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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123004
(43)【公開日】2024-09-10
(54)【発明の名称】エキソソーム標的化二重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240903BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C07K16/28
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024086669
(22)【出願日】2024-05-28
(62)【分割の表示】P 2021521141の分割
【原出願日】2019-10-17
(31)【優先権主張番号】62/746,862
(32)【優先日】2018-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】520448980
【氏名又は名称】イムノーム、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ロビンソン、マシュー、ケイ．
(72)【発明者】
【氏名】モリン、マイケル、ジョン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】癌の治療に使用することができる、エキソソームを選択的に標的化する二重特異性抗体を提供する。
【解決手段】第１のエキソソーム関連タンパク質及び第２のエキソソーム関連タンパク質としてのプログラム死リガンド１（「ＰＤ－Ｌ１」）に特異的に結合することによってエキソソームを選択的に標的化することができる二重特異性抗体に関する。これらの二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害する腫瘍細胞由来のエキソソームを標的とすることによって免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊することができる。したがって、本発明の二重特異性抗体は、癌を治療するための方法において使用することができる。
【選択図】なし
【解決手段】第１のエキソソーム関連タンパク質及び第２のエキソソーム関連タンパク質としてのプログラム死リガンド１（「ＰＤ－Ｌ１」）に特異的に結合することによってエキソソームを選択的に標的化することができる二重特異性抗体に関する。これらの二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害する腫瘍細胞由来のエキソソームを標的とすることによって免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊することができる。したがって、本発明の二重特異性抗体は、癌を治療するための方法において使用することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）エキソソームタンパク質に特異的な第１の抗原結合部分、及び
（Ｂ）プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的な第２の抗原結合部分
を含む、二重特異性抗体。
（Ｂ）プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的な第２の抗原結合部分
を含む、二重特異性抗体。
【請求項2】
第２の抗原結合部分が、
（１）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ；ならびに
（２）（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ
を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
（１）（ａ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ；ならびに
（２）（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ
を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
第２の抗原結合部分が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ－９３６５５９から選択される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＨ鎖又はその断片、及びＶＬ鎖又はその断片を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
第１の抗原結合部分が、ＥＰＮ１、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０及びＮＫＣＣ２から選択されるエキソソームタンパク質に特異的に結合する、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
第１の抗原結合部分がヒトＥＰＮ１上のエピトープに特異的に結合する、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
第１の抗原結合部分が、
（１）配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含む可変重鎖；及び
（２）配列番号４のアミノ酸配列又はその断片を含む可変軽鎖
を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
（１）配列番号２のアミノ酸配列又はその断片を含む可変重鎖；及び
（２）配列番号４のアミノ酸配列又はその断片を含む可変軽鎖
を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
第１の抗原結合部分が、
（１）配列番号６のアミノ酸配列又はその断片を含む可変重鎖；及び
（２）配列番号８のアミノ酸配列又はその断片を含む可変軽鎖
を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
（１）配列番号６のアミノ酸配列又はその断片を含む可変重鎖；及び
（２）配列番号８のアミノ酸配列又はその断片を含む可変軽鎖
を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
第１の抗原結合部分が、
（１）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ；ならびに
（２）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ
を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
（１）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ；ならびに
（２）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つ
を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項9】
第１及び第２の抗原結合部分が直接又はリンカーによって連結されている、請求項１～８のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
リンカーが、化学的リンカー又はポリペプチドリンカーからなる群より選択される、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
ノブ・イントゥ・ホール誘導体、ＳＥＥＤ－ＩｇＧ、ＤＥＫＫ変異型Ｆｃ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃ、ｓｃＤＢ－Ｆｃからなる群より選択される、請求項１～１０のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
Ｆｃドメインを含有せず、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖからなる群より選択される、請求項１～１０のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
完全ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１～１２のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれかに記載の二重特異性抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項15】
請求項１～１３のいずれかに記載の少なくとも１つの二重特異性抗体と、適切な保存容器、ｐＨ緩衝液及びキットを使用するための説明書のうちの少なくとも１つとを含むキット。
【請求項16】
対象において癌を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１～１３のいずれかに記載の二重特異性抗体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項17】
二重特異性抗体が、腫瘍細胞由来のエキソソームを標的とすることによって免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
抗腫瘍活性の抑制がＣＤ８＋サプレッサＴ細胞によって媒介される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
対象がヒトである、請求項１６～１８のいずれかに記載いずれかに記載の方法。
【請求項20】
約０．５～２０ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体を対象に投与する、請求項１６～１９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野は、癌の治療のための抗体に基づく治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト適応免疫系は、細胞性（Ｔ細胞）プロセス及び体液性（Ｂ細胞）プロセスの両方を介して抗原投与に応答する。体液性応答は、抗原に結合することができる表面結合免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を発現するＢ細胞の選択及びクローン増幅をもたらす。Ｔ細胞は、骨髄に由来する未成熟前駆体から発生し、次いで胸腺に移動し、そこで増殖して成熟Ｔリンパ球に分化する。
【0003】
体液性応答の発生は、クローン増幅と一致して起こる体細胞高頻度突然変異及びクラススイッチのプロセスを含む。合わせて、これらのプロセスは、標的抗原に対して親和性成熟し、４つの一般的なクラス（Ｍ、Ｄ、Ａ、Ｇ、又はＥ）の１つに属する定常ドメインを含有する分泌抗体をもたらす。抗体の各クラス（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＥ）は、細胞免疫系と異なる方法で相互作用する。標的抗原に対して親和性成熟した抗体の特徴は、１）生殖細胞系列遺伝子と比較してヌクレオチド及びその後のアミノ酸の変化、２）標的抗原に対する高い結合親和性、３）他のタンパク質と比較して標的抗原に対する結合選択性を含み得る。
【0004】
腫瘍患者が腫瘍細胞抗原に対する免疫応答を開始できることはよく理解されている。それらの抗原は、変異タンパク質をもたらす腫瘍内の遺伝的変化又は免疫系への他の正常なタンパク質の異常な提示のいずれかに起因し得る。異常な提示は、新生児タンパク質の異所性発現、細胞内タンパク質の細胞表面への誤った局在化、又は細胞の溶解を含むがこれらに限定されないプロセスによって起こり得る。タンパク質のグリコシル化の変化をもたらす酵素の異常な発現はまた、体液性免疫系によって認識される非自己抗原の生成をもたらし得る。
【0005】
癌に関連するものを含む疾患関連タンパク質に選択的に結合する抗体は、治療効果をもたらす方法でそれらの標的タンパク質の機能を調節することに成功していることが証明されている。変異した、又は他の異常なタンパク質に対する抗体応答を開始するヒト免疫系の能力は、患者の免疫応答が、重要な腫瘍ドライバを認識し、その機能を調節することができる抗体を含み得ることを示唆する。これに関して、細胞膜輸送に関与するタンパク質の発現増加は、腫瘍成長及び腫瘍転移の増加に関連する。
【0006】
膜輸送は、広範囲の細胞プロセスの調節に寄与する。細胞表面受容体の内在化は、成長因子受容体を介したシグナル伝達の適切な調節のための重要な機構である。クラスリン被覆小胞を介した内在化は、細胞表面からの癌関連受容体の内在化のための１つの経路である。クラスリン被覆小胞におけるその後の内在化のための、クラスリン被覆ピット（ＣＣＰ）へのこれらの受容体の負荷は、経路の最初の段階の１つである。ＣＣＰへの受容体の負荷は、一部には、エプシン１（ＥＰＮ１）などのアダプタ分子との相互作用によって決定される。
【0007】
ＥＰＮ１は、細胞膜に局在する約６０．３ｋＤａのタンパク質である。これは、ＰＩ（４，５）Ｐ２、ユビキチン、及びクラスリン／ＡＰ－２相互作用ドメインを含有する。ＥＰＮ１の内因性発現の発現をノックダウンすること、ＥＰＮ１の変異型を過剰発現すること、又はＥＰＮ１とそのカーゴ分子との相互作用を遮断するように設計された薬剤で細胞を処理することは、公知のＣＣＰ依存性カーゴの内在化を阻害することができる。そのようなカーゴの例は、ＶＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ３である。特に、特定の種類の癌腫瘍細胞はＥＰＮ１担持エキソソームを放出し、そのような細胞の増殖は、ＥＰＮ１がその受容体と相互作用するのを防ぐことによって阻止することができる。
【0008】
ナイーブ成熟Ｔ細胞は、胸腺を離れ、リンパ節、脾臓、及び扁桃などの特殊なリンパ器官に移動する。ナイーブＴ細胞が活性化シグナルを受け取ると、複数回の分裂を受けて、エフェクタ細胞の集団、ならびにそれらが活性化シグナルへのその後の曝露に応答するためにプライミングされたままである静止期に戻る他の細胞を生じる。
【0009】
Ｔ細胞の活性化は、２シグナル共刺激モデルによって起こる（図２１）。Ｔ細胞活性化のための一次シグナルは、主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）タンパク質との複合体における、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）の表面上に提示されるその同族抗原（Ａｇ）へのＴ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合である。この活性化様式は、外来抗原に対する応答を可能にすることに加えて、自己対非自己の識別、及び免疫寛容の達成も可能にする。
【0010】
第２の活性化シグナルは、ＡＰＣの表面に存在する共刺激分子を介してＴリンパ球に伝達される。一次シグナルと二次シグナルの強度間の相互作用は、適切なＴ細胞活性化のために必要である。抗原活性化の存在下での共刺激の欠如は、Ｔ細胞の枯渇又は外来抗原刺激に対する寛容をもたらし得る。対照的に、ＴＣＲを介した強力な一次シグナル伝達は、共刺激の欠如を克服することができる。
【0011】
共刺激によるＴ細胞の活性化はまた、負の共刺激シグナルによって均衡が保たれる。正及び負の共刺激シグナル間の相互作用は、寛容の破壊及び自己免疫の発生を防止しながら、外来抗原に対する免疫活性化の適切なバランスを提供する。
【0012】
共刺激に関与する分子は、それらの分子を介したシグナル伝達の操作がＴ細胞応答を増強又は減弱させることができるので、治療上重要である。Ｔ細胞の枯渇又はアネルギーは、Ｔ細胞の表面上のプログラム細胞死１（ＰＤ－１）の発現と相関する。リガンドであるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）のその同族受容体ＰＤ－１への結合は、Ｔ細胞活性化を低下させる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を防止することができる抗体でアンタゴナイズすることにより、Ｔ細胞の活性化が増強され、腫瘍患者の臨床転帰が改善されることが実証されている。
【0013】
腫瘍由来のエキソソーム上に存在するＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞に対する強力な負の調節シグナルである。エキソソームは、多胞体に由来し、細胞外環境に分泌されるナノサイズ（３０～１５０ｎｍ）の膜小胞である。エキソソームは、細胞由来の膜結合受容体及びリガンド、ならびにＲＮＡ及び代謝産物などの細胞内成分を含有する。腫瘍細胞は、ある距離で腫瘍由来成分を正常細胞に移入することができるエキソソームを産生することが公知である。腫瘍由来のエキソソームは、とりわけ、正常細胞の形質転換及び転移ニッチの調整に関連付けられてきた。
【0014】
エキソソーム関連ＰＤ－Ｌ１のレベル上昇は進行疾患のマーカであり、頭頸部癌、胃癌、黒色腫、及び多形性神経膠芽腫を含む特定の癌における臨床転帰と逆相関し得る。腫瘍におけるエキソソーム誘導性Ｔ細胞抑制の破壊は、癌の治療のための治療戦略である。その目的を念頭に置いて、エキソソームＰＤ－Ｌ１及び別のエキソソームマーカを標的化することができる二重特異性抗体を、ＰＤ－Ｌ１誘導性免疫抑制を克服し、様々な癌を治療するための有効な薬剤として本明細書で説明する。より具体的には、ＰＤ－Ｌ１及びＥＰＮ１を標的とする二重特異性抗体を本明細書に開示し、例示する。
【0015】
発明の概要
本明細書に記載される発明は、第１のエキソソーム関連タンパク質及び第２のエキソソーム関連タンパク質としてのプログラム死リガンド１（「ＰＤ－Ｌ１」）に特異的に結合することによって、エキソソームを同時に標的化することができる二重特異性抗体に関する。そのような二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するＰＤ－Ｌ１などのリガンドを含有する腫瘍細胞由来のエキソソームを標的とすることによって、免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊することができる。したがって、本発明の組成物及び方法は、癌の治療に使用することができる。
本明細書に記載される発明は、第１のエキソソーム関連タンパク質及び第２のエキソソーム関連タンパク質としてのプログラム死リガンド１（「ＰＤ－Ｌ１」）に特異的に結合することによって、エキソソームを同時に標的化することができる二重特異性抗体に関する。そのような二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するＰＤ－Ｌ１などのリガンドを含有する腫瘍細胞由来のエキソソームを標的とすることによって、免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊することができる。したがって、本発明の組成物及び方法は、癌の治療に使用することができる。
【0016】
二重特異性抗体の第１のエキソソーム関連標的は、例えば、テトラスパニン膜貫通ファミリータンパク質、腫瘍感受性遺伝子１０１（「ＴＳＧ１０１」）、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子、プログラム細胞死６相互作用タンパク質（「ＰＤＣＤ６ＩＰ」）、熱ショックタンパク質、細胞骨格タンパク質、アネキシン、又は膜輸送タンパク質であり得る。したがって、本発明による二重特異性抗体の第１の結合部分は、例えば、エプシン１（「ＥＰＮ１」）、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びＮＫＣＣ２に特異的に結合することができる。
【0017】
本発明による二重特異性抗体の第２の結合部分は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又はＢＭＳ ９３６５５９などであるがこれらに限定されない、ＰＤ－Ｌ１特異的抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む任意のＰＤ－Ｌ１特異的抗体に由来し得る。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図3】図３は、結合をフローサイトメトリによって評価した場合、吸着によってラテックスビーズ上に捕捉されたエキソソームが抗ＥＰＮ１抗体、ＩＭＭ２００５９と反応性であることを示す。対照的に、ＩＭＭ２００５９はＢＳＡ被覆ビーズに結合しない。
【図4】図４は、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴ装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたフローサイトメトリによって、無傷のＡ５４９肺癌細胞株へのＩＭＭ２００５９結合について観察された濃度依存的結合曲線を示す。無傷の細胞へのＩＭＭ２００５９の結合を、フルオロフォア標識抗ヒト二次抗体で検出した。
【図5】図５は、Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴ装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたフローサイトメトリによって、無傷のＨｕｈ７肝細胞癌細胞へのＩＭＭ２００５９結合について観察された濃度依存的結合曲線を示す。無傷の細胞へのＩＭＭ２００５９の結合を、フルオロフォア標識抗ヒト二次Ａｂで検出した。
【図6】図６は、そのホモログＥＰＮ２と比較したＥＰＮ１に対するＩＭＭ２００５９の選択性を表す定量的ドットブロット結果を示す。ＩＭＭ２００５９の結合を、漸増濃度の組換えＥＰＮ１又はＥＰＮ２に対するドットブロットによって分析した。
【0019】
詳細な説明
本明細書に記載される発明は、第１及び第２のエキソソーム関連タンパク質に特異的に結合することによって、エキソソームを同時に標的化することができる二重特異性抗体に関する。より具体的には、本発明による第２のエピソーム関連タンパク質は、プログラム死リガンド１（「ＰＤ－Ｌ１」）である。したがって、本発明による二重特異性抗体は、エキソソーム会合タンパク質上のエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合部分と、ＰＤ－Ｌ１上のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部分とを有する。本発明による二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するＰＤ－Ｌ１などのリガンドを含有する腫瘍細胞由来エキソソームを標的とすることによって、免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊することができる。したがって、二重特異性抗体は、様々な種類の癌に罹患している対象を治療するために使用され得る。したがって、本発明はまた、癌治療プロトコルの構成要素として、本発明の二重特異性抗体の投与及び送達を必要とする対象への投与及び送達のために製剤化される組成物を含む。
本明細書に記載される発明は、第１及び第２のエキソソーム関連タンパク質に特異的に結合することによって、エキソソームを同時に標的化することができる二重特異性抗体に関する。より具体的には、本発明による第２のエピソーム関連タンパク質は、プログラム死リガンド１（「ＰＤ－Ｌ１」）である。したがって、本発明による二重特異性抗体は、エキソソーム会合タンパク質上のエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合部分と、ＰＤ－Ｌ１上のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部分とを有する。本発明による二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するＰＤ－Ｌ１などのリガンドを含有する腫瘍細胞由来エキソソームを標的とすることによって、免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊することができる。したがって、二重特異性抗体は、様々な種類の癌に罹患している対象を治療するために使用され得る。したがって、本発明はまた、癌治療プロトコルの構成要素として、本発明の二重特異性抗体の投与及び送達を必要とする対象への投与及び送達のために製剤化される組成物を含む。
【0020】
一般に、エキソソームは、以下の群の１つ以上に属するタンパク質を含有することが公知の小胞である：ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１などのテトラスパニン膜貫通ファミリータンパク質；腫瘍感受性遺伝子１０１（「ＴＳＧ１０１」）；主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子；プログラム細胞死６相互作用タンパク質（「ＰＤＣＤ６ＩＰ」）１８、２２、３７、３８、４１；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０）；細胞骨格タンパク質（アクチン及びチューブリン）；アネキシン（膜の細胞骨格変化及び膜融合を調節するタンパク質）；ならびに膜輸送タンパク質。エキソソームは、一般に、カルネキシン及びゴルジマトリックスタンパク質又は核タンパク質などの小胞体タンパク質を含有しないと考えられている。エキソソームは、タンパク質ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＮＫＣＣ２も含み得ることが公知である。
【0021】
基本的な抗体構造は、２つの重（Ｈ）及び２つの軽（Ｌ）ポリペプチド鎖を含み、それらの各々は、定常領域及び可変領域を含み、ジスルフィド結合によって相互接続されている。ヒトには、ラムダ（「λ」）及びカッパ（「κ」）と呼ばれる２種類の免疫グロブリン軽鎖と、抗体分子の機能活性を決定する、アイソタイプとしても知られる５つの主要な免疫グロブリン重鎖クラス：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとが存在する。可変重（「ＶＨ」）領域と可変軽（「ＶＬ」）領域は一緒になって、抗体のその抗原への特異的結合を担う可変フラグメント「Ｆｖ」を形成する。完全長重鎖はまた、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する。Ａｂの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクタ細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【0022】
ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含む。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されており、ＣＤＲを三次元空間で位置決め及び整列するのに役立つ。各鎖の３つのＣＤＲは、典型的には、Ｎ末端から順に番号付けられるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定されることが多い。したがって、重鎖ＣＤＲは、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３と称される；同様に、軽鎖ＣＤＲは、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２及びＬ－ＣＤＲ３と称される。重鎖及び軽鎖のそれぞれの抗原結合断片である、１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインは、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる。Ｆ（ａｂ）’２フラグメントは、２つのＦａｂフラグメントを含み、免疫グロブリン分子をそのヒンジ領域の下で切断することによって生成することができる。
【0023】
二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに同時結合することができる。本発明による二重特異性抗体は、同じ分子内に存在する任意の免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン由来の分子、又は分子の複合体の形態であり得る。様々な実施形態では、本発明による二重特異性抗体の第１の結合部分は、エプシン１（「ＥＰＮ１」）、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０及びＮＫＣＣ２などであるがこれらに限定されないエキソソーム関連タンパク質上のエピトープに結合する抗体から選択され得る。例えば、二重特異性抗体は、参照により組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／５４２５９号に記載されている結合部分などの、ヒトＥＰＮ１上のエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合部分を含むことができる。様々な実施形態では、本発明による二重特異性抗体のＥＰＮ１特異的第１結合部分は、配列番号２又は配列番号６に示す可変重鎖、配列番号４又は配列番号８に示す可変軽鎖を含むことができる。他の実施形態では、本発明による二重特異性抗体の第１の抗原結合部分は、（１）（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つ；（２）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つを有する。
【0024】
本発明による二重特異性抗体の第２の結合部分は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又はＢＭＳ－９３６５５９などであるがこれらに限定されない、ＰＤ－Ｌ１特異的抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む任意のＰＤ－Ｌ１特異的抗体に由来し得る。
【0025】
二重特異性抗体の前述の説明を念頭に置いて、本発明による二重特異性抗体の一実施形態は、配列番号９に基づく重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０に基づく重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１に基づく重鎖ＣＤＲ３、配列番号１２に基づく軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３に基づく軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１４に基づく軽鎖ＣＤＲ３を有するＥＰＮ１特異的第１結合部分と、ＰＤ－Ｌ１特異的抗体に由来する重鎖及び軽鎖ＣＤＲを有するＰＤ－Ｌ１特異的第２結合部分とを有し得る。したがって、本発明による二重特異性抗体の別の実施形態は、配列番号９に基づく重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０に基づく重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１１に基づく重鎖ＣＤＲ３、配列番号１２に基づく軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３に基づく軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１４に基づく軽鎖ＣＤＲ３を有するＥＰＮ１特異的第１結合部分と、配列番号１７に基づく重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８に基づく重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９に基づく重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０に基づく軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１に基づく軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２２に基づく軽鎖ＣＤＲ３を有するＰＤ－Ｌ１特異的第２結合部分とを有し得る。
【0026】
二重特異性抗ＣＤ－６３／抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１陽性エキソソームプールを選択的に標的とすることができる二重特異性抗体の別の実施形態である。抗ＣＤ－６３／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の実施形態には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体：アテゾリズマブ（配列番号１５及び１６）；アベルマブ（配列番号２３及び２４）；デュルバルマブ（配列番号２５及び２６）；又はＢＭＳ－９３６５５９（配列番号２７及び２８）のうちの１つの可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲと組み合わせた、抗ＣＤ－６３抗体（配列番号４４及び４５）の可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲを有する抗体が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態は、ＤＶＤ－Ｉｇ型に操作された、抗ＣＤ－６３抗体（配列番号４４及び４５）ならびにアテゾリズマブのＶＨ及びＶＬドメインを含む抗ＣＤ－６３／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体である。抗ＣＤ－６３可変ドメイン及びアテゾリズマブ可変ドメインの４つの異なる構成が、抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体について定義されたリンカー及び配向を使用して可能である。
【0027】
二重特異性抗ＨＥＲ２／抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１陽性エキソソームプールを選択的に標的とすることができる二重特異性抗体のさらに別の実施形態である。抗ＨＥＲ２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の実施形態には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体：アテゾリズマブ（配列番号１５及び１６）；アベルマブ（配列番号２３及び２４）；デュルバルマブ（配列番号２５及び２６）；又はＢＭＳ－９３６５５９（配列番号２７及び２８）の１つの可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲと組み合わせた、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（配列番号４６及び４７）の可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲを有することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態は、ＤＶＤ－Ｉｇ型に操作された、抗ＨＥＲ２抗体（配列番号４６及び４７）ならびにアテゾリズマブのＶＨ及びＶＬドメインを含む抗ＨＥＲ２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体である。抗ＨＥＲ２可変ドメイン及びアテゾリズマブ可変ドメインの４つの異なる構成が、抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体について定義されたリンカー及び配向を使用して可能である。
【0028】
二重特異性抗ＥｐＣＡＭ／抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１陽性エキソソームプールを選択的に標的とすることができる二重特異性抗体のさらに別の実施形態である。抗ＰＤ－Ｌ１抗体：アテゾリズマブ（配列番号１５及び１６）；アベルマブ（配列番号２３及び２４）；デュルバルマブ（配列番号２５及び２６）；又はＢＭＳ－９３６５５９（配列番号２７及び２８）のうちの１つの可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲと組み合わせた、抗ＥｐＣＡＭ抗体オポルツズマブ（配列番号４８及び４９）の可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲを有する抗ＥｐＣＡＭ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性の実施形態。好ましい実施形態は、ＤＶＤ－Ｉｇ型に操作された、抗ＥｐＣＡＭ抗体（配列番号４８及び４９）ならびにアテゾリズマブのＶＨ及びＶＬドメインを含む抗ＥｐＣＡＭ／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体である。抗ＥｐＣＡＭ可変ドメイン及びアテゾリズマブ可変ドメインの４つの異なる構成が、抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体について定義されたリンカー及び配向を使用して可能である。
【0029】
二重特異性抗ＨＥＲ３／抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１陽性エキソソームプールを選択的に標的とすることができる二重特異性抗体のさらに別の実施形態である。抗ＰＤ－Ｌ１抗体：アテゾリズマブ（配列番号１５及び１６）；アベルマブ（配列番号２３及び２４）；デュルバルマブ（配列番号２５及び２６）；又はＢＭＳ－９３６５５９（配列番号２７及び２８）のうちの１つの可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲと組み合わせた、抗ＨＥＲ３抗体（配列番号５０及び５１）の可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲを有する抗ＨＥＲ３／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性の実施形態。好ましい実施形態は、ＤＶＤ－Ｉｇ型に操作された、抗ＨＥＲ３抗体（配列番号５０及び５１）ならびにアテゾリズマブのＶＨ及びＶＬドメインを含む抗ＨＥＲ３／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体である。抗ＨＥＲ３可変ドメイン及びアテゾリズマブ可変ドメインの４つの異なる構成が、抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体について定義されたリンカー及び配向を使用して可能である。
【0030】
本発明による二重特異性抗体は、完全ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。言い換えれば、本発明による二重特異性抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域及びＣＤＲを含み得る。実際に、フレームワーク領域は、１つのヒト抗体に由来し得、異なるヒト抗体に由来するＣＤＲを含むように操作され得る。例えば、本発明による抗体は、ｉ）エキソソームタンパク質標的に特異的なヒト抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ；ｉｉ）ＰＤ－Ｌ１に特異的なヒト抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ；及び別のヒト抗体に由来するフレームワーク領域を有し得る。
【0031】
本発明による二重特異性抗体は、抗体フラグメント変異体であり得る。例えば、本発明による二重特異性抗体のフラグメント変異体には、二価Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、二価一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｂｉ－ｓｃＦｖ」）、及び二価ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｂｉ－ｄｓＦｖ」）が含まれる。（Ｆａｂ’）２フラグメントは、抗体全体を酵素ペプシンで処理して、その後還元することなく得ることができる２つのＦａｂ’フラグメントの二量体であり、そのためＦａｂ’単量体は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持されたままである。ｂｉ－ｓｃＦｖフラグメントなどの一本鎖（「ｓｃ」）抗体は、第１の抗体の重鎖及び軽鎖のＶＬ領域及びＶＨ領域、ならびに第２の抗体の重鎖及び軽鎖のＶＬ領域及びＶＨ領域を含む遺伝子操作された分子であり、すべてが１つ以上の適切なポリペプチドリンカーによって連結されて、遺伝子融合された一本鎖分子を生成する。本発明による二重特異性抗体はまた、２つの異なるｓｃＦＶ抗体の二量体であり得る。二重特異性抗体のさらに他の例としては、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ又はｓｃＦｖ２）、ダイアボディ、ｄＡｂ２ＮＨＨ２、ノブ・イントゥ・ホール誘導体、ＳＥＥＤ－ＩｇＧ、ヘテロＦｃ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖＪｕｎ／Ｆｏｓ、Ｆａｂ’－Ｊｕｎ／Ｆｏｓ、トリボディ、ＤＮＬ－Ｆ（ａｂ）３、ｓｃＦｖ３－ＣＨｌ／ＣＬ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ２、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＤＢ－Ｆｃ、ｓｃＤｂ－ＣＨ３、Ｄｂ－Ｆｅ、ｓｃＦｖ２－Ｈ／Ｌ、ＤＶＤ－Ｉｇ、タンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」）、ｓｃＦｖ－ｄｈｌｘ－ｓｃＦｖ、ｄＡｂ２－ＩｇＧ、ｄＡｂ－ＩｇＧ、ｄＡｂ－Ｆｃ－ｄＡｂが挙げられる。
【0032】
当業者は、二重特異性抗体の保存的変異体が産生され得ることを認識するであろう。そのような保存的変異体は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間の正しい折り畳み及び安定化に必要な重要なアミノ酸残基を保持し、分子の低いｐＩ及び低い毒性を保存するために残基の電荷特性を保持する。収率を高めるために、ＶＨ領域及びＶＬ領域においてアミノ酸置換（例えば、多くとも１個、多くとも２個、多くとも３個、多くとも４個、又は多くとも５個のアミノ酸置換）を行うことができる。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つのアミノ酸群は、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：ｉ）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）；ｉｉ）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；ｉｉｉ）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；ｉｖ）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）；ｖ）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）及びバリン（Ｖ）；ならびにｖｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）。
【0033】
本発明による二重特異性抗体はまた、内因性抗体のバックグラウンドに対する生物製剤の検出を容易にするための「タグ付き」免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含み得る。より具体的には、タグ付きＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ由来ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＥＦ、又はＣＤ構造ループの１つ以上に組み込まれた異種抗体エピトープである。ＣＨ３タグは、好ましくはＩｇＧ１サブクラス抗体の構造的状況に組み込まれ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む他のヒトＩｇＧサブクラスも本発明に従って利用可能である。「ＣＨ３足場」とも呼ばれるエピトープタグ付きＣＨ３ドメインは、一般に免疫グロブリンＦｃ部分の形態で、重鎖定常領域を有する本発明の任意の抗体に組み込むことができる。ＣＨ３足場タグの例、及びそれらを抗体に組み込む方法は、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／３２７８０号に開示されている。エピトープタグ付きＣＨ３足場を検出するために使用される抗体は、本明細書では一般に「検出抗体」と呼ばれる。
【0034】
本発明による二重特異性抗体の治療有効性は、その標的抗原に対する結合親和性と相関する。結合親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１－１０６，１９７９によって記載されているＳｃａｔｃｈａｒｄ法の変法によって算出され得る。あるいは、結合親和性は、抗体のその抗原からの解離速度によって測定され得る。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、競合ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、及びフローサイトメトリを含む様々な方法が、結合親和性を測定するために使用できる。
【0035】
抗原に「特異的に結合する」抗体は、抗原に高親和性で結合し、他の無関係な抗原には有意に結合しない抗体である。抗体のその抗原に対する高親和性結合は、抗原標的の抗原決定基としても知られるエピトープに対する抗体のＣＤＲの１つ以上の結合相互作用によって媒介される。エピトープは、抗原性である分子上の特定の化学基又はペプチド配列であり、特異的免疫応答を誘発することができることを意味する。本発明による抗体によって特異的に結合されるエピトープは、例えば、１つ以上の種類の癌の細胞によって発現されるタンパク質内に含まれ得る。一般に、抗体は、その解離定数値（「ＫＤ」）が５０ｎＭ以下である場合、「高親和性結合」を示す。したがって、本発明による二重特異性抗体は、抗体と結合標的の少なくとも１つとの間のＫＤが５０ｎＭ、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下である場合、そのエキソソームタンパク質又はＰＤ－Ｌ１結合標的に対して高親和性結合を示す。
【0036】
本発明による二重特異性抗体の高親和性結合は、例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞へのその結合に関して説明することができる。より具体的には、本発明による抗体は、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値を示す場合、ＰＤ－Ｌ１発現細胞に対して高親和性結合を示す。同様に、ＰＤ－Ｌ１に高親和性で結合することに加えて、同じ抗体は、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、又はＮＫＣＣ２に結合するなどの、異なるエキソソーム関連タンパク質にも高親和性で結合することができる。様々な変異体では、例えば、本発明による二重特異性抗体は、（ｉ）１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＥＰＮ１発現エキソソーム又は細胞に対するＥＣ５０；及び１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＰＤ－Ｌ１発現エピソーム又は細胞に対するＥＣ５０を示す。
【0037】
上記のように、本発明による二重特異性抗体は、対象における疾患を予防、治療又は改善するための方法において使用することができる。より具体的には、本発明による二重特異性抗体は、癌を予防、治療又は改善するために使用することができる。疾患を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「治療する」とは、腫瘍量の減少又は転移の数又はサイズの減少などの、疾患又は病的状態が発症し始めた後に疾患又は病的状態の徴候又は症状を改善する治療的介入を指す。「改善する」とは、癌などの疾患の徴候又は症状の数又は重症度の減少を指す。症状（１つ又は複数）の主観的軽減又は臨床医もしくは他の資格のある専門家によって認められた客観的に同定可能な改善のいずれかを提供する、本発明による二重特異性抗体の量。癌を予防、治療又は改善するための方法は、ｉ）抗腫瘍誘導Ｔ細胞活性化の抑制因子であるＰＤ－Ｌ１；及びｉｉ）Ｔ細胞活性化を抑制してもしなくてもよい１つの他のエキソソームタンパク質を含む腫瘍細胞由来エキソソームを標的とすることによって、免疫細胞による抗腫瘍活性の抑制を破壊することによって腫瘍成長又は転移を阻害するために、有効量の本発明による二重特異性抗体を含む組成物を対象に投与することを必要とし得る。したがって、投与された二重特異性抗体は、腫瘍細胞由来エキソソームと接触し（すなわち、エキソソームと直接物理的に会合して配置され）、二重特異性抗体は、そのエキソソーム標的の少なくとも１つに結合して、ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞活性化の抑制因子として機能するのを妨げることができる。様々な実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、さもなければリンパ節における抗原特異的Ｔ細胞の増殖を減少させる阻害性シグナルを伝達する、ＰＤ－Ｌ１媒介性細胞シグナル伝達を防止すると同時に、制御性Ｔ細胞（抗炎症性、抑制性Ｔ細胞）のアポトーシスを減少させる。
【0038】
本発明による二重特異性抗体を必要とする対象に投与される、本発明による二重特異性抗体は、組成物に製剤化される。より具体的には、二重特異性抗体は、全身投与、又は腫瘍内投与などの局所投与のために製剤化することができる。例えば、本発明による二重特異性抗体は、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化され得る。組成物は、対象への投与のための単位剤形で調製することができる。投与の量及びタイミングは、所望の結果を達成するために、治療する臨床医の裁量に委ねられる。本発明による二重特異性抗体の投与はまた、他の抗癌剤の投与又は腫瘍の外科的切除などの治療的治療を伴い得る。任意の適切な抗癌剤を、本明細書に開示される二重特異性抗体と組み合わせて投与することができる。例示的な抗癌剤としては、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答調節剤、抗ホルモン剤（例えば抗アンドロゲン剤）及び抗血管形成剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗癌治療には、放射線療法及び癌細胞を特異的に標的化する他の抗体が含まれる。
【0039】
投与のための組成物は、水性担体などの薬学的に許容される担体に溶解した二重特異性抗体の溶液を含み得る。一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的及び生理学的に許容される流体、例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース又はグリセロールをビヒクルとして含む注射用流体を含む。粉末、丸剤、錠剤、又はカプセル形態などの固体組成物の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤等のような少量の非毒性の補助物質、例えば酢酸ナトリウム又はモノラウリン酸ソルビタンを含み得る。前述の担体溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まず、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、ならびに酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムなどの毒性調整剤などの、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含有し得る。これらの製剤中の抗体の濃度は大きく異なる可能性があり、選択される特定の投与様式及び対象の必要性に従って、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択される。
【0040】
本発明による二重特異性抗体組成物を投与するための選択肢には、低速注入による投与、又は静脈内プッシュもしくはボーラスによる投与が含まれるが、これらに限定されない。投与に先立って、本発明による二重特異性抗体組成物を凍結乾燥形態で提供し、投与前に滅菌溶液中で所望の濃度に再水和し得る。次いで、二重特異性抗体溶液を、例えば、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに加えてもよく、場合によっては、０．５～２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与してもよい。本発明による抗体組成物の投与の一例では、より高い負荷用量が投与され、その後の維持用量はより低いレベルで投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量を約９０分間にわたって注入し、続いて、先の用量が十分に忍容された場合、３０分間にわたって注入される２ｍｇ／ｋｇの４～８週間にわたる毎週の維持用量を注入し得る。
【0041】
本発明による二重特異性抗体組成物はまた、制御放出製剤であり得る。制御放出非経口製剤は、例えば、埋め込み剤又は油性注射剤として作製することができる。ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、及びナノ粒子を含む粒子系もまた、本発明による二重特異性抗体組成物を送達するために使用され得る。本明細書で言及されるマイクロカプセルは、本発明による二重特異性抗体を中心コア成分として含有する。ミクロスフェアでは、本発明による抗体は粒子全体に分散される。約１μｍより小さい粒子、ミクロスフェア、及びマイクロカプセルは、一般に、それぞれナノ粒子、ナノスフェア、及びナノカプセルと呼ばれる。
【0042】
本発明による二重特異性抗体組成物は、対象の癌を治療するためのキットに包装することもできる。そのようなキットは、本明細書に開示される任意の組成物を含む。キットはまた、各医薬組成物用のアンプル、バイアル及びチューブなどの適切な保存容器、ならびに組成物を対象に投与する際に使用するための緩衝液及び平衡塩類溶液などの他の含まれる試薬を含み得る。組成物及び他の試薬は、溶液又は粉末形態などの任意の好都合な形態でキット中に存在し得る。キットは、組成物の使用説明書をさらに含み得る。キットは、医薬組成物及び他の試薬を収容するための１つ以上の区画を有し得る包装容器をさらに含み得る。
【0043】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、二重特異性抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現を使用して組換え生産することができる。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－３９を参照されたい。あるいは、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製することができる。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１を参照されたい。二重特異性抗体には、二重特異性抗体断片が含まれる。例えば、Ｂｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－４８，Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８を参照されたい。したがって、本発明による二重特異性抗体は、培養中の生細胞におけるそれらのアミノ酸配列をコードする核酸配列の発現によって産生され得る。本発明による「単離された」二重特異性抗体は、細胞、タンパク質及び細胞小器官などの他の生物学的成分環境から実質的に分離又は精製されたものである。例えば、二重特異性抗体は、以下のように精製される場合、単離され得る：ｉ）ローリー法によって決定される場合、タンパク質の９５重量％超、９６重量％超、９７重量％超、９８重量％超、もしくは９９重量％超、又は９９重量％超；ｉｉ）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度；ｉｉｉ）クマシーブルー又は銀染色を使用した還元条件下又は非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均一性。単離された抗体はまた、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内にインサイチュで存在する本発明による抗体であり得る。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【0044】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明による抗体のための適切なヌクレオチドコード配列で細胞を形質転換又はトランスフェクトすることによって、本発明による二重特異性抗体を発現させ得る。宿主発現細胞の例には、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクター内に含まれる二重特異性抗体コード配列でトランスフェクトされ得る、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母；抗体コード配列を含むバキュロビン１（ｂａｃｕｌｏｖｉｎ１）などの組換えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含む、カリフラワーモザイクウイルス（「ＣａＭＶ」）又はタバコモザイクウイルス（「ＴＭＶ」）などの組換えウイルス発現ベクターに感染した植物細胞系；ならびにメタロチオネインプロモータもしくは伸長因子Ｉαプロモータなどの哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモータ、又はアデノウイルス後期プロモータ及びワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータなどの哺乳動物ウイルスに由来するプロモータを含む組換え発現構築物を有する、ＣＯＳ、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＥｘｐｉＣＨＯ、ベビーハムスター腎臓（「ＢＨＫ」）細胞、ＨＥＫ２９３、Ｅｘｐｉ２９３、３Ｔ３、ＮＳＯ細胞などであるがこれらに限定されない哺乳動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。例えば、重鎖断片及び軽鎖断片をそれぞれ発現するためにマウス及びラット伸長因子１αプロモータを組み込んだ二重プロモータベクターと併せて、ヒト胚性腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）又はＥｘｐｉ２９３などのその誘導体などの哺乳動物細胞は、本発明による抗体のための有効な発現系であり、これは、発現される抗体分子の意図される使用に依存して有利に選択することができる。
【0045】
本発明による二重特異性抗体を抗体の医薬組成物の生成のために大量に生産する場合、高レベルの容易に精製される融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列がｌａｃ Ｚコード領域とインフレームでベクターに個別に連結され得る、ｐＵＲ２７８ベクター（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐｌＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１－３１０９（１９８５）、及びＶａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３－５５０９（１９８９））；本発明の抗体をグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）と融合させるためのｐＧＥＸベクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明による抗体とポリペプチドタグのＧＳＴ融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン－アガロースビーズへの吸着及び結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。対照的に、ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子産物、すなわち本発明による抗体がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【0046】
本発明による抗体をコードする挿入配列（１つもしくは複数）の発現を調節するか、又は所望に応じて遺伝子産物を修飾及び処理する宿主発現細胞系も選択され得る。例えば、タンパク質産物の切断などのグリコシル化及びプロセシングを含む修飾は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。実際に、様々な宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的及び特異的な機構を有する。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、ならびに本発明による遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための適切な細胞機構を有する真核宿主細胞を使用し得る。
【0047】
例
以下の例は、エキソソームを標的とする二重特異性抗体の設計及び特性付けを説明する。
以下の例は、エキソソームを標的とする二重特異性抗体の設計及び特性付けを説明する。
【0048】
例１．エキソソームは、抗体の標的となり得る膜結合タンパク質を含有する。
正常組織及び腫瘍組織の両方に由来する細胞は、少なくとも２つのクラスの細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム及びエクトソームを生成することができ、これらは異なる生物学的プロセスを介して誘導される。ＥＶは、細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすと認識されている。ＥＶは、小胞の脂質二重層に挿入されるタンパク質を含む、一連の異なるタンパク質構成要素を特徴とする。エキソソーム膜に存在することが公知のタンパク質は、テトラスパニン、熱ショックタンパク質、膜輸送体、細胞表面受容体、及び脂質結合分子を含むがこれらに限定されない機能クラスに分類することができる。これらの機能クラスを含む認識されたタンパク質には、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＮＫＣＣ２、及びＰＤ－Ｌ１が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ６３などのエキソソームの表面に存在するタンパク質は、それらの表面分子に特異的な抗体によって検出することができる。図２は、２２Ｒｖ１前立腺癌細胞に由来するエキソソームが、抗ＣＤ６３被覆ビーズとの相互作用を介して用量依存的に単離され得ることを示す。エキソソームに関連する膜貫通タンパク質の組成は、エキソソームが由来する細胞型に依存し得る。エキソソームのバルク調製物をラテックスビーズにコンジュゲートさせ、フローサイトメトリによって抗ＣＤ６３抗体で検出することができる（図３）。バルクエキソソーム被覆ビーズは、抗ＥＰＮ１抗体ＩＭＭ２００５９とも反応性であった。ＩＭＭ２００５９染色は、ビーズ表面上に存在するエキソソームに依存していた；ＢＳＡ被覆ビーズはＩＭＭ２００５９と相互作用しなかった。データは、ＥＰＮ１がエキソソームの少なくとも一部の表面に存在することを示唆する。
正常組織及び腫瘍組織の両方に由来する細胞は、少なくとも２つのクラスの細胞外小胞（ＥＶ）、エキソソーム及びエクトソームを生成することができ、これらは異なる生物学的プロセスを介して誘導される。ＥＶは、細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすと認識されている。ＥＶは、小胞の脂質二重層に挿入されるタンパク質を含む、一連の異なるタンパク質構成要素を特徴とする。エキソソーム膜に存在することが公知のタンパク質は、テトラスパニン、熱ショックタンパク質、膜輸送体、細胞表面受容体、及び脂質結合分子を含むがこれらに限定されない機能クラスに分類することができる。これらの機能クラスを含む認識されたタンパク質には、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＮＫＣＣ２、及びＰＤ－Ｌ１が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ６３などのエキソソームの表面に存在するタンパク質は、それらの表面分子に特異的な抗体によって検出することができる。図２は、２２Ｒｖ１前立腺癌細胞に由来するエキソソームが、抗ＣＤ６３被覆ビーズとの相互作用を介して用量依存的に単離され得ることを示す。エキソソームに関連する膜貫通タンパク質の組成は、エキソソームが由来する細胞型に依存し得る。エキソソームのバルク調製物をラテックスビーズにコンジュゲートさせ、フローサイトメトリによって抗ＣＤ６３抗体で検出することができる（図３）。バルクエキソソーム被覆ビーズは、抗ＥＰＮ１抗体ＩＭＭ２００５９とも反応性であった。ＩＭＭ２００５９染色は、ビーズ表面上に存在するエキソソームに依存していた；ＢＳＡ被覆ビーズはＩＭＭ２００５９と相互作用しなかった。データは、ＥＰＮ１がエキソソームの少なくとも一部の表面に存在することを示唆する。
【0049】
例２．ＩＭＭ２００５９は、ＥＰＮ１に結合する抗体である。
ヒトハイブリドーマＰＲ０４５－２Ｈ１１を、頭頸部癌患者のリンパ節から単離したヒトＢ細胞をＢ５６Ｔ融合パートナーと融合させることによって作製した。ヒトＢ細胞とＢ５６Ｔとの融合は、本質的にＵＳＰＴＯ＃ＥＰ２２４２８３６’’Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍａｋｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．’’に記載されている電気融合によって実施した。ＰＲ０４５－２Ｈ１１の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ＰＲ０４５－２Ｈ１１を産生したハイブリドーマ株の細胞から単離したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ増幅によって得て、得られた抗体ｃＤＮＡを配列決定反応に供した。配列番号１は、ハイブリドーマから単離したＰＲ０４５－２Ｈ１１のＶＨに対応し、配列番号３はＶＬに対応する。ＲＴ－ＰＣＲ戦略に起因して、これらの配列は、可変ドメインのフレームワーク１の５’側最末端部分に対応する領域を欠く。ＩＧＨＶ及びＩＧＫＬ遺伝子割り当てを、公知の生殖系列遺伝子配列との相同性に基づいて予測し、ＶＨ及びＶＬ配列の真の５’末端の代用物として使用した。ＩＭＭ２００５９は、ＰＲ０４５－２Ｈ１１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む組換え発現されたヒトＩｇＧ１抗体である。ＩＭＭ２００５９ ＶＨ（配列番号５）の発現断片を、ＩＧＨＶ３－４８＊０２のフレームワーク１の５’末端に対応する生殖系列配列を使用して作製した。ＰＲ０４５－２Ｈ１１ ＶＬ（配列番号７）の完全長発現断片を、ＩＧＫＶ３－１１＊０１のフレームワーク１の５’末端に対応する生殖系列配列を使用して作製した。配列番号５及び配列番号７に対応する断片を、二重プロモータＩｇＧ１発現ベクターへのギブソン様式のクローニングを容易にするために、さらなる５’及び３’伸長を用いて合成した。ＶＨ断片及びＶＬ断片によってコードされる対応するタンパク質配列を、それぞれ配列番号６及び配列番号８に定義する。ＶＨ及びＶＬドメインのコード領域は、それぞれ１５及び１４ヌクレオチドだけ生殖系列配列とは異なる体細胞高頻度突然変異の特徴を有する。
ヒトハイブリドーマＰＲ０４５－２Ｈ１１を、頭頸部癌患者のリンパ節から単離したヒトＢ細胞をＢ５６Ｔ融合パートナーと融合させることによって作製した。ヒトＢ細胞とＢ５６Ｔとの融合は、本質的にＵＳＰＴＯ＃ＥＰ２２４２８３６’’Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍａｋｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．’’に記載されている電気融合によって実施した。ＰＲ０４５－２Ｈ１１の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ＰＲ０４５－２Ｈ１１を産生したハイブリドーマ株の細胞から単離したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ増幅によって得て、得られた抗体ｃＤＮＡを配列決定反応に供した。配列番号１は、ハイブリドーマから単離したＰＲ０４５－２Ｈ１１のＶＨに対応し、配列番号３はＶＬに対応する。ＲＴ－ＰＣＲ戦略に起因して、これらの配列は、可変ドメインのフレームワーク１の５’側最末端部分に対応する領域を欠く。ＩＧＨＶ及びＩＧＫＬ遺伝子割り当てを、公知の生殖系列遺伝子配列との相同性に基づいて予測し、ＶＨ及びＶＬ配列の真の５’末端の代用物として使用した。ＩＭＭ２００５９は、ＰＲ０４５－２Ｈ１１のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む組換え発現されたヒトＩｇＧ１抗体である。ＩＭＭ２００５９ ＶＨ（配列番号５）の発現断片を、ＩＧＨＶ３－４８＊０２のフレームワーク１の５’末端に対応する生殖系列配列を使用して作製した。ＰＲ０４５－２Ｈ１１ ＶＬ（配列番号７）の完全長発現断片を、ＩＧＫＶ３－１１＊０１のフレームワーク１の５’末端に対応する生殖系列配列を使用して作製した。配列番号５及び配列番号７に対応する断片を、二重プロモータＩｇＧ１発現ベクターへのギブソン様式のクローニングを容易にするために、さらなる５’及び３’伸長を用いて合成した。ＶＨ断片及びＶＬ断片によってコードされる対応するタンパク質配列を、それぞれ配列番号６及び配列番号８に定義する。ＶＨ及びＶＬドメインのコード領域は、それぞれ１５及び１４ヌクレオチドだけ生殖系列配列とは異なる体細胞高頻度突然変異の特徴を有する。
【0050】
ＩＭＭ２００５９を、製造業者が推奨する条件を使用したＥｘｐｉ２９３細胞への一過性トランスフェクションによって組換え発現させた。組換え抗体を、プロテインＡ／Ｇアフィニティクロマトグラフィによって馴化培地から精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、フローサイトメトリによって活性を分析した。ＩＭＭ２００５９は、元のＰＲ０４５－２Ｈ１１ハイブリドーマ産生抗体と一致する結合活性を示す。図４及び図５に示すように、ＩＭＭ２００５９は、フローサイトメトリによって分析した場合、Ａ５４９肺腺癌及びＨｕｈ７肝細胞癌細胞株の表面への飽和結合を示す。ＩＭＭ２００５９は、それぞれ０．９及び１．３μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＡ５４９及びＨｕｈ７に結合する。これらの値は、６～９ｎＭのＥＣ５０値に対応する。
【0051】
ＩＭＭ２００５９は、そのホモログＥＰＮ２と比較して、用量依存的に組換えＥＰＮ１に選択的に結合する（図６）。ＩＭＭ２００５９はまた、逆相タンパク質アッセイ（ＲＰＰＡ）において、ＥＰＮ３と比較してＥＰＮ１に対する選択性を示した。組換えＥＰＮ１との相互作用の強さを、表面プラズモン共鳴によってさらに定義した（表１）。ＩＭＭ２００５９又はアイソタイプ対照を抗ヒトＦｃセンサ表面上に捕捉して、結合表面及び対照表面を生成した。組換えＥＰＮ１を、三つ組みで、漸増濃度で表面上に流した。二重サブトラクションデータを１：１結合モデルに当てはめた。表１に概説するように、ＩＭＭ２００５９は、９５０＋／－１０ｐＭの平均ＫＤでＥＰＮ１への再現性のある結合を示した。
【表1】
【0052】
ＩＭＭ２００５９は、ＥＰＮ－１陽性マウス細胞の表面に結合する。図７に示すように、ＩＭＭ２００５９は、マウスＮＩＨ－３Ｔ３細胞に存在する抗原の細胞表面及び細胞内プールの両方に結合する。この結合パターンは、ヒト細胞株ＭＦＥ２９６に対しても観察される。市販の抗マウスＥＰＮ１抗体は、ＥＰＮ１の細胞表面プールを認識しない。
【0053】
例３．抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の設計。
２つのユニークな標的抗原に結合することができる抗体である二重特異性抗体は、２つの単一特異性抗体からの可変ドメインを１つの抗体様分子に組み合わせることによって作製することができる。複数の二重特異性抗体構造が文献に記載されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ｍＡｂｓ，９：１８２－２１２；２０１７）。二重特異性抗体構造の一実施形態は、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）である。図８は、２つの単一特異性抗体及び２つの単一特異性抗体から作製されたＤＶＤ－Ｉｇ型二重特異性抗体のカートゥーン表示である。二重特異性抗体は、標的の１つのみを発現するものと比較して、両方の標的抗原を発現する細胞、ひいてはエキソソームに対する標的化選択性を改善することができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ＢＲ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９９：１４１５－１４２５；２００８）。図９は、ＥＰＮ１又はＰＤ－Ｌ１のみを標的化することができる単一特異性抗体と比較した、ＥＰＮ１及びＰＤ－Ｌ１の両方に結合することができる二重特異性抗体によるエキソソーム標的化のカートゥーン表示である。
２つのユニークな標的抗原に結合することができる抗体である二重特異性抗体は、２つの単一特異性抗体からの可変ドメインを１つの抗体様分子に組み合わせることによって作製することができる。複数の二重特異性抗体構造が文献に記載されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ｍＡｂｓ，９：１８２－２１２；２０１７）。二重特異性抗体構造の一実施形態は、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）である。図８は、２つの単一特異性抗体及び２つの単一特異性抗体から作製されたＤＶＤ－Ｉｇ型二重特異性抗体のカートゥーン表示である。二重特異性抗体は、標的の１つのみを発現するものと比較して、両方の標的抗原を発現する細胞、ひいてはエキソソームに対する標的化選択性を改善することができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ＢＲ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９９：１４１５－１４２５；２００８）。図９は、ＥＰＮ１又はＰＤ－Ｌ１のみを標的化することができる単一特異性抗体と比較した、ＥＰＮ１及びＰＤ－Ｌ１の両方に結合することができる二重特異性抗体によるエキソソーム標的化のカートゥーン表示である。
【0054】
いくつかの抗ＰＤ－Ｌ１抗体が文献に記載されている。それらには、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＢＭＳ－９３６５５９が含まれるが、これらに限定されない。エキソソームＰＤ－Ｌ１及び第２のエキソソームマーカを共標的化することができる二重特異性抗体を、腫瘍細胞局在ＰＤ－Ｌ１と比較してエキソソームＰＤ－Ｌ１を選択的に標的化するために開発することができた。ＰＤ－Ｌ１二重特異性において標的化され得るエキソソームマーカには、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ３７、ＣＤ４５／ＩＣＡＭ－１、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、フロチリン１、グリピカン１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＮＫＣＣ２及びＥＰＮ－１が含まれるが、これらに限定されない。二重特異性抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、１つの可能な実施形態を表す。好ましい実施形態は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブ（配列番号１５及び１６）、アベルマブ（配列番号２３及び２４）、デュルバルマブ（配列番号２５及び２６）、又はＢＭＳ－９３６５５９（配列番号２７及び２８）のうちの１つの可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲと組み合わせた、ＩＭＭ２００５９の可変ドメイン又は可変ドメイン内に存在するＣＤＲを含む抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性である。好ましい実施形態は、ＤＶＤ－Ｉｇ型に操作された、ＩＭＭ２００５９及びアテゾリズマブのＶＨ及びＶＬドメインを含む抗ＥＰＮ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体である。ＩＭＭ２００５９及びアテゾリズマブ可変ドメインの４つの異なる構成を設計した。ＶＨドメインを、ペプチドリンカーＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２９）を介して、ＩＭＭ２００５９－Ｌ－アテゾリズマブ（配列番号３３）配向及びアテゾリズマブ－Ｌ－ＩＭＭ２００５９（配列番号３９）配向の両方で連結した。ＩＭＭ２００５９及びアテゾリズマブのＶＬドメインを、２つの異なるリンカーを用いて、Ｎ末端からＣ末端に両方の順序で単一のポリペプチドに融合した。「Ｌ」リンカーは、アミノ酸配列ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号３０）を含み、「Ｓ」リンカーは、アミノ酸配列ＴＶＡＡＰ（配列番号３１）を含む。配列番号３５及び配列番号４１は、それぞれＩＭＭ２００５９－Ｌ－アテゾリズマブ及びアテゾリズマブ－Ｌ－ＩＭＭ２００５９の順序で構築物を含む「Ｌ」リンカーを表す。配列番号３７及び配列番号４３は、「Ｓ」リンカー配列によって連結された二重特異性構築物に対応する。
【0055】
例４．抗ＥＰＮ１／抗ＰＤ－Ｌ１ ＤＶＤ－ＩｇＧ二重特異性抗体の結合活性。
４つの抗ＥＰＮ１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を、二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３哺乳動物細胞株の誘導体の馴化培地からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製した。４つの二重特異性抗体を含む可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３３及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４１、ならびに配列番号３９及び４３であった。精製された抗体をドットブロット分析に供して、それらが組換えＥＰＮ１及び組換えＰＤ－Ｌ１の両方に結合することができるかどうかを決定した。精製された組換えタンパク質を、図１０に示すように３つの用量レベルでスポットし、４つの抗ＥＰＮ１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体でプローブした。単一特異性ＩＭＭ２００５９／ＰＲ０４５－２Ｈ１１及びアテゾリズマブは、それぞれＥＰＮ１及びＰＤ－Ｌ１への結合についての陽性対照として機能した。デングウイルスのコートタンパク質に特異的な抗体を陰性対照として使用した。４つの二重特異性抗体はすべて、ＩＭＭ２００５９と同様のレベルでＥＰＮ１に結合した。ＰＤ－Ｌ１への結合は、抗ＰＤ－Ｌ１可変ドメインがＤＶＤ－ＩｇＧのＮ末端（Ａｔｅ／ＰＲ０４５－２Ｈ１１：Ｓ及びＡｔｅ／ＰＲ０４５－２Ｈ１１：Ｌ）に存在することを必要とした。それらを抗ＥＰＮ１可変ドメインのＣ末端（ＰＲ０４５－２Ｈ１１／Ａｔｅ：Ｓ及びＰＲ０４５－２Ｈ１１／Ａｔｅ：Ｌ）に配置すると、ドットブロット形式でＰＤ－Ｌ１に結合する能力が低下した。可変軽鎖構築物内のリンカーの長さは結合に影響を及ぼさなかった。配列番号３７及び３９に対応する可変軽鎖ドメインを含む抗体は、ドットブロット形式で組換えＰＤ－Ｌ１に同等に結合した。
４つの抗ＥＰＮ１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を、二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３哺乳動物細胞株の誘導体の馴化培地からプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製した。４つの二重特異性抗体を含む可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３３及び３５、配列番号３３及び３７、配列番号３９及び４１、ならびに配列番号３９及び４３であった。精製された抗体をドットブロット分析に供して、それらが組換えＥＰＮ１及び組換えＰＤ－Ｌ１の両方に結合することができるかどうかを決定した。精製された組換えタンパク質を、図１０に示すように３つの用量レベルでスポットし、４つの抗ＥＰＮ１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体でプローブした。単一特異性ＩＭＭ２００５９／ＰＲ０４５－２Ｈ１１及びアテゾリズマブは、それぞれＥＰＮ１及びＰＤ－Ｌ１への結合についての陽性対照として機能した。デングウイルスのコートタンパク質に特異的な抗体を陰性対照として使用した。４つの二重特異性抗体はすべて、ＩＭＭ２００５９と同様のレベルでＥＰＮ１に結合した。ＰＤ－Ｌ１への結合は、抗ＰＤ－Ｌ１可変ドメインがＤＶＤ－ＩｇＧのＮ末端（Ａｔｅ／ＰＲ０４５－２Ｈ１１：Ｓ及びＡｔｅ／ＰＲ０４５－２Ｈ１１：Ｌ）に存在することを必要とした。それらを抗ＥＰＮ１可変ドメインのＣ末端（ＰＲ０４５－２Ｈ１１／Ａｔｅ：Ｓ及びＰＲ０４５－２Ｈ１１／Ａｔｅ：Ｌ）に配置すると、ドットブロット形式でＰＤ－Ｌ１に結合する能力が低下した。可変軽鎖構築物内のリンカーの長さは結合に影響を及ぼさなかった。配列番号３７及び３９に対応する可変軽鎖ドメインを含む抗体は、ドットブロット形式で組換えＰＤ－Ｌ１に同等に結合した。
【0056】
フローサイトメトリによって分析した場合、配列番号３３及び３９によって定義される可変ドメインを含む二重特異性抗体は、細胞表面上でＥＰＮ１及びＰＤ－Ｌ１の両方を発現することが公知のＡ５４９細胞の表面に結合した。細胞表面への二重特異性抗体の結合は、約０．３マイクログラム／ｍＬのＥＣ５０で用量依存的結合プロフィールを示した（図１１）。
配列表
配列表
【0057】
配列番号１－ＶＨ ＰＲ０４５－２Ｈ１１ヌクレオチド配列
ＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣ
配列番号２－ＶＨ ＰＲ０４５－２Ｈ１１アミノ酸配列
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ＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣ
配列番号２－ＶＨ ＰＲ０４５－２Ｈ１１アミノ酸配列
ＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＨＳＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬＷＧＲＧＡＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
【0058】
配列番号３－ＶＬ ＰＲ０４５－２Ｈ１１ヌクレオチド配列
ＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴ
配列番号４－ＶＬ ＰＲ０４５－２Ｈ１１アミノ酸配列
ＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＲＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ
ＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴ
配列番号４－ＶＬ ＰＲ０４５－２Ｈ１１アミノ酸配列
ＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＲＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ
【0059】
配列番号５－ＩＭＭ２００５９ ＶＨドメインヌクレオチド配列
ＡＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ
配列番号６－ＩＭＭ２００５９ ＶＨドメインアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＨＳＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬＷＧＲＧＡＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬ
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配列番号６－ＩＭＭ２００５９ ＶＨドメインアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＩＨＳＬＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬＷＧＲＧＡＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬ
【0060】
配列番号７－ＩＭＭ２００５９ ＶＬドメインヌクレオチド配列
ＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧ
配列番号８－ＩＭＭ２００５９ ＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号８－ＩＭＭ２００５９ ＶＬドメインアミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＲＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
【0061】
配列番号９－ＩＭＭ２００５９ Ｈ－ＣＤＲ１
ＳＩＨＳＬＮ
配列番号１０－ＩＭＭ２００５９ Ｈ－ＣＤＲ２
ＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１１－ＩＭＭ２００５９ Ｈ－ＣＤＲ３
ＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬ
配列番号１２－ＩＭＭ２００５９ Ｌ－ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡ
配列番号１３－ＩＭＭ２００５９ Ｌ－ＣＤＲ２
ＤＡＳＩＲＡＴ
配列番号１４－ＩＭＭ２００５９ Ｌ－ＣＤＲ３
ＱＱＲＹＮＷＬＴ
ＳＩＨＳＬＮ
配列番号１０－ＩＭＭ２００５９ Ｈ－ＣＤＲ２
ＹＩＳＳＮＳＴＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１１－ＩＭＭ２００５９ Ｈ－ＣＤＲ３
ＤＹＹＣＴＧＧＴＣＦＦＬＰＤＬ
配列番号１２－ＩＭＭ２００５９ Ｌ－ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡ
配列番号１３－ＩＭＭ２００５９ Ｌ－ＣＤＲ２
ＤＡＳＩＲＡＴ
配列番号１４－ＩＭＭ２００５９ Ｌ－ＣＤＲ３
ＱＱＲＹＮＷＬＴ
【0062】
配列番号１５－アテゾリズマブＶＨドメイン
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
配列番号１６－アテゾリズマブＶＬドメイン
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
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配列番号１６－アテゾリズマブＶＬドメイン
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
【0063】
配列番号１７－アテゾリズマブＨ－ＣＤＲ１
ＳＤＳＷＩＨ
配列番号１８－アテゾリズマブＨ－ＣＤＲ２
ＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１９－アテゾリズマブＨ－ＣＤＲ３
ＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹ
配列番号２０－アテゾリズマブＬ－ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ
配列番号２１－アテゾリズマブＬ－ＣＤＲ２
ＳＡＳＦＬＹＳ
配列番号２２－アテゾリズマブＬ－ＣＤＲ３
ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ
ＳＤＳＷＩＨ
配列番号１８－アテゾリズマブＨ－ＣＤＲ２
ＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１９－アテゾリズマブＨ－ＣＤＲ３
ＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹ
配列番号２０－アテゾリズマブＬ－ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ
配列番号２１－アテゾリズマブＬ－ＣＤＲ２
ＳＡＳＦＬＹＳ
配列番号２２－アテゾリズマブＬ－ＣＤＲ３
ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ
【0064】
配列番号２３－アベルマブＶＨドメイン
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＩＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
配列番号２４－アベルマブＶＬドメイン
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＮＲＰＳＧＶ
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配列番号２４－アベルマブＶＬドメイン
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＮＲＰＳＧＶ
ＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬＧ
【0065】
配列番号２５－デュルバルマブＶＨドメイン
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＧＷＦＧＥＬＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
配列番号２６－デュルバルマブＶＬドメイン
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
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配列番号２６－デュルバルマブＶＬドメイン
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
【0066】
配列番号２７－ＢＭＳ－９３６５５９ ＶＨドメイン
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＤＴＦＳＴＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＨＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＫＦＨＦＶＳＧＳＰＦＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
配列番号２８－ＢＭＳ－９３６５５９ ＶＬドメイン
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ
ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＤＴＦＳＴＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＫＡＨＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＫＦＨＦＶＳＧＳＰＦＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
配列番号２８－ＢＭＳ－９３６５５９ ＶＬドメイン
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ
ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ
【0067】
配列番号２９－ＶＨ「Ｌ」リンカー
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ
配列番号３０－ＶＬ「Ｌ」リンカー
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ
配列番号３１－ＶＬ「Ｓ」リンカー
ＴＶＡＡＰ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ
配列番号３０－ＶＬ「Ｌ」リンカー
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ
配列番号３１－ＶＬ「Ｓ」リンカー
ＴＶＡＡＰ
【0068】
配列番号３２－ＩＭＭ２００５９－Ｌ－ＡＴＥ二重特異性ＶＨドメインヌクレオチド配列
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配列番号３３－ＩＭＭ２００５９－Ｌ－ＡＴＥ二重特異性ＶＨドメインアミノ酸配列
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配列番号３３－ＩＭＭ２００５９－Ｌ－ＡＴＥ二重特異性ＶＨドメインアミノ酸配列
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【0069】
配列番号３４－ＩＭＭ２００５９－Ｌ－ＡＴＥ二重特異性ＶＬドメインヌクレオチド配列
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配列番号３５－ＩＭＭ２００５９－Ｌ－ＡＴＥ二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号３５－ＩＭＭ２００５９－Ｌ－ＡＴＥ二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
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【0070】
配列番号３６－２Ｈ１１－Ｓ－ＡＴＥ二重特異性ＶＬドメインヌクレオチド配列
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配列番号３７－２Ｈ１１－Ｓ－ＡＴＥ二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号３７－２Ｈ１１－Ｓ－ＡＴＥ二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
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【0071】
配列番号３８－ＡＴＥ－Ｌ－２Ｈ１１二重特異性ＶＨドメインヌクレオチド配列
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配列番号３９－ＡＴＥ－Ｌ－２Ｈ１１二重特異性ＶＨドメインアミノ酸配列
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【0072】
配列番号４０－ＡＴＥ－Ｌ－２Ｈ１１二重特異性ＶＬドメインヌクレオチド配列
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配列番号４１－ＡＴＥ－Ｌ－２Ｈ１１二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号４１－ＡＴＥ－Ｌ－２Ｈ１１二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
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【0073】
配列番号４２－ＡＴＥ－Ｓ－２Ｈ１１二重特異性ＶＬドメインヌクレオチド配列
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配列番号４３－ＡＴＥ－Ｓ－２Ｈ１１二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号４３－ＡＴＥ－Ｓ－２Ｈ１１二重特異性ＶＬドメインアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＮＩＳＮＦＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＲＹＮＷＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【0074】
配列番号４４－抗ＣＤ－６３抗体のＶＨドメインアミノ酸配列
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配列番号４５－抗ＣＤ－６３抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号４５－抗ＣＤ－６３抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
ＤＩＷＭＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＰＧＥＫＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＩＱＴＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＩＦＳＳＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫＲ
【0075】
配列番号４６－抗ＨＥＲ２抗体のＶＨドメインアミノ酸配列
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配列番号４７－抗ＨＥＲ２抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号４７－抗ＨＥＲ２抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0076】
配列番号４８－抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＨドメインアミノ酸配列
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配列番号４９－抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号４９－抗ＥｐＣＡＭ抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＡＱＮＬＥＩＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＬＫ
【0077】
配列番号５０－抗ＨＥＲ３抗体のＶＨドメインアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＨＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＦＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＭＴＶＤＴＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＲＤＹＤＹＤＧＲＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ
配列番号５１－抗ＨＥＲ３抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号５１－抗ＨＥＲ３抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＴＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＨＩＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0078】
配列番号５２－抗ＥＧＦＲ抗体のＶＨドメインアミノ酸配列
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬ
配列番号５３－抗ＥＧＦＲ抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
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配列番号５３－抗ＥＧＦＲ抗体のＶＬドメインアミノ酸配列
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）エキソソームタンパク質に特異的な第１の抗原結合部分、及び
（Ｂ）プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的な第２の抗原結合部分
を含む、二重特異性抗体。
（Ｂ）プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的な第２の抗原結合部分
を含む、二重特異性抗体。
【外国語明細書】