤としては、例えばグアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。
溶解補助剤として使用するタンパク質変性剤としては、例えばグアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。
【0059】
（２－４－２－６．その他）
溶解補助剤の成分として、キレート剤を使用してもよい。溶解補助剤として使用するキレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ethylenediaminetetraacetic Acid）等が挙げられる。
溶解補助剤の成分として、キレート剤を使用してもよい。溶解補助剤として使用するキレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ethylenediaminetetraacetic Acid）等が挙げられる。
【0060】
また、上述した溶解補助剤の中でも、加温加圧特定システム１００の溶解補助剤は、界面活性剤を含むことが好ましく、ＳＤＳと、オクチルフェノールエトキシレートとのいずれか一方または両方を含むことがより好ましい。
【0061】
例えば、加温加圧特定システム１００の核酸抽出工程で抽出した核酸を高感度で検出したい場合にはＳＤＳを用いるとよい。これに対し、加温加圧特定システム１００の核酸抽出工程で抽出した核酸を、ＳＤＳによって阻害される酵素反応に用いる場合には、試料の膜構造に対してＳＤＳよりも温和に作用するオクチルフェノールエトキシレートを用いるとよい。
【0062】
加温加圧特定システム１００の溶解補助剤は、必要に応じて緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤としては、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）等が挙げられる。
【0063】
（２－４－３．核酸の種類）
上記の加熱工程において、抽出される核酸の種類は、特に限定されない。例えば、抽出される核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：Deoxyribonucleic Acid）であるゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等や、リボ核酸（ＲＮＡ：Ribonucleic Acid）であるメッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ等であってもよい。
上記の加熱工程において、抽出される核酸の種類は、特に限定されない。例えば、抽出される核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：Deoxyribonucleic Acid）であるゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等や、リボ核酸（ＲＮＡ：Ribonucleic Acid）であるメッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ等であってもよい。
【0064】
（２－５．サイズ確認工程）
以下では、加温特定システム１００の加熱工程の後に実施される、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて、加熱工程における封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する内部状態を特定する特定工程であるサイズ確認工程について説明する。
以下では、加温特定システム１００の加熱工程の後に実施される、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて、加熱工程における封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する内部状態を特定する特定工程であるサイズ確認工程について説明する。
【0065】
（２－５－１．サイズ確認工程の具体例）
例えば、サイズ確認工程では、発泡ビーズＢの減縮によって、封入容器２０が加熱された温度が１３０℃以上であることを特定する。すなわち、サイズ確認工程では、目視によって発泡ビーズＢのサイズが顕著に減縮し、もとのサイズの半分以下に変化した場合には、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓが１３０℃以上に加熱されたことを確認することができる。このとき、サイズ確認工程では、１３０℃以上の温度に応じてサイズが変化するので、発泡ビーズＢが減縮したサイズをもとに菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓが加熱された温度を推定することもできる。
例えば、サイズ確認工程では、発泡ビーズＢの減縮によって、封入容器２０が加熱された温度が１３０℃以上であることを特定する。すなわち、サイズ確認工程では、目視によって発泡ビーズＢのサイズが顕著に減縮し、もとのサイズの半分以下に変化した場合には、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓが１３０℃以上に加熱されたことを確認することができる。このとき、サイズ確認工程では、１３０℃以上の温度に応じてサイズが変化するので、発泡ビーズＢが減縮したサイズをもとに菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓが加熱された温度を推定することもできる。
【0066】
また、サイズ確認工程では、温度および圧力の関係性をもとに封入容器２０の圧力を特定することもできる。すなわち、サイズ確認工程では、最高温度１３０℃のときは最高圧力２７５７ｈＰａ、最高温度１４０℃のときは最高圧力３７０６ｈＰａ、最高温度１５０℃のときは最高圧力４９０６ｈＰａ、最高温度１６０℃のときは最高圧力６４０３ｈＰａ、最高温度１７０℃のときは最高圧力８２４９ｈＰａ、最高温度１８０℃のときは最高圧力１０４９８ｈＰａに到達したことを特定することができる。
【0067】
（２－６．核酸精製工程）
以下では、加温特定システム１００の加熱工程の後に実施される、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を精製する核酸精製工程について説明する。
以下では、加温特定システム１００の加熱工程の後に実施される、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を精製する核酸精製工程について説明する。
【0068】
（２－６－１．核酸精製工程の具体例）
例えば、核酸精製工程では、核酸を吸着する吸着担体を有するカラムに注入した後に、カラムに核酸を溶出する溶出液を注入することによって核酸を精製する。
例えば、核酸精製工程では、核酸を吸着する吸着担体を有するカラムに注入した後に、カラムに核酸を溶出する溶出液を注入することによって核酸を精製する。
【0069】
（２－７．核酸増幅工程）
以下では、加温特定システム１００の加熱工程の後、または核酸精製工程の後に実施される、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を増幅する核酸増幅工程について説明する。
以下では、加温特定システム１００の加熱工程の後、または核酸精製工程の後に実施される、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を増幅する核酸増幅工程について説明する。
【0070】
（２－７－１．核酸増幅工程の具体例）
例えば、核酸増幅工程では、加熱工程によって抽出された核酸を含む溶液に対してＰＣＲ反応を実施することによって核酸を増幅する。また、核酸増幅工程では、核酸精製工程によって精製された核酸を含む溶液に対してＰＣＲ反応を実施することによって核酸を増幅する。
例えば、核酸増幅工程では、加熱工程によって抽出された核酸を含む溶液に対してＰＣＲ反応を実施することによって核酸を増幅する。また、核酸増幅工程では、核酸精製工程によって精製された核酸を含む溶液に対してＰＣＲ反応を実施することによって核酸を増幅する。
【0071】
〔３．各種実験結果〕
図２～図７を用いて、実施形態に係る加温加圧特定システム１００による各種実験結果について説明する。以下では、加温加圧確認実験に関する実験結果、ＰＣＲアンプリコン測定実験に関する実験結果の順に説明する。
図２～図７を用いて、実施形態に係る加温加圧特定システム１００による各種実験結果について説明する。以下では、加温加圧確認実験に関する実験結果、ＰＣＲアンプリコン測定実験に関する実験結果の順に説明する。
【0072】
（３－１．加温加圧確認実験）
図２および図３を用いて、加温加圧特定システム１００による加熱温度等を確認する加熱加圧確認実験に関する実験結果について説明する。図２は、実施形態に係る加温加圧確認実験の実験結果の一例を示す図である。図３は、実施形態に係る温度および圧力の関係性の一例を示す図である。以下では、実験手順を示しつつ、加温加圧確認実験の実験結果を順に説明する。
図２および図３を用いて、加温加圧特定システム１００による加熱温度等を確認する加熱加圧確認実験に関する実験結果について説明する。図２は、実施形態に係る加温加圧確認実験の実験結果の一例を示す図である。図３は、実施形態に係る温度および圧力の関係性の一例を示す図である。以下では、実験手順を示しつつ、加温加圧確認実験の実験結果を順に説明する。
【0073】
（３－１－１．加温加圧確認実験の実験手順）
加温加圧特定システム１００による加温確認実験に関する実験手順の例について説明する。第１に、６．５ｍｍの発泡ポリスチレン製の発泡ビーズＢを封入容器２０であるＰＣＲチューブに挿入する。第２に、１％ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含む溶解補助剤溶液４０μＬを、発泡ビーズＢを挿入したＰＣＲチューブに注入する。第３に、上記の発泡ビーズＢと溶解補助剤を封入したＰＣＲチューブを密閉し、６０秒間加熱する。第４に、加熱処理後の発泡ビーズＢの状態を目視によって確認する。
加温加圧特定システム１００による加温確認実験に関する実験手順の例について説明する。第１に、６．５ｍｍの発泡ポリスチレン製の発泡ビーズＢを封入容器２０であるＰＣＲチューブに挿入する。第２に、１％ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含む溶解補助剤溶液４０μＬを、発泡ビーズＢを挿入したＰＣＲチューブに注入する。第３に、上記の発泡ビーズＢと溶解補助剤を封入したＰＣＲチューブを密閉し、６０秒間加熱する。第４に、加熱処理後の発泡ビーズＢの状態を目視によって確認する。
【0074】
（３－１－２．加熱加圧確認実験の実験結果）
図２を用いて、加熱加圧確認実験の実験結果について説明する。図２は、加熱をしていない混合溶液である陰性対照試料「ＮＣ」、９０℃で加熱した混合溶液である「９０℃」、１００℃で加熱した混合溶液である「１００℃」、１１０℃で加熱した混合溶液である「１１０℃」、１２０℃で加熱した混合溶液である「１２０℃」、１３０℃で加熱した混合溶液である「１３０℃」、１４０℃で加熱した混合溶液である「１４０℃」、１５０℃で加熱した混合溶液である「１５０℃」、および１６０℃で加熱した混合溶液である「１６０℃」の加熱後のＰＣＲチューブの各状態を示す。
図２を用いて、加熱加圧確認実験の実験結果について説明する。図２は、加熱をしていない混合溶液である陰性対照試料「ＮＣ」、９０℃で加熱した混合溶液である「９０℃」、１００℃で加熱した混合溶液である「１００℃」、１１０℃で加熱した混合溶液である「１１０℃」、１２０℃で加熱した混合溶液である「１２０℃」、１３０℃で加熱した混合溶液である「１３０℃」、１４０℃で加熱した混合溶液である「１４０℃」、１５０℃で加熱した混合溶液である「１５０℃」、および１６０℃で加熱した混合溶液である「１６０℃」の加熱後のＰＣＲチューブの各状態を示す。
【0075】
（３－１－３．加熱加圧確認実験の実験結果の考察）
図２では、「ＮＣ」、「９０℃」、「１００℃」、「１１０℃」、および「１２０℃」では発泡ビーズＢのサイズの減縮が見られないが、「１３０℃」、「１４０℃」、「１５０℃」、および「１６０℃」では発泡ビーズＢの顕著なサイズの減縮が視認できる。また、図２では、発泡ビーズＢのサイズとして、「１３０℃」＞「１４０℃」＞「１５０℃」＞「１６０℃」となっていることが確認できる。
図２では、「ＮＣ」、「９０℃」、「１００℃」、「１１０℃」、および「１２０℃」では発泡ビーズＢのサイズの減縮が見られないが、「１３０℃」、「１４０℃」、「１５０℃」、および「１６０℃」では発泡ビーズＢの顕著なサイズの減縮が視認できる。また、図２では、発泡ビーズＢのサイズとして、「１３０℃」＞「１４０℃」＞「１５０℃」＞「１６０℃」となっていることが確認できる。
【0076】
加熱加圧確認実験の実験結果より、加温加圧特定システム１００では発泡ビーズＢの大きさの変化を視認することによって、各試料が１３０℃以上に加熱したことを確認することができる。
【0077】
（３－１－４．温度と圧力との関係性）
図３を用いて、封入容器２０内部の温度と圧力との関係性について説明する。図３に示すように、封入容器２０の体積、発泡ビーズＢの体積、内容物の成分や量等の情報から、温度［℃］に対する反応チューブ内圧［ｈＰａ］の理論的な関係性が導出できる。
図３を用いて、封入容器２０内部の温度と圧力との関係性について説明する。図３に示すように、封入容器２０の体積、発泡ビーズＢの体積、内容物の成分や量等の情報から、温度［℃］に対する反応チューブ内圧［ｈＰａ］の理論的な関係性が導出できる。
【0078】
図３の例では、温度「２０℃」では反応チューブ内圧「２３ｈＰａ」、温度「４０℃」では反応チューブ内圧「７３ｈＰａ」、温度「６０℃」では反応チューブ内圧「１９９ｈＰａ」、温度「８０℃」では反応チューブ内圧「４７５ｈＰａ」、温度「１００℃」では反応チューブ内圧「１０２２ｈＰａ」、温度「１１０℃」では反応チューブ内圧「１４５０ｈＰａ」、温度「１２０℃」では反応チューブ内圧「２０１８ｈＰａ」、温度「１３０℃」では反応チューブ内圧「２７５７ｈＰａ」、温度「１４０℃」では反応チューブ内圧「３７０６ｈＰａ」、温度「１５０℃」では反応チューブ内圧「４９０６ｈＰａ」、温度「１６０℃」では反応チューブ内圧「６４０３ｈＰａ」、温度「１７０℃」では反応チューブ内圧「８２４９ｈＰａ」、温度「１８０℃」では反応チューブ内圧「１０４９８ｈＰａ」、温度「１９０℃」では反応チューブ内圧「１３２１０ｈＰａ」、温度「２００℃」では反応チューブ内圧「１６４５０ｈＰａ」であることを示している。
【0079】
すなわち、加熱後の発泡ビーズＢのサイズから推定される加熱温度、または加熱装置３０の設定温度から、封入容器２０の内部に加えられた圧力を特定することができる。一方、比較対象となる発泡ビーズＢに加えられた圧力が与えられている場合には、加熱後の発泡ビーズＢのサイズから加熱温度を特定することもできる。
【0080】
（３－２．ＰＣＲアンプリコン測定実験）
図４～図７を用いて、加温加圧特定システム１００によるＰＣＲアンプリコン（Amplicon）を測定するＰＣＲアンプリコン測定実験に関する実験結果について説明する。図４～図６は、実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験条件の一例を示す図である。図７は、実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果の一例を示す図である。以下では、実験手順を示しつつ、ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果を順に説明する。
図４～図７を用いて、加温加圧特定システム１００によるＰＣＲアンプリコン（Amplicon）を測定するＰＣＲアンプリコン測定実験に関する実験結果について説明する。図４～図６は、実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験条件の一例を示す図である。図７は、実施形態に係るＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果の一例を示す図である。以下では、実験手順を示しつつ、ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果を順に説明する。
【0081】
（３－２－１．ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験手順）
図４～図６を用いて、加温加圧特定システム１００によるＰＣＲアンプリコン測定実験に関する実験手順の例について説明する。第１に、発泡ビーズＢおよび菌体培養液Ｓを封入容器２０に封入し、高温高圧法による高温高圧処理（１４０℃、４５秒間加熱）を実施する。第２に、高温高圧処理後の菌体培養液Ｓを１／１００に希釈し、希釈液を調製する。第３に、希釈液２０μＬと実験条件１、２に示すＰＣＲミックス２０μＬとを混合し、実験条件３に示す温度サイクル条件でＰＣＲ反応を実施する。第４に、ＰＣＲ反応後の溶液をアジレントテクノロジー（Agilent Technologies）社製の「Agilent 2100 バイオアナライザ電気泳動システム」を用いて電気泳動し、ＰＣＲ増幅の有無を確認する。
図４～図６を用いて、加温加圧特定システム１００によるＰＣＲアンプリコン測定実験に関する実験手順の例について説明する。第１に、発泡ビーズＢおよび菌体培養液Ｓを封入容器２０に封入し、高温高圧法による高温高圧処理（１４０℃、４５秒間加熱）を実施する。第２に、高温高圧処理後の菌体培養液Ｓを１／１００に希釈し、希釈液を調製する。第３に、希釈液２０μＬと実験条件１、２に示すＰＣＲミックス２０μＬとを混合し、実験条件３に示す温度サイクル条件でＰＣＲ反応を実施する。第４に、ＰＣＲ反応後の溶液をアジレントテクノロジー（Agilent Technologies）社製の「Agilent 2100 バイオアナライザ電気泳動システム」を用いて電気泳動し、ＰＣＲ増幅の有無を確認する。
【0082】
（３－２－１－１．実験条件１）
第１に、図４を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験のプライマーに関する実験条件１について説明する。図４の例に示すように、フォワードプライマーは、プライマーの名称「１６Ｓ ２９０ｆ＿２」、塩基配列「ＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣ」、アンプリコンの塩基対「２１１ｂ．ｐ．」である。また、リバースプライマーは、プライマーの名称「１６Ｓ ５００ｒ＋ＧＧ」、塩基配列「ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ」、アンプリコンの塩基対「２１１ｂ．ｐ．」である。
第１に、図４を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験のプライマーに関する実験条件１について説明する。図４の例に示すように、フォワードプライマーは、プライマーの名称「１６Ｓ ２９０ｆ＿２」、塩基配列「ＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣ」、アンプリコンの塩基対「２１１ｂ．ｐ．」である。また、リバースプライマーは、プライマーの名称「１６Ｓ ５００ｒ＋ＧＧ」、塩基配列「ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ」、アンプリコンの塩基対「２１１ｂ．ｐ．」である。
【0083】
（３－２－１－２．実験条件２）
第２に、図５を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験の試薬に関する実験条件２について説明する。図５の例に示すように、ＰＣＲアンプリコン測定実験の試薬として、「プラチナム（Platinum）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ」を１．０Ｕ／μＬ、０．２０μＬ／ｔｕｂｅ、「高温高圧処理液」を２０μＬ／ｔｕｂｅ、「フォワードプライマー」を１０．０μＭ、０．８μＬ／ｔｕｂｅ、「リバースプライマー」を１０．０μＭ、０．８μＬ／ｔｕｂｅ、「硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４」を５０ｍＭ、１．６０μＬ／ｔｕｂｅ、「ｄＮＴＰ（deoxynucleoside triphosphate）ミックス」を２．００ｍＭ、４．００μＬ／ｔｕｂｅ、「１０×ＰＣＲバッファー」を１０倍濃度、４．００μＬ／ｔｕｂｅ、「ミリＱ水」を８．６０μＬ／ｔｕｂｅを混合し、合計４０．００μＬ／ｔｕｂｅとする。
第２に、図５を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験の試薬に関する実験条件２について説明する。図５の例に示すように、ＰＣＲアンプリコン測定実験の試薬として、「プラチナム（Platinum）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ」を１．０Ｕ／μＬ、０．２０μＬ／ｔｕｂｅ、「高温高圧処理液」を２０μＬ／ｔｕｂｅ、「フォワードプライマー」を１０．０μＭ、０．８μＬ／ｔｕｂｅ、「リバースプライマー」を１０．０μＭ、０．８μＬ／ｔｕｂｅ、「硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４」を５０ｍＭ、１．６０μＬ／ｔｕｂｅ、「ｄＮＴＰ（deoxynucleoside triphosphate）ミックス」を２．００ｍＭ、４．００μＬ／ｔｕｂｅ、「１０×ＰＣＲバッファー」を１０倍濃度、４．００μＬ／ｔｕｂｅ、「ミリＱ水」を８．６０μＬ／ｔｕｂｅを混合し、合計４０．００μＬ／ｔｕｂｅとする。
【0084】
（３－２－１－３．実験条件３）
第３に、図６を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験の反応条件に関する実験条件３について説明する。図６の例に示すように、ＰＣＲアンプリコン測定実験の反応条件として、「活性化（Activate）」過程を９８℃、１２０秒、１サイクルの条件で実施する。また、「変性（Denature）」過程を９８℃、１５秒、「アニーリング（Annealing）」過程を５８℃、２５秒、「伸長（Extension）」過程を７２℃、１５秒で、３５サイクルの条件で実施する。また、「追加伸長（add. Extension）」過程を７２℃、１２０秒、１サイクルの条件で実施する。
第３に、図６を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験の反応条件に関する実験条件３について説明する。図６の例に示すように、ＰＣＲアンプリコン測定実験の反応条件として、「活性化（Activate）」過程を９８℃、１２０秒、１サイクルの条件で実施する。また、「変性（Denature）」過程を９８℃、１５秒、「アニーリング（Annealing）」過程を５８℃、２５秒、「伸長（Extension）」過程を７２℃、１５秒で、３５サイクルの条件で実施する。また、「追加伸長（add. Extension）」過程を７２℃、１２０秒、１サイクルの条件で実施する。
【0085】
（３－２－２．ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果）
図７を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果１について説明する。図７Ａは、発泡ビーズＢを挿入しない菌体培養液Ｓである陽性対照試料「ＰＣ」の電気泳動図である。図７Ｂは、高温高圧処理をしていない菌体培養液Ｓである陰性対照試料「ＮＣ」の電気泳動図である。図７Ｃは、発泡ビーズＢを挿入し、かつ溶解補助剤を添加した菌体培養液Ｓである「発泡ビーズ法（溶解補助剤あり、１／１００希釈）」の電気泳動図である。図７Ｄは、発泡ビーズＢを挿入し、溶解補助剤を添加していない菌体培養液Ｓである「発泡ビーズ法（溶解補助剤あり）」の電気泳動図である。
図７を用いて、ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果１について説明する。図７Ａは、発泡ビーズＢを挿入しない菌体培養液Ｓである陽性対照試料「ＰＣ」の電気泳動図である。図７Ｂは、高温高圧処理をしていない菌体培養液Ｓである陰性対照試料「ＮＣ」の電気泳動図である。図７Ｃは、発泡ビーズＢを挿入し、かつ溶解補助剤を添加した菌体培養液Ｓである「発泡ビーズ法（溶解補助剤あり、１／１００希釈）」の電気泳動図である。図７Ｄは、発泡ビーズＢを挿入し、溶解補助剤を添加していない菌体培養液Ｓである「発泡ビーズ法（溶解補助剤あり）」の電気泳動図である。
【0086】
（３－２－３．ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果の考察）
図７より、発泡ビーズＢを挿入した菌体培養液Ｓを用いてＰＣＲを行った結果（図７Ｄ）は、発泡ビーズＢを挿入しない菌体培養液Ｓを用いてＰＣＲを行った結果（図７Ａ）の陽性対照試料「ＰＣ」に対して、顕著なＰＣＲアンプリコンの減少は見られない。
図７より、発泡ビーズＢを挿入した菌体培養液Ｓを用いてＰＣＲを行った結果（図７Ｄ）は、発泡ビーズＢを挿入しない菌体培養液Ｓを用いてＰＣＲを行った結果（図７Ａ）の陽性対照試料「ＰＣ」に対して、顕著なＰＣＲアンプリコンの減少は見られない。
【0087】
ＰＣＲアンプリコン測定実験の実験結果より、加温加圧特定システム１００では、核酸抽出工程および核酸増幅工程において影響を及ぼさないことが確認できる。
【0088】
〔４．加温加圧特定システム１００の処理の流れ〕
図８を用いて、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の工程の流れについて説明する。図８は、実施形態に係る加温加圧特定工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０４の工程は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０４の工程のうち、省略される工程があってもよい。
図８を用いて、実施形態に係る加温加圧特定システム１００の工程の流れについて説明する。図８は、実施形態に係る加温加圧特定工程の流れの一例を示すフローチャートである。なお、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０４の工程は、異なる順序で実行することもできる。また、下記のステップＳ１０１～Ｓ１０４の工程のうち、省略される工程があってもよい。
【0089】
第１に、加温加圧特定システム１００では、発泡ビーズ挿入工程を実施する（ステップＳ１０１）。第２に、加温加圧特定システム１００では、菌体培養液採取工程を実施する（ステップＳ１０２）。第３に、加温加圧特定システム１００では、加熱工程を実施する（ステップＳ１０３）。第４に、加温加圧特定システム１００では、サイズ確認工程を実施し（ステップＳ１０４）、加温加圧特定工程を終了する。なお、加温加圧特定システム１００では、サイズ確認工程の実施後に、核酸精製工程、核酸増幅工程を実施することもできる。
【0090】
〔５．実施形態の効果〕
最後に、実施形態の効果について説明する。以下では、実施形態に係る工程に対応する効果１～７について説明する。
最後に、実施形態の効果について説明する。以下では、実施形態に係る工程に対応する効果１～７について説明する。
【0091】
（５－１．効果１）
第１に、上述した実施形態に係る工程では、封入容器２０に、試料を含む試料溶液および発泡ビーズＢを封入し、封入容器２０を密閉した後に加熱し、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて、封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する内部状態を特定する。このため、実施形態に係る工程では、試料の状態を効果的に特定することができる。
第１に、上述した実施形態に係る工程では、封入容器２０に、試料を含む試料溶液および発泡ビーズＢを封入し、封入容器２０を密閉した後に加熱し、発泡ビーズＢの大きさの変化に基づいて、封入容器２０の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する内部状態を特定する。このため、実施形態に係る工程では、試料の状態を効果的に特定することができる。
【0092】
（５－２．効果２）
第２に、上述した実施形態に係る工程では、発泡ビーズＢの減縮によって、封入容器２０が加熱された温度が１３０℃以上であることを特定する。このため、実施形態に係る工程では、１４０℃以上の加熱処理において、試料の状態を効果的に特定することができる。
第２に、上述した実施形態に係る工程では、発泡ビーズＢの減縮によって、封入容器２０が加熱された温度が１３０℃以上であることを特定する。このため、実施形態に係る工程では、１４０℃以上の加熱処理において、試料の状態を効果的に特定することができる。
【0093】
（５－３．効果３）
第３に、上述した実施形態に係る工程では、発泡ビーズＢは、発泡ポリスチレンである。このため、実施形態に係る工程では、容易に入手できる素材の発泡ビーズＢを使用することによって、試料の状態を効果的に特定することができる。
第３に、上述した実施形態に係る工程では、発泡ビーズＢは、発泡ポリスチレンである。このため、実施形態に係る工程では、容易に入手できる素材の発泡ビーズＢを使用することによって、試料の状態を効果的に特定することができる。
【0094】
（５－４．効果４）
第４に、上述した実施形態に係る工程では、封入容器２０は、ＰＣＲチューブである。このため、実施形態に係る工程では、少量の試料を扱う処理において、試料の状態を効果的に特定することができる。
第４に、上述した実施形態に係る工程では、封入容器２０は、ＰＣＲチューブである。このため、実施形態に係る工程では、少量の試料を扱う処理において、試料の状態を効果的に特定することができる。
【0095】
（５－５．効果５）
第５に、上述した実施形態に係る工程では、試料溶液は、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓである。このため、実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から核酸を抽出する高温高圧法において、試料の状態を効果的に特定することができる。
第５に、上述した実施形態に係る工程では、試料溶液は、菌体Ｃを含む菌体培養液Ｓである。このため、実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から核酸を抽出する高温高圧法において、試料の状態を効果的に特定することができる。
【0096】
（５－６．効果６）
第６に、上述した実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を精製する。このため、実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸の精製に影響を及ぼすことなく、試料の状態を効果的に特定することができる。
第６に、上述した実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を精製する。このため、実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸の精製に影響を及ぼすことなく、試料の状態を効果的に特定することができる。
【0097】
（５－７．効果７）
第７に、上述した実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を増幅する。このため、実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸の増幅に影響を及ぼすことなく、試料の状態を効果的に特定することができる。
第７に、上述した実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸を増幅する。このため、実施形態に係る工程では、菌体Ｃの細胞から抽出された核酸の増幅に影響を及ぼすことなく、試料の状態を効果的に特定することができる。
【0098】
〔システム〕
上記文書中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各種のデータやパラメータを含む情報については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
上記文書中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各種のデータやパラメータを含む情報については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
【0099】
また、図示した各装置の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。すなわち、各装置の分散や統合の具体的形態は図示のものに限られない。つまり、その全部または一部を、各種の負荷や使用状況などに応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。
【0100】
〔その他〕
開示される技術特徴の組合せのいくつかの例を以下に記載する。
開示される技術特徴の組合せのいくつかの例を以下に記載する。
【0101】
（１）容器の内部状態を特定する状態特定方法であって、前記容器に、試料を含む試料溶液および発泡成形されたビーズを封入する封入工程と、前記容器を密閉し、加熱する加熱工程と、前記ビーズの大きさの変化に基づいて、前記加熱工程における前記容器の温度および圧力のうち少なくとも１つに関する前記内部状態を特定する特定工程と、を含む状態特定方法。
【0102】
（２）前記特定工程は、前記ビーズの減縮によって、前記容器が加熱された前記温度が１３０℃以上であることを特定する、（１）に記載の状態特定方法。
【0103】
（３）前記ビーズは、発泡ポリスチレンである、（１）または（２）に記載の状態特定方法。
【0104】
（４）前記容器は、ＰＣＲチューブである、（１）～（３）のいずれか１つに記載の状態特定方法。
【0105】
（５）前記試料溶液は、菌体を含む菌体培養液である、（１）～（４）のいずれか１つに記載の状態特定方法。
【0106】
（６）前記加熱工程によって前記菌体の細胞から抽出された核酸を精製する精製工程、をさらに含む（５）に記載の状態特定方法。
【0107】
（７）前記加熱工程によって前記菌体の細胞から抽出された核酸を増幅する増幅工程、をさらに含む（５）または（６）に記載の状態特定方法。
【符号の説明】
【0108】
１０ 菌体培養容器
２０ 封入容器
３０ 加熱装置
１００ 加温加圧特定システム
２０ 封入容器
３０ 加熱装置
１００ 加温加圧特定システム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】