▶ オハイオ ステート イノベーション ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123088
(43)【公開日】2024-09-10
(54)【発明の名称】腫瘍溶解性ウイルスによるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの発現
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20240903BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20240903BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20240903BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
A61K38/46
A61K35/763
A61P35/00
C12N7/01
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024096293
(22)【出願日】2024-06-13
(62)【分割の表示】P 2022129037の分割
【原出願日】2017-07-31
(31)【優先権主張番号】62/368,822
(32)【優先日】2016-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/479,671
(32)【優先日】2017-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】516046846
【氏名又は名称】オハイオ ステート イノベーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】カウアー バルヴィーン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】組換えＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを含む新規改変ウイルス及びそのウイルスを癌の治療に用いる方法を提供する。
【解決手段】哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスであって、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は組織特異的プロモーターに作動可能に結合されており、腫瘍細胞を標的とするように改変されているか、又は腫瘍特異的プロモーターの制御下でウイルス複製に重要な遺伝子を配置するように改変されている、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む、組換えウイルスを提供する。
【選択図】図５Ａ
【解決手段】哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスであって、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は組織特異的プロモーターに作動可能に結合されており、腫瘍細胞を標的とするように改変されているか、又は腫瘍特異的プロモーターの制御下でウイルス複製に重要な遺伝子を配置するように改変されている、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む、組換えウイルスを提供する。
【選択図】図５Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む、組換えウイルス。
【請求項2】
前記ウイルスは、腫瘍細胞を標的とするように改変されている、請求項１に記載の組換
えウイルス。
えウイルス。
【請求項3】
前記ウイルスは、腫瘍特異的プロモーターの制御下で、ウイルス複製に重要な遺伝子を
配置するように改変されている、請求項１に記載の組換えウイルス。
配置するように改変されている、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項4】
前記組換えウイルスは、単純ヘルペスウイルス－１バックボーンを含む、請求項１に記
載の組換えウイルス。
載の組換えウイルス。
【請求項5】
前記ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、組織特異的プロモーターに作動可能に結合されてい
る、請求項１に記載の組換えウイルス。
る、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項6】
前記ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に結合されている、
請求項１に記載の組換えウイルス。
請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項7】
前記ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、構成的プロモーターに作動可能に結合されている、
請求項１に記載の組換えウイルス。
請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項8】
被験体において癌を治療する方法であって、請求項１に記載の前記ウイルスを前記被験
体に投与することを含む、方法。
体に投与することを含む、方法。
【請求項9】
請求項１に記載の前記ウイルスを前記被験体に投与することを含む、癌細胞においてＰ
Ｄ－Ｌ１を阻害する方法。
Ｄ－Ｌ１を阻害する方法。
【請求項10】
被験体における癌の部位で浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞の数を増加させる方法であって、請求項
１に記載の前記ウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
１に記載の前記ウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項11】
被験体における癌の部位で浸潤ナチュラルキラー細胞の数を増加させる方法であって、
請求項１に記載の前記ウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
請求項１に記載の前記ウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項12】
被験体における癌の転移を阻害する方法であって、請求項１に記載の前記ウイルスを前
記被験体に投与することを含む、方法。
記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項13】
被験体における癌を治療する方法であって、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む
組換えウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
組換えウイルスを前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項14】
前記ウイルスは、腫瘍細胞を標的とするように改変されている、請求項１３に記載の方
法。
法。
【請求項15】
前記組換えウイルスは、単純ヘルペスウイルス－１バックボーンを含む、請求項１３に
記載の方法。
記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
（政府支援の陳述）
この研究は、国立衛生研究所により授与されたＮＩＨ １Ｒ０１ＮＳ０６４６０７及び
ＮＩＨ Ｐ０１ ＣＡ１６３２０５により支援された。政府は、本発明において、ある特
定の権利を有する。
この研究は、国立衛生研究所により授与されたＮＩＨ １Ｒ０１ＮＳ０６４６０７及び
ＮＩＨ Ｐ０１ ＣＡ１６３２０５により支援された。政府は、本発明において、ある特
定の権利を有する。
【0002】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１６年７月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／３６８，８２２号
、及び２０１７年３月３１日に出願された米国特許仮出願第６２／４７９，６７１号の利
益を主張するものであり、これらのそれぞれは、その全体が参照により明示的に本明細書
に組み込まれる。
本願は、２０１６年７月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／３６８，８２２号
、及び２０１７年３月３１日に出願された米国特許仮出願第６２／４７９，６７１号の利
益を主張するものであり、これらのそれぞれは、その全体が参照により明示的に本明細書
に組み込まれる。
【0003】
［背景技術］
膠芽腫（ＧＢＭ）は、患者生存率が劣悪な世界保健機関グレードＩＶの星状細胞腫であ
り、極度の異質性及び侵襲性、並びに放射線及び化学療法薬に対する耐性を特徴とする。
脳転移は、ＧＢＭよりも２～３倍多い頻度であり、乳癌と共に脳転移腫瘍型の上位３種に
挙げられる。現在の標準的治療を受ける患者の平均生存率は、ＧＢＭについては１８月未
満であり、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）については２～２５月である。脳腫瘍及び癌の新規治
療法が一般的に必要とされている。
膠芽腫（ＧＢＭ）は、患者生存率が劣悪な世界保健機関グレードＩＶの星状細胞腫であ
り、極度の異質性及び侵襲性、並びに放射線及び化学療法薬に対する耐性を特徴とする。
脳転移は、ＧＢＭよりも２～３倍多い頻度であり、乳癌と共に脳転移腫瘍型の上位３種に
挙げられる。現在の標準的治療を受ける患者の平均生存率は、ＧＢＭについては１８月未
満であり、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）については２～２５月である。脳腫瘍及び癌の新規治
療法が一般的に必要とされている。
【0004】
膠芽腫（ＧＢＭ）は、患者生存率が劣悪な世界保健機関グレードＩＶの星状細胞腫であ
り、極度の異質性及び侵襲性、並びに放射線及び化学療法薬に対する耐性を特徴とする。
脳転移は、ＧＢＭよりも２～３倍の頻度であり、乳癌と共に脳転移腫瘍型の上位３種に挙
げられる。現在の標準的治療を受ける患者の平均生存率は、ＧＢＭについては１８月未満
であり、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）については２～２５月である。脳腫瘍及び癌の新規治療
法が一般的に必要とされている。
り、極度の異質性及び侵襲性、並びに放射線及び化学療法薬に対する耐性を特徴とする。
脳転移は、ＧＢＭよりも２～３倍の頻度であり、乳癌と共に脳転移腫瘍型の上位３種に挙
げられる。現在の標準的治療を受ける患者の平均生存率は、ＧＢＭについては１８月未満
であり、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）については２～２５月である。脳腫瘍及び癌の新規治療
法が一般的に必要とされている。
【0005】
［発明の概要］
哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を発現する組換えウイルスに関する方法及び組成物
が開示される。
一態様では、任意の先行する態様の組換えウイルスが本明細書で開示され、その組換え
ウイルスは、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えＨＳＶ－１ウイルスである。
哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を発現する組換えウイルスに関する方法及び組成物
が開示される。
一態様では、任意の先行する態様の組換えウイルスが本明細書で開示され、その組換え
ウイルスは、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えＨＳＶ－１ウイルスである。
【0006】
一態様では、任意の先行する態様の組換えウイルスが本明細書で開示され、そのウイル
スは、腫瘍細胞を標的とするように改変されているか、又は腫瘍特異的プロモーターの制
御下で、ウイルス複製に重要な遺伝子を配置するように改変されている。
スは、腫瘍細胞を標的とするように改変されているか、又は腫瘍特異的プロモーターの制
御下で、ウイルス複製に重要な遺伝子を配置するように改変されている。
【0007】
一態様では、任意の先行する態様の組換えウイルスが本明細書で開示され、ここで、Ｐ
ＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター又は構成的プ
ロモーターに作動可能に結合（operatively linked）されている。
ＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター又は構成的プ
ロモーターに作動可能に結合（operatively linked）されている。
【0008】
任意の先行する態様の組換えウイルスを被験体に投与することを含む、癌を治療する方
法もまた本明細書で開示される。
一態様では、任意の先行する態様の組換えウイルスを被験体に投与することを含む、癌
を阻害する方法及び／又は転移を阻害する方法が本明細書で開示される。
法もまた本明細書で開示される。
一態様では、任意の先行する態様の組換えウイルスを被験体に投与することを含む、癌
を阻害する方法及び／又は転移を阻害する方法が本明細書で開示される。
【0009】
任意の先行する態様のウイルスを被験体に投与することを含む、癌細胞においてＰＤ－
Ｌ１を阻害する方法もまた本明細書で開示される。
一態様では、任意の先行する態様のウイルスを被験体に投与することを含む、被験体に
おける癌の部位で浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞の数を増加させる方法が本明細書で開示される。
Ｌ１を阻害する方法もまた本明細書で開示される。
一態様では、任意の先行する態様のウイルスを被験体に投与することを含む、被験体に
おける癌の部位で浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞の数を増加させる方法が本明細書で開示される。
【0010】
任意の先行する態様のウイルスを被験体に投与することを含む、被験体における癌の部
位で浸潤ナチュラルキラー細胞の数を増加させる方法もまた開示される。
本明細書に組み込まれ、また本明細書の一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施
形態を例証し、説明と共に、開示される組成物及び方法を例証する。
位で浸潤ナチュラルキラー細胞の数を増加させる方法もまた開示される。
本明細書に組み込まれ、また本明細書の一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施
形態を例証し、説明と共に、開示される組成物及び方法を例証する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】ＨＳＶＱｕｉｃｋバックボーン内のＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導入遺伝子発現ベクターを示す図である。
【図1B】導入遺伝子発現がＵ８７ΔＥＧＦＲ神経膠腫細胞（ＷＢ）における感染の３時間以内に検出可能であることを示す図である。
【図1C】ＨＳＶＱ対照（ＷＢ）と比較して、ＨＳＶ－Ｐ１０感染が感染ＤＢ７細胞におけるＡｋｔリン酸化に劇的に影響を及ぼすことを示す図である。
【図2】ヒト乳癌脳転移の切片（上、４０倍）及び頭蓋内ＤＢ７を有するＦＶＢ／Ｎマウスの切片（下、２０倍）に由来する、代表的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びにＰＴＥＮ染色を示す図である。
【図3】ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ベクターを含むＨＳＶ（ＨＳＶ－Ｐ１０）が、対照ＨＳＶＱウイルスと同様に、神経膠腫細胞においてインビトロで複製し、広がることができることを示す図である。
【図4A】ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現が複数の細胞株におけるＨＳＶ－Ｐ１０細胞死滅を阻害しないことを示す図である。ＭＴＴアッセイ（ＤＢ７、マウス乳癌、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ヒト乳癌、ＬＮ２２９及びＵ８７ΔＥＧＦＲ、ヒト神経膠腫）の結果を示す図である。
【図4B】ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現が複数の細胞株におけるＨＳＶ－Ｐ１０細胞死滅を阻害しないことを示す図である。ＭＴＴアッセイ（ＤＢ７、マウス乳癌、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ヒト乳癌、ＬＮ２２９及びＵ８７ΔＥＧＦＲ、ヒト神経膠腫）の結果を示す図である。
【図4C】ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現が複数の細胞株におけるＨＳＶ－Ｐ１０細胞死滅を阻害しないことを示す図である。ＭＴＴアッセイ（ＤＢ７、マウス乳癌、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ヒト乳癌、ＬＮ２２９及びＵ８７ΔＥＧＦＲ、ヒト神経膠腫）の結果を示す図である。
【図4D】ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現が複数の細胞株におけるＨＳＶ－Ｐ１０細胞死滅を阻害しないことを示す図である。ＭＴＴアッセイ（ＤＢ７、マウス乳癌、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ヒト乳癌、ＬＮ２２９及びＵ８７ΔＥＧＦＲ、ヒト神経膠腫）の結果を示す図である。
【図5A】ＤＢ７－ｄｓＲｅｄ腫瘍を有するＦＶＢ／Ｎマウスの生存率を示す図である。ウイルスが、腫瘍移植の７日後に腫瘍内に注入されたことを示す図である。
【図5B】ＤＢ７腫瘍を有するヌードマウスの生存率を示す図である。ウイルスが、腫瘍移植の７日後に腫瘍内に注入されたことを示す図である。
【図6A】ウイルス処置後７日目の脳免疫系浸潤を示す図である。マクロファージ（ＣＤ４５ｈｉ）に対するＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋ミクログリア（ＣＤ４５ｌｏ－ｉｎ
ｔ）の比を示す図である。
【図6B】ウイルス処置後７日目の脳免疫系浸潤を示す図である。ＭＨＣ－ＩＩ＋ミクログリア（赤）及びマクロファージ（緑）の百分率を示す図である。
【図6C】ウイルス処置後７日目の脳免疫系浸潤を示す図である。浸潤ＣＤ４９ｂ＋ ＣＤ３３５＋ＮＫ細胞を示す図である。
【図6D】ウイルス処置後７日目の脳免疫系浸潤を示す図である。浸潤細胞毒性ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示す図である。
【図7】感染及び隣接非感染のＤＢ７乳癌細胞２４ｈｐｉの表面上でウイルス誘導性ＰＤ－Ｌ１発現をＨＳＶ－Ｐ１０が阻害することを示す図である。フローサイトメトリーによる測定結果を示す図である。
【図8】ＤＢ７細胞溶解物に対する抗体について分析された、処置後７日目に採取された腫瘍を有するＦＶＢ／Ｎマウスの血清を示す図である。群ごとにｎ＝３である。ＥＬＩＳＡによる測定結果を示す図である。
【図9】ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現組換えウイルス（ＲＡＰＴＯＲとしてもまた既知のＨＳＶ－Ｐ１０など）が癌細胞を攻撃することができる経路の説明を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
図９に示すように、抗腫瘍抗体応答は、増加し、ＡＫＴのリン酸化が減少したため、Ｐ
Ｄ－Ｌ１発現は、減少して、Ｔ細胞増殖及びＮＫ細胞増殖を低減させる抑制シグナルを妨
げる。したがって、ＮＫ細胞及びＴ細胞の浸潤が増加し、抗腫瘍活性を発揮することがで
きる。
Ｄ－Ｌ１発現は、減少して、Ｔ細胞増殖及びＮＫ細胞増殖を低減させる抑制シグナルを妨
げる。したがって、ＮＫ細胞及びＴ細胞の浸潤が増加し、抗腫瘍活性を発揮することがで
きる。
【0013】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法を開示及び説明する前に、特
に指定されない限り、これらが特定の合成法又は特定の組換えバイオテクノロジー方法に
限定されないこと、又は、特に指定されない限り、特定の試薬に限定されず、当然ながら
それ自体が変化してもよいことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定
の実施形態を説明するための目的のものにすぎず、限定することを意図しないことも理解
するべきである。
に指定されない限り、これらが特定の合成法又は特定の組換えバイオテクノロジー方法に
限定されないこと、又は、特に指定されない限り、特定の試薬に限定されず、当然ながら
それ自体が変化してもよいことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定
の実施形態を説明するための目的のものにすぎず、限定することを意図しないことも理解
するべきである。
【0014】
Ａ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」
及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包
含する。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のこのような担体の混
合物などを含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」
及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包
含する。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のこのような担体の混
合物などを含む。
【0015】
範囲は、「約」１つの特定の値から、かつ／又は「約」別の特定の値までとして表され
得る。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値から、かつ／又
は他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似として表さ
れるとき、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲のそれ
ぞれの端点は、他の端点に関しても、他の端点とは独立しても、この両方において、有意
であると更に理解されるであろう。本明細書で多くの値が開示され、それぞれの値がその
値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書でもまた開示されることもまた理解さ
れる。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」もまた開示されている。当
業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、「そ
の値以上」及び値間の可能な範囲もまた開示されていることもまた理解される。例えば、
値「１０」が開示されている場合、「１０以下」と同様に「１０以上」もまた開示されて
いる。本願全体にわたってデータが多数の異なるフォーマットで提供され、このデータが
、端点及び開始点並びにデータ点の任意の組み合わせに対する範囲を表すこともまた理解
される。例えば、特定のデータポイント「１０」及び特定のデータポイント１５が開示さ
れている場合、１０と１５との間と同様に、１０及び１５よりも大きい、１０及び１５以
上、１０及び１５未満、１０及び１５以下、並びに１０及び１５に等しいデータポイント
が開示されていると見なされることが理解される。特定の２つの単位間のそれぞれの単位
もまた開示されていることもまた理解される。例えば、１０及び１５が開示されている場
合、１１、１２、１３及び１４もまた開示されている。
得る。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値から、かつ／又
は他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似として表さ
れるとき、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲のそれ
ぞれの端点は、他の端点に関しても、他の端点とは独立しても、この両方において、有意
であると更に理解されるであろう。本明細書で多くの値が開示され、それぞれの値がその
値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書でもまた開示されることもまた理解さ
れる。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」もまた開示されている。当
業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、「そ
の値以上」及び値間の可能な範囲もまた開示されていることもまた理解される。例えば、
値「１０」が開示されている場合、「１０以下」と同様に「１０以上」もまた開示されて
いる。本願全体にわたってデータが多数の異なるフォーマットで提供され、このデータが
、端点及び開始点並びにデータ点の任意の組み合わせに対する範囲を表すこともまた理解
される。例えば、特定のデータポイント「１０」及び特定のデータポイント１５が開示さ
れている場合、１０と１５との間と同様に、１０及び１５よりも大きい、１０及び１５以
上、１０及び１５未満、１０及び１５以下、並びに１０及び１５に等しいデータポイント
が開示されていると見なされることが理解される。特定の２つの単位間のそれぞれの単位
もまた開示されていることもまた理解される。例えば、１０及び１５が開示されている場
合、１１、１２、１３及び１４もまた開示されている。
【0016】
本明細書及び以下の「特許請求の範囲」において、多数の用語に言及し、それらは以下
の意味を有すると定義されるものとする。
「任意選択的な」又は「任意選択的に」は、引き続いて記載された事象又は状況が起こ
ってもよいかあるいは起こらなくてもよいこと、及び説明が、当該事象又は状況が起こる
場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
の意味を有すると定義されるものとする。
「任意選択的な」又は「任意選択的に」は、引き続いて記載された事象又は状況が起こ
ってもよいかあるいは起こらなくてもよいこと、及び説明が、当該事象又は状況が起こる
場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
【0017】
「減少」は、症状、組成又は活性の量がより少ないことをもたらす任意の変化を指すこ
とができる。物質はまた、その物質を含む遺伝子産物の遺伝子産生量が、その物質を含ま
ない遺伝子産物の産生量に対してより少ないとき、遺伝子の遺伝子産出量を減少させると
理解される。また、例えば、減少は、症状が以前の観察よりも少なくなるような、疾患の
症状における変化であり得る。
とができる。物質はまた、その物質を含む遺伝子産物の遺伝子産生量が、その物質を含ま
ない遺伝子産物の産生量に対してより少ないとき、遺伝子の遺伝子産出量を減少させると
理解される。また、例えば、減少は、症状が以前の観察よりも少なくなるような、疾患の
症状における変化であり得る。
【0018】
「阻害する」、「阻害している」及び「阻害」は、活性、応答、状態、疾病又は他の生
物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、活性、応答、状態又は疾病の
完全除去を含むことができるが、これらに限定されない。これにはまた、例えば、天然又
は対照レベルと比較して、活性、応答、状態又は疾病における１０％の低減を含んでもよ
い。したがって、低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、１００％又は中間の任意の量の低減であり得る。
物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、活性、応答、状態又は疾病の
完全除去を含むことができるが、これらに限定されない。これにはまた、例えば、天然又
は対照レベルと比較して、活性、応答、状態又は疾病における１０％の低減を含んでもよ
い。したがって、低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、１００％又は中間の任意の量の低減であり得る。
【0019】
ここで、「治療」、「治療する」又は「治療している」は、疾病又は状態の影響を低減
する方法を意味することができる。治療はまた、症状のみよりもむしろ疾患又は状態自体
を低減する方法を指すことができる。治療は、天然レベルからの任意の低減であり得、疾
病、状態、又は疾病若しくは状態の症状の完全除去であってよいが、これらに限定されな
い。したがって、開示される方法では、「治療」は、罹患した疾患又は疾患進行の重症度
における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又
は１００％の低減を指すことができる。例えば、同一被験体又は対照被験体における天然
レベルと比較して、疾患を有する被験体における疾患の１つ以上の症状で１０％低減があ
る場合、（転移を阻害又は低減するなどの）癌の効果を低減又は阻害するための開示され
る方法が、治療であると考えられる。したがって、低減は、天然レベル又は対照レベルと
比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％又は中間
の任意の量の低減であり得る。「治療」が疾患又は状態の治癒とは限らず、疾患又は状態
の外観の向上を指すことが理解され、本明細書において企図される。
する方法を意味することができる。治療はまた、症状のみよりもむしろ疾患又は状態自体
を低減する方法を指すことができる。治療は、天然レベルからの任意の低減であり得、疾
病、状態、又は疾病若しくは状態の症状の完全除去であってよいが、これらに限定されな
い。したがって、開示される方法では、「治療」は、罹患した疾患又は疾患進行の重症度
における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又
は１００％の低減を指すことができる。例えば、同一被験体又は対照被験体における天然
レベルと比較して、疾患を有する被験体における疾患の１つ以上の症状で１０％低減があ
る場合、（転移を阻害又は低減するなどの）癌の効果を低減又は阻害するための開示され
る方法が、治療であると考えられる。したがって、低減は、天然レベル又は対照レベルと
比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％又は中間
の任意の量の低減であり得る。「治療」が疾患又は状態の治癒とは限らず、疾患又は状態
の外観の向上を指すことが理解され、本明細書において企図される。
【0020】
本明細書全体において、様々な出版物が参照される。これらの出版物の開示全体が、開
示内容が関連する技術分野の状態をより十分に説明するためにここに参照により本出願に
組み込まれる。開示される参照文献も、その参照文献が依拠される文において考察される
それらに含まれる資料について、参照により本明細書に個々に、かつ具体的に組み込まれ
る。
示内容が関連する技術分野の状態をより十分に説明するためにここに参照により本出願に
組み込まれる。開示される参照文献も、その参照文献が依拠される文において考察される
それらに含まれる資料について、参照により本明細書に個々に、かつ具体的に組み込まれ
る。
【0021】
Ｂ．組成物
開示される組成物を調製するために使用される成分と、本明細書で開示される方法の範
囲内で使用される組成物それ自体が開示される。これら及び他の物質が本明細書で開示さ
れており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている
場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個々及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的
な言及は、明示的に開示されていない場合があるが、それぞれが具体的に企図され、本明
細書に記載されることが理解される。例えば、特定のＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現組換えウイ
ルスが開示かつ論じられ、またＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ及び／又はウイルスバックボーンを含
む多数の分子に対して行うことができる多数の修飾が論じられている場合、それとは反対
の具体的な指示がない限り、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ及び任意のウイルスバックボーンと可能
な修飾とのあらゆる組み合わせ及び置換が具体的に企図される。したがって、分子Ａ、Ｂ
及びＣの種類が開示されており、同様に分子Ｄ、Ｅ及びＦの種類及び分子Ａ～Ｄの組み合
わせの例が開示されている場合、それぞれが個々に列挙されていない場合であっても、そ
れぞれが個々にかつ集合的に企図され、組み合わせＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ
－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ及びＣ－Ｆが開示されると見なされる。同様に、これらの任意のサ
ブセット又は組み合わせもまた開示される。したがって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ及びＣ
－Ｅのサブグループが開示されていると見なされるであろう。この概念は、本出願の全て
の態様に適用され、開示される組成物の作製及び使用方法における工程を含むが、これに
限定されない。このように、実施することができる多様な更なる工程が存在する場合、こ
れらの更なる工程のそれぞれは、任意の特定の実施形態又は開示される方法の実施形態の
組み合わせにより実施することができることが理解される。
開示される組成物を調製するために使用される成分と、本明細書で開示される方法の範
囲内で使用される組成物それ自体が開示される。これら及び他の物質が本明細書で開示さ
れており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている
場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個々及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的
な言及は、明示的に開示されていない場合があるが、それぞれが具体的に企図され、本明
細書に記載されることが理解される。例えば、特定のＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現組換えウイ
ルスが開示かつ論じられ、またＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ及び／又はウイルスバックボーンを含
む多数の分子に対して行うことができる多数の修飾が論じられている場合、それとは反対
の具体的な指示がない限り、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ及び任意のウイルスバックボーンと可能
な修飾とのあらゆる組み合わせ及び置換が具体的に企図される。したがって、分子Ａ、Ｂ
及びＣの種類が開示されており、同様に分子Ｄ、Ｅ及びＦの種類及び分子Ａ～Ｄの組み合
わせの例が開示されている場合、それぞれが個々に列挙されていない場合であっても、そ
れぞれが個々にかつ集合的に企図され、組み合わせＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ
－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ及びＣ－Ｆが開示されると見なされる。同様に、これらの任意のサ
ブセット又は組み合わせもまた開示される。したがって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ及びＣ
－Ｅのサブグループが開示されていると見なされるであろう。この概念は、本出願の全て
の態様に適用され、開示される組成物の作製及び使用方法における工程を含むが、これに
限定されない。このように、実施することができる多様な更なる工程が存在する場合、こ
れらの更なる工程のそれぞれは、任意の特定の実施形態又は開示される方法の実施形態の
組み合わせにより実施することができることが理解される。
【0022】
１０番染色体上の腫瘍抑制ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）は、細胞
内でＡＫＴシグナル伝達経路を阻害するホスファターゼである。ＰＴＥＮは、全ての高悪
性度神経膠腫のうちの約５０％において変異しているか又は欠失しており、全ての乳癌の
３３～４９％において失われている。ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、Ｎ末端に１７３個の付加ア
ミノ酸を有する、最近発見されたＰＴＥＮの代替開始部位変異体である。このより長い形
態のＰＴＥＮは、分泌され、膜透過性であり、細胞への分泌及び再導入後にそのホスファ
ターゼ活性を維持する。感染細胞からＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを分泌する（例えば、改変型単
純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－Ｐ１０）などの）改変型ウイルスを用いる新規腫瘍治療（
例えば、脳腫瘍治療）が、本明細書で開示される。
内でＡＫＴシグナル伝達経路を阻害するホスファターゼである。ＰＴＥＮは、全ての高悪
性度神経膠腫のうちの約５０％において変異しているか又は欠失しており、全ての乳癌の
３３～４９％において失われている。ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、Ｎ末端に１７３個の付加ア
ミノ酸を有する、最近発見されたＰＴＥＮの代替開始部位変異体である。このより長い形
態のＰＴＥＮは、分泌され、膜透過性であり、細胞への分泌及び再導入後にそのホスファ
ターゼ活性を維持する。感染細胞からＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを分泌する（例えば、改変型単
純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－Ｐ１０）などの）改変型ウイルスを用いる新規腫瘍治療（
例えば、脳腫瘍治療）が、本明細書で開示される。
【0023】
組成物の細胞への送達
一態様では、本明細書で開示される機能的効果及び治療的効果は、例えば、癌細胞など
の細胞におけるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの発現の結果であることが理解され、本明細書におい
て企図される。インビトロ又はインビボのいずれかで、細胞に核酸（ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
発現核酸など）を送達するために使用することができる多数の組成物及び方法がある。こ
れらの方法及び組成物は、ウイルス系送達システム及び非ウイルス系送達システムの２つ
の種類に主に分類することができる。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフ
ェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、フ
ァージ核酸、ファージ、コスミドなどの多数の直接送達システムを介して、又は遺伝物質
の細胞への転写若しくはカチオン性リポソームなどの担体を介して送達することができる
。したがって、一態様では、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを含むウイルスベクター、プラスミド、
ファージ、コスミドである。被験体にＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを投与することを含む、被験体
における癌を治療する方法がまた本明細で開示され、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、リポフェク
ション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファー
ジ核酸、ファージ、コスミドを介して、又は遺伝物質の細胞への転写若しくはカチオン性
リポソームなどの担体を介して癌細胞に送達される。ＤＮＡのエレクトロポレーション及
び直接拡散などの、ウイルスベクター、化学トランスフェクタント又は物理的機械的方法
を含むトランスフェクションのための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５～１４６８（１９９０）及びＷｏｌｆｆ
，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５～８１８，（１９９１）によって記載されてい
る。このような方法は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載の組成物及び
方法での使用に容易に適合可能である。特定の場合では、方法は、巨大ＤＮＡ分子により
特異的に機能するように改変されることとなる。更に、これらの方法は、担体の標的化特
性を使用することによって、特定の疾患及び細胞集団を標的とするために使用することが
できる。
一態様では、本明細書で開示される機能的効果及び治療的効果は、例えば、癌細胞など
の細胞におけるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの発現の結果であることが理解され、本明細書におい
て企図される。インビトロ又はインビボのいずれかで、細胞に核酸（ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
発現核酸など）を送達するために使用することができる多数の組成物及び方法がある。こ
れらの方法及び組成物は、ウイルス系送達システム及び非ウイルス系送達システムの２つ
の種類に主に分類することができる。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフ
ェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、フ
ァージ核酸、ファージ、コスミドなどの多数の直接送達システムを介して、又は遺伝物質
の細胞への転写若しくはカチオン性リポソームなどの担体を介して送達することができる
。したがって、一態様では、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを含むウイルスベクター、プラスミド、
ファージ、コスミドである。被験体にＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを投与することを含む、被験体
における癌を治療する方法がまた本明細で開示され、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、リポフェク
ション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファー
ジ核酸、ファージ、コスミドを介して、又は遺伝物質の細胞への転写若しくはカチオン性
リポソームなどの担体を介して癌細胞に送達される。ＤＮＡのエレクトロポレーション及
び直接拡散などの、ウイルスベクター、化学トランスフェクタント又は物理的機械的方法
を含むトランスフェクションのための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５～１４６８（１９９０）及びＷｏｌｆｆ
，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５～８１８，（１９９１）によって記載されてい
る。このような方法は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載の組成物及び
方法での使用に容易に適合可能である。特定の場合では、方法は、巨大ＤＮＡ分子により
特異的に機能するように改変されることとなる。更に、これらの方法は、担体の標的化特
性を使用することによって、特定の疾患及び細胞集団を標的とするために使用することが
できる。
【0024】
ａ）核酸系送達システム
転写ベクターは、細胞内に遺伝子を送達するために使用される、又は遺伝子を送達する
ための一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルス若しくはアデノウイル
スの一部として使用される、任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であり得
る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３～８８，（１９９３））。
転写ベクターは、細胞内に遺伝子を送達するために使用される、又は遺伝子を送達する
ための一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルス若しくはアデノウイル
スの一部として使用される、任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であり得
る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３～８８，（１９９３））。
【0025】
本明細書で使用されるとき、プラスミド又はウイルスベクターは、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
などの開示される核酸を分解させることなく細胞内に輸送し、核酸が送達された細胞内で
遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む、媒介物である。ウイルスベクターは、例え
ば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポ
リオウイルス、エイズウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスウイルス及び他のＲＮＡ
ウイルスであり、ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスを含む。ウイルスをベク
ターとしての使用に好適であるようにする、これらのウイルスの性質を共有する、任意の
ウイルス科もまた好ましい。レトロウイルスには、マウスＭａｌｏｎｅｙ白血病ウイルス
、ＭＭＬＶ及びＭＭＬＶの好ましい性質をベクターとして発現するレトロウイルスが挙げ
られる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きな遺伝子ペイロード
、すなわち、導入遺伝子又はマーカー遺伝子を担持することができ、この理由から、一般
的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖性細胞において有用ではない
。アデノウイルスベクターは、比較的安定かつ取り扱いが容易で、高力価を有し、エアゾ
ール製剤で送達することができ、非分裂性細胞にトランスフェクトすることができる。ポ
ックスウイルスベクターは、大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、耐
熱性であり、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって
誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように遺伝子操作されたウイルスベクターであ
る。この種類の好ましいベクターは、インターロイキン８又は１０に対するコード領域を
担持することとなる。
などの開示される核酸を分解させることなく細胞内に輸送し、核酸が送達された細胞内で
遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む、媒介物である。ウイルスベクターは、例え
ば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポ
リオウイルス、エイズウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスウイルス及び他のＲＮＡ
ウイルスであり、ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスを含む。ウイルスをベク
ターとしての使用に好適であるようにする、これらのウイルスの性質を共有する、任意の
ウイルス科もまた好ましい。レトロウイルスには、マウスＭａｌｏｎｅｙ白血病ウイルス
、ＭＭＬＶ及びＭＭＬＶの好ましい性質をベクターとして発現するレトロウイルスが挙げ
られる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きな遺伝子ペイロード
、すなわち、導入遺伝子又はマーカー遺伝子を担持することができ、この理由から、一般
的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖性細胞において有用ではない
。アデノウイルスベクターは、比較的安定かつ取り扱いが容易で、高力価を有し、エアゾ
ール製剤で送達することができ、非分裂性細胞にトランスフェクトすることができる。ポ
ックスウイルスベクターは、大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、耐
熱性であり、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって
誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように遺伝子操作されたウイルスベクターであ
る。この種類の好ましいベクターは、インターロイキン８又は１０に対するコード領域を
担持することとなる。
【0026】
ウイルスベクターは、細胞内に遺伝子を導入するための化学的方法又は物理的方法より
も高い処理能力（遺伝子導入能）を有することができる。一般的には、ウイルスベクター
は、非構造性初期遺伝子、構造性後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写体、複製及
びカプシド形成に必要な逆方向末端反復、並びにウイルスゲノムの転写及び複製を制御す
るためのプロモーターを含む。ベクターとして遺伝子操作されたとき、ウイルスは、除去
された初期遺伝子のうちの１つ以上を一般的に有し、遺伝子又は遺伝子／プロモーターカ
セットは、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム内に挿入される。この種
類の構築物は、約８ｋｂまでの外来遺伝的材料を担持することができる。除去された初期
遺伝子の必須機能は、トランス型において初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように設計
された細胞株によって一般的に提供される。
も高い処理能力（遺伝子導入能）を有することができる。一般的には、ウイルスベクター
は、非構造性初期遺伝子、構造性後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写体、複製及
びカプシド形成に必要な逆方向末端反復、並びにウイルスゲノムの転写及び複製を制御す
るためのプロモーターを含む。ベクターとして遺伝子操作されたとき、ウイルスは、除去
された初期遺伝子のうちの１つ以上を一般的に有し、遺伝子又は遺伝子／プロモーターカ
セットは、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム内に挿入される。この種
類の構築物は、約８ｋｂまでの外来遺伝的材料を担持することができる。除去された初期
遺伝子の必須機能は、トランス型において初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように設計
された細胞株によって一般的に提供される。
【0027】
（１）腫瘍溶解性ベクター
一態様では、ウイルスベクターは、腫瘍溶解性であり得る。腫瘍溶解性ウイルスは、感
染細胞の直接溶菌、毒素の分泌及び／又は宿主抗腫瘍免疫応答の刺激のいずれかを介して
、癌細胞に選択的に感染し、死滅させる。腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、ＨＳ
Ｖ、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ＶＳＶ及び麻疹ウイルスを含むがこれらに限定
されない、任意の種類のウイルスベクターであり得る。例えば、ＨＳＶ系腫瘍溶解性ウイ
ルスは、（本明細書で神経病原性因子γ－３４．５とも称する）ＩＣＰ３４．５のヌル変
異又は欠失を含むことができる。この変異は、最終分化した非分裂性細胞ではもはや複製
できないが、癌などの急速に分裂する細胞に感染して溶解する能力を保持している、ＨＳ
Ｖベクターをもたらす。一態様では、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを発現する開示される改変ウイ
ルスのウイルスベクターバックボーンは、例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋ（ＨＳＶＱ）、ＨＳ
Ｖ１７１６、ＵＬ５６タンパク質発現を欠いた）ＨＦ１０及び（ＩＣＰ３４．５及びＧＭ
－ＣＳＦの機能的発現を欠いた）ＯｎｃｏＶｅｘ ＧＭ－ＣＳＦなどの、腫瘍溶解性ＨＳ
Ｖベクターであり得る。腫瘍溶解性ウイルスはまた、ＯＮＹＸ－０１５、Ｈ１０１及びＫ
Ｈ９０１を含むがこれらに限定されない、腫瘍溶解性アデノウイルス、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ
及びＲＴ３Ｄを含むがこれらに限定されない、腫瘍溶解性レオウイルス、ＧＬ－ＯＮＣ１
及びＪＸ－５９４を含むがこれらに限定されない、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、並び
に、ＭＶ－ＮＩＳを含むがこれに限定されない腫瘍溶解性（oncoclytic）麻疹ウイルスで
あり得る。ウイルスベクターの選択は、ウイルスバックボーンの向性、導入遺伝子サイズ
又は科学者が入手可能であるかに依存する場合がある。したがって、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
発現ＨＳＶウイルスベクターが本明細書で開示され、ここで、ウイルスバックボーンは、
腫瘍細胞を標的化するため及び／又は、例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋ（ＨＳＶＱ）などの腫
瘍特異的プロモーターの制御下でウイルス複製に重要な遺伝子を配置するために改変され
た、腫瘍溶解性ＨＳＶ－１バックボーンである。
一態様では、ウイルスベクターは、腫瘍溶解性であり得る。腫瘍溶解性ウイルスは、感
染細胞の直接溶菌、毒素の分泌及び／又は宿主抗腫瘍免疫応答の刺激のいずれかを介して
、癌細胞に選択的に感染し、死滅させる。腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、ＨＳ
Ｖ、レオウイルス、ワクシニアウイルス、ＶＳＶ及び麻疹ウイルスを含むがこれらに限定
されない、任意の種類のウイルスベクターであり得る。例えば、ＨＳＶ系腫瘍溶解性ウイ
ルスは、（本明細書で神経病原性因子γ－３４．５とも称する）ＩＣＰ３４．５のヌル変
異又は欠失を含むことができる。この変異は、最終分化した非分裂性細胞ではもはや複製
できないが、癌などの急速に分裂する細胞に感染して溶解する能力を保持している、ＨＳ
Ｖベクターをもたらす。一態様では、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを発現する開示される改変ウイ
ルスのウイルスベクターバックボーンは、例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋ（ＨＳＶＱ）、ＨＳ
Ｖ１７１６、ＵＬ５６タンパク質発現を欠いた）ＨＦ１０及び（ＩＣＰ３４．５及びＧＭ
－ＣＳＦの機能的発現を欠いた）ＯｎｃｏＶｅｘ ＧＭ－ＣＳＦなどの、腫瘍溶解性ＨＳ
Ｖベクターであり得る。腫瘍溶解性ウイルスはまた、ＯＮＹＸ－０１５、Ｈ１０１及びＫ
Ｈ９０１を含むがこれらに限定されない、腫瘍溶解性アデノウイルス、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ
及びＲＴ３Ｄを含むがこれらに限定されない、腫瘍溶解性レオウイルス、ＧＬ－ＯＮＣ１
及びＪＸ－５９４を含むがこれらに限定されない、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、並び
に、ＭＶ－ＮＩＳを含むがこれに限定されない腫瘍溶解性（oncoclytic）麻疹ウイルスで
あり得る。ウイルスベクターの選択は、ウイルスバックボーンの向性、導入遺伝子サイズ
又は科学者が入手可能であるかに依存する場合がある。したがって、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
発現ＨＳＶウイルスベクターが本明細書で開示され、ここで、ウイルスバックボーンは、
腫瘍細胞を標的化するため及び／又は、例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋ（ＨＳＶＱ）などの腫
瘍特異的プロモーターの制御下でウイルス複製に重要な遺伝子を配置するために改変され
た、腫瘍溶解性ＨＳＶ－１バックボーンである。
【0028】
（２）ヘルペスウイルスベクター
ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルス科に属する動物ウイルスである。ヘルペスウイ
ルスは、宿主範囲が広く、巨大導入遺伝子ペイロードを受容することができる。加えて、
ヘルペスウイルスは、被験体において潜伏感染を確立し、永久に持続する能力を有する。
ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルス科に属する動物ウイルスである。ヘルペスウイ
ルスは、宿主範囲が広く、巨大導入遺伝子ペイロードを受容することができる。加えて、
ヘルペスウイルスは、被験体において潜伏感染を確立し、永久に持続する能力を有する。
【0029】
単純ヘルペスウイルス－１ベクター（例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋ）などのヘルペスウイ
ルスベクターは、複製に必須ではないが宿主細胞範囲に影響を及ぼす遺伝子を除去するた
めに、弱毒化することができる。例えば、ウイルスは、神経病原性因子γ－３４．５及び
／又はウイルスリボヌクレオチドリダクターゼＩＣＰ６において欠失を含むように改変す
ることができる。更なる改変は、ＩＣＰ４７及び／又はＧＭ－ＣＳＦ発現の欠失又はヌル
変異を含むことができる。
ルスベクターは、複製に必須ではないが宿主細胞範囲に影響を及ぼす遺伝子を除去するた
めに、弱毒化することができる。例えば、ウイルスは、神経病原性因子γ－３４．５及び
／又はウイルスリボヌクレオチドリダクターゼＩＣＰ６において欠失を含むように改変す
ることができる。更なる改変は、ＩＣＰ４７及び／又はＧＭ－ＣＳＦ発現の欠失又はヌル
変異を含むことができる。
【0030】
開示されるヘルペスウイルスベクターはまた、複製欠損であり得る。ＨＳＶは、８０種
よりも多いウイルス遺伝子産物をコードし、それらの約半分は、ウイルス複製のために必
須である。必須遺伝子の１つを欠失させることにより複製欠損変異体を作製し、補完細胞
株によりトランス型において遺伝子産物を提供することは、比較的容易である。このよう
な変異体ウイルスは、非補完細胞において複製不可能であるが、変異体ウイルスは、多く
のウイルス遺伝子産物を依然として発現するという事実により、細胞毒性を保持すること
ができる。ウイルス複製はまた、トランス型においてインビトロで補完することができる
最初期遺伝子におけるヌル突然変異によって容易に破壊され、非病原性ベクターの高力価
の純粋製剤を直接産生することが可能となる。複製欠損ベクターによる形質導入は、神経
組織及び非神経組織の両方において潜在的感染を引き起こし、ベクターは、非病原性であ
り、再活性化が不可能であり、長期持続する。例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋウイルスベクタ
ー（ＨＳＶＱ）は、非神経組織への感染を制限するように改変された。一態様では、哺乳
動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスが本明細書で開示され、その組換え
ウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルスである。いくつかの
態様では、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ＨＳＶウイルスベクターが本明細書で開示され、ウイ
ルスバックボーンは、腫瘍細胞を標的化するため及び／又は、例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋ
（ＨＳＶＱ）などの腫瘍特異的プロモーターの制御下でウイルス複製に重要な遺伝子を配
置するために改変された、ＨＳＶ－１バックボーンである。ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導入遺伝
子を発現するＨＳＶＱウイルスは、本明細書ではＨＳＶ Ｐ１０又はＲＡＰＴＯＲウイル
スと称する（例えば、図１Ａを参照されたい）。
よりも多いウイルス遺伝子産物をコードし、それらの約半分は、ウイルス複製のために必
須である。必須遺伝子の１つを欠失させることにより複製欠損変異体を作製し、補完細胞
株によりトランス型において遺伝子産物を提供することは、比較的容易である。このよう
な変異体ウイルスは、非補完細胞において複製不可能であるが、変異体ウイルスは、多く
のウイルス遺伝子産物を依然として発現するという事実により、細胞毒性を保持すること
ができる。ウイルス複製はまた、トランス型においてインビトロで補完することができる
最初期遺伝子におけるヌル突然変異によって容易に破壊され、非病原性ベクターの高力価
の純粋製剤を直接産生することが可能となる。複製欠損ベクターによる形質導入は、神経
組織及び非神経組織の両方において潜在的感染を引き起こし、ベクターは、非病原性であ
り、再活性化が不可能であり、長期持続する。例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋウイルスベクタ
ー（ＨＳＶＱ）は、非神経組織への感染を制限するように改変された。一態様では、哺乳
動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスが本明細書で開示され、その組換え
ウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルスである。いくつかの
態様では、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ＨＳＶウイルスベクターが本明細書で開示され、ウイ
ルスバックボーンは、腫瘍細胞を標的化するため及び／又は、例えば、ＨＳＶＱｕｉｃｋ
（ＨＳＶＱ）などの腫瘍特異的プロモーターの制御下でウイルス複製に重要な遺伝子を配
置するために改変された、ＨＳＶ－１バックボーンである。ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導入遺伝
子を発現するＨＳＶＱウイルスは、本明細書ではＨＳＶ Ｐ１０又はＲＡＰＴＯＲウイル
スと称する（例えば、図１Ａを参照されたい）。
【0031】
（３）レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科に属する動物ウイルスであり、任意の型、亜科、
属又は向性を含む。レトロウイルスベクターは、全般的に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．「Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」により記載
されている。
レトロウイルスは、レトロウイルス科に属する動物ウイルスであり、任意の型、亜科、
属又は向性を含む。レトロウイルスベクターは、全般的に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．「Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」により記載
されている。
【0032】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴを内部に包み込んだパッケージである。核酸
カーゴは、それと共にパッケージングシグナルを担持し、複製された娘分子がパッケージ
コート内に効率的にパッケージされることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、
複製及び複製されたウイルスのパッケージングのために、シス型において必要とされる多
数の分子がある。一般的に、レトロウイルスゲノムは、タンパク質膜の作製に関与するｇ
ａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含む。レトロウイルスゲノムは、標的細胞に導入される
べき外来ＤＮＡにより一般的に置換されたｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子である。レト
ロウイルスベクターは、パッケージコート内に取り込むためのパッケージングシグナル、
ｇａｇ転写ユニットの開始の信号を発する配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合する
ためのプライマー結合部位を含む逆転写に必要な要素、ＤＮＡ合成中にＲＮＡストランド
のスイッチを誘導する端末反復配列、ＤＮＡ合成の第２のストランドの合成用のプライミ
ング部位として作用するプリンに富む配列５’から３’ＬＴＲ、及び宿主ゲノム内に挿入
するレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲの端部付近にある特定の配列
を典型的に含む。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来配列がウイ
ルスゲノムに挿入され、逆転写された状態となり、複製時に新たなレトロウイルス粒子内
にパッケージされることを可能にする。この量の核酸は、それぞれの転写物のサイズに応
じて１つから多数の遺伝子の送達に十分である。正又は負の選択可能なマーカーのいずれ
かをインサートにおいて他の遺伝子と共に含むことが好ましい。
カーゴは、それと共にパッケージングシグナルを担持し、複製された娘分子がパッケージ
コート内に効率的にパッケージされることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、
複製及び複製されたウイルスのパッケージングのために、シス型において必要とされる多
数の分子がある。一般的に、レトロウイルスゲノムは、タンパク質膜の作製に関与するｇ
ａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含む。レトロウイルスゲノムは、標的細胞に導入される
べき外来ＤＮＡにより一般的に置換されたｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子である。レト
ロウイルスベクターは、パッケージコート内に取り込むためのパッケージングシグナル、
ｇａｇ転写ユニットの開始の信号を発する配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合する
ためのプライマー結合部位を含む逆転写に必要な要素、ＤＮＡ合成中にＲＮＡストランド
のスイッチを誘導する端末反復配列、ＤＮＡ合成の第２のストランドの合成用のプライミ
ング部位として作用するプリンに富む配列５’から３’ＬＴＲ、及び宿主ゲノム内に挿入
するレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲの端部付近にある特定の配列
を典型的に含む。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来配列がウイ
ルスゲノムに挿入され、逆転写された状態となり、複製時に新たなレトロウイルス粒子内
にパッケージされることを可能にする。この量の核酸は、それぞれの転写物のサイズに応
じて１つから多数の遺伝子の送達に十分である。正又は負の選択可能なマーカーのいずれ
かをインサートにおいて他の遺伝子と共に含むことが好ましい。
【0033】
大部分のレトロウイルスベクター中の複製機構及びパッケージングタンパク質を除去し
たため（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）、ベクターは、それらをパッケージング細胞株内に
配置することによって一般的に生成される。パッケージング細胞株は、複製機構及びパッ
ケージング機構を含むが、パッケージングシグナルを欠いているレトロウイルスによりト
ランスフェクト又は形質転換された、細胞株である。選択ＤＮＡを担持したベクターがこ
の細胞株にトランスフェクトされると、目的の遺伝子を含むベクターは、ヘルパー細胞に
よりシス型において提供された機構により、複製され、新たなレトロウイルス粒子内にパ
ッケージされる。機構に関するゲノムがパッケージされないのは、ゲノムが必須シグナル
を欠いているからである。
たため（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）、ベクターは、それらをパッケージング細胞株内に
配置することによって一般的に生成される。パッケージング細胞株は、複製機構及びパッ
ケージング機構を含むが、パッケージングシグナルを欠いているレトロウイルスによりト
ランスフェクト又は形質転換された、細胞株である。選択ＤＮＡを担持したベクターがこ
の細胞株にトランスフェクトされると、目的の遺伝子を含むベクターは、ヘルパー細胞に
よりシス型において提供された機構により、複製され、新たなレトロウイルス粒子内にパ
ッケージされる。機構に関するゲノムがパッケージされないのは、ゲノムが必須シグナル
を欠いているからである。
【0034】
（４）アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３～１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２～２８８３（１９８６）；Ｈａｊ Ａ
ｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７～２７４（１９８６）；
Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６～１２３９（
１９８７）；Ｚｈａｎｇ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８～８７２（１９９３））。ベクターとしてこれ
らのウイルスを使用する利点は、他の細胞型に広がることができる程度が限定されている
ことであり、これは、それらが初期感染細胞内部で複製できるが、新たな感染性ウイルス
粒子を形成することができないためである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞
、血管内皮、ＣＮＳ親腫及び多数の他の組織部位への直接的なインビボ送達の後に高効率
遺伝子導入を達成することが示されている。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受
容体に結合することによって遺伝子導入を実現し、その後、そのウイルスは、野生型又は
複製欠損アデノウイルスと同様に、受容体媒介エンドサイトーシスにより取り込まれる。
複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３～１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２～２８８３（１９８６）；Ｈａｊ Ａ
ｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７～２７４（１９８６）；
Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６～１２３９（
１９８７）；Ｚｈａｎｇ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８～８７２（１９９３））。ベクターとしてこれ
らのウイルスを使用する利点は、他の細胞型に広がることができる程度が限定されている
ことであり、これは、それらが初期感染細胞内部で複製できるが、新たな感染性ウイルス
粒子を形成することができないためである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞
、血管内皮、ＣＮＳ親腫及び多数の他の組織部位への直接的なインビボ送達の後に高効率
遺伝子導入を達成することが示されている。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受
容体に結合することによって遺伝子導入を実現し、その後、そのウイルスは、野生型又は
複製欠損アデノウイルスと同様に、受容体媒介エンドサイトーシスにより取り込まれる。
【0035】
ウイルスベクターは、除去されたＥ１遺伝子を有していたアデノウイルスに基づくウイ
ルスベクターであり得、これらのビリオンは、ヒト２９３細胞株などの細胞株において生
成される。別の好ましい実施形態では、Ｅ１及びＥ３遺伝子の両方が、アデノウイルスゲ
ノムから除去される。
ルスベクターであり得、これらのビリオンは、ヒト２９３細胞株などの細胞株において生
成される。別の好ましい実施形態では、Ｅ１及びＥ３遺伝子の両方が、アデノウイルスゲ
ノムから除去される。
【0036】
（５）アデノ随伴ウイルスベクター
他の種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パ
ルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに対して非病原性であるため
、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４～５ｋｂを輸送することができ、
野生型ＡＡＶは、１９番染色体に安定して挿入することが既知である。この部位特異的組
み込み特性を含むベクターが好ましい。この種類のベクターの特に好ましい実施形態は、
Ａｖｉｇｅｎ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により作製されたＰ４．１ Ｃベク
ターであり、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ－ｔｋ及び／又は
緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含むことができる
。
他の種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パ
ルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに対して非病原性であるため
、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４～５ｋｂを輸送することができ、
野生型ＡＡＶは、１９番染色体に安定して挿入することが既知である。この部位特異的組
み込み特性を含むベクターが好ましい。この種類のベクターの特に好ましい実施形態は、
Ａｖｉｇｅｎ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により作製されたＰ４．１ Ｃベク
ターであり、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ－ｔｋ及び／又は
緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含むことができる
。
【0037】
別の種類のＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、非相同遺伝子に操作可能に結合された細胞
特異的発現を誘導するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する、逆方向
末端反復（ＩＴＲ）の対を含む。この文脈において非相同とは、ＡＡＶ又はＢ１９パルボ
ウイルスに由来しない任意のヌクレオチド配列又は遺伝子を指す。
特異的発現を誘導するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する、逆方向
末端反復（ＩＴＲ）の対を含む。この文脈において非相同とは、ＡＡＶ又はＢ１９パルボ
ウイルスに由来しない任意のヌクレオチド配列又は遺伝子を指す。
【0038】
一般的に、ＡＡＶ及びＢ１９のコード化領域は、欠失しており、安全な非細胞毒性ベク
ターをもたらす。ＡＡＶ ＩＴＲ又はその改変体は、感染性及び部位特異的組み込みを付
与するが、細胞毒性を付与せず、プロモーターは、細胞特異的発現を誘導する。米国特許
第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する資料について、参照により本明細
書に組み込まれる。
ターをもたらす。ＡＡＶ ＩＴＲ又はその改変体は、感染性及び部位特異的組み込みを付
与するが、細胞毒性を付与せず、プロモーターは、細胞特異的発現を誘導する。米国特許
第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する資料について、参照により本明細
書に組み込まれる。
【0039】
したがって、開示されるベクターは、実質的な毒性を持つことなく哺乳動物の染色体内
に組み込むことが可能なＤＮＡ分子をもたらす。
ウイルス又はレトロウイルスに挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の
制御を助けるためのプロモーター及び／又はエンハンサーを含む。プロモーターは、一般
的に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列で
ある。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコ
アエレメントを含み、上流エレメント及び応答エレメントを含むことができる。
に組み込むことが可能なＤＮＡ分子をもたらす。
ウイルス又はレトロウイルスに挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の
制御を助けるためのプロモーター及び／又はエンハンサーを含む。プロモーターは、一般
的に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列で
ある。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコ
アエレメントを含み、上流エレメント及び応答エレメントを含むことができる。
【0040】
（６）巨大ペイロードウイルスベクター
巨大ヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝学的実験は、ヘルペスウイルスに感染可能
な細胞において、巨大非相同ＤＮＡフラグメントをクローニングし、増殖させ、確立する
ことができる手段を提供した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
８：３３～４１，１９９４；Ｃｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６３３～６４４、１９９９）。これらの巨大ＤＮＡウ
イルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）
は、＞１５０ｋｂのヒト非相同ＤＮＡフラグメントを特定の細胞に送達する能力を有する
。ＥＢＶ組換え体は、感染Ｂ細胞内のＤＮＡの巨大断片をエピソームＤＮＡとして維持す
ることができる。ヒトゲノムインサートに担持された３３０ｋｂまでの個々のクローンは
、遺伝的に安定していることを示した。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶ感染時に構
成的に発現される、特定のＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１を必要とする。加えて、これ
らのベクターは、トランスフェクションに使用することができ、大量のタンパク質を、イ
ンビトロで一時的に生成することができる。ヘルペスウイルス単位複製配列システムはま
た、＞２２０ｋｂのＤＮＡ断片をパッケージし、エピソームとしてＤＮＡを安定して維持
することができる細胞を感染させるために使用されている。
巨大ヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝学的実験は、ヘルペスウイルスに感染可能
な細胞において、巨大非相同ＤＮＡフラグメントをクローニングし、増殖させ、確立する
ことができる手段を提供した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
８：３３～４１，１９９４；Ｃｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６３３～６４４、１９９９）。これらの巨大ＤＮＡウ
イルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）
は、＞１５０ｋｂのヒト非相同ＤＮＡフラグメントを特定の細胞に送達する能力を有する
。ＥＢＶ組換え体は、感染Ｂ細胞内のＤＮＡの巨大断片をエピソームＤＮＡとして維持す
ることができる。ヒトゲノムインサートに担持された３３０ｋｂまでの個々のクローンは
、遺伝的に安定していることを示した。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶ感染時に構
成的に発現される、特定のＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１を必要とする。加えて、これ
らのベクターは、トランスフェクションに使用することができ、大量のタンパク質を、イ
ンビトロで一時的に生成することができる。ヘルペスウイルス単位複製配列システムはま
た、＞２２０ｋｂのＤＮＡ断片をパッケージし、エピソームとしてＤＮＡを安定して維持
することができる細胞を感染させるために使用されている。
【0041】
他の有用なシステムは、例えば、複製ワクシニアウイルスベクター及び宿主制限的非複
製ワクシニアウイルスベクターを含む。
ｂ）非核酸系システム
本明細書に開示されるように、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、種々の方法で標的細胞に送達す
ることができる。例えば、組成物は、エレクトロポレーションを介して、又はリポフェク
ションを介して、又はリン酸カルシウム沈殿を介して送達することができる。選択された
送達機構は、標的化された細胞の種類に部分的に依存し、送達が、例えば、インビボ又は
インビトロで行われているかどうかに依存することとなる。
製ワクシニアウイルスベクターを含む。
ｂ）非核酸系システム
本明細書に開示されるように、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、種々の方法で標的細胞に送達す
ることができる。例えば、組成物は、エレクトロポレーションを介して、又はリポフェク
ションを介して、又はリン酸カルシウム沈殿を介して送達することができる。選択された
送達機構は、標的化された細胞の種類に部分的に依存し、送達が、例えば、インビボ又は
インビトロで行われているかどうかに依存することとなる。
【0042】
したがって、組成物は、開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ及び当該ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導
入遺伝子を含むＨＳＶＱベクターに加えて、例えば、カチオン性リポソーム（例えば、Ｄ
ＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣコレステロール）又はアニオン性リポソームなどのリポソーム
のような脂質を含むことができる。リポソームは、所望する場合、特定の細胞の標的化を
容易にするためのタンパク質を更に含むことができる。化合物及びカチオン性リポソーム
を含む組成物の投与は、標的器官への血液輸入に投与することができるか又は気道内に吸
入して気道の細胞を標的化することができる。リポソームに関して、例えば、Ｂｒｉｇｈ
ａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５～１０
０（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
ＵＳＡ，８４：７４１３～７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を
参照されたい。更に、化合物は、マクロファージなどの特定の細胞種を標的とすることが
できるマイクロカプセルの成分として、又はマイクロカプセルからの化合物の拡散若しく
は化合物の送達が特定の速度若しくは投与量について設計されている部位で、投与するこ
とができる。
入遺伝子を含むＨＳＶＱベクターに加えて、例えば、カチオン性リポソーム（例えば、Ｄ
ＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣコレステロール）又はアニオン性リポソームなどのリポソーム
のような脂質を含むことができる。リポソームは、所望する場合、特定の細胞の標的化を
容易にするためのタンパク質を更に含むことができる。化合物及びカチオン性リポソーム
を含む組成物の投与は、標的器官への血液輸入に投与することができるか又は気道内に吸
入して気道の細胞を標的化することができる。リポソームに関して、例えば、Ｂｒｉｇｈ
ａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５～１０
０（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
ＵＳＡ，８４：７４１３～７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を
参照されたい。更に、化合物は、マクロファージなどの特定の細胞種を標的とすることが
できるマイクロカプセルの成分として、又はマイクロカプセルからの化合物の拡散若しく
は化合物の送達が特定の速度若しくは投与量について設計されている部位で、投与するこ
とができる。
【0043】
被験体の細胞内への外因性ＤＮＡの投与及び取り込み（すなわち、遺伝子形質導入又は
トランスフェクション）を含む上記記載の方法では、細胞への組成物の送達は、多様な機
構を介することができる。一例として、送達は、リポソームを介することができ、ＬＩＰ
ＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｕａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅ
ｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉ
ｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの市販のリポソーム製剤、並びに当該技術分野の標
準手順に従って開発された他のリポソームを使用する。加えて、開示される核酸又はベク
ターは、エレクトロポレーションによりインビボで送達することができ、送達のための技
術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手でき、
また同様にＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機械（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）により利用できる。
トランスフェクション）を含む上記記載の方法では、細胞への組成物の送達は、多様な機
構を介することができる。一例として、送達は、リポソームを介することができ、ＬＩＰ
ＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｕａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅ
ｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉ
ｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの市販のリポソーム製剤、並びに当該技術分野の標
準手順に従って開発された他のリポソームを使用する。加えて、開示される核酸又はベク
ターは、エレクトロポレーションによりインビボで送達することができ、送達のための技
術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手でき、
また同様にＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機械（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）により利用できる。
【0044】
材料は、溶液、（例えば、微小粒子、リポソーム又は細胞に組み込まれた）懸濁液であ
ってもよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的と
してもよい。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技
術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈ
ｅｍ．，２：４４７～４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５～２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．
，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００～７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３～９，（１９９３）；Ｂａｔ
ｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，
３５：４２１～４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７～８０，（１９９２）；及びＲｏｆ
ｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２～２０
６５，（１９９１））。これらの手法は、多様な他の特定の細胞型について使用すること
ができる。「ステルス」などのビヒクル及び（結腸癌を標的とする脂質介在性薬物を含む
）他の抗体共役（conjugated）リポソーム、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体
介在性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、並びにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高
特異的治療的レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ
標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４～６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎ
ｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ，１１０４：１７９～１８７，（１９９２））。全般的に、受容体は、構成的誘発
性又はリガンド誘発性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン
被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、
受容体が分別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細
胞内に保存されるか又はリポソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、
栄養取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の
日和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節などの多様な機能を果た
す。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガン
ド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体介在性エンドサイトーシスの分子
機構及び細胞機構がレビューされている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ
ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９～４０９（１９９１））。
ってもよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的と
してもよい。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技
術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈ
ｅｍ．，２：４４７～４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５～２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．
，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００～７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３～９，（１９９３）；Ｂａｔ
ｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，
３５：４２１～４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７～８０，（１９９２）；及びＲｏｆ
ｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２～２０
６５，（１９９１））。これらの手法は、多様な他の特定の細胞型について使用すること
ができる。「ステルス」などのビヒクル及び（結腸癌を標的とする脂質介在性薬物を含む
）他の抗体共役（conjugated）リポソーム、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体
介在性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、並びにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高
特異的治療的レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ
標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４～６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎ
ｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ，１１０４：１７９～１８７，（１９９２））。全般的に、受容体は、構成的誘発
性又はリガンド誘発性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン
被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、
受容体が分別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細
胞内に保存されるか又はリポソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、
栄養取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の
日和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節などの多様な機能を果た
す。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガン
ド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体介在性エンドサイトーシスの分子
機構及び細胞機構がレビューされている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ
ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９～４０９（１９９１））。
【0045】
宿主細胞ゲノム内に組み込まれることとなる、細胞に送達される核酸は、組み込み配列
を一般的に含む。これらの配列は、特に、ウイルス系システムが使用されるときに、ウイ
ルス関連配列である場合が多い。これらのウイルス組み込みシステムはまた、リポソーム
などの、送達の非核酸系システムを使用して送達されることとなる核酸内に組み込むこと
もできるため、送達システムに含まれる核酸は、宿主ゲノム内に組み込まれているように
することができる。
を一般的に含む。これらの配列は、特に、ウイルス系システムが使用されるときに、ウイ
ルス関連配列である場合が多い。これらのウイルス組み込みシステムはまた、リポソーム
などの、送達の非核酸系システムを使用して送達されることとなる核酸内に組み込むこと
もできるため、送達システムに含まれる核酸は、宿主ゲノム内に組み込まれているように
することができる。
【0046】
宿主ゲノム内に組み込むための他の一般的な技術は、例えば、宿主ゲノムとの相同的組
換えを促進するように設計されたシステムを含む。これらのシステムは、ベクター核酸と
標的核酸との間で組換えが生じる宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する、
発現されることとなる核酸に隣接する配列に一般的に依存し、送達された核酸が宿主ゲノ
ム内に組み込まれるようにする。相同的組換えを促進するために必要なこれらのシステム
及び方法は、当業者に既知である。
換えを促進するように設計されたシステムを含む。これらのシステムは、ベクター核酸と
標的核酸との間で組換えが生じる宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する、
発現されることとなる核酸に隣接する配列に一般的に依存し、送達された核酸が宿主ゲノ
ム内に組み込まれるようにする。相同的組換えを促進するために必要なこれらのシステム
及び方法は、当業者に既知である。
【0047】
ｃ）インビボ／エクスビボ
上記のように、組成物は、薬学的に許容される担体に施すことができ、当該技術分野で
公知の多様な機構（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介した
ＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど）によりインビボかつ／又はエクスビボで
被験体の細胞に送達することができる。
上記のように、組成物は、薬学的に許容される担体に施すことができ、当該技術分野で
公知の多様な機構（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介した
ＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど）によりインビボかつ／又はエクスビボで
被験体の細胞に送達することができる。
【0048】
エクスビボ法が使用される場合、細胞又は組織は、当該技術分野で公知の標準プロトコ
ルに従って除去して、体外で維持することができる。組成物は、例えば、リン酸カルシウ
ム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション又はプロテオリ
ポソームなどの任意の遺伝子導入機構を介して細胞内に導入することができる。次いで、
形質導入細胞は、（例えば、薬学的に許容される担体に）注入するか又は細胞若しくは組
織種類に対する標準的方法を通じて、被験者に同型で移植して戻すことができる。標準的
方法は、被験体内への様々な細胞の移植又は注入として既知である。
ルに従って除去して、体外で維持することができる。組成物は、例えば、リン酸カルシウ
ム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション又はプロテオリ
ポソームなどの任意の遺伝子導入機構を介して細胞内に導入することができる。次いで、
形質導入細胞は、（例えば、薬学的に許容される担体に）注入するか又は細胞若しくは組
織種類に対する標準的方法を通じて、被験者に同型で移植して戻すことができる。標準的
方法は、被験体内への様々な細胞の移植又は注入として既知である。
【0049】
発現系
細胞に送達される核酸は、発現制御系を一般的に含む。例えば、ウイルス又はレトロウ
イルスの系に挿入された遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるためのプ
ロモーター及び／又はエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に
関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは
、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、
上流エレメント及び応答エレメントを含むことができる。
細胞に送達される核酸は、発現制御系を一般的に含む。例えば、ウイルス又はレトロウ
イルスの系に挿入された遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるためのプ
ロモーター及び／又はエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に
関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは
、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、
上流エレメント及び応答エレメントを含むことができる。
【0050】
ａ）ウイルスプロモーター及びエンハンサー
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様
々な起源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、
レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなど、最も好ましくは、サイトメガロウイルスなどの
ウイルスのゲノムから、又は非相同哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモー
ターから得てもよい。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、Ｓ
Ｖ４０ウイルスの複製起点もまた含む、ＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる
（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイ
トメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして
簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５～
３６０（１９８２））。当然ながら、宿主細胞又は関連する種からのプロモーターもまた
、本明細書において有用である。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様
々な起源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、
レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなど、最も好ましくは、サイトメガロウイルスなどの
ウイルスのゲノムから、又は非相同哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモー
ターから得てもよい。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、Ｓ
Ｖ４０ウイルスの複製起点もまた含む、ＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる
（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイ
トメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして
簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５～
３６０（１９８２））。当然ながら、宿主細胞又は関連する種からのプロモーターもまた
、本明細書において有用である。
【0051】
エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から不定の距離で機能するＤＮＡの配列を指
し、転写ユニットに対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））又は３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかに存
在し得る。更に、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ
．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、及びコーディング配列それ自体内（Ｏｓｂ
ｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８
４））に存在し得る。エンハンサーは、通常、１０～３００ｂｐの長さであり、シス型で
機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大させるよう機能する。
エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答性のエレメントをしばしば含む。プロモ
ーターもまた、転写の調節を媒介する応答性のエレメントを含み得る。エンハンサーは、
遺伝子の発現の調節を多くの場合決定する。現在、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラス
ターゼ、アルブミン、－フェトプロテイン及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配
列が知られているが、一般的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが一般的な
発現のために使用されることとなる。好ましい例は、複製起点（ｂｐ１００～２７０）の
後位置のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、
複製起点の後位置のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーである。
し、転写ユニットに対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））又は３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかに存
在し得る。更に、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ
．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、及びコーディング配列それ自体内（Ｏｓｂ
ｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８
４））に存在し得る。エンハンサーは、通常、１０～３００ｂｐの長さであり、シス型で
機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大させるよう機能する。
エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答性のエレメントをしばしば含む。プロモ
ーターもまた、転写の調節を媒介する応答性のエレメントを含み得る。エンハンサーは、
遺伝子の発現の調節を多くの場合決定する。現在、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラス
ターゼ、アルブミン、－フェトプロテイン及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配
列が知られているが、一般的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが一般的な
発現のために使用されることとなる。好ましい例は、複製起点（ｂｐ１００～２７０）の
後位置のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、
複製起点の後位置のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーである。
【0052】
プロモーター及び／又はエンハンサーは、それらの機能を引き起こす光又は特定の化学
事象のいずれかによって特異的に活性化されてもよい。系は、テトラサイクリン及びデキ
サメタゾンなどの試薬によって制御できる。ガンマ線照射などの照射又はアルキル化化学
療法薬への曝露によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もまた存在する。
事象のいずれかによって特異的に活性化されてもよい。系は、テトラサイクリン及びデキ
サメタゾンなどの試薬によって制御できる。ガンマ線照射などの照射又はアルキル化化学
療法薬への曝露によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もまた存在する。
【0053】
ある実施形態において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、転写されるべき
転写ユニットの領域の発現を最大化するために、構成的プロモーター及び／又はエンハン
サーとして作用することができる。ある構築物において、プロモーター及び／又はエンハ
ンサー領域は、たとえそれが特定の時期に特定の型の細胞においてのみ発現する場合であ
っても、真核生物細胞の全ての種類で活性である。この種類の好ましいプロモーターは、
ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロ
モーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）及びレトロウイルスベクターＬＴ
Ｒである。いくつかの態様では、構成的プロモーターは、ＨＳＶに対する最初期遺伝子プ
ロモーターなどのウイルスバックボーンにおいて発現されるプロモーターである。したが
って、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスが本明細書
に開示され、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、例えば、ＨＳＶ ＩＥ４／５プロモーターな
どの構成的プロモーターに操作可能に結合されている。
転写ユニットの領域の発現を最大化するために、構成的プロモーター及び／又はエンハン
サーとして作用することができる。ある構築物において、プロモーター及び／又はエンハ
ンサー領域は、たとえそれが特定の時期に特定の型の細胞においてのみ発現する場合であ
っても、真核生物細胞の全ての種類で活性である。この種類の好ましいプロモーターは、
ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロ
モーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）及びレトロウイルスベクターＬＴ
Ｒである。いくつかの態様では、構成的プロモーターは、ＨＳＶに対する最初期遺伝子プ
ロモーターなどのウイルスバックボーンにおいて発現されるプロモーターである。したが
って、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスが本明細書
に開示され、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、例えば、ＨＳＶ ＩＥ４／５プロモーターな
どの構成的プロモーターに操作可能に結合されている。
【0054】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の組織への発現を制限するための、一
定の条件が成立するとき又は管理医師が発現を開始かつ／又は停止したいときの、組織特
異的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当該技術
分野で既知の任意の誘導性プロモーターを含むことができ、テトラサイクリン誘導性トラ
ンスジェニックシステム（テトラサイクリン転写活性化因子（ｔＴＡ）又は「Ｔｅｔ－Ｏ
ｆｆ」及び逆テトラサイクリン転写活性化因子（ｒｔＴＡ）又は「Ｔｅｔ－Ｏｎ」）及び
Ｃｒｅ－ｌｏｘが挙げられるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターは、発
現が特定の組織／細胞型に制限されるプロモーターである。組織特異的プロモーターは、
当該技術分野で公知であり、既知又は市販の任意の組織特異的プロモーターを含むことが
できる。組織特異的プロモーターの選択は、発現が望まれる細胞型に基づく。したがって
、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスが本明細書に開
示され、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーター
に操作可能に結合されている。
定の条件が成立するとき又は管理医師が発現を開始かつ／又は停止したいときの、組織特
異的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当該技術
分野で既知の任意の誘導性プロモーターを含むことができ、テトラサイクリン誘導性トラ
ンスジェニックシステム（テトラサイクリン転写活性化因子（ｔＴＡ）又は「Ｔｅｔ－Ｏ
ｆｆ」及び逆テトラサイクリン転写活性化因子（ｒｔＴＡ）又は「Ｔｅｔ－Ｏｎ」）及び
Ｃｒｅ－ｌｏｘが挙げられるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターは、発
現が特定の組織／細胞型に制限されるプロモーターである。組織特異的プロモーターは、
当該技術分野で公知であり、既知又は市販の任意の組織特異的プロモーターを含むことが
できる。組織特異的プロモーターの選択は、発現が望まれる細胞型に基づく。したがって
、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルスが本明細書に開
示され、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子は、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーター
に操作可能に結合されている。
【0055】
全ての特定の制御エレメントを、コンストラクト発現ベクターにクローニングして、使
用することができ、それは、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現するこ
とが明らかになっている。グリア線維性酢酸性タンパク質（glial fibrillary acetic pr
otein、ＧＦＡＰ）のプロモーターは、膠細胞起源の細胞において選択的に遺伝子を発現
するのに使用されている。
用することができ、それは、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現するこ
とが明らかになっている。グリア線維性酢酸性タンパク質（glial fibrillary acetic pr
otein、ＧＦＡＰ）のプロモーターは、膠細胞起源の細胞において選択的に遺伝子を発現
するのに使用されている。
【0056】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）に用いられる
発現ベクターはまた、転写の終止に必要な配列を含んでいてもよく、これはｍＲＮＡの発
現に影響を及ぼす。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの未翻訳
部分においてポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写
終結部位を含む。転写単位がポリアデニル化領域もまた含むことが好ましい。この領域の
１つの利点は、それが転写単位をｍＲＮＡのように加工及び輸送する可能性を高めること
である。発現コンストラクトにおけるポリアデニル化シグナルの同定及び使用は、よく確
立されている。同種のポリアデニル化シグナルが導入遺伝子コンストラクトにおいて使用
されることが好ましい。ある転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポ
リアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写単位が他の標準的な配列を
単独で、又は上述の配列と組み合わせて含み、コンストラクトからの発現、又はその安定
性を向上させることもまた好ましい。
発現ベクターはまた、転写の終止に必要な配列を含んでいてもよく、これはｍＲＮＡの発
現に影響を及ぼす。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの未翻訳
部分においてポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写
終結部位を含む。転写単位がポリアデニル化領域もまた含むことが好ましい。この領域の
１つの利点は、それが転写単位をｍＲＮＡのように加工及び輸送する可能性を高めること
である。発現コンストラクトにおけるポリアデニル化シグナルの同定及び使用は、よく確
立されている。同種のポリアデニル化シグナルが導入遺伝子コンストラクトにおいて使用
されることが好ましい。ある転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポ
リアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写単位が他の標準的な配列を
単独で、又は上述の配列と組み合わせて含み、コンストラクトからの発現、又はその安定
性を向上させることもまた好ましい。
【0057】
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産
物は、遺伝子が細胞に送達され、送達された後に発現されるかどうかを確認するために使
用される。好ましいマーカー遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃ
Ｚ遺伝子及び緑色蛍光タンパク質である。
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産
物は、遺伝子が細胞に送達され、送達された後に発現されるかどうかを確認するために使
用される。好ましいマーカー遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃ
Ｚ遺伝子及び緑色蛍光タンパク質である。
【0058】
いくつかの実施形態では、マーカーは、選択可能マーカーであってもよい。哺乳動物細
胞に対する好適な選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、
チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイドロマイシン（hy
dromycin）及びピューロマイシンが挙げられる。このような選択可能マーカーが哺乳動物
宿主細胞に成功裏に導入されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧に置かれ
た場合に生存することができる。広く使用されている２つの異なるカテゴリの選択体制が
存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝と、補充された培地と独立して増殖する能力を
欠落する変異細胞株の使用とに基づく。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬ
ＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養素の添加な
しで増殖する能力を欠落する。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特
定の遺伝子を欠損しているので、失われたヌクレオチドが補充された培地中に供給されな
ければ生存できない。培地を補充することの代替としては、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝
子を、対応する遺伝子を欠損している細胞へと導入し、それによってそれらの増殖要求を
改変することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子によって形質転換されなかった個々の細胞
は、無添加培地において生存することができない。
胞に対する好適な選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、
チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイドロマイシン（hy
dromycin）及びピューロマイシンが挙げられる。このような選択可能マーカーが哺乳動物
宿主細胞に成功裏に導入されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧に置かれ
た場合に生存することができる。広く使用されている２つの異なるカテゴリの選択体制が
存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝と、補充された培地と独立して増殖する能力を
欠落する変異細胞株の使用とに基づく。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬ
ＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養素の添加な
しで増殖する能力を欠落する。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特
定の遺伝子を欠損しているので、失われたヌクレオチドが補充された培地中に供給されな
ければ生存できない。培地を補充することの代替としては、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝
子を、対応する遺伝子を欠損している細胞へと導入し、それによってそれらの増殖要求を
改変することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子によって形質転換されなかった個々の細胞
は、無添加培地において生存することができない。
【0059】
第２のカテゴリは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用
を必要としない、優性選択である。これらのスキームは、一般的には、宿主細胞の増殖を
停止するための薬剤を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性をもたら
すタンパク質を発現し、選択を生き延びることができる。そのような優性選択の例は、薬
物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ
，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））又
はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
５：４１０～４１３（１９８５））を使用する。それらの３つの例は、真核生物の制御下
で細菌の遺伝子を使用し、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８若しくはネオマイシン（ジェネ
ティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性をもたら
す。他は、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューラマイシンを含む。
を必要としない、優性選択である。これらのスキームは、一般的には、宿主細胞の増殖を
停止するための薬剤を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性をもたら
すタンパク質を発現し、選択を生き延びることができる。そのような優性選択の例は、薬
物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ
，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））又
はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
５：４１０～４１３（１９８５））を使用する。それらの３つの例は、真核生物の制御下
で細菌の遺伝子を使用し、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８若しくはネオマイシン（ジェネ
ティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性をもたら
す。他は、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューラマイシンを含む。
【0060】
配列類似性
本明細書で論じられる場合、相同性及び同一性という語句の使用は、類似性と同じこと
を意味すると理解される。したがって、例えば、相同性という語の使用が２つの非天然配
列間で使用される場合、これが必ずしもこれらの２つ配列間の進化的関係を示さないが、
むしろそれらの核酸配列間の類似度又は関連性に注目していると理解される。進化的に関
連する２つの分子間の相同性を決定するための方法の多くは、任意の２つ以上の核酸又は
タンパク質に、それらが進化的に関連するか否かに関わらず、配列類似性を測定する目的
で規定どおりに適用される。
本明細書で論じられる場合、相同性及び同一性という語句の使用は、類似性と同じこと
を意味すると理解される。したがって、例えば、相同性という語の使用が２つの非天然配
列間で使用される場合、これが必ずしもこれらの２つ配列間の進化的関係を示さないが、
むしろそれらの核酸配列間の類似度又は関連性に注目していると理解される。進化的に関
連する２つの分子間の相同性を決定するための方法の多くは、任意の２つ以上の核酸又は
タンパク質に、それらが進化的に関連するか否かに関わらず、配列類似性を測定する目的
で規定どおりに適用される。
【0061】
本明細書で開示される遺伝子及びタンパク質のうちの任意の既知の変異体及び誘導体又
は起こり得るものを決定するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性に関
して変異体及び誘導体を定義することによるものであることが理解される。例えば、配列
番号１は、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子の特定の配列を明示する。具体的には、記載された
配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９
、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、
９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの相同性を有する、本明細書で開
示されるこれら及び他の遺伝子及びタンパク質の変異体が開示される。当業者は、２つの
タンパク質又は遺伝子などの２つの核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例え
ば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配列をアライメントした後に
算出することができる。
は起こり得るものを決定するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性に関
して変異体及び誘導体を定義することによるものであることが理解される。例えば、配列
番号１は、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子の特定の配列を明示する。具体的には、記載された
配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９
、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、
９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの相同性を有する、本明細書で開
示されるこれら及び他の遺伝子及びタンパク質の変異体が開示される。当業者は、２つの
タンパク質又は遺伝子などの２つの核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例え
ば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配列をアライメントした後に
算出することができる。
【0062】
一般的に、本明細書で開示される遺伝子及びタンパク質のうちの任意の既知の変異体及
び誘導体又は起こり得るものを決定するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する
相同性に関して変異体及び誘導体を定義することによるものであることが理解される。本
明細書で開示される特定の配列の同一性もまた、本明細書の他の個所で論じられる。一般
的には、本明細書で開示される遺伝子及びタンパク質の変異体は、典型的には、記載され
た配列又は天然配列に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６
、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、
９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの相同性を
有する。当業者は、２つのタンパク質又は遺伝子などの２つの核酸の相同性を決定する方
法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配
列をアライメントした後に算出することができる。
び誘導体又は起こり得るものを決定するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する
相同性に関して変異体及び誘導体を定義することによるものであることが理解される。本
明細書で開示される特定の配列の同一性もまた、本明細書の他の個所で論じられる。一般
的には、本明細書で開示される遺伝子及びタンパク質の変異体は、典型的には、記載され
た配列又は天然配列に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６
、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、
９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの相同性を
有する。当業者は、２つのタンパク質又は遺伝子などの２つの核酸の相同性を決定する方
法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配
列をアライメントした後に算出することができる。
【0063】
相同性を算出する他の方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比
較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄ
ｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１
９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐ
ｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８
８）の類似性に関する検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、
ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実施によって、
又はインスペクションによって行われてもよい。
較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄ
ｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１
９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐ
ｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８
８）の類似性に関する検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、
ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実施によって、
又はインスペクションによって行われてもよい。
【0064】
方法のうちの任意を一般的に使用することができること、特定の場合には、これらの様
々な方法の結果が異なってもよいことが理解されるが、当業者は、同一性がこれらの方法
のうちの少なくとも１つにより見出される場合、配列が記載された同一性を有すると言え
るであろうこと、及び本明細書で開示されているであろうことが理解される。
々な方法の結果が異なってもよいことが理解されるが、当業者は、同一性がこれらの方法
のうちの少なくとも１つにより見出される場合、配列が記載された同一性を有すると言え
るであろうこと、及び本明細書で開示されているであろうことが理解される。
【0065】
例えば、本明細書で使用するとき、他の配列と特定のパーセントの相同性を有している
と記載された配列は、上述の計算法のうちの任意の１つ以上によって計算されたとして記
載された相同性を有する配列を指す。例えば、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法を用いて第
２の配列と８０パーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列が他の計
算法のいずれかによって計算されたように第２の配列と８０パーセントの相同性を有さな
い場合であっても、第１の配列は、本明細書で定義されたように、第２の配列と８０パー
セントの相同性を有する。別の例として、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法及びＰｅａｒｓ
ｏｎ－Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を用いて第２の配列と８０パーセントの相同性を有する
ように計算される場合、第１の配列がＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌ
ｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法又は他の計算法のうちのいずれかに
よって計算されたように第２の配列と８０パーセントの相同性を有さない場合であっても
、第１の配列は、本明細書で定義されたように、第２の配列と８０パーセントの相同性を
有する。更に別の例として、第１の配列が計算法のそれぞれを用いて第２の配列と８０パ
ーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列は、本明細書で定義された
ように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する（ただし、実際には、異なる計算
法は、多くの場合、異なる計算相同性百分率をもたらすこととなる）。
と記載された配列は、上述の計算法のうちの任意の１つ以上によって計算されたとして記
載された相同性を有する配列を指す。例えば、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法を用いて第
２の配列と８０パーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列が他の計
算法のいずれかによって計算されたように第２の配列と８０パーセントの相同性を有さな
い場合であっても、第１の配列は、本明細書で定義されたように、第２の配列と８０パー
セントの相同性を有する。別の例として、第１の配列がＺｕｋｅｒ計算法及びＰｅａｒｓ
ｏｎ－Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を用いて第２の配列と８０パーセントの相同性を有する
ように計算される場合、第１の配列がＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌ
ｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法又は他の計算法のうちのいずれかに
よって計算されたように第２の配列と８０パーセントの相同性を有さない場合であっても
、第１の配列は、本明細書で定義されたように、第２の配列と８０パーセントの相同性を
有する。更に別の例として、第１の配列が計算法のそれぞれを用いて第２の配列と８０パ
ーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列は、本明細書で定義された
ように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する（ただし、実際には、異なる計算
法は、多くの場合、異なる計算相同性百分率をもたらすこととなる）。
【0066】
ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
用語ハイブリダイゼーションは、プライマー又はプローブ及び遺伝子などの少なくとも
２つの核酸分子間の配列駆動相互作用を、一般的に意味する。配列駆動相互作用は、２つ
のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はヌクレオチド誘導体の間にヌクレオチド特異
的な様式で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ又はＴと相互作用す
るＡは、配列駆動相互作用である。一般的に、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワト
ソン－クリック面又はフーグスティーン面の上で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼー
ションは、当業者に既知の多くの条件及びパラメータにより影響を受ける。例えば、反応
の塩濃度、ｐＨ及び温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズすることとなるかどう
かに影響を与える。
用語ハイブリダイゼーションは、プライマー又はプローブ及び遺伝子などの少なくとも
２つの核酸分子間の配列駆動相互作用を、一般的に意味する。配列駆動相互作用は、２つ
のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はヌクレオチド誘導体の間にヌクレオチド特異
的な様式で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ又はＴと相互作用す
るＡは、配列駆動相互作用である。一般的に、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワト
ソン－クリック面又はフーグスティーン面の上で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼー
ションは、当業者に既知の多くの条件及びパラメータにより影響を受ける。例えば、反応
の塩濃度、ｐＨ及び温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズすることとなるかどう
かに影響を与える。
【0067】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのためのパラメータは、当業者に公
知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程及び洗浄工
程のいずれか一方又は両方の、温度及び塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択
的ハイブリダイゼーションを達成するハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半
分がそのハイブリダイゼーション相手から解離する融点）未満の約１２～２５℃の温度で
の高イオン強度溶液（６Ｘ ＳＳＣ又は６Ｘ ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーション
と、それに続く、洗浄温度がＴｍ未満の約５℃～約２０℃となるように選択された温度及
び塩濃度の組み合わせで洗浄されることを含んでもよい。温度及び塩条件は、フィルタに
固定化された基準ＤＮＡの試料を対象の標識核酸にハイブリダイズさせた後、異なるスト
リンジェンシーの条件下で洗浄した予備実験において、経験的に容易に決定される。ハイ
ブリダイゼーション温度は、一般的には、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション及びＲ
ＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションについてはより高い。条件は、ストリンジェンシー
を達成するために上記のように、又当該技術分野で既知であるように使用することができ
る。ＤＮＡに対して好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件。ＤＮＡハ
イブリダイゼーションは、６Ｘ ＳＳＣ又は６Ｘ ＳＳＰＥ中で（水溶液中で）約６８℃
にあり、その後６８℃で洗浄することができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄のスト
リンジェンシーは、所望する場合、所望する相補性の程度が減少するに従って、また更に
、可変性が探索される任意の領域のＧ－Ｃ又はＡ－Ｔの豊富度に応じて、低減することが
できる。同様に、ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、所望する場
合、所望する相同性が増加するに従って、また更に、高い相同性が所望される任意の領域
のＧ－Ｃ又はＡ－Ｔの豊富度に応じて、全て当該技術分野で既知のように、増加させるこ
とができる。
知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程及び洗浄工
程のいずれか一方又は両方の、温度及び塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択
的ハイブリダイゼーションを達成するハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半
分がそのハイブリダイゼーション相手から解離する融点）未満の約１２～２５℃の温度で
の高イオン強度溶液（６Ｘ ＳＳＣ又は６Ｘ ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーション
と、それに続く、洗浄温度がＴｍ未満の約５℃～約２０℃となるように選択された温度及
び塩濃度の組み合わせで洗浄されることを含んでもよい。温度及び塩条件は、フィルタに
固定化された基準ＤＮＡの試料を対象の標識核酸にハイブリダイズさせた後、異なるスト
リンジェンシーの条件下で洗浄した予備実験において、経験的に容易に決定される。ハイ
ブリダイゼーション温度は、一般的には、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション及びＲ
ＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションについてはより高い。条件は、ストリンジェンシー
を達成するために上記のように、又当該技術分野で既知であるように使用することができ
る。ＤＮＡに対して好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件。ＤＮＡハ
イブリダイゼーションは、６Ｘ ＳＳＣ又は６Ｘ ＳＳＰＥ中で（水溶液中で）約６８℃
にあり、その後６８℃で洗浄することができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄のスト
リンジェンシーは、所望する場合、所望する相補性の程度が減少するに従って、また更に
、可変性が探索される任意の領域のＧ－Ｃ又はＡ－Ｔの豊富度に応じて、低減することが
できる。同様に、ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェンシーは、所望する場
合、所望する相同性が増加するに従って、また更に、高い相同性が所望される任意の領域
のＧ－Ｃ又はＡ－Ｔの豊富度に応じて、全て当該技術分野で既知のように、増加させるこ
とができる。
【0068】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するための別の方法は、別の核酸に結合した核酸
のうちの１つの量（百分率）に注目することによる。例えば、いくつかの実施形態では、
選択的ハイブリダイゼーション条件は、制限核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１
、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、
８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９
８、９９、１００パーセントが、非制限核酸に結合されているときであろう。一般的には
、非制限プライマーは、例えば、１０又は１００又は１０００倍過剰である。このタイプ
のアッセイは、制限プライマー及び非制限プライマーの両方が、例えば、それらのｋｄ未
満である１０倍若しくは１００倍若しくは１０００倍であるか、又は核酸分子の１つのみ
が１０倍又は１００倍又は１０００倍であるか、又は核酸分子の一方又は両方がそれらの
ｋｄを超える条件下で行うことができる。
のうちの１つの量（百分率）に注目することによる。例えば、いくつかの実施形態では、
選択的ハイブリダイゼーション条件は、制限核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１
、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、
８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９
８、９９、１００パーセントが、非制限核酸に結合されているときであろう。一般的には
、非制限プライマーは、例えば、１０又は１００又は１０００倍過剰である。このタイプ
のアッセイは、制限プライマー及び非制限プライマーの両方が、例えば、それらのｋｄ未
満である１０倍若しくは１００倍若しくは１０００倍であるか、又は核酸分子の１つのみ
が１０倍又は１００倍又は１０００倍であるか、又は核酸分子の一方又は両方がそれらの
ｋｄを超える条件下で行うことができる。
【0069】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するための別の方法は、所望の酵素的操作を促進
するためにハイブリダイゼーションが必要な条件下で酵素的操作を受けたプライマーの百
分率に注目することである。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼー
ション条件は、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、
７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８
８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パー
セントが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的操作されるときであろう。例えば、酵素
的操作がＤＮＡ伸長である場合には、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマー
分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７
８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１
、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長される場
合であろう。好ましい条件はまた、酵素が操作を行うために適切であるとして製造メーカ
によって提案された又は当該技術分野で示された条件を含む。
するためにハイブリダイゼーションが必要な条件下で酵素的操作を受けたプライマーの百
分率に注目することである。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリダイゼー
ション条件は、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、
７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８
８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パー
セントが、酵素的操作を促進する条件下で酵素的操作されるときであろう。例えば、酵素
的操作がＤＮＡ伸長である場合には、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマー
分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７
８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１
、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長される場
合であろう。好ましい条件はまた、酵素が操作を行うために適切であるとして製造メーカ
によって提案された又は当該技術分野で示された条件を含む。
【0070】
相同性と同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するため
に本明細書に開示される様々な方法が存在することが理解される。これらの方法及び条件
が、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの異なる割合を提供してもよく、特に指
示しない限り、方法のいずれかのパラメータを満たすことが十分であろうことが理解され
る。例えば、８０％ハイブリダイゼーションが必要であり、ハイブリダイゼーションがこ
れらの方法のいずれか１つにおける必要なパラメータの範囲内で起こる場合に限り、本明
細書で開示されたと考えられる。
に本明細書に開示される様々な方法が存在することが理解される。これらの方法及び条件
が、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの異なる割合を提供してもよく、特に指
示しない限り、方法のいずれかのパラメータを満たすことが十分であろうことが理解され
る。例えば、８０％ハイブリダイゼーションが必要であり、ハイブリダイゼーションがこ
れらの方法のいずれか１つにおける必要なパラメータの範囲内で起こる場合に限り、本明
細書で開示されたと考えられる。
【0071】
組成物又は方法が、全体で又は個別のいずれかで、ハイブリダイゼーションを決定する
ためのこれらの基準のいずれか１つに適合する場合、本明細書で開示される組成物又は方
法であることを当業者が理解するものと理解される。
ためのこれらの基準のいずれか１つに適合する場合、本明細書で開示される組成物又は方
法であることを当業者が理解するものと理解される。
【0072】
核酸
核酸系である、本明細書で開示される様々な分子があり、例えば、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
をコードする核酸又はこれらのフラグメント及び様々な機能性核酸を含む。開示される核
酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体からなる。こ
れらの分子及び他の分子の非限定的な例は、本明細書において議論されている。例えば、
細胞内でベクターが発現されるとき、発現されたｍＲＮＡは、一般的には、Ａ、Ｃ、Ｇ及
びＵからなることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因性
の送達を通じて細胞又は細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境にお
けるアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体からなることが有益であるこ
とが理解される。
核酸系である、本明細書で開示される様々な分子があり、例えば、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
をコードする核酸又はこれらのフラグメント及び様々な機能性核酸を含む。開示される核
酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体からなる。こ
れらの分子及び他の分子の非限定的な例は、本明細書において議論されている。例えば、
細胞内でベクターが発現されるとき、発現されたｍＲＮＡは、一般的には、Ａ、Ｃ、Ｇ及
びＵからなることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因性
の送達を通じて細胞又は細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境にお
けるアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体からなることが有益であるこ
とが理解される。
【0073】
ａ）ヌクレオチド及び関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは
、ヌクレオシド間結合を生成するそれらのリン酸部分及び糖部分を通じて結合され得る。
ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グ
アニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）及びチミン－１－イル（Ｔ）であり
得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドの
リン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、３’－ＡＭＰ（３’－
アデノシンモノリン酸）又は５’－ＧＭＰ（５’－グアノシンモノリン酸）であろう。当
該技術分野において利用可能な多数の様々のこれらの種類の分子が存在し、本明細書にお
いて利用可能である。
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは
、ヌクレオシド間結合を生成するそれらのリン酸部分及び糖部分を通じて結合され得る。
ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グ
アニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）及びチミン－１－イル（Ｔ）であり
得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドの
リン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、３’－ＡＭＰ（３’－
アデノシンモノリン酸）又は５’－ＧＭＰ（５’－グアノシンモノリン酸）であろう。当
該技術分野において利用可能な多数の様々のこれらの種類の分子が存在し、本明細書にお
いて利用可能である。
【0074】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖又はリン酸部分のいずれかにある種の修飾を含むヌク
レオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は、当該技術分野において公知であり、例え
ば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン
、ヒポキサンチン及び２－アミノアデニン、並びに糖部分又はリン酸部分における修飾が
挙げられる。当該技術分野において利用可能な多数の様々のこれらの種類の分子が存在し
、本明細書において利用可能である。
レオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は、当該技術分野において公知であり、例え
ば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン
、ヒポキサンチン及び２－アミノアデニン、並びに糖部分又はリン酸部分における修飾が
挙げられる。当該技術分野において利用可能な多数の様々のこれらの種類の分子が存在し
、本明細書において利用可能である。
【0075】
ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドに対して同様の機能性を有するが、ペプチド核酸
（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン－
クリック又はフーグスティーンの様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通じ
て共に結合する分子である。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用する際に
二重らせん型構造に適合することができる。当該技術分野において利用可能な多数の様々
のこれらの種類の分子が存在し、本明細書において利用可能である。
（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン－
クリック又はフーグスティーンの様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通じ
て共に結合する分子である。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用する際に
二重らせん型構造に適合することができる。当該技術分野において利用可能な多数の様々
のこれらの種類の分子が存在し、本明細書において利用可能である。
【0076】
他の種類の分子（コンジュゲート）をヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に結合させ
て、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチ
ド又はヌクレオチド類似体に化学結合することができる。このようなコンジュゲートとし
ては、コレステロール部分のような脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。（
Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
１９８９，８６，６５５３～６５５６）。当該技術分野において利用可能な多数の様々の
これらの種類の分子が存在し、本明細書において利用可能である。
て、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチ
ド又はヌクレオチド類似体に化学結合することができる。このようなコンジュゲートとし
ては、コレステロール部分のような脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。（
Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
１９８９，８６，６５５３～６５５６）。当該技術分野において利用可能な多数の様々の
これらの種類の分子が存在し、本明細書において利用可能である。
【0077】
ワトソン－クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド
置換体のワトソン－クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌ
クレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のワトソン－クリック面は、プリン塩基ヌクレ
オチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のＣ２位、Ｎ１位及びＣ６位、並び
にピリミジン塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のＣ２位、
Ｎ３位、Ｃ４位を含む。
置換体のワトソン－クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌ
クレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のワトソン－クリック面は、プリン塩基ヌクレ
オチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のＣ２位、Ｎ１位及びＣ６位、並び
にピリミジン塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のＣ２位、
Ｎ３位、Ｃ４位を含む。
【0078】
フーグスティーン相互作用は、二本鎖ＤＮＡの主溝において露出したヌクレオチド又は
ヌクレオチド類似体のフーグスティーン面で起こる相互作用である。フーグスティーン面
は、プリンヌクレオチドのＮ７位及びＣ６位における反応性基（ＮＨ２又はＯ）を含む。
ヌクレオチド類似体のフーグスティーン面で起こる相互作用である。フーグスティーン面
は、プリンヌクレオチドのＮ７位及びＣ６位における反応性基（ＮＨ２又はＯ）を含む。
【0079】
ｂ）配列
本明細書で開示されるシグナル伝達経路に関与するタンパク質分子に関連する様々な配
列が存在し、例えば、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ又はＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを作製するために本明
細書で開示される核酸のいずれかであり、これらの全ては、核酸によってコードされるか
又は核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体及び他の類似体、及びこれらの遺伝子の対
立遺伝子、及びスプライス変異体、及び他の種類の変異体についての配列は、Ｇｅｎｂａ
ｎｋを含む、様々なタンパク質及び遺伝子のデータベースにおいて利用可能である。配列
の矛盾及び相違をいかに解決するか、特定の配列に関する組成物及び方法を、他の関連す
る配列のためにいかに適応させるかについて、当業者は理解する。プライマー及び／又は
プローブは、本明細書に開示されている情報が与えられた任意の配列について設計するこ
とができ、当該技術分野で既知である。
本明細書で開示されるシグナル伝達経路に関与するタンパク質分子に関連する様々な配
列が存在し、例えば、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ又はＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを作製するために本明
細書で開示される核酸のいずれかであり、これらの全ては、核酸によってコードされるか
又は核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体及び他の類似体、及びこれらの遺伝子の対
立遺伝子、及びスプライス変異体、及び他の種類の変異体についての配列は、Ｇｅｎｂａ
ｎｋを含む、様々なタンパク質及び遺伝子のデータベースにおいて利用可能である。配列
の矛盾及び相違をいかに解決するか、特定の配列に関する組成物及び方法を、他の関連す
る配列のためにいかに適応させるかについて、当業者は理解する。プライマー及び／又は
プローブは、本明細書に開示されている情報が与えられた任意の配列について設計するこ
とができ、当該技術分野で既知である。
【0080】
医薬担体／医薬品の送達
上述のように、組成物はまた、薬学的に許容される担体中で、インビボで投与され得る
。「薬学的に許容される」とは、生物学的に又はその他の点で望ましい物質を意味し、す
なわち、その物質は、望ましくない生物学的効果をいずれも引き起こすことなく、又は物
質が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核
酸又はベクターと共に被験体に投与されてもよい。担体は、当業者に公知であるように、
活性成分の分解を最小限にするように、かつ被験体における任意の有害な副作用を最小限
にするように、当然選択されるであろう。
上述のように、組成物はまた、薬学的に許容される担体中で、インビボで投与され得る
。「薬学的に許容される」とは、生物学的に又はその他の点で望ましい物質を意味し、す
なわち、その物質は、望ましくない生物学的効果をいずれも引き起こすことなく、又は物
質が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核
酸又はベクターと共に被験体に投与されてもよい。担体は、当業者に公知であるように、
活性成分の分解を最小限にするように、かつ被験体における任意の有害な副作用を最小限
にするように、当然選択されるであろう。
【0081】
組成物は、局所鼻腔内投与又は吸入による投与を含んで、経口的に、非経口的に（例え
ば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外に、局所的
になどで投与されてもよい。本明細書で使用するとき、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一
方又は両方を通る鼻及び鼻腔への組成物の送達を意味し、噴霧機構若しくは液滴機構によ
る送達又は核酸若しくはベクターのエアロゾル化を介した送達を含むことができる。吸入
による組成物の投与は、噴霧機構又は液滴機構による送達を介して鼻又は口を通して行う
ことができる。送達はまた、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に対して
直接行うことができる。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の人種、年齢、体重及
び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸又はベクター
、組成物の投与様式などに依存して、被験体によって異なるであろう。したがって、全て
の組成物の正確な量を指定することは不可能である。しかし、適量は、本明細書の教示に
鑑みて、通常の実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
ば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外に、局所的
になどで投与されてもよい。本明細書で使用するとき、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一
方又は両方を通る鼻及び鼻腔への組成物の送達を意味し、噴霧機構若しくは液滴機構によ
る送達又は核酸若しくはベクターのエアロゾル化を介した送達を含むことができる。吸入
による組成物の投与は、噴霧機構又は液滴機構による送達を介して鼻又は口を通して行う
ことができる。送達はまた、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に対して
直接行うことができる。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の人種、年齢、体重及
び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸又はベクター
、組成物の投与様式などに依存して、被験体によって異なるであろう。したがって、全て
の組成物の正確な量を指定することは不可能である。しかし、適量は、本明細書の教示に
鑑みて、通常の実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【0082】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に注射を特徴とする。注射剤は、溶液若
しくは懸濁液、注射前における液体での溶解又は懸濁に好適な固形、又は乳剤のいずれか
として、従来の形態で調製されてよい。非経口投与についてごく最近改良された方法は、
一定用量が維持されるように徐放系又は持続放出系の使用を伴う。例えば、参照により本
明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
しくは懸濁液、注射前における液体での溶解又は懸濁に好適な固形、又は乳剤のいずれか
として、従来の形態で調製されてよい。非経口投与についてごく最近改良された方法は、
一定用量が維持されるように徐放系又は持続放出系の使用を伴う。例えば、参照により本
明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【0083】
材料は、溶液、（例えば、微小粒子、リポソーム又は細胞に組み込まれた）懸濁液であ
ってもよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的と
してもよい。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技
術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈ
ｅｍ．，２：４４７～４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５～２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．
，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００～７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３～９，（１９９３）；Ｂａｔ
ｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，
３５：４２１～４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７～８０，（１９９２）；及びＲｏｆ
ｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２～２０
６５，（１９９１））。「ステルス」などのビヒクル及び（結腸癌を標的とする脂質介在
性薬物を含む）他の抗体共役リポソーム、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体介
在性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、並びにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高特
異的治療的レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標
的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４～６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇ
ｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃ
ｔａ，１１０４：１７９～１８７，（１９９２））。全般的に、受容体は、構成的誘発性
又はリガンド誘発性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被
覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受
容体が分別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細胞
内に保存されるか又はリポソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄
養取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日
和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節などの多様な機能を果たす
。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガンド
濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体介在性エンドサイトーシスの分子機
構及び細胞機構がレビューされている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａ
ｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９～４０９（１９９１））。
ってもよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的と
してもよい。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技
術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈ
ｅｍ．，２：４４７～４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５～２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．
，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００～７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３～９，（１９９３）；Ｂａｔ
ｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，
３５：４２１～４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７～８０，（１９９２）；及びＲｏｆ
ｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２～２０
６５，（１９９１））。「ステルス」などのビヒクル及び（結腸癌を標的とする脂質介在
性薬物を含む）他の抗体共役リポソーム、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体介
在性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、並びにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高特
異的治療的レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標
的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４～６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇ
ｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃ
ｔａ，１１０４：１７９～１８７，（１９９２））。全般的に、受容体は、構成的誘発性
又はリガンド誘発性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被
覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受
容体が分別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細胞
内に保存されるか又はリポソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄
養取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日
和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節などの多様な機能を果たす
。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガンド
濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体介在性エンドサイトーシスの分子機
構及び細胞機構がレビューされている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａ
ｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９～４０９（１９９１））。
【0084】
ａ）薬学的に許容される担体
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療する上で使用するこ
とができる。
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療する上で使用するこ
とができる。
【0085】
好適な担体及びこれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇ
ｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ
１９９５に記載されている。一般的には、適量の薬学的に許容される塩を製剤に使用し
て、製剤等張性（formulation isotonic）を与える。薬学的に許容される担体の例には、
生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されな
い。溶液のｐＨは、好ましくは、約５～約８、より好ましくは、約７～約７．５である。
更に、担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤を
含み、マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子である
。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体が更に好ましい場
合があることは、当業者には明白であろう。
ｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇ
ｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ
１９９５に記載されている。一般的には、適量の薬学的に許容される塩を製剤に使用し
て、製剤等張性（formulation isotonic）を与える。薬学的に許容される担体の例には、
生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されな
い。溶液のｐＨは、好ましくは、約５～約８、より好ましくは、約７～約７．５である。
更に、担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤を
含み、マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子である
。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体が更に好ましい場
合があることは、当業者には明白であろう。
【0086】
医薬担体は、当業者に既知である。これらは、最も一般的には、滅菌水、生理食塩水及
び生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的な担体である
と考えられる。組成物は、筋肉内又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業
者によって使用される標準的な手順に従って投与されることとなる。
び生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的な担体である
と考えられる。組成物は、筋肉内又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業
者によって使用される標準的な手順に従って投与されることとなる。
【0087】
医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面
活性剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの、１種
以上の有効成分を含んでもよい。
活性剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの、１種
以上の有効成分を含んでもよい。
【0088】
医薬組成物は、局所治療又は全身治療が望まれているかどうか、及び治療すべき領域に
応じて、多数の方法で投与されてもよい。投与は、（眼科的、経腟的、経直腸的、鼻腔内
を含んで）局所的に、経口的に、吸入により又は、例えば、静脈内点滴、皮下注射、腹腔
内注射若しくは筋肉内注射による非経口的にでもよい。開示される抗体は、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、腔内又は経皮的に投与することができる。
応じて、多数の方法で投与されてもよい。投与は、（眼科的、経腟的、経直腸的、鼻腔内
を含んで）局所的に、経口的に、吸入により又は、例えば、静脈内点滴、皮下注射、腹腔
内注射若しくは筋肉内注射による非経口的にでもよい。開示される抗体は、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、腔内又は経皮的に投与することができる。
【0089】
非経口的投与の製剤には、滅菌した水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションが挙
げられる。非水溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ
オイルなどの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体に
は、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸
濁液が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース
、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は不揮発性油が挙げられる。静
脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づ
く電解質補充剤など）などが挙げられる。防腐剤及び他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤
、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどとして存在してもよい。
げられる。非水溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ
オイルなどの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体に
は、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸
濁液が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース
、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は不揮発性油が挙げられる。静
脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づ
く電解質補充剤など）などが挙げられる。防腐剤及び他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤
、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどとして存在してもよい。
【0090】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐剤、スプレー
、液体及び粉末を含んでもよい。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤又は油性基剤、増
粘剤などが、必要となるか又は望ましい場合がある。
、液体及び粉末を含んでもよい。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤又は油性基剤、増
粘剤などが、必要となるか又は望ましい場合がある。
【0091】
経口投与のための組成物には、粉末若しくは顆粒、水中又は非水性媒体中の懸濁液若し
くは溶液、カプセル、小袋又はタブレットが挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化
剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。
くは溶液、カプセル、小袋又はタブレットが挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化
剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。
【0092】
組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸
及びリン酸などの無機酸並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビ
ン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸などの有機酸との反応に
よって、又は、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基
並びにモノ、ジ、トリアルキルアミン及びアリールアミン及び置換エタノールアミンなど
の有機塩基類との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩
として、投与される可能性がある場合がある。
及びリン酸などの無機酸並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビ
ン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸などの有機酸との反応に
よって、又は、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基
並びにモノ、ジ、トリアルキルアミン及びアリールアミン及び置換エタノールアミンなど
の有機塩基類との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩
として、投与される可能性がある場合がある。
【0093】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよく、その
ような決定を行うことは、当業者の技能の範囲内である。組成物の投与の用量範囲は、疾
患の症状に影響する所望の効果を生じるほど大きい用量である。用量は、望ましくない交
差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきでは
ない。一般に、用量は、年齢、状態、性別及び患者の疾患の程度、投与経路又は他の薬物
がレジメンに含まれているかどうかにより変動することとなり、当業者によって決定する
ことができる。用量は、いずれかの禁忌がある場合には、個々の医師によって調整するこ
とができる。用量は、変更することができ、毎日、１日又は数日間、１つ以上の用量の投
与において投与することができる。指針は、所与のクラスの医薬製品に対する適切な用量
に関する文献において見出すことができる。例えば、抗体について適切な用量を選択する
際の指針は、抗体の治療用途に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏ
ｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃ
ｈ．２２ ａｎｄ ｐｐ．３０３～３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ
ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐ
ｐ．３６５～３８９に見出すことができる。単独使用の抗体の一般的な１日用量は、上記
の因子に基づいて、１日につき体重１ｋｇ当たり約１μｇ～最大１００ｍｇ又はそれ以上
の範囲である場合がある。
組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよく、その
ような決定を行うことは、当業者の技能の範囲内である。組成物の投与の用量範囲は、疾
患の症状に影響する所望の効果を生じるほど大きい用量である。用量は、望ましくない交
差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきでは
ない。一般に、用量は、年齢、状態、性別及び患者の疾患の程度、投与経路又は他の薬物
がレジメンに含まれているかどうかにより変動することとなり、当業者によって決定する
ことができる。用量は、いずれかの禁忌がある場合には、個々の医師によって調整するこ
とができる。用量は、変更することができ、毎日、１日又は数日間、１つ以上の用量の投
与において投与することができる。指針は、所与のクラスの医薬製品に対する適切な用量
に関する文献において見出すことができる。例えば、抗体について適切な用量を選択する
際の指針は、抗体の治療用途に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏ
ｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃ
ｈ．２２ ａｎｄ ｐｐ．３０３～３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ
ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐ
ｐ．３６５～３８９に見出すことができる。単独使用の抗体の一般的な１日用量は、上記
の因子に基づいて、１日につき体重１ｋｇ当たり約１μｇ～最大１００ｍｇ又はそれ以上
の範囲である場合がある。
【0094】
Ｃ．癌を治療する方法
開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現組換えウイルスは、癌の治療に有効であることが理
解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、本明細書で開示されるＰＴＥ
Ｎ－Ｌｏｎｇ発現ウイルスのいずれかを被験体に投与することを含む、被験体において癌
を治療する方法が、本明細書に開示される。例えば、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌ
ｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルス（ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導入遺伝子を含む腫瘍溶解性Ｈ
ＳＶウイルスベクター、例えば、ＨＳＶ－Ｐ１０など）を被験体に投与することを含む、
被験体における癌の治療方法が、本明細書に開示される。
開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現組換えウイルスは、癌の治療に有効であることが理
解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、本明細書で開示されるＰＴＥ
Ｎ－Ｌｏｎｇ発現ウイルスのいずれかを被験体に投与することを含む、被験体において癌
を治療する方法が、本明細書に開示される。例えば、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌ
ｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイルス（ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導入遺伝子を含む腫瘍溶解性Ｈ
ＳＶウイルスベクター、例えば、ＨＳＶ－Ｐ１０など）を被験体に投与することを含む、
被験体における癌の治療方法が、本明細書に開示される。
【0095】
本明細書で開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ウイルスは、癌などの制御不能な細胞増
殖が生じる任意の疾患を治療するために使用することができる。種々の型の癌の非限定的
リストには、以下のものがある。リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、白血病、癌、固
形組織の癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽
細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、酸素欠乏腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リン
パ腫若しくは肉腫、転移性癌又は一般的な癌。
殖が生じる任意の疾患を治療するために使用することができる。種々の型の癌の非限定的
リストには、以下のものがある。リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、白血病、癌、固
形組織の癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽
細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、酸素欠乏腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リン
パ腫若しくは肉腫、転移性癌又は一般的な癌。
【0096】
開示するＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ウイルスを治療に使用することができる癌の代表的な
非限定的リストには、以下のものがある。リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、
菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部
扁平上皮癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫、膠芽腫、卵巣癌、
膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮癌、結
腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、並びに上皮癌、腎癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌
、頭頚部癌腫、大腸癌、造血性癌、精巣癌、結腸癌、並びに直腸癌。
非限定的リストには、以下のものがある。リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、
菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部
扁平上皮癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫、膠芽腫、卵巣癌、
膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮癌、結
腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、並びに上皮癌、腎癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌
、頭頚部癌腫、大腸癌、造血性癌、精巣癌、結腸癌、並びに直腸癌。
【0097】
本明細書で開示される哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを発現する組換えウイルスはまた、
子宮頸部異形成及び肛門異形成などの前癌状態、他の異形成、高度異形成上皮、過形成、
非定型過形成及び新生組織形成を治療するために使用してもよい。
子宮頸部異形成及び肛門異形成などの前癌状態、他の異形成、高度異形成上皮、過形成、
非定型過形成及び新生組織形成を治療するために使用してもよい。
【0098】
一態様では、開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ウイルスは、被験体に既に存在する癌
を阻害、低減又は治療するために治療的に投与することができる。しかし、ＰＴＥＮ－Ｌ
ｏｎｇ発現ウイルスを予防的に投与して転移を阻害又は減少させることができることもま
た、本明細書で企図される。したがって、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝
子を発現する組換えウイルスを被験体に投与することを含む、被験体における癌の転移を
阻害又は推定する方法が、本明細書に開示される。
を阻害、低減又は治療するために治療的に投与することができる。しかし、ＰＴＥＮ－Ｌ
ｏｎｇ発現ウイルスを予防的に投与して転移を阻害又は減少させることができることもま
た、本明細書で企図される。したがって、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝
子を発現する組換えウイルスを被験体に投与することを含む、被験体における癌の転移を
阻害又は推定する方法が、本明細書に開示される。
【0099】
本明細書に開示されるように、癌を治療し、阻害し、かつ／又は減少させる能力は、少
なからず、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞などの免疫細胞の浸潤が増加した結果であり得
る。一般的には、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、感染部位及び／又は癌が浸潤すること
を阻害するであろう。癌細胞は、多くの場合、ＰＤ１－ＰＤ－Ｌ１相互作用をチェックポ
イントとして利用して、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤を阻害する。ＰＤ１は、Ｔ細
胞上で発現され、そのリガンドＰＤ－Ｌ１と結合すると、シグナル伝達経路がトリガーさ
れ、増殖を阻害するＰＤ１を停止させる。癌細胞は、ＰＤ－Ｌ１を増加させて、Ｔ細胞及
びＮＫ細胞が媒介する死滅を回避する。開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現組換えウイル
スは、ＰＤ－Ｌ１の発現を阻害する。ＰＤ－Ｌ１を阻害することにより、ＰＤ１－ＰＤ－
Ｌ１チェックポイントが阻害され、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞が浸潤して癌を死滅させ
ることを可能にする。したがって、一態様では、本明細書で開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎ
ｇ発現組換えウイルスのいずれかを被験体に投与することを含む、被験体における癌の部
位で浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞及び／又は浸潤ＮＫ細胞の数を増加させる方法が、本明細書に開
示される。例えば、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイル
ス（ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導入遺伝子を含む腫瘍溶解性ＨＳＶウイルスベクター、例えば、
ＨＳＶ－Ｐ１０など）を被験体に投与することを含む、被験体における癌の部位での浸潤
ＣＤ８ Ｔ細胞及び／又は浸潤ＮＫ細胞の数を増加させる方法が、本明細書に開示される
。
なからず、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞などの免疫細胞の浸潤が増加した結果であり得
る。一般的には、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、感染部位及び／又は癌が浸潤すること
を阻害するであろう。癌細胞は、多くの場合、ＰＤ１－ＰＤ－Ｌ１相互作用をチェックポ
イントとして利用して、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤を阻害する。ＰＤ１は、Ｔ細
胞上で発現され、そのリガンドＰＤ－Ｌ１と結合すると、シグナル伝達経路がトリガーさ
れ、増殖を阻害するＰＤ１を停止させる。癌細胞は、ＰＤ－Ｌ１を増加させて、Ｔ細胞及
びＮＫ細胞が媒介する死滅を回避する。開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現組換えウイル
スは、ＰＤ－Ｌ１の発現を阻害する。ＰＤ－Ｌ１を阻害することにより、ＰＤ１－ＰＤ－
Ｌ１チェックポイントが阻害され、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞が浸潤して癌を死滅させ
ることを可能にする。したがって、一態様では、本明細書で開示されるＰＴＥＮ－Ｌｏｎ
ｇ発現組換えウイルスのいずれかを被験体に投与することを含む、被験体における癌の部
位で浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞及び／又は浸潤ＮＫ細胞の数を増加させる方法が、本明細書に開
示される。例えば、一態様では、哺乳動物ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ遺伝子を含む組換えウイル
ス（ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ導入遺伝子を含む腫瘍溶解性ＨＳＶウイルスベクター、例えば、
ＨＳＶ－Ｐ１０など）を被験体に投与することを含む、被験体における癌の部位での浸潤
ＣＤ８ Ｔ細胞及び／又は浸潤ＮＫ細胞の数を増加させる方法が、本明細書に開示される
。
【0100】
［実施例］
以下の実施例は、本明細書において特許請求の範囲に記載された化合物、組成物、物品
、デバイス及び／又は方法をどのように製造及び評価するかの完全な開示及び記載を当業
者に提供するために示され、純粋に例示的であることが意図され、開示を制限することを
意図しない。数字（例えば、量、温度など）に関して精度を保証する努力がなされたが、
ある程度の誤差及び偏差を考慮するものとする。特に記載のない限り、部分は、重量部で
あり、温度は、℃単位又は周囲温度であり、圧力は、大気圧又はほぼ大気圧である。
以下の実施例は、本明細書において特許請求の範囲に記載された化合物、組成物、物品
、デバイス及び／又は方法をどのように製造及び評価するかの完全な開示及び記載を当業
者に提供するために示され、純粋に例示的であることが意図され、開示を制限することを
意図しない。数字（例えば、量、温度など）に関して精度を保証する努力がなされたが、
ある程度の誤差及び偏差を考慮するものとする。特に記載のない限り、部分は、重量部で
あり、温度は、℃単位又は周囲温度であり、圧力は、大気圧又はほぼ大気圧である。
【0101】
（実施例１）
腫瘍溶解性ＨＳＶ－１ベクターは、ＨＳＶＱｕｉｋシステムを用いて生成された。この
システムは、神経病原性因子γ－３４．５及びウイルスリボヌクレオチドリダクターゼＩ
ＣＰ６について二重に欠失したＦ株ＨＳＶ－１である、Ｇ２０７ウイルスバックボーンを
用いる（図１Ａ）。ウイルスは、神経由来ではない腫瘍細胞において条件付きに複製され
、タンパク質キナーゼＲシグナル伝達が欠損し、分割の間に自身のリボヌクレオチドリダ
クターゼを産生する。ＰＴＥＮ－Ｌ導入遺伝子は、標準ＰＴＥＮ開始部位の５１９ｂｐ上
流のＡＴＧ開始部位を含む（配列番号：１）。この第２の開始部位は、導入遺伝子におい
て変異されており、標準ＰＴＥＮを、部位特異的変異誘発法を用いてその第２のＡＴＧ開
始部位をＡＴＡに変異させることによって排除する。この変異は、全ＰＴＥＮ－Ｌ遺伝子
の発現を促進し、ＰＴＥＮの短い細胞内形態の発現を防止する。変異ＰＴＥＮ－Ｌ導入遺
伝子は、ＨＳＶｑｕｉｋプロトコルに従ってＧ２０７ウイルスバックボーンにクローニン
グされた。
腫瘍溶解性ＨＳＶ－１ベクターは、ＨＳＶＱｕｉｋシステムを用いて生成された。この
システムは、神経病原性因子γ－３４．５及びウイルスリボヌクレオチドリダクターゼＩ
ＣＰ６について二重に欠失したＦ株ＨＳＶ－１である、Ｇ２０７ウイルスバックボーンを
用いる（図１Ａ）。ウイルスは、神経由来ではない腫瘍細胞において条件付きに複製され
、タンパク質キナーゼＲシグナル伝達が欠損し、分割の間に自身のリボヌクレオチドリダ
クターゼを産生する。ＰＴＥＮ－Ｌ導入遺伝子は、標準ＰＴＥＮ開始部位の５１９ｂｐ上
流のＡＴＧ開始部位を含む（配列番号：１）。この第２の開始部位は、導入遺伝子におい
て変異されており、標準ＰＴＥＮを、部位特異的変異誘発法を用いてその第２のＡＴＧ開
始部位をＡＴＡに変異させることによって排除する。この変異は、全ＰＴＥＮ－Ｌ遺伝子
の発現を促進し、ＰＴＥＮの短い細胞内形態の発現を防止する。変異ＰＴＥＮ－Ｌ導入遺
伝子は、ＨＳＶｑｕｉｋプロトコルに従ってＧ２０７ウイルスバックボーンにクローニン
グされた。
【0102】
ＨＳＶ－Ｐ１０は、増幅され、標準ショ糖精製プロトコルを用いて精製された。７０％
融合性ベロ細胞の１５０ｍｍプレート１０～２０枚を、最小体積の２％－ＦＢＳ ＤＭＥ
Ｍ中で低ＭＯＩで感染させた。感染プレートは、５％Ｃ０２＋空気を含む加湿インキュベ
ータ内で３４Ｃに移された。プレート上の細胞の大部分が丸くなり始めたとき（通常は３
～４日目）、細胞及び培地をこすり落として集めた。細胞を遠心分離によりペレット化し
、上澄みを５０ｍｌ円錐管に移して分離した。全ての細胞を２０～３０ｍｌの上澄み中で
共に再懸濁し、細胞及び培地を液体窒素内で急速凍結し、－８０Ｃで保存した。凍結細胞
を３７Ｃ水槽内で解凍して４Ｃにし、超音波処理してウイルス粒子を無傷細胞から放出さ
せた。細胞破砕物を遠心分離により再びペレット化し、ウイルス粒子を含む培地を、細胞
を含まない分離された培地と併せた。ウイルス粒子を超遠心分離によりペレット化し、無
菌生理食塩水中に再懸濁した。再懸濁したウイルスを３０％スクロース層の上に重ね合わ
せ、分離した層を再び超遠心分離してウイルス粒子のみを精製した。ペレット化したウイ
ルスを最小体積の無菌生理食塩水中２０％グリセリンに再懸濁し、２０μｌアリコートに
分割して－８０Ｃで保存した。
融合性ベロ細胞の１５０ｍｍプレート１０～２０枚を、最小体積の２％－ＦＢＳ ＤＭＥ
Ｍ中で低ＭＯＩで感染させた。感染プレートは、５％Ｃ０２＋空気を含む加湿インキュベ
ータ内で３４Ｃに移された。プレート上の細胞の大部分が丸くなり始めたとき（通常は３
～４日目）、細胞及び培地をこすり落として集めた。細胞を遠心分離によりペレット化し
、上澄みを５０ｍｌ円錐管に移して分離した。全ての細胞を２０～３０ｍｌの上澄み中で
共に再懸濁し、細胞及び培地を液体窒素内で急速凍結し、－８０Ｃで保存した。凍結細胞
を３７Ｃ水槽内で解凍して４Ｃにし、超音波処理してウイルス粒子を無傷細胞から放出さ
せた。細胞破砕物を遠心分離により再びペレット化し、ウイルス粒子を含む培地を、細胞
を含まない分離された培地と併せた。ウイルス粒子を超遠心分離によりペレット化し、無
菌生理食塩水中に再懸濁した。再懸濁したウイルスを３０％スクロース層の上に重ね合わ
せ、分離した層を再び超遠心分離してウイルス粒子のみを精製した。ペレット化したウイ
ルスを最小体積の無菌生理食塩水中２０％グリセリンに再懸濁し、２０μｌアリコートに
分割して－８０Ｃで保存した。
【0103】
ＰＴＥＮ－Ｌ発現ウイルス（ＨＳＶ－Ｐ１０はまたＲＡＰＴＯＲとも称する）のインビ
トロ及びインビボの有効性を試験するために、Ｕ８７膠芽腫細胞をＨＳＶ－Ｐ１０（すな
わち、ＲＡＰＴＯＲ）に感染の多重度１で感染させ、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの発現は、様々
な時点で測定された（図１Ｂ）。ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現は、感染後４時間以内に観察さ
れる。次に、ＡＫＴのリン酸化におけるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの効果を比較するために、Ｄ
Ｂ７細胞を、非感染細胞（ＮＶ）又はＨＳＶＱベクターのみに感染した細胞（Ｑ）又はＨ
ＳＶ－Ｐ１０に感染した細胞（すなわち、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ＨＳＶＱ）（Ｒ）に由
来する細胞溶解物により感染させた。ここで、ＨＳＶＱ－Ｐ１０に感染したＤＢ７細胞は
、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを発現し、ＡＫＴリン酸化を低減した。ＨＳＶＱ感染細胞と比較し
た。
トロ及びインビボの有効性を試験するために、Ｕ８７膠芽腫細胞をＨＳＶ－Ｐ１０（すな
わち、ＲＡＰＴＯＲ）に感染の多重度１で感染させ、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの発現は、様々
な時点で測定された（図１Ｂ）。ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現は、感染後４時間以内に観察さ
れる。次に、ＡＫＴのリン酸化におけるＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの効果を比較するために、Ｄ
Ｂ７細胞を、非感染細胞（ＮＶ）又はＨＳＶＱベクターのみに感染した細胞（Ｑ）又はＨ
ＳＶ－Ｐ１０に感染した細胞（すなわち、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ＨＳＶＱ）（Ｒ）に由
来する細胞溶解物により感染させた。ここで、ＨＳＶＱ－Ｐ１０に感染したＤＢ７細胞は
、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇを発現し、ＡＫＴリン酸化を低減した。ＨＳＶＱ感染細胞と比較し
た。
【0104】
ＰＴＥＮは、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）では通常失われている。これを確認するために、
ヒト乳癌脳転移の切片（上、４０倍）及び頭蓋内ＤＢ７（マウス乳癌細胞）を有するＦＶ
Ｂ／Ｎマウスの切片（下、２０倍）に由来する、代表的なヘマトキシリン及びエオシン（
Ｈ＆Ｅ）染色並びにＰＴＥＮ染色を示す。染色は、ＢＣＢＭ細胞におけるＰＴＥＮの顕著
な喪失を裏付ける。
ヒト乳癌脳転移の切片（上、４０倍）及び頭蓋内ＤＢ７（マウス乳癌細胞）を有するＦＶ
Ｂ／Ｎマウスの切片（下、２０倍）に由来する、代表的なヘマトキシリン及びエオシン（
Ｈ＆Ｅ）染色並びにＰＴＥＮ染色を示す。染色は、ＢＣＢＭ細胞におけるＰＴＥＮの顕著
な喪失を裏付ける。
【0105】
ＲＡＰＴＯＲウイルス（すなわち、ＨＳＶ－Ｐ１０）がＨＳＶＱウイルスと同じ細胞向
性及び増殖能力を有することを示すために、ＬＮ２２９細胞（膠芽腫細胞株）、Ｕ２５１
－Ｔ３細胞（神経膠腫細胞）及びＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞（神経膠腫細胞）をＨＳＶＱ又は
ＨＳＶ－Ｐ１０のいずれか一方で感染の多重度（ＭＯＩ）０．１で感染させた。細胞は、
生存性及び感染について観察された。図３に示すように、ＨＳＶＱ及びＨＳＶ－Ｐ１０の
両方は、３つの細胞タイプ全てに感染し、ＬＮ２２９細胞及びＵ２５１－Ｔ３細胞を完全
に溶解することができた。
性及び増殖能力を有することを示すために、ＬＮ２２９細胞（膠芽腫細胞株）、Ｕ２５１
－Ｔ３細胞（神経膠腫細胞）及びＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞（神経膠腫細胞）をＨＳＶＱ又は
ＨＳＶ－Ｐ１０のいずれか一方で感染の多重度（ＭＯＩ）０．１で感染させた。細胞は、
生存性及び感染について観察された。図３に示すように、ＨＳＶＱ及びＨＳＶ－Ｐ１０の
両方は、３つの細胞タイプ全てに感染し、ＬＮ２２９細胞及びＵ２５１－Ｔ３細胞を完全
に溶解することができた。
【0106】
次に、ＭＴＴアッセイをＤＢ７細胞（図４Ａ）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（ヒト乳癌
）（図４Ｂ）、ＬＮ２２９細胞（図４Ｃ）、Ｕ８７ΔＥＧＦＲ細胞（図４Ｄ）において行
い、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現が複数の細胞株におけるＨＳＶ－Ｐ１０細胞死滅を阻害しな
いことが観察された。それぞれの細胞シナリオでは、感染細胞の溶菌の速度は、同一であ
った。大きさの差異は、９６時間の培養にわたって完全に維持されている任意の差異によ
って証明されるような、ウイルス感染における真の差異よりもむしろ、細胞に投与された
ウイルス負荷における変動に起因すると判定された。
）（図４Ｂ）、ＬＮ２２９細胞（図４Ｃ）、Ｕ８７ΔＥＧＦＲ細胞（図４Ｄ）において行
い、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現が複数の細胞株におけるＨＳＶ－Ｐ１０細胞死滅を阻害しな
いことが観察された。それぞれの細胞シナリオでは、感染細胞の溶菌の速度は、同一であ
った。大きさの差異は、９６時間の培養にわたって完全に維持されている任意の差異によ
って証明されるような、ウイルス感染における真の差異よりもむしろ、細胞に投与された
ウイルス負荷における変動に起因すると判定された。
【0107】
ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの発現がどのようにインビボ腫瘍負荷に影響を与えたのかを知るた
めに、ＤＢ７－ｄｓＲｅｄ腫瘍を有するＦＶＢ／Ｎマウス免疫能及びＤＢ７を有するヌー
ドマウスを、生理食塩水対照又はＨＳＶＱウイルスバックボーン又はＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
発現ＨＳＶ－Ｐ１０（すなわち、ＲＡＰＴＯＲ）に感染させた（図５）。感染後４０日目
までに、モック感染動物の９０％及び５０％のＨＳＶＱ感染動物が死亡した。対照的に感
染後１００日目において、ＨＳＶ－Ｐ１０動物の９０％超が生存していた。免疫不全ヌー
ドマウスでは、腫瘍を有する全てのマウスは、ＨＳＶＱ群及び生理食塩水群において１５
日目までに死亡し、ＲＡＰＴＯＲ感染群において１９日目までに死亡した。これは、ＨＳ
Ｖ－Ｐ１０が乳癌脳転移を有するマウスにおける生存を促進することを示す。
めに、ＤＢ７－ｄｓＲｅｄ腫瘍を有するＦＶＢ／Ｎマウス免疫能及びＤＢ７を有するヌー
ドマウスを、生理食塩水対照又はＨＳＶＱウイルスバックボーン又はＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ
発現ＨＳＶ－Ｐ１０（すなわち、ＲＡＰＴＯＲ）に感染させた（図５）。感染後４０日目
までに、モック感染動物の９０％及び５０％のＨＳＶＱ感染動物が死亡した。対照的に感
染後１００日目において、ＨＳＶ－Ｐ１０動物の９０％超が生存していた。免疫不全ヌー
ドマウスでは、腫瘍を有する全てのマウスは、ＨＳＶＱ群及び生理食塩水群において１５
日目までに死亡し、ＲＡＰＴＯＲ感染群において１９日目までに死亡した。これは、ＨＳ
Ｖ－Ｐ１０が乳癌脳転移を有するマウスにおける生存を促進することを示す。
【0108】
ＨＳＶ－Ｐ１０感染マウスにおける保護の機構を決定するために、感染腫瘍細胞を除去
して、マクロファージ、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤の存在について測定した（図
６）。ＣＤ１１ｂ＋及びＦ４／８０＋について染色すると、マクロファージ（ＣＤ４５ｈ
ｉ）に対するＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋ミクログリア（ＣＤ４５ｌｏ－ｉｎｔ）の比が
、ＨＳＱＶ細胞及びＨＳＶ－Ｐ１０細胞において減少し、ＨＳＶ－Ｐ１０感染細胞に比較
的より多くのマクロファージが存在したことが観察された（図６Ａ）。ミクログリア及び
マクロファージの活性化状態を判定するために測定すると、活性化細胞の割合もまたＨＳ
ＶＱ感染細胞及びＩＳＶ－Ｐ１０感染細胞において増加し、ＨＳＶ－Ｐ１０集団において
より顕著に活性化することが更に観察された（図６Ｂ）。浸潤ＮＫ細胞（図６Ｃ）及び浸
潤ＣＤ８ Ｔ細胞（図６Ｄ）について測定すると、ＨＳＶＱが浸潤ＮＫ細胞又は浸潤ＣＤ
８ Ｔ細胞の割合において統計的増加を有さなかった一方で、ＲＡＰＴＯＲ感染細胞（す
なわち、ＨＳＶ－Ｐ１０感染細胞）が、ＨＳＶＱ及びモック感染と比較して、ＮＫ細胞及
びＣＤ８ Ｔ細胞の割合における大幅な増加を示したことが示された。
して、マクロファージ、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤の存在について測定した（図
６）。ＣＤ１１ｂ＋及びＦ４／８０＋について染色すると、マクロファージ（ＣＤ４５ｈ
ｉ）に対するＣＤ１１ｂ＋ Ｆ４／８０＋ミクログリア（ＣＤ４５ｌｏ－ｉｎｔ）の比が
、ＨＳＱＶ細胞及びＨＳＶ－Ｐ１０細胞において減少し、ＨＳＶ－Ｐ１０感染細胞に比較
的より多くのマクロファージが存在したことが観察された（図６Ａ）。ミクログリア及び
マクロファージの活性化状態を判定するために測定すると、活性化細胞の割合もまたＨＳ
ＶＱ感染細胞及びＩＳＶ－Ｐ１０感染細胞において増加し、ＨＳＶ－Ｐ１０集団において
より顕著に活性化することが更に観察された（図６Ｂ）。浸潤ＮＫ細胞（図６Ｃ）及び浸
潤ＣＤ８ Ｔ細胞（図６Ｄ）について測定すると、ＨＳＶＱが浸潤ＮＫ細胞又は浸潤ＣＤ
８ Ｔ細胞の割合において統計的増加を有さなかった一方で、ＲＡＰＴＯＲ感染細胞（す
なわち、ＨＳＶ－Ｐ１０感染細胞）が、ＨＳＶＱ及びモック感染と比較して、ＮＫ細胞及
びＣＤ８ Ｔ細胞の割合における大幅な増加を示したことが示された。
【0109】
浸潤ＮＫ細胞及び浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞における増加が、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の
増殖を阻害するためにＰＤ１を通してシグナル伝達するように通常機能し得る、ＰＤ－Ｌ
１発現における減少に起因し得ることを仮定し、細胞は、ＰＤ－Ｌ１発現について試験さ
れた（図７）。モック感染したＤＢ７細胞は、予測されたであろう、ほとんど検出できな
いレベルのＰＤ－Ｌ１を示した。同様に予測されたように、ＨＳＶＱ感染細胞は、感染後
２４時間のウイルス誘導ＰＤ－Ｌ１発現を示した。しかし、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ＨＳ
Ｖ－Ｐ１０（すなわち、ＲＡＰＴＯＲ）に感染した細胞は、ＰＤ－Ｌ１発現において大幅
な低減を示した。ＨＳＶＱバックボーンとＨＳＶ－Ｐ１０との間で唯一異なるのがＰＴＥ
Ｎ－Ｌｏｎｇ導入遺伝子であるため、ＰＤ－Ｌ１におけるこの低減は、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎ
ｇ発現の直接の結果である。
増殖を阻害するためにＰＤ１を通してシグナル伝達するように通常機能し得る、ＰＤ－Ｌ
１発現における減少に起因し得ることを仮定し、細胞は、ＰＤ－Ｌ１発現について試験さ
れた（図７）。モック感染したＤＢ７細胞は、予測されたであろう、ほとんど検出できな
いレベルのＰＤ－Ｌ１を示した。同様に予測されたように、ＨＳＶＱ感染細胞は、感染後
２４時間のウイルス誘導ＰＤ－Ｌ１発現を示した。しかし、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ＨＳ
Ｖ－Ｐ１０（すなわち、ＲＡＰＴＯＲ）に感染した細胞は、ＰＤ－Ｌ１発現において大幅
な低減を示した。ＨＳＶＱバックボーンとＨＳＶ－Ｐ１０との間で唯一異なるのがＰＴＥ
Ｎ－Ｌｏｎｇ導入遺伝子であるため、ＰＤ－Ｌ１におけるこの低減は、ＰＴＥＮ－Ｌｏｎ
ｇ発現の直接の結果である。
【0110】
加えて、ＨＳＶ－Ｐ１０感染動物は、抗ＤＢ－７抗体を産生することができた（図８）
。
結論
ＨＳＶ－Ｐ１０ウイルスは、二重に欠失したγ－３４．５遺伝子並びにＧＦＰ及びＰＴ
ＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ベクターを含むウイルスＩＣＰ６における挿入変異を有する単純ヘル
ペスウイルス１型である。ＨＳＶ－Ｐ１０：は、感染細胞においてＰＴＥＮ－Ｌを発現し
、感染細胞からＰＴＥＮ－Ｌを分泌し、感染細胞におけるＡｋｔリン酸化もまた低減する
。ＨＳＶ－Ｐ１０は、ＨＳＶＱと比較して神経膠腫細胞において等価複製を示し、神経膠
腫細胞株及び乳癌細胞株をＨＳＶＱと同じ有効性で死滅させる。
。
結論
ＨＳＶ－Ｐ１０ウイルスは、二重に欠失したγ－３４．５遺伝子並びにＧＦＰ及びＰＴ
ＥＮ－Ｌｏｎｇ発現ベクターを含むウイルスＩＣＰ６における挿入変異を有する単純ヘル
ペスウイルス１型である。ＨＳＶ－Ｐ１０：は、感染細胞においてＰＴＥＮ－Ｌを発現し
、感染細胞からＰＴＥＮ－Ｌを分泌し、感染細胞におけるＡｋｔリン酸化もまた低減する
。ＨＳＶ－Ｐ１０は、ＨＳＶＱと比較して神経膠腫細胞において等価複製を示し、神経膠
腫細胞株及び乳癌細胞株をＨＳＶＱと同じ有効性で死滅させる。
【0111】
しかし、ＨＳＶ－Ｐ１０は、ＤＢ７乳癌脳転移を有する免疫能があるマウスにおける生
存を促進する。これは部分的に、ＰＤ－Ｌ１の発現によってもはや抑制されない、ＤＢ７
腫瘍を有する脳半球の活性化免疫エフェクター細胞の補充の増加における結果であるのは
、ＨＳＶ－Ｐ１０が感染細胞及び隣接非感染細胞においてＰＤ－Ｌ１発現を低減すること
が本明細書で示されたからである。加えて、ＨＳＶ－Ｐ１０は、ＤＢ７癌抗原に対してロ
バストな抗原拡散を誘導する。
存を促進する。これは部分的に、ＰＤ－Ｌ１の発現によってもはや抑制されない、ＤＢ７
腫瘍を有する脳半球の活性化免疫エフェクター細胞の補充の増加における結果であるのは
、ＨＳＶ－Ｐ１０が感染細胞及び隣接非感染細胞においてＰＤ－Ｌ１発現を低減すること
が本明細書で示されたからである。加えて、ＨＳＶ－Ｐ１０は、ＤＢ７癌抗原に対してロ
バストな抗原拡散を誘導する。
【0112】
ＨＳＶ－Ｐ１０は、腫瘍細胞の死滅を誘発するために３つの主要な方法で作用する。第
１に、ウイルスは、感染腫瘍細胞中で選択的に複製し、感染腫瘍細胞を破壊することがで
きる。第２に、ＨＳＶ－Ｐ１０は、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの分泌を誘導し、Ｐ
ＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、非感染腫瘍細胞の増殖を局所的に遅くするように作用することがで
き、損傷関連分子パターン分子としてもまた作用して、感染の部位に対して自然免疫系を
補充することができる。第３に、ＨＳＶ－Ｐ１０は、腫瘍細胞溶解及び感染の部位への免
疫細胞補充を介して、非自己腫瘍ペプチドを免疫系に曝露することにより、腫瘍細胞に対
する適応的免疫応答を誘発する、「癌ワクチン」として作用する（図９）。
１に、ウイルスは、感染腫瘍細胞中で選択的に複製し、感染腫瘍細胞を破壊することがで
きる。第２に、ＨＳＶ－Ｐ１０は、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇの分泌を誘導し、Ｐ
ＴＥＮ－Ｌｏｎｇは、非感染腫瘍細胞の増殖を局所的に遅くするように作用することがで
き、損傷関連分子パターン分子としてもまた作用して、感染の部位に対して自然免疫系を
補充することができる。第３に、ＨＳＶ－Ｐ１０は、腫瘍細胞溶解及び感染の部位への免
疫細胞補充を介して、非自己腫瘍ペプチドを免疫系に曝露することにより、腫瘍細胞に対
する適応的免疫応答を誘発する、「癌ワクチン」として作用する（図９）。
【0113】
Ｅ．参照文献
１ Ｃｅｒａｍｉ，Ｅ．，Ｄｅｍｉｒ，Ｅ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｎ．，Ｔａｙｌｏｒ，
Ｂ．Ｓ．，＆ Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（２０１０）。「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｎｅｔｗｏｒ
ｋ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｃｏｒｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｇ
ｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ。」Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，５（２），ｅ８９１８。
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【0114】
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ｄｙ，Ｍ．，Ｒａｐｐ，Ｚ．，Ｓｈａｗ，Ｊ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．（２０１３）。「
Ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＰＴＥＮ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｈａｔ ｅｎｔｅｒｓ
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ｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），３４１（６１４４），３９９～４０２。
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ａｐａｍｙｃｉｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｕｇ
ｍｅｎｔｓ ａｎｔｉｇｌｉｏｍａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ－
ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ。」Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１４；１３（
１２）：３０２４～３０３６。
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ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏ
ｎｃｏｌｙｔｉｃ ＨＳＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅ
ｖａｌｕａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｍｏ
ｄｅｌｓ。」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３（８），７０５～１４。
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５ Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｓ，Ｙａｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ。「Ｍｉｃｒｏｅｎｖ
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ｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｉｍｅｓ ｂｒａｉｎ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｕｔｇｒｏｗｔ
ｈ。」Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５２７（７５７６）：１００～１０４。
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【0118】
Ｆ． 配列
配列番号：１ ＰＴＥＮ－Ｌｏｎｇコード化領域
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ＡＣＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡ
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】