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特開2024-123082二重特異抗体またはその抗原結合断片、及びそれを製造する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123082
(43)【公開日】2024-09-10
(54)【発明の名称】二重特異抗体またはその抗原結合断片、及びそれを製造する方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240903BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240903BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240903BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240903BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024096090
(22)【出願日】2024-06-13
(62)【分割の表示】P 2023515550の分割
【原出願日】2021-05-28
(31)【優先権主張番号】10-2020-0066030
(32)【優先日】2020-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】522457553
【氏名又は名称】マストバイオ株式会社
【氏名又は名称原語表記】ＭＵＳＴＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100137589
【弁理士】
【氏名又は名称】右田 俊介
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ソンヨプ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ヨンジン
(72)【発明者】
【氏名】パン，ヒョジュ
(72)【発明者】
【氏名】キム，メンソプ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を提供する。
【解決手段】ＩｇＧの第１ ＣＨ３抗体不変領域を含む第１ポリペプチド、及びＩｇＧの第２ ＣＨ３抗体不変領域を含む第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドは、異種二量体を形成するタンパク質複合体であり、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）またはグリシン（Ｇ）を含む、タンパク質複合体（ただし、前記アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。
【選択図】図２
【解決手段】ＩｇＧの第１ ＣＨ３抗体不変領域を含む第１ポリペプチド、及びＩｇＧの第２ ＣＨ３抗体不変領域を含む第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドは、異種二量体を形成するタンパク質複合体であり、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）またはグリシン（Ｇ）を含む、タンパク質複合体（ただし、前記アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩｇＧの第１ ＣＨ３抗体不変領域を含む第１ポリペプチド、及びＩｇＧの第２ ＣＨ３抗体不変領域を含む第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドは、異種二量体を形成するタンパク質複合体であり、
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）を含み、
前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）またはグリシン（Ｇ）を含む、タンパク質複合体（ただし、前記アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）を含み、
前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）またはグリシン（Ｇ）を含む、タンパク質複合体（ただし、前記アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年６月１日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００６６０３０号を優先権として主張し、前記明細書全体は、本出願の参考文献である。
本発明は、異種二量体形成率が高い二重特異抗体またはその抗原結合断片、及びそれを製造する方法に関する。
本発明は、異種二量体形成率が高い二重特異抗体またはその抗原結合断片、及びそれを製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
天然のヒト免疫グロブリン（Ｉｇ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）は、互いに同一な２つの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と、２つの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）とが結合された形態によってなっている。また、該免疫グロブリンは、機能的に、抗原・抗体結合をなすＦａｂ（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）領域と、２個の重鎖が二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成するＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域とに分けることができる。そのような自然免疫グロブリン、すなわち、単一クローン抗体（ｍＡＢ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、一般的に、２つのＦａｂ領域が互いに同一であるために、同一抗原の同一結合位置（ｅｐｉｔｏｐｅ）を標的として作用し、二価（ｂｉ－ｖａｌｅｎｔ）の単一特異的（ｍｏｎｏ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）である結合特性を有する。
【0003】
該免疫グロブリンは、Ｆａｂ領域が有する標的特異的抗原結合機能と、Ｆｃ領域が有する免疫細胞誘導及び生体内半減期増大機能により、多様な疾病の治療剤として広く活用されている。しかしながら、最近になり、癌または自己免疫疾患のような難治性疾患において、互いに異なる標的に作用する２つの薬物を共に使用し、シナジーを出す治療法が、単一薬物を使用するより、高い治療効果を示すようになりながら、２つの標的物質に作用することができる多様な二重特異（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が開発されている。
【0004】
そのように開発された二重特異抗体のうち、互いに異なる抗体の可変部位切片をポリペプチド鎖で連結したｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ形態の二重抗体は、分子量が小さく、安定性が低く、生体内に長く留まり、薬効を持続させるということができないという短所を有する。また、自然免疫グロブリンのポリペプチド末端に、他の抗体の可変部位切片を連結したｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ形態またはＦａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ形態の二重抗体は、構造的安定性が低く、凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成し、生体内において、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示しうるという短所がある。従って、そのような問題を解決するために、可能な限り、自然免疫グロブリンの形態に撚りながら、互いに異なる可変部位を有する二重抗体の開発が必要である。
【0005】
そのような形態の二重抗体が形成されるためには、互いに異なる２つのＦａｂ－ＦｃのＦｃ領域間に、異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形成がなされなければならない。Ｆｃ異種二量体形成には、それぞれのＣＨ３ドメインが互いに相互作用する位置のアミノ酸が重要に作用するので、それらアミノ酸を他のアミノ酸で置換する方式により、Ｆｃ異種二量体技術開発がなされている（米国特許番号５７３１１６８Ａ（１９９８．０３．２４．）、韓国特許番号１０－２０９８９１９（２０２０．０４．０２．））。
【0006】
しかしながら、そのように開発された既存のＦｃ異種二量体技術も、全てのＦｃ構造体を１００％異種二量体形態に作ることができないという限界を有しており、異種二量体と同種二量体との混合物を形成することになる。
【0007】
従って、異種二量体形成効率が改善されたタンパク質複合体、それを含む二重特異抗体またはその抗原結合断片、受容体、及び該受容体に結合する作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）、拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、リガンド、並びに受容体誘引（ｄｅｃｏｙ）二重接合体などを開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
一態様は、異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を提供することである。
他の態様は、異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を製造する方法を提供することである。
さらに他の態様は、異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を含む疾病予防用または疾病治療用の薬学的組成物を提供することである。
さらに他の態様は、異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を利用した疾病予防方法または疾病治療方法を提供することである。
さらに他の態様は、疾病の予防剤または治療剤の製造のための異種二量体形成率が高いタンパク質複合体の用途を提供することである。
他の態様は、異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を製造する方法を提供することである。
さらに他の態様は、異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を含む疾病予防用または疾病治療用の薬学的組成物を提供することである。
さらに他の態様は、異種二量体形成率が高いタンパク質複合体を利用した疾病予防方法または疾病治療方法を提供することである。
さらに他の態様は、疾病の予防剤または治療剤の製造のための異種二量体形成率が高いタンパク質複合体の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
一態様は、第１ ＣＨ３抗体不変領域を含む第１ポリペプチド、及び第２ ＣＨ３抗体不変領域を含む第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドは、異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するタンパク質複合体を提供する。
一具体例において、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６番目位置にトリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置にセリン（Ｓ）、３６８位置にアラニン（Ａ）、及び４０７位置にバリン（Ｖ）を含み、該第１ ＣＨ３抗体不変領域及び該第２ ＣＨ３抗体不変領域のうち１以上は、３５１及び３９４からなる群の中から選択された１以上の位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）からなる群の中から選択された１以上のアミノ酸を含むものでもある。
前記タンパク質複合体は、第１ ＣＨ３抗体不変領域を含む第１ポリペプチド、及び第２ ＣＨ３抗体不変領域を含む第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドは、異種二量体を形成することができる。
一具体例において、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６番目位置にトリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置にセリン（Ｓ）、３６８位置にアラニン（Ａ）、及び４０７位置にバリン（Ｖ）を含み、該第１ ＣＨ３抗体不変領域及び該第２ ＣＨ３抗体不変領域のうち１以上は、３５１及び３９４からなる群の中から選択された１以上の位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）からなる群の中から選択された１以上のアミノ酸を含むものでもある。
前記タンパク質複合体は、第１ ＣＨ３抗体不変領域を含む第１ポリペプチド、及び第２ ＣＨ３抗体不変領域を含む第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドは、異種二量体を形成することができる。
【0010】
用語「抗体 （ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、用語「免疫グロブリン（Ｉｇ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」と相互交換的に使用される。完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）、及び２個の全長重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合（ＳＳ－ｂｏｎｄ：ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で結合する。前記軽鎖は、λ、κの２種があり、大体において、２１１個ないし２１７個のアミノ酸によって構成されている。ヒト抗体のそれぞれには、いずれも同一に、１種の軽鎖だけが存在する。該軽鎖は、不変領域と可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とが連続してなっている。前記重鎖は、５種（γ、δ、α、μ、ε）があり、重鎖が抗体の種類を決定する。αとγは、４５０個、μとεは、５５０個のアミノ酸によって構成されている。該重鎖は、２つの領域、すなわち、可変領域と不変領域とがある。前記可変領域は、抗体において、抗原が結合する領域を意味する。前記可変領域は、抗原との結合特異性を付与する相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含むものでもある。
【0011】
前記抗体は、抗原に結合するＦａｂ（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）領域と、細胞表面受容体に結合するＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域とを含むものでもある。パパイン（ｐａｐａｉｎ）で切断する場合、完全な抗体は、２個のＦａｂ領域と、１個のＦｃ領域とに切断することができる。該Ｆａｂ領域は、重鎖の可変領域（ＶＨ）ドメインと、重鎖の不変領域１（ＣＨ１）ドメインとを含むポリペプチド；及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）ドメインと、軽鎖の不変領域（ＣＬ）ドメインとのポリペプチドが、二硫化結合で連結されたものでもある。該Ｆｃ領域は、重鎖の不変領域２（ＣＨ２）ドメインと、不変領域３（ＣＨ３）ドメインとを含むポリペプチド２個が連結されたものでもある。該Ｆｃ領域は、ヒンジ領域を形成することができる。
【0012】
前記ＣＨ３抗体不変領域は、抗体の重鎖不変領域３ドメインを意味する。
第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、抗体のＦｃ領域を形成することができる。
前述の異種二量体またはヘテロダイマーは、アミノ酸残基の順序、個数または種類が互いに異なる２つのポリペプチドが結合したものを意味する。前記タンパク質複合体は、互いに異なる標的に特異的に結合する２つのポリペプチドが結合して形成された二重特異抗体またはその抗原結合断片でもある。
第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、抗体のＦｃ領域を形成することができる。
前述の異種二量体またはヘテロダイマーは、アミノ酸残基の順序、個数または種類が互いに異なる２つのポリペプチドが結合したものを意味する。前記タンパク質複合体は、互いに異なる標的に特異的に結合する２つのポリペプチドが結合して形成された二重特異抗体またはその抗原結合断片でもある。
【0013】
前記タンパク質複合体は、二重特異（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体またはその抗原結合断片、受容体と作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）の接合体、受容体と拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）との接合体、受容体とリガンド（ｌｉｇａｎｄ）との接合体、またはリガンドと誘引（ｄｅｃｏｙ）受容体との接合体でもある。また、前記タンパク質複合体は、抗原結合断片（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、膜受容体の細胞外ドメイン、作用剤、拮抗剤、リガンド、誘引受容体、サイトカイン、凝固因子及び親和性タグからなる群の中から選択されたものを含むものでもある。
【0014】
前記抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭでもある。前記抗体は、モノクーナル抗体またはポリクローナル抗体でもある。前記抗体は、動物由来抗体、マウス・ヒトキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはヒト抗体でもある。
【0015】
用語「抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、免疫グロブリン全体構造に係わるその断片であり、抗原が結合することができる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、該抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＦｖＦ（ａｂ’）２、またはそれらの組み合わせでもある。
用語「二重特異（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」とは、互いに異なる標的タンパク質を特異的に認識することを意味する。二重特異抗体またはその抗原結合断片は、異なる標的抗原を認識する２つの抗原結合部位を有する抗体またはその抗原結合断片を意味する。該二重特異抗体またはその抗原結合断片は、二重特異抗体（ＢｓＡｂ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：）とも呼ばれる。
用語「二重特異（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」とは、互いに異なる標的タンパク質を特異的に認識することを意味する。二重特異抗体またはその抗原結合断片は、異なる標的抗原を認識する２つの抗原結合部位を有する抗体またはその抗原結合断片を意味する。該二重特異抗体またはその抗原結合断片は、二重特異抗体（ＢｓＡｂ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：）とも呼ばれる。
【0016】
前記二重特異抗体またはその抗原結合断片は、ｋｉｈ（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃ、トリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）、ＩｇＧ類似（ＩｇＧ－ｌｉｋｅ）抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂ、２：１ ＣｒｏｓｓＭａｂ、２：２ ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤｕｏＢｏｄｙ、ＤＶＤ－Ｉｇ（ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＩｇＧ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ＡＤＰＴＩＲ、ＢｉＴＥ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）－Ｆｃ、ＤＡＲＴ（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）－Ｆｃ、Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＬＰ－ＤＡＲＴ、ＣＯＤＶ（Ｃｒｏｓｓ－Ｏｏｖｅｒ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ）－Ｉｇ、ＣＯＤＶ－Ｆａｂ－ＴＬ、ＨＬＥ（Ｈａｌｆ－Ｌｉｆｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ）－Ｂｉｔｅ、Ｔａｎｄｅｍ ＶHH（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）－Ｆｃ、またはそれらの組み合わせでもある。
【0017】
用語「受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、生物学的系に伝達することができる信号を受けたり、伝達したりする物質を意味する。前記受容体は、タンパク質受容体でもある。前記受容体は、作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）、拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、リガンド（ｌｉｇａｎｄ）またはサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に結合することができる。前記作用剤は、受容体と結合し、受容体を活性化させ、生物学的反応を誘導する物質でもある。前記拮抗剤は、受容体と結合し、受容体を抑制し、生物学的反応を抑制する物質でもある。前記リガンドは、受容体に結合する物質でもある。前記リガンドは、誘引（ｄｅｃｏｙ）受容体と結合することができる。該誘引受容体は、リガンドに特異的に結合することにより、実際の受容体を介する信号伝逹を阻害する受容体を意味する。前記サイトカインは、細胞の信号伝逹、炎症過程の調節及び維持に作用する小型タンパク質を意味する。
【0018】
前記タンパク質複合体は、変形されたものでもある。例えば、前記タンパク質複合体は、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）または結合、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、タグ付着、またはそれらの組み合わせに変形されたものでもある。前記抗体は、抗癌剤のような他の薬物と接合されうる。例えば、前記タンパク質複合体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリンホスファターゼ、ヘプテン（ｈａｐｔｅｎ）、ビオチン、ストレブトアビジン、蛍光物質、放射性物質、量子点、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ヒスチジンタグ、またはそれらの組み合わせと結合されたものでもある。前記蛍光物質は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０（いずれも登録商標）でもある。
【0019】
前記アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘ（「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ． （１９９１）」）に記載されたＥＵインデックス）による。前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸位置、及びここに該当するアミノ酸種類は、ヒトＩｇＧ１を基準にする。
【0020】
前記タンパク質複合体において、第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６番目位置に、トリプトファン（Ｗ）を含むものでもある。第１ ＣＨ３抗体不変領域において、３６６番目位置は、スレオニン（Ｔ）からトリプトファン（Ｗ）に置換されたもの（Ｔ３６６Ｗ）でもある。前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、そして４０７位置に、バリン（Ｖ）を含むものでもある。第２ ＣＨ３抗体不変領域において、３６６位置は、スレオニン（Ｔ）からセリン（Ｓ）に置換されたもの（Ｔ３６６Ｓ）でもある。第２ ＣＨ３抗体不変領域において、３６８位置は、ロイシン（Ｌ）からアラニン（Ａ）に置換されたもの（Ｌ３６８Ａ）でもある。第２ ＣＨ３抗体不変領域において、４０７位置は、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）に置換されたもの（Ｙ４０７Ｖ）でもある。
【0021】
前記タンパク質複合体において、第１ ＣＨ３抗体不変領域及び第２ ＣＨ３抗体不変領域のうち１以上は、３５１及び３９４からなる群の中から選択された１以上の位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）及びセリン（Ｓ）からなる群の中から選択された１以上のアミノ酸を含むものでもある。
【0022】
例えば、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１及び３９４からなる群の中から選択された１以上の位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）及びイソロイシン（Ｉ）からなる群の中から選択された１以上のアミノ酸を含むものでもある。また、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１及び３９４からなる群の中から選択された１以上の位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）からなる群の中から選択された１以上のアミノ酸を含むものでもある。
【0023】
一具体例において、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、３９４位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはトリプトファン（Ｗ）を含むものでもある。前記３９４位置は、スレオニン（Ｔ）からフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはトリプトファン（Ｗ）に置換されたもの（Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４ＨまたはＴ３９４Ｗ）でもある。
【0024】
他の具体例において、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、３５１位置に、トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を含むものでもある。前記３５１位置は、ロイシン（Ｌ）から、トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）またはフェニルアラニン（Ｆ）に置換されたもの（Ｌ３５１Ｗ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１ＡまたはＬ３５１Ｆ）でもある。
【0025】
さらに他の具体例において、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を含むものでもある。前記３５１位置は、ロイシン（Ｌ）から、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）またはフェニルアラニン（Ｆ）に置換されたもの（Ｌ３５１Ａ、Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１ＭまたはＬ３５１Ｆ）でもある。
【0026】
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３９４位置に、ヒスチジン（Ｈ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３９４位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３９４位置に、トリプトファン（Ｗ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、トリプトファン（Ｗ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、バリン（Ｖ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）、並びに
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、３９４位置に、ヒスチジン（Ｈ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）からなる群の中から選択されたものを含むものでもある。
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３９４位置に、ヒスチジン（Ｈ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３９４位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３９４位置に、トリプトファン（Ｗ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、トリプトファン（Ｗ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、バリン（Ｖ）、
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）、並びに
３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、３９４位置に、ヒスチジン（Ｈ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）からなる群の中から選択されたものを含むものでもある。
【0027】
前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、グリシン（Ｇ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、バリン（Ｖ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、メチオニン（Ｍ）、並びに
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）からなる群の中から選択されたものを含むものでもある。
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、グリシン（Ｇ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、バリン（Ｖ）、
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、メチオニン（Ｍ）、並びに
３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）からなる群の中から選択されたものを含むものでもある。
【0028】
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、３９４位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）またはトリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）を含むものでもある。
【0029】
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）を含むものでもある。前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３９４位置に、ヒスチジン（Ｈ）をさらに含むものでもある。
【0030】
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、グリシン（Ｇ）を含むものでもある。前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）をさらに含むものでもある。
【0031】
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、バリン（Ｖ）またはメチオニン（Ｍ）を含むものでもある。
【0032】
前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１位置に、バリン（Ｖ）、またはアラニン（Ａ）をさらに含むものでもある。例えば、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、バリン（Ｖ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）を含むものでもある。また、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）、及び３５１位置に、アラニン（Ａ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）を含むものでもある。
【0033】
一態様によるタンパク質複合体は、Ｆｃ変異体の逆配列置換された変異体でもある。本明細書において、用語「逆配列置換変異体」は、タンパク質複合体の左右重鎖不変領域が、座標平面上において、Ｙ軸に対して対称になる構造を示す。例えば、前記逆配列置換変異体は、一具体例によるタンパク質複合体において、アミノ酸置換された特定位置及び種類は、同一であるが、第１ ＣＨ３抗体不変領域と第２ ＣＨ３抗体不変領域とが座標平面上において、Ｙ軸に対して対称になる構造を示しうる。前記逆配列置換変異体は、特定アミノ酸の置換前と類似した比率で異種二量体を形成するので、高効率のＦｃ変異体を形成することができる。前記タンパク質複合体の具体的な内容は、前述の通りである。
【0034】
一具体例において、前記第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、及び４０７位置に、バリン（Ｖ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６番目位置に、トリプトファン（Ｗ）を含み、第１ ＣＨ３抗体不変領域及び第２ ＣＨ３抗体不変領域のうち１以上は、３５１及び３９４からなる群の中から選択された１以上の位置に、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）からなる群の中から選択された１以上のアミノ酸を含むものでもある。前記第１ ＣＨ３抗体不変領域及び第２ ＣＨ３抗体不変領域の具体的な内容は、前述の通りである。
【0035】
また、第１ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、セリン（Ｓ）、３６８位置に、アラニン（Ａ）、４０７位置に、バリン（Ｖ）、及び３５１位置に、グリシン（Ｇ）を含み、前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３６６位置に、トリプトファン（Ｗ）を含むものでもある。前記第２ ＣＨ３抗体不変領域は、３５１位置に、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）をさらに含むものでもある。
【0036】
一実施例においては、抗体のＣＨ３抗体不変領域において、特定位置のアミノ酸を置換して選別されたＦｃ変異体の異種二量体形成率を比較した結果、野生型ＩｇＧ１と、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）二重抗体とを比較し、異種二量体形成率が顕著に高いだけでなく、熱力学的安定性にすぐれているということを確認した。また、前記Ｆｃ変異体の逆配列置換された変異体においても、野生型ＩｇＧ１と、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）二重抗体とを比較し、異種二量体形成率が顕著に高いことを確認した。従って、一態様によるタンパク質複合体は、異種二量体形成効率が改善されたが、それを含む二重特異抗体またはその抗原結合断片、受容体と、該受容体に結合する作用剤、拮抗剤、リガンド、サイトカイン及び受容体誘引二重接合体として、活用可能である。
【0037】
他の態様は、一態様による第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、またはそれらの組み合わせをコーディングする１以上の発現ベクターを、１以上の細胞に形質転換し、前述の第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現させる段階を含むタンパク質複合体を製造する方法を提供する。
【0038】
前述の第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、及びタンパク質複合体の具体的な内容は、前述の通りである。
【0039】
該発現ベクターは、適切な宿主細胞において、目的タンパク質を発現することができる発現ベクターであり、挿入された核酸配列が発現されるように作動自在に（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）連結された必須な調節要素を含むベクターを意味する。前記「作動自在に連結された」とは、一般的機能を遂行するように、核酸発現調節配列と、目的タンパク質をコーディングする核酸とが機能的に連結されていることを意味する。前記発現ベクターは、前述の第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、またはそれらの組み合わせをコーディングするポリヌクレオチドを含むものでもある。前記発現ベクターは、遺伝子の発現に必要な調節部位、例えば、エンハンサ（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、プローモーター、ポリ（Ａ）配列などを含むものでもある。
【0040】
前記細胞は、癌細胞でもある。前記細胞は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞でもある。前記細胞は、細菌、酵母、植物細胞または哺乳動物細胞でもある。前記細菌は、大腸菌でもある。前記哺乳動物細胞は、マウス、ラット、兎、犬、猫、羊、牛、馬、猿、チンパンジーまたはヒトに由来する細胞を意味する。前記細胞は、細胞株でもある。前記細胞は、例えば、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、ヒト胚芽腎臓（ＨＥＫ：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞、ＣＯＳ－７及びＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞からなる群の中から選択される。前記ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＧＳ－ＣＨＯ細胞またはＣＨＯＤＵＫＸ（ＤＸＢ１１）細胞でもある。前記ＨＥＫ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞でもある。
【0041】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、特定核酸断片を細胞の遺伝体内に挿入し、挿入された核酸を発現させる方法を意味する。
【0042】
前記第１ポリペプチドをコーディングする発現ベクターと、前記第２ポリペプチドをコーディングする発現ベクターとを、細胞に共形質転換（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させるか、あるいは第１ポリペプチドをコーディングする発現ベクターと、前記第２ポリペプチドをコーディングする発現ベクターとを、２種以上の細胞にそれぞれ形質転換させることができる。
【0043】
前記細胞は、細胞培養培地においても培養される。該細胞培養培地は、細胞を培養するのに必要な栄養成分を含む溶液を意味する。前記培地は、細胞を培養するのに利用される、商業化された培地または製造された培地を含む。前記細胞培養培地は、抗生物質を含むものでもある。前記細胞培養培地は、Ｇ４１８（ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）、またはそれらの組み合わせを含むものでもある。前記細胞培養培地は、化学組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を含むものでもある。
【0044】
前記細胞は、細胞の生存または増殖を許容する条件下においても培養される。前記細胞の生存または増殖を許容する条件は、細胞の種類によっても異なる。前記細胞は、約２５℃ないし約４２℃、約２５℃ないし約４０℃、約３０℃ないし約４０℃、約３０℃ないし約３７℃、または約３７℃においても培養される。前記細胞は、約１％ ＣＯ2ないし約１０％ ＣＯ2、または約５％ ＣＯ2ないし約１０％ ＣＯ2の空気存在下においても培養される。前記細胞は、約ｐＨ６ないし約ｐＨ８、約ｐＨ６．２ないし約ｐＨ７．８、約ｐＨ６．４ないし約ｐＨ７．６、約ｐＨ６．６ないし約ｐＨ７．４、または約ｐＨ６．８ないし約ｐＨ７．２の培地においても培養される。前記細胞は、溶存酸素約１０％ないし約８０％、約１５％ないし約７０％、または約２０％ないし約６０％の条件においても培養される。
【0045】
前記培養は、細胞の種類によっても異なる。前記培養は、周知の方法を利用することができる。前記培養は、プレート、フラスコなどによっても行われる。前記培養は、基質に付着させるか、あるいは培養液に浮遊させる方法によっても行われる。前記培養は、継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）、回分培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、灌流培養（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはそれらの組み合わせでもある。前述の培養時、細胞培養培地を新鮮な培地に周期的に交換することができる。前記細胞を、約１日以上、約２日以上、約３日以上、約４日以上、約５日以上、約６日以上、約１週間以上、約１０日以上、約２週間以上、約３週間以上、約１ヵ月以上、約１日ないし約１ヵ月、約１日ないし約３週、約１日ないし約２週、約２日ないし約２週、約３日ないし約２週、約４日ないし約２週、約５日ないし約２週、約６日ないし約２週、または約１週ないし約２週の間、培養することができる。
【0046】
前記細胞または細胞培養液から、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、または第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとのタンパク質複合体を得る段階を含むものでもある。
前記細胞培養液は、前記細胞がない培養液でもある。
前記細胞培養液は、前記細胞がない培養液でもある。
【0047】
前記発現ベクターを細胞に共形質転換する場合、前記細胞または前記細胞培養液から、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとのタンパク質複合体を得ることができる。前記第１ポリペプチドをコーディングする発現ベクターと、前記第２ポリペプチドをコーディングする発現ベクターとを、２種以上の細胞にそれぞれ形質転換する場合、前記細胞または前記細胞培養液から、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドをそれぞれ得ることができる。
【0048】
前記タンパク質複合体を得る段階は、得られた第１ポリペプチドと、得られた第２ポリペプチドとをインキュベーションし、タンパク質複合体を形成させる段階を含むものでもある。前記インキュベーションは、還元条件下においても行われる。前記還元条件は、２－メルカブトエタノール（２－ＭＥ：２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ：ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、またはそれらの組み合わせの存在下にでもある。
【0049】
前記タンパク質複合体を得る段階は、タンパク質複合体を精製する段階を含むものでもある。前記精製は、濾過、遠心分離、クロマトグラフィ、透析、免疫沈降、またはそれらの組み合わせによっても行される。
【0050】
さらに他の態様は、一態様によるタンパク質複合体を含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【0051】
前記タンパク質複合体に係わる具体的な内容は、前述の通りである。
【0052】
前記癌は、固形癌または非固形癌でもある。該固形癌は、例えば、肝臓、肺、乳房、皮膚のような臓器に癌腫瘍が発生したものを意味する。非固形癌は、血液内に発生した癌であり、血液癌とも呼ばれる。前記癌は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、造血細胞由来癌、胚細胞腫瘍（ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）または芽細胞腫（ｂｌａｓｔｏｍａ）でもある。前記癌は、乳癌、皮膚癌、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓癌、腎臓癌、透明細胞肉腫、黒色腫、脳脊髄腫瘍、脳癌、胸腺腫、中皮腫、食道癌、胆道癌、睾丸癌、生殖細胞腫、甲状腺癌、副甲状線癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、骨髄形成異常症侯群（ＭＤＳ：ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、内分泌系癌及び肉腫からなる群の中からも選択される。
【0053】
用語「予防」とは、前記薬学的組成物の投与によって疾患を抑制するか、あるいはその発病を遅延させる全ての行為を意味する。用語「治療」とは、前記薬学的組成物の投与によって疾患の症状が好転するか、あるいは良好に変更される全ての行為を意味する。
【0054】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むものでもある。前記担体は、賦形剤、希釈剤または補助剤を含む意味に使用される。前記担体は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルからなる群の中から選択されたものでもある。前記組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤、保存剤、またはそれらの組み合わせを含むものでもある。
【0055】
前記薬学的組成物は、通常の方法により、任意の剤形で準備することができる。前記組成物は、例えば、経口投与剤形（例えば、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、錠剤または顆粒）、あるいは非経口剤形（例えば、注射剤）にも剤形化される。また、前記組成物は、全身剤形または局所剤形にも製造される。
【0056】
前記薬学的組成物は、他の抗癌剤をさらに含むものでもある。前記抗癌剤は、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、Ｔ－ＤＭ１、パージェタ（Ｐｅｒｊｅｔａ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、パクリタキセル、タキソール、タモキシフェン、シスプラチン、またはそれらの組み合わせでもある。前記薬学的組成物は、単一組成物、または個別的な組成物でもある。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片の組成物は、非経口投与剤形の組成物であり、該抗癌剤は、経口投与剤形の組成物でもある。
【0057】
前記薬学的組成物は、前記タンパク質複合体を有効な量で含むものでもある。用語「有効な量」とは、疾患の予防または治療を必要とする個体に投与される場合、予防または治療の効果を示すに十分な量を意味する。前記有効な量は、当業者が、選択される細胞または個体により、適切に選択することができる。疾患の重症度、患者の年齢・体重・健康・性別、患者の薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の比率、治療期間、使用された組成物との配合、または同時使用される薬物を含む要素、及びその他医学分野に周知の要素によっても決定される。前記有効な量は、前記薬学的組成物当たり、約０．５μｇないし約２ｇ、約１μｇないし約１ｇ、約１０μｇないし約５００ｍｇ、約１００μｇないし約１００ｍｇ、または約１ｍｇないし約５０ｍｇでもある。
【0058】
前記薬学的組成物の投与量は、例えば、成人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多会、または１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、または１年に１回投与されうる。
【0059】
さらに他の態様は、一態様によるタンパク質複合体を、細胞または個体に投与する段階を含む癌の予防方法または治療方法を提供する。
前述のタンパク質複合体、細胞、癌、予防、または治療に係わる具体的な内容は、前述の通りである。
前述のタンパク質複合体、細胞、癌、予防、または治療に係わる具体的な内容は、前述の通りである。
【0060】
前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、牛、馬、豚、犬、羊、山羊または猫でもある。前記個体は、癌を病むとか病む可能性が高い個体でもある。
【0061】
前記方法は、前記個体に第２の有効成分を投与する段階をさらに含むものでもある。該第２の有効成分は、癌の予防または治療のための有効成分でもある。前記有効成分は、前記タンパク質複合体と、同時、個別または順にも投与される。
【0062】
前記タンパク質複合体は、例えば、経口、静脈内、筋肉内、経口、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、粘膜、鼻内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）、器官内（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ）または皮下投与のような任意の手段により、個体に直接投与されうる。前記タンパク質複合体は、全身的または局所的にも投与され、単独、または他の薬学的活性化合物と共に投与されうる。
【0063】
前記タンパク質複合体の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうる。前記投与量は、例えば、成人基準で、約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇの範囲内でもある。前記投与は、１日１回、１日多会、または１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、または１年に１回投与されうる。
【発明の効果】
【0064】
異種二量体形成率が高いタンパク質複合体、それを製造する方法、タンパク質複合体を含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物、及びそれを利用した癌の予防方法または治療方法によれば、増大された安定性を有する二重特異抗体または抗原結合断片、受容体と、該受容体に結合する作用剤、拮抗剤、リガンド、サイトカインまたは受容体誘引二重接合体を容易に製造することができ、疾病の予防または治療、及び疾病診断のような多様な分野に活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】Ｆｃ変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＰＴＣＷＴ（陰性対照群）、０１９：ＰＴＣ０１９（陽性対照群）、０３９：ＰＴＣ０３９、０４０：ＰＴＣ０４０、０７４：ＰＴＣ０７４、１１１：ＰＴＣ１１１）。
【図2】Ｆｃ変異体のＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ＳＤＳ）分析結果を示したグラフである。
【図3A】ＰＴＣＷＴのサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果を示したグラフである。
【図3B】ＰＴＣ０１９のサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果を示したグラフである。
【図3C】ＰＴＣ０３９のサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果を示したグラフである。
【図3D】ＰＴＣ０４０のサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果を示したグラフである。
【図3E】ＰＴＣ０７４のサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果を示したグラフである。
【図3F】ＰＴＣ１１１のサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果を示したグラフである。
【図4】逆配列置換Ｆｃ変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＰＴＣＷＴ（陰性対照群）、０１９：ＰＴＣ０１９（陽性対照群）、０８８：ＰＴＣ０８８、０８９：ＰＴＣ０８９、０９０：ＰＴＣ０９０）。
【図5】一部配列置換Ｆｃ変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＰＴＣＷＴ（陰性対照群）、０１９：ＰＴＣ０１９（陽性対照群）、０７４：ＰＴＣ０７４、０９７：ＰＴＣ０９７、０９８：ＰＴＣ０９８、０９９：ＰＴＣ０９９、１１１：ＰＴＣ１１１、１１２：ＰＴＣ１１２）。
【図6】Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣＷＴ配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陰性対照群）、０１９：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０１９配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陽性対照群）、０７４：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体）。
【図7】Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣＷＴ配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陰性対照群）、０１９：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０１９配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陽性対照群）、０７４：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体）。
【図8】Ｆａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣＷＴ配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体（陰性対照群）、０１９：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０１９配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体（陽性対照群）、０７４：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体）。
【図9】抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体のイン・ビトロ癌細胞死滅誘導能を評価したグラフである（アベルマブ：陽性対照群、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖＢｓＡｂ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列を保有している抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体）。
【図10】抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体のイン・ビボ癌成長抑制効能を評価したグラフである（アベルマブ：陽性対照群、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖＢｓＡｂ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列を保有している抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体）。
【発明を実施するための形態】
【0066】
以下、本発明の理解の一助とするために、望ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明につき、さらに容易に理解することができるように提供されるのみ、下記実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例0067】
実施例１．Ｆｃ異種二量体変異体の準備
抗体のＣＨ３ドメインから、アミノ酸置換によって変化されるＦｃ異種二量体形成能を評価するために、設計された各Ｆｃ変異体の発現系を構築した。
抗体のＣＨ３ドメインから、アミノ酸置換によって変化されるＦｃ異種二量体形成能を評価するために、設計された各Ｆｃ変異体の発現系を構築した。
【0068】
異種二量体をなす２つのＦｃポリペプチドの区分及び分析を容易にするために、第１ポリペプチドは、重鎖と軽鎖とがいずれも連結された完全な形態のＩｇＧ鎖（Ｆｃ１）を発現するように設計され、第２ポリペプチドは、重鎖のＦｃ領域（Ｆｃ２）のみを発現するように設計された。Ｆｃ１は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むアベルマブ抗体（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｐｆｉｚｅｒ、登録商標）を基に、ＣＨ３ドメインのアミノ酸を置換し、Ｆｃ２は、野生型ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を基とし、ＣＨ３ドメインのアミノ酸を置換した。Ｆｃ１軽鎖は、アベルマブ抗体の軽鎖と同一なアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
【0069】
比較のために、野生型ＩｇＧ１（表１の「ＰＴＣＷＴ」に対応する）を陰性対照群にし、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）二重抗体（表１の「ＰＴＣ０１９」に対応する）を陽性対照群として利用した。
具体的には、それぞれのポリペプチドをコーディングするヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）をｐＣＨＯ１．０ベクターに導入し、発現ベクターを準備した。ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）細胞株を、ＥｘｐｉＣＨＯTM発現培地で培養した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｅTM ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用し、Ｆｃ１発現ベクターとＦｃ２発現ベクターとを、１：１で混合し、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM細胞株に形質感染させた。形質感染された細胞を発現培地で培養した後、培養液を分離して回収した。回収された培養液は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ ＳｐｉｎＴｒａｐTMカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、発現タンパク質を精製した。精製されたタンパク質は、緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換し、タンパク質の濃度を測定した。
発現されたアミノ酸配列は、以下に記載されている通りである。
具体的には、それぞれのポリペプチドをコーディングするヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）をｐＣＨＯ１．０ベクターに導入し、発現ベクターを準備した。ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）細胞株を、ＥｘｐｉＣＨＯTM発現培地で培養した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｅTM ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用し、Ｆｃ１発現ベクターとＦｃ２発現ベクターとを、１：１で混合し、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM細胞株に形質感染させた。形質感染された細胞を発現培地で培養した後、培養液を分離して回収した。回収された培養液は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ ＳｐｉｎＴｒａｐTMカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、発現タンパク質を精製した。精製されたタンパク質は、緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換し、タンパク質の濃度を測定した。
発現されたアミノ酸配列は、以下に記載されている通りである。
【0070】
【0071】
【0072】
【0073】
【0074】
【0075】
【0076】
実施例２．Ｆｃ変異体の異種二量体形成能比較
前述の実施例１で構築された一時的発現系を利用し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によって変化されるＦｃ異種二量体の形成能を比較し、それを介し、高効率Ｆｃ異種二量体変異体を選別した。
前述の実施例１で構築された一時的発現系を利用し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によって変化されるＦｃ異種二量体の形成能を比較し、それを介し、高効率Ｆｃ異種二量体変異体を選別した。
【0077】
評価方法として、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、異種二量体に該当するＰＡＧＥバンドの強度を測定して比較した。
具体的には、実施例１で精製されたタンパク質を、２－メルカプトエタノールで還元させるか、あるいは２－メルカプトエタノールで処理していない試料を準備した。還元または非還元の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法によって電気泳動し、ＣｈｅｍｉＤｏｃTM Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とＩｍａｇｅ ＬａｂTM Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を利用し、電気泳動バンドの強度を測定した。
測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表１に示した。
具体的には、実施例１で精製されたタンパク質を、２－メルカプトエタノールで還元させるか、あるいは２－メルカプトエタノールで処理していない試料を準備した。還元または非還元の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法によって電気泳動し、ＣｈｅｍｉＤｏｃTM Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とＩｍａｇｅ ＬａｂTM Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を利用し、電気泳動バンドの強度を測定した。
測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表１に示した。
【0078】
【表1】
【0079】
その結果、表１に示されているように、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）の異種二量体形成率は、それぞれ４１．５％及び６４．６％を示す一方、ＰＴＣ０３２、ＰＴＣ０３３、ＰＴＣ０３４、ＰＴＣ０３７、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０６１、ＰＴＣ０７４、ＰＴＣ０８２、ＰＴＣ０９１、ＰＴＣ１１１及びＰＴＣ１１３の異種二量体形成率は、それぞれ７８．７％、７６．４％、７６．１％、８５．８％、９３．８％、９４．６％、７０．９％、９４．９％、７９．３％、７５．４％、９２．７％及び８２．８％を示すということを確認することができた。特に、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１は、Ｆｃ異種二量体の比率が９０％を超えることを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、非常にすぐれたＦｃ異種二量体形成能を示しうる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、非常にすぐれたＦｃ異種二量体形成能を示しうる。
【0080】
実施例３．高効率Ｆｃ変異体の異種二量体形成能評価
３－１．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
前記実施例２で選別された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体形成能を評価するために、前記実施例２と同一方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
具体的には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、電気泳動バンドの強度を測定した。その後、測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成の比率を確認し、その結果を下記表２に示した（Ｎ／Ａ：該当事項なし）。
３－１．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
前記実施例２で選別された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体形成能を評価するために、前記実施例２と同一方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
具体的には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、電気泳動バンドの強度を測定した。その後、測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成の比率を確認し、その結果を下記表２に示した（Ｎ／Ａ：該当事項なし）。
【0081】
【表2】
【0082】
図１は、Ｆｃ変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである。
その結果、図１に示されているように、選別されたＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１のＦｃ変異体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と比較し、Ｆｃ１－１同種二量体（１４６．８ｋＤａ）のバンド強度が顕著に低減され、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）と比較し、Ｆｃ２単量体（２５．９ｋＤａ）のバンド強度が顕著に低減されていることを確認することができた。一方、Ｆｃ１－２異種二量体は、９９．３ｋＤａにおいて、高効率に形成されることを確認することができた。
その結果、図１に示されているように、選別されたＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１のＦｃ変異体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と比較し、Ｆｃ１－１同種二量体（１４６．８ｋＤａ）のバンド強度が顕著に低減され、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）と比較し、Ｆｃ２単量体（２５．９ｋＤａ）のバンド強度が顕著に低減されていることを確認することができた。一方、Ｆｃ１－２異種二量体は、９９．３ｋＤａにおいて、高効率に形成されることを確認することができた。
【0083】
また、表１に示されているように、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）の場合、Ｆｃ１－２異種二量体だけではなく、Ｆｃ１－１同種二量体が、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）において、１７．１％の比率で形成され、Ｆｃ－２－２同種二量体が、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）において、３９．９％で形成され、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）において、１３．３％の比率で形成されることを確認することができた。なお、選別されたＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１のＦｃ変異体の場合、Ｆｃ１－１同種二量体及びＦｃ－２－２同種二量体の形成率が低く、Ｆｃ１－２異種二量体の形成率が顕著に高いということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、Ｆｃ１－２異種二量体の選択的形成が可能であるということが分かる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、Ｆｃ１－２異種二量体の選択的形成が可能であるということが分かる。
【0084】
３－２．ＣＥ－ＳＤＳ分析
前記実施例２で選別された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体形成能を検証するために、毛細管電気泳動法であるＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ＳＤＳ）分析を行った。
具体的には、ＰＡ ８００ ｐｌｕｓTM ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＳＣＩＥＸ）を利用し、毛細管電気泳動を行い、Ｆｃ変異体のＦｃ異種二量体形成の比率を検証し、その結果を下記表３に示した。
前記実施例２で選別された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体形成能を検証するために、毛細管電気泳動法であるＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ＳＤＳ）分析を行った。
具体的には、ＰＡ ８００ ｐｌｕｓTM ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＳＣＩＥＸ）を利用し、毛細管電気泳動を行い、Ｆｃ変異体のＦｃ異種二量体形成の比率を検証し、その結果を下記表３に示した。
【0085】
【表3】
【0086】
図２は、Ｆｃ変異体のＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ＳＤＳ）分析結果を示したグラフである。
その結果、図２に示されているように、滞留時間の２３分ごろ、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）のＦｃ－２－２同種二量体形成率は、３４．４４％を示し、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）のＦｃ－２－２同種二量体形成率が１３．７１％であるということを確認することができた。なお、ＰＣＴ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４の場合、Ｆｃ－２－２同種二量体が形成されておらず、ＰＣＴ１１１の場合、０．５７％であり、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と陽性対照群（ＰＣＴ０１９）とを比較し、顕著に低い比率に形成されるということを確認することができた。
その結果、図２に示されているように、滞留時間の２３分ごろ、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）のＦｃ－２－２同種二量体形成率は、３４．４４％を示し、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）のＦｃ－２－２同種二量体形成率が１３．７１％であるということを確認することができた。なお、ＰＣＴ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４の場合、Ｆｃ－２－２同種二量体が形成されておらず、ＰＣＴ１１１の場合、０．５７％であり、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と陽性対照群（ＰＣＴ０１９）とを比較し、顕著に低い比率に形成されるということを確認することができた。
【0087】
また、表２に示されているように、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１の異種二量体形成率は、それぞれ８１．０％、８０．２％、８３．８％及び８４．８％であり、陰性対照群（ＰＣＴＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、有意的に高いということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、異種二量体形成能にすぐれているということが分かる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、異種二量体形成能にすぐれているということが分かる。
【0088】
３－３．ＳＥ－ＨＰＬＣ分析
前記実施例２で選別された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体形成能を検証するために、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を行い、その結果を下記表４に示した。
前記実施例２で選別された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体形成能を検証するために、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ－ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を行い、その結果を下記表４に示した。
【0089】
【表4】
【0090】
図３Ａないし図３Ｆは、それぞれＰＴＣＷＴ、ＰＴＣ０１９、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１のサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）分析結果を示したグラフである。
その結果、図３Ａないし図３Ｆに示されているように、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで精製されたタンパク質のＳＥ－ＨＰＬＣ分析において、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）を含むＦＣ変異体は、滞留時間１６．９８９分ないし１７．１９７分において、異種二量体の主ピーク（ｍａｉｎ ｐｅａｋ）が観察された。具体的には、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）の場合、滞留時間１６．０７９分において、Ｆｃ－１－１同種二量体ピークが観察され、１８．３７７分において、Ｆｃ２－２同種二量体ピークが観察された（図３Ａ）。また、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）の場合、滞留時間１８．３４３分において、Ｆｃ－２－２同種二量体ピークが観察され、１９．１４分において、Ｆｃ－２単量体ピークが観察された（図３Ｂ）。すなわち、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＣＴ０１９）の場合、Ｆｃ１－２異種二量体を含む多重ピーク（ｍｕｌｔｉ ｐｅａｋ）を示し、異種二量体形成率が低いということを確認することができた、なお、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１のＦｃ変異体の場合、主ピークが単一ピークの形態に観察された。すなわち、選別されたＦｃ変異体の場合、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、異種二量体の形成率にすぐれているということを確認することができた。
その結果、図３Ａないし図３Ｆに示されているように、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで精製されたタンパク質のＳＥ－ＨＰＬＣ分析において、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）を含むＦＣ変異体は、滞留時間１６．９８９分ないし１７．１９７分において、異種二量体の主ピーク（ｍａｉｎ ｐｅａｋ）が観察された。具体的には、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）の場合、滞留時間１６．０７９分において、Ｆｃ－１－１同種二量体ピークが観察され、１８．３７７分において、Ｆｃ２－２同種二量体ピークが観察された（図３Ａ）。また、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）の場合、滞留時間１８．３４３分において、Ｆｃ－２－２同種二量体ピークが観察され、１９．１４分において、Ｆｃ－２単量体ピークが観察された（図３Ｂ）。すなわち、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＣＴ０１９）の場合、Ｆｃ１－２異種二量体を含む多重ピーク（ｍｕｌｔｉ ｐｅａｋ）を示し、異種二量体形成率が低いということを確認することができた、なお、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１のＦｃ変異体の場合、主ピークが単一ピークの形態に観察された。すなわち、選別されたＦｃ変異体の場合、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、異種二量体の形成率にすぐれているということを確認することができた。
【0091】
また、表４に示されているように、選別されたＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１のＦｃ変異体は、異種二量体形成能が、ＰＴＣＷＴとＰＴＣ０１９との２つの対照群に比べ、すぐれているということを確認することができた。
従って、一態様によるＦＣ変異体は、異種二量体を高効率で形成することができ、二重特異抗体を容易に製造することができる。
従って、一態様によるＦＣ変異体は、異種二量体を高効率で形成することができ、二重特異抗体を容易に製造することができる。
【0092】
実施例４．高効率Ｆｃ変異体異種二量体の熱力学的安定性評価
前記実施例３で確認された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体構造安定性を間接的に確認するために、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）を利用した熱力学的安定性評価を行った。
具体的には、Ｎａｎｏ ＤＳＣTM（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し、選別されたＦｃ変異体の熱的安定性を測定し、融点（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃））を算出した。算出されたＦｃ変異体の融点を下記表５に示した。
前記実施例３で確認された高効率Ｆｃ変異体の異種二量体構造安定性を間接的に確認するために、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）を利用した熱力学的安定性評価を行った。
具体的には、Ｎａｎｏ ＤＳＣTM（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し、選別されたＦｃ変異体の熱的安定性を測定し、融点（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃））を算出した。算出されたＦｃ変異体の融点を下記表５に示した。
【0093】
【表5】
【0094】
その結果、表５に示されているように、選別されたＦｃ変異体であるＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１は、野生型Ｆｃ異種二量体（ＰＴＣＷＴ）と比較し、熱的安定性が若干不安定であったが、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社のＫｉＨ Ｆｃ異種二量体（ＰＴＣ０１９）と比較し、比較的高い熱力学的安定性を有するということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、異種二量体形成能にすぐれているだけではなく、熱力学的安定性にすぐれており、安定した二重特異抗体の形成が可能である。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、異種二量体形成能にすぐれているだけではなく、熱力学的安定性にすぐれており、安定した二重特異抗体の形成が可能である。
【0095】
実施例５．高効率Ｆｃ変異体のＣＨ３ドメインにおける逆配列置換変異体の異種二量体形成能比較
前記実施例３で選別された高効率Ｆｃ変異体のＣＨ３ドメインにおける逆配列置換変異体の異種二量体形成能を評価するために、前記実施例２と同一方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表６に示した。
前記実施例３で選別された高効率Ｆｃ変異体のＣＨ３ドメインにおける逆配列置換変異体の異種二量体形成能を評価するために、前記実施例２と同一方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表６に示した。
【0096】
【表6】
【0097】
図４は、逆配列置換Ｆｃ変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＰＴＣＷＴ（陰性対照群）、０１９：ＰＴＣ０１９（陽性対照群）、０８８：ＰＴＣ０８８、０８９：ＰＴＣ０８９、０９０：ＰＴＣ０９０）。
その結果、図４に示されているように、逆配列置換Ｆｃ変異体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と比較し、１５０ｋＤａ近辺でバンドが形成されておらず、４９．２ｋＤａにおいて、バンドが弱く形成されるということを確認することができた。すなわち、逆配列置換Ｆｃ変異体は、Ｆｃ－１－１同種二量体が形成されず、Ｆｃ－２－２同種二量体形成が低減されたということを確認することができた。また、陽性対照群（ＰＣＴ０１９）と比較し、２５ｋＤａ近辺において、バンドが弱く形成されることを確認することができた。すなわち、逆配列置換Ｆｃ変異体は、Ｆｃ－２単量体の形成が低減され、それは、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０及びＰＴＣ０７４と類似した異種二量体形成率を示すということを知ることができる（図１参照）。
その結果、図４に示されているように、逆配列置換Ｆｃ変異体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と比較し、１５０ｋＤａ近辺でバンドが形成されておらず、４９．２ｋＤａにおいて、バンドが弱く形成されるということを確認することができた。すなわち、逆配列置換Ｆｃ変異体は、Ｆｃ－１－１同種二量体が形成されず、Ｆｃ－２－２同種二量体形成が低減されたということを確認することができた。また、陽性対照群（ＰＣＴ０１９）と比較し、２５ｋＤａ近辺において、バンドが弱く形成されることを確認することができた。すなわち、逆配列置換Ｆｃ変異体は、Ｆｃ－２単量体の形成が低減され、それは、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０及びＰＴＣ０７４と類似した異種二量体形成率を示すということを知ることができる（図１参照）。
【0098】
また、表６に示されているように、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）の異種二量体形成率が、それぞれ４０．９％及び６４．７％を示す一方、ＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０及びＰＴＣ０７４の逆配列置換Ｆｃ変異体であるＰＴＣ０８８、ＰＴＣ０８９及びＰＴＣ０９０は、それぞれ７２．１％、８３．３％及び９２．１％の異種二量体形成率を示すということを確認することができた。
従って、一態様によるＦｃ変異体の逆配列置換変異体は、置換前後において、類似した比率でもって、異種二量体を形成するということを知ることができる。また、Ｆｃ変異体の逆配列置換変異体は、異種二量体形成率にすぐれているので、Ｆｃ１またはＦｃ２に挿入される配列の置換いかんにかかわらず、Ｆｃ変異体を高効率で形成することができる。
従って、一態様によるＦｃ変異体の逆配列置換変異体は、置換前後において、類似した比率でもって、異種二量体を形成するということを知ることができる。また、Ｆｃ変異体の逆配列置換変異体は、異種二量体形成率にすぐれているので、Ｆｃ１またはＦｃ２に挿入される配列の置換いかんにかかわらず、Ｆｃ変異体を高効率で形成することができる。
【0099】
実施例６．ＣＨ３ドメインの３５１位置配列変更Ｆｃ変異体の異種二量体形成能比較
前記実施例３で選別された高効率ＦＣ変異体であるＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１と共に、ＣＨ３ドメインの３５１番位置が、類似性質のアミノ酸に置換された変異体の異種二量体形成能を評価するために、前記実施例２と同一方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
該ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表７に示した。
前記実施例３で選別された高効率ＦＣ変異体であるＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１と共に、ＣＨ３ドメインの３５１番位置が、類似性質のアミノ酸に置換された変異体の異種二量体形成能を評価するために、前記実施例２と同一方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
該ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表７に示した。
【0100】
【表7】
【0101】
図５は、一部配列置換Ｆｃ変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＰＴＣＷＴ（陰性対照群）、０１９：ＰＴＣ０１９（陽性対照群）、０７４：ＰＴＣ０７４、０９７：ＰＴＣ０９７、０９８：ＰＴＣ０９８、０９９：ＰＴＣ０９９）。１１１：ＰＴＣ１１１、１１３：ＰＴＣ１１３）。
その結果、図５に示されているように、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１の場合、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と比較し、１５０ｋＤａ近辺において、バンドが形成されておらず、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）と比較し、４９．２ｋＤａ及び２４．６ｋＤａのバンドの強度が顕著に低減されたことを確認することができた。また、Ｆｃ－２ ３５１位置に、配列が置換されたＰＴＣ０９７、ＰＴＣ０９８及びＰＴＣ０９９と比較し、２４．６ｋＤａにおいて、バンドの強度が顕著に低減されたことを確認することができた。一方、Ｆｃ－１－２異種二量体の予想分子量である９８ｋＤａにおいて、バンドの強度が増大したことを確認することができた。
その結果、図５に示されているように、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１の場合、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と比較し、１５０ｋＤａ近辺において、バンドが形成されておらず、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）と比較し、４９．２ｋＤａ及び２４．６ｋＤａのバンドの強度が顕著に低減されたことを確認することができた。また、Ｆｃ－２ ３５１位置に、配列が置換されたＰＴＣ０９７、ＰＴＣ０９８及びＰＴＣ０９９と比較し、２４．６ｋＤａにおいて、バンドの強度が顕著に低減されたことを確認することができた。一方、Ｆｃ－１－２異種二量体の予想分子量である９８ｋＤａにおいて、バンドの強度が増大したことを確認することができた。
【0102】
また、表７に示されているように、ＰＴＣ０７４、ＰＴＣ０９７、ＰＴＣ０９９及びＰＴＣ０１１１の異種二量体形成率は、それぞれ９３．５％、８２．７％、８６．５％及び９２．７％を示し、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、有意的に高いということを確認することができた。特に、ＣＨ３ドメインの３５１番位置を、グリシン（Ｇ）またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換したＰＴＣ０７４とＰＴＣ１１１との場合、Ｆｃ異種二量体の形成率が９０％を超えることを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、ＣＨ３ドメインの３５１番位置を、特定アミノ酸で置換することにより、すぐれたＦｃ異種二量体形成能を有することが知ることができる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、ＣＨ３ドメインの３５１番位置を、特定アミノ酸で置換することにより、すぐれたＦｃ異種二量体形成能を有することが知ることができる。
【0103】
実施例７．高効率Ｆｃ変異体を含む二重特異抗体の異種二量体形成能評価
７－１．Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異抗体
前記実施例３で選別された高効率Ｆｃ変異体を含む異種二重抗体の異種二量体形成収率を評価するために、第１ポリペプチドは、重鎖と軽鎖とがいずれも連結された完全な形態のＩｇＧ鎖（Ｆｃ１）を発現するように設計し、第２ポリペプチドは、ｓｃＦＶ－Ｆｃ形態（Ｆｃ２）を発現するように設計した。その後、Ｆｃ１は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むアベルマブ抗体（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｐｆｉｚｅｒ）を基に発現が進められ、Ｆｃ２は、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列を基とするＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むｓｃＦｖ形態に発現が進められた。
７－１．Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異抗体
前記実施例３で選別された高効率Ｆｃ変異体を含む異種二重抗体の異種二量体形成収率を評価するために、第１ポリペプチドは、重鎖と軽鎖とがいずれも連結された完全な形態のＩｇＧ鎖（Ｆｃ１）を発現するように設計し、第２ポリペプチドは、ｓｃＦＶ－Ｆｃ形態（Ｆｃ２）を発現するように設計した。その後、Ｆｃ１は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むアベルマブ抗体（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｐｆｉｚｅｒ）を基に発現が進められ、Ｆｃ２は、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列を基とするＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むｓｃＦｖ形態に発現が進められた。
【0104】
比較のために、野生型ＣＨ３ドメイン配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣＷＴ」に対応する）のＦｃ２に、ブリナツモマブの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを結合したＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体を陰性対照群にし、ＣＨ３ドメインに、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣ０１９」に対応する）のＦｃ２に、ブリナツモマブの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを結合したＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体を陽性対照群として利用した。
【0105】
前記実施例１で構築された一時的発現系を利用し、各試験物質の発現を進め、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、異種二量体に該当するＰＡＧＥバンドの強度を測定し、異種二量体形成収率を比較した。
測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表８に示した。
測定されたバンドの強度を介し、ＣＨ３ドメインのアミノ酸置換によるＦｃ異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表８に示した。
【0106】
【表8】
【0107】
図６は、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣＷＴ配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陰性対照群）、０１９：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０１９配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陽性対照群）、０７４：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体）。
その結果、図６に示されているように、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）の配列が適用された異種二重抗体と比較し、１４４ｋＤａにおいて、バンドが形成されないことを確認することができた。また、ＰＴＣ０１９配列が適用された異種二重抗体と比較し、１０４．８ｋＤａにおいて、バンドの強度が低減されることを確認することができた。一方、完全なＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体の予想分子量である１２４．４ｋＤａにおいては、陰性対照群（ＰＣＴＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、バンドの強度が増大したことを確認することができた。
その結果、図６に示されているように、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）の配列が適用された異種二重抗体と比較し、１４４ｋＤａにおいて、バンドが形成されないことを確認することができた。また、ＰＴＣ０１９配列が適用された異種二重抗体と比較し、１０４．８ｋＤａにおいて、バンドの強度が低減されることを確認することができた。一方、完全なＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体の予想分子量である１２４．４ｋＤａにおいては、陰性対照群（ＰＣＴＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、バンドの強度が増大したことを確認することができた。
【0108】
また、表８に示されているように、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体のＣＨ３ドメイン配列がＰＴＣ０７４である異種二重抗体のＦｃ１－２異種二量体形成率は、８８．８％であり、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、異種二量体形成率が有意に高いということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、互いに異なる構造の抗体を形成する異種二重抗体構造に適用が可能であり、すぐれた異種二量体形成能を有するということを知ることができる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、互いに異なる構造の抗体を形成する異種二重抗体構造に適用が可能であり、すぐれた異種二量体形成能を有するということを知ることができる。
【0109】
７－２．Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異抗体
第２ポリペプチドが、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ形態（Ｆｃ２）に発現するように設計されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異抗体を使用し、Ｆｃ２は、ブリナツモマブの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列と、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）のＶＨ－ＶＬ配列を基とするＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む二重ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ × ｓｃＦｖ）形態に発現が進められたという点を除いては、前記実施例７－１と同一方法により、異種二量体形成収率を評価した。
第２ポリペプチドが、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ形態（Ｆｃ２）に発現するように設計されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異抗体を使用し、Ｆｃ２は、ブリナツモマブの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列と、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）のＶＨ－ＶＬ配列を基とするＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む二重ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ × ｓｃＦｖ）形態に発現が進められたという点を除いては、前記実施例７－１と同一方法により、異種二量体形成収率を評価した。
【0110】
比較のために、野生型ＣＨ３ドメイン配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣＷＴ」に対応する）のＦｃ２に、二重ｓｃＦｖを結合させたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体を陰性対照群にし、ＣＨ３ドメインに、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣ０１９」に対応する）のＦｃ２に、二重ｓｃＦｖを結合させたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体を陽性対照群として利用した。
【0111】
【表9】
【0112】
図７は、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣＷＴ配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陰性対照群）、０１９：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０１９配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体（陽性対照群）、０７４：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体）。
その結果、図７に示されているように、ＰＴＣ０７４配列を適用したＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖｘｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）配列及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）配列が適用された重合体を比較し、１９６ｋＤａバンドの強度が顕著に低減されたことを確認することができた。また、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）配列が適用された二重複合体で示される異種二量体以外のバンド強度が低減されたが、目標とする１６７．８ｋＤａのＦｃ１－２異種二量体が高効率に形成されたことを確認することができた。
その結果、図７に示されているように、ＰＴＣ０７４配列を適用したＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖｘｓｃＦｖ－Ｆｃ二重複合体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）配列及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）配列が適用された重合体を比較し、１９６ｋＤａバンドの強度が顕著に低減されたことを確認することができた。また、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）配列が適用された二重複合体で示される異種二量体以外のバンド強度が低減されたが、目標とする１６７．８ｋＤａのＦｃ１－２異種二量体が高効率に形成されたことを確認することができた。
【0113】
また、表９に示されているように、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体のＣＨ３ドメイン配列がＰＴＣ０７４である異種二重抗体のＦｃ１－２異種二量体形成率は、７０．２％であり、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）と陽性対照群（ＰＴＣ０１９）とを比較し、異種二量体形成率が有意に高いということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、いくつかの構造が連結され、分子量が大きい構造の異種二重抗体構造に適用が容易であるだけではなく、前記構造に適用するとき、異種二量体形成にすぐれているということが分かる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、いくつかの構造が連結され、分子量が大きい構造の異種二重抗体構造に適用が容易であるだけではなく、前記構造に適用するとき、異種二量体形成にすぐれているということが分かる。
【0114】
７－３．Ｆａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重特異抗体
第２ポリペプチドがサイトカイン－Ｆｃ形態（Ｆｃ２）を発現するように設計されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重特異抗体を使用し、Ｆｃ２は、インターロイキン－２（ＩＬ－２（アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎｅ））配列を基とするＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むサイトカイン形態に発現が進められたという点を除いては、前記実施例７－１と同一方法により、異種二量体形成収率を評価した。
第２ポリペプチドがサイトカイン－Ｆｃ形態（Ｆｃ２）を発現するように設計されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重特異抗体を使用し、Ｆｃ２は、インターロイキン－２（ＩＬ－２（アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎｅ））配列を基とするＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むサイトカイン形態に発現が進められたという点を除いては、前記実施例７－１と同一方法により、異種二量体形成収率を評価した。
【0115】
比較のために、野生型ＣＨ３ドメイン配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣＷＴ」に対応する）のＦｃ２に、ＩＬ－２変異体（ＩＬ－２ｖ）を結合したＦａｂ－Ｆｃ×ＩＬ－２ｖ－Ｆｃ異種二重抗体を陰性対照群にし、ＣＨ３ドメインに、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣ０１９」に対応する）のＦｃ２に、ＩＬ－２変異体（ＩＬ－２ｖ）を結合したＦａｂ－Ｆｃ×ＩＬ－２ｖ－Ｆｃ異種二重抗体を陽性対照群として利用した。
【0116】
【表10】
【0117】
図８は、Ｆａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示したイメージである（Ｍ：サイズマーカー、ＷＴ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣＷＴ配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体（陰性対照群）、０１９：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０１９配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体（陽性対照群）、０７４：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列が適用されたＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体）。
その結果、図８に示されているように、ＰＴＣ０７４配列及びＰＴＣ１１１配列を適用したＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）または陽性対照群（ＰＴＣ０１９）と比較し、９４．４ｋＤａ（Ｆｃ－２－２同種二量体）及び７７．４ｋＤａ（Ｆｃ１単量体）において、バンドの強度が低減され、１３６．５ｋＤａ（Ｆｃ－１－２異種二量体）において、バンドの強度が増大されたことを確認することができた。従って、ＰＴＣ０７４配列及びＰＴＣ１１１配列を適用したＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体は、Ｆｃ－２－２同種二量体バンド及びＦｃ－１単量体の形成が低減されることにより、Ｆｃ－１－２異種二量体が高効率に形成されたことが分かる。
その結果、図８に示されているように、ＰＴＣ０７４配列及びＰＴＣ１１１配列を適用したＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体は、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）または陽性対照群（ＰＴＣ０１９）と比較し、９４．４ｋＤａ（Ｆｃ－２－２同種二量体）及び７７．４ｋＤａ（Ｆｃ１単量体）において、バンドの強度が低減され、１３６．５ｋＤａ（Ｆｃ－１－２異種二量体）において、バンドの強度が増大されたことを確認することができた。従って、ＰＴＣ０７４配列及びＰＴＣ１１１配列を適用したＦａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体は、Ｆｃ－２－２同種二量体バンド及びＦｃ－１単量体の形成が低減されることにより、Ｆｃ－１－２異種二量体が高効率に形成されたことが分かる。
【0118】
また、表１０に示されているように、Ｆａｂ－Ｆｃ ×サイトカイン－Ｆｃ二重複合体に、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）、ＰＴＣ０７４及びＰＴＣ１１１の配列が反映された構造により、Ｆｃ－１－２異種二量体の比率が、それぞれ４０．６％、６８．８％、９０．４％及び８９．９％と、ＰＴＣ０７４、ＰＴＣ１１１が反映された二重複合体が、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）、陽性対照群（ＰＴＣ０１９）と比較し、異種二量体の形成率が有意に高いということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、抗体を形成する構造に適用するだけではなく、サイトカインタンパク質を適用する場合、異種二量体形成能にすぐれているということが分かる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、抗体を形成する構造に適用するだけではなく、サイトカインタンパク質を適用する場合、異種二量体形成能にすぐれているということが分かる。
【0119】
７－４．Ｆａｂ－Ｆｃ×Ｆａｂ－Ｆｃ二重特異抗体
前記実施例３で選別された高効率Ｆｃ変異体を含む異種二重抗体の異種二量体形成収率を評価するために、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとのいずれも、重鎖と軽鎖とがいずれも連結された完全な形態の二重特異抗体を発現するように設計した。具体的には、Ｆｃ１は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むアベルマブ抗体（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｐｆｉｚｅｒ）を基に、発現が進められ、Ｆｃ２は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むベバシズマブ抗体（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）を基に、発現が進められた。
前記実施例３で選別された高効率Ｆｃ変異体を含む異種二重抗体の異種二量体形成収率を評価するために、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとのいずれも、重鎖と軽鎖とがいずれも連結された完全な形態の二重特異抗体を発現するように設計した。具体的には、Ｆｃ１は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むアベルマブ抗体（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｐｆｉｚｅｒ）を基に、発現が進められ、Ｆｃ２は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むベバシズマブ抗体（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）を基に、発現が進められた。
【0120】
比較のために、野生型ＣＨ３ドメイン配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣＷＴ」に対応する）を含むＦａｂ－Ｆｃ×Ｆａｂ－Ｆｃ異種二重抗体を陰性対照群にし、ＣＨ３ドメインに、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）配列を有するＦｃ変異体（表１の「ＰＴＣ０１９」に対応する）を含むＦａｂ－Ｆｃ×Ｆａｂ－Ｆｃ異種二重抗体を陽性対照群として利用した。
【0121】
評価方法としては、Ｉｎｔａｃｔ ＭＡＳＳ（ＥＳＩ－ＬＣ－ＭＳ）分析方法が使用された。具体的には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＤｉｏｎｅｘTM ＵＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００とＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００＋（ＡＢ ｓｃｉｅｘ）とを利用し、ＬＣ－ＭＳを進め、分析プログラムは、Ａｎａｌｙｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）、ＰｅａｋＶｉｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）を利用し、異種二量体形成能を算出し、その結果を下記表１１に示した。
【0122】
【表11】
【0123】
表１１に示されているように、陰性対照群（ＰＴＣＷＴ）及び陽性対照群（ＰＴＣ０１９）の配列を適用したＦａｂ－Ｆｃ×Ｆａｂ－Ｆｃ異種二重抗体のＦｃ－１－２異種二量体形成率は、それぞれ２５．４％及び３２．４％である一方、ＣＨ３ドメイン配列がＰＴＣ０３９、ＰＴＣ０４０及びＰＴＣ０７４である異種二重抗体のＦｃ－１－２異種二量体形成率は、それぞれ５８．１％、４０．５％、４６．８％であるということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、二重特異抗体への適用が容易であるだけではなく、前記構造への適用時、異種二量体形成にすぐれているということが分かる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体は、二重特異抗体への適用が容易であるだけではなく、前記構造への適用時、異種二量体形成にすぐれているということが分かる。
【0124】
実施例８．高効率Ｆｃ変異体を含むＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ二重特異抗体の抗癌活性評価
８－１．癌細胞死滅及び癌成長抑制の確認
前記実施例７－１で製造した抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体の癌細胞死滅及び癌成長抑制能力を評価した。
８－１．癌細胞死滅及び癌成長抑制の確認
前記実施例７－１で製造した抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体の癌細胞死滅及び癌成長抑制能力を評価した。
【0125】
具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地（＃１１８７５－０９３、Ｇｉｂｃｏ）に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと１％（ｖ／ｖ）ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した後、３７℃、５％ ＣＯ２条件において、乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を培養した。その後、前記細胞を１０，０００細胞／ウェルの濃度でもって、９６ウェルプレートに分注した後、３７℃、５％ ＣＯ2条件で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養し、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）（エフェクタ細胞）を、２０：１（エフェクタ細胞：ターゲット（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）細胞）の比率で分注し、共培養した。その後、前記細胞に、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体をウェルに処理した後、４８時間培養した。その後、上澄み液を回収した後、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（＃Ｃ２０３０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、下記数式１によって細胞毒性を分析した。陽性対照群においては、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体、Ｂａｖｅｎｃｉｏ）を使用した。
【0126】
【数1】
【0127】
【表12】
【0128】
図９は、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体のイン・ビトロ癌細胞死滅誘導能を評価したグラフである（アベルマブ：陽性対照群、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ ＢｓＡｂ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列を保有している抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体）。
その結果、図９に示されているように、陽性対照群のＥmax（最大細胞毒性効果）は、物質最大濃度において２６％である一方，Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体のＥmaxは、７６．３％であり、癌細胞に対する細胞毒性効果が顕著に高いということを確認することができた。また、陽性対照群は、物質濃度２log（ｎｇ／ｍＬ）以上において、細胞溶解が増大せずに飽和され、０log～２log（ｎｇ／ｍＬ）区間において、有効量が形成されるということを確認することができた。一方、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、物質濃度１log（ｎｇ／ｍＬ）以上において、細胞溶解が増大せずに飽和され、－１log～１log（ｎｇ／ｍＬ）において、有効量が形成されるということを確認することができた。
その結果、図９に示されているように、陽性対照群のＥmax（最大細胞毒性効果）は、物質最大濃度において２６％である一方，Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体のＥmaxは、７６．３％であり、癌細胞に対する細胞毒性効果が顕著に高いということを確認することができた。また、陽性対照群は、物質濃度２log（ｎｇ／ｍＬ）以上において、細胞溶解が増大せずに飽和され、０log～２log（ｎｇ／ｍＬ）区間において、有効量が形成されるということを確認することができた。一方、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、物質濃度１log（ｎｇ／ｍＬ）以上において、細胞溶解が増大せずに飽和され、－１log～１log（ｎｇ／ｍＬ）において、有効量が形成されるということを確認することができた。
【0129】
また、表１２に示されているように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に対する増殖抑制効果が、陽性対照群の場合、１１．８ｎｇ／ｍＬＥＣ50である一方、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｃ－Ｆｃ異種二重抗体は、１．３ｎｇ／ｍＬＥＣ50と、癌細胞増殖抑制にさらに効果的であるということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体によって形成されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、公知された免疫抗癌剤と比較し、低い濃度において、すぐれた抗癌効果を示すが、正常細胞破壊や耐性のような既存治療剤の副作用を代替することができる。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体によって形成されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、公知された免疫抗癌剤と比較し、低い濃度において、すぐれた抗癌効果を示すが、正常細胞破壊や耐性のような既存治療剤の副作用を代替することができる。
【0130】
８－２．抗癌効能の確認
ヒト化されたマウス異種移植モデル（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）を使用し、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体のイン・ビボ抗癌効能を評価した。具体的には、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（５×１０6）と、精製されたヒトＴ細胞（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ）（２．５×１０6）との混合物を、同一量のマトリゲルと混合し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（メス、６週齢、ＪＡ ＢＩＯ）の脇腹に、０．２ｍＬ／マウスの容量で皮下投与した。接種一時間後、前記実施例７－１で製造した抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体２．５ｍｇ／ｋｇを静脈投与（５回／株）した。陽性対照物質であるアベルマブは、２０ｍｇ／ｋｇで静脈投与（３回／株）した。接種７日後から、腫瘍体積を測定（３回／週）し、２つの物質の抗癌効能を比較評価した。
ヒト化されたマウス異種移植モデル（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）を使用し、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体のイン・ビボ抗癌効能を評価した。具体的には、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（５×１０6）と、精製されたヒトＴ細胞（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ）（２．５×１０6）との混合物を、同一量のマトリゲルと混合し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（メス、６週齢、ＪＡ ＢＩＯ）の脇腹に、０．２ｍＬ／マウスの容量で皮下投与した。接種一時間後、前記実施例７－１で製造した抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体２．５ｍｇ／ｋｇを静脈投与（５回／株）した。陽性対照物質であるアベルマブは、２０ｍｇ／ｋｇで静脈投与（３回／株）した。接種７日後から、腫瘍体積を測定（３回／週）し、２つの物質の抗癌効能を比較評価した。
【0131】
図１０は、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体のイン・ビボ癌成長抑制効能を評価したグラフである（アベルマブ：陽性対照群、抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃ ＦｖＢｓＡｂ：ＣＨ３ドメインに、ＰＴＣ０７４配列を保有している抗ＰＤ－Ｌ１×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ二重特異抗体）。
その結果、図１０に示されているように、陰性対照群の場合、平均腫瘍体積が６００ｍｍ3以上になるまで、２８日間漸進的に増大し、腫瘍成長抑制効果がないということを確認することができた。また、陽性対照群の場合、腫瘍体積が持続的に増大し、２８日目、腫瘍成長抑制効果が５９％と示されることを確認することができた。一方、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃの場合、９日目から２１日目まで、同一腫瘍成長抑制回帰（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を維持し、２８日目、腫瘍成長抑制効果が８０％と、ヒト化されたマウス異種移植モデルにおいて、効果的に腫瘍成長を抑制するということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体によって形成されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、腫瘍成長抑制効果にすぐれるが、乳癌を含む多様な癌の予防または治療に利用されうる。
その結果、図１０に示されているように、陰性対照群の場合、平均腫瘍体積が６００ｍｍ3以上になるまで、２８日間漸進的に増大し、腫瘍成長抑制効果がないということを確認することができた。また、陽性対照群の場合、腫瘍体積が持続的に増大し、２８日目、腫瘍成長抑制効果が５９％と示されることを確認することができた。一方、Ｆａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃの場合、９日目から２１日目まで、同一腫瘍成長抑制回帰（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を維持し、２８日目、腫瘍成長抑制効果が８０％と、ヒト化されたマウス異種移植モデルにおいて、効果的に腫瘍成長を抑制するということを確認することができた。
すなわち、一態様によるＦｃ変異体によって形成されたＦａｂ－Ｆｃ × ｓｃＦｖ－Ｆｃ異種二重抗体は、腫瘍成長抑制効果にすぐれるが、乳癌を含む多様な癌の予防または治療に利用されうる。
【0132】
前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明の技術的思想や、必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述された実施例は、全ての面において、例示的なものであり、限定的ではないと理解されなければならない。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】