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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024012296
(43)【公開日】2024-01-30
(54)【発明の名称】獣医学的使用のためのエリスロポエチンおよびアナログ
(51)【国際特許分類】
C07K 14/505 20060101AFI20240123BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20240123BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20240123BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240123BHJP
【ＦＩ】
C07K14/505 ZNA
A61P7/06
A61K38/22
C12N15/12
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023171616
(22)【出願日】2023-10-02
(62)【分割の表示】P 2019566794の分割
【原出願日】2018-06-05
(31)【優先権主張番号】62/516,092
(32)【優先日】2017-06-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/516,642
(32)【優先日】2017-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/559,104
(32)【優先日】2017-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516001834
【氏名又は名称】エランコ・ユーエス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｅｌａｎｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ハンチュン
(72)【発明者】
【氏名】グェン， ラム
(72)【発明者】
【氏名】リー， ヨンチョン
(72)【発明者】
【氏名】チュー， チンイー
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア－ムリーリョ， エステラ
(72)【発明者】
【氏名】ライトマン， ヴィクトリア
(72)【発明者】
【氏名】サンドロフ， スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】チン， リチャード
(72)【発明者】
【氏名】リー， シー ジアン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】猫、犬、および馬を含めた伴侶動物における貧血（例えば、非難治性貧血）を治療するために用いられ得る方法および化合物を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドであって、Ｎ結合グリコシル化部位が、アスパラギン－ｘａａ－セリンまたはアスパラギン－ｘａａ－スレオニン配列からなり、式中、ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、いずれのＮ結合グリコシル化部位も、別のＮ結合グリコシル化部位と重複せず、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位のそれぞれが、前記特定のアミノ酸配列の特定の位置に存在するＥＰＯポリペプチド、前記ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物、並びに前記ＥＰＯポリペプチドを非経口的に投与することを含む、治療する方法を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドであって、Ｎ結合グリコシル化部位が、アスパラギン－ｘａａ－セリンまたはアスパラギン－ｘａａ－スレオニン配列からなり、式中、ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、いずれのＮ結合グリコシル化部位も、別のＮ結合グリコシル化部位と重複せず、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位のそれぞれが、前記特定のアミノ酸配列の特定の位置に存在するＥＰＯポリペプチド、前記ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物、並びに前記ＥＰＯポリペプチドを非経口的に投与することを含む、治療する方法を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２または配列番号１３（ただし、配列番号２または配列番号１３には少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位の存在が示されていない）のアミノ酸配列を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドであって、Ｎ結合グリコシル化部位が、アスパラギン－ｘａａ－セリンまたはアスパラギン－ｘａａ－スレオニン配列を含み、式中、ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、いずれのＮ結合グリコシル化部位も、別のＮ結合グリコシル化部位と重複しない、ＥＰＯポリペプチド。
【請求項2】
少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位のそれぞれが、
ａ）配列番号２の位置４７～４９、５５～５７、５６～５８、６０～６２、６１～６３、７９～８１、８２～８４、９１～９３、９２～９４、９７～９９、９８～１００、９９～１０１、１１２～１１４、１１３～１１５、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１３７～１３９、１４０～１４２、１４１～１４３、１４２～１４４、１４３～１４５、１４４～１４６、１４５～１４７、１４６～１４８、１４７～１４９、１４８～１５０、１４９～１５１、１５０～１５２、１６１～１６３、１６２～１６４、１８４～１８６、および１８６～１８８から選択される位置；または
ｂ）配列番号１３の位置２１～２３、２９～３１、３０～３２、３４～３６、３５～３７、５３～５５、５６～５８、６５～６７、６６～６８、７１～７３、７２～７４、７３～７５、８６～８８、８７～８９、８８～９０、８９～９１、９０～９２、１１１～１１３、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１１７～１１９、１１８～１２０、１１９～１２１、１２０～１２２、１２１～１２３、１２２～１２４、１２３～１２５、１２４～１２６、１３５～１３７、１３６～１３８、１５８～１６０、および１６２～１６４から選択される位置
に存在する、請求項１に記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置４７～４９、５５～５７、５６～５８、６０～６２、６１～６３、７９～８１、８２～８４、９１～９３、９２～９４、９７～９９、９８～１００、９９～１０１、１１２～１１４、１１３～１１５、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１３７～１３９、１４０～１４２、１４１～１４３、１４２～１４４、１４３～１４５、１４４～１４６、１４５～１４７、１４６～１４８、１４７～１４９、１４８～１５０、１４９～１５１、１５０～１５２、１６１～１６３、１６２～１６４、１８４～１８６、および１８６～１８８から選択される位置；または
ｂ）配列番号１３の位置２１～２３、２９～３１、３０～３２、３４～３６、３５～３７、５３～５５、５６～５８、６５～６７、６６～６８、７１～７３、７２～７４、７３～７５、８６～８８、８７～８９、８８～９０、８９～９１、９０～９２、１１１～１１３、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１１７～１１９、１１８～１２０、１１９～１２１、１２０～１２２、１２１～１２３、１２２～１２４、１２３～１２５、１２４～１２６、１３５～１３７、１３６～１３８、１５８～１６０、および１６２～１６４から選択される位置
に存在する、請求項１に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項3】
配列番号４の位置１１３に相当する位置にバリンを含む、請求項１または請求項２に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項4】
ａ）配列番号２の位置４７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置４８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置４９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項5】
ａ）配列番号２の位置５５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置５６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置５７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置２９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置２９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項6】
ａ）配列番号２の位置５６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置５７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置５８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置３０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項7】
ａ）配列番号２の位置６０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置６１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置６２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置３４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項8】
ａ）配列番号２の位置６１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置６２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置６３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項9】
ａ）配列番号２の位置７９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置８０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置８１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置５３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置５３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項10】
ａ）配列番号２の位置８２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置８３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置８４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置５６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置５６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項11】
ａ）配列番号２の位置９１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置６５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置６５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項12】
ａ）配列番号２の位置９２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置６６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置６６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項13】
ａ）配列番号２の位置９７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置７１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項14】
ａ）配列番号２の位置９８に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１００に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置７２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項15】
ａ）配列番号２の位置９９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１００に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１０１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置７３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項16】
ａ）配列番号２の位置１１２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置８６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項17】
ａ）配列番号２の位置１１３に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置８７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項18】
ａ）配列番号２の位置１１４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置８８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項19】
ａ）配列番号２の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項20】
ａ）配列番号２の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項21】
ａ）配列番号２の位置１１６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置９０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置９０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項22】
ａ）配列番号２の位置１３７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１３８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１３９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１１１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項23】
ａ）配列番号２の位置１４０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１１４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項24】
ａ）配列番号２の位置１４１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項25】
ａ）配列番号２の位置１４２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１１６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項26】
ａ）配列番号２の位置１４３に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１１７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項27】
ａ）配列番号２の位置１４４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１１８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項28】
ａ）配列番号２の位置１４５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１１９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項29】
ａ）配列番号２の位置１４６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１２０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項30】
ａ）配列番号２の位置１４７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項31】
ａ）配列番号２の位置１４８に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１２２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項32】
ａ）配列番号２の位置１４９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１５０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１２３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項33】
ａ）配列番号２の位置１５０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１５１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１２４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項34】
ａ）配列番号２の位置１６１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項35】
ａ）配列番号２の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項36】
ａ）配列番号２の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項37】
ａ）配列番号２の位置１８４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１８５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１８６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１５８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１５９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１５８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１５９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項38】
ａ）配列番号２の位置１８６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１８７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１８８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項39】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項40】
Ｎ結合グリコシル化部位がアミノ酸誘導体を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項41】
アミノ酸誘導体が、アスパラギン誘導体、セリン誘導体、またはスレオニン誘導体である、請求項４０に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項42】
グリコシル化されている、請求項１～４１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項43】
Ｎ結合グリコシル化部位に結合した少なくとも１つのグリカン部分を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項44】
ＰＥＧ化されている、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項45】
グリカンにおいてＰＥＧ化されている、請求項１～４４のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項46】
第一級アミンにおいてＰＥＧ化されている、請求項１～４５のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項47】
Ｎ末端α－アミンにおいてＰＥＧ化されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項48】
等電点電気泳動法によって決定される、約１～約３．５、約１．５～約３．５、約２～約３．５、約２．５～約３．５、約３～約３．５、約３．５もしくはそれ未満、または約３もしくはそれ未満の等電点の値域を有する、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドを複数含む組成物。
【請求項49】
等電点電気泳動法によって決定される、約３．５～約６、約４～約６、約４．５～約６、約５～約６、約５．５～約６、約３．５～約５、約４～約５、約４．５～約５、約３．５もしくはそれを上回る、約４もしくはそれを上回る、または約４．５もしくはそれを上回る等電点の値域を有する、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドを複数含む組成物。
【請求項50】
請求項４８に記載の組成物および請求項４９に記載の組成物を含む組み合わせ。
【請求項51】
請求項１～４１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項52】
調節配列を含む、請求項５１に記載の核酸。
【請求項53】
調節配列が、構成的プロモーター；テトラサイクリン応答エレメントもしくは低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性調節配列；組織特異的プロモーター；エンハンサー；サイレンサーである；またはマイクロＲＮＡもしくは転写因子をコードする、請求項５２に記載の核酸。
【請求項54】
配列番号２または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＥＰＯポリペプチドと異種調節配列とをコードする単離された核酸であって、異種調節配列が構成的プロモーターではない、核酸。
【請求項55】
異種調節配列が、テトラサイクリン応答エレメントもしくは低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性調節配列；組織特異的プロモーター；エンハンサー；サイレンサーである；またはマイクロＲＮＡもしくは転写因子をコードする、請求項５４に記載の核酸。
【請求項56】
請求項５１～５５のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項57】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターである、請求項５６に記載のベクター。
【請求項58】
レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項５６または請求項５７に記載のベクター。
【請求項59】
請求項１～４１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を含む第１のベクター；および調節配列を含む第２のベクターを含む発現系。
【請求項60】
配列番号２または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を含む第１のベクター；調節配列を含む第２のベクターを含む、発現系。
【請求項61】
調節配列がマイクロＲＮＡまたは転写因子をコードする、請求項５９または請求項６０に記載の発現系。
【請求項62】
第１のベクターおよび／または第２のベクターがウイルスベクターまたは細菌ベクターである、請求項６０または請求項６１に記載の発現系。
【請求項63】
第１のベクターおよび／または第２のベクターが、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項64】
請求項５１～５５のいずれか一項に記載の核酸、請求項５６～５８のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５９～６３のいずれか一項に記載の発現系を含む宿主細胞。
【請求項65】
ＥＰＯポリペプチドを含む組成物を生成する方法であって、請求項６４に記載の宿主細胞を培養することおよびＥＰＯポリペプチドを単離することを含む、方法。
【請求項66】
ＥＰＯポリペプチドがカラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
ＥＰＯポリペプチドがイオン交換カラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項６５または請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
ＥＰＯポリペプチドが、Ｃａｐｔｏブチルカラムクロマトグラフィー、カチオン交換カラムクロマトグラフィー、またはアニオン交換カラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
ＥＰＯポリペプチドが混合モードカラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
ＥＰＯポリペプチドが疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーによって単離される、請求項６５～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
ＥＰＯポリペプチドがクロマトグラフィーカラムの組み合わせによって単離される、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
ウイルスを不活化することおよび／または除去することをさらに含む、請求項６５～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
ＥＰＯポリペプチドは、等電点電気泳動法によって決定される、約１～約３．５、約１．５～約３．５、約２～約３．５、約２．５～約３．５、約３～約３．５、約３．５もしくはそれ未満、または約３もしくはそれ未満の等電点の値域を有する、請求項６５～７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
ＥＰＯポリペプチドは、等電点電気泳動法によって決定される、約３．５～約６、約４～約６、約４．５～約６、約５～約６、約５．５～約６、約３．５～約５、約４～約５、約４．５～約５、約３．５もしくはそれを上回る、約４もしくはそれを上回る、または約４．５もしくはそれを上回る等電点の値域を有する、請求項６５～７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
請求項１～４７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド、請求項４８もしくは４９に記載の組成物、請求項５０に記載の組み合わせ、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の核酸、請求項５６～５８のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５９～６３のいずれか一項に記載の発現系、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項76】
ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体が、ａ）リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート８０；ｂ）リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート２０；ｃ）クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート８０；またはｄ）クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む、薬学的組成物。
【請求項77】
ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体が、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、およびｍ－クレゾールを含む、薬学的組成物。
【請求項78】
ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート２０、およびベンジルアルコールを含む、薬学的組成物。
【請求項79】
塩化ナトリウムの濃度が約１４０ｍＭである、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項80】
リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムの濃度が約２０ｍＭである、請求項７６～７９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項81】
ポリソルベート２０またはポリソルベート８０の濃度が約６５０ｎＭである、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項82】
ｍ－クレゾールの濃度が約０．２％である、請求項７７または７９～８１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項83】
ベンジルアルコールの濃度が約１％である、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項84】
薬学的に許容される担体が、
ａ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート８０、または
ｂ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート２０
を含む、請求項７６～８３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
ａ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート８０、または
ｂ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート２０
を含む、請求項７６～８３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項85】
薬学的に許容される担体が、約２０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム、約１４０ｎＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート８０、および約０．２％の濃度のｍ－クレゾールを含む、請求項７６～８４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項86】
薬学的に許容される担体が、約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｎＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート２０、および約１％の濃度のベンジルアルコールを含む、請求項７６～８５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項87】
ＥＰＯポリペプチドが、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド、請求項４８もしくは請求項４９に記載の組成物、または請求項５０に記載の組み合わせである、請求項７６～８６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項88】
伴侶動物種にＥＰＯポリペプチドを送達する方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド、請求項４８もしくは４９に記載の組成物、請求項５０に記載の組み合わせ、または請求項７５もしくは請求項８７に記載の薬学的組成物を非経口的に投与することを含む、方法。
【請求項89】
伴侶動物種にＥＰＯポリペプチドを送達する方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド、請求項４８もしくは４９に記載の組成物、請求項５０に記載の組み合わせ、または請求項７５もしくは請求項８７に記載の薬学的組成物を、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路または吸入経路で投与することを含む、方法。
【請求項90】
伴侶動物種にＥＰＯポリペプチドをコードする単離された核酸を送達する方法であって、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の核酸、請求項５６～５８のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５９～６３のいずれか一項に記載の発現系を非経口的に投与することを含む、方法。
【請求項91】
貧血を有する伴侶動物種を治療する方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド、請求項４８もしくは４９に記載の組成物、請求項５０に記載の組み合わせ、または請求項７５もしくは請求項８７に記載の薬学的組成物の治療的有効量を前記伴侶動物種に投与することを含む、方法。
【請求項92】
貧血を有する伴侶動物種を治療する方法であって、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の核酸、請求項５６～５８のいずれか一項に記載のベクター、または請求項５９～６３のいずれか一項に記載の発現系の治療的有効量を前記伴侶動物種に投与することを含む、方法。
【請求項93】
ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物が非経口的に投与される、請求項９１または請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物が、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路または吸入経路で投与される、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
伴侶動物種が、ネコ、イヌまたはウマである、請求項８８～９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項96】
貧血が、慢性腎臓疾患、炎症性腸疾患または脊髄形成異常症によって引き起こされる、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項97】
ＥＰＯポリペプチドが、約１μｇ／ｋｇ体重～約１０μｇ／ｋｇ体重、または約１μｇ／ｋｇ体重～約５μｇ／ｋｇ体重、または約１μｇ／ｋｇ体重、または約３μｇ／ｋｇ体重、または約５μｇ／ｋｇ体重、または約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される、請求項８８～９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項98】
ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物が７～１０日ごとに投与される、請求項８８～９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項99】
鉄デキストランを投与することを含む、請求項８８～９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項100】
伴侶動物種が、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物の投与前に、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約１５％を下回る、約１８％を下回る、約２０％を下回る、約２５％を下回る、約２９％を下回る、または約３０％を下回るベースラインヘマトクリットパーセンテージを有する、請求項８８～９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項101】
伴侶動物種のヘマトクリットパーセンテージが、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物の投与後に、少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３２％、または少なくとも３５％、または少なくとも３８％、または少なくとも４０％、または少なくとも４２％、または少なくとも４５％、または少なくとも４８％まで上昇する、請求項８８～１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項102】
伴侶動物種のヘマトクリットパーセンテージが、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物の最初の投与の１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間後の時点で、少なくとも２５％、または少なくとも２７％、または少なくとも３０％、または少なくとも３２％、または少なくとも３５％まで上昇する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
伴侶動物種の体重が、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物の投与後に、ベースラインと比較して維持されるかまたは増加する、請求項８８～１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項104】
伴侶動物種の体重が、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物の最初の投与の１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間後の時点で維持されるかまたは増加する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項105】
対称性ジメチルアルギニンまたは血清クレアチン腎臓バイオマーカーのレベルが、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系または薬学的組成物の投与後に、ベースラインと比較して低下する、請求項８８～１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項106】
標的細胞においてＥＰＯポリペプチドを発現させる方法であって、
ａ）核酸、ベクターまたは発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクターまたは発現系が、
ｉ）請求項１～４１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む、方法。
ａ）核酸、ベクターまたは発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクターまたは発現系が、
ｉ）請求項１～４１のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項107】
標的細胞においてＥＰＯポリペプチドを発現させる方法であって、
ａ）核酸、ベクターまたは発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクターまたは発現系が、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドまたは配列番号１３のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）構成的プロモーターではない調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む、方法。
ａ）核酸、ベクターまたは発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクターまたは発現系が、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドまたは配列番号１３のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）構成的プロモーターではない調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項108】
調節配列が、テトラサイクリン応答エレメントもしくは低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性調節配列；組織特異的プロモーター；エンハンサー；サイレンサーである；またはマイクロＲＮＡもしくは転写因子をコードする、請求項１０６または請求項１０７に記載の方法。
【請求項109】
ベクターがウイルスベクターまたは細菌ベクターである、請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項110】
ベクターが、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターである、請求項１０６～１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項111】
細胞が伴侶動物種の細胞である、請求項１０６～１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項112】
細胞が生きた伴侶動物種の中に位置する、請求項１０６～１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項113】
伴侶動物種がイヌ、ネコまたはウマである、請求項１１１または請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
ａ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｂ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号９の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｃ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１０の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｄ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１１の少なくとも１つのアミノ酸置換；または
ｅ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１２の少なくとも１つのアミノ酸置換
を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
ｂ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号９の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｃ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１０の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｄ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１１の少なくとも１つのアミノ酸置換；または
ｅ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１２の少なくとも１つのアミノ酸置換
を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【請求項115】
少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ）配列番号１３の位置１０３に相当する位置における置換；
ｂ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号９の置換；
ｃ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１０の置換；
ｄ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１１の置換；または
ｅ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１２の置換
である、請求項１１４に記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号１３の位置１０３に相当する位置における置換；
ｂ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号９の置換；
ｃ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１０の置換；
ｄ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１１の置換；または
ｅ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１２の置換
である、請求項１１４に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項116】
配列番号１３の位置１０３に相当する位置でアラニンが置換されている、請求項１１４または１１５に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項117】
少なくとも１つのアミノ酸置換がアミノ酸誘導体での置換を含む、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項118】
ＥＰＯポリペプチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１１４～１１７のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項119】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項120】
請求項１１４～１１９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項121】
請求項１２０に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項122】
ＥＰＯポリペプチドを含む組成物を生成する方法であって、請求項１２１に記載の宿主細胞を培養することおよびＥＰＯポリペプチドを単離することを含む、方法。
【請求項123】
請求項１１４～１１９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項124】
ＥＰＯポリペプチドが、請求項１１４～１１９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチドである、請求項７６～８６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項125】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１のアミノ酸配列；および異種ポリペプチド配列を含むネコエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）ポリペプチドの細胞外ドメインを含むポリペプチド。
【請求項126】
配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１のアミノ酸配列；および異種ポリペプチド配列を含むポリペプチド。
【請求項127】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１２５または請求項１２６に記載のポリペプチド。
【請求項128】
請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項129】
請求項１２８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項130】
請求項１２９に記載の宿主細胞を培養することおよびポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドを生成する方法。
【請求項131】
請求項１２６～１２７のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項132】
多血症を有する対象を治療する方法であって、請求項１１４～１１９のいずれか一項に記載のＥＰＯポリペプチド、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１２０もしくは請求項１２８に記載の核酸、または請求項１２３、請求項１２４もしくは請求項１３１に記載の薬学的組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項133】
ＥＰＯポリペプチド、ポリペプチド、核酸または薬学的組成物が非経口的に投与される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項134】
ＥＰＯポリペプチド、ポリペプチド、核酸または薬学的組成物が、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路または吸入経路で投与される、請求項１３２または請求項１３３に記載の方法。
【請求項135】
対象が伴侶動物種である、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項136】
伴侶動物種がネコ、イヌまたはウマである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項137】
対象がヒトである、請求項１３２～１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項138】
多血症が、ＪＡＫ２における変異、腫瘍からのＥＰＯの過剰生成および／または分泌によって引き起こされる、請求項１３２～１３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月６日に出願した米国仮出願第６２／５１６，０９２号；２０１７年６月７日に出願した第６２／５１６，６４２号；および２０１７年９月１５日に出願した第６２／５５９，１０４号に対する優先権の恩典を主張するものであり、そのそれぞれはいかなる目的に対しても参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年６月６日に出願した米国仮出願第６２／５１６，０９２号；２０１７年６月７日に出願した第６２／５１６，６４２号；および２０１７年９月１５日に出願した第６２／５５９，１０４号に対する優先権の恩典を主張するものであり、そのそれぞれはいかなる目的に対しても参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、例えばイヌ、ネコ、およびウマなどの伴侶動物における貧血を治療するための、増強した薬物動態を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドアナログ、ならびにそれを生成するおよび使用する方法に関する。本開示は、例えばヒトおよび伴侶動物を含めた哺乳動物におけるＥＰＯの過剰生成を治療するための、第２の結合部位に変異を有するＥＰＯポリペプチドおよびそれを使用する方法にも関する。本開示は、例えばＥＰＯポリペプチドのコントロールまたは誘導された発現のための、ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、ベクター、および発現系、ならびにそれを使用する方法（例えば、遺伝子療法の方法）に関する。本開示は、さらに、本明細書において記載されるＥＰＯポリペプチドを含めたＥＰＯポリペプチドに対する製剤に関する。本開示は、例えばヒトおよび伴侶動物を含めた任意の哺乳動物におけるＥＰＯの過剰生成を治療するための、ＥＰＯ受容体の細胞外ドメインを含むポリペプチドおよびそれを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【0003】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、ヘマトポエチン（ｈｅｍａｔｏｐｏｅｉｔｉｎ）またはヘモポエチンとしても知られ、エリスロポエシス（すなわち、赤血球生成）を刺激し得る糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、慢性腎臓疾患、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性結腸炎）、ならびに化学療法および放射線療法により生じる脊髄形成異常症により生じる貧血を治療するために用いられる。これらのヒト障害は、組み換えＥＰＯ分子（例えば、ダルベポエチン（Ａｒａｎｅｓｐ（商標）およびＥｐｏｇｅｎ（商標）、Ａｍｇｅｎ）およびＤｙｎｅｐｏ（商標）、Ｓｈｉｒｅ）で治療されることもある。
【0004】
伴侶動物は、自己免疫疾患およびがんを含めたヒト疾患と類似している多くの疾患に罹患する。伴侶動物疾患を治療するためにヒトタンパク質が用いられているものの、ヒト由来アミノ酸配列の相当の含有量を有するタンパク質は、治療される動物にとって免疫原性であり得ることが理解される。ヒト薬物が伴侶動物において免疫応答を誘発する場合、それは有効でない可能性がある。Ｍａｕｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｇ．２０１０，２１（４）：３７３－３８２を参照されたい。
【0005】
猫における貧血は、現在、Ｅｐｏｇｅｎ（商標）またはＡｒａｎｅｓｐ（商標）などのヒトエリスロポエチン薬を投与することによって治療されている。しかしながら、ヒトＥＰＯ薬は、猫に投与された場合に免疫原性応答を誘発（ｉｌｌｉｃｉｔ）し得る可能性が高い。加えて、ヒトＥＰＯ薬は、それがヒトにおいてそうであるのと同等に有益な治療効果を伴侶動物において提供する様式では伴侶動物ＥＰＯ受容体に結合しない可能性がある。
【0006】
それゆえ、猫、犬、および馬を含めた伴侶動物における貧血（例えば、非難治性貧血）を治療するために用いられ得る方法および化合物に対する満たされていない必要性が残る。理想的には、そのような化合物は、ＥＰＯ受容体に特異的に結合しかつ療法が実践可能である程度に十分に長い血漿中半減期を有するが、種特異的でありかつ免疫原性がそれほど高くないものであろう。伴侶動物における貧血の治療のための、増強した薬物動態を有するネコＥＰＯポリペプチドを含めたＥＰＯポリペプチド、およびそうしたＥＰＯポリペプチドまたはそうしたＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を投与する方法が本明細書において記載される。
【0007】
ＥＰＯの過剰生成も問題である。例えば、腫瘍（例えば、腎臓腫瘍）からのＥＰＯの過剰生成および／もしくは分泌によって、ＪＡＫ２における非活性化変異によって、またはＥＰＯの過剰生成をもたらす遺伝性調節異常によって、多血症が引き起こされ得る。哺乳動物における多血症の治療のための、第２の結合部位に変異を有するＥＰＯポリペプチド、およびそうしたＥＰＯポリペプチドまたはそうしたＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を投与する方法も本明細書において記載される。また、哺乳動物における多血症の治療のための、ネコＥＰＯ受容体の細胞外ドメインを含むポリペプチド、およびそうしたポリペプチドまたはそうしたＥＰＯＲポリペプチドをコードする核酸を投与する方法も本明細書において記載される。
【発明の概要】
【0008】
実施形態１．配列番号２または配列番号１３（ただし、配列番号２または配列番号１３には少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位の存在が示されていない）のアミノ酸配列を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドであって、Ｎ結合グリコシル化部位は、アスパラギン－ｘａａ－セリンまたはアスパラギン－ｘａａ－スレオニン配列を含み、式中、ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、いずれのＮ結合グリコシル化部位も、別のＮ結合グリコシル化部位と重複しない、ＥＰＯポリペプチド。
【0009】
実施形態２．少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位のそれぞれは、
ａ）配列番号２の位置４７～４９、５５～５７、５６～５８、６０～６２、６１～６３、７９～８１、８２～８４、９１～９３、９２～９４、９７～９９、９８～１００、９９～１０１、１１２～１１４、１１３～１１５、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１３７～１３９、１４０～１４２、１４１～１４３、１４２～１４４、１４３～１４５、１４４～１４６、１４５～１４７、１４６～１４８、１４７～１４９、１４８～１５０、１４９～１５１、１５０～１５２、１６１～１６３、１６２～１６４、１８４～１８６、および１８６～１８８から選択される位置；または
ｂ）配列番号１３の位置２１～２３、２９～３１、３０～３２、３４～３６、３５～３７、５３～５５、５６～５８、６５～６７、６６～６８、７１～７３、７２～７４、７３～７５、８６～８８、８７～８９、８８～９０、８９～９１、９０～９２、１１１～１１３、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１１７～１１９、１１８～１２０、１１９～１２１、１２０～１２２、１２１～１２３、１２２～１２４、１２３～１２５、１２４～１２６、１３５～１３７、１３６～１３８、１５８～１６０、および１６２～１６４から選択される位置
に存在する、実施形態１に記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置４７～４９、５５～５７、５６～５８、６０～６２、６１～６３、７９～８１、８２～８４、９１～９３、９２～９４、９７～９９、９８～１００、９９～１０１、１１２～１１４、１１３～１１５、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１３７～１３９、１４０～１４２、１４１～１４３、１４２～１４４、１４３～１４５、１４４～１４６、１４５～１４７、１４６～１４８、１４７～１４９、１４８～１５０、１４９～１５１、１５０～１５２、１６１～１６３、１６２～１６４、１８４～１８６、および１８６～１８８から選択される位置；または
ｂ）配列番号１３の位置２１～２３、２９～３１、３０～３２、３４～３６、３５～３７、５３～５５、５６～５８、６５～６７、６６～６８、７１～７３、７２～７４、７３～７５、８６～８８、８７～８９、８８～９０、８９～９１、９０～９２、１１１～１１３、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１１７～１１９、１１８～１２０、１１９～１２１、１２０～１２２、１２１～１２３、１２２～１２４、１２３～１２５、１２４～１２６、１３５～１３７、１３６～１３８、１５８～１６０、および１６２～１６４から選択される位置
に存在する、実施形態１に記載のＥＰＯポリペプチド。
【0010】
実施形態３．配列番号４の位置１１３に相当する位置にバリンを含む、実施形態１または実施形態２に記載のＥＰＯポリペプチド。
【0011】
実施形態４．
ａ）配列番号２の位置４７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置４８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置４９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置４７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置４８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置４９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0012】
実施形態５．
ａ）配列番号２の位置５５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置５６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置５７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置２９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置５５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置５６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置５７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置２９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0013】
実施形態６．
ａ）配列番号２の位置５６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置５７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置５８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置５６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置５７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置５８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0014】
実施形態７．
ａ）配列番号２の位置６０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置６１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置６２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置６０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置６１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置６２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0015】
実施形態８．
ａ）配列番号２の位置６１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置６２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置６３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置６１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置６２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置６３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0016】
実施形態９．
ａ）配列番号２の位置７９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置８０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置８１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置５３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置７９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置８０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置８１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置５３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0017】
実施形態１０．
ａ）配列番号２の位置８２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置８３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置８４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置５６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置８２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置８３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置８４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置５６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置５７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置５８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0018】
実施形態１１．
ａ）配列番号２の位置９１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置６５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１０のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置９１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置６５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１０のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0019】
実施形態１２．
ａ）配列番号２の位置９２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置６６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置９２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置６６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置６７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置６８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0020】
実施形態１３．
ａ）配列番号２の位置９７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置９７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置９９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0021】
実施形態１４．
ａ）配列番号２の位置９８に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１００に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１３のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置９８に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置９９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１００に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１３のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0022】
実施形態１５．
ａ）配列番号２の位置９９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１００に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１０１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置９９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１００に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１０１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置７３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置７４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置７５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0023】
実施形態１６．
ａ）配列番号２の位置１１２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１１２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0024】
実施形態１７．
ａ）配列番号２の位置１１３に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１１３に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置８９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0025】
実施形態１８．
ａ）配列番号２の位置１１４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１１４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置８９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0026】
実施形態１９．
ａ）配列番号２の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１８のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１８のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0027】
実施形態２０．
ａ）配列番号２の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置８９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0028】
実施形態２１．
ａ）配列番号２の位置１１６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置９０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２０のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１１６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１１７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１１８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置９０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置９１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置９２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２０のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0029】
実施形態２２．
ａ）配列番号２の位置１３７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１３８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１３９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１３７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１３８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１３９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0030】
実施形態２３．
ａ）配列番号２の位置１４０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２２のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２２のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0031】
実施形態２４．
ａ）配列番号２の位置１４１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２３のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２３のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0032】
実施形態２５．
ａ）配列番号２の位置１４２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0033】
実施形態２６．
ａ）配列番号２の位置１４３に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４３に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１７に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１１９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0034】
実施形態２７．
ａ）配列番号２の位置１４４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１１９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0035】
実施形態２８．
ａ）配列番号２の位置１４５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４５に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１１９に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0036】
実施形態２９．
ａ）配列番号２の位置１４６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２８のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２０に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２８のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0037】
実施形態３０．
ａ）配列番号２の位置１４７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４７に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４８に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１４９に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２１に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～２９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0038】
実施形態３１．
ａ）配列番号２の位置１４８に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３０のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４８に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１４９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３０のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0039】
実施形態３２．
ａ）配列番号２の位置１４９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１５０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１４９に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１５０に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５１に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２３に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２４に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２５に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0040】
実施形態３３．
ａ）配列番号２の位置１５０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１５１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３２のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１５０に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１５１に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１５２に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１２４に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１２５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１２６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３２のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0041】
実施形態３４．
ａ）配列番号２の位置１６１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３３のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１６１に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６２に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６３に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３５に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３６に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３７に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３３のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0042】
実施形態３５．
ａ）配列番号２の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0043】
実施形態３６．
ａ）配列番号２の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１３６に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１３７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１３８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0044】
実施形態３７．
ａ）配列番号２の位置１８４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１８５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１８６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１５８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１５９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１８４に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１８５に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１８６に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１５８に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１５９に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６０に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0045】
実施形態３８．
ａ）配列番号２の位置１８６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１８７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１８８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号２の位置１８６に相当する位置にアスパラギン、配列番号２の位置１８７に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号２の位置１８８に相当する位置にセリンもしくはスレオニン；または
ｂ）配列番号１３の位置１６２に相当する位置にアスパラギン、配列番号１３の位置１６３に相当する位置にプロリン以外の任意のアミノ酸、および配列番号１３の位置１６４に相当する位置にセリンもしくはスレオニン
を含む、実施形態１～３７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0046】
実施形態３９．配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３８のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0047】
実施形態４０．Ｎ結合グリコシル化部位はアミノ酸誘導体を含む、実施形態１～３９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0048】
実施形態４１．アミノ酸誘導体は、アスパラギン誘導体、セリン誘導体、またはスレオニン誘導体である、実施形態４０に記載のＥＰＯポリペプチド。
【0049】
実施形態４２．グリコシル化されている、実施形態１～４１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0050】
実施形態４３．Ｎ結合グリコシル化部位に結合した少なくとも１つのグリカン部分を含む、実施形態１～４２のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0051】
実施形態４４．ＰＥＧ化されている、実施形態１～４３のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0052】
実施形態４５．グリカンにおいてＰＥＧ化されている、実施形態１～４４のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0053】
実施形態４６．第一級アミンにおいてＰＥＧ化されている、実施形態１～４５のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0054】
実施形態４７．Ｎ末端α－アミンにおいてＰＥＧ化されている、実施形態１～４６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0055】
実施形態４８．等電点電気泳動法によって決定される、約１～約３．５、約１．５～約３．５、約２～約３．５、約２．５～約３．５、約３～約３．５、約３．５もしくはそれ未満、または約３もしくはそれ未満の等電点の値域を有する、実施形態１～４７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドを複数含む組成物。
【0056】
実施形態４９．等電点電気泳動法によって決定される、約３．５～約６、約４～約６、約４．５～約６、約５～約６、約５．５～約６、約３．５～約５、約４～約５、約４．５～約５、約３．５もしくはそれを上回る、約４もしくはそれを上回る、または約４．５もしくはそれを上回る等電点の値域を有する、実施形態１～４７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドを複数含む組成物。
【0057】
実施形態５０．実施形態４８に記載の組成物および実施形態４９に記載の組成物を含む組み合わせ。
【0058】
実施形態５１．実施形態１～４１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドをコードする単離された核酸。
【0059】
実施形態５２．調節配列を含む、実施形態５１に記載の核酸。
【0060】
実施形態５３．調節配列は、構成的プロモーター；テトラサイクリン応答エレメントもしくは低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性調節配列；組織特異的プロモーター；エンハンサー；サイレンサーである；またはマイクロＲＮＡもしくは転写因子をコードする、実施形態５２に記載の核酸。
【0061】
実施形態５４．配列番号２または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＥＰＯポリペプチド；および異種調節配列をコードする単離された核酸であって、異種調節配列は構成的プロモーターではない、核酸。
【0062】
実施形態５５．異種調節配列は、テトラサイクリン応答エレメントもしくは低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性調節配列；組織特異的プロモーター；エンハンサー；サイレンサーである；またはマイクロＲＮＡもしくは転写因子をコードする、実施形態５４に記載の核酸。
【0063】
実施形態５６．実施形態５１～５５のいずれか一つに記載の核酸を含むベクター。
【0064】
実施形態５７．ウイルスベクターまたは細菌ベクターである、実施形態５６に記載のベクター。
【0065】
実施形態５８．レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、実施形態５６または実施形態５７に記載のベクター。
【0066】
実施形態５９．実施形態１～４１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を含む第１のベクター；および調節配列を含む第２のベクターを含む発現系。
【0067】
実施形態６０．配列番号２または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を含む第１のベクター；および調節配列を含む第２のベクターを含む発現系。
【0068】
実施形態６１．調節配列はマイクロＲＮＡまたは転写因子をコードする、実施形態５９または実施形態６０に記載の発現系。
【0069】
実施形態６２．第１のベクターおよび／または第２のベクターはウイルスベクターまたは細菌ベクターである、実施形態６０または実施形態６１に記載の発現系。
【0070】
実施形態６３．第１のベクターおよび／または第２のベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、実施形態６０～６２のいずれか一つに記載の発現系。
【0071】
実施形態６４．実施形態５１～５５のいずれか一つに記載の核酸、実施形態５６～５８のいずれか一つに記載のベクター、または実施形態５９～６３のいずれか一つに記載の発現系を含む宿主細胞。
【0072】
実施形態６５．ＥＰＯポリペプチドを含む組成物を生成する方法であって、実施形態６４に記載の宿主細胞を培養することおよびＥＰＯポリペプチドを単離することを含む方法。
【0073】
実施形態６６．ＥＰＯポリペプチドはカラムクロマトグラフィーによって単離される、実施形態６５に記載の方法。
【0074】
実施形態６７．ＥＰＯポリペプチドはイオン交換カラムクロマトグラフィーによって単離される、実施形態６５または実施形態６６に記載の方法。
【0075】
実施形態６８．ＥＰＯポリペプチドは、Ｃａｐｔｏブチルカラムクロマトグラフィー、カチオン交換カラムクロマトグラフィー、またはアニオン交換カラムクロマトグラフィーによって単離される、実施形態６５～６７のいずれか一つに記載の方法。
【0076】
実施形態６９．ＥＰＯポリペプチドは混合モードカラムクロマトグラフィーによって単離される、実施形態６５～６８のいずれか一つに記載の方法。
【0077】
実施形態７０．ＥＰＯポリペプチドは疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーによって単離される、実施形態６５～６９のいずれか一つに記載の方法。
【0078】
実施形態７１．ＥＰＯポリペプチドはクロマトグラフィーカラムの組み合わせによって単離される、実施形態６５～７０のいずれか一つに記載の方法。
【0079】
実施形態７２．ウイルスを不活化することおよび／または除去することをさらに含む、実施形態６５～７１のいずれか一つに記載の方法。
【0080】
実施形態７３．ＥＰＯポリペプチドは、等電点電気泳動法によって決定される、約１～約３．５、約１．５～約３．５、約２～約３．５、約２．５～約３．５、約３～約３．５、約３．５もしくはそれ未満、または約３もしくはそれ未満の等電点の値域を有する、実施形態６５～７２のいずれか一つに記載の方法。
【0081】
実施形態７４．ＥＰＯポリペプチドは、等電点電気泳動法によって決定される、約３．５～約６、約４～約６、約４．５～約６、約５～約６、約５．５～約６、約３．５～約５、約４～約５、約４．５～約５、約３．５もしくはそれを上回る、約４もしくはそれを上回る、または約４．５もしくはそれを上回る等電点の値域を有する、実施形態６５～７２のいずれか一つに記載の方法。
【0082】
実施形態７５．実施形態１～４７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態４８もしくは４９に記載の組成物、実施形態５０に記載の組み合わせ、実施形態５１～５５のいずれか一つに記載の核酸、実施形態５６～５８のいずれか一つに記載のベクター、または実施形態５９～６３のいずれか一つに記載の発現系；および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【0083】
実施形態７６．ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体は、ａ）リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート８０；ｂ）リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート２０；ｃ）クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート８０；またはｄ）クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む、薬学的組成物。
【0084】
実施形態７７．ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、およびｍ－クレゾールを含む、薬学的組成物。
【0085】
実施形態７８．ＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート２０、およびベンジルアルコールを含む、薬学的組成物。
【0086】
実施形態７９．塩化ナトリウムの濃度は約１４０ｍＭである、実施形態７６～７８のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0087】
実施形態８０．リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムの濃度は約２０ｍＭである、実施形態７６～７９のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0088】
実施形態８１．ポリソルベート２０またはポリソルベート８０の濃度は約６５０ｎＭである、実施形態７６～８０のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0089】
実施形態８２．ｍ－クレゾールの濃度は約０．２％である、実施形態７７または７９～８１のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0090】
実施形態８３．ベンジルアルコールの濃度は約１％である、実施形態７８～８２のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0091】
実施形態８４．薬学的に許容される担体は、
ａ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート８０、または
ｂ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート２０
を含む、実施形態７６～８３のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
ａ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート８０、または
ｂ）約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート２０
を含む、実施形態７６～８３のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0092】
実施形態８５．薬学的に許容される担体は、約２０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム、約１４０ｎＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート８０、および約０．２％の濃度のｍ－クレゾールを含む、実施形態７６～８４のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0093】
実施形態８６．薬学的に許容される担体は、約２０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、約１４０ｎＭの濃度の塩化ナトリウム、約６５０ｎＭの濃度のポリソルベート２０、および約１％の濃度のベンジルアルコールを含む、実施形態７６～８５のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0094】
実施形態８７．ＥＰＯポリペプチドは、実施形態１～４７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態４８もしくは実施形態４９に記載の組成物、または実施形態５０に記載の組み合わせである、実施形態７６～８６のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0095】
実施形態８８．伴侶動物種にＥＰＯポリペプチドを送達する方法であって、実施形態１～４７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態４８もしくは４９に記載の組成物、実施形態５０に記載の組み合わせ、または実施形態７５もしくは実施形態８７に記載の薬学的組成物を非経口的に投与することを含む方法。
【0096】
実施形態８９．伴侶動物種にＥＰＯポリペプチドを送達する方法であって、実施形態１～４７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態４８もしくは４９に記載の組成物、実施形態５０に記載の組み合わせ、または実施形態７５もしくは実施形態８７に記載の薬学的組成物を、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路、または吸入経路によって投与することを含む方法。
【0097】
実施形態９０．伴侶動物種にＥＰＯポリペプチドをコードする単離された核酸を送達する方法であって、実施形態５１～５５のいずれか一つに記載の核酸、実施形態５６～５８のいずれか一つに記載のベクター、または請求項５９～６３のいずれか一つに記載の発現系を非経口的に投与することを含む方法。
【0098】
実施形態９１．貧血を有する伴侶動物種を治療する方法であって、実施形態１～４７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態４８もしくは４９に記載の組成物、実施形態５０に記載の組み合わせ、または実施形態７５もしくは実施形態８７に記載の薬学的組成物の治療的有効量を伴侶動物種に投与することを含む方法。
【0099】
実施形態９２．貧血を有する伴侶動物種を治療する方法であって、実施形態５１～５５のいずれか一つに記載の核酸、実施形態５６～５８のいずれか一つに記載のベクター、または実施形態５９～６３のいずれか一つに記載の発現系の治療的有効量を伴侶動物種に投与することを含む方法。
【0100】
実施形態９３．ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物は非経口的に投与される、実施形態９１または実施形態９２に記載の方法。
【0101】
実施形態９４．ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物は、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路、または吸入経路によって投与される、実施形態９１～９３のいずれか一つに記載の方法。
【0102】
実施形態９５．伴侶動物種は、ネコ、イヌ、またはウマである、実施形態８８～９４のいずれか一つに記載の方法。
【0103】
実施形態９６．貧血は、慢性腎臓疾患、炎症性腸疾患、または脊髄形成異常症によって引き起こされる、実施形態９１～９５のいずれか一つに記載の方法。
【0104】
実施形態９７．ＥＰＯポリペプチドは、約１μｇ／ｋｇ体重～約１０μｇ／ｋｇ体重、または約１μｇ／ｋｇ体重～約５μｇ／ｋｇ体重、または約１μｇ／ｋｇ体重、または約３μｇ／ｋｇ体重、または約５μｇ／ｋｇ体重、または約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与される、実施形態８８～９６のいずれか一つに記載の方法。
【0105】
実施形態９８．ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物は７～１０日ごとに投与される、実施形態８８～９７のいずれか一つに記載の方法。
【0106】
実施形態９９．鉄デキストランを投与することをさらに含む、実施形態８８～９８のいずれか一つに記載の方法。
【0107】
実施形態１００．伴侶動物種は、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物の投与前に、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約１５％を下回る、約１８％を下回る、約２０％を下回る、約２５％を下回る、約２９％を下回る、または約３０％を下回るベースラインヘマトクリットパーセンテージを有する、実施形態８８～９９のいずれか一つに記載の方法。
【0108】
実施形態１０１．伴侶動物種のヘマトクリットパーセンテージは、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物の投与後に、少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３２％、または少なくとも３５％、または少なくとも３８％、または少なくとも４０％、または少なくとも４２％、または少なくとも４５％、または少なくとも４８％まで増加する、実施形態８８～１００のいずれか一つに記載の方法。
【0109】
実施形態１０２．伴侶動物種のヘマトクリットパーセンテージは、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物の最初の投与の１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間後の時点で、少なくとも２５％、または少なくとも２７％、または少なくとも３０％、または少なくとも３２％、または少なくとも３５％まで増加する、実施形態１０１に記載の方法。
【0110】
実施形態１０３．伴侶動物種の体重は、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物の投与後に、ベースラインと比較して維持されるまたは増加する、実施形態８８～１０２のいずれか一つに記載の方法。
【0111】
実施形態１０４．伴侶動物種の体重は、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物の最初の投与の１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間後の時点で維持されるまたは増加する、実施形態１０３に記載の方法。
【0112】
実施形態１０５．対称性ジメチルアルギニンまたは血清クレアチン腎臓バイオマーカーのレベルは、ＥＰＯポリペプチド、組成物、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物の投与後に、ベースラインと比較して減少する、実施形態８８～１０４のいずれか一つに記載の方法。
【0113】
実施形態１０６．標的細胞においてＥＰＯポリペプチドを発現させる方法であって、
ａ）核酸、ベクター、または発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクター、または発現系は、
ｉ）実施形態１～４１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む、標的細胞においてＥＰＯポリペプチドを発現させる方法。
ａ）核酸、ベクター、または発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクター、または発現系は、
ｉ）実施形態１～４１のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む、標的細胞においてＥＰＯポリペプチドを発現させる方法。
【0114】
実施形態１０７．標的細胞においてＥＰＯポリペプチドを発現させる方法であって、
ａ）核酸、ベクター、または発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクター、または発現系は、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドまたは配列番号１３のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）構成的プロモーターではない調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む方法。
ａ）核酸、ベクター、または発現系を標的細胞内に移入することであって、核酸、ベクター、または発現系は、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドまたは配列番号１３のアミノ酸配列を有するＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、および
ｉｉ）構成的プロモーターではない調節配列
を含む、移入すること；ならびに
ｂ）ＥＰＯポリペプチドの発現を助ける条件下で細胞を培養すること
を含む方法。
【0115】
実施形態１０８．調節配列は、テトラサイクリン応答エレメントもしくは低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性調節配列；組織特異的プロモーター；エンハンサー；サイレンサーである；またはマイクロＲＮＡもしくは転写因子をコードする、実施形態１０６または実施形態１０７に記載の方法。
【0116】
実施形態１０９．ベクターはウイルスベクターまたは細菌ベクターである、実施形態１０６～１０８のいずれか一つに記載の方法。
【0117】
実施形態１１０．ベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、実施形態１０６～１０９のいずれか一つに記載の方法。
【0118】
実施形態１１１．細胞は伴侶動物種の細胞である、実施形態１０６～１１０のいずれか一つに記載の方法。
【0119】
実施形態１１２．細胞は生きた伴侶動物種の中に位置する、実施形態１０６～１１１のいずれか一つに記載の方法。
【0120】
実施形態１１３．伴侶動物種は、イヌ、ネコ、またはウマである、実施形態１１１または実施形態１１２に記載の方法。
【0121】
実施形態１１４．
ａ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｂ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号９の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｃ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１０の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｄ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１１の少なくとも１つのアミノ酸置換；または
ｅ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１２の少なくとも１つのアミノ酸置換
を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
ａ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｂ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号９の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｃ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１０の少なくとも１つのアミノ酸置換；
ｄ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１１の少なくとも１つのアミノ酸置換；または
ｅ）配列番号１３の位置５、８、１０、１１、１４、１５、７８、９６、９７、９９、１００、１０３、１０４、１０７、１０８、もしくは１１０から選択される位置に相当する、配列番号１２の少なくとも１つのアミノ酸置換
を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド。
【0122】
実施形態１１５．少なくとも１つのアミノ酸置換は、
ａ）配列番号１３の位置１０３に相当する位置における置換；
ｂ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号９の置換；
ｃ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１０の置換；
ｄ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１１の置換；または
ｅ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１２の置換
である、実施形態１１４に記載のＥＰＯポリペプチド。
ａ）配列番号１３の位置１０３に相当する位置における置換；
ｂ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号９の置換；
ｃ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１０の置換；
ｄ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１１の置換；または
ｅ）配列番号１３の位置１０３に相当する、配列番号１２の置換
である、実施形態１１４に記載のＥＰＯポリペプチド。
【0123】
実施形態１１６．配列番号１３の位置１０３に相当する位置でアラニンが置換されている、実施形態１１４または１１５に記載のＥＰＯポリペプチド。
【0124】
実施形態１１７．少なくとも１つのアミノ酸置換はアミノ酸誘導体での置換を含む、実施形態１１４～１１６のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0125】
実施形態１１８．ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列を含む、実施形態１１４～１１７のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド。
【0126】
実施形態１１９．配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【0127】
実施形態１２０．実施形態１１４～１１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドをコードする単離された核酸。
【0128】
実施形態１２１．実施形態１２０に記載の核酸を含む宿主細胞。
【0129】
実施形態１２２．ＥＰＯポリペプチドを含む組成物を生成する方法であって、実施形態１２１に記載の宿主細胞を培養することおよびＥＰＯポリペプチドを単離することを含む方法。
【0130】
実施形態１２３．実施形態１１４～１１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【0131】
実施形態１２４．ＥＰＯポリペプチドは、実施形態１１４～１１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチドである、実施形態７６～８６のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【0132】
実施形態１２５．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２のアミノ酸配列；および異種ポリペプチド配列を含むネコエリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）ポリペプチドの細胞外ドメインを含むポリペプチド。
【0133】
実施形態１２６．配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２のアミノ酸配列；および異種ポリペプチド配列を含むポリペプチド。
【0134】
実施形態１２７．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、実施形態１１５または実施形態１１６に記載のポリペプチド。
【0135】
実施形態１２８．実施形態１２５～１２７のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【0136】
実施形態１２９．実施形態１２８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【0137】
実施形態１３０．実施形態１２９に記載の宿主細胞を培養することおよびポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドを生成する方法。
【0138】
実施形態１３１．実施形態１２６～１２７のいずれか一つに記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【0139】
実施形態１３２．多血症を有する対象を治療する方法であって、実施形態１１４～１１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態１２５～１２７のいずれか一つに記載のポリペプチド、実施形態１２０もしくは実施形態１２８に記載の核酸、または実施形態１２３、実施形態１２４、もしくは実施形態１３１に記載の薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、方法。
【0140】
実施形態１３３．ＥＰＯポリペプチド、ポリペプチド、核酸、または薬学的組成物は非経口的に投与される、実施形態１３２に記載の方法。
【0141】
実施形態１３４．ＥＰＯポリペプチド、ポリペプチド、核酸、または薬学的組成物は、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路、または吸入経路によって投与される、実施形態１３２または実施形態１３３に記載の方法。
【0142】
実施形態１３５．対象は伴侶動物種である、実施形態１３２～１３２のいずれか一つに記載の方法。
【0143】
実施形態１３６．伴侶動物種は、ネコ、イヌ、またはウマである、実施形態１３５に記載の方法。
【0144】
実施形態１３７．対象はヒトである、実施形態１３２～１３４のいずれか一つに記載の方法。
【0145】
実施形態１３８．多血症は、ＪＡＫ２における変異、腫瘍からのＥＰＯの過剰生成および／または分泌によって引き起こされる、実施形態１３２～１３７のいずれか一つに記載の方法。
【0146】
これらおよび他の態様ならびに様々な実施形態は、下でより十分に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0147】
【図2A-B】様々なシアル酸付加状態の分離を示すＩＥＦゲルを示している。ｐＩマーカー箇所が表示されている。
【図3】単離されたネコＥＰＯアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）のウェスタンブロットを示している。レーン１：分子量マーカー；レーン２～６：それぞれ１μｇ、０．５μｇ、０．２μｇ、０．１μｇ、および０．０５μｇの単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟。
【図4A】蛍光検出器を有するＨＰＬＣを用いた、ＤＭＢ－シアル酸としてのシアル酸解析を示している。既知の濃度のＮｅｕ５Ｇｃ／Ｎｅｕ５Ａの市販の標準についてのシアル酸解析を示している。
【図4B】蛍光検出器を有するＨＰＬＣを用いた、ＤＭＢ－シアル酸としてのシアル酸解析を示している。単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟についてのシアル酸解析を示している。
【図5】高度シアル酸付加ネコＥＰＯ（酸性画分）は、低度シアル酸付加ネコＥＰＯ（塩基性画分）と比較してより低い活性を有することを実証した、ＴＦ－１細胞増殖アッセイの結果を示している。
【図6A】皮下（ＳＱ）注射後の２匹の猫（ドットおよびセーレム）における低度シアル酸付加アナログ６－３０ＧＶ成熟（塩基性画分）についての薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示している。
【図6B】静脈内（ＩＶ）注射後の４匹の猫における高度シアル酸付加アナログ６－３０ＧＶ成熟（酸性画分）についての平均ＰＫプロファイルおよびパラメーターを示している。
【図6C】皮下（ＳＱ）注射後の４匹の猫における高度シアル酸付加アナログ６－３０ＧＶ成熟（酸性画分）についての平均ＰＫプロファイルおよびパラメーターを示している。
【図6D】筋肉内（ＩＭ）注射後の３匹の猫における高度シアル酸付加アナログ６－３０ＧＶ成熟（酸性画分）についての平均ＰＫプロファイルおよびパラメーターを示している。
【図7A-D】ｆＥＰＯＲ２０１－Ｎ－ｆｌａｇ、ｆＥＰＯＲ２０２－Ｎ－ｆｌａｇ、ｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－Ｆｃ、ｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃ、およびｆＥＰＯＲ２０３＿ＥＣＤ－Ｆｃの発現を示した一連のウェスタンブロットである。図７Ａは、ネコＥＰＯＲ２０１－ＥＣＤ－Ｆｃ（レーン１）およびネコＥＰＯＲ２０２－ＥＣＤ－Ｆｃ（レーン２）を同定する抗ヒトＦｃ抗体を用いたウェスタンブロットである。図７Ｂおよび図７Ｃは、トランスフェクトされていないコントロール（レーン５）と比較した、ネコＥＰＯＲ２０１－Ｎ－ｆｌａｇ（レーン３および４）およびネコＥＰＯＲ２０２－Ｎ－ｆｌａｇ（レーン６および７）を同定する抗ｆｌａｇ抗体を用いたウェスタンブロットである。図７Ｄは、ネコＥＰＯＲ２０３－ＥＣＤ－Ｆｃ（レーン９）および分子量標準（レーン８）のＳＤＳ－ＰＡＧＥのクマシー染色である。
【図8】組み換えヒトＥＰＯおよびアナログ６－３０ＧＶ成熟についてのＴＦ－１細胞増殖アッセイおよび算出されたＥＣ５０値の結果を示している。
【図9】ネコＥＰＯのＥ１８とＲ１４、Ｙ１５、およびＫ９７との間の提案される相互作用を示している。
【図10】アナログ６－３０ＥＶ成熟、およびアナログ６－３０ＥＶ成熟とアナログ６－３０ＧＶ成熟との５０／５０混合物についてのＴＦ－１細胞増殖アッセイの結果を示している。
【図11】ネコアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）とネコＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃ（配列番号２６）との間のＥＬＩＳＡ結合アッセイを示している。表される４つのパラメーターは、Ａ：最小値；Ｄ：最大値；Ｃ：変曲点；およびＤ：曲線のヒル勾配、である。
【図12】３つの用量レベル（１μｇ／ｋｇ（「ＥＰＯ１」；ｎ＝５）、３μｇ／ｋｇ（「ＥＰＯ３」；ｎ＝５）、または１０μｇ／ｋｇ（「ＥＰＯ１０」；ｎ＝５））のうちの１つでの、偽薬またはネコアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の投与より１日前の時点での、ならびに投与の５、７、１０、および１４日後の時点での、猫における網状赤血球絶対数パーセンテージを示したグラフである。
【図13】ネコアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４；１０μｇ／ｋｇ；ｎ＝４）の投与より４日前の時点での、ならびに投与の３、５、１０、１７、１９、２４、３１、および３３日後の時点での、猫における網状赤血球絶対数パーセンテージを示したグラフである。
【0148】
ある特定の配列の説明
表1は、本明細書において参照されるある特定の配列のリストを提供する。
表1は、本明細書において参照されるある特定の配列のリストを提供する。
【発明を実施するための形態】
【0149】
本開示は、成熟形態における位置１８にグリシン（ＥＰＯ Ｇ１８）を有する野生型ネコＥＰＯが、第２の受容体結合部位に対する修飾された効果を有し得、位置１８におけるグルタミン酸（ＥＰＯ Ｅ１８）が、向上したネコＥＰＯ第２部位結合活性を有し得るという構造的証拠を提供する。本開示は、Ｅ１８がネコＥＰＯの第２の結合部位における少なくとも３つのアミノ酸（Ｒ１４、Ｔ１５、およびＬ９７）と潜在的に相互作用するとしてどのように同定されたかを記載する。第２の結合部位は、ＥＰＯ受容体二量体化を促すと理解される。
【0150】
本開示は、１つまたは複数の付加的なグリコシル化部位を有する、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４前駆体（配列番号２、Ｅ４４は成熟ＥＰＯにおけるＥ１８に相当する）および野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８成熟（配列番号１３）ポリペプチドのアナログを提供する。例えば、付加的なＮ結合グリコシル化部位を導入する（単独でまたは任意の組み合わせで）のに適したネコＥＰＯのアミノ酸箇所が提供される。ネコＥＰＯポリペプチドを用いた治療の方法のように、ネコＥＰＯポリペプチドの酸性および塩基性画分を含めたネコＥＰＯポリペプチドを生成するまたは精製する方法も提供される。ネコＥＰＯポリペプチドを含めたＥＰＯポリペプチドの単回投薬用および／または複数回投薬用の薬学的組成物のための製剤化も記載される。ネコＥＰＯポリペプチドをコードする核酸、ベクター、発現系、ならびに遺伝子療法の方法による、コントロールされた発現を含めた、そうしたポリペプチドを発現させる方法が記載される。
【0151】
哺乳動物における多血症の治療のための、第２の結合部位に変異を有するＥＰＯポリペプチド、およびそうしたＥＰＯポリペプチドまたはそうしたＥＰＯポリペプチドを発現する核酸を投与する方法も本明細書において記載される。第２の結合部位に変異を有するＥＰＯポリペプチドは、第１のＥＰＯ受容体に対する高いアフィニティーを維持し得るが、ＥＰＯ受容体二量体化に欠陥を有し得る。第２部位変異を有するＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯ受容体を占有することによって、内因性ＥＰＯが機能するのを妨げ得る。また、哺乳動物における多血症の治療のための、ネコＥＰＯ受容体の細胞外ドメインを含むポリペプチド、およびそうしたＥＰＯＲポリペプチドまたはそうしたＥＰＯＲポリペプチドをコードする核酸を投与する方法も本明細書において記載される。
【0152】
読者の利便性のために、本明細書において用いられる用語についての以下の定義が提供される。
【0153】
本明細書において使用するとき、Ｋｄなどの数的用語は、科学的測定に基づいて算出され、ゆえに適当な測定誤差に供される。ある場合には、数的用語は、最も近い有効数字に四捨五入されている数値を含み得る。
【0154】
本明細書において使用するとき、「ａ」または「ａｎ」は、別途指定がない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。本明細書において使用するとき、「または」という用語は、別途指定がない限り、「および／または」を意味する。多項従属請求項の文脈において、「または」の使用は、他の請求項に戻って参照する場合、そうした請求項を択一式でのみ指す。
【0155】
例示的ＥＰＯポリペプチド
新規のネコＥＰＯポリペプチド、例えば、配列番号２または配列番号１３（ただし、配列番号２または配列番号１３には少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位の存在が示されていない）のアミノ酸配列を含むＥＰＯポリペプチドが提供される。
新規のネコＥＰＯポリペプチド、例えば、配列番号２または配列番号１３（ただし、配列番号２または配列番号１３には少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位の存在が示されていない）のアミノ酸配列を含むＥＰＯポリペプチドが提供される。
【0156】
「アミノ酸配列」とは、タンパク質におけるアミノ酸の配列を意味し、配列の１つまたは複数のアミノ酸がそれらの側鎖基を化学的に修飾されているアミノ酸の配列、ならびに公知の配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸が、それによってＥＰＯ受容体に結合する能力などの所望の特性が取り除かれることなく、置き換えられている、挿入されている、または欠失しているものを含む。アミノ酸配列は、ペプチド、オリゴペプチド、またはタンパク質とも称され得る。
【0157】
本明細書において用いられる「エリスロポエチン」、「ＥＰＯ」、または「ＥＰＯポリペプチド」とは、ＥＰＯの全体または断片を含むポリペプチドである。
【0158】
例えば、「ＥＰＯ」とは、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒトおよびカニクイザル）、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、および伴侶動物（例えば、犬、猫、およびウマ）などの哺乳動物を含めた、任意の脊椎動物供給源由来のＥＰＯポリペプチドを指す。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0159】
本明細書において用いられる「エリスロポエチン受容体」、「ＥＰＯ受容体」、または「ＥＰＯＲ」とは、ＥＰＯポリペプチドに結合する、ＥＰＯ受容体の全体または一部分を含むポリペプチドである。
【0160】
例えば、「ＥＰＯＲ」とは、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒトおよびカニクイザル）、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、および伴侶動物（例えば、犬、猫、およびウマ）などの哺乳動物を含めた、任意の脊椎動物供給源由来のＥＰＯＲポリペプチドを指す。一部の実施形態において、ＥＰＯＲは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
【0161】
「伴侶動物種」または「伴侶動物」という用語は、ヒトにとっての伴侶であることに適した動物を指す。一部の実施形態において、伴侶動物は、犬、猫、または馬である。一部の実施形態において、伴侶動物は、ウサギ、フェレット、モルモット、またはげっ歯類等である。一部の実施形態において、伴侶動物はウシまたはブタである。
【0162】
「細胞外ドメイン」（「ＥＣＤ」）とは、膜貫通ドメインを越えて細胞外空間に伸びる、ポリペプチドの部分である。本明細書において用いられる「細胞外ドメイン」という用語は、そのリガンドに結合する、完全な細胞外ドメインを含み得るまたは１つもしくは複数のアミノ酸を欠く短縮した細胞外ドメインを含み得る。細胞外ドメインの組成は、どのアミノ酸が膜内にあるかを判定するために用いられるアルゴリズムに依存し得る。所定のタンパク質に対する種々の細胞外ドメインを、種々のアルゴリズムが予測し得および種々の系が発現させ得る。
【0163】
ＥＰＯＲポリペプチドの細胞外ドメインは、ＥＰＯに結合する、ＥＰＯＲの完全な細胞外ドメインまたは短縮した細胞外ドメインを含み得る。一部の実施形態において、ＥＰＯＲポリペプチドの細胞外ドメインは、伴侶動物種に由来するＥＰＯＲポリペプチドの細胞外ドメインである。例えば、一部の実施形態において、ＥＰＯＲポリペプチドの細胞外ドメインは、イヌＥＰＯＲ、ネコＥＰＯＲ、ウマＥＰＯＲ、またはヒトＥＰＯＲに由来する。一部の実施形態において、ＥＰＯＲポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
【0164】
「野生型」とは、天然に存在するポリペプチドの非変異型またはその断片を指す。野生型ポリペプチドは、組み換えにより生成され得る。
【0165】
「生物活性のある」実体または「生物活性」を有する実体とは、天然に存在する分子の代謝的もしくは生理的過程に関係したもしくは関連した任意の機能、および／または構造的、調節的、もしくは生化学的機能を有する実体である。生物活性のあるポリペプチドまたはその断片には、リガンド－受容体相互作用または抗原－抗体結合を含むがそれらに限定されない生物学的反応に関与し得るものが含まれる。生物活性には、向上した所望の活性または減少した望ましくない活性が含まれ得る。実体は、それが別の分子との分子相互作用に関与する場合、疾患状態を緩和することにおいてそれが治療的価値を有する場合、免疫応答を誘導することにおいてそれが予防的価値を有する場合、分子の存在を判定することにおいてそれが診断的および／または予測的価値を有する場合、生物活性を実証し得る。
【0166】
「アナログ」とは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を実質的に保持する、単一のまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって参照ポリペプチドとは異なるポリペプチドである。
【0167】
本明細書において使用するとき、ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」および「相同性」とは、配列をアラインしおよび必要な場合にはギャップを導入して配列同一性最大パーセントを達成し、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部として見なさない後の、特異的なペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＮＥ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に使用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野における技能の範囲内にある様々なやり方で達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含めた、アライメントを測定するための適当なパラメーターを決定し得る。
【0168】
一部の実施形態において、アナログは、野生型配列ポリペプチドと、少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0169】
アミノ酸置換は、ポリペプチドにおける１つのアミノ酸の、別のアミノ酸での置き換えを含み得るが、それに限定されるわけではない。例示的置換が表２に示されている。アミノ酸置換は関心対象の分子内に導入され得、産物は、所望の活性、例えば保持された／向上した受容体結合、減少した免疫原性、または向上した薬物動態についてスクリーニングされ得る。
【0170】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされ得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【0171】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのうちの一員を別のクラスと交換することを伴う。
【0172】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２または配列番号１３に存在しない少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位の存在を除いて、配列番号２または配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位は、アスパラギン－ｘａａ－セリン配列を含み、式中、ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位は、アスパラギン－ｘａａ－スレオニン配列を含み、式中、ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位はいずれも、別のＮ結合グリコシル化部位と重複しない。
【0173】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置４７～４９、５５～５７、５６～５８、６０～６２、６１～６３、７９～８１、８２～８４、９１～９３、９２～９４、９７～９９、９８～１００、９９～１０１、１１２～１１４、１１３～１１５、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１３７～１３９、１４０～１４２、１４１～１４３、１４２～１４４、１４３～１４５、１４４～１４６、１４５～１４７、１４６～１４８、１４７～１４９、１４８～１５０、１４９～１５１、１５０～１５２、１６１～１６３、１６２～１６４、１８４～１８６、および／または１８６～１８８にＮ結合グリコシル化部位を含む。
【0174】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸位置２１～２３、２９～３１、３０～３２、３４～３６、３５～３７、５３～５５、５６～５８、６５～６７、６６～６８、７１～７３、７２～７４、７３～７５、８６～８８、８７～８９、８８～９０、８９～９１、９０～９２、１１１～１１３、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１１７～１１９、１１８～１２０、１１９～１２１、１２０～１２２、１２１～１２３、１２２～１２４、１２３～１２５、１２４～１２６、１３５～１３７、１３６～１３８、１５８～１６０、および／または１６２～１６４にＮ結合グリコシル化部位を含む。
【0175】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２の位置１１３に相当するアミノ酸位置にバリンを含む。
【0176】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0177】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、下記の表３に列挙される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
*Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸を示す。
【0178】
本明細書において用いられる「アミノ酸誘導体」とは、ヒトに見出される２０種の一般的な天然アミノ酸のうちの１つではない、任意のアミノ酸、修飾されたアミノ酸、および／またはアミノ酸アナログを指す。例示的アミノ酸誘導体には、ヒトに見出されない天然アミノ酸（例えば、一部の微生物に見出され得るセレノシステインおよびピロリシン）および非天然アミノ酸が含まれる。例示的アミノ酸誘導体には、化学製品の製造業者および販売業者を通じて市販されているアミノ酸誘導体が含まれるが、それらに限定されるわけではない（例えば、２０１７年５月６日にアクセスしたｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ？ＴａｂｌｅＰａｇｅ＝１６２７４９６５、それは参照により本明細書に組み入れられる）。宿主細胞、真正細菌合成酵素に由来する直交アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、直交ｔＲＮＡ、およびアミノ酸誘導体を利用する翻訳系を用いて、１つまたは複数のアミノ酸誘導体がポリペプチド内の特異的箇所に組み入れられ得る。さらなる説明に関しては、例えば米国特許第９，６２４，４８５号を参照されたい。
【0179】
一部の実施形態において、本明細書において記載されるＥＰＯポリペプチドまたは他のポリペプチドは、アミノ酸誘導体でのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、アミノ酸誘導体は、アスパラギン誘導体、セリン誘導体、スレオニン誘導体、またはアラニン誘導体である。
【0180】
本明細書において用いられる「グリコシル化された」とは、共有結合によって結合した１つまたは複数のグリカン部分を有するポリペプチドを指す。
【0181】
本明細書において用いられる「グリカン」または「グリカン部分」とは、グリコシド結合によって連結した単糖類を指す。
【0182】
グリカンはいくつかの形で糖ペプチドに結合し、そのうちアスパラギンへのＮ－結合型ならびにセリンおよびスレオニンへのＯ－結合型は、組み換え治療用糖タンパク質に最も適している。Ｎ－結合型グリコシル化は、Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列で生じ、式中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る。
【0183】
本明細書において用いられる「シアル酸付加」とは、共有結合によって結合した１つまたは複数のシアル酸部分を有するポリペプチドを指す。
【0184】
グリコシル化されたおよびシアル酸付加されたタンパク質を生成するための多様な手法が開発されている。例えば、Ｓａｖｉｎｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ＆Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１（８）：８２７－３３（２０１５）を参照されたい。
【0185】
本明細書において用いられる「ＰＥＧ化された」とは、結び付いたまたは共有結合的にもしくは非共有結合によって結合した１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有するポリペプチドを指す。
【0186】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドはグリコシル化されている。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、Ｎ結合グリコシル化部位に結合した少なくとも１つのグリカン部分を含む。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドはシアル酸付加されている。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドはＰＥＧ化されている。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドはグリカンにおいてＰＥＧ化されている。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは第一級アミンにおいてＰＥＧ化されている。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドはＮ末端α－アミンにおいてＰＥＧ化されている。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、グリコシル化され、シアル酸付加され、および／またはＰＥＧ化されている。
【0187】
例示的ＥＰＯポリペプチドの発現および生成
シグナル配列を有するまたは有しないＥＰＯポリペプチドのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。核酸分子の構築において、同種シグナル配列（すなわち、野生型ＥＰＯのシグナル配列）が用いられない場合には、別のシグナル配列、例えばＰＣＴ／ＵＳ０６／０２９５１に記載されるシグナル配列のいずれか１つが用いられ得る。
シグナル配列を有するまたは有しないＥＰＯポリペプチドのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。核酸分子の構築において、同種シグナル配列（すなわち、野生型ＥＰＯのシグナル配列）が用いられない場合には、別のシグナル配列、例えばＰＣＴ／ＵＳ０６／０２９５１に記載されるシグナル配列のいずれか１つが用いられ得る。
【0188】
典型的に、本明細書において記載されるＥＰＯポリペプチドまたは別のポリペプチドなど、関心対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクター内に挿入される。
【0189】
「ベクター」という用語は、宿主細胞において繁殖され得るクローン化された１種または複数のポリヌクレオチドを含有するように操作され得るポリヌクレオチドを記載するために用いられる。ベクターは、以下の要素：複製開始点、関心対象のポリペプチドの発現を調節する１種もしくは複数の調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサーなど）、または１種もしくは複数の選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、および比色アッセイにおいて用いられ得る遺伝子、例えばβ－ガラクトシダーゼなど）のうちの１つまたは複数を含み得る。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞において関心対象のポリペプチドを発現させるために用いられるベクターを指す。
【0190】
ベクターは、非ウイルス法（例えば、裸のＤＮＡ、調製されたＤＮＡ、またはリポソーム）を介してまたはウイルス法を介して送達可能なＤＮＡプラスミドであり得る。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターなどのウイルスベクターである。ベクターは細菌ベクターであり得る。
【0191】
本明細書において用いられる「発現系」という用語は、発現ベクターと少なくとも１種の付加的なベクターとの組み合わせを指す。組み合わせは、非ウイルス法を介してまたはウイルス法を介して送達可能であり得る。
【0192】
一部の実施形態において、発現系は、発現ベクターと、調節配列（例えば、転写因子またはマイクロＲＮＡをコードする核酸配列）を含むベクターとを含む。
【0193】
本明細書において記載されるＥＰＯまたはＥＰＯＲポリペプチドの発現を調節して、インビボにおけるＥＰＯまたはＥＰＯＲの過度の生成を阻止し得る。コントロールされた発現は、免疫原性、多血症（赤血球の過剰生成）、または他の負の効果を低下させ得る。テトラサイクリン応答系、マイクロＲＮＡ調節系、または低酸素誘導系（例えば、低酸素誘導性プロモーターまたはエンハンサーを活性化するプロリルヒドロキシラーゼの使用）など、インビトロおよびインビボにおいて遺伝子調節をコントロールする多くの公知の方法が存在する。
【0194】
「調節配列」（「調節領域」または「調節エレメント」とも称される）という用語は、遺伝子発現および／またはタンパク質発現を直接的または間接的に促すおよび／またはコントロールする核酸配列を指す。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もしくは転写因子をコードする核酸配列であり得る。調節配列は、遺伝子発現および／またはタンパク質発現を増加させ得るまたは減少させ得る。
【0195】
一部の実施形態において、調節配列は、転写因子などの制御タンパク質に結合して、遺伝子発現および／またはタンパク質発現をコントロールする。一部の実施形態において、調節配列は、遺伝子発現および／またはタンパク質発現をコントロールする転写因子をコードする。一部の実施形態において、調節配列は、標的ｍＲＮＡに結合してタンパク質発現をコントロールするｍｉＲＮＡをコードする。
【0196】
一部の実施形態において、調節配列は、コントロール可能な調節配列である。一部の実施形態において、調節配列は、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）などのコントロール不能な調節配列である。一部の実施形態において、調節配列は、プロモーターなどの正の調節配列である。一部の実施形態において、調節配列は、サイレンサーなどの負の調節配列である。一部の実施形態において、調節配列は、一過性の、誘導性の（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーターまたは低酸素誘導性プロモーター）、および／または組織特異的な遺伝子発現および／またはタンパク質発現を提供する。
【0197】
一部の実施形態において、調節配列は、本開示のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸（コード配列）に動作可能に連結されている。調節配列は、それらが、コードされるポリペプチドの発現を指揮するように機能する限りは、コード配列と近接している必要はない。ゆえに、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列は、なおもコード配列に「動作可能に連結されている」と見なされ得る。
【0198】
一部の実施形態において、調節配列は、本開示のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結されていない。例えば、調節配列は、ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸と同じベクターまたは異なるベクターから発現されるマイクロＲＮＡ配列または転写因子であり得る。
【0199】
「宿主細胞」とは、ベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るまたはレシピエントになっている細胞を指す。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。例示的真核細胞には、霊長類または非霊長類動物細胞などの哺乳動物細胞；酵母などの真菌細胞；植物細胞；および昆虫細胞が含まれる。非限定的な例示的哺乳動物細胞には、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、２９３細胞、およびＣＨＯ細胞、ならびに２９３－６Ｅ、ＤＧ－４４、ＣＨＯ－Ｓ、およびＣＨＯ－Ｋ細胞など、それらの誘導体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して、必ずしも元の親細胞と（形態がまたはゲノムＤＮＡ相補体が）完全に同一ではない可能性がある。宿主細胞には、本明細書において提供されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【0200】
本明細書において用いられる「単離された」という用語は、それが典型的に天然において一緒に見出されるまたは生成される成分の少なくとも一部から分離されている分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが生成された細胞の成分の少なくとも一部からそれが分離されている場合、「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、それを生成した細胞からポリペプチドを含有する上清を物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離すること」であると見なされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが、典型的に天然においてそれが見出されるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合には、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡなど）の一部ではない場合、または例えばＲＮＡポリヌクレオチドの場合には、それが生成された細胞の成分の少なくとも一部から分離されている場合、「単離された」と称される。ゆえに、宿主細胞内部のベクターに含有されるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称され得る。
【0201】
一部の実施形態において、本明細書において記載されるＥＰＯポリペプチドまたは別のポリペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＣＨＴクロマトグラフィー、および／または合成分子がコンジュゲートされた樹脂クロマトグラフィー（例えば、Ｈｉｓタグアフィニティーカラムクロマトグラフィー）などのクロマトグラフィーを用いて単離される。一部の実施形態において、本明細書において記載されるＥＰＯポリペプチドまたは別のポリペプチドは、Ｃａｐｔｏブチルカラムクロマトグラフィー、カチオン交換カラムクロマトグラフィー、アニオン交換カラムクロマトグラフィー、および／または混合モードカラムクロマトグラフィーを用いて単離される。一部の実施形態において、本明細書において記載されるＥＰＯポリペプチドまたは別のポリペプチドは、クロマトグラフィー法および／またはカラムの組み合わせを用いて単離される。
【0202】
一部の実施形態において、生成または単離の方法は、任意のウイルスを不活化することまたは除去することをさらに含む。
【0203】
本明細書において用いられる「等電点」または「ｐＩ」という用語は、分子が、等電点電気泳動法によって決定される、正味の電荷を帯びていないおよび／または電場においてさらに移動しないｐＨを指す。
【0204】
本明細書において用いられる「等電点の値域」という用語は、分子の大多数が、等電点電気泳動法によって決定される、正味の電荷を帯びていないおよび／または電場においてさらに移動しないｐＨの値域を指す。
【0205】
一部の実施形態において、組成物は、等電点電気泳動法によって決定される、約１～約３．５、約１．５～約３．５、約２～約３．５、約２．５～約３．５、約３～約３．５、約３．５もしくはそれ未満、または約３もしくはそれ未満の等電点の値域を有するＥＰＯポリペプチドを含む。一部の実施形態において、組成物は、等電点電気泳動法によって決定される、約１～約３．５、約１．５～約３．５、約２～約３．５、約２．５～約３．５、約３～約３．５、約３．５もしくはそれ未満、または約３もしくはそれ未満の等電点の値域を有するＥＰＯポリペプチドの酸性画分を含む。一部の実施形態において、組成物は、等電点電気泳動法によって決定される、約１～約３．５、約１．５～約３．５、約２～約３．５、約２．５～約３．５、約３～約３．５、約３．５もしくはそれ未満、または約３もしくはそれ未満の等電点の値域を有するＥＰＯポリペプチドの高度シアル酸付加画分を含む。
【0206】
一部の実施形態において、組成物は、等電点電気泳動法によって決定される、約３．５～約６、約４～約６、約４．５～約６、約５～約６、約５．５～約６、約３．５～約５、約４～約５、約４．５～約５、約３．５もしくはそれを上回る、約４もしくはそれを上回る、または約４．５もしくはそれを上回る等電点の値域を有するＥＰＯポリペプチドを含む。一部の実施形態において、組成物は、等電点電気泳動法によって決定される、約３．５～約６、約４～約６、約４．５～約６、約５～約６、約５．５～約６、約３．５～約５、約４～約５、約４．５～約５、約３．５もしくはそれを上回る、約４もしくはそれを上回る、または約４．５もしくはそれを上回る等電点の値域を有するＥＰＯポリペプチドの塩基性画分を含む。一部の実施形態において、組成物は、等電点電気泳動法によって決定される、約３．５～約６、約４～約６、約４．５～約６、約５～約６、約５．５～約６、約３．５～約５、約４～約５、約４．５～約５、約３．５もしくはそれを上回る、約４もしくはそれを上回る、または約４．５もしくはそれを上回る等電点の値域を有するＥＰＯポリペプチドの低度シアル酸付加画分を含む。
【0207】
ＥＰＯＲに対する例示的ＥＰＯポリペプチドアフィニティー
「アフィニティー」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的相互作用の総計の強度を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティーは、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって表され得る。アフィニティーは、例えばイムノブロット、ＥＬＩＳＡ ＫＤ、ＫｉｎＥｘ Ａ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、または表面プラズモン共鳴装置など、当該技術分野で公知の一般的方法によって測定され得る。
「アフィニティー」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的相互作用の総計の強度を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティーは、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって表され得る。アフィニティーは、例えばイムノブロット、ＥＬＩＳＡ ＫＤ、ＫｉｎＥｘ Ａ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、または表面プラズモン共鳴装置など、当該技術分野で公知の一般的方法によって測定され得る。
【0208】
「ＫＤ」、「Ｋｄ」、「Ｋｄ」、または「Ｋｄ値」という用語は、抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すために互換可能に用いられる。一部の実施形態において、抗体のＫｄは、供給業者の指示書に従って、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）など、バイオセンサーを用いたバイオレイヤー干渉法アッセイを用いることによって測定される。簡潔には、ビオチン化された抗体をセンサーチップに結合させ、抗体の会合を９０秒間モニターし、解離を６００秒間モニターする。希釈および結合工程のためのバッファーは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。バッファーのみのブランク曲線を差し引いて、任意のドリフトを補正する。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェアを用いて、データを２：１結合モデルにフィットさせて、会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）、およびＫｄを決定する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出される。「ｋｏｎ」という用語は、抗原への抗体の会合に対する速度定数を指し、「ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する速度定数を指す。
【0209】
リガンドまたは受容体に「結合する」という用語は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような結合を判定する方法も当該技術分野で周知である。分子は、それが特定の細胞または物質と反応する、会合する、またはそれに対するアフィニティーを有する場合、「結合」を呈すると言われ、当該反応、会合、またはアフィニティーは、例えばイムノブロット、ＥＬＩＳＡ ＫＤ、ＫｉｎＥｘ Ａ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴装置など、当該技術分野で公知の１つまたは複数の方法によって検出可能である。
【0210】
「表面プラズモン共鳴」とは、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ，ａ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイムの生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を表す。さらなる説明に関しては、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９－２６を参照されたい。
【0211】
「バイオレイヤー干渉法」とは、バイオセンサーチップ上の固定されたタンパク質のレイヤーおよび内部参照レイヤーから反射される光の干渉パターンを解析する光学的解析技法を指す。バイオセンサーチップに結合している分子の数の変化は、干渉パターンのシフトを引き起こし、それがリアルタイムで測定され得る。バイオレイヤー干渉法のための非限定的な例示的装置は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）である。例えば、Ａｂｄｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：２０９－２７７を参照されたい。
【0212】
「低下させる」または「阻害する」ことは、参照と比較して、活性、機能、または量を減少させる、低下させる、または停止させることを意味する。一部の実施形態において、「低下させる」または「阻害する」によって、２０％またはそれを上回る全体的減少を引き起こす能力を意味する。一部の実施形態において、「低下させる」または「阻害する」によって、５０％またはそれを上回る全体的減少を引き起こす能力を意味する。一部の実施形態において、「低下させる」または「阻害する」によって、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれを上回る全体的減少を引き起こす能力を意味する。一部の実施形態において、上述の量が、ある期間にわたって、同じ期間にわたるコントロール投薬（偽薬など）と比べて阻害されるまたは減少する。
【0213】
「増加させる」または「刺激する」ことは、参照と比較して、活性、機能、または量を増加させる、向上させる、または増大させることを意味する。一部の実施形態において、「低下させる」または「阻害する」によって、２０％またはそれを上回る全体的増加を引き起こす能力を意味する。一部の実施形態において、「増加させる」または「刺激する」によって、５０％またはそれを上回る全体的増加を引き起こす能力を意味する。一部の実施形態において、「増加させる」または「刺激する」によって、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれを上回る全体的増加を引き起こす能力を意味する。一部の実施形態において、上述の量が、ある期間にわたって、同じ期間にわたるコントロール投薬（偽薬など）と比べて刺激されるまたは増加する。
【0214】
本明細書において用いられる「参照」とは、比較目的のために用いられる任意の試料、標準、またはレベルを指す。参照は、健常または非疾患性試料から獲得され得る。一部の例において、参照は、伴侶動物の非疾患性または未処理試料から獲得される。一部の例において、参照は、試験されているまたは治療されている動物ではない、特定の種の１匹または複数匹の健常動物から獲得される。
【0215】
一部の実施形態において、本発明のＥＰＯポリペプチドまたは核酸の投与は、少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３２％、または少なくとも３５％、または少なくとも３８％、または少なくとも４０％、または少なくとも４２％、または少なくとも４５％、または少なくとも４８％まで増加する、ヘマトクリットパーセントの増加をもたらし得る。
【0216】
例示的薬学的組成物
「薬学的製剤」および「薬学的組成物」という用語は、活性成分の生物活性が有効となるのを可能にするような形態にあり、かつ製剤が投与される対象にとって許容されないほど有毒である付加的成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的製剤」および「薬学的組成物」という用語は、活性成分の生物活性が有効となるのを可能にするような形態にあり、かつ製剤が投与される対象にとって許容されないほど有毒である付加的成分を含有しない調製物を指す。
【0217】
「薬学的に許容される担体」とは、対象への投与のための「薬学的組成物」を一緒に含む、治療剤との使用のための当該技術分野で慣習的な非毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、処方助剤、または担体を指す。薬学的に許容される担体は、採用される投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、かつ製剤の他の成分と適合性である。薬学的に許容される担体は、採用される製剤にとって適当である。薬学的に許容される担体の例には、アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；レシチン；ヒト血清アルブミン、イヌもしくは他の動物アルブミンなどの血清タンパク質；リン酸塩、クエン酸塩、トロメタミン、もしくはＨＥＰＥＳバッファーなどのバッファー；グリシン；ソルビン酸；ソルビン酸カリウム；飽和した植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物；水；硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、もしくは三ケイ酸マグネシウムなどの塩もしくは電解質；ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質；ポリエチレングリコール；ショ糖；マンニトール；またはアルギニンを含むがそれに限定されないアミノ酸が含まれる。
【0218】
一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、約６．２～約７、約６～約７．２、約６．４～約６．８、約６、または約７のｐＨを有し、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、約６．２～約７、約６～約７．２、約６、約６．４～約６．８、または約７のｐＨを有し、クエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む。
【0219】
一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート８０を含む。一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む。一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む。一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびポリソルベート８０を含む。
【0220】
一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、約１００ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１１０ｎＭ～約１７０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１３０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１３０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、または約１８０ｎＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。
【0221】
一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、約１００ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１１０ｎＭ～約１７０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１３０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１３０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、または約１８０ｎＭの濃度のリン酸ナトリウムを含む。
【0222】
一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、約５５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約５７０ｎＭ～約７３０ｎＭ、約５９０ｎＭ～約７２０ｎＭ、約６００ｎＭ～約７００ｎＭ、約６２０ｎＭ～約６８０ｎＭ、約６４０ｎＭ～約６６０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約５７０ｎＭ～約６７０ｎＭ、約５５０ｎＭ～約６５０ｎＭ、約６５０ｎＭ～約７５０ｎＭ、約６３０ｎＭ～約７００ｎＭ、または約６７０ｎＭ～約６００ｎＭの濃度のポリソルベートを含む。一部の実施形態において、ポリソルベートはポリソルベート８０である。一部の実施形態において、ポリソルベートはポリソルベート２０である。
【0223】
一部の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ｍ－クレゾールまたはベンジルアルコールを含む。一部の実施形態において、ｍ－クレゾールの濃度は、約０．２％、約０．１％～約０．３％、約０．０８％～約０．２５％、または約０．０５％～約０．２５％である。一部の実施形態において、ベンジルアルコールの濃度は、約１％、約０．５％～約２％、約０．２％～約２．５％、約１％～約５％、約０．５％～約５％、または約１％～約３％である。
【0224】
薬学的組成物は、凍結乾燥形態で保存され得る：ゆえに、一部の実施形態において、調製過程は凍結乾燥工程を含む。次いで、凍結乾燥組成物は、猫への投与前に、典型的には非経口投与に適した水性組成物として再製剤化される。他の実施形態において、特にタンパク質が熱および酸化変性に非常に安定である場合、薬学的組成物は、液体の、すなわち水性の組成物として保存され得、それは、犬、猫、または馬に直接的にまたは適当な希釈を有して投与され得る。それは滅菌注射用水（ＷＦＩ）で再構成され得、ベンジルアルコールなどの静菌性の試薬が含まれ得る。ゆえに、本発明は、固体および液体形態の両方の薬学的組成物を提供する。
【0225】
薬学的組成物のｐＨは、投与される場合、典型的に約ｐＨ６～ｐＨ８の値域内にあり、例えば約６、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７、約７．２である。本発明の製剤は、それらが治療目的のために用いられる対象となる場合、滅菌である。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通した濾過によるものを含めた、当該技術分野で公知のいくつかの手段のいずれかによって達成され得る。無菌状態は、抗細菌剤の有りまたは無しで維持され得る。
【0226】
本発明の薬学的製剤は、猫などの伴侶動物における貧血を伴う病状を治療するための本発明の方法において有用である。例えば、本明細書において記載される方法は、本開示の核酸またはポリペプチドの治療的有効用量を猫に投与することを含む。多くの実施形態において、治療的有効用量は、非経口的に、例えば皮下投与、静脈内注入、静脈内ボーラス注射、または筋肉内注射によって投与される。
【0227】
ゆえに、本発明の方法に従って、本発明のＥＰＯポリペプチドもしくは核酸、他のポリペプチドもしくは核酸、または薬学的組成物は、ネコ、イヌ、ウマ、またはヒトに治療的有効用量で投与される。
【0228】
一部の実施形態において、治療的有効用量は、少なくとも連続２または３週間の間、週１回投与され、一部の実施形態において、治療のこのサイクルは、任意で１週間または複数の週間の治療なしが散在して、２回またはそれを上回る回数反復される。他の実施形態において、治療的有効用量は、連続２～５日間の間、１日１回投与され、一部の実施形態において、治療のこのサイクルは、任意で１日もしくは複数の日数または１週間もしくは複数の週間の治療なしが散在して、２回またはそれを上回る回数反復される。
【0229】
ＥＰＯおよびＥＰＯＲ ＥＣＤポリペプチドの例示的使用
本明細書において開示される、１つもしくは複数の付加的なＮ－グリコシル化部位を含むＥＰＯポリペプチド、またはＥＰＯポリペプチドを含む薬学的組成物は、非再生性貧血を治療するのに有用であり得る。非再生性貧血状態は、イヌ、ネコ、またはウマを含むがそれらに限定されない伴侶動物において呈され得る。
本明細書において開示される、１つもしくは複数の付加的なＮ－グリコシル化部位を含むＥＰＯポリペプチド、またはＥＰＯポリペプチドを含む薬学的組成物は、非再生性貧血を治療するのに有用であり得る。非再生性貧血状態は、イヌ、ネコ、またはウマを含むがそれらに限定されない伴侶動物において呈され得る。
【0230】
本明細書において開示される、第２の結合部位にアミノ酸置換を含むＥＰＯポリペプチド、または第２部位変異ＥＰＯポリペプチドを含む薬学的組成物は、多血症を治療するのに有用であり得る。
【0231】
本明細書において開示される、ＥＰＯＲの細胞外ドメインを含むポリペプチド、またはＥＰＯＲ ＥＣＤポリペプチドを含む薬学的組成物は、多血症を治療するのに有用であり得る。
【0232】
本明細書において使用するとき、「治療」とは、有益なまたは所望の臨床結果を獲得するための手法である。本明細書において用いられる「治療」は、伴侶動物を含めた哺乳動物における疾患に対する治療法の任意の施しまたは適用を網羅する。本開示の目的上、有益なまたは所望の臨床結果には、１つまたは複数の症候の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の広がりを阻止することまたは遅らせること、疾患の再発を阻止することまたは遅らせること、疾患進行を遅らせることまたは減速させること、病状の改善、疾患または疾患の進行を阻害すること、疾患またはその進行を阻害することまたは減速させること、その発症を停止させること、および寛解（部分的または完全にかかわらず）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、「治療」によって、増殖性疾患の病理学的帰結の低下も包含される。本明細書において提供される方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか１つまたは複数を企図する。上記に沿って、治療という用語は、障害のすべての態様の１００パーセントの除去を要するわけではない。
【0233】
一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチド、核酸、ベクター、発現系、またはそれを含む薬学的組成物を、本明細書における方法に従って利用して、ＥＰＯ欠損またはＥＰＯ非感受性により誘導される病状を治療し得る。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチド、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物を、イヌ、ネコ、またはウマなどの伴侶動物に投与して、ＥＰＯ欠損またはＥＰＯ非感受性により誘導される病状を治療する。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチド、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物を、イヌ、ネコ、またはウマなどの伴侶動物に投与して、貧血を治療する。
【0234】
物質／分子、アゴニスト、またはアンタゴニストの「治療的有効量」は、治療される対象となる疾患のタイプ、病状、疾患の重症度および経過、治療目的のタイプ、任意の以前の療法、病歴、以前の治療に対する応答、主治獣医の裁量、動物の年齢、性別、および重量、ならびに物質／分子、アゴニスト、またはアンタゴニストが動物において所望の応答を誘発する能力などの因子に従って様々であり得る。治療的有効量とは、物質／分子、アゴニスト、またはアンタゴニストの任意の有毒なまたは有害な効果を、治療的に有益な効果が上回る量でもある。治療的有効量は、１回または複数回の投与で送達され得る。治療的有効量とは、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量を指す。
【0235】
一部の実施形態において、ＥＰＯもしくはＥＰＯＲポリペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、または発現系、または薬学的組成物は、皮下投与、静脈内注入、または筋肉内注射によって非経口的に投与される。一部の実施形態において、ＥＰＯもしくはＥＰＯＲポリペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物は、ボーラス注射としてまたはある期間にわたる連続的注入によって投与される。一部の実施形態において、ＥＰＯもしくはＥＰＯＲポリペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、髄腔内、または吸入経路によって投与される。
【0236】
本明細書において記載されるＥＰＯまたはＥＰＯＲポリペプチドは、投薬あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の値域内の量で投与され得る。一部の実施形態において、ＥＰＯまたはＥＰＯＲポリペプチドは、投薬あたり０．０００５ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重の値域内の量で投与され得る。一部の実施形態において、ＥＰＯまたはＥＰＯＲポリペプチドは、投薬あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の値域内の量で投与され得る。一部の実施形態において、ＥＰＯポリペプチドは、約１μｇ／ｋｇ体重～約１０μｇ／ｋｇ体重、または約１μｇ／ｋｇ体重～約５μｇ／ｋｇ体重、または約１μｇ／ｋｇ体重、または約３μｇ／ｋｇ体重、または約５μｇ／ｋｇ体重、または約１０μｇ／ｋｇ体重の値域内の量で投与され得る。
【0237】
ＥＰＯもしくはＥＰＯＲポリペプチド、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物は、単回、または一連の治療にわたって伴侶動物に投与され得る。例えば、ＥＰＯもしくはＥＰＯＲポリペプチド、核酸、ベクター、発現系、または薬学的組成物は、少なくとも１回、１回を上回る回数、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、もしくは少なくとも５回、または慢性的使用で投与され得る。
【0238】
一部の実施形態において、用量は、少なくとも連続２または３週間の間、週１回投与され、一部の実施形態において、治療のこのサイクルは、任意で１週間または複数の週間の治療なしが散在して、２回またはそれを上回る回数反復される。他の実施形態において、治療的有効用量は、連続２～５日間の間、１日１回投与され、一部の実施形態において、治療のこのサイクルは、任意で１日もしくは複数の日数または１週間もしくは複数の週間の治療なしが散在して、２回またはそれを上回る回数反復される。
【0239】
１種または複数のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与には、任意の順序での同時の（並行した）および連続したまたは逐次的な投与が含まれる。「並行して」という用語は、投与の少なくとも一部が時間において重複する場合、または一方の治療剤の投与が、他方の治療剤の投与と比べて短い期間内に収まる場合、２種またはそれを上回る種類の治療剤の投与を指すために本明細書において用いられる。例えば、２種またはそれを上回る種類の治療剤は、わずか指定された分数ほどの時間分離を有して投与される。「逐次的に」という用語は、１種もしくは複数の薬剤の投与が、１種もしくは複数の他の薬剤の投与を中断した後に続く場合、または１種もしくは複数の薬剤の投与が、１種もしくは複数の他の薬剤の投与前に始まる場合、２種またはそれを上回る種類の治療剤の投与を指すために本明細書において用いられる。例えば、２種またはそれを上回る種類の治療剤の投与は、およそ指定された分数を上回る時間分離を有して施される。本明細書において使用するとき、「と併用した」とは、もう一方の治療様式に加えた一方の治療様式の施しを指す。そのため、「と併用した」とは、動物への他方の治療様式の施しの前、間、または後の一方の治療様式の施しを指す。
【0240】
貧血状態の検出、診断、およびモニタリングのための、ＥＰＯポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法が本明細書において提供される。例えば、貧血は、標準的方法を用いてヘマトクリットパーセンテージ（ＨＣＴ％）を測定することによって検出され得る、診断され得る、またはモニターされ得る。伴侶動物がＥＰＯポリペプチドに応答するかどうかを判定する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、方法は、ＥＰＯポリペプチドを用いて、動物がＥＰＯＲを発現する細胞を有するかどうかを検出することを含む。一部の実施形態において、検出の方法は、試料とＥＰＯポリペプチドまたはポリヌクレオチドとを接触させること、および結合のレベルが参照または比較試料（コントロールなど）のものと異なるかどうかを判定することを含む。一部の実施形態において、方法は、本明細書において記載される抗体またはポリペプチドが、対象動物にとって適当な治療であるかどうかを判定するのに有用であり得る。
【0241】
一部の実施形態において、試料は生物学的試料である。「生物学的試料」という用語は、生き物または以前は生きていた物由来のある分量の物質を意味する。一部の実施形態において、生物学的試料は細胞または細胞／組織溶解物である。一部の実施形態において、生物学的試料には、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、滑液、および上皮細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【0242】
特異的なリガンド－受容体結合を検出するための当該技術分野で公知の様々な方法が用いられ得る。行われ得る例示的イムノアッセイには、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ネフェロメトリー阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。指標部分、つまり標識基は、対象抗体に結合され得、方法の様々な用途の必要性を満たすように選択され、それは、アッセイ機器の使用可能性および適合するイムノアッセイ手順によってしばしば決定付けられる。適当な標識には、限定されることなく、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはｐ－ガラクトシダーゼ）、蛍光性部分もしくは蛍光性タンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、ＧＦＰ、またはＢＦＰ）、または発光性部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．によって供給されるＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）が含まれる。上述の様々なイムノアッセイを実施する際に用いられる対象となる一般的技法は、当業者に公知である。
【0243】
診断の目的のために、ＥＰＯまたはＥＰＯＲを含むポリペプチドは、当該技術分野で公知の放射性同位体、蛍光性標識、および様々な酵素－基質標識を含むがそれらに限定されない、検出可能な部分で標識され得る。タンパク質に標識をコンジュゲートする方法は、当該技術分野で公知である。
【0244】
以下の実施例は、本開示の特定の態様を例示するものであり、決して本開示を限定することを意図されるものではない。
【実施例0245】
実施例１
ネコＥＰＯに対するＮ結合グリコシル化部位の同定
野生型ネコＥＰＯは、野生型ネコＥＰＯ Ｇ４４前駆体形態（配列番号１または「野生型ネコＥＰＯ Ｇ４４」）のアミノ酸位置５０～５２、６４～６６、および１０９～１１１、ならびに野生型Ｇ１８ネコＥＰＯ成熟形態（配列番号１２または「野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８」）のアミノ酸位置２４～２６、３８～４０、および８３～８５に、３つのＮ結合グリコシル化部位を有する。
ネコＥＰＯに対するＮ結合グリコシル化部位の同定
野生型ネコＥＰＯは、野生型ネコＥＰＯ Ｇ４４前駆体形態（配列番号１または「野生型ネコＥＰＯ Ｇ４４」）のアミノ酸位置５０～５２、６４～６６、および１０９～１１１、ならびに野生型Ｇ１８ネコＥＰＯ成熟形態（配列番号１２または「野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８」）のアミノ酸位置２４～２６、３８～４０、および８３～８５に、３つのＮ結合グリコシル化部位を有する。
【0246】
付加的なＮ結合グリコシル化部位が、野生型ネコＥＰＯアミノ酸配列に導入され得る。例えば、１、２、３、４、５、または６つの付加的なＮ結合グリコシル化部位が、野生型ネコＥＰＯアミノ酸配列に導入され得る。Ｎ結合グリコシル化部位は、Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒというコンセンサス配列を有し得、式中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である。１つまたは複数のグリコシル化部位の付加は、ネコＥＰＯ分子の分子サイズを増加させ得、より多くのシアル酸付加部位を提供し得、および／または動物の血清における分子の半減期を向上させ得る。
【0247】
表４は、１つまたは複数の付加的なＮ結合グリコシル化部位を作出するために用いられ得る、野生型ネコＥＰＯ Ｇ４４のアミノ酸置換を列挙している。
*Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸を示す。
【0248】
実施例２
付加的なＮ結合グリコシル化部位を有するネコＥＰＯの発現
野生型ネコＥＰＯ Ｇ４４前駆体形態と比較して、付加的なＮ結合グリコシル化部位を有するＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を化学的に合成した。具体的には、配列は、野生型ネコＥＰＯ前駆体の位置４４にグリシン、位置１１３にバリン置換、ならびに位置５６～５８（Ｎ５６Ｔ５８）および１１４～１１６（Ｎ１１４）に２つの付加的なＮ結合グリコシル化部位を有する「アナログ６－３０ＧＶ前駆体」（配列番号３）をコードした。
付加的なＮ結合グリコシル化部位を有するネコＥＰＯの発現
野生型ネコＥＰＯ Ｇ４４前駆体形態と比較して、付加的なＮ結合グリコシル化部位を有するＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を化学的に合成した。具体的には、配列は、野生型ネコＥＰＯ前駆体の位置４４にグリシン、位置１１３にバリン置換、ならびに位置５６～５８（Ｎ５６Ｔ５８）および１１４～１１６（Ｎ１１４）に２つの付加的なＮ結合グリコシル化部位を有する「アナログ６－３０ＧＶ前駆体」（配列番号３）をコードした。
【0249】
ヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ ＤＧ－４４宿主細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ ＤＧ－４４細胞は、当該技術分野で公知であるように、発現ベクター上のＤＨＦＲ遺伝子およびメトトレキサート媒介性遺伝子増幅を用いた、ＥＰＯポリペプチドの発現の高収量および安定性に対して選択された。「アナログ６－３０ＧＶ成熟」（配列番号１４）と名付けられたＥＰＯポリペプチドの成熟形態は、培養培地中に分泌された。
【0250】
実施例３
ネコＥＰＯの単離
ネコＥＰＯポリペプチドを発現する細胞株を、十分な分量のＥＰＯポリペプチドが生成されるまで培養し得る。ポリペプチドを、Ｃａｐｔｏブチルカラムクロマトグラフィー、カチオン交換（ＣＥＸ）カラムクロマトグラフィー、アニオン交換（ＡＥＸ）カラムクロマトグラフィー、または他のクロマトグラフィー法を含めた、様々な工程の１つまたは複数によって単離し得る。他のクロマトグラフィー法には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、混合モードカラムクロマトグラフィー（例えば、ＣＨＴ、および／またはＣａｐｔｏＭＭＣなどの多様な（ｕｌｔｉｍｏｄａｌ）モードカラムクロマトグラフィー）が含まれ得る。低いｐＨまたは他のウイルス不活化およびウイルス除去工程が適用され得る。単離されたＥＰＯポリペプチドを賦形剤と混和しおよび濾過によって滅菌して、本発明の薬学的組成物を調製し得る。薬学的組成物を、造血活性を刺激するのに十分な用量で、貧血を有する猫に投与し得る。
ネコＥＰＯの単離
ネコＥＰＯポリペプチドを発現する細胞株を、十分な分量のＥＰＯポリペプチドが生成されるまで培養し得る。ポリペプチドを、Ｃａｐｔｏブチルカラムクロマトグラフィー、カチオン交換（ＣＥＸ）カラムクロマトグラフィー、アニオン交換（ＡＥＸ）カラムクロマトグラフィー、または他のクロマトグラフィー法を含めた、様々な工程の１つまたは複数によって単離し得る。他のクロマトグラフィー法には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、混合モードカラムクロマトグラフィー（例えば、ＣＨＴ、および／またはＣａｐｔｏＭＭＣなどの多様な（ｕｌｔｉｍｏｄａｌ）モードカラムクロマトグラフィー）が含まれ得る。低いｐＨまたは他のウイルス不活化およびウイルス除去工程が適用され得る。単離されたＥＰＯポリペプチドを賦形剤と混和しおよび濾過によって滅菌して、本発明の薬学的組成物を調製し得る。薬学的組成物を、造血活性を刺激するのに十分な用量で、貧血を有する猫に投与し得る。
【0251】
細胞生存率が９５％を下回った時点で、馴化培地を浄化することによって上清を収穫した。例えば、クロマトグラフィー工程の組み合わせを用いて、アナログ６－３０ＧＶ成熟ポリペプチド（配列番号１４）を精製した。ＥＰＯポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞からの培地を回収し、培地が１Ｍ ＮａＣｌよりも高いＮａＣｌ濃度を有するように塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の添加により調整し、それにより、ＥＰＯポリペプチドは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってＣａｐｔｏブチルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合し得た。ＥＰＯは、約１～約２．５Ｍ ＮａＣｌを有して、約５．７５～約８．５のｐＨでＣａｐｔｏブチルカラムに結合すると理解されている。馴化培地を遠心分離および濾過によって浄化し、Ｃａｐｔｏブチルカラムにロードした。結合しているＥＰＯポリペプチドは、約５．６のｐＨで３０％イソプロパノールを用いてカラムから溶出された。
【0252】
分画除去された宿主細胞タンパク質を、ＣＨＯ宿主細胞タンパク質解析ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＣＭ０１５；Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解析した。宿主細胞タンパク質の少なくとも約９５％が、この精製法によってＥＰＯタンパク質から分画除去された。
【0253】
Ｃａｐｔｏブチルカラムからの溶出液を、サブトラクションクロマトグラフィー工程として、ＳＰカチオン交換（ＣＥＸ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直接ロードした。約５．６のｐＨで３０％イソプロパノールというこのロード条件下で、ＥＰＯポリペプチドはＳＰ ＣＥＸカラムを素通りし、一方で宿主細胞タンパク質は結合するはずである。
【0254】
約５．６のｐＨで３０％イソプロパノールにおいてＥＰＯポリペプチドに結合するＣａｐｔｏ Ｑアニオン交換（ＡＥＸ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ＳＰ ＣＥＸカラムからの素通りを直接ロードした。ｐＨ４洗浄液を添加して塩基性ＥＰＯポリペプチドの画分を除去し、一方で酸性ＥＰＯポリペプチドの画分は固相にとどまった。ＥＰＯポリペプチド酸性画分を、ｐＨ４で０．１５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出し、溶出液を常温で９０分間よりも長くｐＨ４で保ってウイルスを不活化した。この工程は、ＥＰＯポリペプチド酸性画分の濃度も増加させた。
【0255】
ＥＰＯポリペプチド酸性画分を含有する溶出液をＳＰ ＣＥＸカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直接ロードして、ＥＰＯポリペプチド酸性画分をさらに濃縮するとともに、任意の残存エンドトキシンおよび塩基性ＥＰＯポリペプチド画分を分画除去した。ＥＰＯポリペプチド酸性画分を、ｐＨ４で０．５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出し、溶出液を常温で９０分間よりも長くｐＨ４で保ってウイルスを不活化した。
【0256】
タンジェント流濾過（ＴＦＦ）を用いて、ＥＰＯポリペプチド画分の酸性および塩基性画分を濃縮し得る。任意の凝集体を除去するためにおよび所望のバッファー（例えば、下で記載される製剤バッファー）へのバッファー交換として、Ｓｐｅｒｄｅｘ２００を用いたゲル濾過工程を実施し得る。ナノ濾過工程を実施して、任意の残存ウイルス夾雑物を除去し得る。
【0257】
実施例４
ＥＰＯバッファー製剤
様々なバッファー製剤におけるネコＥＰＯの熱安定性を解析した。ｐＨ６．２およびｐＨ７で、２０ｍＭクエン酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウムを含有するバッファーを考察した。１４０ｍＭの最終濃度の塩化ナトリウムをすべてのバッファーにおいて用いた。ポリソルベート８０および２０を比較した。静菌性の試薬ベンジルアルコールおよびｍ－クレゾールも比較した。各バッファー中６μｇ／μＬの濃度のネコＥＰＯアナログ６－３０ＧＶ成熟の融解温度（Ｔｍ）を、２０℃から９５℃までの示差走査蛍光技法によって測定した。表５は、試験した様々なバッファーにおけるネコＥＰＯのＴｍ値を列挙している。
*ピークなしは、異なる融点が観察されなかったことを示す。
ＥＰＯバッファー製剤
様々なバッファー製剤におけるネコＥＰＯの熱安定性を解析した。ｐＨ６．２およびｐＨ７で、２０ｍＭクエン酸ナトリウムまたは２０ｍＭリン酸ナトリウムを含有するバッファーを考察した。１４０ｍＭの最終濃度の塩化ナトリウムをすべてのバッファーにおいて用いた。ポリソルベート８０および２０を比較した。静菌性の試薬ベンジルアルコールおよびｍ－クレゾールも比較した。各バッファー中６μｇ／μＬの濃度のネコＥＰＯアナログ６－３０ＧＶ成熟の融解温度（Ｔｍ）を、２０℃から９５℃までの示差走査蛍光技法によって測定した。表５は、試験した様々なバッファーにおけるネコＥＰＯのＴｍ値を列挙している。
【0258】
抗細菌剤を含有せずかつ５０℃またはそれを上回るＴｍを有する製剤Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３は、単回投薬により望ましくあり得る。抗細菌剤を含有する製剤の中で、５０℃のＴｍを有する製剤Ａ５およびＣ６は、複数回投薬により望ましいように見える。
【0259】
実施例５
アナログ６－３０ＧＶ成熟の特徴づけ
実施例３の方法を用いて単離されたネコＥＰＯアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の特徴を明らかにした。
アナログ６－３０ＧＶ成熟の特徴づけ
実施例３の方法を用いて単離されたネコＥＰＯアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の特徴を明らかにした。
【0260】
塩基性および酸性アナログ６－３０ＧＶ成熟画分を、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）（図１Ａおよび図２）およびドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル（図１Ｂ）により可視化した。
【0261】
ウェスタン解析に関しては、アナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分の段階希釈（１μｇ、０．５μｇ、０．２μｇ、０．１μｇ、および０．０５μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、膜を１：１０００希釈のウサギ抗ヒトＥＰＯポリクローナル抗体（カタログ番号ＡＢ－３８６－ＮＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブした（図３）。抗体はヒトＥＰＯのＮ末端１９アミノ酸に特異的であり、それはネコＥＰＯの同じＮ末端１９アミノ酸である。グリコシル化された野生型ネコＥＰＯ成熟形態の分子量は、推定約３４ｋＤａである。図３に基づき、アナログ６－３０ＧＶ成熟の分子量は約５０～５５ｋＤａであると見られる。付加的なグリコシル化は、分子サイズの増加に寄与していると見られる。
【0262】
タンパク質上のシアル酸付加によるグリコシル化は、インビボ薬物動態を増強し得る。すべての脊椎動物グリカン上に末端単位として発現される共通のシアル酸には、典型的に、Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）が含まれる。アナログ６－３０ＧＶ成熟のシアル酸解析を実施した。簡潔には、アナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分を８０℃にて２Ｍ酢酸で３時間処理し、その後、酢酸を減圧遠心分離下で除去した。処理されたＥＰＯ試料を３Ｋスピン濾過ユニットにより濾過して、加水分解されていないタンパク質を除去した。素通り試料をＤＭＢ試薬と反応させた。０．０４μｇのインジェクション量を、Ｃ１８カラムおよび蛍光検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってプロファイルした。トランスフェクトされたＣＨＯ ＤＧ４４細胞によって発現されるアナログ６－３０ＧＶ成熟上に存在するシアル酸の支配的形態として、Ｎ－アセチルノイラミン酸が同定された。検出可能なＮ－グリコリルノイラミン酸は同定されなかった（図４）。
【0263】
アナログ６－３０ＧＶ成熟のＮ末端配列をエドマン配列決定によって確認した。簡潔には、単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。タンパク質バンドを膜から単離し、カリフォルニア大学デービス校のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいてエドマン分解を用いたＮ末端配列決定に供した。Ｎ末端配列はＡｌａ Ｐｒｏ Ｘａａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｘａａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌとして同定され、それは配列番号１４のＮ末端配列に相当する。
【0264】
単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）を、製造業者の指示書を用いてＮ－グリカナーゼ（登録商標）（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）（カタログ番号ＧＫＥ－５００６Ａ、ＰｒｏＺｙｍｅ，ＣＡ）で処理して、Ｎ－結合グリカンを除去した。脱グリコシル化過程を、１９ｋＤバンドが可視化されるまでＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニターし、ポリペプチドが脱グリコシル化されたことを示した。脱グリコシル化されたアナログ６－３０ＧＶ成熟試料の断片の配列を、カリフォルニア州Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙにおいて、タンデム質量分析を用いて解析した。アナログ６－３０成熟の配列を、ペプチド配列の７７％をマッピングすることによって確認した（データ示さず）。
【0265】
実施例６
インビトロ活性に対するネコＥＰＯのシアル酸付加の効果
単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分および塩基性画分のインビトロ活性を、ＴＦ－１細胞増殖アッセイによって比較した。ＴＦ－１細胞は、因子依存性ヒト赤白血球細胞である。ＥＰＯは、ＴＦ－１細胞増殖を促進する因子の１つである。酸性（または高度シアル酸付加）画分は約２～約３．５の等電点域を有し、塩基性（または低度シアル酸付加）画分は約３．５～約５の等電点域を有した。
インビトロ活性に対するネコＥＰＯのシアル酸付加の効果
単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分および塩基性画分のインビトロ活性を、ＴＦ－１細胞増殖アッセイによって比較した。ＴＦ－１細胞は、因子依存性ヒト赤白血球細胞である。ＥＰＯは、ＴＦ－１細胞増殖を促進する因子の１つである。酸性（または高度シアル酸付加）画分は約２～約３．５の等電点域を有し、塩基性（または低度シアル酸付加）画分は約３．５～約５の等電点域を有した。
【0266】
増殖アッセイに関しては、ＴＦ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２００３）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２１５－ＧＭ）を補給したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｒｖｉｎｅカタログ番号９１６０）中で培養した。アナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分または塩基性画分のいずれかでの処理の前に、ＴＦ－１細胞をｍＬあたり２×１０５個細胞で９６平底ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌朝、細胞を、アナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性および塩基性画分の種々の濃度で処理した。４８時間のインキュベーション後、製造業者の指示書に従って、ＭＴＴ試薬（カタログ番号ＣＧＤ１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を細胞にもう４８～７２時間添加した。次いで、不溶性の紫色の反応産物をイソプロパノールで溶解し、プレートを５７０および６９０ｎｍで読み取った。増殖強度を、バックグラウンド補正した、５７０ｎｍと６９０ｎｍとの間の光学濃度の差（ΔＯＤ）として測定した。単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分は、細胞に基づく機能アッセイにおいて、塩基性画分よりも低い力価を示し（図５）、シアル酸付加が高度であるほどより低い活性につながることを示唆した。
【0267】
実施例７
薬物動態に対するシアル酸付加の効果
単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の塩基性画分の１０μｇ／ｋｇ用量、または単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分の１０μｇ／ｋｇ用量の単回注射を伴う、猫における薬物動態調査を行った。検討した塩基性（または低度シアル酸付加）画分は約４～約６の等電点域を有し、酸性画分は約２～約３．５の等電点域を有した。２匹の猫に塩基性画分を皮下注射し、１１匹の猫に酸性画分を注射した（４匹の猫は静脈内注射を介して；４匹の猫は皮下注射を介して；および３匹の猫は筋肉内注射を介して）。
薬物動態に対するシアル酸付加の効果
単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の塩基性画分の１０μｇ／ｋｇ用量、または単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分の１０μｇ／ｋｇ用量の単回注射を伴う、猫における薬物動態調査を行った。検討した塩基性（または低度シアル酸付加）画分は約４～約６の等電点域を有し、酸性画分は約２～約３．５の等電点域を有した。２匹の猫に塩基性画分を皮下注射し、１１匹の猫に酸性画分を注射した（４匹の猫は静脈内注射を介して；４匹の猫は皮下注射を介して；および３匹の猫は筋肉内注射を介して）。
【0268】
注射前（時間０）におけるおよび注射後の様々な時点における血清からのＥＰＯ濃度を、ＥＬＩＳＡによって解析した。単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の塩基性画分の試料を、ＥＬＩＳＡにおいて、０．４ｎｇ／ｍＬの検出限界を有する参照として用いた。単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の塩基性画分を皮下注射された猫の血清において、ＥＰＯは経時的にほとんど検出されず、低度シアル酸付加形態の非常に短い半減期を示唆した（図６Ａ）。静脈内、皮下、および筋肉内投与によって、単離されたアナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性画分を注射された猫の血清におけるＥＰＯ濃度が、それぞれ図６Ｂ、図６Ｃ、および図６Ｄに示されている。平均値として算出された薬物動態パラメーターが、下記の表６に列挙されている。
*生体利用能は、IV群における100%生体利用能という仮定に基づいて算出されている。
【0269】
アナログ６－３０ＧＶ成熟の高度シアル酸付加は、インビボにおけるポリペプチドの薬物動態を増強しているように見えるが、インビトロでの細胞に基づく機能アッセイにおいてその力価を低下させているように見える（実施例６）。ネコＥＰＯの薬物動態は、高度シアル酸付加によりインビボで増強され得るものの、トレードオフは、より低いアフィニティーおよび活性であり得る。そして、低度シアル酸付加されたネコＥＰＯは、より優れたアフィニティーおよび活性を有し得るものの、それはより短い半減期を呈する可能性が高い。
【0270】
実施例８
ネコＥＰＯ受容体の発現
単一膜貫通ドメインを有する数種のネコＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）タンパク質は、エクソン３のヌクレオチド配列の差に由来する選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡ配列により生じる。２種のＥＰＯＲタンパク質のアミノ酸配列を、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースから獲得した：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｍ３Ｘ４９１ Ｍ３Ｘ４９１＿ＦＥＬＣＡ（配列番号２７）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｍ３Ｗ３３３ Ｍ３Ｗ３３３＿ＦＥＬＣＡ（配列番号３２）。Ｍ３Ｘ４９１＿ＦＥＬＣＡのアミノ酸配列は、本明細書においてネコＥＰＯＲ２０１（ｆＥＰＯＲ２０１）とも指定される。しかしながら、Ｍ３Ｗ３３３の位置５０～５３におけるアミノ酸は公知ではなく、データベースにおいて「Ｘ」によって表される。３次元タンパク質構造解析を用いて、Ｍ３Ｗ３３３に対するアミノ酸配列を改変し、位置５０～５３にアミノ酸を挿入してｆＥＰＯＲ２０２（配列番号２８）を産出した。
ネコＥＰＯ受容体の発現
単一膜貫通ドメインを有する数種のネコＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）タンパク質は、エクソン３のヌクレオチド配列の差に由来する選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡ配列により生じる。２種のＥＰＯＲタンパク質のアミノ酸配列を、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースから獲得した：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｍ３Ｘ４９１ Ｍ３Ｘ４９１＿ＦＥＬＣＡ（配列番号２７）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｍ３Ｗ３３３ Ｍ３Ｗ３３３＿ＦＥＬＣＡ（配列番号３２）。Ｍ３Ｘ４９１＿ＦＥＬＣＡのアミノ酸配列は、本明細書においてネコＥＰＯＲ２０１（ｆＥＰＯＲ２０１）とも指定される。しかしながら、Ｍ３Ｗ３３３の位置５０～５３におけるアミノ酸は公知ではなく、データベースにおいて「Ｘ」によって表される。３次元タンパク質構造解析を用いて、Ｍ３Ｗ３３３に対するアミノ酸配列を改変し、位置５０～５３にアミノ酸を挿入してｆＥＰＯＲ２０２（配列番号２８）を産出した。
【0271】
ヒトＦｃに融合した（それぞれ配列番号７および８）ネコＥＰＯＲ２０１およびＥＰＯＲ２０２の可溶型の細胞外ドメイン（それぞれ配列番号２３および２４）をコードするヌクレオチド配列を合成し、哺乳動物発現ベクター内にクローニングし、ＣＨＯ細胞において発現させた。細胞ペレットからの上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびプローブとして抗Ｆｃ抗体を用いたウェスタンブロットによって解析し、ｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－ＦｃおよびｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃの両方とも組み換えにより発現し得ることが実証された（図７Ａ）。それぞれ配列番号２９および３０のアミノ酸配列を含むＥＰＯＲ２０１およびＥＰＯＲ２０２の細胞外ドメインも用いられ得る。
【0272】
Ｎ末端ｆｌａｇタグを有する完全長ネコＥＰＯＲ２０１およびＥＰＯＲ２０２（それぞれ配列番号５および６）をコードするヌクレオチド配列を合成し、哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。各発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、各トランスフェクションからの安定なプール細胞を選択した。細胞ペレットからの溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびプローブとして抗ｆｌａｇ抗体を用いたウェスタンブロットによって解析し、ｆＥＰＯＲ２０１－Ｎ－ｆｌａｇおよびｆＥＰＯＲ２０２－Ｎ－ｆｌａｇの両方とも組み換えにより発現し得ることが実証された（図７Ｂおよび図７Ｃ）。ネコ完全長ＥＰＯＲ発現細胞株は、適正な改変の有無にかかわらず、ネコＥＰＯ結合アッセイまたは機能アッセイに用いられ得る。ＥＰＯＲ２０１タンパク質の両方（配列番号５および７）を、標準的プロテインＡクロマトグラフィーを用いて単離した。
【0273】
実施例９
ネコＥＰＯ受容体へのアナログ６－３０ＧＶ成熟の結合
ｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－Ｆｃ（配列番号７）およびｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃ（配列番号８）へのアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１２）の結合を別個に試験した。結合解析を以下のように実施した。簡潔には、ｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－ＦｃおよびｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃを、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（カタログ番号２１３３６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。遊離した未反応のビオチンを透析によって除去した。ビオチン化されたｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－ＦｃおよびｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃを、ストレプトアビジンセンサーチップ（カタログ番号１８－５０９、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に捕捉した。
ネコＥＰＯ受容体へのアナログ６－３０ＧＶ成熟の結合
ｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－Ｆｃ（配列番号７）およびｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃ（配列番号８）へのアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１２）の結合を別個に試験した。結合解析を以下のように実施した。簡潔には、ｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－ＦｃおよびｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃを、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（カタログ番号２１３３６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化した。遊離した未反応のビオチンを透析によって除去した。ビオチン化されたｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－ＦｃおよびｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃを、ストレプトアビジンセンサーチップ（カタログ番号１８－５０９、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に捕捉した。
【0274】
５つの異なる濃度（１５０、５０、１７、５．６、および１．９ｎＭ）のアナログ６－３０ＧＶ成熟の会合を９０秒間モニターした。解離を６００秒間モニターした。バッファーのみのブランク曲線を差し引いて、任意のドリフトを補正した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ解析ソフトウェアを用いて、データを１：１結合モデルにフィットさせて、ｋｏｎ（会合速度定数）、ｋｏｆｆ（解離速度定数）、およびＫｄ（解離定数）を決定した。結合統計は、許容されるパラメーターの範囲内に収まった（３．０未満またはそれに等しいカイ二乗；０．９より大きいまたはそれに等しい決定係数（Ｒ－ｓｑｕａｒｅｄ））。希釈およびすべての結合工程のためのバッファーは、２００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０５％アジ化ナトリウム、および０．１ｍｇ ＢＳＡ、ｐＨ７．４であった。アナログ６－３０ＧＶ成熟とｆＥＰＯＲ２０１＿ＥＣＤ－Ｆｃ（配列番号７）とのＫｄは４×１０－１０Ｍであり、アナログ６－３０ＧＶ成熟とｆＥＰＯＲ２０２＿ＥＣＤ－Ｆｃ（配列番号８）とのＫｄは１．７×１０－１０Ｍであった。
【0275】
実施例１０
ヒトＥＰＯ受容体へのアナログ６－３０ＧＶ成熟およびヒトＥＰＯ結合の比較
ヒトＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）へのアナログ６－３０ＧＶ成熟および組み換えヒトＥＰＯ（カタログ番号Ｅ５６２７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の結合を比較した。簡潔には、ヒトＥＰＯＲ（カタログ番号９６３－ＥＲ－０５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の細胞外ドメインをビオチン化した。遊離した未反応のビオチンを、ビオチン化されたヒトＥＰＯＲから大量の透析によって除去した。ビオチン化されたヒトＥＰＯＲを、ストレプトアビジンセンサーチップ上に捕捉した。５つの異なる濃度（２０、６．７、２．２、０．７４、および０．２５ｎＭ）のアナログ６－３０ＧＶ成熟またはヒトＥＰＯのいずれかと、ヒトＥＰＯＲとの会合を９０秒間モニターした。解離を６００秒間モニターした。バッファーのみのブランク曲線を差し引いて、任意のドリフトを補正した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ解析ソフトウェアを用いて、データを１：１結合モデルにフィットさせて、ｋｏｎ（会合速度定数）、ｋｏｆｆ（解離速度定数）、およびＫｄ（解離定数）を決定した。結合統計は、許容されるパラメーターの範囲内に収まった（３．０未満またはそれに等しいカイ二乗；０．９より大きいまたはそれに等しい決定係数）。希釈およびすべての結合工程のためのバッファーは、２００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０５％アジ化ナトリウム、および０．１ｍｇ ＢＳＡ、ｐＨ７．４であった。ヒトＥＰＯとヒトＥＰＯＲとのＫｄは１．０７×１０－１０Ｍであり、アナログ６－３０ＧＶ成熟とヒトＥＰＯＲとのＫｄは９．７６×１０－１１Ｍであった。アナログ６－３０ＧＶ成熟およびヒトＥＰＯは、ヒトＥＰＯＲに対して同程度の結合アフィニティーを有するように見える。
ヒトＥＰＯ受容体へのアナログ６－３０ＧＶ成熟およびヒトＥＰＯ結合の比較
ヒトＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）へのアナログ６－３０ＧＶ成熟および組み換えヒトＥＰＯ（カタログ番号Ｅ５６２７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の結合を比較した。簡潔には、ヒトＥＰＯＲ（カタログ番号９６３－ＥＲ－０５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の細胞外ドメインをビオチン化した。遊離した未反応のビオチンを、ビオチン化されたヒトＥＰＯＲから大量の透析によって除去した。ビオチン化されたヒトＥＰＯＲを、ストレプトアビジンセンサーチップ上に捕捉した。５つの異なる濃度（２０、６．７、２．２、０．７４、および０．２５ｎＭ）のアナログ６－３０ＧＶ成熟またはヒトＥＰＯのいずれかと、ヒトＥＰＯＲとの会合を９０秒間モニターした。解離を６００秒間モニターした。バッファーのみのブランク曲線を差し引いて、任意のドリフトを補正した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ解析ソフトウェアを用いて、データを１：１結合モデルにフィットさせて、ｋｏｎ（会合速度定数）、ｋｏｆｆ（解離速度定数）、およびＫｄ（解離定数）を決定した。結合統計は、許容されるパラメーターの範囲内に収まった（３．０未満またはそれに等しいカイ二乗；０．９より大きいまたはそれに等しい決定係数）。希釈およびすべての結合工程のためのバッファーは、２００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０５％アジ化ナトリウム、および０．１ｍｇ ＢＳＡ、ｐＨ７．４であった。ヒトＥＰＯとヒトＥＰＯＲとのＫｄは１．０７×１０－１０Ｍであり、アナログ６－３０ＧＶ成熟とヒトＥＰＯＲとのＫｄは９．７６×１０－１１Ｍであった。アナログ６－３０ＧＶ成熟およびヒトＥＰＯは、ヒトＥＰＯＲに対して同程度の結合アフィニティーを有するように見える。
【0276】
実施例１１
ＴＦ－１細胞に対するアナログ６－３０ＧＶ成熟およびヒトＥＰＯ増殖効果の比較
ＥＰＯポリペプチドは、２つのＥＰＯ受容体結合部位を有する。第２部位結合はヒトにおいて弱い（第１の部位と比較して約５００～１０００倍低いアフィニティー）と理解されていることから、実施例１０に記載されるアッセイと同様のインビトロ結合アッセイは、第１部位結合カイネティクスを大きく反映する。Ｐｈｉｌｏ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ＥＰＯ：ｏｎｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｏｎｅ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１６８１－９１（１９９６）を参照されたい。本実施例に記載されるアッセイと同様のＥＰＯ依存的細胞増殖アッセイは、ＥＰＯ活性を査定し得る、というのもそれは、第１の結合部位ならびに第２の結合部位の完全性に関係するためである。
ＴＦ－１細胞に対するアナログ６－３０ＧＶ成熟およびヒトＥＰＯ増殖効果の比較
ＥＰＯポリペプチドは、２つのＥＰＯ受容体結合部位を有する。第２部位結合はヒトにおいて弱い（第１の部位と比較して約５００～１０００倍低いアフィニティー）と理解されていることから、実施例１０に記載されるアッセイと同様のインビトロ結合アッセイは、第１部位結合カイネティクスを大きく反映する。Ｐｈｉｌｏ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ＥＰＯ：ｏｎｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｏｎｅ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１６８１－９１（１９９６）を参照されたい。本実施例に記載されるアッセイと同様のＥＰＯ依存的細胞増殖アッセイは、ＥＰＯ活性を査定し得る、というのもそれは、第１の結合部位ならびに第２の結合部位の完全性に関係するためである。
【0277】
ヒトＥＰＯＲを発現するＴＦ－１細胞に対するアナログ６－３０ＧＶ成熟の増殖効果を、組み換えヒトＥＰＯ（カタログ番号Ｅ５６２７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のものと比較した。増殖アッセイに関しては、ＴＦ－１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２１５－ＧＭ）を補給したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｒｖｉｎｅカタログ番号９１６０）中で培養した。アナログ６－３０ＧＶ成熟または組み換えヒトＥＰＯのいずれかでの処理の前に、ＴＦ－１細胞をｍＬあたり２×１０５個細胞で９６平底ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌朝、細胞を、アナログ６－３０ＧＶ成熟または組み換えヒトＥＰＯの種々の濃度で処理した。４８時間のインキュベーション後、製造業者の指示書に従って、ＭＴＴ試薬を細胞にもう４８～７２時間添加した。次いで、不溶性の紫色の反応産物をイソプロパノールで溶解し、プレートを５７０および６９０ｎｍで読み取った。増殖強度を、バックグラウンド補正した、５７０ｎｍと６９０ｎｍとの間の光学濃度の差（ΔＯＤ）として測定した。
【0278】
アナログ６－３０ＧＶ成熟および組み換えヒトＥＰＯに対するＴＦ－１細胞の増殖応答が、図８に示されている。半値応答（ＥＣ５０）を与えるＥＰＯポリペプチドの濃度を、各増殖曲線に対して決定した。予想外に、ヒトＥＰＯＲに対するアナログ６－３０ＧＶ成熟および組み換えヒトＥＰＯの同程度のアフィニティー（実施例１０において測定される）は、このＭＴＴアッセイに基づく２種のＥＰＯポリペプチド間の同程度のＥＣ５０には転換されないように見えた。アナログ６－３０ＧＶ成熟に対するＥＣ５０（０．３ＩＵ／ｍＬ）は、組み換えヒトＥＰＯに対するＥＣ５０（０．０２ＩＵ／ｍＬ）よりも１桁高く、組み換えヒトＥＰＯと比較してアナログ６－３０ＧＶ成熟に対するより低い増殖活性を示唆した。
【0279】
実施例１２
ネコＥＰＯのタンパク質構造解析
組み換えヒトＥＰＯと比較してアナログ６－３０ＧＶ成熟の減少した増殖効果の考え得る理由を同定するために、野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８およびヒトＥＰＯの第２の受容体結合部位の構造を比較した。
ネコＥＰＯのタンパク質構造解析
組み換えヒトＥＰＯと比較してアナログ６－３０ＧＶ成熟の減少した増殖効果の考え得る理由を同定するために、野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８およびヒトＥＰＯの第２の受容体結合部位の構造を比較した。
【0280】
まず、ネコＥＰＯ Ｇ１８およびヒトＥＰＯの３次元構造を、当業者によって理解されるタンパク質構造モデル化により獲得した。ヒトＥＰＯの第２の結合部位の箇所に基づき、野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８の第２の結合部位を同定した。次に、野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８およびヒトＥＰＯの第２の受容体結合部位の接触面残基を比較し、野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８の第２部位結合に影響を及ぼしている可能性は低いことが見出された。次いで、野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８の第２の結合部位の内部におけるアミノ酸残基を考察した。予想外に、位置１８におけるグリシン（Ｇ）が、第２の結合部位の内部において同定された。加えて、タンパク質構造の空の体積を、Ｇ１８周辺で観察した。
【0281】
これは、野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８のタンパク質構造の検討につながった。野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８は変異体として特徴を明らかにされており、野生型ネコＥＰＯ Ｇ１８とＥＰＯ Ｅ１８との間の生物学的機能（例えば、増殖効果等）のいかなる差も不明である。このタンパク質構造解析に基づき、Ｇ１８とは異なり、Ｅ１８は、Ｒ１４と水素結合を、Ｙ１５と水素／ファンデルワールス力を形成するように見えた。Ｅ１８は、Ｋ９７とも相互作用するように見えた。図９を参照されたい。Ｒ１４、Ｙ１５、およびＫ９７は第２の結合部位の接触面に位置し、第２の受容体結合を維持することに直接関与し得る。
【0282】
加えて、他の哺乳動物種のアミノ酸配列を考察し、考察したもののすべては、Ｅ１８だけでなくＲ１４、Ｙ１５、およびＫ９７も共有することが見出された。４つすべてのアミノ酸（Ｒ１４、Ｙ１５、Ｅ１８、およびＫ９７）は、ヒト、犬、馬、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ラット、ヒツジ、およびブタにおいて保存されている。
【0283】
この解析に基づき、アナログ６－３０ＧＶ成熟のＧ１８は、その第２部位結合に影響を及ぼしている可能性があり、その減少した増殖効果に寄与している可能性がある。
【0284】
実施例１３
アナログ６－３０ＥＶの発現および単離
Ｅ１８が第２部位結合に重要であり得ることを発見次第、野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８のアナログを伴う調査を行った。野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４前駆体形態と比較して、付加的なＮ結合グリコシル化部位を有するＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を化学的に合成した。具体的には、配列は、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４前駆体の位置４４にグルタミン酸、位置１１３にバリン置換、ならびに位置５６～５８（Ｎ５６Ｔ５８）および１１４～１１６（Ｎ１１４）に２つの付加的なＮ結合グリコシル化部位を有する「アナログ６－３０ＥＶ前駆体」（配列番号４）をコードした。
アナログ６－３０ＥＶの発現および単離
Ｅ１８が第２部位結合に重要であり得ることを発見次第、野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８のアナログを伴う調査を行った。野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４前駆体形態と比較して、付加的なＮ結合グリコシル化部位を有するＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を化学的に合成した。具体的には、配列は、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４前駆体の位置４４にグルタミン酸、位置１１３にバリン置換、ならびに位置５６～５８（Ｎ５６Ｔ５８）および１１４～１１６（Ｎ１１４）に２つの付加的なＮ結合グリコシル化部位を有する「アナログ６－３０ＥＶ前駆体」（配列番号４）をコードした。
【0285】
ヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ ＤＧ－４４宿主細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ ＤＧ－４４細胞は、当該技術分野で公知であるように、発現ベクター上のＤＨＦＲ遺伝子およびメトトレキサート媒介性遺伝子増幅を用いた、ＥＰＯポリペプチドの発現の高収量および安定性に対して選択された。「アナログ６－３０ＥＶ成熟」（配列番号１５）と名付けられたＥＰＯポリペプチドの成熟形態は、培養培地中に分泌された。アナログ６－３０ＥＶ成熟を、実施例３に記載される方法に従って単離した。
【0286】
実施例１４
ネコＥＰＯ Ｅ４４に対するＮ結合グリコシル化部位
野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４前駆体形態（配列番号２または「野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４」）は、アミノ酸位置５０～５２、６４～６６、および１０９～１１１に３つのＮ結合グリコシル化部位を有し、それは、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４成熟形態（配列番号１３または「野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８」）のアミノ酸位置２４～２６、３８～４０、および８３～８５に相当する。
ネコＥＰＯ Ｅ４４に対するＮ結合グリコシル化部位
野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４前駆体形態（配列番号２または「野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４」）は、アミノ酸位置５０～５２、６４～６６、および１０９～１１１に３つのＮ結合グリコシル化部位を有し、それは、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４成熟形態（配列番号１３または「野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８」）のアミノ酸位置２４～２６、３８～４０、および８３～８５に相当する。
【0287】
付加的なＮ結合グリコシル化部位が、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４および野生型ネコＥＰＯ Ｅ１８アミノ酸配列にも導入され得る。例えば、１、２、３、４、５、または６つの付加的なＮ結合グリコシル化部位が、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４／Ｅ１８アミノ酸配列に導入され得る。Ｎ結合グリコシル化部位は、Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒというコンセンサス配列を有し得、式中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である。１つまたは複数のグリコシル化部位の付加は、ネコＥＰＯ分子の分子サイズを増加させ得、より多くのシアル酸付加部位を提供し得、および／または動物の血清における分子の半減期を向上させ得る。
【0288】
表７は、１つまたは複数の付加的なＮ結合グリコシル化部位を作出するために用いられ得る、野生型ネコＥＰＯ Ｅ４４およびＥ１８のアミノ酸置換を列挙している。
*Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸を示す。
【0289】
実施例１５
ＥＰＯＲへのアナログ６－３０ＥＶ成熟およびアナログ６－３０ＧＶ成熟の結合
ヒトＥＰＯＲ－Ｆｃ（カタログ番号９６３－ＥＲ－０５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）への、約２～約３．５の等電点域を有するアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の酸性（高度シアル酸付加）画分、アナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の酸性（高度シアル酸付加）画分、および約４～約５の等電点域を有するアナログ６－３０ＧＶ成熟の塩基性（低度シアル酸付加）画分の結合をＥＬＩＳＡによって試験した。
ＥＰＯＲへのアナログ６－３０ＥＶ成熟およびアナログ６－３０ＧＶ成熟の結合
ヒトＥＰＯＲ－Ｆｃ（カタログ番号９６３－ＥＲ－０５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）への、約２～約３．５の等電点域を有するアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の酸性（高度シアル酸付加）画分、アナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の酸性（高度シアル酸付加）画分、および約４～約５の等電点域を有するアナログ６－３０ＧＶ成熟の塩基性（低度シアル酸付加）画分の結合をＥＬＩＳＡによって試験した。
【0290】
９６ウェルプレートをマウス抗ＥＰＯ特異的抗体（カタログ番号ＭＡＢ２８７、クローン９Ｃ２１Ｄ１１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングして、ＥＰＯポリペプチドを捕捉した。ＥＰＯが結合したウェルを２００ｎｇ／ｍＬの濃度のヒトＥＰＯＲ－Ｆｃとともにインキュベートし、結合したＥＰＯＲを抗ヒトＦｃＨＲＰがコンジュゲートされた抗体によって検出した。２回目のＥＬＩＳＡを実施したが、ＥＰＯポリペプチドの３つの試料を、まずノイラミニダーゼで処理してシアル酸を除去した。結果として生じたＥＣ５０が、下記の表８に列挙されている。
* ELISA2を実施する前に、EPO試料をノイラミニダーゼ処理した。
【0291】
アナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性（高度シアル酸付加）画分は、塩基性（低度シアル酸付加）画分と比較してより高いＥＣ５０値を呈し、酸性画分との低下した受容体結合アフィニティーを示唆した。この結果は、アナログ６－３０ＧＶ成熟の酸性および塩基性画分を比較した実施例６の結合アッセイ結果と一致した。２回目のＥＬＩＳＡに関してシアル酸残基が除去された場合、アナログ６－３０ＥＶ成熟およびアナログ６－３０ＧＶ成熟に対するＥＣ５０値は概して同程度であり、ＥＰＯ受容体に対する同程度の結合アフィニティーを示唆した。
【0292】
実施例１６
アナログ６－３０ＥＶ成熟およびアナログ６－３０ＧＶ成熟の増殖効果
アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）およびアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の第１および第２の受容体結合部位の完全性を、実施例１１に記載されるＴＦ－１細胞増殖アッセイによって比較した。このアッセイにおいて、２つの試料：１）アナログ６－３０ＥＶ成熟、および２）５０％のアナログ６－３０ＥＶ成熟と５０％のアナログ６－３０ＧＶ成熟との混合物、を試験した。
アナログ６－３０ＥＶ成熟およびアナログ６－３０ＧＶ成熟の増殖効果
アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）およびアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の第１および第２の受容体結合部位の完全性を、実施例１１に記載されるＴＦ－１細胞増殖アッセイによって比較した。このアッセイにおいて、２つの試料：１）アナログ６－３０ＥＶ成熟、および２）５０％のアナログ６－３０ＥＶ成熟と５０％のアナログ６－３０ＧＶ成熟との混合物、を試験した。
【0293】
ＴＦ－１細胞を、種々の濃度の試料１および２で処理し、ＭＴＴ試薬を用いて増殖を測定した。反応産物をイソプロパノールで溶解し、プレートを５７０および６９０ｎｍで読み取った。増殖強度を、バックグラウンド補正した、５７０ｎｍと６９０ｎｍとの間の光学濃度の差（ΔＯＤ）として測定した。試料１および２に対するＴＦ－１細胞の増殖応答が、図１０に示されている。
【0294】
半値応答（ＥＣ５０）を与えるＥＰＯポリペプチドの濃度を、各増殖曲線に対して決定した。試料１（４．７８ｎｇ／ｍＬ）および試料２（４．５４ｎｇ／ｍＬ）に対するＥＣ５０は同程度であり、試料２における５０％のアナログ６－３０ＧＶ成熟の存在は、ＥＣ５０に影響を及ぼさなかった可能性が高いことを示唆した。しかしながら、アナログ６－３０ＧＶ成熟は、試料１（ΔＯＤ＝０．４４）と比較した場合、試料２（ΔＯＤ＝０．２９）のスパンまたは増殖シグナルを低下させるように見えた。２つの試料間での増殖活性の低下は、Ｇ１８が第２部位結合活性を弱めることを示唆する。
【0295】
実施例１７
ＥＰＯ第２部位変異体
第２の結合部位に欠陥（または「部位２欠陥」）を有するＥＰＯを用いて、内因性のＥＰＯ活性に拮抗し得る。例えば、第２部位結合に欠陥を有するＥＰＯは、ＥＰＯ受容体結合を競合し得かつシグナル伝達をブロックし得、ゆえに新たな赤血球作出を阻止し得る。ゆえに、第２部位変異を有するＥＰＯは、過度のＥＰＯを分泌する腫瘍（例えば、腎臓腫瘍）またはＥＰＯの過剰生成の遺伝性障害によって引き起こされる病状など、過度のＥＰＯ生成に起因した多血症（上昇した赤血球数）のある特定の形態などの疾患を治療する薬剤であり得る。
ＥＰＯ第２部位変異体
第２の結合部位に欠陥（または「部位２欠陥」）を有するＥＰＯを用いて、内因性のＥＰＯ活性に拮抗し得る。例えば、第２部位結合に欠陥を有するＥＰＯは、ＥＰＯ受容体結合を競合し得かつシグナル伝達をブロックし得、ゆえに新たな赤血球作出を阻止し得る。ゆえに、第２部位変異を有するＥＰＯは、過度のＥＰＯを分泌する腫瘍（例えば、腎臓腫瘍）またはＥＰＯの過剰生成の遺伝性障害によって引き起こされる病状など、過度のＥＰＯ生成に起因した多血症（上昇した赤血球数）のある特定の形態などの疾患を治療する薬剤であり得る。
【0296】
内因性のＥＰＯ受容体が超感受性であるまたは自己活性化型である場合において、第２の結合部位に欠陥を有するＥＰＯの投与は、変異受容体をブロックし得る。高用量において、部位２欠陥を有するＥＰＯは、必要な場合には標的細胞を殺傷して、過度の１：１比のＥＰＯ：受容体複合体を形成し得、および／または赤血球形成を低下させ得る。
【0297】
ヒトＥＰＯ、ネコＥＰＯ、またはイヌＥＰＯの１つまたは複数の第２部位変異は、野生型ネコＥＰＯポリペプチドの位置Ｌ（５）、Ｄ（８）、Ｒ（１０）、Ｖ（１１）、Ｒ（１４）、Ｙ（１５）、Ｑ（７８）、Ｄ（９６）、Ｋ（９７）、Ｖ（９９）、Ｓ（１００）、Ｒ（１０３）、Ｓ（１０４）、Ｔ／Ｓ（１０７）、Ｌ（１０８）、またはＲ（１１０）に相当する位置におけるアミノ酸置換から選択される。例えば、Ｒ（１０３）をＡｌａまたは他のアミノ酸に変異させて、第２部位活性を妨害し得る。
【0298】
実施例１８
アナログ６－３０ＥＶ成熟のシアル酸特徴づけ
アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の酸性画分のシアル酸含有量を解析し、ポリペプチドあたりおよそ２０個のシアル酸分子を有するアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の酸性画分のものと比較した。アナログ６－３０ＥＶ成熟およびアナログ６－３０ＧＶ成熟のＩＥＦプロファイルは類似しており、ＥアナログがＧアナログと同程度のシアル酸含有量を有することを示唆した。両アナログ上に存在するシアル酸の支配的形態として、Ｎ－アセチルノイラミン酸が同定された。
アナログ６－３０ＥＶ成熟のシアル酸特徴づけ
アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の酸性画分のシアル酸含有量を解析し、ポリペプチドあたりおよそ２０個のシアル酸分子を有するアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）の酸性画分のものと比較した。アナログ６－３０ＥＶ成熟およびアナログ６－３０ＧＶ成熟のＩＥＦプロファイルは類似しており、ＥアナログがＧアナログと同程度のシアル酸含有量を有することを示唆した。両アナログ上に存在するシアル酸の支配的形態として、Ｎ－アセチルノイラミン酸が同定された。
【0299】
シアル酸解析を以下のように実施した。３０μＬの試料と４μＬの氷酢酸とを混合することによって、アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）からシアル酸を放出した。混合物を８０℃で２時間インキュベートした。遊離したシアル酸を蛍光色素１，２－ジアミノ－４，５－メチレンオキシベンゼン（ｍｅｔｈｙｌｅｎｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ）（ＤＭＢ）で標識した。２０μＬのＤＭＢ－チオナイト（ｔｈｉｏｎｉｔｅ）溶液と５μＬの遊離したシアル酸試料とを混合することによって、蛍光標識化を実施した。混合物を５０℃で３時間インキュベートした。７５μＬの蒸留脱イオン水を添加することによって、反応を停止させた。ＤＭＢ標識されたシアル酸を、７％メタノール、９％アセトニトリル、および８４％水を含有する単一組成の（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）移動相を有する、Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８カラム（５μ、４．６×１５０ｍｍ）またはＥｘｔｅｎｄ Ｃ１８カラム（５μ、４．６×１５０ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを用いたＨＰＬＣによって解析した。すべてのノイラミン酸、例えばＮｅｕ５Ｇｃ（ＮＧＮＡ）；Ｎｅｕ５Ａｃ（ＮＡＮＡ）；Ｎｅｕ５，７Ａｃ２；Ｎｅｕ５，Ｇｃ９Ａｃ；Ｎｅｕ５，９Ａｃ２；およびＮｅｕ５，７（８），９Ａｃは、３０分以内にベースライン分離される。
【0300】
実施例１９
ネコＥＰＯＲへのネコＥＰＯ Ｅ１８の結合
ネコＥＰＯＲ（ｆＥＰＯＲ２０３（配列番号２７））の選択的スプライシングを受けた変異体に対する予測タンパク質配列を、アクセッション番号ＸＰ＿０１９６７３３７８．１としてＮＣＢＩデータベースから獲得した。位置３９におけるアミノ酸は公知ではなく、データベースにおいて「Ｘ」によって表される。３次元タンパク質構造モデル化を実施し、ＥＰＯＲ２０３（配列番号２１）の位置３９におけるアラニンの配置が、正しいＮ末端タンパク質立体構造を維持すると判定された。
ネコＥＰＯＲへのネコＥＰＯ Ｅ１８の結合
ネコＥＰＯＲ（ｆＥＰＯＲ２０３（配列番号２７））の選択的スプライシングを受けた変異体に対する予測タンパク質配列を、アクセッション番号ＸＰ＿０１９６７３３７８．１としてＮＣＢＩデータベースから獲得した。位置３９におけるアミノ酸は公知ではなく、データベースにおいて「Ｘ」によって表される。３次元タンパク質構造モデル化を実施し、ＥＰＯＲ２０３（配列番号２１）の位置３９におけるアラニンの配置が、正しいＮ末端タンパク質立体構造を維持すると判定された。
【0301】
ＥＰＯＲ２０３の可溶型の細胞外ドメインを同定し（ＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ ＥＣＤ；配列番号２６）、シグナル配列、ＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ ＥＣＤ、リンカー、およびヒトＦｃ（ＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃ；配列番号２２）をコードするヌクレオチド配列を合成し、哺乳動物発現ベクター内にクローニングし、ＨＥＫまたはＣＨＯ細胞において発現させた。ＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃを、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養物上清から精製し、中性ｐＨのＰＢＳ中に調合した。図７Ｄは、ネコＥＰＯＲ２０３＿ＥＣＤ＿ＦｃのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のクマシー染色を示している。配列番号３１のアミノ酸配列を含むＥＰＯＲ２０３の細胞外ドメインも用いられ得る。
【0302】
実施例２０
ネコＥＰＯ受容体へのアナログ６－３０ＥＶ成熟の結合
ネコＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃ（配列番号２６）へのアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の結合を、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて二つ組で査定した。ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを抗ヒトＥＰＯ抗体（４μｇ／ｍＬ）で冷蔵温度（２～８℃）にて一晩コーティングし、ＰＢＳ中５％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。アナログ６－３０ＥＶ成熟を、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）バッファー中５００ｎｇ／ｍＬの濃度から始まる２倍段階希釈で調製した。アナログ６－３０ＥＶ成熟の希釈液（１００μＬ）を各ウェルに移し、室温で２時間インキュベートした。ネコＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃ（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴバッファー中２００ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、結合を室温で１時間進めさせた。ウサギ抗ヒトＦｃ抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（０．２μｇ／ｍＬ）を検出に用い、室温で１時間ウェル中に放置した。３，３，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をＨＲＰ基質としてウェルに適用し、シグナル発生のために５～７分間ウェル中に保った。アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）とネコＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃとの間の結合が実証された。平均検出シグナルをアナログ６－３０ＥＶ成熟濃度に対してプロットし、曲線フィッティング解析を実施した（図１１）。
ネコＥＰＯ受容体へのアナログ６－３０ＥＶ成熟の結合
ネコＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃ（配列番号２６）へのアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の結合を、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて二つ組で査定した。ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを抗ヒトＥＰＯ抗体（４μｇ／ｍＬ）で冷蔵温度（２～８℃）にて一晩コーティングし、ＰＢＳ中５％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。アナログ６－３０ＥＶ成熟を、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）バッファー中５００ｎｇ／ｍＬの濃度から始まる２倍段階希釈で調製した。アナログ６－３０ＥＶ成熟の希釈液（１００μＬ）を各ウェルに移し、室温で２時間インキュベートした。ネコＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃ（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴバッファー中２００ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、結合を室温で１時間進めさせた。ウサギ抗ヒトＦｃ抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（０．２μｇ／ｍＬ）を検出に用い、室温で１時間ウェル中に放置した。３，３，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をＨＲＰ基質としてウェルに適用し、シグナル発生のために５～７分間ウェル中に保った。アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）とネコＥＰＯＲ２０３＿３９Ａ＿ＥＣＤ＿Ｆｃとの間の結合が実証された。平均検出シグナルをアナログ６－３０ＥＶ成熟濃度に対してプロットし、曲線フィッティング解析を実施した（図１１）。
【0303】
実施例２１
正常な猫へのアナログ６－３０ＥＶ成熟の投与
１μｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、３μｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、もしくは１０μｇ／ｋｇ（ｎ＝５）のアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）、１０μｇ／ｋｇ（ｎ＝４）のアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）、またはＰＢＳの単回用量を正常な猫へ皮下投与した。網状赤血球絶対数パーセンテージを、ＥＰＯ生物活性の指標として測定した。要するに、ＥＰＯは赤血球系細胞上のＥＰＯ受容体に結合し、受容体の二量体化はＪＡＫ２経路およびエリスロポエシスのシグナル伝達を活性化する。赤血球系細胞は網状赤血球に、次いで赤血球に分化する。ゆえに、ＥＰＯ生物活性およびエリスロポエシスの増加は、網状赤血球絶対数のパーセンテージの増加によって証明される。
正常な猫へのアナログ６－３０ＥＶ成熟の投与
１μｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、３μｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、もしくは１０μｇ／ｋｇ（ｎ＝５）のアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）、１０μｇ／ｋｇ（ｎ＝４）のアナログ６－３０ＧＶ成熟（配列番号１４）、またはＰＢＳの単回用量を正常な猫へ皮下投与した。網状赤血球絶対数パーセンテージを、ＥＰＯ生物活性の指標として測定した。要するに、ＥＰＯは赤血球系細胞上のＥＰＯ受容体に結合し、受容体の二量体化はＪＡＫ２経路およびエリスロポエシスのシグナル伝達を活性化する。赤血球系細胞は網状赤血球に、次いで赤血球に分化する。ゆえに、ＥＰＯ生物活性およびエリスロポエシスの増加は、網状赤血球絶対数のパーセンテージの増加によって証明される。
【0304】
図１２は、投薬の１日前の時点での、ならびに偽薬またはアナログ６－３０ＥＶ成熟またはＰＢＳ（ｎ＝４）の皮下投与の５、７、１０、および１４日後の時点での、猫における平均網状赤血球絶対数パーセンテージを示している。図１３は、投薬の４日前の時点での、ならびにアナログ６－３０ＧＶの皮下投与の３、５、１０、１７、１９、２４、３１、および３３日後の時点での、猫における平均網状赤血球絶対数パーセンテージを示している。アナログ６－３０ＥＶ成熟で処理された群ではエリスロポエシスの増加が実証されたが、アナログ６－３０ＧＶ成熟で処理された群ではそうではなかった。
【0305】
実施例２２
貧血猫におけるアナログ６－３０ＥＶ成熟の有効性調査
非盲検の、ヒストリカルコントロールの（猫の治療後および治療前のデータを比較した）、パイロット有効性調査を行って、国際獣医腎臓病研究グループ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）（ＩＲＩＳ）ステージ３慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）および貧血を有するクライアント所有の猫における赤血球（ＲＢＣ）、網状赤血球、および生命の質（ＱｏＬ）に対する、アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の効率を評価した。任意の有害事象（ＡＥ）の照合および中和抗体の存在によって、安全性も評価した。調査を完了した２匹の猫からの予備データは、貧血の向上（すなわち、ヘマトクリットパーセンテージ（ＨＣＴ％）の増加）を示し、腎臓機能に特異的な対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および血清クレアチニン腎臓バイオマーカー試験における向上を示唆し、体重の維持または向上を示した。
貧血猫におけるアナログ６－３０ＥＶ成熟の有効性調査
非盲検の、ヒストリカルコントロールの（猫の治療後および治療前のデータを比較した）、パイロット有効性調査を行って、国際獣医腎臓病研究グループ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）（ＩＲＩＳ）ステージ３慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）および貧血を有するクライアント所有の猫における赤血球（ＲＢＣ）、網状赤血球、および生命の質（ＱｏＬ）に対する、アナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）の効率を評価した。任意の有害事象（ＡＥ）の照合および中和抗体の存在によって、安全性も評価した。調査を完了した２匹の猫からの予備データは、貧血の向上（すなわち、ヘマトクリットパーセンテージ（ＨＣＴ％）の増加）を示し、腎臓機能に特異的な対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）および血清クレアチニン腎臓バイオマーカー試験における向上を示唆し、体重の維持または向上を示した。
【0306】
以下の適格基準すべてを満たす、ＩＲＩＳステージ３ＣＫＤおよび貧血を有する猫が登録された。
【0307】
組み入れ基準
ネコは、
１．扱いやすく、調査手順に協力的である。
２．連続した２つの評価間で空腹時血清クレアチニンの２５％の増加を有する、急速進行性のＣＫＤを有する。
３．０日目に少なくとも１歳であり、任意の性別；無傷のまたは去勢された；妊娠していない、授乳していない；任意の品種および任意の重量である。
４．
ａ）２．９～５．０ｍｇ／ｄＬのスクリーニング来院時の空腹時血清クレアチニン、および０日目の６ヶ月以内の２．９～５．０ｍｇ／ｄＬの血清クレアチニンの以前の医療歴（空腹時または非空腹時）；ならびに
ｂ）尿比重（Ｕｒｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒａｖｉｔｙ）（ＵＳＧ）＜１．０３５
として定義されるＩＲＩＳステージ３ＣＫＤを有する。
５．非再生性貧血および１５～３０％ＨＣＴを有する。
６．ＣＫＤに対する標準的医療を受けているところである。
ネコは、
１．扱いやすく、調査手順に協力的である。
２．連続した２つの評価間で空腹時血清クレアチニンの２５％の増加を有する、急速進行性のＣＫＤを有する。
３．０日目に少なくとも１歳であり、任意の性別；無傷のまたは去勢された；妊娠していない、授乳していない；任意の品種および任意の重量である。
４．
ａ）２．９～５．０ｍｇ／ｄＬのスクリーニング来院時の空腹時血清クレアチニン、および０日目の６ヶ月以内の２．９～５．０ｍｇ／ｄＬの血清クレアチニンの以前の医療歴（空腹時または非空腹時）；ならびに
ｂ）尿比重（Ｕｒｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒａｖｉｔｙ）（ＵＳＧ）＜１．０３５
として定義されるＩＲＩＳステージ３ＣＫＤを有する。
５．非再生性貧血および１５～３０％ＨＣＴを有する。
６．ＣＫＤに対する標準的医療を受けているところである。
【0308】
除外基準
ネコは、
１．ほとんど屋外にいる（毎日の＞６０％を屋外で過ごす）。
２．連続した２つの評価間で空腹時血清クレアチニンの２５％の増加を有する、急速進行性のＣＫＤを有する。
３．今までにエリスロポエチン刺激剤で治療されたことがある。
４．０日目の６週間以内に全赤血球または濃厚赤血球（ｐａｃｋｅｄ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を投与されている。
５．以下のことを例外として、尿路感染症（ＵＴＩ）を有する：ＵＴＩを有する猫は３週間の適当な抗生物質療法（培養／感受性に基づく）および反復陰性培養での治療後に登録され得る。
６．以下の疾患／病状：
・新生物形成
・肝臓疾患
・ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）
・ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）
・糖尿病（ＤＭ）
・甲状腺機能亢進症
・ヘマトクリット＜１５％
・全身性血圧＞１６０ｍｍＨｇ
のいずれかを有する。
７．０日目の２週間前に、ＣＫＤに対する既存の並行医薬または療法に対して、新たな処方または処方変更（用量または投薬頻度）を要する。
ネコは、
１．ほとんど屋外にいる（毎日の＞６０％を屋外で過ごす）。
２．連続した２つの評価間で空腹時血清クレアチニンの２５％の増加を有する、急速進行性のＣＫＤを有する。
３．今までにエリスロポエチン刺激剤で治療されたことがある。
４．０日目の６週間以内に全赤血球または濃厚赤血球（ｐａｃｋｅｄ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を投与されている。
５．以下のことを例外として、尿路感染症（ＵＴＩ）を有する：ＵＴＩを有する猫は３週間の適当な抗生物質療法（培養／感受性に基づく）および反復陰性培養での治療後に登録され得る。
６．以下の疾患／病状：
・新生物形成
・肝臓疾患
・ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）
・ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）
・糖尿病（ＤＭ）
・甲状腺機能亢進症
・ヘマトクリット＜１５％
・全身性血圧＞１６０ｍｍＨｇ
のいずれかを有する。
７．０日目の２週間前に、ＣＫＤに対する既存の並行医薬または療法に対して、新たな処方または処方変更（用量または投薬頻度）を要する。
【0309】
２匹の猫に、およそ７～１０日間離してアナログ６－３０ＥＶ成熟（配列番号１５）を３μｇ／ｋｇの開始用量で２回皮下投与し、６週間追跡した。猫に鉄デキストランを並行して投与した。
【0310】
全来院時（予定のまたは予定外の）に、以下のデータを回収しおよび／または評価した：医療歴に関する身体検査、生命の質（活力、快適性、および精神的幸福）、食欲、活動性（首輪に取り付けたＶｅｔｒａｘ活動センサー）、血圧、および観察された事象についての所有者の日誌。初回スクリーニング時および６週目の来院時に、血液学、生化学、尿タンパク質対クレアチニン比に関する尿検査、およびＳＤＭＡ査定を行った。尿培養±感受性を、ベースライン時および必要に応じて調査を通じて査定した。ヘマトクリットを、予定のおよび予定外の全来院時に社内で査定した。
【0311】
ベースラインヘマトクリットは、猫ＷＥＸ－２０１において２２．８％のベースラインから３５．９％の最大値（４週目の時点で）まで（表９）、猫ＬＵＮ－２０１においてベースライン２６．６％から３５．５％の最大値（２週目の時点で）まで向上した（表１０）。貧血（ＨＣＴ）は、アナログ６－３０ＥＶ成熟の２回目の投薬後に両方の猫において向上したため、調査中に付加的な投薬は施されなかったが；しかしながら、ＷＥＸ－２０１において６週目およびＬＵＮ－２０１において５週目までのＨＣＴの下落は、さらなる治療を施してＨＣＴを維持し得ることを示唆する。ＳＤＭＡ腎臓バイオマーカー試験は、猫ＷＥＸ－２０１において３０から１４μｇ／ｄＬに（表９）、猫ＬＵＮ－２０１において２９から１７μｇ／ｄＬに（表１０）向上した（すなわち、低下した）。体重は、調査中に維持された（ＬＵＮ－２０１；表１０）または向上した（ＷＥＸ－２０１；表９）。
【0312】
猫において観察されたＳＤＭＡおよび血清クレアチニン腎臓バイオマーカーの向上傾向は、アナログ６－３０ＥＶ成熟による治療後の腎臓機能の向上を示唆する。後期ステージＣＫＤおよび貧血を有する猫が、非所望の体重減少をもたらす臨床的に関連した共存疾患を経験することは珍しいことではない。アナログ６－３０ＥＶ成熟による治療は、体重を増加させる（ＷＥＸ－２０１）または維持する（ＬＵＮ－２０１）のいずれかに有効であった。
（配列表）
SEQUENCE LISTING
<110> KINDRED BIOSCIENCES, INC.
<120> ERYTHROPOIETIN AND ANALOGS FOR VETERINARY USE
<130> 01157-0009-00PCT
<150> US 62/516,092
<151> 2017-06-06
<150> US 62/516,642
<151> 2017-06-07
<150> US 62/559,104
<151> 2017-09-15
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 192
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 1
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Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile
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35 40 45
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50 55 60
Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met
65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr
145 150 155 160
Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
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<211> 192
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 2
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Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile
20 25 30
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala
35 40 45
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50 55 60
Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met
65 70 75 80
Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu
85 90 95
Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln
100 105 110
Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu
115 120 125
Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala
130 135 140
Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr
145 150 155 160
Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
165 170 175
Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg
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<211> 192
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPO Analog 6-30 G44V113 precursor form or "Analog 6-30 GV
Precursor"
<400> 3
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Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile
20 25 30
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Gly Ala Arg Glu Ala
35 40 45
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50 55 60
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<213> Artificial Sequence
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<223> Feline EPO Analog 6-30 E44V113 precursor form or "Analog 6-30 EV
Precursor"
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Lys Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys
35 40 45
Val Asn Met Val Cys Met Arg Ala Pro Glu Ala Ser Ala Cys Gly Ser
50 55 60
Ser Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser
65 70 75 80
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100 105 110
Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe
115 120 125
Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg
130 135 140
Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro
145 150 155 160
Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu
165 170 175
Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr
180 185 190
Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val
195 200 205
Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly
210 215 220
Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser
225 230 235 240
Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr
245 250 255
Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val
260 265 270
Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg
275 280 285
Phe Thr Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro
290 295 300
Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln
305 310 315 320
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340 345 350
Cys Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro Gly Ala Glu Glu Gly Pro
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
Leu Leu Arg Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro Pro
450 455 460
His Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser Thr
465 470 475 480
Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln Gly Asp Ser Ser Thr
485 490 495
Gly Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Thr Glu
500 505 510
Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
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<210> 6
<211> 521
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flag_feline EPOR202_full-length (fEPOR202-N-flag)
<400> 6
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Lys Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys
35 40 45
Gly Lys Asp Gly Ser Val Cys Arg Pro Pro Gln Trp Phe Leu Glu Gly
50 55 60
Asn Ala Glu Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala
65 70 75 80
Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe Tyr Gln Leu
85 90 95
Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala Pro Thr Ala
100 105 110
Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser
115 120 125
Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala
130 135 140
Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp
145 150 155 160
Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly Gly His Val
165 170 175
Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile
180 185 190
Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln
195 200 205
Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu
210 215 220
Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg Met Ala Glu
225 230 235 240
Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu
245 250 255
Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser Leu Ile
260 265 270
Leu Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser His
275 280 285
Arg Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser Pro Glu
290 295 300
Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe Gln Leu
305 310 315 320
Trp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys Ala Pro
325 330 335
Phe Ala Glu Asp Pro Pro Ser Pro Leu Glu Val Leu Ser Glu Arg Cys
340 345 350
Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro Gly Ala Glu Glu Gly Pro Leu
355 360 365
Leu Glu Pro Leu Gly Ser Glu His Thr Gln Asp Thr Tyr Leu Val Leu
370 375 380
Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp Leu Pro Arg
385 390 395 400
Pro Asp Gly Ser Leu Asp Met Val Ala Met His Lys Gly Ser Glu Ala
405 410 415
Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ser Leu Lys Pro Gly Pro Glu Gly Ala
420 425 430
Leu Gly Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser Ser Gln Leu
435 440 445
Leu Arg Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr Pro Pro His
450 455 460
Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser Asp Ser Gly Ile Ser Thr Asp
465 470 475 480
Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln Gly Asp Ser Ser Thr Gly
485 490 495
Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala Thr Glu Thr
500 505 510
Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
515 520
<210> 7
<211> 488
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR201_ECD_human Fc
<400> 7
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Val Asn Met Val Cys Met Arg Ala Pro Glu
35 40 45
Ala Ser Ala Cys Gly Ser Ser Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe
50 55 60
Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe
65 70 75 80
Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln
85 90 95
Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr
100 105 110
Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val
115 120 125
Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val
130 135 140
Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu
145 150 155 160
Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val
165 170 175
Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala
180 185 190
Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala
195 200 205
Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala
210 215 220
Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu
225 230 235 240
Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Ile Glu Gly Arg Met
245 250 255
Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 8
<211> 490
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR202_ECD_human Fc
<400> 8
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Gly Lys Asp Gly Ser Val Cys Arg Pro Pro
35 40 45
Gln Trp Phe Leu Glu Gly Asn Ala Glu Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val
50 55 60
Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu
85 90 95
His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu
100 105 110
Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr
115 120 125
Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn
130 135 140
Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala
145 150 155 160
Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala
165 170 175
Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn
180 185 190
Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu
195 200 205
Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val
210 215 220
Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp
225 230 235 240
Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Ile Glu Gly
245 250 255
Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
260 265 270
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
290 295 300
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
305 310 315 320
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
325 330 335
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
340 345 350
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
355 360 365
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
370 375 380
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
385 390 395 400
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
405 410 415
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
420 425 430
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
435 440 445
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
450 455 460
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
465 470 475 480
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490
<210> 9
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210> 10
<211> 166
<212> PRT
<213> Canis lupus
<400> 10
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly
20 25 30
Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ala Ser Gln Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 11
<211> 166
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 11
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly
20 25 30
Cys Ser Phe Gly Glu Asn Val Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Ser Trp Lys Arg Met Glu Val Glu Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Gln Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Arg Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Ala Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 12
<211> 166
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 12
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Gly Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly
20 25 30
Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 13
<211> 166
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 13
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly
20 25 30
Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 14
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPO Analog 6-30 G18V87 mature form or "Analog 6-30 GV
Mature"
<400> 14
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Gly Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Asn Glu Thr
20 25 30
Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 15
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPO Analog 6-30 E18V87 mature form or "Analog 6-30 EV
Mature"
<400> 15
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Asn Glu Thr
20 25 30
Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 16
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human erythropoietin second site mutation R103A
<400> 16
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
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50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Ala Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210> 17
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felis catus Erythropoietin second site mutation R103A
<400> 17
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly
20 25 30
Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Ala Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 18
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Canis lupus erythropoietin second site mutation R103A
<400> 18
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly
20 25 30
Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ala Ser Gln Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Ala Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 19
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Equus caballus erythropoietin second site mutation R103A
<400> 19
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly
20 25 30
Cys Ser Phe Gly Glu Asn Val Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
35 40 45
Tyr Ser Trp Lys Arg Met Glu Val Glu Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Gln Gly Gln Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Leu Arg Leu His Val Asp
85 90 95
Lys Ala Val Ser Ser Leu Ala Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Pro Leu Arg Thr Phe Ala Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile
130 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Arg Gly Asp Arg
165
<210> 20
<211> 508
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 20
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Xaa Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser
115 120 125
Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val
130 135 140
Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly
145 150 155 160
Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala
165 170 175
Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly
180 185 190
Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu
195 200 205
Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg
210 215 220
Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu
245 250 255
Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ala Leu
260 265 270
Leu Ser His Arg Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro
275 280 285
Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn
290 295 300
Phe Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro
305 310 315 320
Cys Ala Pro Phe Ala Glu Asp Pro Pro Ser Pro Leu Glu Val Leu Ser
325 330 335
Glu Arg Cys Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro Gly Ala Glu Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Gly Ser Glu His Thr Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Arg Pro Asp Gly Ser Leu Asp Met Val Ala Met His Lys Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ser Leu Lys Pro Gly Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Leu Gly Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr
435 440 445
Pro Pro His Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser Asp Ser Gly Ile
450 455 460
Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln Gly Asp Ser
465 470 475 480
Ser Thr Gly Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala
485 490 495
Thr Glu Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
500 505
<210> 21
<211> 508
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felis catus EPO receptor EPOR203_39A
<400> 21
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser
115 120 125
Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val
130 135 140
Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly
145 150 155 160
Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala
165 170 175
Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly
180 185 190
Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu
195 200 205
Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg
210 215 220
Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu
245 250 255
Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ala Leu
260 265 270
Leu Ser His Arg Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro
275 280 285
Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn
290 295 300
Phe Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro
305 310 315 320
Cys Ala Pro Phe Ala Glu Asp Pro Pro Ser Pro Leu Glu Val Leu Ser
325 330 335
Glu Arg Cys Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro Gly Ala Glu Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Gly Ser Glu His Thr Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Arg Pro Asp Gly Ser Leu Asp Met Val Ala Met His Lys Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ser Leu Lys Pro Gly Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Leu Gly Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr
435 440 445
Pro Pro His Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser Asp Ser Gly Ile
450 455 460
Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln Gly Asp Ser
465 470 475 480
Ser Thr Gly Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala
485 490 495
Thr Glu Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
500 505
<210> 22
<211> 486
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR203_39A_ECD_Fc
<400> 22
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu
35 40 45
Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser
115 120 125
Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val
130 135 140
Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly
145 150 155 160
Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala
165 170 175
Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly
180 185 190
Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu
195 200 205
Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg
210 215 220
Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Gly Gly Gly Ser Pro
245 250 255
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
260 265 270
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
275 280 285
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
290 295 300
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
305 310 315 320
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
325 330 335
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
340 345 350
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
355 360 365
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
370 375 380
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
385 390 395 400
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
405 410 415
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
420 425 430
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
435 440 445
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
450 455 460
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
465 470 475 480
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 23
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR201 ECD
<400> 23
Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Val Asn Met
1 5 10 15
Val Cys Met Arg Ala Pro Glu Ala Ser Ala Cys Gly Ser Ser Glu Arg
20 25 30
Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val
35 40 45
Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp
50 55 60
Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg
65 70 75 80
Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg
100 105 110
Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu
115 120 125
Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu
130 135 140
Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn
145 150 155 160
Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu
165 170 175
Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg
180 185 190
Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly
195 200 205
Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp
210 215 220
Leu Asp
225
<210> 24
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR202 ECD
<400> 24
Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Gly Lys Asp
1 5 10 15
Gly Ser Val Cys Arg Pro Pro Gln Trp Phe Leu Glu Gly Asn Ala Glu
20 25 30
Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala
35 40 45
Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu
50 55 60
Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala
65 70 75 80
Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val
85 90 95
Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr
100 105 110
His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala
115 120 125
Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg
130 135 140
Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu
145 150 155 160
Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu
165 170 175
Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg
180 185 190
Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe
195 200 205
Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala
210 215 220
Ser Asp Leu Asp
225
<210> 25
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR203 ECD
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 25
Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Xaa Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu
20 25 30
Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly
35 40 45
Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys
50 55 60
Pro Cys Ser Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe
65 70 75 80
Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu
85 90 95
Leu Arg Val Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile
100 105 110
Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro
130 135 140
Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile
145 150 155 160
Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp
165 170 175
Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr
180 185 190
Thr Phe Met Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe
195 200 205
Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu
210 215 220
Asp Pro
225
<210> 26
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR203_39A ECD
<400> 26
Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu
20 25 30
Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly
35 40 45
Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys
50 55 60
Pro Cys Ser Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe
65 70 75 80
Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu
85 90 95
Leu Arg Val Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile
100 105 110
Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro
130 135 140
Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile
145 150 155 160
Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp
165 170 175
Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr
180 185 190
Thr Phe Met Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe
195 200 205
Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu
210 215 220
Asp Pro
225
<210> 27
<211> 512
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 27
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Val Asn Met Val Cys Met Arg Ala Pro Glu
35 40 45
Ala Ser Ala Cys Gly Ser Ser Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe
50 55 60
Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe
65 70 75 80
Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln
85 90 95
Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr
100 105 110
Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val
115 120 125
Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val
130 135 140
Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu
145 150 155 160
Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val
165 170 175
Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala
180 185 190
Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala
195 200 205
Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala
210 215 220
Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu
225 230 235 240
Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr
245 250 255
Leu Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ala
260 265 270
Leu Leu Ser His Arg Arg Phe Thr Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp
275 280 285
Pro Gly Ile Pro Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr
290 295 300
His Lys Gly Asn Phe Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Cys Leu
305 310 315 320
Trp Trp Ser Pro Cys Ala Pro Phe Ala Glu Asp Pro Pro Ser Pro Leu
325 330 335
Glu Val Leu Ser Glu Arg Cys Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro
340 345 350
Gly Ala Glu Glu Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Gly Ser Glu His Thr
355 360 365
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370 375 380
Pro Ser Glu Asp Leu Pro Arg Pro Asp Gly Ser Leu Asp Met Val Ala
385 390 395 400
Met His Lys Gly Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ser Leu
405 410 415
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420 425 430
Leu Asp Pro Ser Ser Gln Leu Leu Arg Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu
435 440 445
Leu Pro Pro Thr Pro Pro His Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser
450 455 460
Asp Ser Gly Ile Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala
465 470 475 480
Gln Gly Asp Ser Ser Thr Gly Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser
485 490 495
Leu Ile Pro Ala Thr Glu Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
500 505 510
<210> 28
<211> 511
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felis catus EPO receptor Sequence EPOR202
<400> 28
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Gly Lys Asp Gly Ser Val Cys Arg Pro Pro
35 40 45
Gln Trp Phe Leu Glu Gly Asn Ala Glu Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu
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100 105 110
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115 120 125
Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn
130 135 140
Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala
145 150 155 160
Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala
165 170 175
Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn
180 185 190
Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu
195 200 205
Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val
210 215 220
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225 230 235 240
Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile
245 250 255
Leu Thr Leu Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val
260 265 270
Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro
275 280 285
Gly Ile Pro Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His
290 295 300
Lys Gly Asn Phe Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Cys Leu Trp
305 310 315 320
Trp Ser Pro Cys Ala Pro Phe Ala Glu Asp Pro Pro Ser Pro Leu Glu
325 330 335
Val Leu Ser Glu Arg Cys Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro Gly
340 345 350
Ala Glu Glu Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Gly Ser Glu His Thr Gln
355 360 365
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370 375 380
Ser Glu Asp Leu Pro Arg Pro Asp Gly Ser Leu Asp Met Val Ala Met
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His Lys Gly Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ser Leu Lys
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420 425 430
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435 440 445
Pro Pro Thr Pro Pro His Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser Asp
450 455 460
Ser Gly Ile Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln
465 470 475 480
Gly Asp Ser Ser Thr Gly Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu
485 490 495
Ile Pro Ala Thr Glu Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
500 505 510
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<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR201 ECD (minimal)
<400> 29
Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Val Asn Met Val Cys Met Arg Ala Pro
1 5 10 15
Glu Ala Ser Ala Cys Gly Ser Ser Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys
20 25 30
Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser
35 40 45
Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His
50 55 60
Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala
85 90 95
Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu
100 105 110
Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp
115 120 125
Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro
130 135 140
Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val
145 150 155 160
Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys
165 170 175
Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg
180 185 190
Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser
195 200 205
Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr
210 215
<210> 30
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR202 ECD (minimal)
<400> 30
Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Gly Lys Asp Gly Ser Val Cys Arg Pro
1 5 10 15
Pro Gln Trp Phe Leu Glu Gly Asn Ala Glu Glu Arg Leu Glu Asp Leu
20 25 30
Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn
35 40 45
Tyr Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser
50 55 60
Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser
65 70 75 80
Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val
85 90 95
Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile
100 105 110
Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg
115 120 125
Ala Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly
130 135 140
Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly
145 150 155 160
Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr
165 170 175
Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met
180 185 190
Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala
195 200 205
Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr
210 215
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR203 ECD (minimal)
<400> 31
Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro
1 5 10 15
Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe
20 25 30
Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe
35 40 45
Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln
50 55 60
Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val
85 90 95
Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val
100 105 110
Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu
115 120 125
Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val
130 135 140
Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala
145 150 155 160
Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala
165 170 175
Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala
180 185 190
Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu
195 200 205
Pro Ala Ser Leu Leu Thr
210
<210> 32
<211> 508
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(53)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 32
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Gly Lys Asp Gly Ser Val Cys Arg Pro Pro
35 40 45
Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser
115 120 125
Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val
130 135 140
Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly
145 150 155 160
Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala
165 170 175
Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly
180 185 190
Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu
195 200 205
Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg
210 215 220
Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu
245 250 255
Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ala Leu
260 265 270
Leu Ser His Arg Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro
275 280 285
Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn
290 295 300
Phe Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro
305 310 315 320
Cys Ala Pro Phe Ala Glu Asp Pro Pro Ser Pro Leu Glu Val Leu Ser
325 330 335
Glu Arg Cys Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro Gly Ala Glu Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Gly Ser Glu His Thr Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Arg Pro Asp Gly Ser Leu Asp Met Val Ala Met His Lys Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ser Leu Lys Pro Gly Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Leu Gly Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr
435 440 445
Pro Pro His Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser Asp Ser Gly Ile
450 455 460
Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln Gly Asp Ser
465 470 475 480
Ser Thr Gly Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala
485 490 495
Thr Glu Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
500 505
（配列表）
SEQUENCE LISTING
<110> KINDRED BIOSCIENCES, INC.
<120> ERYTHROPOIETIN AND ANALOGS FOR VETERINARY USE
<130> 01157-0009-00PCT
<150> US 62/516,092
<151> 2017-06-06
<150> US 62/516,642
<151> 2017-06-07
<150> US 62/559,104
<151> 2017-09-15
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 192
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 1
Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile
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Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Gly Ala Arg Glu Ala
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Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln
100 105 110
Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu
115 120 125
Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala
130 135 140
Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr
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Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
165 170 175
Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg
180 185 190
<210> 2
<211> 192
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 2
Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile
20 25 30
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala
35 40 45
Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn
50 55 60
Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met
65 70 75 80
Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu
85 90 95
Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln
100 105 110
Pro Ser Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu
115 120 125
Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala
130 135 140
Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr
145 150 155 160
Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
165 170 175
Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg
180 185 190
<210> 3
<211> 192
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPO Analog 6-30 G44V113 precursor form or "Analog 6-30 GV
Precursor"
<400> 3
Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile
20 25 30
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Gly Ala Arg Glu Ala
35 40 45
Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Phe Ser Glu Asn
50 55 60
Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met
65 70 75 80
Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu
85 90 95
Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln
100 105 110
Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu
115 120 125
Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala
130 135 140
Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr
145 150 155 160
Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
165 170 175
Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg
180 185 190
<210> 4
<211> 192
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPO Analog 6-30 E44V113 precursor form or "Analog 6-30 EV
Precursor"
<400> 4
Met Gly Ser Cys Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile
20 25 30
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala
35 40 45
Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Phe Ser Glu Asn
50 55 60
Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met
65 70 75 80
Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu
85 90 95
Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln
100 105 110
Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu
115 120 125
Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala
130 135 140
Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr
145 150 155 160
Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
165 170 175
Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg
180 185 190
<210> 5
<211> 522
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flag_feline EPOR201_full-length (fEPOR201-N-flag)
<400> 5
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
20 25 30
Asp Lys Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys
35 40 45
Val Asn Met Val Cys Met Arg Ala Pro Glu Ala Ser Ala Cys Gly Ser
50 55 60
Ser Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser
65 70 75 80
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<213> Felis catus
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Felis catus Erythropoietin second site mutation R103A
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Canis lupus erythropoietin second site mutation R103A
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<220>
<223> Equus caballus erythropoietin second site mutation R103A
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<210> 20
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<213> Felis catus
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 20
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1 5 10 15
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35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 25
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225
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<211> 226
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340 345 350
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450 455 460
Ser Gly Ile Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln
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Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala
85 90 95
Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu
100 105 110
Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp
115 120 125
Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro
130 135 140
Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val
145 150 155 160
Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys
165 170 175
Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg
180 185 190
Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser
195 200 205
Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr
210 215
<210> 30
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR202 ECD (minimal)
<400> 30
Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Gly Lys Asp Gly Ser Val Cys Arg Pro
1 5 10 15
Pro Gln Trp Phe Leu Glu Gly Asn Ala Glu Glu Arg Leu Glu Asp Leu
20 25 30
Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn
35 40 45
Tyr Ser Phe Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser
50 55 60
Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser
65 70 75 80
Leu Pro Thr Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val
85 90 95
Thr Ala Val Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile
100 105 110
Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg
115 120 125
Ala Asp Glu Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly
130 135 140
Ala Pro Val Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly
145 150 155 160
Asn Val Ala Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr
165 170 175
Glu Cys Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met
180 185 190
Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala
195 200 205
Trp Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Thr
210 215
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Feline EPOR203 ECD (minimal)
<400> 31
Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro
1 5 10 15
Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe
20 25 30
Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe
35 40 45
Phe Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln
50 55 60
Ala Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val
85 90 95
Ser Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val
100 105 110
Val Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu
115 120 125
Gly Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val
130 135 140
Ala Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala
145 150 155 160
Gly Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala
165 170 175
Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala
180 185 190
Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu
195 200 205
Pro Ala Ser Leu Leu Thr
210
<210> 32
<211> 508
<212> PRT
<213> Felis catus
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(53)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 32
Met Asp His Leu Trp Ala Pro Leu Trp Pro Gly Val Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Pro Leu Asp
20 25 30
Pro Lys Phe Glu Ser Lys Gly Lys Asp Gly Ser Val Cys Arg Pro Pro
35 40 45
Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp
50 55 60
Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Asp Asn Tyr Ser Phe Phe
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Glu Gly Glu Pro Trp Lys Pro Cys Ser Leu His Gln Ala
85 90 95
Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala
100 105 110
Asp Ala Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Val Ser
115 120 125
Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val
130 135 140
Leu Leu Asp Pro Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Asp Glu Gly
145 150 155 160
Gly His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Val Ala
165 170 175
Ser Leu Ile Arg Tyr Glu Val Asn Ile Ser Ser Gly Asn Val Ala Gly
180 185 190
Gly Ala Gln Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Arg Thr Glu Cys Ala Leu
195 200 205
Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Met Val Arg Ala Arg
210 215 220
Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu
245 250 255
Ser Leu Ile Leu Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Ala Leu
260 265 270
Leu Ser His Arg Arg Thr Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro
275 280 285
Ser Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn
290 295 300
Phe Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro
305 310 315 320
Cys Ala Pro Phe Ala Glu Asp Pro Pro Ser Pro Leu Glu Val Leu Ser
325 330 335
Glu Arg Cys Trp Gly Ala Thr Gln Ala Ala Glu Pro Gly Ala Glu Glu
340 345 350
Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Gly Ser Glu His Thr Gln Asp Thr Tyr
355 360 365
Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Pro Arg Pro Asp Gly Ser Leu Asp Met Val Ala Met His Lys Gly
385 390 395 400
Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ser Leu Lys Pro Gly Pro
405 410 415
Glu Gly Ala Leu Gly Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser
420 425 430
Ser Gln Leu Leu Arg Pro Arg Ala Leu Pro Pro Glu Leu Pro Pro Thr
435 440 445
Pro Pro His Ile Lys Tyr Leu Tyr Leu Met Val Ser Asp Ser Gly Ile
450 455 460
Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gln Glu Ala Gln Gly Asp Ser
465 470 475 480
Ser Thr Gly Pro Tyr Leu Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala
485 490 495
Thr Glu Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser
500 505
【図1】
【図2A-B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A-D】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0145】
実施形態１３８．多血症は、ＪＡＫ２における変異、腫瘍からのＥＰＯの過剰生成および／または分泌によって引き起こされる、実施形態１３２～１３７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１３９．多血症を有する対象を治療するための医薬であって、実施形態１１４～１１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態１２５～１２７のいずれか一つに記載のポリペプチド、実施形態１２０もしくは１２８に記載の核酸、または実施形態１２３、実施形態１２４、もしくは実施形態１３１に記載の薬学的組成物を含み、任意選択的にＥＰＯポリペプチド、ポリペプチド、核酸、または薬学的組成物が非経口的に、任意選択的に筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路または吸入経路で、投与され、任意選択的に対象が伴侶動物種であり、任意選択的に伴侶動物種がネコ、イヌまたはウマであり、または任意選択的に対象がヒトである、医薬。
実施形態１３９．多血症を有する対象を治療するための医薬であって、実施形態１１４～１１９のいずれか一つに記載のＥＰＯポリペプチド、実施形態１２５～１２７のいずれか一つに記載のポリペプチド、実施形態１２０もしくは１２８に記載の核酸、または実施形態１２３、実施形態１２４、もしくは実施形態１３１に記載の薬学的組成物を含み、任意選択的にＥＰＯポリペプチド、ポリペプチド、核酸、または薬学的組成物が非経口的に、任意選択的に筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路または吸入経路で、投与され、任意選択的に対象が伴侶動物種であり、任意選択的に伴侶動物種がネコ、イヌまたはウマであり、または任意選択的に対象がヒトである、医薬。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１３（ただし、配列番号１３には少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位の存在が示されていない）のアミノ酸配列を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドであって、Ｎ結合グリコシル化部位が、アスパラギン－ｘａａ－セリンまたはアスパラギン－ｘａａ－スレオニン配列からなり、式中、ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、いずれのＮ結合グリコシル化部位も、別のＮ結合グリコシル化部位と重複せず、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位のそれぞれが、配列番号１３の位置２１～２３、２９～３１、３４～３６、３５～３７、５３～５５、５６～５８、６５～６７、６６～６８、７１～７３、７２～７４、７３～７５、８６～８８、８７～８９、１１１～１１３、１１４～１１６、１１５～１１７、１１６～１１８、１１７～１１９、１１８～１２０、１１９～１２１、１２０～１２２、１２１～１２３、１２２～１２４、１２３～１２５、１３５～１３７、１３６～１３８、１５８～１６０、および１６２～１６４からなる群から選択される位置に存在する、ＥＰＯポリペプチド。
【請求項2】
グリコシル化されている、請求項１に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項3】
ＰＥＧ化されている、請求項１に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項4】
配列番号１３の位置８７に相当する位置にバリンを含む、請求項１に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項5】
グリコシル化されている、請求項４に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項6】
ＰＥＧ化されている、請求項４に記載のＥＰＯポリペプチド。
【請求項7】
請求項１に記載のＥＰＯポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項8】
伴侶動物種にＥＰＯポリペプチドを送達する方法であって、請求項１に記載のＥＰＯポリペプチドを非経口的に投与することを含む、方法。
【請求項9】
貧血を有する伴侶動物種を治療する方法であって、請求項１に記載のＥＰＯポリペプチドの治療的有効量を前記伴侶動物種に投与することを含む、方法。
【請求項10】
前記伴侶動物種は、ＥＰＯポリペプチドの投与前に、約１５％～約３０％のベースラインヘマトクリットパーセンテージを有する、請求項９に記載の方法。
【外国語明細書】