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特開2024-122931メンブランベシクルの生産方法及びメンブランベシクルを利用した物質生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024122931
(43)【公開日】2024-09-09
(54)【発明の名称】メンブランベシクルの生産方法及びメンブランベシクルを利用した物質生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240902BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240902BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20240902BHJP
C12P 7/625 20220101ALN20240902BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N1/21
C12N15/52
C12P7/625
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024028110
(22)【出願日】2024-02-28
(31)【優先権主張番号】P 2023030519
(32)【優先日】2023-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 開催日 ２０２２年３月１７日 集会名、開催場所 日本農芸化学会２０２２年度大会 オンライン開催 ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｂｂａ．ｏｒ．ｊｐ／２０２２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日 令和４年３月１日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓ４１５９８－０２２－０７２１８－ｚ 公開者 田口精一、高相昊 公開された発明の内容 Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｌｙｍｅｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日 令和４年３月１日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｄａｉ．ａｃ．ｊｐ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｆｉｌｅｓ／７４１６／７７８０／６６４４／ＰｒｅｓｓＲｅｌｅａｓｅ＿＿－．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｓｕｋｕｂａ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｐｄｆ／ｐ２０２２０３０１１４３０００．ｐｄｆ 公開者 学校法人東京農業大学、国立大学法人筑波大学 公開された発明の内容 「生分解性プラスチックの微生物合成の過程で発見した「膜小胞の分泌生産」～“泡”をきっかけとした「瓢箪から駒」の研究ストーリー～」
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日 ２０２３年９月２日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｃｏｍ／２６７３－８００７／３／３／７０ 公開者 田口精一、高相昊 公開された発明の内容 Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－／Ｍｕｌｔｉ－Ｌａｙｅｒｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＧＦＰ－Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日 ２０２２年３月５日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｂｂａ．ｏｒ．ｊｐ／ＭｅｅｔｉｎｇｏｆＪＳＢＢＡ／２０２２／ＭｅｅｔｉｎｇｏｆＪＳＢＢＡ２０２２．ｐｄｆ 公開者 田口精一、高相昊 公開された発明の内容 バイオポリマー生産系を駆動力とした膜小胞（ＭＶ）の微生物合成
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日 ２０２３年１０月１９日 ウェブサイトのアドレス ・ｈｔｔｐｓ：／／ｓｈｉｎｇｉ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｌｉｓｔ／ｌｉｓｔ＿２０２３／２０２３＿ｋｏｂｅ－ｕ．ｈｔｍｌ＃２０２３１０１９Ｐ－００１ ・ｃｈｒｏｍｅ－ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：／／ｅｆａｉｄｎｂｍｎｎｎｉｂｐｃａｊｐｃｇｌｃｌｅｆｉｎｄｍｋａｊ／ｈｔｔｐｓ：／／ｓｈｉｎｇｉ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／２０２３／２０２３＿ｋｏｂｅ－ｕ＿００１．ｐｄｆ 公開者 高相昊 公開された発明の内容 「メンブレンベシクルの人工発生装置」
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】100122574
【弁理士】
【氏名又は名称】吉永 貴大
(72)【発明者】
【氏名】田口 精一
(72)【発明者】
【氏名】高 相昊
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD83
4B064BJ04
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB15
4B065BC03
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】効率的な大腸菌からのメンブランベシクル生産およびその制御法を提供することを目的とする。
【解決手段】ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子をコードした大腸菌をグルコース存在下で培養し、大腸菌の細胞内にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を蓄積させることにより細胞内の内圧を高める工程と、大腸菌の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、細胞膜の外膜にメンブランベシクルを生産する工程と、を有する、メンブランベシクルの生産方法により解決する。
【選択図】図１
【解決手段】ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子をコードした大腸菌をグルコース存在下で培養し、大腸菌の細胞内にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を蓄積させることにより細胞内の内圧を高める工程と、大腸菌の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、細胞膜の外膜にメンブランベシクルを生産する工程と、を有する、メンブランベシクルの生産方法により解決する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子をコードした微生物を炭素源存在下で培養し、前記微生物の細胞内にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を蓄積させることにより細胞内の内圧を高める工程と、
前記微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、
メンブランベシクルを前記細胞膜の外膜に生産する工程と、
を有する、メンブランベシクルの生産方法。
前記微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、
メンブランベシクルを前記細胞膜の外膜に生産する工程と、
を有する、メンブランベシクルの生産方法。
【請求項2】
前記微生物が、細胞壁生合成酵素の遺伝子欠損株である、請求項１に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項3】
前記微生物が、単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子の変異を含む細菌株である、請求項１に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項4】
前記メンブランベシクルの平均粒子径が、５０～２００ｎｍである、請求項１に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項5】
前記炭素源が、グルコースである、請求項１に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項6】
前記グルコースが、０．１～１５．０重量％である、請求項５に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項7】
前記グルコース濃度を調整することにより、単層ＭＶ（outer MV）と多層 ＭＶ（outer/inner MV）の発生を制御する、
請求項５に記載のメンブランベシクルの生産方法。
請求項５に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項8】
前記微生物が、グラム陰性菌である、請求項１に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項9】
前記グラム陰性菌が、大腸菌である、請求項８に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項10】
前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）が、ポリ（３－ヒドロキシブチレートである、請求項１に記載のメンブランベシクルの生産方法。
【請求項11】
ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子と、目的物質生産遺伝子とをコードした微生物を炭素源存在下で培養し、前記微生物の細胞内にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を蓄積させることにより細胞内の内圧を高める工程と、
前記微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、
前記目的物質を含有するメンブランベシクルを前記細胞膜の外膜に生産する工程と、
を有する、物質生産方法。
前記微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、
前記目的物質を含有するメンブランベシクルを前記細胞膜の外膜に生産する工程と、
を有する、物質生産方法。
【請求項12】
前記目的物質が、タンパク質、酵素、核酸、ポリエステルからなる群から選択された少なくとも１種である、請求項１１に記載の物質生産方法。
【請求項13】
前記炭素源が、グルコースである、請求項１２に記載の物質生産方法。
【請求項14】
前記グルコース濃度を調整することにより、単層ＭＶ（outer MV）と多層 ＭＶ（outer/inner MV）の発生を制御する、
請求項１３に記載の物質生産方法。
請求項１３に記載の物質生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物を利用したメンブランベシクルの効率的生産法及びメンブランベシクルを利用した物質生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
多くの細菌は細胞膜からメンブランベシクル（membrane vesicle、以下「ＭＶ」ということがある）という膜小胞を生産することが知られている。ＭＶの大きさは２０～２００ｎｍであり、細胞膜から数多くのＭＶが放出される様子から、シャボン玉に例えられることもある。ＭＶは細胞膜由来のリン脂質や膜タンパク質、ＬＰＳ（lypopolysaccharide）等で構成されており、細胞表面と類似の構造を持つことから、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素などの様々な物質を含有していることも明らかになりつつある。ＭＶは構造安定性も高いことから、多面的な機能を有していると考えられ、ドラックデリバリー（ＤＤＳ）に代表されるような効率的な微生物制御への応用も期待されている。またＭＶはワクチン抗原としてあるいは抗原を輸送するキャリアとして近年注目されており研究が進んでいる。
【0003】
尾花ら（2016）は、様々な遺伝子変異株や制御因子を用いた解析により多くのＭＶ生産関連遺伝子が同定され、様々なＭＶ機構が提唱されているが、これらのＭＶ生産機構に共通することとして細胞膜がたわむことが挙げられることを報告している（非特許文献１）。
【0004】
また、特開２０２１－７１３５７号公報には、ドラッグデリバリーシステムおよびワクチン等への応用が期待されている一方で、これまで一般的であった超遠心分離法によりメンブランベシクルが損傷を受ける問題点を解決するため、担体に担持されたペプチドまたはポリミキシンＢとを接触させることによって複合体を形成し、担体に結合したメンブランベシクルを温和な条件で担体から解離できるようにしたメンブランベシクルの単離方法を開示している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２１－７１３５７号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】尾花ら，“グラム陽性細菌が能動的につくるメンブランベシクルの機能と生合成”，日本乳酸菌学会，2016年，第27巻，第1号，p.10-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
これまでの報告はＭＶの生産をあくまでも自然現象として確認したものであり、効率的なＭＶ生産およびその制御法や、人為的に目的物質をＭＶに包摂させることについては十分に検討されていない。
【0008】
そこで、本発明は、効率的な大腸菌からのＭＶ生産およびその制御法を提供することを目的とする。また、本発明は、その制御法を利用した物質生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、効率的な大腸菌からのＭＶ生産およびその制御法を提供するため、大腸菌にバイオポリマーを生産させ、また培地中のグルコース濃度を調整することにより、大腸菌から均一な粒子径のＭＶを効率的に高生産することを見出した。さらに、本発明者らは、当該ＭＶの内部に人為的に目的物質を包摂しうることを見出した。
【0010】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子をコードした微生物を炭素源存在下で培養し、前記微生物の細胞内にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を蓄積させることにより細胞内の内圧を高める工程と、前記微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、メンブランベシクルを前記細胞膜の外膜に生産する工程と、を有する、メンブランベシクルの生産方法を提供するものである。
【0011】
また、本発明は、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子及び目的物質生産遺伝子をコードした微生物を炭素源存在下で培養し、前記微生物の細胞内にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）を蓄積させることにより細胞内の内圧を高める工程と、前記微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、前記目的物質を含有するメンブランベシクルを前記細胞膜の外膜に生産する工程と、を有する、物質生産方法を提供するものである。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、微生物にバイオポリマーを生産させ、また培地中の糖濃度により大腸菌から均一な粒子径のメンブランベシクルを効率的に高生産するとともに、目的物質を効率的に高生産する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明の実施形態に係るメンブランベシクルの生産方法の概要を説明するための図である。
【図2】図２（Ａ）は遠心管内の粒子含有帯域の量の比較（BW/PHB（＋）、BW/PHB（－）、ＢＷ）、図２（Ｂ）はBW/PHB（＋）の試料からのＭＶの抽出をFM1－43 FXの蛍光強度に基づいてモニターした結果を示す図である。
【図3】図３（Ａ）は、グルコース濃度依存的にＭＶが生産されることを示した図である。図３（Ｂ）は、グルコース濃度依存的にＰＨＢが生産されることを示した図である。図３（Ｃ）は、ＰＨＢ生産量とＭＶ生産量との間の相関関係を示す図である。
【図4】走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した顕微鏡写真である。
【図6】大腸菌にＧＦＰ遺伝子を組みこんでＭＶ生産を行った結果を示す図である。
【図7】グルコース濃度を変化させた場合のＰＨＢ蓄積量とＧＦＰ強度との関係を検討した結果を示す図である。
【図8】グルコース濃度による単層ＭＶ（outer MV）と多層 ＭＶ（outer/inner MV）の発生の制御系を説明するための概念図である。
【図9】細胞壁生合成に関与する遺伝子欠損株を用いてＭＶ生産を行った結果を示す図である。
【図10】ＭＶ内にＰＨＢオリゴマーが内包されていることを示す質量分析（ＭＳ）を行った結果を示す図である。
【図11】ＭＶ中にＤＮＡが内包されている結果を示す図である。
【図12】ＭＶ中にＰＨＢ合成酵素（PhaCRe）が含まれていることを示すウェスタンブロットの分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
図１は本発明の実施形態に係るメンブランベシクルの生産方法の概要を説明するための図である。本実施形態に係るメンブランベシクルの生産方法は、以下の３つのステップで構成されている。
【0015】
ステップ１：ポリ（３－ヒドロキアルカノエート）（以下、「ＰＨＡ」ということがある）生産遺伝子をコードした微生物を炭素源存在下で培養し、ＰＨＡ蓄積による内圧を利用してＰＨＡ生産が行われる。
【0016】
ステップ２：内圧は、外膜－ペプチドグリカン－内膜の３つの構造体である生体高分子の間に形成されるリンクネットワークに物理的な摂動を与える。ここで、摂動（せつどう）とは、一般に力学系において、主要な力の寄与（主要項）による運動が、他の副次的な力の寄与（摂動項）によって乱される現象をいう。なお、転じて摂動現象をもたらす副次的な力のことを摂動と呼ぶ場合がある。その結果、エンベロープストレスとしてペリプラズム空間に無秩序な状態が発生し、ＭＶの生合成を引き起こす。
【0017】
ステップ３：細胞膜の外膜にＭＶを生産する。（Ａ）ＯＭＶが形成される場合（低内圧）、単層小胞が多く発生する。（Ｂ）ＯＩＭＶ（高内圧）が形成されると、多層小胞が多く発生する。
【0018】
本実施形態において使用される細菌は、グラム陰性菌である。かかるグラム陰性菌の例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ａｌｃａｌｌｇｅｎｅｓ属細菌、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属細菌、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属細菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ属細菌、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｖｉｂｒｉｏ属細菌などが挙げられる。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌（大腸菌）が使用される。
【0019】
大腸菌のようなグラム陰性菌の場合、ペプチドグリカンと膜合成の不均衡などいくつかの経路を経てＭＶ形成が促進される。特に、膜のエンベロープストレスは、ＭＶの生成によく関与することが分かっている。エンベロープストレスは、外膜－ペプチドグリカン－内膜という３つの生体高分子の連結構造の乱れによって引き起こされる。そのため、エンベロープストレスと密接に関連する多くの自然変異や人工変異が、細胞内に顕著に分布している。
【0020】
本実施形態において、ＭＶの生産性を高めるという観点から、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子をコードした微生物は、細胞壁生合成酵素の遺伝子欠損株であることが好ましい。より具体的には、前記微生物は、単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子の変異を含む細菌株であることが好ましい。ＭｔｇＡをコードする遺伝子の変異を含む細菌株を用いることにより、ＭＶ生産能（ＭＶの数）を増大させるだけでなく、ＭＶの粒径を増大させることができるため、目的物質の生産性（ＭＶ１個あたりの容量）を増大させることができる。
【0021】
前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）（ＰＨＡ）としては、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシペンタノエート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート、３－ヒドロキシオクタノエート、３－ヒドロキシノナノエート、３－ヒドロキシデカノエート、３－ヒドロキシドデカノエート、３－ヒドロキシテトラデカノエート、３－ヒドロキシペンタデカノエート、３－ヒドロキシヘキサデカノエート等が挙げられる。中でも、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）であることが好ましい。
【0022】
本実施形態において細菌株は、単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｔｇＡ）をコードする遺伝子（以下、「ｍｔｇＡ遺伝子」ともいう）に変異を含み、該変異は、ＭｔｇＡの不活性化をもたらす変異であるか、または該変異のない対照株と比べてＭｔｇＡ活性の低減をもたらす変異である。このような変異を、本実施形態においては、「ｍｔｇＡ遺伝子の欠損」ともいう。「変異のない対照株」とは、ｍｔｇＡ遺伝子に変異を含まない（すなわち、ｍｔｇＡ遺伝子の欠損を有しない）株であり、例えば、野生株、または当該変異を導入する前の親株を意味する。「不活性化」には、活性の喪失、抑制および低減が含まれる。すなわち、「ＭｔｇＡの不活性化」には、ＭｔｇＡ活性の喪失、抑制または低減、ＭｔｇＡの発現の喪失、抑制または低減、およびＭｔｇＡをコードする遺伝子の機能の喪失、抑制または低減が含まれる。ＭｔｇＡは、ペプチドグリカン合成に関与する酵素である。本発明において、ＭｔｇＡをコードする遺伝子における変異は、ＭｔｇＡの不活性化またはＭｔｇＡ活性の低減をもたらすいずれの変異であってもよく、当該分野で知られた方法によって変異を導入することができる。例えば、ＭｔｇＡをコードする遺伝子の塩基配列の全体または一部の欠失、該配列中の１以上の塩基の挿入もしくは置換、またはそれらの組み合わせや、ＭｔｇＡをコードする遺伝子への少なくとも１つの停止コドンの挿入、フレームシフト突然変異を導入するための１以上の塩基の挿入もしくは欠失、ＭｔｇＡをコードする遺伝子内の１以上の点突然変異の導入等が挙げられる。
【0023】
一方、本実施形態のメンブランベシクルの生産方法は、ＭＶ形成のトリガーがＰＨＡ蓄積そのものであるという、従来のメンブランベシクルの生産機構とは異なる機構である。すなわち、放出されたＭＶの量とＰＨＡ生成量には、細胞の形態変化を伴う直線的な関係が存在する。このことから、細胞の体積変化は、ＰＨＡ蓄積によって引き起こされる内圧、いわばエンベロープストレスとよく相関していると考えられる（図１）。
【0024】
本実施形態において、ＭＶの平均粒子径は、５０～２００ｎｍである。本実施形態において、平均粒子径は、ナノ粒子解析システム ナノサイトシリーズ（NanoSight社製）により測定した数値を利用している。ナノ粒子解析システム ナノサイトシリーズ（NanoSight社製）は、ナノ粒子のブラウン運動の速度を計測し、その速度から粒子径を算出する。本実施形態では、生産されるＭＶの粒子径の均一性が高いため、工業規格化や製造管理の点で利点を有する。
【0025】
本実施形態において炭素源はグルコースを使用することができる。微生物細胞内のＰＨＡ蓄積率はグルコース濃度に応じて高めることができるが、グルコース濃度が一定以上高まると微生物細胞内のＰＨＡ蓄積率も頭打ちになるため、培地中のグルコース濃度は、０．１～１５．０重量％であることが好ましく、１．５～６．０重量％であることがより好ましい。
【0026】
本実施形態の物質生産方法は、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）生産遺伝子と、目的物質生産遺伝子とをコードした微生物を炭素源存在下で培養し、前記微生物の細胞内にポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）（ＰＨＡ）を蓄積させることにより細胞内の内圧を高める工程と、前記微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させる工程と、前記目的物質を含有するメンブランベシクルを前記細胞膜の外膜に生産する工程と、を有する。
【0027】
グラム陰性菌では、与えられた生理的状況に応じて、単層ＭＶ（Outer MV, ＯＭＶ）と多層ＭＶ（Outer/Inner MV, ＯＩＭＶ）の形成がしばしば議論されている。先述したメンブランベシクルの生産方法では、培養上清中に ＯＭＶ とＯＩＭＶ が混在している状態である。そのため、本実施形態に係る物質生産方法は、このＯＩＭＶｓの形成を利用して、目的物質を封入するためのカプセルとして利用することができる。
【0028】
多層ＭＶ（ＯＩＭＶｓ）を優先的に形成させる観点からは、培地中のグルコース濃度を１．５重量％以上とすることが好ましい。
【0029】
前記目的物質としては、微生物が細胞内に生成蓄積することができ、かつ、ＭＶに封入できる有機化合物であれば限定されないが、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫グロブリンなどの抗体；アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼなどの酵素；乳酸、酢酸、コハク酸などの有機酸；エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノールなどの低級アルコール；インシュリン、副腎皮質ホルモン、アドレナリン、ノルアドレナリン、甲状腺ホルモンなどのホルモン；インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子などのサイトカイン；ワクチンの抗原；ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの誘導体などの核酸；ＤＨＡ、ＥＰＡなどの高級不飽和脂肪酸、そのモノエステル、ジエステル、トリグリセリドや、リン脂質、糖脂質などの脂質；高級アルカジエン、高級アルカトリエン、トリテルペン、テトラテルペンなどの高級炭化水素；β－カロテンやアスタキサンチン等のカロチノイド、クロロフィルやバクテリオクロロフィル等の色素；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２などのビタミン類；ポリエステルモノマー、ポリエステルオリゴマーなどのポリエステル；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；その他の生理活性物質（タンパク質、ペプチド等）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0030】
また、本実施形態において微生物の細胞膜の外膜－ペプチドグリカン－内膜に物理的な摂動を誘発させるＰＨＡはポリマーに限定されず、ＰＨＡのモノマーやＰＨＡオリゴマーであってもよい。
【0031】
本実施形態の物質生産方法においては、その他の共通する事項について、先述したメンブランベシクルの生産方法で述べた事項が適宜適用される。
【実施例0032】
１．ＭＶの生合成とＧＦＰの内包
（１）細菌株、プラスミド、増殖条件
本研究で使用した菌株とプラスミドを示す（表１）。宿主株としてE．coli BW25113を使用した。ＰＨＢ生産には、ＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ralstonia eutropha由来phaCRe）、３－ケトチオラーゼ遺伝子（R．eutropha由来phaARe）、アセトアセチル－CoA還元酵素遺伝子（R．eutropha由来phaBRe）を有するプラスミドpGEM－phaCReAB6を使用した。
（１）細菌株、プラスミド、増殖条件
本研究で使用した菌株とプラスミドを示す（表１）。宿主株としてE．coli BW25113を使用した。ＰＨＢ生産には、ＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ralstonia eutropha由来phaCRe）、３－ケトチオラーゼ遺伝子（R．eutropha由来phaARe）、アセトアセチル－CoA還元酵素遺伝子（R．eutropha由来phaBRe）を有するプラスミドpGEM－phaCReAB6を使用した。
【0033】
【表1】
【0034】
大腸菌は、通常、2.0%(w/v)のグルコースを含むＬＢ培地（10 g/L Tryptone，5 g/L Yeast extract，10 g/L NaCl）で培養し、ＰＨＢ生産に使用した。グルコース依存的なＰＨＢ生産量を調べる場合、その濃度は、0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0, 3.0, 4.0% (w/v) のように変化させた。プラスミドベクターを保有する菌株の培地には、50 mg/L アンピシリンを添加した。すべての試験菌株はＬＢで30℃、13時間前培養し、500 mL坂口フラスコ中の新鮮なＬＢ 100 mlに接種した。組換え株は125strokes/minで往復振盪して培養した。
【0035】
（２）電子顕微鏡による観察
組換え大腸菌の培養上清を電子顕微鏡観察に供した。遠心分離（6000×g，１分）により細胞ペレットを回収し、10mM ＰＢＳ中2.5%グルタルアルデヒドで4℃、一晩固定した。固定した細胞を10 mM ＰＢＳで3回洗浄し、2%酸化オスミウム溶液で追加固定した。固定した細胞を水で3回洗浄した後、ｔ－ブチルアルコールで凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞をカーボンテープに貼り付け、イオンスパッタリング装置（HPC－1SW，Vacuum device）を用いてオスミウムをスパッタリングコーティングした。この細胞を、走査型電子顕微鏡（JSM-6700F，日本電子）を用いて5kVの電圧で検査した。
組換え大腸菌の培養上清を電子顕微鏡観察に供した。遠心分離（6000×g，１分）により細胞ペレットを回収し、10mM ＰＢＳ中2.5%グルタルアルデヒドで4℃、一晩固定した。固定した細胞を10 mM ＰＢＳで3回洗浄し、2%酸化オスミウム溶液で追加固定した。固定した細胞を水で3回洗浄した後、ｔ－ブチルアルコールで凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞をカーボンテープに貼り付け、イオンスパッタリング装置（HPC－1SW，Vacuum device）を用いてオスミウムをスパッタリングコーティングした。この細胞を、走査型電子顕微鏡（JSM-6700F，日本電子）を用いて5kVの電圧で検査した。
【0036】
（３）細胞の大きさの決定
顕微鏡BZ－X700（キーエンス社製）を用いて細胞画像を撮影した。SH800 cell sorter (SONY)を用いてフローサイトメトリーにより相対的な細胞サイズを測定した。48時間後に細胞を採取し、ＰＢＳで10倍希釈したサンプルを分析した。流速は6μL/minとした（圧力1）。SH800ソフトウェア（SONY）を用いて、10万カウントの前方散乱データおよび後方散乱データを記録した。
顕微鏡BZ－X700（キーエンス社製）を用いて細胞画像を撮影した。SH800 cell sorter (SONY)を用いてフローサイトメトリーにより相対的な細胞サイズを測定した。48時間後に細胞を採取し、ＰＢＳで10倍希釈したサンプルを分析した。流速は6μL/minとした（圧力1）。SH800ソフトウェア（SONY）を用いて、10万カウントの前方散乱データおよび後方散乱データを記録した。
【0037】
（４）ＰＨＢ総量の定量化
培養後、回収した細胞を水で3回洗浄し、凍結乾燥させた。細胞中のＰＨＢ含量は、メタノールで乾燥させた細胞試料を用いて、先に述べたようにガスクロマトグラフ（ＧＣ）により定量した。簡単に説明すると、約50 mgの乾燥細胞を、15：85% (v/v) 硫酸/メタノール 2 mLおよびクロロホルム 2 mL中、100 ℃で140分間メタノール化した。冷却後、純水 1 mL を加え、2 層に分離するまで放置した。クロロホルム層の一部を炎イオン化検出器（FID）付きＧＣ（GC－2030、島津製作所）に供し、P（3HB）由来のメチルエステル化3HBを検出した。
培養後、回収した細胞を水で3回洗浄し、凍結乾燥させた。細胞中のＰＨＢ含量は、メタノールで乾燥させた細胞試料を用いて、先に述べたようにガスクロマトグラフ（ＧＣ）により定量した。簡単に説明すると、約50 mgの乾燥細胞を、15：85% (v/v) 硫酸/メタノール 2 mLおよびクロロホルム 2 mL中、100 ℃で140分間メタノール化した。冷却後、純水 1 mL を加え、2 層に分離するまで放置した。クロロホルム層の一部を炎イオン化検出器（FID）付きＧＣ（GC－2030、島津製作所）に供し、P（3HB）由来のメチルエステル化3HBを検出した。
【0038】
（５）ＭＶの分離と定量化
ＭＶの単離と定量は、65 mLの培養上清（BW/PHB（＋）、BW/PHB（－）、BW）を0.45μm孔径のセルロースアセテートフィルター（Merck Millipore）でろ過し、150万×g、4℃で1時間超遠心をした。このペレットを二重蒸留水に再懸濁し、ＭＶの定量を行った。さらに精製するために、ＭＶペレットをHEPES－NaClバッファーの45%ヨードキサノール（Optiprep，AXIS－SHIELD）に再懸濁し、45－10%のヨードキサノールグラジエントで密度勾配超遠心 (100万×g、4℃、3時間) に供した。ＭＶの定量化のため、単離したＭＶを200μLのＰＢＳに溶解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の1.25μg/mL FM1－43 FX（Molecular Probes，Invitrogen）とインキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーSynergy H1（BioTek Instruments社製）を用いて、励起波長472nm、発光波長580nmでＭＶを測定した。FM1－43 FXによる染色を行わないＭＶサンプル、またはFM1－43 FX単独をネガティブコントロールとした。
ＭＶの単離と定量は、65 mLの培養上清（BW/PHB（＋）、BW/PHB（－）、BW）を0.45μm孔径のセルロースアセテートフィルター（Merck Millipore）でろ過し、150万×g、4℃で1時間超遠心をした。このペレットを二重蒸留水に再懸濁し、ＭＶの定量を行った。さらに精製するために、ＭＶペレットをHEPES－NaClバッファーの45%ヨードキサノール（Optiprep，AXIS－SHIELD）に再懸濁し、45－10%のヨードキサノールグラジエントで密度勾配超遠心 (100万×g、4℃、3時間) に供した。ＭＶの定量化のため、単離したＭＶを200μLのＰＢＳに溶解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の1.25μg/mL FM1－43 FX（Molecular Probes，Invitrogen）とインキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーSynergy H1（BioTek Instruments社製）を用いて、励起波長472nm、発光波長580nmでＭＶを測定した。FM1－43 FXによる染色を行わないＭＶサンプル、またはFM1－43 FX単独をネガティブコントロールとした。
【0039】
ＭＶの粒子径は、NanoSight NTA 3.2 (Malvern Instruments) を用いて測定した。単離したＭＶを用いてNanoSight粒子追跡解析を行った。ナノサイト粒子解析は、ゲインを10、検出閾値を2、カメラレベルを13に設定し、3回に分けて60秒リードで実施した。各サンプルから対応するブランクサンプルのバックグラウンドが差し引かれ、3つのリードの平均が計算され、粒子径とmLあたりの粒子数でプロットされた。
【0040】
ＴＥＭ 観察では、単離した ＭＶ を 2%酢酸ウラニルで染色し、120 kV の透過型電子顕微鏡（JEM－2010、日本電子）で検査した。分離したＭＶに関与するタンパク質は、12.0%ポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS－PAGE）により分析し、クーマシーブリリアントブルー（EzStain AQua，ATTA）で染色した。
【0041】
（６）結果
（６－１）大腸菌の乾燥細胞重量、ＰＨＢ含量、相対的なＭＶ生産量
表２に、各大腸菌の乾燥細胞重量、ＰＨＢ含量を測定した結果を示す。また、図２（Ａ）は遠心管内の粒子含有帯域の量の比較（BW/PHB（＋）、BW/PHB（－）、BW）、図２（Ｂ）はBW/PHB（＋）の試料からのＭＶの抽出をFM1－43 FXの蛍光強度に基づいてモニターした結果を示す図である。
（６－１）大腸菌の乾燥細胞重量、ＰＨＢ含量、相対的なＭＶ生産量
表２に、各大腸菌の乾燥細胞重量、ＰＨＢ含量を測定した結果を示す。また、図２（Ａ）は遠心管内の粒子含有帯域の量の比較（BW/PHB（＋）、BW/PHB（－）、BW）、図２（Ｂ）はBW/PHB（＋）の試料からのＭＶの抽出をFM1－43 FXの蛍光強度に基づいてモニターした結果を示す図である。
【0042】
ＰＨＢ合成経路を有する組換え株 BW/PHB (＋) (pGEM－phaCReAB を保有する BW25113) を培養すると、坂口フラスコ内に多数の気泡が観察された。表２に示すように、2%グルコースを含む ＬＢ 培地において、ＰＨＢの細胞内含量は 60 ± 4 wt% であった。
【0043】
一方、不活性化ＰＨＢ合成酵素遺伝子 [phaCRe(C319A)]6 を保有するBW/PHB (－) とプラスミドを保有しない親株大腸菌BW25113 (BW) ではこの現象が見られないことを確認した。したがって、この現象はＰＨＢ生産株に特異的であることがわかった。このため、いくつかの解析により、さらに泡の存在を確認した。その結果、透過型電子顕微鏡観察のために固定液（四酸化オスミウム）にさらすと、泡の中には少なくとも黒く変化した脂質が含まれていることが示唆された。
【0044】
【表2】
【0045】
また、図２に示すように、BW/PHB（＋）の試料からのＭＶの抽出をFM1－43 FXの蛍光強度に基づいてモニターしたところ、大腸菌にＰＨＢ（polyhydroxybutyrate)生産遺伝子群を発現させ、ＰＨＢを高発現させると、大腸菌表面にＭＶが大量に生成されることが明らかとなった。
【0046】
（６－２）ＰＨＢ蓄積量とＭＶ生成量の関係
次に、グルコース添加濃度に伴うＰＨＢ生産およびＭＶ分泌の亢進が、細胞自体にどのような影響を及ぼすかについて検討した。図３（Ａ）は、グルコース濃度依存的にＭＶが良好に生成されることを示している。これは、グルコース濃度を調節することで、ＭＶ生成量を微調整できることを意味している。また、放出されたＭＶの量は、図３（Ｂ）に示すように、ＰＨＢ生産量と良好に比例していた。驚くべきことに、図３（Ｃ）に示すように、ＰＨＢ生産量とＭＶ生産量の間には、R2＝0.99625という極めて高い相関関係を得ることができた。したがって、グルコース濃度を調節することで、ＭＶの分泌量を細かく調節・制御できることが明らかとなった。
次に、グルコース添加濃度に伴うＰＨＢ生産およびＭＶ分泌の亢進が、細胞自体にどのような影響を及ぼすかについて検討した。図３（Ａ）は、グルコース濃度依存的にＭＶが良好に生成されることを示している。これは、グルコース濃度を調節することで、ＭＶ生成量を微調整できることを意味している。また、放出されたＭＶの量は、図３（Ｂ）に示すように、ＰＨＢ生産量と良好に比例していた。驚くべきことに、図３（Ｃ）に示すように、ＰＨＢ生産量とＭＶ生産量の間には、R2＝0.99625という極めて高い相関関係を得ることができた。したがって、グルコース濃度を調節することで、ＭＶの分泌量を細かく調節・制御できることが明らかとなった。
【0047】
（６－３）電子顕微鏡による観察
図４は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した顕微鏡写真である。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、BW/PHB（＋）の単細胞表面に複数の粒子（約100nmスケール）が出芽していた。これらの形態学的観察から、このような出芽した粒子は、Hirayamaら，Microb．，Biotechnol．13，1162－1178 (2020)に基づき、メンブランベシクル（ＭＶ、矢印）であると推測した。
図４は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した顕微鏡写真である。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、BW/PHB（＋）の単細胞表面に複数の粒子（約100nmスケール）が出芽していた。これらの形態学的観察から、このような出芽した粒子は、Hirayamaら，Microb．，Biotechnol．13，1162－1178 (2020)に基づき、メンブランベシクル（ＭＶ、矢印）であると推測した。
【0048】
（６－４）細胞の大きさの決定
図５（Ａ）は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による顕微鏡写真である。また、図５（Ｂ）は、 NanoSightトラッキング解析によりＭＶの粒度分布を解析した結果を示す図である。
図５（Ａ）は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による顕微鏡写真である。また、図５（Ｂ）は、 NanoSightトラッキング解析によりＭＶの粒度分布を解析した結果を示す図である。
【0049】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析によっても、回収画分にＭＶが存在することが明らかになった（図５Ａ）。ＴＥＭ像では、単層および多層のＭＶが混在していることが確認された。次に、Nanosightトラッキング分析によりＭＶの直径を測定し、そのサイズ分布をプロットした（図５Ｂ）。BW/PHB (＋) 細胞由来の MV の平均粒子径は 93.2 ±3.1 nm であり、先行研究 で見られた親株の大腸菌 BW25113 で観察されたものと一致した。これらの結果から、BW/PHB（＋）細胞は、ＭＶを培養液中に放出したことが示唆された。最終的に、ＭＶの生合成について結論付けた。
【0050】
（６－５）細胞内物質 （ＧＦＰ） のＭＶへの内包
図６は、大腸菌にＧＦＰ遺伝子を組みこんでＭＶ生産を行った結果を示す図である。常法に従い、大腸菌にＧＦＰ遺伝子を組みこんで先述した培養下で培養した。その結果、生成したＭＶ中にＧＦＰが大量に含有されていることが明らかになった。
図６は、大腸菌にＧＦＰ遺伝子を組みこんでＭＶ生産を行った結果を示す図である。常法に従い、大腸菌にＧＦＰ遺伝子を組みこんで先述した培養下で培養した。その結果、生成したＭＶ中にＧＦＰが大量に含有されていることが明らかになった。
【0051】
この結果から、ＭＶ生成方法により有用な物質を大量にＭＶに含有させることが可能となった。これらの技術は、ＤＤＳやワクチンにも応用展開可能と考えられる。
【0052】
（６－６）
図７は、グルコース濃度を変化させた場合のＰＨＢ蓄積量とＧＦＰ強度との関係を検討した結果を示す図である。細胞内で生産させた目的物質を封入するためのカプセルとしては、単層ＭＶ（ＯＭＶ） よりも多層ＭＶ（ＯＩＭＶ）が優れている。既存の技術では、体積の小さなペリプラズムという微小空間で、目的物質を生産させてＯＭＶに封入するという非効率的な手法が採用されてきた（Ojimaら，Biotechnol. Bioeng. 2020, 117 (3), 701-709.）。一方、今回は、体積の大きな細胞質空間で目的物を生産させると同時に、ＯＩＭＶに目的物を濃密にパッキングできることが示されている（図６）。さらに、グルコース濃度を変化させてＰＨＢ蓄積量とＧＦＰ強度を測定することで、単層ＭＶ（ＯＭＶ）と多層ＭＶ（ＯＩＭＶ）の生成に与える影響を推察した。
図７は、グルコース濃度を変化させた場合のＰＨＢ蓄積量とＧＦＰ強度との関係を検討した結果を示す図である。細胞内で生産させた目的物質を封入するためのカプセルとしては、単層ＭＶ（ＯＭＶ） よりも多層ＭＶ（ＯＩＭＶ）が優れている。既存の技術では、体積の小さなペリプラズムという微小空間で、目的物質を生産させてＯＭＶに封入するという非効率的な手法が採用されてきた（Ojimaら，Biotechnol. Bioeng. 2020, 117 (3), 701-709.）。一方、今回は、体積の大きな細胞質空間で目的物を生産させると同時に、ＯＩＭＶに目的物を濃密にパッキングできることが示されている（図６）。さらに、グルコース濃度を変化させてＰＨＢ蓄積量とＧＦＰ強度を測定することで、単層ＭＶ（ＯＭＶ）と多層ＭＶ（ＯＩＭＶ）の生成に与える影響を推察した。
【0053】
その結果、グルコース濃度が15 g/L（1.5重量％）以上でＧＦＰ強度が指数関数的に増加することが判明した（図７上）。また、走査型電子顕微鏡（JSM-6700F，日本電子）でＭＶの膜構造を観察したところ、グルコース濃度5 g/Lでは単層ＭＶ（outer MV）、グルコース濃度20 g/Lでは多層 ＭＶ（outer/inner MV）が優位に発生していたことが判明した（図７下）。従って、今回の実験系において、グルコース濃度15 g/L（1.5重量％）を境に単層ＭＶ（outer MV）と多層 ＭＶ （outer/inner MV）の発生率が変化したことが明らかとなった。
【0054】
図８は、グルコース濃度による単層ＭＶ（outer MV）と多層 ＭＶ（outer/inner MV）の制御系を説明するための概念図である。上記の実験の結果、単層ＭＶ（outer MV）の発生が優位なグルコース濃度と、多層膜ＭＶの発生が優位となるグルコース濃度との間に臨界点が存在することが推察された。ホストとなる微生物や培養条件によって、この臨界点は異なるが、グルコース濃度を調整することにより、単層ＭＶ（outer MV）と多層 ＭＶ（outer/inner MV）の発生を任意に制御できる可能性が示された。
【0055】
２．ＭＶ生産性の増強と各種有用物質の内包
（１）方法
細胞壁生合成酵素をコードする遺伝子mtgAを欠損させた大腸菌に、pGEM-phaCReAB （表１） を導入し、2.0% (w/v) のグルコースを含むＬＢ培地で培養し、ＰＨＢを生産させた。上述と同様に、培養条件は、30°C、13時間前培養し、500 mL坂口フラスコ中の新鮮なLB 100 mL に接種した。さらに、組換え株は125 strokes/minで往復振盪して培養した。また、ＭＶの分離と定量は、前記１（５） と同様に実施した。
（１）方法
細胞壁生合成酵素をコードする遺伝子mtgAを欠損させた大腸菌に、pGEM-phaCReAB （表１） を導入し、2.0% (w/v) のグルコースを含むＬＢ培地で培養し、ＰＨＢを生産させた。上述と同様に、培養条件は、30°C、13時間前培養し、500 mL坂口フラスコ中の新鮮なLB 100 mL に接種した。さらに、組換え株は125 strokes/minで往復振盪して培養した。また、ＭＶの分離と定量は、前記１（５） と同様に実施した。
【0056】
ＭＶ中のＤＮＡ内包の存否については、ＤＮＡポリメラーゼ Prime STAR GXL (Takara) を用いたＰＣＲによって分析した。ＰＣＲ条件は、精製したＭＶサンプルを鋳型にして、ＰＨＢ重合酵素をコードするＤＮＡを複製するためのプライマーを用いて、98℃、30秒/60℃、30秒/68℃、1分30秒、30サイクルの反応条件で実施し、アガロースゲル電気泳動によって、ＰＣＲ産物を解析した。
【0057】
ＭＶ中のＤＮＡ内包の存否については、精製したＭＶサンプル 1 μLをESI-TofMS分析装置に供した。イオン化の条件は、加速電圧30 kVでポジティブイオンモードに設定し、m/z 値100 － 5000までのトータルイオンを検出した。
【0058】
（２）結果
（２－１）ＭＶ生産性の増強、ＭＶ粒子径の増大制御
細胞壁生合成に関与する遺伝子欠損を鋭意検討した結果を図９に示す。図９に示すように、細胞壁生合成酵素をコードする遺伝子mtgAを欠損させた大腸菌を宿主として使用することにより、野生株と比較してＭＶの生産性が７．７倍に向上することが判明した。さらに、この際、野生株でのＭＶの粒子径と比べて、１．３倍増大することがわかった。これらの結果から、mtgA遺伝子を欠損することが、ＭＶ生産能を増大させるだけでなく、内包化合物の収容能力（キャパシティ）に関与する粒径の増大制御に有効であることが明らかとなった。
（２－１）ＭＶ生産性の増強、ＭＶ粒子径の増大制御
細胞壁生合成に関与する遺伝子欠損を鋭意検討した結果を図９に示す。図９に示すように、細胞壁生合成酵素をコードする遺伝子mtgAを欠損させた大腸菌を宿主として使用することにより、野生株と比較してＭＶの生産性が７．７倍に向上することが判明した。さらに、この際、野生株でのＭＶの粒子径と比べて、１．３倍増大することがわかった。これらの結果から、mtgA遺伝子を欠損することが、ＭＶ生産能を増大させるだけでなく、内包化合物の収容能力（キャパシティ）に関与する粒径の増大制御に有効であることが明らかとなった。
【0059】
（２－２）ＭＶ中のＰＨＢオリゴマー内包の確認
図１０は、ＭＶ内にＰＨＢオリゴマーが内包されていることを示す質量分析 （ＭＳ） の結果である。ＰＨＢ合成酵素のアミノ酸変異を鋭意検討した結果、ＰＨＢ合成酵素の改変体を用いた場合、20量体のＰＨＢオリゴマー （m/z 1756、図１０中の下矢印）が内包されていることが明らかとなった。
図１０は、ＭＶ内にＰＨＢオリゴマーが内包されていることを示す質量分析 （ＭＳ） の結果である。ＰＨＢ合成酵素のアミノ酸変異を鋭意検討した結果、ＰＨＢ合成酵素の改変体を用いた場合、20量体のＰＨＢオリゴマー （m/z 1756、図１０中の下矢印）が内包されていることが明らかとなった。
【0060】
（２－３）ＭＶ中のＤＮＡ内包の確認
図１１は、ＭＶ中にＤＮＡが内包されている結果を示す図である。ＰＣＲの結果、ＰＨＢ重合酵素をコードする遺伝子が検出された。すなわち、細胞内に存在するプラスミドがＭＶ形成の際に、ＭＶの内部に内包・誘導されることがわかった。
図１１は、ＭＶ中にＤＮＡが内包されている結果を示す図である。ＰＣＲの結果、ＰＨＢ重合酵素をコードする遺伝子が検出された。すなわち、細胞内に存在するプラスミドがＭＶ形成の際に、ＭＶの内部に内包・誘導されることがわかった。
【0061】
（２－４）ＭＶ中のＰＨＢ合成酵素の内包の確認
図１２は、ＭＶ中にＰＨＢ合成酵素（PhaCRe）が含まれていることを示すウェスタンブロットの分析結果を示す図である。図１２に示すように、まず、通常の培養では細胞質内でしか存在しないと想定されるＰＨＢ合成酵素が、培養上清液から検出された（サンプル１）。また、超遠心分離機によって回収されたＭＶ（サンプル２）、さらに精製されたＭＶ（サンプル３）からもＰＨＢ合成酵素が検出されることがわかった。このことから、ＰＨＢ合成酵素は、細胞質内で発現し、ＭＶを介して細胞外へと分泌されていることが明らかとなった。つまり、有用酵素であるＰＨＢ合成酵素をＭＶの中に詰め込むことができることを意味している。
図１２は、ＭＶ中にＰＨＢ合成酵素（PhaCRe）が含まれていることを示すウェスタンブロットの分析結果を示す図である。図１２に示すように、まず、通常の培養では細胞質内でしか存在しないと想定されるＰＨＢ合成酵素が、培養上清液から検出された（サンプル１）。また、超遠心分離機によって回収されたＭＶ（サンプル２）、さらに精製されたＭＶ（サンプル３）からもＰＨＢ合成酵素が検出されることがわかった。このことから、ＰＨＢ合成酵素は、細胞質内で発現し、ＭＶを介して細胞外へと分泌されていることが明らかとなった。つまり、有用酵素であるＰＨＢ合成酵素をＭＶの中に詰め込むことができることを意味している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
