特開 2024-12295 ＤＵＸ４の発現を低減するためのＰ３８阻害剤の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024012295

(43)【公開日】2024-01-30

(54)【発明の名称】ＤＵＸ４の発現を低減するためのＰ３８阻害剤の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240123BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20240123BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240123BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240123BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240123BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/4418 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240123BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z

C12N5/077 ZNA

C12N15/11 Z

C07K14/47

C07K16/18

C12Q1/02

A61K31/4418

A61K31/4439

A61K31/506

A61K31/519

A61K31/7088

A61K31/713

A61K38/02

A61K45/00

A61P21/00

A61P43/00 105

A61P43/00 121

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023171577

(22)【出願日】2023-10-02

(62)【分割の表示】P 2020520036の分割

【原出願日】2018-10-05

(31)【優先権主張番号】62/568,673

(32)【優先日】2017-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/568,754

(32)【優先日】2017-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/682,565

(32)【優先日】2018-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/682,563

(32)【優先日】2018-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

３．プルロニック

４．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520117639

【氏名又は名称】フルクラム セラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】カカーチェ，アンジェラ マリー

(72)【発明者】

【氏名】ロハス ソト，ルイス グスタヴォ アレハンドロ

(72)【発明者】

【氏名】トンプソン，ローリン エー．，サード

(72)【発明者】

【氏名】ウォレス，オーウェン ブレンダン

(72)【発明者】

【氏名】ロンコ，ルシエンヌ，ブイ．

(72)【発明者】

【氏名】シェン，ニン

(72)【発明者】

【氏名】ロバートソン，アラン スコット

(72)【発明者】

【氏名】チャン，アーロン ナクウォン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＤＵＸ４及びＤＵＸ４によって調節される下流遺伝子の遺伝子およびタンパク質発現を低減するためにｐ３８キナーゼを阻害する組成物および方法を提供する。
【解決手段】細胞における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、または、ＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減する方法であって、前記細胞を、前記細胞における活性ｐ３８タンパク質の低減をもたらす作用剤と接触させ、それによって前記ＤＵＸ４ポリペプチドまたはＤＵＸ４の前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの発現を低減することを含む、方法とする。
【選択図】図６Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減する方法であって、前記細胞を、前記細胞における活性ｐ３８タンパク質の低減をもたらす作用剤と接触させ、それによって前記ＤＵＸ４ポリペプチドまたはＤＵＸ４の前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの発現を低減することを含む、方法。

【請求項2】

前記作用剤は、前記ｐ３８タンパク質の発現もしくは活性を阻害するか、またはその量を低減し、前記活性が、任意にキナーゼ活性である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞が、筋細胞、任意に終末分化筋細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞が、対照細胞における、前記ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、前記ＤＵＸ４ポリペプチド、または前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの発現レベルと比較して、前記ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、前記ＤＵＸ４ポリペプチド、または前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの増加した発現レベルを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、前記ＤＵＸ４ポリペプチド、または前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの前記増加した発現レベルが、前記細胞におけるＤ４Ｚ４遺伝子座での低減した抑制によるものである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記細胞が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連している、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記細胞が、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に１個以上のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復の欠失を含み、任意に、前記細胞が、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に７個以下のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞が、染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有１（ＳＭＣＨＤ１）遺伝子に１つ以上の変異を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記細胞が、少なくとも１つの非欠失４ｑＡ対立遺伝子を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質の前記発現を阻害する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそのアンチセンスポリヌクレオチドに結合する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記作用剤が、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質の前記活性を阻害する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質に結合する、請求項１～９、および１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記作用剤が、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、またはこれからなる、請求項１～９、１３、および１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記作用剤が、小分子、任意に小有機分子または小無機分子を含む、請求項１～９、１３、および１４のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記下流標的遺伝子が、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記ｐ３８タンパク質の前記発現または前記活性が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減される、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４タンパク質、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現と関連した疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において、それを行う方法であって、前記対象に、前記対象の１つ以上の組織における低減した活性ｐ３８タンパク質の量をもたらす作用剤を含む薬学的組成物を提供し、それによって前記対象の１つ以上の組織における前記ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、前記ＤＵＸ４タンパク質、または前記下流標的遺伝子をコードする前記ポリペプチドの発現を低減することを含む、方法。

【請求項20】

前記疾患または障害が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、任意にＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記対象が、Ｄ４Ｚ４遺伝子座で低減した抑制を含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記対象が、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に１個以上のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復の欠失を含み、任意に、前記細胞が、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に７個以下のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復を含む、請求項１９～２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

前記対象が、染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有１（ＳＭＣＨＤ１）遺伝子に１つ以上の変異を含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

前記対象が、少なくとも１つの非欠失４ｑＡ対立遺伝子を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質の前記発現を阻害する、請求項１９～２４のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそのアンチセンスポリヌクレオチドに結合する、請求項１９～２５のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

前記作用剤が、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる、請求項１９～２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質の前記活性を阻害する、請求項１９～２４のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質に結合する、請求項１９～２４、および２８のいずれかに記載の方法。

【請求項30】

前記作用剤が、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、またはこれからなる、請求項１９～２４、２８、および２９のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

前記作用剤が、小分子、任意に小有機分子または小無機分子を含む、請求項１９～２４、２８、および２９のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

前記下流標的遺伝子が、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである、請求項１９～３１のいずれかに記載の方法。

【請求項33】

前記ｐ３８タンパク質の前記発現または前記活性が、前記対象の筋組織において少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減される、請求項１９～３２のいずれかに記載の方法。

【請求項34】

前記方法が、前記対象の筋組織における前記ｐ３８タンパク質の前記発現または活性を阻害する、請求項１９～３３のいずれかに記載の方法。

【請求項35】

前記方法が、前記対象における筋変性を減少させる、請求項１９～３４のいずれかに記載の方法。

【請求項36】

前記方法が、前記対象における筋細胞のアポトーシスを低減する、請求項１９～３５のいずれかに記載の方法。

【請求項37】

前記筋組織が、終末分化している、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記薬学的組成物が、前記対象に非経口的に提供される、請求項１１に記載の方法。

【請求項39】

前記薬学的組成物が、前記対象の筋組織に提供される、請求項１１に記載の方法。

【請求項40】

前記方法が、前記対象に、ＤＵＸ４タンパク質、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現と関連した前記疾患または障害を治療するための第２の作用剤を提供することをさらに含む、請求項１９～３９のいずれかに記載の方法。

【請求項41】

細胞における低減した活性ｐ３８タンパク質の量をもたらす作用剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物の単位剤形であって、前記単位剤形が投与される対象における１つ以上の細胞または組織における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を低減するために有効である、単位剤形。

【請求項42】

前記作用剤が、前記ＤＵＸ４ポリペプチドに結合するか、または前記ＤＵＸ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに結合する、請求項４１に記載の単位剤形。

【請求項43】

前記作用剤が、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる、請求項４１または請求項４２に記載の単位剤形。

【請求項44】

前記作用剤が、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、またはこれからなる、請求項４１または請求項４２に記載の単位剤形。

【請求項45】

前記作用剤が、小分子、任意に有機分子または無機分子を含む、請求項４１または請求項４２に記載の単位剤形。

【請求項46】

前記下流標的遺伝子が、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである、請求項４１～４５のいずれかに記載の単位剤形。

【請求項47】

前記組織が、筋組織であり、任意に、前記組織が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連した変異を含む細胞を含む、請求項４１～４６のいずれかに記載の単位剤形。

【請求項48】

筋細胞のアポトーシスを低減する方法であって、前記細胞を、前記細胞における低減した活性ｐ３８タンパク質の量をもたらす作用剤と接触させ、それによって、前記細胞における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４タンパク質、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減することを含み、任意に、前記筋細胞が、終末分化している、方法。

【請求項49】

前記細胞が、対照細胞における、前記ＤＵＸ４ポリペプチド、または前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの発現レベルと比較して、前記ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、前記ＤＵＸ４ポリペプチド、または前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの増加した発現レベルを有する、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、前記ＤＵＸ４ポリペプチド、または前記下流標的遺伝子によってコードされる前記ポリペプチドの前記増加した発現レベルが、前記細胞におけるＤ４Ｚ４遺伝子座での低減した抑制によるものである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記細胞が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連している、請求項４８～５０のいずれかに記載の方法。

【請求項52】

前記細胞が、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に１個以上のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復の欠失を含み、任意に、前記細胞が、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に７個以下のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復を含む、請求項４８～５１のいずれかに記載の方法。

【請求項53】

前記細胞が、染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有１（ＳＭＣＨＤ１）遺伝子に１つ以上の変異を含む、請求項４８～５２のいずれかに記載の方法。

【請求項54】

前記細胞が、少なくとも１つの非欠失４ｑＡ対立遺伝子を含む、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質の前記発現を阻害する、請求項５３～５９のいずれかに記載の方法。

【請求項56】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそのアンチセンスポリヌクレオチドに結合する、請求項４８～５５のいずれかに記載の方法。

【請求項57】

前記作用剤が、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる、請求項４８～５６のいずれかに記載の方法。

【請求項58】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質の前記活性を阻害する、請求項４８～５４のいずれかに記載の方法。

【請求項59】

前記作用剤が、前記ｐ３８タンパク質に結合する、請求項４８～５４、および５８のいずれかに記載の方法。

【請求項60】

前記作用剤が、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、またはこれからなる、請求項４８～５４、５８３、および５９のいずれかに記載の方法。

【請求項61】

前記作用剤が、小分子、任意に小有機分子または小無機分子を含む、請求項４８～５４、５８、および５９のいずれかに記載の方法。

【請求項62】

前記下流標的遺伝子が、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである、請求項４８～６１のいずれかに記載の方法。

【請求項63】

前記ｐ３８タンパク質の前記発現または前記活性が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減される、請求項４８～６２のいずれかに記載の方法。

【請求項64】

前記方法が、筋組織における筋細胞のアポトーシスを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減する、請求項４８～６３のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月５日出願の米国仮特許出願第６２／５６８，６７３号、２０１７年１０月５日出願の米国仮特許出願第６２／５６８，７５４号、２０１８年６月８日出願の米国仮特許出願第６２／６８２，５６３号、および２０１８年６月８日出願の米国仮特許出願第６２／６８２，５６５号の優先権を主張し、これらの全ては、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年１０月４日に作成された、当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＦＵＬＣ＿０２７＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前がつけられ、２７ＫＢのサイズである。

【0003】

本発明は、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４によって調節される下流遺伝子の遺伝子およびタンパク質発現を低減するためにｐ３８キナーゼを阻害する組成物および方法に関する。本発明はさらに、ＤＵＸ４の増加した発現またはＤＵＸ４の異常形態の発現と関連した疾患および障害、例えば、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有する対象を治療するための方法に関する。

【背景技術】

【0004】

筋ジストロフィー（ＭＤ）は、動作を制御する骨格筋の進行性衰弱および変性によって特徴付けられる３０超の異なる遺伝子疾患の一群である。ＭＤのいくつかの形態は、乳幼児期または小児期に発生し、他の形態は、中年期以降まで出現しないことがある。様々なＭＤ疾患は、筋衰弱の分布および程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発症年齢、進行速度、ならびに遺伝パターンについて異なる。

【0005】

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、筋ジストロフィーの３番目に最も一般的な形態であり、世界中の１５，０００人に１人に影響を及ぼす。ＦＳＨＤは、ＤＵＸ４遺伝子のエピジェネティックな抑制解除をもたらす遺伝子突然変異によって引き起こされ、これはこの疾患を筋ジストロフィーの中でも独特なものにしている。ＦＳＨＤの主要な徴候は、顔面、肩帯、上腕、および胴体の筋肉の衰弱および消耗であり、より重症例では下肢に影響を及ぼす。

【0006】

ＦＳＨＤと関連した遺伝子突然変異は、Ｄ４Ｚ４クロマチン構造の部分的な脱圧縮をもたらし、結果として、骨格筋において、ＤＵＸ４、Ｄ４Ｚ４単位によってコードされる転写因子を抑制することができない。報告されたＦＳＨＤ症例の約９５％を表す、ＦＳＨＤ１は、１～１０個のＤ４Ｚ４反復を残す、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域におけるマクロサテライトＤ４Ｚ４反復の欠失と関連している（Ｔａｗｉｌ ｅｔ．ａｌ．，２０１４に概説される）。ＦＳＨＤ２は、染色体１８上の染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有１遺伝子（ＳＭＣＨＤ１）における突然変異によって引き起こされる（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ ｅｔ．ａｌ．，２００７に概説される）。ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２突然変異の両方は、４ｑ３５ Ｄ４Ｚ４反復アレイでの抑制の喪失をもたらし、ダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）転写因子をコードする、ダブルホメオボックス４、ＤＵＸ４の全長形態、ｍＲＮＡ（ＤＵＸ４－ｆｌ）の筋肉における異常な転写を可能にする（Ｔａｗｉｌ ｅｔ．ａｌ．，２０１４）。ＦＳＨＤと関連していることが見出されたＤＵＸ４－ｆｌ ＲＮＡアイソフォームは、３′非翻訳領域においてのみ異なり、特定された機能的区別を有さない。

【0007】

現在、ＦＳＨＤの効果を停止または逆転することができる承認された治療はないが、快適性および可動性を改善するために、多くの場合、非ステロイド性抗炎症薬が処方されている。したがって、明らかに、当該技術分野には、例えば、ＦＳＨＤおよび他の疾患を治療するために、ＤＵＸ４、例えば、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡおよび／またはＤＵＸ４タンパク質の発現レベルを低減するための新たな方法の必要性がある。本発明は、この必要性を満たす。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A-1B】ＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４タンパク質およびＲＮＡの発現を示す。図１Ａは、ＤＵＸ４タンパク質および／または４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核を検出するため）を結合する抗体を用いて染色されたＦＳＨＤ筋管の顕微鏡写真を含む。成熟ＦＳＨＤ筋管は、培養（図示せず）においてアクチン横紋を示し、筋管内に含有される核の別個のセットにおいてＤＵＸ４タンパク質を発現した（図１Ａ）。図１Ｂは、ＦＳＨＤ筋管および同質遺伝子野生型（健康）対照からの筋管におけるＤＵＸ４ ｍＲＮＡの相対発現を示すグラフである。

【図2】ＤＭＳＯで治療された野生型筋管、またはＦＴＸ－２もしくはＤＭＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管における示されたＤＵＸ４調節遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すグラフである。各示された遺伝子について、バーは、左から右へ、ＤＭＳＯで治療された野生型筋管、ＤＭＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管、およびＦＴＸ－２（ＤＵＸ４標的化ＡＳＯ）で治療されたＦＳＨＤ筋管に対応する。

【図3A-3C】ＤＵＸ４標的化ＡＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡの低減を示す。ＭＢＤ３Ｌ２は、ｑＰＣＲによって測定されるＰＯＬＲ２Ａ ｍＲＮＡに対して正規化された。図３Ａは、ＤＭＳＯ対照または１μＭのＤＵＸ４標的化ＡＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管、および健康な正常同系野生型筋管（ＷＴ）におけるＭＢＤ３Ｌ２発現を比較する群化されたプレート品質管理データを示すグラフである。図３Ｂは、ＤＵＸ４標的化ＡＳＯ（ＦＴＸ－２）の異なる希釈物で治療されたＦＳＨＤ筋管におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ発現の用量依存性低減を示すグラフである。図３Ｃは、ＤＭＳＯ～ＤＵＸ４標的化ＡＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管またはＤＭＳＯで治療された野生型筋管におけるＭＢＤ３Ｌ２シグナルを比較するプレートベースアッセイ統計を示す。

【図4A-4D】ＤＭＳＯ対照での治療に対して、示されたｐ３８α／β阻害剤で治療されたＦＳＨＤ筋管におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡおよびＭＹＯＧ ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。ｐ３８α／β阻害剤は、ＳＢ ２３９０６３（図４Ａ）、ＶＸ－７０２（図４Ｂ）、パマピモド（図４Ｃ）、およびＴＡＫ－７１５（図４Ｄ）を含んだ。阻害剤の構造も提供される。

【図5A-5B】パマピモドで治療されたＦＳＨＤ筋管からのデータを示す。図５Ａは、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ（黒丸）およびＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ（白丸）における用量依存性低減を示すグラフである。図５Ｂは、ＤＭＳＯまたはパマピモドのいずれかで治療されたＦＳＨＤ筋管の顕微鏡写真を示す。

【図6A-6C】非標的化対照（ＮＴ ＣＴＲＬ）と比較して、ｐ３８ａ ＭＡＰＫ１４を標的化するｓｉＲＮＡ（ｓｉＭＡＰＫ１４ ８５およびｓｉＭＡＰＫ１４ ８６、図６Ａおよび図６Ｂ）で治療された、またはｐ３８ａキナーゼ（ＭＡＰＫ１４およびＤＵＸ４ ｐＬＡＭ）Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（図６Ｃ）で治療されたＦＳＨＤ筋管におけるＭＡＰＫ１４（図６Ａ）およびＭＢＤ３Ｌ２（図６Ｂおよび図６Ｃ）のｍＲＮＡレベルを示すグラフである。図６Ｃでは、各治療について、左から右へ示される結果は、それぞれ、ＭＢＤ３Ｌ２およびＭＹＯＧに対応する。

【図7】ＤＭＳＯ対照治療レベルのパーセンテージとして、増加する投与量のＦＴＸ－１８２１（構造が示される）での治療後のＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４タンパク質、ＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ、およびｐ－ＨＳＰ２７タンパク質の発現レベルを示すグラフである。バーは、標準偏差を表す。

【図8A-8B】筋管形成に対するＦＴＸ－１８２１の効果を示す。図８Ａは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、または示される濃度のＦＴＸ－１８２１での治療、ならびにＭＨＣおよびＤＡＰＩに対する抗体での染色（核染色）後に不死化ＦＳＨＤ筋管の形態の代表的な画像を提供する。図８Ｂは、試験された濃度のＦＴＸ－１８２１での治療後、ＭＨＣ染色によって定義される、筋管における核の定量化を示すグラフである。バーは、３つのレプリケートの標準偏差を表す。

【図9A-9B】インビトロでのＦＳＨＤ筋管におけるアポトーシスアッセイの結果を示す。図９Ａは、活性カスパーゼ－３（アポトーシスのマーカーとして）またはＤＡＰＩについて染色されたＦＳＨＤ筋管の顕微鏡写真を提供する。アポトーシスは、左パネルおよび右の拡大領域において白丸によって示されるように、培養中の筋管のサブセットにおいて散発的に検出された。図９Ｂは、示された濃度のＦＴＸ１８２１で治療されたＦＳＨＤ筋管における活性カスパーゼ－３シグナルの定量化を示すグラフである。

【図10A-10B】ＦＴＸ－１８２１によるＦＳＨＤ筋管における下方調節された遺伝子の特定を示す。図１０Ａは、ＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングによって特定される差次的に発現した遺伝子を例示する、ヒートマップである。各条件についての３つのレプリケートをＲＮＡ－ｓｅｑによって分析し、遺伝子を示されるように変化の方向および強度によってクラスター化した。カラーバーは、観察された正規化された変化を示し、例えば、ＦＴＸ－１８２１によって下方調節された遺伝子は、ＤＭＳＯのみで治療された試料において濃縮される。下方調節された遺伝子は、図１０Ａに列挙される。図１０Ｂは、ビヒクル対照ＤＭＳＯで治療された野生型細胞、ＤＭＳＯで治療されたＦＳＨＤ細胞、またはＦＴＸ－１８２１で治療されたＦＳＨＤ細胞における、ＦＴＸ－１８２１での治療後に下方調節されたＤＵＸ４標的遺伝子の正規化された発現レベルリードを示すグラフである。

【図11】ＤＭＳＯビヒクル対照、ＦＴＸ－１８２１、またはＦＴＸ－８３９での示された治療後の、４つの別個のＦＳＨＤ患者筋芽細胞株、ＦＴＣＥ－０１６、－０２０、－１９７、－１９６、および２つの野生型（ＷＴ）対照株に由来する筋管における、（ＰＯＬＲ２Ａに正規化された）ＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２の、ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。

【図12A-12B】様々なｐ３８阻害剤についての情報を提供する。図１２Ａは、ＦＳＨＤ細胞におけるＭＢＤ３Ｌ２発現を低減するためのＩＣ５０を含む、示されたｐ３８αおよびβ阻害剤の薬理を要約するデータの表である。同等のＭＢＤ３Ｌ２ ＩＣ₅₀値が示され、同様の酵素効力を有することが報告されるｐ３８αおよびβ阻害剤の広範な構造パネルにわたるＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４下流遺伝子発現の阻害を示す。これらのデータは、ｐ３８阻害剤が、約６～６８ｎＭの範囲内のＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２、低減ＩＣ₅₀値をもたらすことを示す。図１２Ｂは、図１２Ａに列挙されるｐ３８阻害剤の化合物構造を提供する。

【図13】遺伝子型の多様性を示し、初代および不死化株の両方、ならびにＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２患者株を含む、「皿での臨床試験」に利用される様々な細胞株の表である。

【図14A-14B】ＦＴＸ－１８２１、ＦＴＸ－８３９、またはＤＭＳＯビヒクル対照での治療後の９つのＦＳＨＤ１および３つのＦＳＨＤ２患者筋管（表２に列挙され、図１４Ｂは２つのみのＦＳＨＤ２細胞株を含有する）において決定される（ｑＲＴ－ＰＣＲによる）ＰＯＬＲ２Ａに正規化されたＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ発現（図１４Ａ）および開裂カスパーゼ－３によって測定されるアポトーシス（図１４Ｂ）を示すグラフである。

【図15】０．３ｍｇ／ｋｇ ＦＴＸ－１８２１の経口投与後のラットにおける血漿曝露、僧帽筋曝露、およびｐ３８標的関与（リン酸化ｐ３８α：総ｐ３８α比）の時間経過を示すグラフである。

【図16】Ａ４およびＣ６異種移植ＴＡ筋におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。

【図17】ビヒクル対照またはｐ３８阻害剤、ＦＴＸ－２８６５での治療後のマウス僧帽筋におけるリン光体／総ＭＣ２比を示すグラフである。

【図18】ビヒクル対照またはｐ３８阻害剤、ＦＴＸ－２８６５での治療後のＣ６異種移植ＴＡ筋におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、細胞における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減する方法であって、細胞を、細胞における活性ｐ３８タンパク質の低減をもたらす作用剤と接触させ、それによってＤＵＸ４ポリペプチドまたはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減することを含む方法を提供する。これらの方法は、様々な異なるタイプの作用剤を使用して、細胞における様々な異なる生物学的プロセスを調節するために、およびＦＳＨＤのような異常ＤＵＸ４発現と関連した疾患について対象を治療するために、実施され得る。

【0010】

本明細書で開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、細胞は、筋細胞、任意に終末分化筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対照細胞、例えば、健康な対象から得られる細胞における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現レベルと比較して、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現レベルを有する。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現レベルは、細胞におけるＤ４Ｚ４遺伝子座での低減した抑制によるものである。特定の実施形態では、細胞は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連し、例えば、ＦＳＨＤと診断された対象から得られたか、またはＦＳＨＤと診断された対象内に存在する。いくつかの実施形態では、細胞は、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に１個以上のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復の欠失を含み、任意に、細胞は、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に７個以下のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有１（ＳＭＣＨＤ１）遺伝子に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つの非欠失４ｑＡ対立遺伝子を含む。

【0011】

本明細書で開示される方法の特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の発現もしくは活性を阻害するか、またはその量を低減し、活性は、任意にキナーゼ活性である。

【0012】

いくつかの実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の発現を阻害する。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを結合するか、またはそのアンチセンスポリヌクレオチドを結合する。特定の実施形態では、作用剤は、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる。

【0013】

いくつかの実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の活性を阻害する。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質を結合する。特定の実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、これらからなる。いくつかの実施形態では、作用剤は、小分子、任意に小有機分子または小無機分子を含む。

【0014】

本明細書で開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、下流標的遺伝子は、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである。

【0015】

本明細書で開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、ｐ３８タンパク質の発現もしくは活性、またはｐ３８タンパク質の量は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減される。

【0016】

関連する実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４タンパク質、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現と関連した疾患または障害を治療または予防する方法であって、対象に、対象の１つ以上の組織における活性ｐ３８タンパク質の量の低減をもたらす作用剤を含む薬学的組成物を提供し、それによって対象の１つ以上の組織におけるＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４タンパク質、または下流標的遺伝子をコードするポリペプチドの発現を低減することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、任意にＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２と関連している。特定の実施形態では、対象は、Ｄ４Ｚ４遺伝子座で低減した抑制を含む。いくつかの実施形態では、対象は、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に１個以上のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復の欠失を含み、任意に、細胞は、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に７個以下のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復を含む。いくつかの実施形態では、対象は、染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有１（ＳＭＣＨＤ１）遺伝子に１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの非欠失４ｑＡ対立遺伝子を含む。特定の実施形態では、ｐ３８タンパク質の発現もしくは活性、または量は、対象の筋組織において少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減される。いくつかの実施形態では、方法は、対象における筋変性を減少させる。いくつかの実施形態では、方法は、対象における筋細胞のアポトーシスを低減する。いくつかの実施形態では、筋組織は、終末分化される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、対象に非経口または経口的に提供される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、対象の筋組織に、任意に非経口的または筋肉内に提供される。特定の実施形態では、方法は、対象に、ＤＵＸ４タンパク質、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現と関連した疾患または障害を治療するための第２の作用剤または療法を提供することをさらに含む。

【0017】

本開示はまた、細胞における活性ｐ３８タンパク質の量の低減をもたらす作用剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物の単位剤形を提供し、単位剤形は、単位剤形が投与される対象における１つ以上の細胞または組織における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を低減するために有効である。特定の実施形態では、作用剤は、ＤＵＸ４ポリペプチドに結合するか、またはＤＵＸ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、作用剤は、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、これらからなる。いくつかの実施形態では、作用剤は、小分子、任意に有機分子または無機分子を含む。特定の実施形態では、組織は、筋組織であり、任意に、組織は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連した突然変異を含む細胞を含む。

【0018】

さらなる関連実施形態では、本開示は、細胞、例えば、筋細胞のアポトーシスを低減する方法であって、細胞を、細胞における活性ｐ３８タンパク質の量の低減をもたらす作用剤と接触させ、任意に、筋細胞が、終末分化され、それによって、細胞における、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４タンパク質、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照細胞における、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現レベルと比較して、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現レベルを有する。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡ、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現レベルは、細胞におけるＤ４Ｚ４遺伝子座での低減した抑制によるものである。特定の実施形態では、細胞は、ＦＳＨＤと関連した１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の発現を阻害し、任意に、作用剤は、ｐ３８タンパク質をコードするポリヌクレオチドに結合するか、またはそのアンチセンスポリヌクレオチドに結合する。例えば、いくつかの実施形態では、作用剤は、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなり、これは、ｐ３８を標的とする。いくつかの実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の活性を阻害し、任意に、作用剤は、ｐ３８タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、これらからなる。いくつかの実施形態では、作用剤は、小分子、任意に小有機分子または小無機分子を含む。特定の実施形態では、ｐ３８タンパク質、ＤＵＸ４タンパク質、またはＤＵＸ４下流遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現または活性は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減される。特定の実施形態では、方法は、筋組織における筋細胞のアポトーシスを、対照、例えば、未治療細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低減する。

【0019】

本明細書で開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、作用剤は、ＤＵＸ４または下流標的遺伝子の発現を低減する。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質、例えば、ｐ３８－αもしくはｐ３８－βを結合するか、またはｐ３８タンパク質、例えば、ｐ３８－αもしくはｐ３８－βをコードするポリヌクレオチド、またはそのアンチセンスポリヌクレオチドを結合する。特定の実施形態では、作用剤は、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる。特定の実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、これらからなる。特定の実施形態では、作用剤は、小分子、任意に有機分子または無機分子を含む。いくつかの実施形態では、下流標的遺伝子は、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである。特定の実施形態では、下流標的遺伝子は、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、またはＫＨＤＣ１Ｌである。

【0020】

本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質、例えば、ｐ３８－αもしくはｐ３８－βを結合するか、またはｐ３８タンパク質、例えば、ｐ３８－αもしくはｐ３８－βをコードするポリヌクレオチドを結合する。いくつかの実施形態では、作用剤は、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ、変性ｍＲＮＡ、モルホリノ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡまたは変性ｍＲＮＡは、抗体またはその機能的断片をコードする。いくつかの実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、これらからなる。いくつかの実施形態では、作用剤は、遺伝子療法ベクター、例えば、ｐ３８、例えば、ｐ３８－αもしくはｐ３８－β、または他の標的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ウイルスベクターを含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、作用剤は、小分子、任意に有機分子または無機分子を含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、下流標的は、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである。いくつかの実施形態では、下流標的遺伝子は、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、またはＫＨＤＣ１Ｌである。いくつかの実施形態では、下流標的遺伝子は、ＣＣＮＡ１である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明は、部分的に、ｐ３８キナーゼ、例えば、ｐ３８－αの阻害が、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４によって調節される下流遺伝子の低減した発現をもたらすという発見に基づく。したがって、本発明は、例えば、異常ＤＵＸ４発現と関連した疾患、例えば、ＦＳＨＤ、筋ジストロフィーの一種の治療または予防において、ＤＵＸ４および／またはその下流標的遺伝子のいずれかの発現および／または活性レベルを低減するために、（単独で、または別の作用剤と組み合わせて）ｐ３８、例えば、ｐ３８－αの阻害剤を使用することに関する方法および組成物を含む。これは、様々な方法、例えば、ＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡの発現を低減すること、ＤＵＸ４タンパク質の発現を低減すること、ＤＵＸ４タンパク質活性を阻害すること、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集、および／またはＤＵＸ４タンパク質の分解を誘発することにおいて達成され得る。

【0022】

筋ジストロフィーは、体の筋肉の進行性衰弱を引き起こす遺伝子疾患の多様な群である。いくつかのタイプの筋ジストロフィーは、幼児期に症状を表すが、他のタイプは成人期に出現する。異なる筋肉群はまた、筋ジストロフィーのタイプに応じて影響され得る。例えば、Ｉｓｉｎ Ｄａｌｋｉｌｉｃ ａｎｄ Ｌｏｕｉｓ Ｍ Ｋｕｎｋｅｌを参照されたい。発症の年齢、重症度、および影響される筋肉群が異なる、様々な形態の筋ジストロフィーを引き起こす、３０個近い遺伝子が知られている。特定される遺伝子の数は毎年増加し、我々の理解を深め、これらの疾患の病因の全体的な複雑性を明らかにしている。

【0023】

例えば、２つの一般的な筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、いくつかの共通の特徴を有する独特な疾患であるとみなされる。ＤＭＤとＦＳＨＤとの間の類似性は、両方とも遺伝子疾患であり、症状が筋衰弱を伴う筋力低下を含み、障害を引き起こすことを含む（したがって、ＤＭＤおよびＦＳＨＤの両方は、筋変性を意味する筋ジストロフィーの大きなカテゴリーに群化される）。しかしながら、ＤＭＤおよびＦＳＨＤは、非常に異なる病因および疾患診断（ＤＭＤにおけるジストロフィン喪失対ＦＳＨＤにおけるＤＵＸ４－ミオトキシンの発現）を有する。例えば、ＤＭＤでは、ＤＭＤ遺伝子における突然変異（＞２０００が知られる）は、ジストロフィンの機能不全または喪失をもたらす。ＦＳＨＤでは、疾患は、筋組織におけるＤＵＸ４遺伝子の過剰発現によるものであり、遺伝子における点突然変異によるものではない（ＤＵＸ４タンパク質は、ＤＵＸ４遺伝子におけるＤ４Ｚ４反復の数が１～８である場合、または抑制が他のサイレンシング機構における突然変異によってＤ４Ｚ４で喪失する場合に発現する）。他の相違としては、ＦＳＨＤには骨格筋のみが関与するが、ＤＭＤでは骨格筋および心筋の両方が影響を受け、ＤＭＤには隔膜が関与するがＦＳＨＤには関与せず、一般的にＤＭＤでは小児期発症があるが、ＦＳＨＤでは成人期／青年期発症があり、ＤＭＤでは歩行に関する発症であるが、ＦＳＨＤでは顔面および近位腕／肩での発症である。別の重要な区別は、ＤＭＤではステロイドへの応答があるが、ＦＳＨＤではないことである。加えて、ＤＭＤのための承認された治療（米国におけるＥｘｏｎｄｙｓ－５１、ＥＵにおけるＡｔａｌｕｒｅｎ）は、ＦＳＨＤにおいて全く効果を有さないであろう。最後に、ＤＭＤでは男性のみが影響を受けるが、ＦＳＨＤでは両性の同等の関与がある。

【0024】

ＦＳＨＤはまた、異常な病理を有し、筋ジストロフィーの中でも、その発症が遺伝子条件およびエピジェネティック条件の両方を要するという点で独特である。遺伝子条件は、完全ＤＵＸ４遺伝子の存在である。ＤＵＸ４遺伝子は、通常は生殖系列および初期胚細胞において発現するレトロ遺伝子であるが、これは、成人組織においてＤ４Ｚ４反復誘発性サイレンシングによって抑制される（Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｎｄ Ｌａｃｅｙ，２０１２）。各Ｄ４Ｚ４要素は、プロモーターおよびＤＵＸ４ ＯＲＦを含有するが、ポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）を欠き、急速なＤＵＸ４ ｍＲＮＡ劣化を引き起こす。対照的に、４ｑＡ許容性対立遺伝子上の遠位Ｄ４Ｚ４単位において開始される転写物は、反復アレイの外に延在し、隣接するｐＬＡＭ配列におけるＰＡＳに到達する（Ｔａｗｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５に概説される）。得られるポリ－Ａテールは、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡを安定化し、健康な筋肉において通常発現されず、骨格筋機能に毒性であるタンパク質へのそれらの翻訳を可能する。骨格筋細胞におけるＤＵＸ４－ｆｌ発現を活性化する、２つのエンハンサー、ＤＵＸ４筋原性エンハンサー１（ＤＭＥ１）およびＤＭＥ２は、ＦＳＨＤにおいてＤＵＸ４－ｆｌ発現を調節することが記載されている（Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0025】

ＦＳＨＤ１、ＦＳＨＤ２初期発生段階、ならびに生殖系列形成段階は、Ｄ４Ｚ４クロマチンに転写許容性立体配座を与えると考えられる。これは、ヒストン修飾における変化、ＦＳＨＤ１におけるＤ４Ｚ４の部分的だが可変の低メチル化、およびＦＳＨＤ２におけるより広範囲の低メチル化によって証拠付けられる（Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかしながら、ＩＣＦ（免疫不全、動原体領域不安定性、および顔面異常）、Ｄ４Ｚ４が強く低メチル化される、珍しい無関係のＤＮＡ低メチル化関連疾患を有する患者には筋ジストロフィー症状が不在であるので、Ｄ４Ｚ４低メチル化は、疾患には十分ではない（ＯＭＩＭ Ｅｎｔｒｙ－＃６１４０６９）。

【0026】

ＤＵＸ４は、ホメオボックス転写因子タンパク質であり、筋肉におけるＤＵＸ４の発現は、転写プログラムを誘導し、骨格筋において通常は発現しない下流遺伝子およびタンパク質産物の発現をもたらす。例えば、ＤＵＸ４発現は、ＦＳＨＤ骨格筋およびトランスフェクト細胞におけるいくつかの生殖系列遺伝子の導入をもたらす（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ，２０１４、Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｎｄ Ｌａｃｅｙ，２０１２）。これらの新規転写物の多くは、ＦＳＨＤ筋細胞において発現するが、対照筋細胞では発現しない（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｓｈａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＤＵＸ４の下流標的遺伝子のいくつかは、転写因子をコードするので、ＤＵＸ４病理学的活性化は、筋肉における大きな遺伝子発現脱調節カスケードをもたらし、これは疾患を引き起こす（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｓｈａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0027】

筋細胞における内因性（ＦＳＨＤ筋線維における）および強制ＤＵＸ４発現は毒性であり、アポトーシスおよび酸化ストレスをもたらし、筋形成およびサルコメア機能に干渉する（Ｒｉｃｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｂｏｓｎｏｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｔａｗｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。疾患進行および発症年齢の両方における臨床異質性は、部分的に、ＤＵＸ４転写における進行性変化をもたらすエピジェネティック不安定性によって説明することができる。ＤＮＡ低メチル化および許容性ＤＵＸ４転写の役割は、組み合わされたＦＳＨＤ１および２欠損を受け継いだ患者において観察される高い臨床的重症度によって例示されている（Ｔａｗｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４、ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７に概説される）。臨床異質性はまた、より軽度に収縮した反復（４－７）を有する患者と比較してより短い反復（１－３）を有する患者におけるより重度の表現型およびより若い発症年齢と共に、Ｄ４Ｚ４反復短縮の重症度における相違によって説明される。

【0028】

ＤＵＸ４は、その標的遺伝子の活性化がＦＳＨＤ筋肉における主要分子シグネチャーであるので、ＦＳＨＤの病理の原因としてここで認識される（Ｔａｗｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５に概説される）。主要な下流標的遺伝子は、ＰＲＡＭＥＦ（黒色腫において優先的に発現する）、ＴＲＩＭ（三要素モチーフ含有）、ＭＢＤＬ（メチル－ＣｐＧ結合タンパク質様）、ＺＳＣＡＮ（ジンクフィンガーおよびＳＣＡＮドメイン含有）、およびＲＦＰＬ（ｒｅｔフィンガータンパク質様）ファミリーを含む、染色体上で空間的にクラスター化される高度に相同性の遺伝子ファミリーのメンバーである（Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｓｈａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｎｄ Ｌａｃｅｙ，２０１２、Ｔａｗｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４、ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＦＳＨＤと対照骨格筋とは、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、ＺＮＦ２８０Ａなどを用いて区別することができる（これらに限定されないが、Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｓｈａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｎｄ Ｌａｃｅｙ，２０１２に記載される）。

【0029】

注釈付きの化学プローブは、ＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４発現を低減する疾患調節小分子薬物標的を特定するためにスクリーニングされた。これらのスクリーニングは、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼアルファ（ＭＡＰＫ１４またはｐ３８α）の活性を阻害する複数の化学スキャフォールドを特定した。添付の実施例に記載されるように、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術またはｐ３８キナーゼのアルファアイソフォームを選択的に標的化する特定のガイドＲＮＡ‘（ｇＲＮＡ）でのＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集を用いるＭＡＰＫ１４遺伝子のノックダウンも、ＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４およびＤＵＸ４関連下流遺伝子発現を低減することが示されている。選択的ｐ３８αおよびβキナーゼ阻害剤は、ＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４およびその下流遺伝子を特異的に低減し、それによってＦＳＨＤ疾患プロセスの中心的な病態生理に影響を及ぼすことが見出された（データを本明細書で例示する）。同じ実験は、ｐ３８αおよびβキナーゼ阻害剤が、ミオゲニンまたは他の筋原性因子の発現に影響を及ぼさず、ＦＳＨＤ筋管における筋原性融合によって示される筋芽細胞の増殖または筋芽細胞の分化にも影響を及ぼさないことを明らかにし、それによって効果が筋肉に対する全体的な毒性によるものではないことを示した。これらのｐ３８キナーゼ阻害剤小分子は、ＤＵＸ４および関連下流遺伝子の発現を低減し、それによって、アポトーシス細胞死を低減することを含み、ＦＳＨＤ疾患プロセスの病態生理に影響を及ぼす。ｐ３８媒介性ＤＵＸ４低減は、ＦＳＨＤにおける下流炎症、脂肪浸潤、および線維化プロセスに影響を及ぼすことが予想されるであろう。

【0030】

α、β、γ、およびδからなる、ｐ３８ ＭＡＰＫファミリーのメンバー、アイソフォームは、ストレスおよび生存への適応に必要な細胞応答において重要な役割を果たす個別の遺伝子によってコードされる（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ ２０１０、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｋｒｅｍｅｎｔｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１３に概説される）。心血管および他の慢性疾患を含む、多くの炎症性疾患では、これらの同じｐ３８ ＭＡＰＫストレス誘発性シグナルは、疾患を、軽減するよりむしろ、悪化させる不適応な応答を誘発し得る（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ ２０１０、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４に概説される）。実際に、骨格筋では、長期運動、インスリン曝露および変性内分泌状態、筋細胞への筋芽細胞分化、活性酸素種、ならびにアポトーシスを含む、様々な細胞ストレスは、全てｐ３８キナーゼ経路を誘導することが示されている（Ｋｅｒｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，２００６、Ｚａｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。実際に、ｐ３８キナーゼ経路は、炎症誘発性サイトカインおよび細胞ストレスを含む、多数の外部刺激によって活性化することができ、二重特異性ＭＡＰＫキナーゼＭＫＫ３およびＭＫＫ６の活性化をもたらす。その活性化ループにおいてｐ３８を順にリン酸化する、ＭＫＫ３およびＭＫＫ６の活性化は、下流リン酸化事象を誘発する。これらは、ＨＳＰ２７、ＭＡＰＫＡＰＫ２（ＭＫ２）、および核における転写変化に達する様々な転写因子のリン酸化を含む。控えめな数のｐ３８調節転写物および大きな数のｐ３８キナーゼの下流エフェクターが特定されている（Ｃｕｅｎｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７およびＫｙｒｉａｋｉｓ ｅｔ．ａｌ．，２００１、Ｖｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００４に記載される）。

【0031】

ｐ３８α ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する異なる化学スキャフォールドからのいくつかの化合物は、リウマチ性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、疼痛、心血管疾患、および癌を含む、様々な（非神経筋）徴候における臨床試験に入った。臨床試験におけるｐ３８αおよびβの阻害は、安全であることが証明された。インビトロおよびインビボ薬理は、これらの臨床試験におけるｐ３８α標的関与が、ＨＳＰ２７（間接標的）およびｐＭＫ２（直接標的）のリン酸化の低減を測定することによって示されるように、ロバストであったことを示す。

【0032】

ｐ３８α ＭＡＰＫは、骨格筋生物学において、特に筋芽細胞の増殖を抑制し、分化およびその後融合して多核化筋管を形成することにおいて、重要な役割を果たすことが知られている。ｐ３８α阻害剤での変性および再生のプロセスを構成的に行っている筋ジストロフィー患者の治療は、明らかではない。ｐ３８αの完全ノックアウト（ＫＯ）は、胚致死性である。胚救出は、ｐ３８αが欠如した筋原性前駆体を試験するために、生後数日のｐｕｐの生存および衛星細胞の単離を可能にする。ｐ３８αが完全に欠如した筋芽細胞は、顕著に重要性の低い分化遺伝子を発現し、融合において重度の欠損を示す。Ｐ２ ｐｕｐの組織学は、顕著に増加したサイクリング衛星細胞および左にシフトした線維分布を示す。（Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ ｅｔ．ａｌ，２００７）。重要なことに、成熟筋肉（Ｍｙｌ１プロモーターによってｃｒｅ駆動される）におけるｐ３８αのＫＯは、初期の時点では不足を示さないが、６ヶ月齢でｐ３８αが不足したマウスは、対照と比較して顕著により大きな再生およびＩ型線維、ならびにより小さな線維分布を示す（Ｗｉｓｓｉｎｇ ｅｔ．ａｌ，２０１４）。これらのデータは、ｐ３８αの阻害が、ＤＵＸ４発現の調節から独立したメカニズムによって、ＦＳＨＤに加えて、再生が不足した疾患において骨格筋再生を誘発することを示す。

【0033】

骨格筋では、ｐ３８は、筋形成中に遺伝子発現を調節することが示されている。ｐ３８γは、特異的遺伝子ノックアウトおよび条件付きノックアウトアプローチの両方を用いる筋形成に必要であることが示されている（Ｃｕｅｎｄａ ｅｔ．ａｌ．，２００７、Ｋｅｒｉｎ ｅｔ．ａｌ．，２００６、Ａｏｕａｄｉ ｅｔ．ａｌ．，２００６）。成人では、ｐ３８αおよびβの選択的阻害剤は、筋形成に対するｐ３８γに関連した影響を回避する。

【0034】

本開示は、ｐ３８が筋形成中に活性化されること、ならびにＦＴＸ－８３９、ＦＴＸ－１８２１などを含む、本明細書で例示される分子によるｐ３８αおよびβの阻害が、ＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４発現およびその下流遺伝子プログラムを大いに低減することを見出す（データは本明細書に例示される）。理論によって縛られることを望むことなく、ｐ３８αは、より短い反復（ＦＳＨＤ１）またはＳＭＣＨＤ１突然変異（ＦＳＨＤ２）を有する突然変異Ｄ４Ｚ４遺伝子座のレベルでの病理的ＤＵＸ４発現、またはＦＳＨＤ患者の筋肉における他のメカニズムによって抑制が失われる場合に必要な重要な筋原性エンハンサーの活性に影響を及ぼすことによって、ＤＵＸ４発現を直接調節すると考えられる。これは、以前の臨床試験から差別化されたメカニズムであり、細胞質におけるｐ３８の機能を標的化し、リウマチ性関節炎、疼痛、うつ病、慢性閉塞性肺疾患、および心血管疾患を含む、多数の疾患において有効性を示すことができなかった。ｐ３８の阻害剤は、ＦＳＨＤについて臨床的に調査されたことがない。

【0035】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に内容で明記されない限り、複数の参照物を含む。

【0036】

本明細書で使用されるとき、「および／または」という用語は、別段に示されない限り、本開示では「および」または「または」のいずれかで使用される。

【0037】

本明細書全体を通して、特に文脈で必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載される要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含を示すが、任意の他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外を示さないことが理解されるであろう。

【0038】

本出願で使用されるとき、「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ」という語は、等価物として使用される。約の有無にかかわらず本出願で使用される任意の数字は、関連技術分野における当業者によって理解される正常変動を網羅することが意図される。特定の実施形態では、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別段に記載されないか、または文脈から明らかではない限り、記載される参照値のいずれかの方向での（より大きいまたは小さい）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に該当する値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

【0039】

「投与」とは、本明細書では、作用剤もしくは組成物を対象に導入すること、または作用剤もしくは組成物を細胞および／もしくは組織と接触させることを指す。

【0040】

特定の態様では、本開示は、細胞、組織、臓器、または対象における、ＤＵＸ４遺伝子、ｍＲＮＡ、もしくはポリペプチドの発現もしくは活性を低減するため、または、これらに限定されないが、本明細書に開示されるもののいずれかを含む、ＤＵＸ４下流遺伝子もしくはポリペプチドの発現もしくは活性を低減するための方法を含む。特定の実施形態では、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡは、ＤＵＸ４－ｆｌである。本明細書で使用されるとき、「ＤＵＸ４下流遺伝子」という用語は、ＤＵＸ４によって転写活性化される（すなわち、その発現が増加される）遺伝子を指し、「ＤＵＸ４下流ポリペプチド」という用語は、コードされたポリペプチドを指す。ＤＵＸ４下流遺伝子の例示的な例が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ＤＵＸ４下流遺伝子は、図１０Ａに示されるものから選択される。

【0041】

本明細書に開示される方法は、インビトロまたはインビボで実施され得、特定の実施形態では、方法は、細胞、組織、臓器、または対象を、ｐ３８阻害剤と接触させ、細胞、組織、臓器、または対象における低減した量の活性ｐ３８タンパク質をもたらすことを含む。「ｐ３８阻害剤」という用語は、細胞、組織、臓器、または対象における低減した量の活性ｐ３８タンパク質をもたらす任意の作用剤を指し得る。細胞における活性ｐ３８タンパク質の量は、これらに限定されないが、ｐ３８タンパク質の総量を低減すること、またはｐ３８タンパク質の１つ以上の活性を阻害することを含む、様々な手段を介して低減され得る。様々な実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ｐ３８遺伝子、ｐ３８ ｍＲＮＡ、またはｐ３８タンパク質の発現を阻害し得、および／またはｐ３８阻害剤は、ｐ３８タンパク質の生物学的活性を阻害し得る。特定の実施形態では、生物学的活性は、キナーゼ活性である。例えば、ｐ３８阻害剤は、ｐ３８ ＭＡＰＫのＡＴＰ結合部位に競合的に結合し、そのキナーゼ活性を阻害し得るか、またはｐ３８ ＭＡＰＫのキナーゼ活性をアロステリックにブロックし得る。特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ｐ３８タンパク質の増加した分解を引き起こす。特定の実施形態では、ｐ３８遺伝子またはｐ３８タンパク質は、哺乳動物ｐ３８遺伝子または哺乳動物ｐ３８タンパク質、例えば、ヒトｐ３８遺伝子またはヒトｐ３８タンパク質、例えば、ヒトｐ３８－α（ＭＡＰＫ１４）またはｐ３８－β（ＭＡＰＫ１１）遺伝子またはタンパク質である。

【0042】

ＲＫまたはＣＳＢＰ（サイトカイニン特異的結合タンパク質）とも呼ばれる、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、酵母Ｈｏｇ１ｐ ＭＡＰキナーゼの哺乳動物オーソログであり、これは、サイトカインおよびストレスへの細胞応答を制御するシグナル伝達カスケードに関与する。４つのｐ３８ ＭＡＰキナーゼ、ｐ３８－α（ＭＡＰＫ１４）、－β（ＭＡＰＫ１１）、－γ（ＭＡＰＫ１２／ＥＲＫ６）、および－δ（ＭＡＰＫ１３／ＳＡＰＫ４）が特定されている。これらは、様々なアイソフォームを含む。特定の実施形態では、これらのいずれかは、本明細書に開示される方法によって標的化され得る。特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ｐ３８－α（ＭＡＰＫ１４）またはｐ３８－β（ＭＡＰＫ１１）、例えば、これらの遺伝子またはタンパク質のヒトバージョンを阻害する。

【0043】

特定の実施形態では、標的化されたｐ３８タンパク質は、以下に記載されるか、またはｐ３８キナーゼ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４アイソフォーム１、ホモサピエンス）についてＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＰ＿００１３０６．１に開示されるアミノ酸配列を含む。
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ＳＲＤＬＬＩＤＥＷＫＳＬＴＹＤＥＶＩＳＦＶＰＰＰＬＤＱＥＥＭＥＳ（配列番号１）。

【0044】

特定の実施形態では、標的化されたｐ３８遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはコード配列は、以下に記載されるか、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＭ＿００１３１５．２に開示されるｐ３８－α核酸配列、またはその補体を含む。
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ＡＡＣＡＧＡ（配列番号２）。

【0045】

特定の実施形態では、標的化されたｐ３８タンパク質は、以下に記載されるか、またはｐ３８キナーゼ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１１アイソフォーム１、ホモサピエンス）についてＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＰ＿００２７４２．３に開示されるアミノ酸配列を含む。
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【0046】

特定の実施形態では、標的化されたｐ３８遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはコード配列は、以下に記載されるか、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＭ＿００２７５１．６に開示されるｐ３８－β核酸配列、またはその補体を含む。
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【0047】

特定の実施形態では、細胞、組織、臓器、または対象をｐ３８阻害剤と接触させることを含む本明細書に開示される方法は、ＤＵＸ４または１つ以上のＤＵＸ４下流遺伝子の発現または活性を阻害または減少させるために実施される。特定の実施形態では、ＤＵＸ４またはＤＵＸ４下流遺伝子は、ヒト遺伝子である。例えば、ＤＵＸ４ダブルホメオボックス４（ホモサピエンス）遺伝子は、以下に記載されるか、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＧ＿０３４１８９．２に開示されるヌクレオチド配列、またはその補体を含み得る。
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【0048】

例えば、ＤＵＸ４ダブルホメオボックス４［ホモサピエンス］ｍＲＮＡ遺伝子は、以下に記載されるか、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＭ＿００１２９３７９８．２に開示されるヌクレオチド配列、またはその補体を含み得る。
ＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＧＡＧＡＣＴＣＧＴＴＴＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＡＡＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＧＴＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＧＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＧＧＴＣＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＧＡＡＴＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＧＴＧＧＧＧＡＡＣＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＧＧＧＣＴＴＴＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＴＣＴＣＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＣＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣＧＴＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＡＣＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＧＡＡＡＣＧＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＡＧＧＡＣＧＣＧＧＧＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＣＧＣＡＧＴＧＣＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＡＧＡＧＴＴＡＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＴＴＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＧ（配列番号６）。

【0049】

特定の実施形態では、ＤＵＸ４ポリペプチド配列は、以下に記載されるか、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＰ＿００１２８０７２７．１に開示される。
ＭＡＬＰＴＰＳＤＳＴＬＰＡＥＡＲＧＲＧＲＲＲＲＬＶＷＴＰＳＱＳＥＡＬＲＡＣＦＥＲＮＰＹＰＧＩＡＴＲＥＲＬＡＱＡＩＧＩＰＥＰＲＶＱＩＷＦＱＮＥＲＳＲＱＬＲＱＨＲＲＥＳＲＰＷＰＧＲＲＧＰＰＥＧＲＲＫＲＴＡＶＴＧＳＱＴＡＬＬＬＲＡＦＥＫＤＲＦＰＧＩＡＡＲＥＥＬＡＲＥＴＧＬＰＥＳＲＩＱＩＷＦＱＮＲＲＡＲＨＰＧＱＧＧＲＡＰＡＱＡＧＧＬＣＳＡＡＰＧＧＧＨＰＡＰＳＷＶＡＦＡＨＴＧＡＷＧＴＧＬＰＡＰＨＶＰＣＡＰＧＡＬＰＱＧＡＦＶＳＱＡＡＲＡＡＰＡＬＱＰＳＱＡＡＰＡＥＧＩＳＱＰＡＰＡＲＧＤＦＡＹＡＡＰＡＰＰＤＧＡＬＳＨＰＱＡＰＲＷＰＰＨＰＧＫＳＲＥＤＲＤＰＱＲＤＧＬＰＧＰＣＡＶＡＱＰＧＰＡＱＡＧＰＱＧＱＧＶＬＡＰＰＴＳＱＧＳＰＷＷＧＷＧＲＧＰＱＶＡＧＡＡＷＥＰＱＡＧＡＡＰＰＰＱＰＡＰＰＤＡＳＡＳＡＲＱＧＱＭＱＧＩＰＡＰＳＱＡＬＱＥＰＡＰＷＳＡＬＰＣＧＬＬＬＤＥＬＬＡＳＰＥＦＬＱＱＡＱＰＬＬＥＴＥＡＰＧＥＬＥＡＳＥＥＡＡＳＬＥＡＰＬＳＥＥＥＹＲＡＬＬＥＥＬ（配列番号７）。

【0050】

ＤＵＸ４下流遺伝子または標的の配列は、当該技術分野において知られており、例示的なＤＵＸ４下流遺伝子は、以下に示されるアクセッション番号によって提供される。
ＭＢＤ３Ｌ２：
ゲノムヌクレオチドアクセッションＮＣ＿００００１９．１０（７０４９３４０．．７０５１７３５）
ｍＲＮＡヌクレオチドアクセッションＮＭ＿１４４６１４．３
タンパク質ポリペプチドアクセッションＮＰ＿６５３２１５．２
ＺＳＣＡＮ４：
ＮＣ＿００００１９．１０（５７６５１４９７．．５７６７９１５２）
ＮＭ＿１５２６７７．２
ＮＰ＿６８９８９０．１
ＬＥＵＴＸ：
ＮＣ＿００００１９．１０（３９７７６５９４．．３９７８６１３５）
ＮＭ＿００１１４３８３２．１
ＮＰ＿００１１３７３０４．１
ＰＲＡＭＥＦ２：
ＮＣ＿０００００１．１１（１２８５７０８６．．１２８６１９０９）
ＮＭ＿０２３０１４．１
ＮＰ＿０７５３９０．１
ＴＲＩＭ４３：
ＮＣ＿０００００２．１２（９５５９２０１８．．９５５９９７２３）
ＮＭ＿１３８８００．２
ＮＰ＿６２０１５５．１
ＫＨＤＣ１Ｌ：
ＮＣ＿０００００６．１２（７３２２３５４４．．７３２２５４５２、補体）
ＮＭ＿００１１２６０６３．２
ＮＰ＿００１１１９５３５．１

【0051】

生物学的試料、例えば、組織におけるｐ３８、ＤＵＸ４、またはＤＵＸ４下流遺伝子またはポリペプチドの発現レベルを決定する方法は、当該技術分野において知られており、例えば、ＲＴ－ＰＣＲおよびＦＡＣＳを含む。

【0052】

一実施形態では、細胞、組織、臓器、または対象における、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ（例えば、ＤＵＸ４－ｆｌ）、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減する方法は、細胞、組織、臓器、または対象を、低減した量の活性ｐ３８タンパク質をもたらす作用剤（本明細書ではｐ３８阻害剤とも呼ばれる）、例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βの阻害剤と接触させることを含む。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の発現または活性を阻害する。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質、例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βの増加した分解を引き起こす。特定の実施形態では、細胞または組織は、細胞または組織における、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を低減するために有効な量の作用剤と接触される。特定の実施形態では、細胞または組織は、細胞または組織における活性ｐ３８タンパク質の量を低減するために有効な量の作用剤と接触される。特定の実施形態では、細胞は、筋細胞である。特定の実施形態では、細胞は、終末分化され、例えば、終末分化された筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対照細胞における発現レベルと比較して、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現レベルを有する。特定の実施形態では、細胞は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、例えば、ＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２と関連している。例えば、細胞は、ＦＳＨＤと診断された対象からの細胞または組織から誘導または入手され得る。本明細書に開示される方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。

【0053】

一実施形態では、本開示は、細胞または組織を、ｐ３８タンパク質の発現または活性を阻害する作用剤（本明細書ではｐ３８阻害剤とも呼ばれる）、例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βの阻害剤と接触させることを含む、細胞または組織のアポトーシスを低減する方法を提供する。特定の実施形態では、細胞または組織は、細胞または組織における、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を低減するために有効な量の作用剤と接触される。特定の実施形態では、細胞または組織は、細胞または組織における活性ｐ３８タンパク質の量を低減するために有効な量の作用剤と接触される。特定の実施形態では、細胞は、筋細胞である。特定の実施形態では、細胞は、終末分化され、例えば、終末分化された筋細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対照細胞における（すなわち、治療前の）発現レベルと比較して、ＤＵＸ４ポリペプチド、または下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの増加した発現レベルを有する。特定の実施形態では、細胞は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、例えば、ＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２と関連している。例えば、細胞は、ＦＳＨＤと診断された対象からの細胞または組織から誘導または入手され得る。本明細書に開示される方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。

【0054】

関連態様では、本開示は、対象に、対象における、または対象の特定の細胞もしくは組織における、活性ｐ３８タンパク質（例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－β）の量を低減する有効量の作用剤を含む薬学的組成物を提供することを含む、それを必要とする対象におけるＤＵＸ４タンパク質またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子の増加した活性または発現と関連した疾患または障害を治療または予防する方法を含む。いくつかの実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質、例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βの発現または活性を阻害する。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の分解を誘導する。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８タンパク質の活性を阻害する、例えば、ｐ３８タンパク質のキナーゼ活性を阻害する。方法のいずれかの特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤は、対象の細胞または組織におけるＤＵＸ４および／または１つ以上のＤＵＸ４下流遺伝子の発現を低減する。

【0055】

本明細書に開示される治療方法の特定の実施形態では、疾患または障害は、ＦＳＨＤ１、ＦＳＨＤ２、免疫不全、動原体不安定性、および顔面異常症候群（ＩＣＦ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、ユーイング肉腫、軟部組織肉腫、横紋筋肉腫、ならびに成人および小児Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される。

【0056】

本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、対象は、ＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２と診断され、特定の実施形態では、対象は、ＦＳＨＤ１および／またはＦＳＨＤ２と関連した１つ以上の遺伝子突然変異を含む。特定の実施形態では、対象は、Ｄ４Ｚ４遺伝子座で低減した抑制を含む。

【0057】

本明細書で開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、対象は、転写活性ＤＵＸ４の存在に基づいてＦＳＨＤを有するとして特定される。別の実施形態では、対象は、健康な対照に対して１つ以上の下流遺伝子、例えば、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａの増加した発現レベルの存在に基づいてＦＳＨＤを有するとして特定される。別の実施形態では、対象は、転写活性ＤＵＸ４の存在および１つ以上のＤＵＸ４下流遺伝子、例えば、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａの増加した発現レベルに基づいてＦＳＨＤを有するとして特定される。

【0058】

別の実施形態では、方法は、ｐ３８キナーゼ阻害剤の投与の前の対象における、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４下流遺伝子、例えば、ＤＵＸ４、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａのうちの１つ以上の発現レベルを測定することを含み得る。方法は、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４下流遺伝子、例えば、ＤＵＸ４、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、およびＺＮＦ２８０Ａ ＫＨＤＣ１Ｌのうちの１つ以上の発現レベルが健康な対照に対して上昇している場合、対象が治療を必要とすることを決定することをさらに含み得る。

【0059】

別の実施形態では、方法は、ｐ３８キナーゼ阻害剤の投与の前および後の対象の細胞における、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４下流遺伝子、例えば、ＤＵＸ４、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａのうちの１つ以上の発現レベルを測定することを含み得る。方法は、ｐ３８キナーゼ阻害剤の投与の前および後の対象における、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４下流遺伝子、例えば、ＤＵＸ４、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａのうちの１つ以上の発現レベルを比較することを含み得る。方法は、ｐ３８キナーゼ阻害剤の投与の前および後のＤＵＸ４およびＤＵＸ４下流遺伝子、例えば、ＤＵＸ４、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、およびＺＮＦ２８０Ａのうちの１つ以上の発現レベルの比較によって治療の有効性を決定することを含み得、発現レベル（複数可）の減少は、有効治療を示す。

【0060】

いくつかの実施形態では、ｐ３８キナーゼ阻害剤は、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、およびＺＮＦ２８０Ａから選択される１つ以上の下流遺伝子を低減する。

【0061】

一実施形態では、ＤＵＸ４ならびに下流遺伝子ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、およびＺＮＦ２８０Ａの転写モジュレーターは、ｐ３８キナーゼによって阻害される。

【0062】

特定の実施形態では、対象は、１０個以下または７個以下の反復（ＦＳＨＤ１）を含むように、４ｑ３５Ａ Ｄ４Ｚ４アレイの短縮を含む。特定の実施形態では、対象、または対象の１つ以上の細胞もしくは組織は、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に１個以上のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復の欠失を含み、任意に、細胞は、染色体４ｑ３５のサブテロメア領域に７個以下のマクロサテライトＤ４Ｚ４反復を含む。特定の実施形態では、対象は、染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有１（ＳＭＣＨＤ１）遺伝子に１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態では、対象は、少なくとも１つの非欠失４ｑＡ対立遺伝子を含む。特定の実施形態では、対象は、少なくとも１つの非欠失４ｑＡ対立遺伝子およびＳＭＣＨＤ１突然変異（ＦＳＨＤ２）を含む。いくつかの実施形態では、対象は、車椅子に束縛される（例えば、ＣＳＳ４．５および５）。特定の実施形態では、治療中または治療後、対象、例えば、ＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２と診断された対象は、筋変性の低減または減少した量または速度を示す。特定の実施形態では、治療中または治療後、対象は、例えば、定量的ＭＲＩを介して決定される、脂肪による骨格筋置換の低減、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも７０％の低減を示す。特定の実施形態では、治療中または治療後、対象は、以下の臨床転帰評価のうちの１つ以上に対する利益の証拠を示す。
重量あり／なしの到達可能作業空間（ＲＷＳ）によって測定される肩／腕機能、
タイムアップアンドゴー（ＴＵＧ）または同様のアッセイによって測定される可動性、
日常生活動作（ＡＤＬ）および生活の質（ＱＯＬ）の患者レポート、ならびに
動力測定法によって測定される定量的骨格筋強度。

【0063】

いくつかの実施形態では、対象は、これらの改善のいずれかを少なくともいくらかの時間、例えば、治療の開始または停止のいずれかの後に少なくとも１週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、または１年にわたって示す。

【0064】

別の態様では、本開示は、ＦＳＨＤ１、ＦＳＨＤ２、ＩＣＦ、および同様の病理的変化が見られる疾患、例えば、ＡＬＳおよびＩＢＭ（Ｔａｗｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）の治療のために、ｐ３８阻害剤、例えば、ｐ３８－αまたはｐ３８－βの阻害剤を使用する開示される方法を提供する。

【0065】

本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態では、薬学的組成物は、対象に非経口的に提供される。

【0066】

本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態では、薬学的組成物は、対象の筋組織に提供される。

【0067】

いくつかの特定の実施形態では、対象にｐ３８阻害剤を提供することを含む本明細書に記載される方法のいずれかは、対象に追加の療法を提供することをさらに含み得る。

【0068】

特定の実施形態では、追加の療法は、臨床管理を含む。一実施形態では、本発明は、ＦＳＨＤ１、ＦＳＨＤ２、ＩＣＦ、ＡＬＳ、ＩＢＭ、ユーイング肉腫、軟部組織肉腫、横紋筋肉腫、ならびに成人および小児Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病の治療または予防方法を提供し、ｐ３８阻害剤は、ＤＵＸ４および／または下流遺伝子および／またはタンパク質発現および／または活性を減少させるために使用され、理学療法、有酸素運動、呼吸機能療法、および／または整形外科的介入を含む臨床管理と組み合わされ得る。

【0069】

特定の実施形態では、追加の療法は、例えば、Ｄ４Ｚ４メチル化を制御し、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡを抑制し、および／またはＤＵＸ４シグナル伝達経路を阻害することによってＦＳＨＤにおける病原性ＤＵＸ４タンパク質生成を低減するために、対象に、１つ以上のミオスタチン阻害剤、抗炎症剤、および遺伝子療法ベクターを提供することを含む。一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における、ＦＳＨＤ１、ＦＳＨＤ２、ＩＣＦ、ＡＬＳ、またはＩＢＭの治療方法を提供し、ｐ３８阻害剤、例えば、ｐ３８－αまたはｐ３８－βの阻害剤は、ＤＵＸ４および下流遺伝子および／またはタンパク質発現を低減するために使用され、例えば、Ｄ４Ｚ４メチル化を制御し、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡを抑制し、ＤＵＸ４経路を阻害することによって、ＦＳＨＤにおける病原性ＤＵＸ４タンパク質生成を低減するために、ミオスタチン阻害剤、抗炎症剤、および／または遺伝子療法と組み合わされ得る。特定の実施形態では、方法は、ｐ３８の阻害剤およびミオスタチン阻害剤を使用して実施される。その受容体複合体に関与し、下流シグナル伝達を活性化するミオスタチンをブロックするために、ミオスタチンに直接結合（Ｆｓｔｌ３、フォリスタチン、ミオスタチン抗体、ＧＡＳＰ１、ミオスタチンプロペプチド、デコリンペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ）、またはその受容体複合体に結合（ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）することのいずれかによって細胞外で作用する特定のミオスタチン経路阻害剤が、特定の実施形態において使用され得る。ミオスタチン阻害剤のいくつかは天然に存在し（ミオスタチンプロペプチド、Ｇａｓｐ１、フォリスタチン、Ｆｓｔｌ３）、その他は操作されている（ミオスタチン抗体、ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ）。

【0070】

特定の実施形態では、追加の療法は、対象に、ＤＵＸ４またはＤＵＸ４下流標的または遺伝子の阻害剤、例えば、ＤＵＸ－４ｆｌ ｍＲＮＡおよび／もしくはＤＵＸ４タンパク質の発現（またはＤＵＸ４下流標的のｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現）を阻害する阻害剤、またはＤＵＸ４活性、例えば、転写アクチベーターとしてのその活性、もしくはＤＵＸ４下流標的の活性を阻害する阻害剤を提供することを含む。特定の実施形態では、阻害剤は、ＤＵＸ４ポリペプチドまたはＤＵＸ４下流標的ポリペプチドの分解を誘導する。特定の実施形態では、阻害剤は、ＤＵＸ４またはＤＵＸ４下流標的遺伝子の核酸配列またはそのアンチセンスに特異的に結合するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、本発明は、ＦＳＨＤ１、ＦＳＨＤ２、ＩＣＦ、ＡＬＳ、またはＩＢＭの治療方法を提供し、ｐ３８阻害剤は、ＤＵＸ４および下流遺伝子およびタンパク質発現を低減するために使用され、ＤＵＸ４またはＤＵＸ４下流標的の阻害剤、例えば、ＤＵＸ４および／または１つ以上のＤＵＸ４下流標的転写物（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に対する小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わされ得る。

【0071】

特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される、および／または異常ＤＵＸ４発現もしくは活性に関連した、ＦＳＨＤまたは任意の他の疾患もしくは障害を治療するために、ＦＳＨＤ骨格筋筋管におけるＤＵＸ４および下流遺伝子発現を低減するために、ｐ３８キナーゼの小分子阻害剤、例えば、ｐ３８－αまたはｐ３８－βの阻害剤を使用する方法を提供する。

【0072】

いくつかの実施形態では、ｐ３８、例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βは、本明細書に開示される小分子または他の作用剤のいずれかによって阻害される。

【0073】

本明細書に記載されるｐ３８阻害剤および／または他の作用剤ならびに組成物（例えば、阻害剤）は、所望の投与経路（例えば、非経口または経口投与）に適した任意の方法で製剤化することができる。いくつかの実施形態では、作用剤または組成物を細胞および／または組織と接触させることは、対象への作用剤または組成物の投与または提供の結果である。いくつかの実施形態では、作用剤または組成物（例えば、ｐ３８阻害剤）は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０回以上投与される。併用療法のいくつかの実施形態では、第１の作用剤または組成物の投与は、第２の作用剤または組成物の投与が続いて行われるか、またはこれと重複して、もしくは同時に起こる。第１および第２の作用剤または組成物は同じであってもよく、またはそれらは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第１および第２の作用剤または組成物は、同じアクターによって、および／または同じ地理的位置において投与される。いくつかの実施形態では、第１および第２の作用剤または組成物は、異なるアクターによって、および／または異なる地理的位置において投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複数の作用剤が単一組成物として投与される。

【0074】

本明細書に開示される方法に従ってｐ３８阻害剤と共に広範な投与方法が使用され得る。例えば、ｐ３８阻害剤は、局所、経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、舌下、筋肉内、直腸、経頬、鼻腔内、リポソーム、吸入、膣内、眼内、局所送達（例えば、カテーテルまたはステントによる）、皮下、脂肪内、関節内、髄腔内、経粘膜、肺、または非経口的に、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、鞘内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、および胸骨内を含む、注射により、デポまたはリザーバのインプラントにより、例えば、皮下または筋肉内に、投与または同時投与され得る。

【0075】

「対象」は、動物（例えば、哺乳動物、豚、魚、鳥、昆虫など）を含む。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ｃｏｗ）などのような家畜、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどのような家禽、ならびにイヌおよびネコのような飼育動物である。いくつかの実施形態では、（例えば、特に研究の文脈において）対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または同系交配ブタなどのような豚である。「対象」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0076】

「組織」とは、共に特定の機能を行う同じ起源からの同様の細胞のアンサンブルである。特定の実施形態では、組織は、筋組織である。

【0077】

本明細書に開示される方法は、ｐ３８遺伝子またはタンパク質の発現または活性を阻害することができる任意の作用剤、例えば、これらに限定されないが、本明細書に開示されるもののいずれかを含む、ｐ３８－αまたはｐ３８－β遺伝子またはタンパク質で実施され得る。

【0078】

特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、例えば、ｐ３８阻害剤と接触していない対照細胞または組織における発現レベルもしくは活性、または参照レベルと比較して、（例えば、対象内の）細胞または組織におけるＤＵＸ４および／または１つ以上のＤＵＸ４下流遺伝子の発現レベルまたは活性の減少をもたらす。「減少」とは、例えば、参照レベルと比較した、少なくとも５％、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％の減少を指す。減少はまた、例えば、参照または対照細胞または組織のレベルと比較して、少なくとも１倍、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００倍以上の減少を意味する。

【0079】

本明細書に記載される方法は、例えば、細胞または組織における、例えば、細胞または組織、例えば、対象における細胞または組織における、低減した量またはレベルの活性ｐ３８タンパク質をもたらす、任意のタイプの阻害剤を用いて実施され得る。特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ｐ３８阻害剤と接触した細胞または組織における活性ｐ３８タンパク質（例えば、活性ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－β）の低減、総ｐ３８タンパク質（例えば、総ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βタンパク質）の低減、ｐ３８ ｍＲＮＡ（例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－β ｍＲＮＡ）の低減、および／またはｐ３８タンパク質活性（例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βキナーゼ活性）の低減を引き起こす。特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βシグナル伝達経路活性または発現の低減を引き起こす。特定の実施形態では、低減は、ｐ３８阻害剤と接触していない同じタイプの細胞または組織におけるレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である。細胞における、総ｐ３８タンパク質もしくはｍＲＮＡレベル、またはｐ３８キナーゼ活性を測定する方法は、当該技術分野において知られている。特定の実施形態では、阻害剤は、ｐ３８活性または発現、例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を阻害または低減する。特定の実施形態では、阻害剤は、ｐ３８タンパク質の増加した分解を引き起こし、細胞または組織におけるより低い量のｐ３８タンパク質をもたらす。特定の方法はまた、ＤＵＸ４またはＤＵＸ４下流遺伝子の発現の任意のタイプの阻害剤を利用し得る。特定の例では、阻害剤は、ｐ３８－αおよびｐ３８－βタンパク質の両方を阻害するが、他の例では、阻害剤は、ｐ３８－αまたはｐ３８－βのいずれかを選択的または優先的に阻害する。特定の実施形態では、阻害剤は、ｐ３８－γを阻害しない。

【0080】

開示される方法を実施するために使用され得る阻害剤は、これらに限定されないが、生体分子、（例えば、タンパク質または核酸）、例えば、これらに限定されないが、ｐ３８－αもしくはｐ３８－β遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現または活性を低減または減少する作用剤を含む。特定の実施形態では、阻害剤は、生体分子の増加した分解を引き起こすことができる。特定の実施形態では、阻害剤は、競合、未競合、または非競合手段によって生体分子を阻害することができる。例示的な阻害剤としては、これらに限定されないが、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、変性ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、タンパク質、タンパク質模倣体、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、小分子、小有機分子、無機分子、化学物質、酵素の結合部位を模倣する類似体、受容体、または他のタンパク質、例えば、シグナル伝達、治療剤、薬学的組成物、薬物、およびこれらの組み合わせに関与するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、阻害剤は、これに限定されないが、細胞における機能的タンパク質の量を低減するｓｉＲＮＡを含む、核酸であり得る。したがって、特定のタンパク質、例えば、ｐ３８を「阻害することができる」とされる化合物または作用剤は、任意のタイプの阻害剤を含む。特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤またはＤＵＸ４もしくはＤＵＸ４下流標的遺伝子の阻害剤は、本明細書に開示される阻害剤または任意の他の異なるクラスのいずれかである。

【0081】

特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤（または他の阻害剤）は、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ａ ｐ３８遺伝子（例えば、ＭＡＰＫ１４またはＭＡＰＫ１１遺伝子）またはｍＲＮＡ（または他の標的遺伝子もしくはｍＲＮＡ）に結合する核酸を含む。したがって、核酸阻害剤は、標的ポリヌクレオチド配列、例えば、本明細書に開示されるｐ３８－α配列と相補的な配列、またはそのアンチセンスを含み得る。特定の実施形態では、核酸阻害剤は、標的ポリヌクレオチド配列またはそのアンチセンスに対応するか、またはこれと相補的な、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも２４、または少なくとも３０ヌクレオチド配列を含む。

【0082】

特定の実施形態では、核酸阻害剤は、細胞に投与される場合、標的遺伝子の発現を減少させる、ＲＮＡ干渉もしくはアンチセンスＲＮＡ剤またはその部分もしくは模倣体、またはモルホリノである。典型的には、核酸阻害剤は、標的核酸分子の少なくとも一部分、もしくはそのオーソログを含むか、または標的核酸分子の相補的鎖の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、１０％、２５％、５０％、７５％、またはさらに９０～１００％低減される。

【0083】

「相補的」核酸配列とは、相補的ヌクレオチド塩基対からなる別の核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列である。「ハイブリダイズする」とは、好適なストリンジェンシーの条件下で、対合して相補的ヌクレオチド塩基間で二本鎖分子を形成する（例えば、ＤＮＡにおいてアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と、塩基対を形成する）ことを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。

【0084】

「アンチセンス」とは、長さにかかわらず、核酸配列と相補的である、核酸配列を指す。特定の実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、個別の細胞、組織、または対象に導入することができ、内因性遺伝子サイレンシング経路に依存しないメカニズムを通して標的遺伝子の低減した発現をもたらす一本鎖ＲＮＡ分子を指す。アンチセンス核酸は、変性バックボーン、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当該技術分野において知られる他のものを含有することができるか、または非天然インターヌクレオシド結合を含有し得る。アンチセンス核酸は、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。

【0085】

本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉」とは、内因性遺伝子サイレンシング経路（例えば、ダイサーおよびＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を通した標的ｍＲＮＡの分解による標的遺伝子の発現を減少させる作用剤の使用を指す。ＲＮＡ干渉は、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む、様々な作用剤を用いて達成され得る。「短ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるヘアピンターンを有する二本鎖人工ＲＮＡ分子を指す。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、典型的には、プラスミドの送達によって、またはウイルスもしくは細菌ベクターを通して達成される。ｓｈＲＮＡは、比較的低速度の分解およびターンオーバーを有する点で、ＲＮＡｉの有利なメディエーターである。小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡと同様に、通常は２０～２５塩基対の長さであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で機能する、二本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。これは、転写後にｍＲＮＡを分解し、翻訳を防止することによって、相補的ヌクレオチド配列を有する特異的な遺伝子の発現に干渉する。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドの長さであり、その３’末端で２塩基オーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞および／または培養系に導入し、標的ｍＲＮＡ配列の分解をもたらすことができる。本明細書で使用される「モルホリノ」とは、標準核酸塩基がモルホリノ環に結合し、ホスホロジアミデート結合を通して結合している、変性された核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは、相補的ｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、分解について相補的ｍＲＮＡ配列を標的化するのではなく、ｍＲＮＡ転写の立体阻害およびｍＲＮＡスプライシングの変更を通して機能する。

【0086】

特定の実施形態では、核酸阻害剤は、細胞に導入され得るメッセンジャーＲＮＡであり、これは、ｐ３８または本明細書に開示される他の標的のポリペプチド阻害剤をコードする。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、その安定性を増加させるか、またはその免疫原性を低減するために、例えば、１つ以上の変性ヌクレオシドの組み込みによって変性される。好適な変性が当該技術分野において知られている。

【0087】

特定の実施形態では、阻害剤は、ｐ３８または本明細書に開示される他の標的のポリヌクレオチドまたはポリペプチド阻害剤をコードする発現カセットを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、遺伝子療法ベクター、例えば、ウイルス遺伝子療法ベクターに存在する。ウイルス遺伝子療法ベクターを含む、様々な遺伝子療法ベクターが当該技術分野において知られており、例えば、ＡＡＶベースの遺伝子療法ベクターを含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、阻害剤は、ポリペプチド阻害剤である。特定の実施形態では、ポリペプチド阻害剤は、ｐ３８のような標的ポリペプチドに結合し、よって、その活性、例えば、キナーゼ活性を阻害する。ポリペプチド阻害剤の例は、抗体および断片のような、任意のタイプのポリペプチド（例えば、ペプチドおよびタンパク質）を含む。

【0089】

「抗体」とは、Ｉｇ分子の可変領域に配置される、少なくとも１つのエピトープ認識部位を通した、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはポリペプチドのような、標的への特異的結合が可能な免疫グロブリン（Ｉｇ）分子である。本明細書で使用されるとき、用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、それらの断片、例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、一本鎖（ｓｃＦｖ）、それらの合成バリアント、天然発生バリアント、必要な特異性の抗原結合断片を有する抗体部分を含む融合タンパク質、キメラ抗体、ナノボディ、および必要な特異性の抗原結合部位または断片を含む免疫グロブリン分子の任意の他の変性された構成も包含する。

【0090】

「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の部分を指す。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。抗体の「機能的断片」とは、抗体の１つ以上の活性を維持する断片であり、例えば、これは、同じエピトープに結合するか、または抗体の生物学的活性を有する。特定の実施形態では、機能的断片は、抗体に存在する６つのＣＤＲを含む。

【0091】

特定の実施形態では、阻害剤は、標的ポリペプチド、例えば、ｐ３８タンパク質の分解を誘導する。例えば、阻害剤は、標的タンパク質の選択的細胞内タンパク質分解を誘導する、タンパク質分解標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）を含む。ＰＲＯＴＡＣは機能的ドメインを含み、これは共有結合したタンパク質結合分子であってもよく、一方はＥ３ユビキチンリガーゼに関与することができ、他方は分解を意図した標的タンパク質に結合する。標的タンパク質へのＥ３リガーゼの動員は、プロテアソームによる標的タンパク質のユビキチン化およびその後の分解をもたらす。特定の実施形態では、阻害剤は、ｐ３８タンパク質（例えば、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－β）を標的とするＰＲＯＴＡＣである。

【0092】

特定の実施形態では、阻害剤は、小分子阻害剤、またはその立体異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、同位体濃縮、プロドラッグ、もしくは薬学的に許容される塩である。特定の実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ｐ３８－αおよび／またはｐ３８－βを阻害する。特定の実施形態では、これは、ｐ３８－γを有意に阻害しない。特定の実施形態では、ｐ３８の小分子阻害剤は、これらに限定されないが、図１２Ｂに示されるものを含む、本明細書に開示される小分子化合物のいずれかを含むが、これらに限定されない。様々なｐ３８阻害剤が知られ、入手可能であり、いくつかは臨床開発されている。これらのいずれかが使用され得る。これらとしては、ＡＲＲＹ－７９７、ＶＸ－７４５、ＶＸ－７０２、ＲＯ－４４０２２５７、ＳＣＩＯ－４６９、ＢＩＲＢ－７９６、ＳＤ－０００６、ＰＨ－７９７８０４、ＡＭＧ－５４８、ＬＹ２２２８８２０、ＳＢ－６８１３２３、およびＧＷ－８５６５５３が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な阻害剤化合物はまた、これらに限定されないが、以下を含む。
Ｎ－（４－（２－エチル－４－（ｍ－トリル）チアゾール－５－イル）ピリジン－２－イル）ベンズアミド、
２－（２，４－ジフルオロフェニル）－６－（１－（２，６－ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド、
６－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－８－メチル－２－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アミノ）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン、
６－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－２－（（１，５－ジヒドロキシペンタン－３－イル）アミノ）－８－メチルピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン、
（Ｒ）－６－（２－（４－フルオロフェニル）－６－（ヒドロキシメチル）－４，５，６，７－テトラヒドロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）－２－（ｏ－トリル）ピリダジン－３（２Ｈ）－オン、
６－（５－（シクロプロピルカルバモイル）－３－フルオロ－２－メチルフェニル）－Ｎ－ネオペンチルニコチンアミド、
５－（２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４－（４－フルオロフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－３－ネオペンチル－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－アミン、
２－（６－クロロ－５－（（２Ｒ，５Ｓ）－４－（４－フルオロベンジル）－２，５－ジメチルピペラジン－１－カルボニル）－１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－オキソアセトアミド、
１－（３－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１－（ｐ－トリル）－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－３－（４－（２－モルホリノエトキシ）ナフタレン－１－イル）ウレア、
４－（（５－（シクロプロピルカルバモイル）－２－メチルフェニル）アミノ）－５－メチル－Ｎ－プロピルピロロ［２，１－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－カルボキサミド、
３－（３－ブロモ－４－（（２，４－ジフルオロベンジル）オキシ）－６－メチル－２－オキソピリジン－１（２Ｈ）－イル）－Ｎ，４－ジメチルベンズアミド、
１－（３－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１－（ｐ－トリル）－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－３－（５－フルオロ－２－（（１－（２－ヒドロキシエチル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル）オキシ）ベンジル）ウレア、
８－（２，６－ジフルオロフェニル）－２－（（１，３－ジヒドロキシプロパン－２－イル）アミノ）－４－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン、
５－（２，６－ジクロロフェニル）－２－（（２，４－ジフルオロフェニル）チオ）－６Ｈ－ピリミド［１，６－ｂ］ピリダジン－６－オン、
（５－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－１－イソブチル－１Ｈ－インダゾール－６－イル）（（２－（ジメチルアミノ）エチル）－ｌ２－アザネイル）メタノン、および
（Ｒ）－２－（（２，４－ジフルオロフェニル）アミノ）－７－（２，３－ジヒドロキシプロポキシ）－１０，１１－ジヒドロ－５Ｈ－ジベンゾ［ａ，ｄ］［７］アンヌレン－５－オン。

【0093】

本発明の特定の阻害剤化合物は、立体異性形態で存在し得る（例えば、それらは、１つ以上の不斉炭素原子を含有し得るか、またはシス－トランス異性を示し得る）。いくつかの化合物は、２つ以上の不斉炭素原子を含み得る。「立体異性体」とは、１つ以上の不斉炭素原子（複数可）について配向（Ｒ／Ｓ）が異なるか、または二重結合について配向（シス：トランス）が異なる化合物を指す。立体異性体という用語は、例えば、置換ビフェニル部分を有する化合物における、単結合についての束縛回転から生じるアトロプ異性体も包含し得る。「エナンチオマー」とは、別の化合物の鏡像である化合物であり、すなわち、エナンチオマーの全ての不斉炭素原子は、他の化合物に対して逆の配向（Ｒ／Ｓ）で存在する。「ジアステレオマー」とは、別の化合物の鏡像ではないが、他の化合物に対して逆の配向（Ｒ／Ｓ）で存在する１つ以上の不斉炭素原子を含む化合物である。本発明の実施形態は、立体異性体の混合物を含み得るか、または単一の立体異性体を含み得る。単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、キラル試薬で開始するか、または立体選択的もしくは立体特異的合成技法によって調製され得る。あるいは、単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、標準キラルクロマトグラフィーまたは結晶化技法から単離され得る。「同位体濃縮」とは、１つ以上の原子が同位体でその天然存在量を超えて濃縮されている化合物を指す。例えば、重水素の天然存在量は、０．０１５％である。当業者は、Ｈ原子を有する全ての化学的化合物において、Ｈ原子が、実際にはＨおよびＤの混合物を表し、約０．０１５％がＤであることを認識する。同位体濃縮化合物は、Ｈ／Ｄ比が０．０１５％よりも大きい１つ以上の特定の化学部位を有し得る。同位体濃縮化合物は、同位体標識と呼ばれ得る。

【0094】

特定の実施形態では、阻害剤は、遺伝子編集系の１つ以上の要素を含む。本明細書で使用されるとき、「遺伝子編集系」という用語は、細胞に導入される場合、内因性ＤＮＡ配列の標的遺伝子座を変性することができるタンパク質、核酸、またはその組み合わせを指す。本発明の方法における使用に適した多数の遺伝子編集系は、当該技術分野において知られており、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に使用される遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた、短い回帰性反復）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系であり、これは、哺乳動物ゲノム操作に使用することができる細菌系に基づいて操作されたヌクレアーゼ系である。一般的には、系は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ｇＲＮＡは、２つの部分、標的ゲノムＤＮＡ配列に特異的であるｃｒｉｓｐｒ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および標的化された挿入部位でのＤＮＡへのエンドヌクレアーゼ結合を促進するトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる、同じＲＮＡオリゴヌクレオチド中に存在し得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、別個のＲＮＡオリゴヌクレオチドとして存在し得る。そのような実施形態では、ｇＲＮＡは、会合してｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を形成するｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびｔｒａｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる。本明細書で使用されるとき、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖のいずれかとして存在する、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの組み合わせを指す。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質、ｃｒＲＮＡ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ分子として組み合わされ、ｇＲＮＡを形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、細胞への導入の前にインビトロで形成される。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、細胞に別個のＲＮＡ分子として導入され、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖が次いで細胞内に形成される。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが提供される。そのような実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが細胞に導入され、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子が次いで細胞内で転写される。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、別個のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0097】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的挿入部位近くのプロトスペーサーモチーフ（ＰＡＭ）配列を含み得る、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分の配列特異性によって標的挿入部位に向けられる。特定のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）での使用に適した様々なＰＡＭ配列が当該技術分野において知られている（例えば、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６－１１２１およびＳｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照されたい）。

【0098】

標的遺伝子座についてのｇＲＮＡの特異性は、ｃｒＲＮＡ配列によって媒介され、これは、標的遺伝子座でＤＮＡ配列と相補的、例えば、ｐ３８－αまたはｐ－３８－β ＤＮＡ配列と相補的である約２０ヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるｃｒＲＮＡ配列は、標的遺伝子座のＤＮＡ配列と少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるｃｒＲＮＡ配列は、標的遺伝子座のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるｃｒＲＮＡ配列は、標的遺伝子座、例えば、ＭＡＰＫ１４またはＭＡＰＫ１１遺伝子のＤＮＡ配列と少なくとも１００％相補的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｒＲＮＡ配列は、特定の標的遺伝子座または標的遺伝子に特有である標的配列を特定するために、当該技術分野において知られるアルゴリズム（例えば、Ｃａｓ－ＯＦＦファインダー）を用いて、オフターゲット結合を最小化するように設計される。

【0099】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質またはオーソログである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＳａＣａｓ９）、またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮｍｅＣａｓ９）から誘導される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オーソログであり、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、およびＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも呼ばれる）、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体である。Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体は、１つのみの触媒活性ドメイン（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）を含む。

【0100】

特定の態様では、本開示は、組成物、例えば、本明細書に記載される様々なクラスの阻害剤を含む、ｐ３８の阻害剤を含む薬学的組成物を含む。本発明は、ｐ３８阻害剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物を包含する。糖、多価アルコール、可溶性ポリマー、塩、および脂質のような、担体または希釈剤として一般的に使用される任意の不活性賦形剤は、本発明の組成物において使用され得る。使用され得る糖および多価アルコールとしては、限定なく、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールが挙げられる。使用され得る可溶性ポリマーの例は、ポリオキシエチレン、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、およびデキストランである。有用な塩としては、限定なく、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムが挙げられる。使用され得る脂質としては、限定なく、脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステル、糖脂質、およびリン脂質が挙げられる。

【0101】

加えて、薬学的組成物は、結合剤（例えば、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム、プリモゲル）、様々なｐＨおよびイオン強度のバッファー（例えば、トリス－ＨＣＬ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール、シクロデキストリン）、滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール）、安定化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、粘度増加剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味剤（例えば、スクロース、アスパルテーム、クエン酸）、香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、フロー助剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）、コーティングおよびフィルム形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）、ならびに／またはアジュバントをさらに含み得る。

【0102】

一実施形態では、薬学的組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放製剤のような、ｐ３８阻害剤を体からの急速排出に対して保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生物分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体での感染細胞に標的化されたリポソームを含む）を薬学的に許容される塩として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される、当該技術分野で知られる方法に従って調製することができる。

【0103】

加えて、本発明は、ｐ３８阻害剤の任意の固体または液体物理的形態を含む薬学的組成物を包含する。例えば、ｐ３８阻害剤は、結晶形態であり、非晶質形態であり、任意の粒径を有することができる。粒子は、微粒子化され得るか、または凝集された、粒状顆粒、粉末、油、油状懸濁液、もしくは固体もしくは液体物理的形態の任意の他の形態であり得る。

【0104】

Ｐ３８阻害剤が不十分な可溶性を示す場合、化合物を可溶化するための方法が使用され得る。そのような方法は、当業者に知られており、これらに限定されないが、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３００、ＰＥＧ ４００、ＤＭＡ（１０－３０％）、ＤＭＳＯ（１０－２０％）、ＮＭＰ（１０－２０％）のような、共溶媒を用いる、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０（１－１０％）、クレモファーＥＬ、クレモファーＲＨ４０、クレモファーＲＨ６０（５－１０％）、プルロニックＦ６８／ポロキサマー１８８（２０－５０％）、ソルトールＨＳ１５（２０－５０％）、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、およびｄ－ａ－トコフェリルＰＥＧ １０００コハク酸塩（２０－５０％）のような、界面活性剤を用いる、ＨＰ β－ＣＤおよびＳＢＥ β－ＣＤ（１０－４０％）のような錯体形成を用いる、ならびにミセル、ポリマーの添加、ナノ粒子懸濁液、およびリポソーム形成のような先進的アプローチを用いる、ｐＨ調整および塩形成を含む。

【0105】

ｐ３８阻害剤はまた、徐放剤形で投与または同時投与され得る。ｐ３８阻害剤は、ガス状、液体、半液体、または固体形態であり、使用される投与経路に適した方法で製剤化され得る。経口投与のために、好適な固体経口製剤は、錠剤、カプセル、丸剤、顆粒、ペレット、サシェおよび発泡剤、ならびに粉末などを含む。好適な液体経口製剤は、溶液、懸濁液、分散液、シロップ、乳濁液、油などを含む。非経口投与のために、凍結乾燥粉末の再構成が典型的には使用される。

【0106】

本明細書に記載される疾患または障害の治療における使用のためのｐ３８阻害剤の好適な用量は、関連技術分野における当業者によって決定され得る。治療的用量は、一般的には、動物試験から誘導される予備的証拠に基づくヒトにおける用量範囲試験を通して特定される。用量は、望ましくない副作用を引き起こすことなく治療的利益をもたらすのに十分であるべきである。投与方法、剤形、および好適な薬学的賦形剤もよく使用され、当業者によって調整され得る。全ての変更および修正は、本特許出願の範囲内で想定される。

【0107】

特定の実施形態では、本開示は、ｐ３８ポリペプチドの発現または活性を阻害する（または低減したレベルの活性ｐ３８タンパク質をもたらす）作用剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物の単位剤形を含み、単位剤形は、単位剤形が投与される対象における１つ以上の組織における、ＤＵＸ４ポリペプチド、またはＤＵＸ４の下流標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減するために有効である。特定の実施形態では、下流標的遺伝子は、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、またはＫＨＤＣ１Ｌである。特定の実施形態では、下流標的遺伝子は、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、ＰＲＡＭＥＦ１５、またはＺＮＦ２８０Ａである。特定の実施形態では、組織は、筋組織である。特定の実施形態では、組織は、終末分化され、例えば、終末分化された筋組織である。特定の実施形態では、組織は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連した突然変異を含む細胞を含む。特定の実施形態では、作用剤は、ｐ３８ポリペプチド（例えば、ｐ３８－αまたはｐ３８－β）に結合するか、またはｐ３８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに結合する。特定の実施形態では、作用剤は、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、変性ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれからなる。他の実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、または抗体もしくはその機能的断片を含むか、これらからなる。他の実施形態では、作用剤は、小分子、任意に有機分子または無機分子を含む。他の実施形態では、作用剤は、遺伝子発現カセット、任意に遺伝子療法ベクター、ｐ３８ポリペプチドの発現または活性を阻害するポリヌクレオチドまたはポリペプチド剤を含む。

【0108】

特定の実施形態では、単位剤形は、本明細書に開示される疾患または障害のいずれか、例えば、ＦＳＨＤを含む、ＤＵＸ４および／または下流ＤＵＸ４標的遺伝子の増加した活性または発現と関連した疾患または障害を治療するために、有効量、有効濃度、および／または阻害濃度の、ｐ３８阻害剤を含む。

【0109】

「薬学的組成物」とは、特定の疾患または障害の予防および／または治療のために対象および／または細胞に投与または送達することができる１つ以上の作用剤の組成物を含む。

【0110】

「薬学的に許容される」は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット／リスク比と相応して、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは混乱なく、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために利用される。

【0111】

「薬学的に許容される担体」は、限定なく、ヒトおよび／または飼育動物における使用に許容されるとして米国食品医薬品局によって承認されている、任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色料、調味料、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、および／または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、ラクトース、グルコース、およびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースのようなセルロース、およびその誘導体；トラガカンス；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油のような油；プロピレングリコールのような、グリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールのような、ポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのような、エステル；アガー；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような、緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬学的製剤に使用される任意の他の適合性物質が挙げられる。任意の従来の培地および／または作用剤が本開示の作用剤と非適合性である限りを除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補足活性材料はまた、組成物に組み込むことができる。

【0112】

本明細書で使用される「有効量」とは、特定の効果の達成、例えば、細胞、組織、臓器、または対象におけるＤＵＸ４－ｆｌ ｍＲＮＡもしくはＤＵＸ４タンパク質、または１つ以上のＤＵＸ４下流標的のｍＲＮＡもしくはタンパク質の低減において有効な作用剤の量を指す。対象の治療的処置の文脈では、有効量は、例えば、対象、例えば、ＦＳＨＤを有する対象における１つ以上の疾患症状を低減するために有効または十分な量であり得る。特定の実施形態では、低減は、治療の前の、または治療なしの量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％である。

【0113】

本明細書で使用される「有効濃度」は、特定の生理学的効果をもたらすために必要な作用剤および／または組成物の最小濃度（質量／体積）を指す。本明細書で使用されるとき、有効濃度は、典型的には、特定の生理学的効果を増加、活性化、および／または向上するために必要な作用剤の濃度を指す。

【0114】

「阻害濃度」は、特定の生理学的効果を阻害するために必要な作用剤の最小濃度（質量／体積）である。本明細書で使用されるとき、阻害濃度は、典型的には、特定の生理学的効果を減少、阻害、および／または抑制するために必要な作用剤の濃度を指す。

【0115】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される作用剤または化合物は、約１ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され得る。別の実施形態では、本明細書に記載される作用剤または化合物は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され得る。例えば、作用剤または化合物は、対象に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ｍｇ／ｋｇ、または一連の値のいずれかの間、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ～約１２ｍｇ／ｋｇなどの範囲内の投与量で投与され得る。別の実施形態では、本明細書に記載される作用剤または化合物は、≦１５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。例えば、作用剤または化合物は、合計１週間あたり１０５ｍｇ／ｋｇのために７日間にわたって１日あたり１５ｍｇ／ｋｇで投与され得る。例えば、化合物は、合計１週間あたり１４０ｍｇ／ｋｇのために７日間にわたって１日あたり２回１０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。

【0116】

多くの実施形態では、本明細書に記載される投与量は、１回の投与量、１日の投与量、または１週間の投与量を指し得る。一実施形態では、作用剤または化合物は、１日あたり１回投与され得る。別の実施形態では、化合物は、１日あたり２回投与され得る。いくつかの実施形態では、作用剤または化合物は、１日あたり３回投与され得る。いくつかの実施形態では、化合物は、１日あたり４回投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される作用剤または化合物は、１週間あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４回投与され得る。他の実施形態では、化合物は、２週間に１回投与される。

【0117】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される作用剤または化合物は、経口投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される作用剤または化合物は、１日あたり１回≦１５ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与され得る。

【0118】

使用される実際の投与量は、患者の要件および治療される状態の重症度に応じて異なり得る。特定の状況のための適切な投与量レジメンの決定は、当該技術分野の技術の範囲内である。便宜上、合計１日投与量は、必要に応じて分割され、１日中に少しずつ投与され得る。

【0119】

開示化合物を利用する投与量レジメンは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、および医学的状態；治療される状態の重症度；投与経路；患者の腎または肝機能；ならびに使用される特定の開示化合物を含む、様々な因子に従って選択される。当該技術分野の通常の技術を有する医師または獣医師であれば、状態の進行を予防、対抗、または停止するために必要な有効量の薬物を容易に決定および処方することができる。

【0120】

本発明の化合物および／またはその薬学的に許容される塩の投与の量および頻度は、患者の年齢、状態、およびサイズ、ならびに治療される症状の重症度のような因子を考慮する担当臨床医の判断に従って調節されるであろう。

【0121】

いくつかの態様では、本発明は、ＦＳＨＤ筋管における、ＤＵＸ４および下流転写物、ＭＢＤ３Ｌ２の発現および／または活性を低減する小分子および／またはゲノムツール（例えば、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および遺伝子治療ウイルス）を用いて薬物標的をスクリーニングして特定するために使用される方法に関する。特定の実施形態では、方法は、ＦＳＨＤ細胞、例えば、ＦＳＨＤ１および／またはＦＳＨＤ２欠損（例えば、突然変異）を含む細胞を含む筋管を、１つ以上の候補作用剤と接触させることと、次いで、候補作用剤と接触した筋管が、陰性対照、例えば、ビヒクルのみと接触した筋管におけるレベルと比較して、低減したＤＵＸ４活性、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡまたはタンパク質の低減したレベル、ＤＵＸ４によって調節された１つ以上の下流遺伝子の低減した活性、またはＤＵＸ４によって調節された１つ以上の下流遺伝子の低減したレベルを有するかを決定することと、を含む。ＤＵＸ４および／またはＤＵＸ４下流遺伝子の低減した活性または発現と関連した候補作用剤が次いで特定され、それが調節する標的が特定され得る。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、ＤＵＸ４および／またはＤＵＸ４下流標的遺伝子の低減した発現と関連したｓｉＲＮＡの遺伝子標的は、本明細書に記載されるもののいずれか、例えば、ＦＳＨＤを含む、ＤＵＸ４および／または下流ＤＵＸ４標的遺伝子の異常発現と関連した疾患または障害を治療するための薬物標的として特定される。同様に、小分子の場合、ＤＵＸ４および／またはＤＵＸ４下流標的遺伝子の低減した活性または発現と関連した小分子の薬物標的は、本明細書に記載されるもののいずれか、例えば、ＦＳＨＤを含む、ＤＵＸ４および／または下流ＤＵＸ４標的遺伝子の異常発現と関連した疾患または障害を治療するための薬物標的として特定される。特定の実施形態では、方法は、筋管の物理的または定性的特性を改善するために使用され得る、候補作用剤およびその標的を特定するために、筋管の物理的または定性的特性を評価し、よって、標的を、本明細書に記載されるもののいずれか、例えば、ＦＳＨＤを含む、ＤＵＸ４および／または下流ＤＵＸ４標的遺伝子の異常発現と関連した疾患または障害を治療するための治療標的として特定することによって実施され得る。

【0122】

特定の実施形態では、本開示は、ＤＵＸ４タンパク質の発現を阻害するか、またはＤＵＸ４の下流遺伝子標的によってコードされるタンパク質の発現を阻害する作用剤を特定する方法を含み、方法は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連した細胞から調製される筋管を、候補作用剤と接触させることと、筋管におけるＤＵＸ４タンパク質、ＤＵＸ４タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＤＵＸ４の下流遺伝子標的、またはＤＵＸ４の下流遺伝子標的をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを決定することと、を含み、候補作用剤は、接触後に決定される発現レベルが、候補作用剤と接触していないか、または陰性対照作用剤と接触したＦＳＨＤと関連した細胞から調製される筋管における、ＤＵＸ４タンパク質または下流遺伝子標的によってコードされるタンパク質の発現レベルと比較して低減する場合、ＤＵＸ４タンパク質、または下流遺伝子標的によってコードされるタンパク質の発現を阻害する作用剤として特定される。

【0123】

本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態では、候補作用剤は、小分子、ポリペプチド、および核酸を含む、本明細書に開示される阻害剤のクラスのいずれかであり得、例えば、候補作用剤は、核酸、任意にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド；ポリペプチド、任意にタンパク質、ペプチド、タンパク質模倣体、ペプチド模倣体、遺伝子療法ベクター、または抗体もしくはその機能的断片；あるいは小分子、任意に有機分子または無期分子を含むか、またはこれからなる。

【0124】

方法のいずれかの特定の実施形態では、下流標的遺伝子は、例えば、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、またはＫＨＤＣ１Ｌである。特定の実施形態では、下流標的遺伝子は、例えば、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＰＲＡＭＥＦ２、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＲＦＰＬ２、ＣＣＮＡ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＴＰＲＸ１、ＰＲＡＭＥＦ２０、ＴＲＩＭ４９、ＰＲＡＭＥＦ４、ＰＲＡＭＥ６、またはＰＲＡＭＥＦ１５である。

【0125】

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかは、潜在的な候補作用剤のライブラリーをスクリーニングすることによって行われる。特定の実施形態では、方法は、高スループットアッセイを用いて行われる。

【0126】

特定の実施形態では、方法は、成熟患者由来ＦＳＨＤ筋管を用いて行われる。

【0127】

一実施形態では、小分子のライブラリーは、ＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４または標的遺伝子発現または活性の標的調整剤をスクリーニングするために使用される。処置の前の３日、細胞は、骨格筋成長培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ－２３０６０）、２０％ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０１４８）を有するゼラチン化９６ウェルプレートにおいてウェルあたり１５，０００個の細胞で播種する。処置の日、培地は、２０％ノックアウト血清置換（Ｇｉｂｃｏ、１０８２８０１０）またはＮｂＡｃｔｉｖ４培地（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ Ｎｂ４－５００）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐが補足された骨格筋細胞分化培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ－２３０６１）に変更される。ｐ３８調節剤は、所望の濃度で、分化ＦＳＨＤ筋管を含有する培養培地に添加され、３～４日間インキュベーターにおいて培養される。筋管は、インキュベーターから取り出され、ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｔ Ｎｏ．／ＩＤ：７４０３４）を用いて抽出される。ｃＤＮＡは、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイについて抽出されたＲＮＡから調製されて、ＤＵＸ４または下流標的遺伝子発現が測定される。ＰＯＬ２ＲＡ転写物は、内因性対照として使用される。

【実施例0128】

以下の実施例に記載される試験を、以下に記載される材料および方法を用いて行った。
略語
ＡＳＯ アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＤＡＰＩ ４’，６－ジアミド－２－フェニルインドール（二塩酸塩）
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＵＸ４ ダブルホメオボックス４
ＤＵＸ４－ｆｌ ダブルホメオボックス４全長
ＦＳＨＤ 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー
Ｇｒｎａ ガイドＲＮＡ
ＭＢＤ３Ｌ２ メチルＣｐＧ結合ドメインタンパク質３様２
ＭＨＣ ミオシン重鎖
ＭＰＡＫ１４ マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４
ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ
ＭＹＯＧ ミオゲニン（筋原性因子４）
ｐ ＨＳＰ２７ リン酸化ヒートショックタンパク質２７
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ｐＬＡＭ ポリアデニル化シグナル配列
ＰＯＬＲ２Ａ ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットＡ
ｑＰＣＲ 定量ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ リボ核酸
ｓｇＲＮＡ シングルガイドＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ 小干渉ＲＮＡ

【0129】

一般的な材料および方法
ヒト骨格筋筋芽細胞：
ＦＴＣＥ－０００１６－０１（不死化ＦＳＤＨ筋芽細胞株、６．３反復）および同系株Ａ４対照健康正常、およびＣ１２ ＦＳＨＤ筋芽細胞を、全ての試験に使用した（Ｍａｍｃｈａｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｔｈｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６に記載の通り）。４つの別個の初代患者筋芽細胞株、ＦＴＣＥ－０１６、－０２０、－１９７、－１９６がＲ．Ｔａｗｉｌより提供された。ＦＳＨＤ筋芽細胞は、染色体４ｑ３５上のＤ４Ｚ４の脱メチル化を介して異常ＤＵＸ４を発現することが示された。
培地成分および組織培養材料は以下を含む。

【0130】

１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７１）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０１４８）が補足されたＳｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ－２３１６０）。ＮｂＡｃｔｉｖ４（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ Ｎｂ４－５００）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（分化培地）。ＥｍｂｒｙｏＭａｘ ０．１％ Ｇｅｌａｔｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＭＤｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＳ－００６－Ｂ）。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００１００２３）、組織培養処理９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ３５９５）、ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔ（Ｆａｌｃｏｎ、３５３０４６）。

【0131】

リアルタイムＰＣＲ試薬およびキット：
溶解バッファー－Ｒｏｃｈｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ Ｒｅａｄｙ溶解バッファー１９．５μＬ（２０μＬについて）（Ｒｏｃｈｅ、０７２４８４３１００１）、ＤＮＡｓｅ Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ２２２２）０．２５μＬ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ、３３３５４０２００１）０．２５μＬ、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４００４）、Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｅａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４３９１１２８）、Ｔａｑｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４４８４２６２）、ＺＳＣＡＮ４ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ００５３７５４９＿ｍ１、ＦＡＭ－ＭＧＢ）、ＭＹＯＧ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ０１０７２２３２＿ｍ１、ＪＵＮ－ＱＳＹ）、ＲＰＬＰ０ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）、およびＬＥＵＴＸ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ００４１８４７０＿ｍ１）。

【0132】

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：
ＡＳＯは、Ｅｘｉｑｏｎから購入した。ＦＴＳＥ－０００００１（ＥｘｉｑｏｎからのＤＵＸ４ ＡＳＯ、ＣＡＧＣＧＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧ（配列番号１８）、３００６１０））、および非標的化ＡＳＯ（Ｅｘｉｑｏｎ、ＡＡＣＡＣＧＴＣＴＡＴＡＣＧＣ（配列番号１９）、３００６１０）。

【0133】

組織培養皿のゼラチンコーティング：
処置の３日前に行い、１ｇのゼラチン（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｇ９３９１）および１Ｌの組織培養グレード水を組み合わせることによって０．１％ゼラチン溶液を作製し、３０分間オートクレーブして溶解し、滅菌した。皿をコーティングするために十分な０．１％ゼラチンを、滅菌ピペットを用いて適用し、次いで溶液を吸引し、皿を空気乾燥し、室温で保存した。

【0134】

細胞播種：
処置の３日前に行い、ウェルあたり１０，０００個の細胞をゼラチン化９６ウェルプレートに、または１００，０００個の細胞をゼラチン化６ウェルプレートに播種した。

【0135】

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび化合物処置：
ＡＳＯまたは化合物処置について、細胞を、ＡＳＯまたは化合物を記載される濃度で含有する１００μＬのＰｒｏｍｏｃｅｌｌ成長培地に播種した。

【0136】

骨格筋筋管分化：
０日目、培地を分化培地に変更する。プレートをインキュベーターから取り出し、成長培地を吸引し、プレートを、９６ウェルには１００μＬおよび６ウェルプレートには１ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、９６ウェルまたは６ウェルにそれぞれ、ウェルあたり１００μＬまたは２ｍＬの分化培地を添加した。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは薬物を所望の濃度で添加し、プレートをインキュベーターに戻し、３～４日間インキュベートした。

【0137】

ＲＮＡ調製：
細胞をインキュベーターから取り出し、培地を吸引した。細胞を以下のプロトコルのうちの１つに従って迅速に溶解し、９６ウェルプレートにおける溶解について、直接溶解および１ステップＲＴ－Ｐｒｅａｍｐ ｑＰＣＲを以下に記載されるプロトコルに従って行った。各９６ウェルについて、混合物は以下を含有する。１９．５μＬのＲｏｃｈｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ Ｒｅａｄｙ溶解バッファー、０．２５μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤、０．２５μＬのＤＮＡｓｅＩ（キットに含まれるものではなくＴｈｅｒｍｏからのもの）を調製した。２０μＬの混合物を各ウェルに添加し、５回混合し、５分ＲＴでインキュベートするか、またはあるいは１５分間激しく振盪した。溶解を顕微鏡下で観察した。試料を－８０℃で少なくとも１５分間冷凍した。

【0138】

ｑＰＣＲ１ステップ：
ｑＰＣＲについて、細胞溶解物を１：１０に希釈し、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬＰ０、ＴＢＰ、ＭＹＯＧ、ＦＲＧ１、ＭＹＨ３、ＡＣＴＮ２などの検出のために１０μＬの１ステップＲＴ－ｑＰＣＲ反応に２μＬを使用した。１０μＬの反応あたり、反応混合物は以下を含んだ。２μＬのＲＮＡ（１：１０希釈溶解物）、５μＬのＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｑｍａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２倍）、０．２５μＬのＲＴ酵素混合物（４０倍）、０．５μＬのＴａｑｍａｎプローブセット（２０倍）、および２．２５μＬのＨ₂０。以下の反応プロトコルをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７で実行し、４８℃１５分間、５０℃２分間、９５℃３０秒間、４０回、９５℃５秒間、６０℃３０秒間、その後プレートを製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ）によって指定されるように読み取った。

【0139】

１ステップＲＴ－前増幅をＤＵＸ４下流遺伝子、すなわち、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＴＲＩＭ４３、ＫＨＤＣ１Ｌの検出に使用し、ＰＯＬ２ＲＡ－ＶＩＣを内因性対照として使用した。１０μＬの反応あたり、反応混合物は以下を含んだ。２．２５μＬのＲＮＡ（１：１０希釈溶解物）、５μＬのＴａｑｍａｎ Ｐｒｅ－Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２倍）、０．２５μＬのＲＴ酵素混合物（４０倍）、２．５μＬのＴａｑｍａｎプローブセット（０．２倍）＊。＊プールについてＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙｓ、等体積の各２０倍ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを使用し、最大１００個のアッセイを組み合わせた。例えば、５０個のＴａｑＭａｎアッセイをプールするために、１０μＬの各アッセイを微小遠心管において組み合わせた。各アッセイが０．２倍の最終濃度であるように、１倍ＴＥバッファーを用いて、プールされたＴａｑＭａｎアッセイを希釈した。上記例について、１ｍＬの総最終体積のために５００μＬの１倍ＴＥバッファーをプールされたＴａｑＭａｎアッセイに添加した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７プロトコルを４８℃１５分、９５℃１０分、１０サイクル：９５℃１５秒、６０℃４分、４℃無限で使用した。試料を次いで５０μＬに希釈し、ｑＰＣＲステップを継続した。１０μＬの反応あたり、反応混合物は以下を含んだ。２μＬのＰｒｅａｍｐ希釈物、５μＬのＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｑｍａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２倍）、０．５μＬのＴａｑｍａｎプローブセット（２０倍）、および２．５μＬのＨ₂０。多重化する場合、体積を合計１０μＬに調整した。以下のプログラムをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７で実行し、５０℃２分間、９５℃３０秒間、４０回、９５℃５秒間、６０℃３０秒間、プレートを製造業者の仕様書（Ｔｈｅｒｍｏ）に従って読み取った。

【0140】

ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔを使用する筋管からの総ＲＮＡ抽出のための方法：
６ウェルプレートにおいて、４５０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓを添加した。溶解物を、２ｍＬ収集管（供給）に配置されたｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに溶解物を移すことによってホモジナイズし、カラムを３０秒間≧８０００ｘｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で遠心分離し、次いでフロースルーを保存しながらカラムを廃棄した。２５０μＬのエタノール（最終３５％）をフロースルーに添加し、ピペット操作によって十分に混合した（遠心分離しなかった）。次いで試料を、形成され得る任意の沈殿物を含み、２ｍＬ収集管（供給）に配置されたＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移した。カラムを１５秒間≧８０００ｘｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄またはタンパク質沈殿のために収集した。７００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷ１をＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに添加し、これを次いで１５秒間≧８０００ｘｇで遠心分離し、この後フロースルーを廃棄した。１０μＬのＤＮＡｓｅＩを７０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＤＤと穏やかに混合することによってＤＮＡｓｅ処置を行い、得られた溶液をカラムに直接添加し、これを室温で２０分間インキュベートした。次いで、７００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＷ１を（製造業者の仕様書に従って）ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに添加し、カラムを１５秒間≧８０００ｘｇ．で遠心分離し、フロースルーを廃棄した。５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに添加し、これを次いで１５秒間≧８０００ｘｇで遠心分離し、この後フロースルーを廃棄した。５００μＬの８０％エタノールをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに添加し、カラムを２分間≧８０００ｘｇで遠心分離してスピンカラムメンブレンを洗浄し、収集管をフロースルーと共に廃棄した。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを新たな２ｍＬ収集管（供給）に配置し、最高速度で５分間遠心分離してメンブレンを乾燥させ、収集管をフロースルーと共に廃棄した。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを新たな１．５ｍＬ収集管（供給）に配置した。１４μＬのＲＮａｓｅフリー水をスピンカラムメンブレンの中心に直接添加し、これを次いで１分間最高速度で遠心分離してＲＮＡを溶出した。約１２μＬのＲＮＡを溶出した。

【0141】

Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．２０１５によって記載される方法を用いるＤＵＸ４－ｆｌの検出：
ｃＤＮＡ調製。１０μＬの反応物は、１μＬのＲＮＡ（１μｇ）、０．５μＬのＯｌｉｇｏ ｄＴ、０．５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、および４．５μＬのＨ₂０を含んだ。反応試料を６５℃で２分間インキュベートし、氷に迅速に移し、少なくとも１分保持した後、２μＬの５倍Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ、０．５μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、０．５μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤、０．５μＬのＳＳＩＶ ＲＴを含んだ、酵素混合物を添加した。試料を５５℃で２０分間および８０℃で１０分間インキュベートし、続いて４℃まで冷却した。１μＬのＲＴ反応、２μＬの５倍ＧＣバッファー、０．８μＬのＤＭＳＯ、０．２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＬの１０μＭ ＴＪ３８Ｆ、０．２μＬの１０μＭ ＴＪ４０Ｒ、０．１μＬのＰｈｕｓｉｏｎ ＩＩ ＤＮＡ ｐｏｌ、および５．５μＬのＨ₂０を含有する１０μＬの反応混合物においてＤＵＸ４前増幅を行った。以下のプロトコルをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７で実行した。９８℃２分、１０サイクルの９８℃、１５秒、６４℃、２０秒、７２℃、１５秒、および４℃無限。

【0142】

ネステッドプライマーでのＤＵＸ４ ｑＰＣＲを、１μＬのＤＵＸ４前増幅ＤＮＡ、５μＬの２倍ＩＱ ＳＹＢＲ Ｍｉｘ、０．４μＬの１０μＭ ＴＪ３８Ｆ、０．４μＬの１０μＭ ＴＪ４１Ｒ、および３．２μＬのＨ₂０を含有する１０μＬの反応物において行った。以下のプロトコルをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７で実行し、９５℃３分、４０サイクルの、９５℃１０秒、６４℃１５秒、７２℃２０秒、８６℃１０秒、次いでプレートをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７で製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ）に従って読み取った。Ｃｔ値をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアから抽出し、Ｇｅｎｅｄａｔａを使用して、ＰＯＬＲ２Ａをハウスキーピング遺伝子として用いる発現の相対レベルを計算した。

【0143】

ＲＮＡｓｅｑ方法：
Ｉｌｌｕｍｉｎａからの４０ｂｐシングルエンドリードは、ＦａｓｔＱＣでチェックすることによって良好な品質を有した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）。「ｓｏｌｅｘａ１．３－ｑｕａｌｓ」モードおよび「ｎｏ－ｎｏｖｅｌ－ｊｕｎｃｓ」としてのオプションでＴｏｐＨａｔ ｖ２．１．１（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を用いて、リードをｈｇ１９にマップした。ｇｔｆ形式の既知のＧｅｎｅをｋｇＸｒｅｆテーブルと統合することによって、ＴｏｐＨａｔの遺伝子モデルを作製した。既知の遺伝子およびｋｇＸｒｅｆの両方をｈｇ１９アセンブリにおけるＵＣＳＣテーブルブラウザからダウンロードした。鎖状性オプションを－ｒ２としてＳｕｂｒｅａｄパッケージからの特徴Ｃｏｕｎｔｓ機能を用いてリード数を得た。リードをＤＥＳｅｑ２で正規化した（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0144】

ＦＳＨＤ筋管免疫細胞化学：
簡潔に、細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１０分間室温で透過処理した。細胞を、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１倍ＰＢＳ溶液）で透過処理した後、ＰＢＳＴ中の１０％Ｎｏｒｍａｌ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｅｒｕｍまたは３％ＢＳＡ（ＮＤＳ）でブロックした。細胞を次いで、５％ＮＤＳを含むＰＢＳＴ中の適切に希釈された一次抗体と１時間室温で、または１２時間４℃でインキュベートし、ＰＢＳＴで３回室温で洗浄し、次いで５％ＮＤＳおよびＤＡＰＩを含むＴＢＳＴ中の所望の二次抗体とインキュベートして、核をカウンターストレインした。分化ＦＳＨＤ筋管においてＥ５－５抗体を用いる免疫細胞化学によってＤＵＸ４を検出した。市販の抗体を用いて活性化カスパーゼ－３を検出した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｉｍａｒｙ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ－３－ａｓｐ１７５－ａｎｔｉｂｏｄｙ／９６６１）。

【0145】

ＲＮＡｓｅｑ方法：
Ｉｌｌｕｍｉｎａからの４０ｂｐシングルエンドリードは、ＦａｓｔＱＣでチェックすることによって良好な品質を有した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）。ＴｏｐＨａｔ ｖ２．１．１を用いてリードをｈｇ１９にマップした。ｇｔｆ形式の既知のＧｅｎｅをｋｇＸｒｅｆテーブルと統合することによって、ＴｏｐＨａｔの遺伝子モデルを作製した。既知の遺伝子およびｋｇＸｒｅｆの両方をｈｇ１９アセンブリにおけるＵＣＳＣテーブルブラウザからダウンロードした。鎖状性オプションを－ｒ２としてＳｕｂｒｅａｄパッケージからの特徴Ｃｏｕｎｔｓ機能を用いてリード数を得た。リードをＤＥＳｅｑ２で正規化した。異なる時間で処理された、ニューロン試料におけるバイオロジカルレプリケートは、主成分分析によって示されるようにバッチ効果を有した。結果的に、このバッチ効果を低減するためにＣｏｍｂａｔを使用した。標準ＲＰＫＭ発現値を計算した。総遺伝子シグネチャーは、非常に小さく、標準統計カットオフ：８６／１９，７９９ｍＲＮＡ遺伝子で定義された。ＤＵＸ４調節遺伝子シグネチャーは、総シグネチャー：７７／８６ｍＲＮＡ遺伝子＝９０％のマジョリティーであった。非ＤＵＸ４調節遺伝子は、中度倍率変化：９／８６ｍＲＮＡ遺伝子＝１０％、２～２．７倍ｌｏｇＦＣを有する総シグネチャーのマイノリティーであった。

【0146】

ＦＳＨＤ筋管のｓｉＲＮＡおよびＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ形質導入のための方法：
合成ｃｒＲＮＡｓは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ｔｒａｃｒＲＮＡへのアニーリングは、仕様書に従って行った。要するに、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをＴＥバッファーに１００μＭで再懸濁し、混合し、アニーリングバッファーで５倍に希釈した。アニーリングを、ＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステムにおいて製造業者の推奨に従って行った。１００ｎｇのアセンブルされたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを、５００ｎｇのＴｒｕｅＣｕｔ Ｃａｓ９（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ３６４９７）と、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＭＰＫ１００９６）と共に提供される再懸濁バッファー中でインキュベートした。１５分のインキュベーション後、記載される方法に従って、反応を使用して５０，０００個の筋芽細胞をトランスフェクトした。ＭＡＰＫ１４（３つのｓｇＲＮＡ）およびｐＬＡＭ領域（ＤＵＸ４のポリアデニル化配列、４つのｇＲＮＡ）の標的化に使用される配列は、ＮＴ－ＣＴＲＬ、ＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号８）、ＭＡＰＫ１４、ＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＣＴＧＧＧ（配列番号９）、ＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＧ（配列番号１０）、ＣＴＴＡＴＣＴＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＣＧ（配列番号１１）、ｐＬＡＭ、ＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号１２）、ＣＡＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＣＧＴ（配列番号１３）、ＡＴＴＡＡＡＡＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧ（配列番号１４）、ＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＡ（配列番号１５）、およびｓｉＲＮＡ ＭＡＰＫ１４、アンチセンス：ＵＡＧＡＵＵＡＣＵＡＧＧＵＵＵＵＡＧＧＴＣ（配列番号１６）、センス：ＣＣＵＡＡＡＡＣＣＵＡＧＵＡＡＵＣＵＡＴＴ（配列番号１７）であった。

【0147】

インビボ材料および方法
ＰＫ／ＰＤ試験のためのラット：
雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６～８週齢）は、Ｈｉｌｌｔｏｐ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）によって供給された。Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃへの到着後、動物は、獣医科スタッフまたは他の指定要員のメンバーによってそれらの一般的な健康状態について評価された。動物は、試験の開始前に少なくとも２日間（ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃへの到着後）順応させた。動物は、順応中および試験全体を通して個別に収容した。動物室環境は、施設操作（目標条件：温度２０～２６℃、相対湿度３０～７０％、１２時間サイクルの光オンオフ）に従って制御した。光、温度、および相対湿度を、ＡｍｅｇａＶｉｅｗ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによって常にモニターした。飼料（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ＃５００２、ＰＭＩ Ｆｅｅｄｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、ＭＯ）は、二重パッケージの照射ペレットであり、飼料ロット番号および仕様書は、試験ノートブックに記録し、ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃに保存する。水（逆浸透）を動物に自由に提供した。水質の周期分析を行い、結果をＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃで保存した。検出レベルで、試験の結果に干渉することが予想される飼料または水に既知の汚染はない。試験＃ＦＵＬＴＨ－２０１７１１２０では、ラットは薬物投与の前に一晩絶食させ、ラットはいつでも水への自由なアクセスが可能であり、投薬後４時間で摂食させた。試験＃ＦＵＬＴＨ－２０１７１２２８について、ラットは、試験全体を通して飼料および水への自由なアクセスが可能であった。

【0148】

異種移植片試験のためのマウス：
雄ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（Ｎｏｄ－Ｒａｇ）マウス（６～８週齢）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ ＶＲ繁殖コロニー（ＵＳＡ）によって供給された。動物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭａｒｙｌａｎｄのＨｏｗａｒｄ ＨａｌｌのＵＭＢ中心動物施設に収容した。動物は、順応（４～５日）中、生着手順全体を通して、薬物治療試験全体を通して群収容（４／ケージ）した。動物室環境は、施設操作（目標条件：温度２０～２６℃、相対湿度３０～７０％、１２時間サイクルの光オンオフ）に従って制御した。光、温度、および相対湿度を、ＡｍｅｇａＶｉｅｗ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによって常にモニターした。飼料（ＬａｂＤｉｅｔｓ ５Ｐ７６ ２２．５％タンパク質齧歯類チャウ）を試験中自由に提供した。滅菌水を自由に提供した。試験の結果に干渉することが予想された飼料または水に既知の汚染はない。

【0149】

ＦＳＨＤおよび対照異種移植マウスの作製：
Ｃ６およびＡ４ ＩＰＳＣ由来ヒト不死化同系筋芽細胞株を、約８週齢雄Ｎｏｄ－Ｒａｇマウスの両側前脛骨（ＴＡ）筋に異種移植することによって、ＦＳＨＤおよび対照マウスを生成した。ヒト筋肉異種移植片を作製するために、マウス後肢のＴＡ内のＡ４またはＣ６細胞を播種するためのニッチを、８週齢免疫欠損ＮＲＧマウスの後肢にＸ線を照射することによって作製し、マウス筋肉再生を防止した。１日後、５０ｕｌの２％ＢａＣｌ２溶液を各ＴＡの長さに沿って注射して、マウス筋組織を除去した。マウス組織アブレーション後、２ｘ１０６個のＣ６細胞を各両側ＴＡ領域に注射し、４週間発生させた。Ａ４またはＣ６細胞の生着後、Ｓａｋｅｌｌａｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６によって記載されるようにヒト細胞の生着を改善させるために、動物を４週間の間欠神経筋電気刺激（ｉＮＭＥＳ）に曝露した。

【0150】

試験物品製剤および調製
適切な量のＦＴＸ－１８２１を正確に計量し、水中の適切な体積の賦形剤（０．５％（１％ＤＭＳＯ：９９％メチルセルロース）と混合して、０．０３ｍｇ／ｍＬの最終濃度を含む均一懸濁液を得た。製剤を試験日に調製し、調製の１時間以内に投与した。動物に与えられる用量体積は、１０ｍＬ／ｋｇであった。２つの用量溶液の２０～５０μＬアリコートを各製剤から取得し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる用量正確性の決定のために取っておく。

【0151】

適切な量のＦＴＸ－２８６５を正確に計量し、適切な体積の注射のための滅菌０．９％食塩水と混合して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を有する透明溶液を達成した。製剤を試験日に調製し、１０ｍＬ／ｋｇの用量体積を用いて動物に与えた。

【0152】

ＦＴＸ－１８２１試験物品投与およびＰＫ／ＰＤ試験設計
ＦＴＸ－１８２１（０．０３ｍｇ／ｍＬ）の投与溶液を、Ｗｕｘｉ施設ＳＯＰ後、０．３ｍｇ／ｋｇの最終用量をもたらすために、１０ｍＬ／ｋｇの用量体積で強制経口投与した。用量体積を、投与の前に測定された体重によって決定した。それぞれの治療群の投与溶液濃度（ｍｇ／ＭＬ）、用量体積（ｍＬ／ｋｇ）、および最終用量（ｍｇ／ｋｇ）を、含まれるエクセル試験シートに記録した。摂食条件：一晩絶食し、投与４時間後に食物を戻す。

【0153】

ＦＴＸ－２８６５試験物品投与および異種移植片試験設計
ＦＴＸ－２８６５（１ｍｇ／ｍＬ）の投与溶液を、（各用量について）１０ｍｇ／ｋｇの最終用量をもたらすために、１０ｍＬ／ｋｇの用量体積でのＩＰ注射を介して投与した。０．９％の滅菌食塩水を、（各用量について）ビヒクル対照として１０ｍＬ／ｋｇの用量体積でのＩＰ注射を介して投与した。用量体積を、朝の投与の前に測定された体重によって決定した。それぞれの治療群の投与溶液濃度（ｍｇ／ＭＬ）、用量体積（ｍＬ／ｋｇ）、および最終用量（ｍｇ／ｋｇ）を、含まれるエクセル試験シートに記録した。ＢＩＤ注射を、標的カバレッジを最大化するために、約１２時間あけた。試験動物は、ビヒクルまたはＦＴＸ－２８６５の合計１４個の注射を８日かけて受け、８日目の最後の朝の注射の約１時間後に犠死させた。

【0154】

試料収集：
ＰＫのための血液試料：約１００μｌの血液試料を、予め定義された各時点で頸静脈または尾静脈を介して得た。血液試料を、抗凝固剤としてＥＤＴＡ－Ｋ２で処置された予め冷却された収集チューブに入れた。

【0155】

ＰＫ評価のための血漿収集：血漿収集のために半時間以内にＰＫ血液試料を４℃、３０００ｇで１５分間遠心分離した。血漿試料を、ポリプロピレンチューブまたは９６ウェルプレートに保存し、ドライアイス上で迅速に凍結し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析まで－７０℃で保存した。

【0156】

ＰＫおよびＰＤ評価のための筋肉収集：心臓穿刺による血液収集後、両側前脛骨筋および僧帽筋を収集した。左および右側からの各筋肉を迅速に別々に計量し、別個のチューブに配置し、次いでドライアイス上で急速冷凍した。一方の側からの筋肉を化合物濃度の測定に使用し、他方の側からの筋肉をＰＤ分析のためにスポンサーへ送った。試料収集が１日の終わりにほぼ同じ時間に行われるように、投与をずらした。

【0157】

ＰＫ分析のための試料処理：
ＬＣ／ＭＳ分析のための血漿試料調製：１０μＬの血漿試料のアリコートは、１５０μＬのＩＳ溶液（ＡＣＮ中の１００ｎｇ／ｍＬのラベタロールおよび１００ｎｇ／ｍＬのトルブタミドおよび１００ｎｇ／ｍＬのジクロフェナク）で沈殿させたタンパク質であり、混合物は、十分にボルテックス混合し、４０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離した。８０μＬの上清のアリコートを試料プレートに移し、８０μＬの水と混合し、次いでプレートを８００ｒｐｍで１０分間振盪した。１μＬの上清を次いでＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注射した。ＬＣ／ＭＳ分析のための筋肉試料調製：筋肉試料を、Ｏｍｎｉビーズ破砕機を用いて水中で１：４比（重量／体積）にホモジナイズした。ホモジネートを次いで薬物濃度の測定のために使用した。２０μＬの筋組織ホモジネートのアリコートは、２００μＬのＩＳ溶液（ＡＣＮ中の１００ｎｇ／ｍＬのラベタロールおよび１００ｎｇ／ｍＬのトルブタミドおよび１００ｎｇ／ｍＬのジクロフェナク）で沈殿させたタンパク質であり、混合物は、十分にボルテックス混合し、４０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離した。８０μＬの上清のアリコートを試料プレートに移し、８０μＬの水と混合し、次いでプレートを８００ｒｐｍで１０分間振盪した。０．３μＬの上清を次いでＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために注射した。

【0158】

分析方法（ＬＣ／ＭＳ、非ＧＬＰ）：
分析方法を実行するために使用される技術的詳細は以下を含む。装置：ＬＣＭＳ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ＱＴＲＡＰ ６５００＋（ＳＣＩＥＸ、ＭＡ、ＵＳＡ）、マトリックス：雄ＳＤラット血漿（ＥＤＴＡ－Ｋ２）、内部標準（複数可）：ＣＡＮ中１００ｎｇ／ｍＬのラベタロールおよび１００ｎｇ／ｍＬのトルブタミドおよび１００ｎｇ／ｍＬのジクロフェナク、ＭＳ条件ＥＳＩ：陽性、ＦＴＸ－１８２１のＳＲＭ検出：［マウス＋ヒト］＋ｍ／ｚ３８３．８３８＞２９９．２３１、ラベタロール（ＩＳ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ３２９．２／１６２．１、トルブタミド（ＩＳ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ２７１．１／１５５、較正曲線：雄ＳＤラット血漿（ＥＤＴＡ－Ｋ２）および筋肉ホモジネートにおけるＦＴＸ００１８２１－０２の１．００～３０００ｎｇ／ｍＬ
定量化方法：試料中および標準溶液試料中の試験物品のピーク面積を、ＬＣ／ＵＶまたはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法によって決定した。方法受容基準：線形性：≧７５％のＳＴＤを、生物流体におけるそれらの公称値の±２０％（ＬＬＯＱについて±２５％）以内ならびに組織ホモジネートおよび排泄物試料におけるそれらの公称値の２５％（ＬＬＯＱについての３０％）以内に逆算した。ＱＣ：≧６７％のすべてのＱＣを、生物流体についてそれらの公称値の±２０％以内ならびに組織および排泄物試料についてそれらの公称値の２５％以内に逆算した。特異性：単一の空のマトリックスにおける分析物の平均計算濃度は、ＬＬＯＱの０．５倍未満であった。感受性：生物流体および組織ホモジネートにおけるＬＬＯＱは、１～３ｎｇ／ｍＬであった。キャリーオーバー：最も高い標準注射の直後の単一の空のマトリックスにおける平均計算キャリーオーバー濃度は、ＬＬＯＱ未満であった。

【0159】

標的関与の免疫アッセイ評価のための筋組織の凍結割断、溶解、および調製のプロトコル：
約５０ｍｇの筋組織をドライアイス上に配置した。標本あたり１つの清潔なレーザーブレードを用いて５０ｍｇ重量を得るために必要に応じて、筋肉試料を切断した。５０ｍｇの筋組織を予めラベル付けしたＴＴ１ Ｃｏｖａｒｉｓバッグ（Ｃｏｖａｒｉｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）に入れ、ドライアイス上に保持した。ＴＴ１ Ｃｏｖａｒｉｓバッグを液体窒素に浸漬させ、試料をＣｏｖａｒｉｓ ｃｒｙｏＰＲＥＰ（Ｃｏｖａｒｉｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）において設定「５」で凍結割断した。ＴＴ１バッグを１８０°回転し、２－ａステップを反復した。試料を予め計量／ラベル付けしたチューブに移し、全ての試料が調製されるまでドライアイス上に維持した。試料重量を記録した。ＲＩＰＡ溶解バッファーを調製した（Ｒ０２７８－５００ＭＬ、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）。１０ｍｌについて、２つのＲｏｃｈｅ ＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤錠剤および１つのＲｏｃｈｅ ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤錠剤を添加した。凍結割断材料に、１ｍｇあたり８μｌのＲＩＰＡバッファーを各チューブに添加し、溶解物が均質になるまで各チューブをボルテックスした。全ての試料が処理されるまで、溶解物を氷上に維持した。溶解物を１３，０００ｇで５分間４℃での遠心分離によって除去した。上清を新しいチューブに移し、液体窒素で急速冷凍した（タンパク質アッセイあたり１０μｌを取っておく）。各試料のタンパク質含有量を測定するために、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＤＣタンパク質アッセイ（５０００１１２、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を行った。試料を、タンパク質評価のためにＰＢＳで１：２０に希釈した。

【0160】

ホスホＭＫ２および総ＭＫ２免疫アッセイ：
ホモジナイズされた僧帽筋溶解物を、内部開発されたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）多重化ホスホＭＫ２／総ＭＫ２免疫アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて評価した。各試料について、５０μｇのタンパク質に等しい、５０μＬの筋溶解物をＭＳＤアッセイ上に装填した。筋溶解物におけるタンパク質濃度を、上記で記載されるＢｒａｄｆｏｒｄ ＤＣタンパク質アッセイによって決定した。試料を二通りに評価した。筋試料を予めコーティングしたＭＳＤプレート上で一晩４℃で、オービタルシェーカー（３００ｒｐｍ）上でインキュベートし、翌朝評価した。

【0161】

筋組織の凍結割断、ＲＮＡ抽出、およびＲＮＡ精製ならびに
ＭＢＤ３Ｌ２およびＣＤＫＮ１Ｂの定量的ＰＣＲアッセイ評価：
約３～５ｍｇのＴＡ筋組織をドライアイス上に配置した。筋組織を予めラベル付けしたＴＴ１ Ｃｏｖａｒｉｓバッグ（Ｃｏｖａｒｉｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）に入れ、ドライアイス上に保持した。ＴＴ１ Ｃｏｖａｒｉｓバッグを液体窒素に浸漬させ、試料をＣｏｖａｒｉｓ ｃｒｙｏＰＲＥＰ（Ｃｏｖａｒｉｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）において設定「５」で凍結割断した。ＴＴ１バッグを１８０°回転し、２－ａステップを反復した。試料を予め計量／ラベル付けしたチューブに移し、全ての試料が調製されるまでドライアイス上に維持した。ＲＮＡは、３～５ｍｇの凍結割断筋組織からのＺｙｍｏ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ ＲＮＡキット（ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる精製であった。ｃＤＮＡは、逆転写を介してＲＮＡテンプレートから合成した。標的化された転写物を次いで、希釈ヒト特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いる１４サイクルＰＣＲアッセイで予め増幅した。遺伝子発現を、ヒト特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いるｑＰＣＲアッセイにおいて分析した。相対発現レベルを、２^-Δ^Ct方法を用いてＣＤＫＮ１Ｂ発現に対して正規化した。

【0162】

データ分析：
血漿および筋肉濃度対時間を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３ソフトウェア（Ｃｅｔｅｒａ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて非コンパートメントアプローチによって分析した。Ｃ０、ＣＬｐ、Ｖｄｓｓ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｔ１／２ＡＵＣ（０－ｔ）、ＡＵＣ（０－ｉｎｆ）、ＭＲＴ（０－ｔ）、ＭＲＴ（０－ｉｎｆ）、％Ｆ、ならびに筋肉濃度対時間プロファイルおよびＰＤエンドポイントのグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェアバージョン７（ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて報告される。筋肉ＰＤを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェアバージョン７（ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて一元配置分散分析を介して評価した。異種移植筋肉におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡに対するＣ６対Ａ４細胞生着の効果を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェアバージョン７（ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて両側Ｔ検定を介して評価した。ＦＳＨＤ異種移植筋肉におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡに対するＦＴＸ－２８６５対ビヒクル治療の効果を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェアバージョン７（ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて両側Ｔ検定を介して評価した。

【0163】

実施例１
配列指向性アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するＤＵＸ４の抑制は下流標的遺伝子を低減する
野生型筋管を、ＤＭＳＯ対照ビヒクルで治療し、ＤＵＸ４タンパク質を発現する成熟患者由来ＦＳＨＤ筋管を、ＤＭＳＯビヒクル対照またはＥｘｉｑｏｎから購入した１μＭのＤＵＸ４配列指向性アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ＦＴＸ－２）で治療した。治療後、筋管を、１９．５５μＬのＲｏｃｈｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｒｅａｄｙ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２５μＬのＤＮＡｓｅ１（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ２２２２）、０．２５μＬのＰｒｏｔｅｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ、３３３５４０２００１）に溶解し、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに収集した。ＤＵＸ４調節下流遺伝子（ＺＳＣＡＮ４、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＬＥＵＴＸ、およびＫＨＤＣ１Ｌ）の発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４４８４２６２）、ＺＳＣＡＮ４ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ００５３７５４９＿ｍ１、ＦＡＭ－ＭＧＢ）、ＭＹＯＧ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ０１０７２２３２＿ｍ１、ＪＵＮ－ＱＳＹ）、ＲＰＬＰ０ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）、および／またはＬＥＵＴＸ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ００４１８４７０＿ｍ１）によって決定した。Ｃｔ値をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアから抽出し、Ｇｅｎｅｄａｔａを使用して、ＰＯＬＲ２Ａをハウスキーピング遺伝子として用いる発現の相対レベルを計算した。

【0164】

結果は、ＤＵＸ４配列指向性ＡＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管が、ＤＭＳＯビヒクル対照で治療されたＦＳＨＤ筋管と比較して、低減した量のＤＵＸ４ならびにＤＵＸ４下流転写因子標的遺伝子、ＺＳＣＡＮ４、ＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＬＥＵＴＸ、およびＫＨＤＣ１Ｌを発現することを示した（図２）。

【0165】

図３Ａにおけるデータは、ＤＭＳＯ対照または１ μＭのＤＵＸ４ ＡＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管、および健康な正常同系対照筋管におけるＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡの発現を比較する、群化されたプレート品質管理データである。図３Ｂは、ＤＵＸ４ ＡＳＯの異なる希釈を用いる、ＤＵＸ４および下流遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２の薬理学的品質管理データおよび用量依存性低減を示す。図３Ｃは、ＷＴに対してＤＭＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管（Ｚ’は０．５１２であり、信号対雑音（Ｓ／Ｎ）は５．１である）、およびＤＭＳＯまたはＤＵＸ４ ＡＳＯで治療されたＦＳＨＤ筋管（Ｚ’は０．３１９であり、信号対雑音（Ｓ／Ｎ）は４．６である）を比較するプレートベースアッセイ統計を示す。

【0166】

実施例２
Ｐ３８小分子阻害剤はＭＢＤ３Ｌ２ ＭＲＮＡ発現を低減する

ＤＵＸ４タンパク質を発現する野生型筋管および成熟患者由来ＦＳＨＤ筋管を、ＤＭＳＯビヒクル対照または複数の濃度の、ＳＢ２３９０６３（図４Ａ）、ＶＸ－７０２（図４Ｂ）、パマピモド（図４Ｃ）、およびＴＡＫ－７１５（図４Ｄ）を含む、異なる範囲のアイソフォームおよびキノーム選択性を有する様々なｐ３８α／β阻害剤で治療した。治療後、対照および治療細胞を、ＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ（ＤＵＸ４下流遺伝子）およびミオゲニン（ＭＹＯＧ）ｍＲＮＡ（対照）発現のＰＣＲ定量化のために処理した。これらのｐ３８α／β阻害剤は、ＦＳＨＤ筋管におけるＭＹＯＧ ｍＲＮＡ発現への影響なしでのＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ発現の強力な（ＩＣ₅₀約＜１０ｎＭ、図４Ａ～Ｄ）低減を示した。

【0167】

ＦＳＨＤ筋管において、ｐ３８阻害剤（例えば、パマピモド）は、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡおよびＤＵＸ４下流遺伝子ＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ発現を、筋管形成に影響を及ぼすことなく、用量依存的に低減した。ＤＭＳＯ治療と比較される場合、１０、１００、および１０００ｎＭのＦＴＸ０００８３９（パマピモド）は、ＦＳＨＤ筋管におけるｑＰＣＲおよびＴａｑｍａｎによって測定されるように（図５Ａ）、筋管への分化に影響を及ぼすことなく（図５Ｂ）、ＰＯＬＲ２Ａ ｍＲＮＡに対して正規化されたＤＵＸ４－ｆｌおよびＭＢＤ３Ｌ２下流遺伝子ｍＲＮＡ レベルの両方を用量依存的に低減した。データは、ｐ３８阻害剤がＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ発現を、ミオゲニンｍＲＮＡ発現に影響を及ぼすことなく、用量依存的に低減することを示す。

【0168】

実施例３
ＳＩＲＮＡノックダウンを介したＰ３８ ＭＡＰＫ１４ ＭＲＮＡおよびＭＢＤ３Ｌ２ ＭＲ
ＮＡ低減

ｐ３８α ＭＡＰＫ１４ ８５およびｐ３８α ＭＡＰＫ１４ ８６ ｓｉＲＮＡｓを、材料および方法に記載される患者ＦＳＨＤ筋管にトランスフェクトした。ｐ３８α ＭＡＰＫ１４ ８５ ｓｉＲＮＡおよびｐ３８α ＭＡＰＫ１４ ８６ ｓｉＲＮＡの各々は（より少ない程度に）、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴ ＣＴＲＬ １およびＮＴ ＣＴＲＬ ２）と比較して、図６Ａに示されるように、ｐ３８ ＭＡＰＫ１４発現を低減し、図６Ｂに示されるように、ＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ（ＤＵＸ４標的遺伝子）発現を低減した。データは、ＭＢＤ３Ｌ２によって例示されるように、ｐ３８α ＭＡＰＫ１４＞５０％のゲノム低減が、ＤＵＸ４および下流標的遺伝子を特に低減したことを示す。

【0169】

実施例４
Ｐ３８αキナーゼＣＡＳ９／ＳＧＲＮＡ ＲＮＰを介したＭＢＤ３Ｌ２ ＭＲＮＡ低減

ＭＡＰＫ１４またはｐＬＡＭ（ＤＵＸ４のポリアデニル化シグナル配列）のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ標的化を、材料および方法に記載されるように行った。ＭＡＰＫ１４またはｐＬＡＭ（ＤＵＸ４のポリアデニル化シグナル配列）に標的化されたＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡは、ＭＢＤ３Ｌ２の発現における低減をもたらしたが、ＭＹＯＧをもたらさなかった。データは、ＭＢＤ３Ｌ２によって例示されるように、ｐ３８α ＭＡＰＫ１４のゲノム低減が、ＤＵＸ４および下流標的遺伝子を特に低減したことを示す。

【0170】

実施例５
ＦＴＸ－１８２１はＤＵＸ４タンパク質およびＭＢＤ３Ｌ２ ＭＲＮＡを下方調節する
患者由来ＦＳＨＤ筋管（Ｄ４Ｚ４アレイの６個の反復を有する）を、ＤＭＳＯビヒクル対照および異なるＦＴＸ－１８２１濃度で治療し、ＤＵＸ４タンパク質およびＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡレベルを、方法および材料に記載されるように決定した。ＤＵＸ４およびＭＢＤ３Ｌ２について、４つのバイオロジカルレプリケートを分析した。加えて、ｐＨＳＰ２７レベルを決定した。ｐＨＳＰ２７定量化のために、２つの独立した実験において３つのレプリケートを得た。

【0171】

ＦＴＸ １８２１でのＦＳＨＤ患者由来筋管の治療は、標的関与の証拠としてホスホＨＳＰ２７レベル（ＩＣ₅₀＝１０ｎＭ）において観察される変化と相関するＤＵＸ４タンパク質（ＩＣ₅₀＝２５ｎＭ）およびＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ（ＩＣ₅₀＝２５ｎＭ）の濃度依存性低減をもたらした（図７）。結果は、ＤＵＸ４タンパク質（ＩＣ₅₀＝２５ｎＭ）およびＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ（ＩＣ₅₀＝１０ｎＭ）の濃度依存性低減を示した。ＤＵＸ４タンパク質およびＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡにおける低減は、標的関与の証拠としてｐ－ＨＳＰ２７レベル（ＩＣ₅₀＝１０ｎＭ）において観察される変化と相関した。これらの結果は、ＦＴＸ－１８２１によるｐ３８α経路阻害が、強力なＤＵＸ４タンパク質およびＭＢＤ３Ｌ２ ｍＲＮＡ下方調節をもたらすことを示す。

【0172】

実施例６
ＦＴＸ－１８２１は筋管形成に影響を及ぼさない
不死化ＦＨＳＤ筋管を、分化し、ＤＭＳＯビヒクル対照または１μＭ、０．３３μＭ、０．１１μＭ、もしくは０．０３７μＭの濃度のＦＴＸ－１８２１で治療した。４日後、細胞を固定し、ＭＨＣまたはＤＡＰＩに対する抗体で染色した。図８Ａを参照されたい。筋管における核は、ＭＨＣ染色に従って定量化した（図８Ｂ）。結果は、試験された濃度のＦＴＸ－１８２１での治療後に筋管形成または融合における変化を示さなかった。

【0173】

実施例７
ＦＴＸ－１８２１はＦＳＨＤ筋管におけるアポトーシスを低減する
アポトーシスを、材料および方法に記載されるように、インビトロでＦＳＨＤ筋管における活性カスパーゼ－３レベルによって測定した。アポトーシスは、図９Ａにおいて白丸および拡大領域によって示されるように、培養中の筋管のサブセットにおいて散発的に検出された。活性カスパーゼ－３シグナルを、異なる濃度のＦＴＸ－１８２１で治療されたＦＳＨＤ筋管において定量化した（図９Ｂ）。結果は、活性カスパーゼ３の検出の低減（ＩＣ₅₀＝４５ｎＭ）によって示されるように、アポトーシスシグナルの用量依存性低減を示し、この効果は、対照筋管と比較してＦＳＨＤ筋管に特異的であった。ＤＭＳＯ治療後、活性カスパーゼ－３シグナルにおける変化は観察されなかった。

【0174】

実施例８
ＦＴＸ－１８２１は病理的ＤＵＸ４転写プログラム発現を低減する
ＤＭＳＯビヒクル対照で治療されたＦＳＨＤ筋管と比較して、ＦＴＸ－１８２１で治療されたＦＳＨＤ筋管における、その発現が下方調節されるＤＵＸ４経路における遺伝子を特定するために、方法および材料に記載されるように試験を行った。加えて、遺伝子発現はまた、ＤＭＳＯで治療された野生型筋管において決定した。各条件についての３つのレプリケートをＲＮＡ－ｓｅｑによって分析し、遺伝子を変化の方向および強度によってクラスター化した。

【0175】

図１０Ａのヒートマップに示されるように、多数の差次的に発現した遺伝子を、ＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングによって特定した。バーは、観察された正規化された変化を示し、例えば、ＦＴＸ－１８２１によって下方調節された遺伝子は、ＤＭＳＯのみで治療された試料において濃縮される。これらの遺伝子の発現は、ＦＴＸ－１８２１（１μＭ）での治療後に正規化し、野生型における観察により近似させた。標準ＲＰＫＭ発現値を用いて計算され、総遺伝子シグネチャーは、非常に小さく、標準統計カットオフ：８６／１９，７９９ｍＲＮＡ遺伝子で定義された。ＤＵＸ４調節遺伝子シグネチャーは、総シグネチャーのマジョリティーであり、これらの遺伝子は、図１０Ａに列挙される。非ＤＵＸ４調節遺伝子は、中度倍率変化：９／８６ｍＲＮＡ遺伝子＝１０％、２～２．７倍ｌｏｇＦＣを有する総シグネチャーのマイノリティーであった。図１０Ｂは、ＦＴＸ－１８２１での治療後に下方調節されたＤＵＸ４標的遺伝子の、材料および方法に記載されるように、正規化リードを示す。１群あたり３つの独立したレプリケートを分析した。

【0176】

実施例９
様々なＦＳＨＤ１遺伝子型および表現型におけるＭＢＤ３Ｌ２ ＭＲＮＡの低減
様々な異なるＦＳＨＤ１遺伝子型を有する患者から得られる細胞におけるＤＵＸ４標的遺伝子の発現を低減するｐ３８阻害剤の能力を、方法および材料に記載されるように行った。４つの別個のＦＳＨＤ患者筋芽細胞株、すなわち、ＦＴＣＥ－０１６、－０２０、－１９７、および－１９６（Ｒａｂｉ Ｔａｗｉｌ寄贈）を、ＦＴＸ－１８２１（１μＭ）またはＦＴＸ－８３９（１ μＭ）で治療し、ＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２のｍＲＮＡレベルを、治療後に決定した。

【0177】

ＭＢＤ３Ｌ２発現レベルは、ＦＳＨＤ株の全てにおいて低減し、健康な対照、ＦＴＣＥ－３９６およびＦＴＣＥ－０１４において測定されるものと同様のレベルをもたらした（図１１）。これは、多様なＦＳＨＤ１遺伝子型および表現型に由来する筋管にわたるｐ３８阻害剤によるＤＵＸ４標的遺伝子低減の証拠である（同様の結果がＦＳＨＤ２について観察され、データは示されない）。

【0178】

実施例１０
ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２遺伝子型および表現型からのＭＢＤ３Ｌ２ ＭＲＮＡの低減
ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２細胞におけるＦＴＸ－１８２１を用いるｐ３８選択的阻害の効果を評価するために、初代筋芽細胞株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＲｏｃｈｅｓｔｅｒのＲａｂｉ Ｔａｗｉｌにより寄贈された。図１３は、試験において使用される１３個のＦＳＨＤ１および３個のＦＳＨＤ２患者筋芽細胞の遺伝子型および表現型をまとめる。様々なＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２筋芽細胞をＤＭＳＯ、ＦＴＸ－１８２１、またはＦＴＸ－８３９（１μＭ）で治療し、治療後、ＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定した。加えて、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２株における活性カスパーゼ－３を測定することによって、アポトーシスを決定した。

【0179】

様々なＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２筋芽細胞の各々は、ＭＢＤ３Ｌ２の低減を示した（図１４Ａ、上１１株）。低減は、健康な対照株（ＣＴＲＬ－ＦＴＣＥ－０１４）におけるものと同様の発現レベルをもたらした（図１４Ａ、下２株）。加えて、ＦＴＸ－８３９での治療は、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２株の両方にわたるアポトーシスにおける、健康な対照株（ＣＴＲＬ－ＦＴＣＥ－０１４）において決定された量と同様のレベルまでの低減を示した（図１４Ｂ）。これらの結果は、臨床的ＦＳＨＤ生検筋芽細胞が、筋管に分化される場合、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２遺伝子型および表現型の両方にわたる病理的ＤＵＸ４下流遺伝子発現および結果として起こる細胞死の両方の低減を示すことを示す。

【0180】

実施例１１
強力で選択的なＰ３８阻害剤での治療後の野生型ラットの筋肉における標的関与
ＦＴＸ－１８２１の薬物動態特性を動物モデルにおいて試験した。ＦＴＸ－１８２１を雄絶食または非絶食Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（時点および治療群あたりＮ＝６動物）に経口投与し、ホスホｐ３８α：総ｐ３８αレベルを決定した。薬物治療の前および後のホスホＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ２（ＭＫ２）対総ＭＫ２比における変化を測定することによって、筋組織におけるｐ３８系標的関与の薬力学分析を行った。使用される全ての方法は、材料および方法セクションに記載される。

【0181】

ＦＴＸ－１８２１は、以前に記載されたもの（Ａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、データ図示せず）と同様の血漿薬物動態特性を示した。これらの試験は、複数の筋肉および血漿へのＦＴＸ－１８２１の急速な分布を追加で示した。筋肉対血漿曝露比は、臨床的に関連する血漿曝露が達成される場合、ラットにおいて１以上であった。

【0182】

薬力学分析は、ＦＴＸ－１８２１の単回経口用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）が、臨床的に関連する血漿濃度をもたらし（Ｂａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、薬物治療の１時間以内のラット僧帽筋におけるホスホＭＫ２対総ＭＫ２比を有意に減少させた（図１５）。Ｐ３８系標的関与は、ＦＴＸ－１８２１の単回用量後少なくとも１２時間にわたって持続した（図１５）。僧帽筋におけるＰ３８系標的関与は、ＦＴＸ－１８２１の血漿および筋肉濃度が２０ｎｇ．ｍＬまたはｎｇ．ｇ超である場合、最大であり、曝露が減少した時点で低下した。ラット試験において達成されるＦＴＸ－１８２１の筋肉濃度は、ＦＳＨＤ筋管におけるインビトロデータに基づいてＦＳＨＤ患者筋肉生検におけるＤＵＸ４依存性標的遺伝子のＣｍａｘでの＞７０％低減をもたらすことが予測される（ａｂｏｖｅ上記）。

【0183】

この薬物動態および薬力学分析は、血漿ＦＴＸ－１８２１濃度が２０ｎｇ／ｍＬ超である場合、筋肉におけるｐ３８系の最大阻害が達成され、ヒト筋肉において、７．５または１５ｍｇＢＩＤの臨床的用量で、顕著なｐ３８経路阻害が予想されることを示した（Ｂａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0184】

実施例１２
強力で選択的なＰ３８阻害剤での治療後のＦＳＨＤ異種移植マウスにおけるＤＵＸ４ゲノムプログラムの阻害
Ｓａｋｅｌｌａｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６によって記載されるように、Ｃ６（ＦＳＨＤ）およびＡ４（対照）ＩＰＳＣ由来ヒト不死化同系筋芽細胞株を、約８週齢雄Ｎｏｄ－Ｒａｇマウスの両側前脛骨（ＴＡ）筋に異種移植することによって、ＦＳＨＤおよび対照筋異種移植マウスを生成した。４週間長の生着およびＩＮＭＥＳ手順後、ＦＳＨＤ異種移植動物を、８日間（合計１４注射）ビヒクルまたはＦＴＸ－２８６５（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかのＢＩＤ注射で治療し、８日目の最後の朝の注射の１時間後の約最大血漿濃度時（Ｔｍａｘ）に犠死させた。犠死時、血漿、僧帽筋、および両側前脛骨筋を収集し、薬物動態エンドポイント、標的関与、およびＤＵＸ４依存性ｍＲＮＡの分析のために急速冷凍させた。ＭＢＤ３Ｌ２を、ヒト特異的プローブを用いるｑＰＣＲによって評価し、ハウスキーピング遺伝子ＣＤＫＮ１Ｂに対して正規化した。ｐＭＫ２およびＭＫ２タンパク質濃度を、定量ＭＳＤアッセイによって評価した。

【0185】

Ａ４またはＣ６筋芽細胞組織を４～６週間生着させた動物からのｑＰＣＲによるＴＡ組織の分析は、ＦＳＨＤ（Ｃ６）対対照（Ａ４）異種移植ＴＡ筋におけるＭＢＤ３Ｌ２および他のＤｕｘ４依存性遺伝子（図示せず）の有意な（ｐ＜０．０５）＞１０倍の増加を示した（図１６）。１群あたりＮ＝８ＴＡ試料。

【0186】

強力で選択的なｐ３８阻害剤、ＦＴＸ－２８６５でのＦＳＨＤ異種移植動物の治療は、腹腔内（ＩＰ）注射によって与えられる１０ｍｇ／ｋｇ用量の反復ＢＩＤ投与後の野生型マウスのＴＡおよび僧帽筋における＞５０％のホスホＭＡＰキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ２（ＭＫ２）対総ＭＫ２比における変化（データ図示せず）によって測定されるように、ｐ３８系標的関与を生成した。ＦＴＸ－２８６５治療は、マウス僧帽筋におけるホスホ対総ＭＫ２比を有意に（ｐ＜０．０５）減少させ、顕著なｐ３８系関与を示し、またｐ３８系を＞８０％を阻害するために動物の骨格筋における十分な薬物濃度を示した（図１７、１群あたりＮ＝８僧帽筋試料）。加えて、ＦＴＸ－２８６５治療は、ＦＳＨＤ異種移植ＴＡ筋におけるＭＢＤ３Ｌ２の発現を、ビヒクル治療動物と比較して有意に（ｐ＜０．０５）減少させ、ｐ３８阻害による病理的ＤＵＸ４遺伝子プログラムの抑制を示した（図１８、１群あたりＮ＝５－７ＴＡ試料）。
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本明細書に記載される全ての刊行物および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、上記の特定の実施形態と併せて記載されたが、その多数の代替、変更、および他の変形が、当業者には明らかであろう。全てのそのような代替、変更、および変形は、本発明の趣旨および範囲内に含まれることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2024012295000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2023-11-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

本願明細書に記載の発明。

【外国語明細書】