特開 2024-123124 ＡＧＥ修飾細胞を除去するための、抗カルボキシメチルリシン抗体及び超音波

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024123124

(43)【公開日】2024-09-10

(54)【発明の名称】ＡＧＥ修飾細胞を除去するための、抗カルボキシメチルリシン抗体及び超音波

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240903BHJP

   A61K 41/13 20200101ALI20240903BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N ZNA

A61K41/13

A61P43/00 105

A61K39/395 N

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024098654

(22)【出願日】2024-06-19

(62)【分割の表示】P 2021507529の分割

【原出願日】2019-08-22

(31)【優先権主張番号】62/721,932

(32)【優先日】2018-08-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

２．プルロニック

３．ＷＩＮＤＯＷＳ

(71)【出願人】

【識別番号】518126074

【氏名又は名称】シワ コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】グルバー ルイス エス．

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法を提供する。
【解決手段】方法は、超音波を、対象に印加するステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む。超音波を印加するステップは、抗ＡＧＥ抗体を投与するステップの前に、又はこの後でなされうる。ＡＧＥ修飾細胞は、制限部位にありうる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法であって、
超音波を、対象に印加するステップ；及び
抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、前記対象に投与するステップ；
を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
「SIW01-028-WO_Sequence_Listing.txt」と名付けられ、２０１９年７月１０日に作成
され、１２０キロバイトのファイルサイズを伴う、ASCIIテキストファイル内に含有され
る配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

老化細胞は、部分的に機能的であるか、又は非機能的な細胞であり、増殖停止の状態にある。老化とは、細胞の独特な状態をいい、バイオマーカーｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}の活性化、及びβ－ガラクトシダーゼの発現などのバイオマーカーと関連する。複製老化は、ＤＮＡ損傷応答をもたらす、テロメアの短縮から生じる。老化はまた、細胞の損傷又はストレス（増殖因子による過剰刺激などのストレス）によっても引き起こされうる。

【0003】

終末糖化反応最終産物（ＡＧＥ：advanced glycation end-product；また、ＡＧＥ修飾タンパク質又は糖化反応最終産物とも称される）は、糖とタンパク質側鎖との非酵素反応から生じる（Ando, K. et al., Membrane Proteins of Human Erythrocytes AreModified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)）。この過程は、還元糖とアミノ基との可逆反応で開始してシッフ塩基を形成し、これが進行して、共有結合性のアマドリ再配列産物を形成する。形成されると、アマドリ産物は、さらなる再配列を経て、ＡＧＥを産生する。糖尿病（ＤＭ：diabetes mellitus）及び酸化ストレスにより引き起こされる高血
糖症は、膜タンパク質の、この翻訳後修飾を促進する（Lindsey JB, et al., “Receptor
For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications,” Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009)）。ＡＧＥはまた、他の方法からも形成されうる。例えば、終末糖化反応最終産物である、Ｎ^ε－（カルボキシメチル）リシンは、脂質の過酸化反応及び糖化反応の両方の産物である。ＡＧＥは、糖尿病性合併症、炎症、網膜症、腎症、アテローム性動脈硬化、脳卒中、内皮細胞機能障害、及び神経変性障害を含む、複数の病理学的状態と関連している（Bierhaus A, “AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular diseaseand diabetes mellitus. I. The AGE concept,” CardiovascRes, Vol. 37(3), 586-600 (1998)）。

【0004】

ＡＧＥ修飾タンパク質はまた、老化細胞のマーカーでもある。当技術分野では、この糖化反応最終産物と老化との関連が周知である。例えば、Gruber, L. （国際公開第２００
９／１４３４１１号パンフレット、２００９年１１月２６日）、Ando, K. et al. （Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by AdvancedGlycation End Products during Aging in the Circulation, BiochemBiophys Res Commun., Vol.258, 123,
125 (1999)）、Ahmed, E.K. et al. （“Protein Modification and Replicative Senescence of WI-38 HumanEmbryonic Fibroblasts” Aging Cells, vol. 9, 252, 260(2010)）、Vlassara, H. et al. （Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface InduceReceptor-Mediated Phagocytosis by Macrophages, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545(1987)）；及びVlassara et al. （“High-affinity-receptor-mediatedUptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism forthe Removal of Senescent Macromolecules” Proc. Natl.Acad. Sci. USAI, Vol. 82, 5588, 5591 (1985)）を参照されたい。さらに、Ahmed, E.K. et al.は、糖化反応最終
産物が、「細胞内タンパク質及び細胞外タンパク質に対する自発的損傷の主要原因のうちの１つ」であることを指し示す（Ahmed,E.K. et al.、上記、３５３頁を参照されたい）。したがって、糖化反応最終産物の蓄積は、老化及び機能の欠如と関連する。

【0005】

細胞の老化を引き起こす損傷又はストレスはまた、細胞内のミトコンドリアＤＮＡに負の影響も与えて、これらにフリーラジカルを産生させ、これが、細胞内の糖と反応して、メチルグリオキサール（ＭＧ：methyl glyoxal）を形成する。続いてＭＧは、タンパク質又は脂質と反応して、終末糖化反応最終産物を発生させる。タンパク質成分であるリシンの場合、ＭＧは、ＡＧＥであるカルボキシメチルリシンを形成するように反応する。

【0006】

ミトコンドリアＤＮＡに対する損傷又はストレスはまた、細胞周期をブロックするタンパク質を産生するように細胞を誘導するＤＮＡ損傷応答も誘発する。これらのブロックするタンパク質は、細胞分裂を阻害する。損傷又はストレスの持続は、ｍＴＯＲの産生を引き起こし、今度はこれが、タンパク質の合成を活性化させ、タンパク質の分解を不活化させる。細胞のさらなる刺激は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）をもたらす。

【0007】

ｐ１６とは、Ｓ期（合成期）を阻害することにより、細胞周期の調節に関与するタンパク質である。ｐ１６は、老化時に活性化される場合もあり、又はＤＮＡ損傷、酸化ストレス、若しくは薬物への曝露など、多様なストレスに応答して活性化される場合もある。ｐ１６は、典型的に、細胞を、ＤＮＡ損傷に応答して老化させ、細胞が過剰増殖状態に入ることを不可逆的に防止する腫瘍抑制タンパク質であると考えられている。しかし、一部の腫瘍は、ｐ１６の過剰発現を示すが、他の腫瘍は、発現の下方調節を示すので、この点には、ある程度の両義性が存在している。一部の腫瘍におけるｐ１６の過剰発現が、不全性網膜芽細胞腫タンパク質（「Ｒｂ」：retinoblastoma protein）の結果生じることを示唆する証拠がある。ｐ１６は、Ｓ期を阻害するように、Ｒｂに作用し、Ｒｂは、ｐ１６を下方調節し、負のフィードバックを創出する。不全性Ｒｂは、Ｓ期の阻害及びｐ１６の下方調節のいずれにも失敗するので、過剰増殖細胞内の、ｐ１６の過剰発現を結果としてもたらす（Romagosa, C. et al., p16^Ink4a overexpression in cancer: atumor suppressor
gene associated with senescence and high-grade tumors, Oncogene, Vol. 30,2087-2097 (2011)）。

【0008】

老化細胞は、炎症促進性因子を含む、細胞間シグナル伝達に関与する多くの因子の分泌と関連し；これらの因子の分泌は、老化関連分泌現象又はＳＡＳＰ（senescence-associated secretory phenotype）と称されている（Freund, A. “Inflammatory networks duringcellular senescence: causes and consequences” TrendsMol Med. 2010 May;16(5):238-46）。クローン病及び関節リウマチなどの自己免疫疾患は、慢性炎症と関連する（Ferraccioli, G. etal. “Interleukin-1β andInterleukin-6 in Arthritis Animal Models: Roles in the Early Phase ofTransition from Acute to Chronic Inflammation and Relevance for HumanRheumatoid Arthritis” Mol Med. 2010 Nov-Dec; 16(11-12):
552-557）。慢性炎症は、病理部位近傍における、ベースラインより高レベルであるが、急性炎症において見出されるレベルより低レベルの炎症促進性因子の存在により特徴づけられうる。これらの因子の例は、ＴＮＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ５補体タンパク質、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＩｇＥ、α４β１インテグリン、及びα４β７インテグリンを含む。老化細胞はまた、ＩＬ－１β、ＩＬ－８、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦＡＰ３、ＥＳＭ１、及びＣＣＬ２を含む、炎症において役割を伴う遺伝子も上方調節する（Burton, D.G.A. et al., “Microarray analysisof senescent vascular smooth muscle cells: a link to atherosclerosis andvascular calcification”, Experimental Gerontology, Vol.44, No. 10, pp. 659-665 (October 2009)）
。

【0009】

老化細胞は、ＳＡＳＰの一部として、反応性酸素分子種（「ＲＯＳ」：reactive oxygenspecies）を分泌する。ＲＯＳは、細胞の老化の維持において、重要な役割を果たすと
考えられる。ＲＯＳの分泌は、老化細胞が、近隣細胞内の老化を誘導するバイスタンダー効果を創出する：ＲＯＳは、ｐ１６の発現を活性化させ、老化をもたらすことが公知である、細胞の損傷そのものを創出する（Nelson, G., A senescent cell bystander effect:
senescence-induced senescence, Aging Cell, Vo. 11, 345-349 (2012)）。ｐ１６／Ｒｂ経路は、ＲＯＳの誘導をもたらし、これは、タンパク質キナーゼＣデルタを活性化させ、ＲＯＳをさらに増強する正のフィードバックループを創出し、細胞周期の不可逆的な停止の維持の一助となり；がん細胞を、ＲＯＳに曝露すれば、過剰増殖細胞内の細胞期の停止を誘導することにより、がんを治療するのに効果的でありうることが示唆されてさえいる（Rayess, H. et al.,Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, Int J Cancer, Vol. 130,1715-1725 (2012)）。

【0010】

近年の研究は、老化細胞を除去することの治療的利益を裏付けている。Mayo Clinic in
Rochester、Minnesotaにおけるインビボ動物研究は、老化細胞の消失についてのバイオ
マーカーを保有するトランスジェニックマウスにおける老化細胞の消失は、細胞の老化と関連する老化関連障害を遅延させることを見出した。脂肪組織内及び筋肉組織内の老化細胞の消失は、サルコペニア及び白内障の発症を実質的に遅延させ、骨格筋及び眼における老化指標を低減した（Baker, D. J. et al., “Clearance of p16^Ink4a-positivesenescent cells delays ageing-associated disorders”,Nature, Vol. 479, pp. 232-236, (2011)）。老化細胞の消失を誘導するように治療されたマウスは、筋線維の直径が、非治
療マウスと比較して大きいことが見出された。トレッドミル運動試験は、治療がまた、筋肉の機能も保存することも指し示した。老化細胞の除去のための、トランスジェニックマウスの持続的治療は、負の副作用を及ぼさず、細胞に依存する老化関連現象を、選択的に遅延させた。このデータは、老化細胞の除去が、有益な治療効果をもたらすことを裏付け、これらの利益が、有害作用を伴わずに達成されうることを示す。

【0011】

マウスにおける、さらなるインビボ動物研究は、老化細胞溶解剤を使用する、老化細胞の除去が、老化関連障害、アテローム性動脈硬化、及び肺線維症を治療することを見出した。高齢マウス又は早老マウスにおける、老化細胞溶解薬による短期治療は、複数の老化関連現象を緩和した（Zhu, Y. et al., “The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolyticdrugs”, Aging Cell, vol. 14, pp. 644-658 (2015)）。老化細胞溶解薬による長期治療は、アテローム性動脈硬化が確立されたマウスにおいて、血管運動機能を改善し、血管内膜プラークの石灰化を低減した（Roos, C.M. et al.,
“Chronic senolytic treatmentalleviates established vasomotor dysfunction in aged or atherosclerotic mice”, Aging Cell (2016)）。老化細胞溶解剤の投与による、
老化細胞の除去は、マウスにおける放射線誘導性肺線維症を回復させた（Pan, J. et al., “Inhibition of Bcl-2/xl with ABT-263 selectively kills senescent typeII pneumocytes and reverses pulmonary fibrosis induced by ionizing radiation inmice”,
International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, Vol. 99, No. 2,pp. 353-361 (2017)）。このデータは、老化細胞を除去することの利益を、さらに裏付けている。

【0012】

老化細胞は、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドなど、老化の細胞表面マーカーに結合する抗体を使用してもまた、特異的にターゲティングされ、除去されうる。抗体は、２つの重鎖と、２つの軽鎖とから構成されるＹ字形タンパク質である。Ｙ字形の２つアームが、抗体の抗原結合性断片（Ｆａｂ：fragment antigen-binding）領域を形成するのに対し、Ｙ字形の基部又はテール部は、抗体のＦｃ（結晶性断片：fragment crystallizable）領域を形成する。抗原への結合は、相補性決定領域（また、ＣＤＲ又は超可変
領域としても公知である）のセットである、パラトープと称される場所にある、抗原結合性断片領域（Ｙ字形のアームの先端部分）の末端部分で生じる。相補性決定領域は、異なる抗体間で異なり、所与の抗体に、所与の抗原との結合のための特異性を与える。抗体のＦｃ（結晶性断片）領域は、抗原への結合の結果を決定し、補体カスケードを誘発するか、又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）を誘起することなどにより、免疫系と相互作用しうる。抗体ベースの免疫
療法は、抗体が結合する抗原を発現する細胞を、特異的にターゲティングし、これらを死滅させる一方で、抗原を発現しない細胞を回避するそれらの能力のために、特に、所望である。

【0013】

終末糖化反応最終産物（ＡＧＥ：advanced glycation end-product）に結合する抗体（抗ＡＧＥ抗体）は、サルコペニア（国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット、米国公開第２０１６／０２１５０４３号明細書、米国公開第２０１６／０１７５４１３号明細書）、アテローム性動脈硬化（米国公開第２０１３／０２４３７８５号明細書）、炎症及び自己免疫障害（国際公開第２０１６／０４４２５２号パンフレット）、神経変性障害（国際公開第２０１７／１８１１１６号パンフレット）、並びにがん（国際公開第２０１７／１４３０７３号パンフレット）を含む、多様なＡＧＥ障害の治療において効果的であることが示されている。ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体は、当技術分野で公知である。例は、Bucalaによる米国特許第５，７０２，７０４号明細書、及びAl-Abed et al.による米国特許第６，３８０，１６５号明細書において記載されている例を含む。抗ＡＧＥ抗体は、市販されているが、市販されている抗体は、治療的使用の対象とならない。

【0014】

超音波は、細胞の特異的なターゲティングにおいてもまた効果的な、機械的技法である。超音波は、細胞構造の物理的差違に基づき、細胞を特異的にターゲティングする。超音波は、標的とする細胞又は標的組織を、熱的効果（加熱）により損傷又は破壊する場合もあり、キャビテーション、マイクロストリーミング、及び音響流など、非熱的効果により損傷又は破壊する場合もある。非破壊的超音波もまた、炎症過程との相互作用など、治療的利益をもたらしうる（Aviles Jr., F. et al., “Contactlow-frequency ultrasound used to accelerate granulation tissue proliferationand rapid removal of nonviable tissue in colonized wounds: a case study”, Ostomy Wound Management, available online atwww.o-wm.com/content/contact-low-frequency-ultrasound-used-accelerate-granulation-tissue-proliferation-and-rapid(2011)）。周波数、強度、波長、速度
、波形、連続性（パルス状印加又は定常印加）、及び印加の持続時間などの超音波パラメータは、特異的治療効果をもたらすように変動させうる。

【0015】

超音波は、がん性細胞及び腫瘍のターゲティングにおいて、特に、効果的である。悪性細胞は、超音波による損傷を、正常な健常細胞より受けやすい（Lejbkowicz, F. etal.,
“Distinct sensitivity of normal and malignant cells toultrasound in vitro”, Environmental HealthPerspectives, Vol. 105, Supplement 6, pp. 1575-1578 (1997)
）。低強度の超音波は、音響力学療法（感作分子と共に施される超音波）、超音波媒介型化学療法、音響穿孔、超音波媒介型遺伝子送達、及び抗血管超音波療法などの形態でがんを治療するのに、治療的に使用されうる（Wood, A. K. W. et al., “A review of low-intensityultrasound for cancer therapy”, Ultrasound in Medicine& Biology, Vol.
41, No. 4, pp. 905-928 (2015)）。

【0016】

超音波は、多様な種類のがんに対して効果的であることが示されている。１．１ＭＨｚの周波数における、連続超音波の印加は、ヒト白血病細胞において、強度依存的な細胞膜の損傷及び細胞生存率の低下を引き起こす（Wang, P. et al., “Membrane damage effect ofcontinuous wave ultrasound on K562 human leukemia cells”, Journal of Ultrasound Medicine, Vol. 31, pp. 1977-1986 (2012)）。低周波数及び低強度の超音波は、
インビトロ及びインビボのいずれの神経膠腫細胞においても、アポトーシスを誘導しうる（Zhang, Z. etal., “Low frequency and intensity ultrasound induces apoptosisof brain glioma in rats mediated by caspase-3 Bcl-2, and survivin”, Brain Research, Vol. 1473, pp. 25-34 (2012)）。５－アミノレブリン酸、プロトポルフィリンIX、
及びタラポルフィンナトリウムを、音響増感剤として含む、ポルフィリン誘導体を使用する、音響力学療法は、インビトロの悪性神経膠腫細胞に対して、細胞毒性である（Endo, S. et al., “Porphyrinderivatives-mediated sonodynamic therapy for malignant gliomas in vitro”, Ultrasound in Medicine and Biology, Vol. 41, No. 9, pp. 2458-2465(2015)）。

【0017】

細胞及び組織を、直接損傷することに加えて、超音波は、他の治療剤と組み合わせて施されうる。超音波媒介型キャビテーションは、低分子、抗体、又はウイルスベース薬の活性を減少させない（Myers, R. et al., “Ultrasound-mediatedcavitation does not decrease the activity of small molecule, antibody orviral-based medicines”, International Journal ofNanomedicine, Vol. 13, pp. 337-349 (2018)）。超音波は、治療剤の、標的細胞又は標的組織への送達を、容易とするか、又は増強するのに使用されうる。超音波は、リポソームナノ粒子の蓄積、及び上皮腫瘍内の腫瘍透過性を増大させる（Watson, K. D. et al., “Ultrasound increasesnanoparticle delivery by reducing intratumoralpressure and increasing transport in epithelial and epithelial-mesenchymaltransition tumors”, Cancer Research, Vol. 72, No. 6,pp. 1485-1493 (2012)
）。同様に、音響力学療法は、がん細胞に特異的なタンパク質で修飾された二酸化チタンナノ粒子の、標的とする細胞への取込みを増大させる（Ninomiya, K. et al., “Targeted sonodynamictherapy using protein-modified TiO2 nanoparticles”,Ultrasonics Sonochemistry, Vol. 19, pp. 607-614 (2012)）。

【0018】

超音波はまた、抗体など、大型の治療剤の送達及び活性も増強する。超音波は、抗原の、固定化された抗体への結合を、劇的に加速化させる（Chen, R. et al., “Ultrasound-acceleratedimmunoassay, as exemplified by enzyme immunoassay of choriogonadotropin”, Clinical Chemistry, Vol. 30, No. 9, pp. 1446-1451 (1984)）。パルス状高強
度焦点化超音波は、マウスのＩｇＧ１_κモノクローナル抗体の、ヒト類表皮腫瘍内の送達を増強する（Khaibullina, A. etal., “Pulsed high-intensity focused ultrasound enhancesuptake of radiolabeled monoclonal antibody to human epidermoid tumor in nudemice”, Journal of Nuclear Medicine, Vol. 49, pp.295-302 (2008)）。微小気
泡と組み合わせて施されるパルス状超音波は、マウスモデルにおいて、抗表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ：epidermalgrowth factor receptor）抗体の、神経膠腫細胞への送達を増強する（Liao, A-H.et al., “Enhanced therapeutic epidermal growth factorreceptor (EGFR) antibody delivery via pulsed ultrasound with targetingmicrobubbles for glioma treatment”, Journal of Medicaland Biological Engineering, Vol. 35, pp. 156-164 (2015)）。低強度の超音波は、インビトロにおいて、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）の、ヒト頭頸部がん細胞の殺滅に対する抗がん活性を増強する（Masui, T. et
al., “Low-intensity ultrasound enhances the anticanceractivity of cetuximab in human head and neck cancer cells”, Experimental and Therapeutic Medicine, Vol. 5, pp. 11-16 (2013)）。

【0019】

薬物療法の著明な限界は、「制限部位」として公知である、体内の、ある特定の領域への薬物送達である。治療剤を、脳、関節、前立腺、精巣、及び眼などの制限部位に送達することは、困難又は不可能である。アクセスは、血液脳関門、血液精巣関門、血液眼関門、血液網膜関門又は血液房水関門などの血液組織関門のために制限的でありうる。例えば、血液脳関門は、脳及び中枢神経系を、循環血液から分離することから、治療剤が、脳にアクセスする能力を制限する。アクセスはまた、関節へのアクセスを制限する、滑膜などの組織によっても制限されうる。滑膜は、滑膜内関節腔内の、大半の治療剤を濾過する（Allen, K. D. et al., “Evaluatingintra-articular drug delivery for the treatment of osteoarthritis in a ratmodel”, Tissue Engineering: Part B, Vol. 16, No. 1, pp.81-92 (2010)）。抗体など、大型の治療剤を、制限部位に送達することは、特に、困難である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0020】

【特許文献1】国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット

【特許文献2】米国公開第２０１６／０２１５０４３号明細書

【特許文献3】米国公開第２０１６／０１７５４１３号明細書

【特許文献4】米国公開第２０１３／０２４３７８５号明細書

【特許文献5】国際公開第２０１６／０４４２５２号パンフレット

【特許文献6】国際公開第２０１７／１８１１１６号パンフレット

【特許文献7】国際公開第２０１７／１４３０７３号パンフレット

【特許文献8】米国特許第５，７０２，７０４号明細書

【特許文献9】米国特許第６，３８０，１６５号明細書

【非特許文献】

【0021】

【非特許文献1】Aviles Jr., F. et al., “Contact low-frequency ultrasound used to accelerate granulationtissue proliferation and rapid removal of nonviabletissue in colonized wounds: a case study”, Ostomy WoundManagement, available online atwww.o-wm.com/content/contact-low-frequency-ultrasound-used-accelerate-granulation-tissue-proliferation-and-rapid(2011)

【非特許文献2】Lejbkowicz, F. et al., “Distinct sensitivity of normaland malignant cells to ultrasound in vitro”,Environmental Health Perspectives, Vol. 105, Supplement 6, pp. 1575-1578 (1997)

【非特許文献3】Wood, A. K. W. et al., “A review of low-intensity ultrasound for cancer therapy”, Ultrasound in Medicine & Biology, Vol. 41, No. 4, pp. 905-928(2015)

【非特許文献4】Wang, P. et al., “Membranedamage effect of continuous waveultrasound on K562 human leukemia cells”, Journal ofUltrasound Medicine, Vol.31, pp. 1977-1986 (2012)

【非特許文献5】Zhang, Z. et al., “Lowfrequency and intensity ultrasound induces apoptosis of brain glioma in ratsmediated by caspase-3 Bcl-2, and survivin”, Brain Research, Vol. 1473, pp. 25-34 (2012)

【非特許文献6】Endo, S. et al., “Porphyrinderivatives-mediated sonodynamic therapy for malignant gliomas in vitro”, Ultrasound in Medicine and Biology, Vol. 41, No. 9, pp. 2458-2465(2015)

【非特許文献7】Myers, R. et al., “Ultrasound-mediatedcavitation does not decrease the activity of small molecule, antibody orviral-based medicines”, International Journal ofNanomedicine, Vol. 13, pp. 337-349 (2018)

【非特許文献8】Watson, K. D. et al., “Ultrasound increases nanoparticle delivery by reducing intratumoral pressure and increasing transport inepithelial and epithelial-mesenchymal transition tumors”, Cancer Research, Vol. 72, No. 6,pp. 1485-1493 (2012)

【非特許文献9】Ninomiya, K. et al., “Targeted sonodynamic therapy using protein-modified TiO2nanoparticles”, Ultrasonics Sonochemistry, Vol. 19, pp.607-614 (2012)

【非特許文献10】Chen, R. et al., “Ultrasound-acceleratedimmunoassay, as exemplified by enzyme immunoassay of choriogonadotropin”, Clinical Chemistry, Vol. 30, No. 9, pp. 1446-1451 (1984)

【非特許文献11】Khaibullina, A. et al., “Pulsed high-intensity focusedultrasound enhances uptake of radiolabeled monoclonal antibody to humanepidermoidtumor in nude mice”, Journal of Nuclear Medicine, Vol.49, pp. 295-302 (2008)

【非特許文献12】Liao, A-H. et al., “Enhancedtherapeutic epidermal growthfactor receptor (EGFR) antibody delivery via pulsed ultrasound with targetingmicrobubbles for glioma treatment”, Journal of Medicaland Biological Engineering, Vol. 35, pp. 156-164 (2015)

【非特許文献13】Masui, T. et al., “Low-intensityultrasound enhances the anticancer activity of cetuximab in human head and neckcancer cells”, Experimental and Therapeutic Medicine,Vol. 5, pp. 11-16 (2013)

【非特許文献14】Allen, K. D. et al., “Evaluating intra-articular drug delivery for the treatment ofosteoarthritis in a rat model”, Tissue Engineering PartB Reviews, Vol. 16, No. 1, pp. 81-92 (2010)

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0022】

第１の態様では、本発明は、ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法であって、超音波を、対象印加する（apply）ステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステ
ップを含む方法である。

【0023】

第２の態様では、本発明は、組織培養物中又は細胞培養物中のＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法であって、超音波を、組織培養物又は細胞培養物に印加するステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、組織培養物又は細胞培養物に投与するステップを含む方法である。

【0024】

第３の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害を治療する方法であって、超音波を、ＡＧＥ障害を有する対象に印加するステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法である。

【0025】

第４の態様では、本発明は、神経膠腫に罹患している対象を治療する方法であって、対象の血液脳関門を破壊するステップ、その後、抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法である。

【0026】

第５の態様では、本発明は、骨関節炎に罹患している対象を治療する方法であって、超音波を、罹患関節に印加するステップ、その後、抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法である。組成物は、静脈内投与される。

【0027】

第６の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害を治療する方法であって、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体を、対象に投与するステップ；及び超音波を、対象に印加するステップを含む方法である。

【0028】

第７の態様では、本発明は、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体を含む組成物である。

【0029】

第８の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害の治療における使用のための、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体を含む組成物である。

【0030】

第９の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害を治療するための医薬の製造のための、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体の使用である。

【0031】

定義
「制限部位（restricted site）」という用語は、治療剤がアクセスすることが困難な
、ヒト体内の場所を意味する。制限部位の例は、脳、関節、眼、精巣、及び前立腺を含む。

【0032】

「ペプチド」という用語は、２～５０アミノ酸から構成される分子を意味する。

【0033】

「タンパク質」という用語は、５１アミノ酸以上から構成される分子を意味する。

【0034】

「終末糖化反応最終産物」、「ＡＧＥ」、「ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチド」、及び「糖化反応最終産物」という用語は、糖が、さらに再配列され、不可逆的架橋を形成するタンパク質側鎖と反応する結果として形成される、修飾タンパク質又は修飾ペプチドを指す。この過程は、還元糖とアミノ基との可逆反応であって、シッフ塩基を形成する可逆反応で始まり、これが進行して、共有結合性のアマドリ再配列産物を形成する。形成されると、アマドリ産物は、さらなる再配列を経て、ＡＧＥを産生する。ＡＧＥ修飾タンパク質、及びＡＧＥ修飾タンパク質に対する抗体については、Bucalaによる米国特許第５，７０２，７０４号明細書（「Bucala」）、及びAl-Abedet al.による米国特許第６，３８０，１６５号明細書（「Al-Abed」）において記載されている。糖化アルブミン
上で見出されるＮ－デオキシフルクトシルリシンなど、ＡＧＥを形成するのに必要な再配列を経ない、糖化タンパク質又は糖化ペプチドは、ＡＧＥではない。ＡＧＥは、２－（２－フルオイル）－４（５）－（２－フラニル）－１Ｈ－イミダゾール（「ＦＦＩ」：2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazole）；５－ヒドロキシメチル－１－アルキルピロール－２－カルバルデヒド（「ピラリン」）；非蛍光性のモデルＡＧＥである、１－アルキル－２－ホルミル－３，４－ジグリコシルピロール（「ＡＦＧＰ」：1-alkyl-2-formyl-3,4-diglycosyl pyrrole）；カルボキシメチルリシン；カルボキシエチルリシン；及び
ペントシジンなどのＡＧＥ修飾（また、ＡＧＥエピトープ又はＡＧＥ部分とも称される）の存在により同定されうる。別のＡＧＥである、ＡＬＩについては、Al-Abedにおいて記
載されている。

【0035】

「ＡＧＥ抗原」という用語は、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドに対する免疫応答を誘発する物質を意味する。細胞のＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドに対する免疫応答は、ＡＧＥが修飾されていないタンパク質又はペプチドに対する抗体の産生を含まない。

【0036】

「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、又は「ＡＧＥ抗体」とは、好ましくは、抗体の定常領域を含み、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドが、通常、細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウマ細胞、ラクダ科動物細胞（例えば、ラクダ細胞又はアルパカ細胞）、ウシ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、又はヤギ細胞の表面上に結合していることが見出される、タンパク質又はペプチドである、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドに結合する、抗体、抗体断片、又は他のタンパク質若しくはペプチドを意味する。「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、又は「ＡＧＥ抗体」は、ＡＧＥが修飾されたタンパク質又はペプチド、及びＡＧＥが修飾されていない、同じタンパク質又はペプチドの両方に、同じ特異性及び選択性で結合する（すなわち、ＡＧＥ修飾の存在は、結合を増大させない）、抗体又は他のタンパク質を含まない。ＡＧＥ修飾アルブミンは、アルブミンは、通常、細胞の表面上に結合していることが見出されるタンパク質ではないため、細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質ではない。「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、又は「ＡＧＥ抗体」は、細胞の除去、破壊、又は死をもたらす抗体だけを含む。また、例えば、毒素、薬物、又は他の化学物質若しくは粒子にコンジュゲートした抗体も含まれる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまた、可能である。

【0037】

「老化細胞」という用語は、増殖停止の状態にあり、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}の活性化、又は老化と関連するβ－ガラクトシダーゼの発現など、１又は２以上の、老化のバイオマーカーを発現する細胞を意味する。また、ＡＬＳ患者の筋肉内で見出される、一部のサテライト細胞など、インビボでは増殖しないが、ある特定の条件下にあるインビトロでは増殖しうる、１又は２以上の、老化のバイオマーカーを発現する細胞も含まれる。

【0038】

「老化細胞溶解剤」という用語は、老化細胞を破壊する、分子量９００ダルトン未満の低分子を意味する。「老化細胞溶解剤」という用語は、抗体、抗体コンジュゲート、タンパク質、ペプチド、又は生物療法を含まない。

【0039】

「ＡＧＥ障害」という用語は、終末糖化反応最終産物（ＡＧＥ）、ＡＧＥ修飾細胞、又は細胞の老化と関連する、病理学的な状態、疾患、又は障害を意味する。

【0040】

「バリアント」という用語は、特異的に同定された配列と異なり、１又は２以上のヌクレオチド、タンパク質又はアミノ酸の残基が、欠失するか、置換されるか、又は付加された、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、又はアミノ酸配列を意味する。バリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントの場合もあり、天然に存在しないバリアントの場合もある。同定された配列のバリアントは、同定された配列の機能的特徴の、一部又は全部を保持しうる。

【0041】

「配列同一性パーセント（％）」という用語は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列をアライメントし、必要な場合に、ギャップを導入し、保存的置換を、配列同一性の一部と考えずにおいた後で、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一な、候補配列のアミノ酸残基の百分率として規定される。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、BLASTソフトウェア、BLAST-2ソフトウェア、ALIGNソフトウェア、又はMegalign（DNASTAR社製）ソフトウェアなど、公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、多様な方式で達成されうる。好ましくは、配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムである、ALIGN-2を使用して生成される
。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.社（South San Francisco、CA）から公開されているか、又は米国著作権局において、ユーザー文書と共に保管さ
れ、米国著作権登録番号第TXU510087号の下に登録されている、ソースコードからコンパ
イルされうる。ALIGN-2プログラムは、デジタル式のUNIXV4.0Dを含む、UNIXオペレーテ
ィングシステム上の使用のためにコンパイルされるものとする。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。

【0042】

ALIGN-2が、アミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列
Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに照らした、これとの、又はこれに対する配列同一性％（これは、代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに照らした、これとの、又はこれに対する、ある特定のアミノ酸配列の同一性％を有するか、又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとしても言及される）は、以下：100×比X/Y［式中、Xは、配列アライメントプログラムALIGN-2により、このプログラムのＡとＢとのアライメントにおいて、同一なマッチとして評定されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である］の通りに計算される
。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａの、Ｂに照らした、アミノ酸配列の同一性％は、Ｂの、Ａに照らした、アミノ酸配列の同一性％と等しくない。そうでないことが具体的に言明されない限りにおいて、本明細書で使用される、全てのアミノ酸配列の同一性％値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して得られる
。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】抗体結合時間の時間と対比した応答についてのグラフである。

【図2A】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ－１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。

【図2B】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ－１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。

【図2C】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ－１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。

【図2D】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ－１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。

【図3】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ－１４神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。

【図4A】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ－１５神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。

【図4B】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ－１５神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。

【図4C】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ－１５神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。

【発明を実施するための形態】

【0044】

超音波は、制限部位への一時的なアクセスを可能としうることが発見されている。微小気泡の投与と組み合わせた、診断用超音波の印加は、血液脳関門を破壊する（Zhao, B. et al., “Blood-brain barrierdisruption induced by diagnostic ultrasound combined with microbubbles in mice”, Oncotarget, Vol. 9, No. 4, pp. 4897-4914(2018)）。微小気泡の存在下で印加された焦点化超音波は、ラットにおいて、血液脳関門を破壊して、化学療法薬である１，３－ビス（２－クロロエチル）－１－ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ：1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea又はカルムスチン）及びドキソルビシンの、神経膠芽腫への送達を可能とする（Liu, H-L. et al., “Blood-brain barrierdisruption
with focused ultrasound enhances delivery of chemotherapeutic drugs forglioblastoma treatment”, Radiology, Vol. 255, No. 2,pp. 415-425 (2010)；Sun, T. et al., “Closed-loop control of targeted ultrasound drug delivery across theblood-brain/tumor barriers in a rat glioma model”,Proceedings of the National Academy
of Sciences, pp. 1-10 (2017)）。微小気泡の存在下で印加された超音波は、血液脳関
門を破壊して、単鎖抗体であり、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））を、マウスの脳にアクセスさせることが可能である（Nisbet, R. M. et al., “Combined effects ofscanning ultrasound and a tau-specific single
chain antibody in a tau transgenic mouse model”, Brain,Vol. 140, pp. 1220-1230 (2017)；Kinoshita, M. et al., “Noninvasive localized delivery of Herceptin to
the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrierdisruption”, Proceedings of the National Academy ofSciences, Vol. 103, No. 31, pp. 11719-11723 (2006)）。これらの研究は、超音波の印加及び抗体の投与を含む組合せ
療法が、制限部位における、細胞及び組織をターゲティングするための効果的な治療レジメンであることを示唆する。

【0045】

多数のＡＧＥ障害が、制限部位に影響を及ぼす。例えば、近年の研究は、細胞の老化と神経膠腫との関連を同定している。神経膠腫細胞は、インビトロにおいて、自発的に老化する（Stoczynska-Fidelus,E., et al., “Spontaneous in vitro senescence of gliomacells confirmed by an antibody against IDH1R132H”,Anticancer Research, Vol. 34, pp. 2859-2868 (2014)）。同様に、終末糖化反応最終産物は、インビトロの神経膠腫細胞内で、亜硝酸塩蓄積の、用量依存的増大を引き起こす結果として、一酸化窒素の放出の増大、及び対応する酸化損傷の増大をもたらす（Lin, C-H. et al., “Advanced glycosylationend products induce nitric oxide synthase expression in C6 glioma cells
involvement of a p38 MAP kinase-dependent mechanism”,Life Sciences, Vol. 69, pp. 2503-2515 (2001)）。加えて、神経膠腫の侵襲性は、細胞増殖活性の低減、老化の徴候も伴う（Berens, M. E. et al., “‘...those leftbehind.’ Biology and oncology
of invasive glioma cells”, Neoplasia, Vol. 1, No. 3,pp. 208-219 (1999)）。細
胞の老化と神経膠腫との一般的連関を同定することにより、本出願は、終末糖化反応最終産物に結合する抗体が、神経膠腫に効果的な療法であることを示す。超音波の印加は、血液脳関門を破壊し、抗ＡＧＥ抗体が、神経膠腫細胞をターゲティングし、死滅させることを可能とするのに使用されうる。

【0046】

本発明は、超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せを使用して、制限部位内の、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドを発現する細胞（ＡＧＥ修飾細胞）を、特異的にターゲティングし、死滅させる。超音波は、制限部位へのアクセスをもたらし、次いで、これは、抗ＡＧＥ抗体が、制限部位内のＡＧＥ修飾細胞にアクセスすることを可能とする。超音波は、微小気泡などの造影剤を伴うか、又は伴わずに、制限部位へのアクセスをもたらす。

【0047】

超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せはまた、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を増強するのにも使用されうる。超音波は、抗体の、標的抗原への結合を増大させ、これは、抗ＡＧＥ抗体の、ＡＧＥ修飾細胞への結合を改善するであろう。結合が起きると、超音波はまた、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機構を介する、細胞の殺滅も増強する。加えて、抗ＡＧＥ抗体が結合したＡＧＥ修飾細胞は、超音波による破壊を、より受けやすい。超音波が炎症過程に干渉する能力はまた、細胞老化の鍵となる駆動因子である炎症も軽減するであろう。超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せは、老化細胞などのＡＧＥ修飾細胞の殺滅において、相乗作用的であり、相加効果より大きな効果をもたらす。これらの細胞殺滅効果の増強は、体内の任意の場所又はインビトロ環境において実現されうる。

【0048】

ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法は、超音波を印加するステップ、及び糖化反応最終産物に結合する抗体（抗ＡＧＥ抗体）を投与するステップを含む。超音波は、制限部位へのアクセスを容易とするように、抗体が投与される前に印加されうる。代替的に、超音波は、抗体が投与された後及び／又は投与時に印加される場合もある。

【0049】

ＡＧＥ修飾細胞は、体内の任意の部分に見出されうる。好ましくは、ＡＧＥ修飾細胞は、制限部位にある。制限部位の例は、脳、関節、眼、精巣、及び前立腺を含む。代替的に、ＡＧＥ修飾細胞は、組織培養物又は細胞培養物など、インビトロ環境にありうる。

【0050】

超音波は、２０，０００Ｈｚ～１５ＭＨｚの周波数で印加されうる。好ましくは、超音波は、０．６ＭＨｚ、０．７ＭＨｚ、０．８ＭＨｚ、０．９ＭＨｚ、１．０ＭＨｚ、１．５ＭＨｚ、２．０ＭＨｚ、２．５ＭＨｚ、３．０ＭＨｚ、３．５ＭＨｚ、４．０ＭＨｚ、４．５ＭＨｚ、５．０ＭＨｚ、５．１ＭＨｚ、５．２ＭＨｚ、５．３ＭＨｚ、５．４ＭＨｚ、５．５ＭＨｚ、５．６ＭＨｚ、５．７ＭＨｚ、５．８ＭＨｚ、５．９ＭＨｚ、６．０ＭＨｚ、６．１ＭＨｚ、６．２ＭＨｚ、６．３ＭＨｚ、６．４ＭＨｚ、６．５ＭＨｚ、６．６ＭＨｚ、６．７ＭＨｚ、６．８ＭＨｚ、６．９ＭＨｚ、７．０ＭＨｚ、７．５ＭＨｚ、８．０ＭＨｚ、８．５ＭＨｚ、９．０ＭＨｚ、及び９．５ＭＨｚを含む、０．５～１０ＭＨｚの周波数で印加される。

【0051】

超音波は、０．０１～５Ｗ／ｃｍ^２の強度で印加されうる。好ましくは、超音波は、０
．０６Ｗ／ｃｍ^２、０．０７Ｗ／ｃｍ^２、０．０８Ｗ／ｃｍ^２、０．０９Ｗ／ｃｍ^２、０．１Ｗ／ｃｍ^２、０．２Ｗ／ｃｍ^２、０．３Ｗ／ｃｍ^２、０．４Ｗ／ｃｍ^２、０．５Ｗ／ｃｍ^２、０．６Ｗ／ｃｍ^２、０．７Ｗ／ｃｍ^２、０．８Ｗ／ｃｍ^２、０．９Ｗ／ｃｍ^２、１．０Ｗ／ｃｍ^２、１．１Ｗ／ｃｍ^２、１．２Ｗ／ｃｍ^２、１．３Ｗ／ｃｍ^２、１．４Ｗ／ｃｍ^２、１．５Ｗ／ｃｍ^２、１．６Ｗ／ｃｍ^２、１．７Ｗ／ｃｍ^２、１．８Ｗ／ｃｍ^２、１．９Ｗ／ｃｍ^２、２．０Ｗ／ｃｍ^２、２．５Ｗ／ｃｍ^２、３．０Ｗ／ｃｍ^２、３．５Ｗ／ｃｍ^２、４．０Ｗ／ｃｍ^２、及び４．５Ｗ／ｃｍ^２を含む、０．０５～５Ｗ／ｃｍ^２の強度で印加される。

【0052】

超音波は、連続超音波の場合もあり、パルス状超音波の場合もある。好ましくは、超音波は、パルス状超音波である。パルス状超音波は、０．０１～２０ｋＨｚのパルス反復周波数（ＰＲＦ：pulse repetition frequency）を有しうる。好ましくは、パルス状超音波は、０．０６ｋＨｚ、０．０７ｋＨｚ、０．０８ｋＨｚ、０．０９ｋＨｚ、０．１ｋＨｚ、０．２ｋＨｚ、０．３ｋＨｚ、０．４ｋＨｚ、０．５ｋＨｚ、１．０ｋＨｚ、１．５ｋＨｚ、２．０ｋＨｚ、３．０ｋＨｚ、３．５ｋＨｚ、４．０ｋＨｚ、４．５ｋＨｚ、５．０ｋＨｚ、５．５ｋＨｚ、６．０ｋＨｚ、６．５ｋＨｚ、７．０ｋＨｚ、７．５ｋＨｚ、８．０ｋＨｚ、８．５ｋＨｚ、９．０ｋＨｚ、及び９．５ｋＨｚを含む、０．０５～１０ｋＨｚのＰＲＦを有する。

【0053】

超音波は、毎日１回又は２回以上印加されうる。例えば、超音波は、毎日１～１００回印加されうる。超音波は、１時間当たり１回（毎日２４回）など、規則的な間隔で印加される場合もあり、１時間当たり６０回など、一定時間内に２回以上印加される場合もある。毎週１回又は毎月１回を含む、低頻度の施行もまた可能である。

【0054】

超音波は、焦点化される場合もあり、非焦点化される場合もある。焦点化超音波は、典型的に、非焦点化超音波より、大きな強度を送達する。

【0055】

波長、速度、波形、印加の持続時間、パルスの持続時間、空間におけるパルス長及びパルス占有率など、他の超音波パラメータも、特異的治療効果をもたらすように変動させうる。好ましくは、超音波パラメータは、ＡＧＥ修飾細胞をターゲティングする一方で、他の細胞を回避するように選択される。

【0056】

適切な超音波パラメータは、単純な実験により決定されうる。細胞は、患者に由来する試料中、又は細胞培養物中など、単離されうる。硬化又は弾力性の変化など、細胞間の物理的差違は、標的細胞の同定を可能とする（例えば、米国特許第６，０６７，８５９号明細書及び米国特許第７，７５１，０５７号明細書を参照されたい）。超音波は、所望の転帰が達成されるまで、細胞に印加することができる。細胞は、超音波の効果を決定するように、超音波印加の前及び後に観察する。１又は２以上の超音波パラメータを変動させる場合があり、超音波を再度印加することができる。次いで、細胞を観察して、改変された超音波パラメータの効果を決定する。所望の治療効果を達成するまで、この工程を反復する。例えば、ＡＧＥ修飾細胞を単離し、超音波を印加して、細胞の破壊を結果としてもたらす、共鳴調和周波数を決定することができる。超音波の周波数は、共鳴調和周波数を決定するまで、漸増させることができる。適切な超音波パラメータの決定は、超音波は、予測可能な結果をもたらす、十分に研究された機械的技法であるので、当業者に単純な工程である。

【0057】

造影剤は、超音波を印加する前に投与されていてもよく、同時に投与されてもよい。好ましい造影剤は、ガス入り微小気泡を含む。微小気泡は、アルブミン（ALBUNEX（登録商
標）、BISPHERE（登録商標）、ECHOGEN（登録商標）、及びOPTISON（登録商標））、リン脂質（DEFINITY（登録商標）、IMAGENT（登録商標）、MICROMARKER（登録商標）、SONAZOID（登録商標）、SONOVUE（登録商標）、及びTARGESTAR（登録商標））、糖脂質（LEVOVIST（登録商標））、又はPLGA／リン脂質（IMAGIFY（登録商標））から構成される外殻を
有しうる。ナノメートルスケールの直径を有する微小気泡はまた、ナノ気泡とも称される。造影剤は、超音波が印加される場所の近傍に投与されうる。

【0058】

微小気泡はまた、超音波による薬物送達にも使用されうる。治療剤は、微小気泡の外側にコンジュゲートされる場合もあり、微小気泡の内側に、ガス入りで含有される場合もある。微小気泡は、ターゲティングリガンドにコンジュゲートされうる。好ましいターゲティングリガンドは、治療剤としてもまた作用しうる、モノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、それらの免疫原性を低減するように、好ましくは、ヒト化される（又は治療される種に適切であるように、同様に改変される）。特に、好ましいターゲティングリガンドは、ヒト化抗ＡＧＥモノクローナル抗体である。超音波による薬物送達のための、他の薬物担体は、リポソーム及びミセルを含む。リポソーム及びミセルもまた、抗ＡＧＥ抗体などのモノクローナル抗体にコンジュゲートされうる。

【0059】

超音波は、任意の適切な超音波振動子を使用して発生させて印加しうる。好ましい超音波振動子は、超音波プローブである。超音波の、体内への透過を改善するように、水ベースのゲルが、治療領域に塗布されうる。代替的に、超音波発生器は、制限部位へのアクセスを、さらに容易とするように、体内に植え込まれる場合もある（例えば、U.S. Pat. No. 8,977,361を参照されたい）。

【0060】

抗ＡＧＥ抗体は、ＦＦＩ、ピラリン、ＡＦＧＰ、ＡＬＩ、カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ：carboxymethyllysine）、カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ：carboxyethyllysine
）、及びペントシジンなど、ＡＧＥ修飾を有する、１又は２以上のＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチド、及びこのような抗体の混合物に結合しうる。好ましくは、抗体は、ヒト；ネコ、イヌ、及びウマを含む愛玩動物；並びにラクダ（又はアルパカ）、ウシ（ウシ）、ヒツジ、ブタ、及びヤギなど、商業的に重要な動物に対して非免疫原性であるなど、それが使用される動物に対して非免疫原性である。より好ましくは、抗体は、ヒト化抗体（ヒトに対する）、ネコ化抗体（ネコに対する）、イヌ化抗体（イヌに対する）、ウマ化抗体（ウマに対する）、ラクダ科動物化抗体（ラクダ又はアルパカに対する）、ウシ化抗体（ウシに対する）、ヒツジ化抗体（ヒツジに対する）、ブタ化抗体（ブタに対する）、又はヤギ化抗体（ヤギに対する）など、抗体に対する免疫応答を低減するように、動物の抗体と同種の定常領域を有する。最も好ましくは、抗体は、ヒト抗体、ネコ抗体、イヌ抗体、ウマ抗体、ラクダ抗体、ウシ抗体、ヒツジ抗体、ブタ抗体、又はヤギ抗体など、それが使用される動物の抗体と同一（可変領域を除き）である。これらの動物に対する抗体の定常領域及び他の部分の詳細については、下記に記載される。抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もある。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。

【0061】

好ましい抗ＡＧＥ抗体は、カルボキシメチルリシンＡＧＥ修飾又はカルボキシエチルリシンＡＧＥ修飾を呈する、タンパク質又はペプチドに結合する抗ＡＧＥ抗体を含む。カルボキシメチルリシン（また、Ｎ（イプシロン）－（カルボキシメチル）リシン、Ｎ（６）－カルボキシメチルリシン、又は２－アミノ－６－（カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸としても公知である）、及びカルボキシエチルリシン（また、Ｎ－イプシロン－（カルボキシエチル）リシンとしても公知である）は、酸化ストレス及び化学物質の糖化反応の結果として、タンパク質又はペプチド及び脂質において見出される。ＣＭＬ改変タンパク質又はＣＭＬ改変ペプチド及びＣＥＬ改変タンパク質又はＣＥＬ改変ペプチドは、様々な細胞上で発現される受容体である、ＲＡＧＥにより認識される。ＣＭＬ及びＣＥＬについては、十分に研究されており、ＣＭＬ関連製品及びＣＥＬ関連製品は市販されている。例えば、Cell Biolabs, Inc.社は、ＣＭＬ－ＢＳＡ抗原、ＣＭＬポリクローナル抗体、ＣＭＬ免疫ブロットキット、及びＣＭＬ競合ＥＬＩＳＡキット（www.cellbiolabs.com/cml-assays）のほか、ＣＥＬ－ＢＳＡ抗原及びＣＥＬ競合ＥＬＩＳＡキット（www.cellbiolabs.com/cel-n-epsilon-carboxyethyl-lysine-assays-and-reagents）を販売している。好ま
しい抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンをコンジュゲートしたカルボキシメチルリシンに対して惹起された、市販のマウス抗糖化反応最終産物抗体であって、R&D Systems, Inc.社から入手可能であり（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）、ヒト定常領域（又
はそれが投与される動物の定常領域）を有するように修飾された抗体であるカルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）の可変領域を含む。R&D Systems, Inc.社の型番
：MAB3247に対応するカルボキシメチルリシン抗体など、市販の抗体は、診断目的で対象
となる場合があり、動物又はヒトにおける使用に適さない材料を含有しうる。好ましくは、市販の抗体は、毒素又は他の潜在的に有害な材料を除去するように、動物又はヒトにおける使用の前に、精製及び／又は単離される。

【0062】

抗ＡＧＥ抗体は、好ましくは、抗体－抗原複合体からの解離速度又はｋ_ｄ（また、ｋ_ｂａｃｋ又はオフ速度とも称される）が小さい、好ましくは、９×１０^－３、８×１０^－３、７×１０^－３、６×１０^－３（１／秒）以下である。抗ＡＧＥ抗体は、好ましくは、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質に対する高アフィニティーを有し、これは、低解離定数である、９×１０^－６、８×１０^－６、７×１０^－６、６×１０^－６、５×１０^－６、４×１０^－６、又は３×１０^－６（Ｍ）以下のＫ_Ｄとして表されうる。好ましくは、抗ＡＧＥ抗体結合特性は、図１に例示される、R&D Systems, Inc.社（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）から市販されているカルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）と、同等で
あるか、同じであるか、又はこれより優れている。

【0063】

抗ＡＧＥ抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ：antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity）を介して、ＡＧＥ修飾細胞を破壊しうる。ＡＤＣＣとは、免
疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原に特異的抗体が結合した標的細胞を、能動的に溶解する、細胞媒介性免疫防御のメカニズムである。ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ：natural killer）細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球により媒介されうる。エフェクター細胞は、結合した抗体のＦｃ部分に結合する。抗ＡＧＥ抗体はまた、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ：complement-dependent cytotoxicity）を介して、ＡＧＥ修飾細胞
も破壊しうる。ＣＤＣでは、免疫系の補体カスケードは、抗体の、標的抗原に結合した抗体により誘発される。

【0064】

抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を引き起こす薬剤にコンジュゲートされうる。このような薬剤は、毒素、細胞毒性剤、磁気ナノ粒子、及び磁気スピンボルテックスディスクでありうる。

【0065】

ＡＧＥ修飾細胞を、選択的にターゲティングし、これらを除去するように、抗ＡＧＥ抗体にコンジュゲートした小孔形成毒素（ＰＦＴ：pore-forming toxin）（Aroian R. et al., “Pore-Forming Toxins andCellular Non-Immune Defenses (CNIDs),” Current Opinionin Microbiology, 10:57-61 (2007)）などの毒素が、患者に注射されうる。抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥ修飾細胞を認識し、これらに結合する。次いで、毒素が、細胞表面にポア形成を引き起こし、浸透圧溶解によって、細胞を除去する。

【0066】

抗ＡＧＥ抗体にコンジュゲートした磁気ナノ粒子を患者に注射して、ＡＧＥ修飾細胞をターゲティングし、除去することができる。ＡＧＥ修飾細胞を、選択的に除去するために、磁場を印加することにより、磁気ナノ粒子は加熱されうる。

【0067】

代替法として、血管を遮断しうる自己凝集を回避するために、磁場が印加されたときだけ磁化される磁気スピンボルテックスディスクは、磁場が印加されると、スピンし始め、標的細胞の膜破壊を引き起こす。抗ＡＧＥ抗体にコンジュゲートした磁気スピンボルテックスディスクは、他の細胞の除去を伴わずに、ＡＧＥ修飾細胞型を、特異的にターゲティングする。

【0068】

本発明に従うヒト化抗ＡＧＥ抗体は、配列番号２２に示されるアミノ酸の、ヒト定常領域配列を有しうる。ヒト化抗ＡＧＥ抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２３（ＣＤＲ１Ｈ）、配列番号２４（ＣＤＲ２Ｈ）、及び配列番号２５（ＣＤＲ３Ｈ）に示されるタンパク質配列のうちの１又は２以上を有しうる。ヒト化抗ＡＧＥ抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号２６（ＣＤＲ１Ｌ）、配列番号２７（ＣＤＲ２Ｌ）、及び配列番号２８（ＣＤＲ３Ｌ）に示されるタンパク質配列のうちの１又は２以上を有しうる。

【0069】

ヒト化抗ＡＧＥ抗体の重鎖は、配列番号１のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。重鎖の可変ドメインは、配列番号２のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。重鎖可変ドメインの相補性決定領域（配列番号２）は、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に示される。ヒト化抗ＡＧＥ抗体のカッパ軽鎖は、配列番号３のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。カッパ軽鎖の可変ドメインは、配列番号４のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。配列番号４の１２８位におけるアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）残基は、省かれてもよい。軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（配列番号４）は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に示される。可変領域は、コドンが最適化され、合成され、ヒト免疫グロブリンＧ１定常領域を含有する発現ベクターにクローニングされうる。加えて、可変領域は、非ヒト抗ＡＧＥ抗体の調製において使用されうる。

【0070】

抗体の重鎖は、マウス抗ＡＧＥ抗体免疫グロブリンＧ２ｂ重鎖のＤＮＡ配列である、配列番号１２によりコードされうる。配列番号１２によりコードされるマウス抗ＡＧＥ抗体免疫グロブリンＧ２ｂ重鎖のタンパク質配列は、配列番号１６に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号１６の２５～１４２位に対応する、配列番号２０に示される。抗体の重鎖は、代替的に、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のＤＮＡ配列である、配列番号１３によりコードされうる。配列番号１３によりコードされる、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のタンパク質配列は、配列番号１７に示される。キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンは、配列番号２０の２５～１４２位における、マウス可変領域を含む。抗体の軽鎖は、マウス抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖である、配列番号１４のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号１４によりコードされる、マウス抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号１８に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号２１に示され、これは配列番号１８の２１～１３２位に対応する。抗体の軽鎖は、代替的に、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒトカッパ軽鎖である、配列番号１５のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号１５によりコードされる、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒトカッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号１９に示される。キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンは、配列番号２１の２１～１３２位におけるマウス可変領域を含む。

【0071】

本発明に従うヒト化抗ＡＧＥ抗体は、１又は２以上のヒト化重鎖又はヒト化軽鎖を有しうるか、又は含みうる。ヒト化重鎖は、配列番号３０、３２、又は３４のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号３０、配列番号３２、及び配列番号３４によりコードされるヒト化重鎖のタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３に示される。ヒト化軽鎖は、配列番号３６、配列番号３８、又は配列番号４０のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号３６、配列番号３８、及び配列番号４０によりコードされるヒト化軽鎖のタンパク質配列は、それぞれ、配列番号３５、配列番号３７、及び配列番号３９に示される。好ましくは、ヒト化抗ＡＧＥ抗体は、元の抗体特異性を保持しながら、ヒト配列の量を最大化する。配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３から選び出されるタンパク質配列を有する重鎖、並びに配列番号３５、配列番号３７、及び配列番号３９から選び出されるタンパク質配列を有する軽鎖を含有する、完全ヒト化抗体が構築されうる。

【0072】

特に好ましい抗ＡＧＥ抗体は、マウス抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体をヒト化することにより得られうる。マウス抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体は、配列番号４７に示される重鎖タンパク質配列（可変ドメインのタンパク質配列は、配列番号５２に示される）と、及び配列番号５７に示される、軽鎖タンパク質配列（可変ドメインのタンパク質配列は、配列番号６２に示される）とを有する。好ましいヒト化重鎖は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１に示されるタンパク質配列（ヒト化重鎖の可変ドメインのタンパク質配列は、それぞれ、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６に示される）を有しうる。好ましいヒト化軽鎖は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、又は配列番号６１に示されるタンパク質配列（ヒト化軽鎖の可変ドメインのタンパク質配列は、それぞれ、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６に示される）を有しうる。好ましくは、ヒト化抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるタンパク質配列を有する重鎖、並びに配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択されるタンパク質配列を有する軽鎖から構成される。これらのタンパク質配列から構成されたヒト化抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体は、良好な結合及び／又は免疫系の活性化の改善を有する結果として、効能の増大をもたらしうる。

【0073】

非ヒト種に由来する抗体のタンパク質配列は、配列番号２に示される配列を有する重鎖、又は配列番号４に示される配列を有するカッパ軽鎖の可変ドメインを含むように修飾されうる。非ヒト種は、飼いネコ又は飼いイヌなどの愛玩動物の場合もあり、ウシ、ウマ、又はラクダなどの家畜の場合もある。好ましくは、非ヒト種は、マウスではない。ウマ（Equus caballus）抗体免疫グロブリンガンマ４の重鎖は、配列番号５のタンパク質配列（EMBL/GenBank受託番号：AY445518）を有しうるか、又は含みうる。ウマ（Equus caballus）抗体免疫グロブリンデルタの重鎖は、配列番号６のタンパク質配列（EMBL/GenBank受託番号：AY631942）を有しうるか、又は含みうる。イヌ（Canis familiaris）抗体免疫グロブリンＡの重鎖は、配列番号７のタンパク質配列（GenBank受託番号：L36871）を有しう
るか、又は含みうる。イヌ（Canis familiaris）抗体免疫グロブリンＥの重鎖は、配列番号８のタンパク質配列（GenBank受託番号：L36872）を有しうるか、又は含みうる。ネコ
（Felis catus）抗体免疫グロブリンＧ２の重鎖は、配列番号９のタンパク質配列（DDBJ/EMBL/GenBank受託番号：KF811175）を有しうるか、又は含みうる。

【0074】

ラクダ（ヒトコブラクダ（Camelus dromedarius）及びフタコブラクダ（Camelus bactrianus））、ラマ（llama）（ラマ（Lama glama）、アルパカ（Lama pacos及びLama vicugna））、アルパカ（Vicugna pacos）、及びグアナコ（Lama guanicoe）などのラクダ科の動物は、他の哺乳動物では見出されない、固有の抗体を有する。従来の免疫グロブリンＧ抗体から構成される重鎖及び軽鎖の四量体に加えて、ラクダ科動物はまた、軽鎖を含有せず、重鎖二量体として存在する、重鎖免疫グロブリンＧ抗体も有する。これらの抗体は、重鎖抗体、ＨＣＡｂ、単一ドメイン抗体、又はｓｄＡｂとして公知であり、ラクダ科動物の重鎖抗体の可変ドメインは、ＶＨＨとして公知である。ラクダ科動物の重鎖抗体は、重鎖ＣＨ１ドメインを欠き、他の種では見出されないヒンジ領域を有する。アラビアラクダ（ヒトコブラクダ）単一ドメイン抗体の可変領域は、配列番号１０のタンパク質配列（GenBank 受託番号：AJ245148）を有しうるか、又は含みうる。アラビアラクダ（ヒトコブラクダ）の四量体免疫グロブリン重鎖の可変領域は、配列番号１１のタンパク質配列（GenBank受託番号：AJ245184）を有しうるか、又は含みうる。

【0075】

ラクダ科動物に加えて、重鎖抗体はまた、サメ、ガンギエイ、及びエイなどの軟骨魚に
おいても見出される。この種類の抗体は、免疫グロブリン新抗原受容体又はＩｇＮＡＲとして公知であり、ＩｇＮＡＲの可変ドメインは、ＶＮＡＲとして公知である。ＩｇＮＡＲは、各々１つずつの可変ドメイン及び５つずつの定常ドメインから構成される、２つの同一な重鎖二量体として存在する。ラクダ科動物と同様に、軽鎖は存在しない。

【0076】

さらなる非ヒト種のタンパク質配列は、International ImMunoGeneTicsInformation System（www.imgt.org）、European Bioinformatics Institute（www.ebi.ac.uk）、DNA Databank of Japan（ddbj.nig.ac.jp／arsa）、又はNationalCenter for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov）などのオンラインデータベース内で、たやすく見
出されうる。

【0077】

抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する重鎖は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。

【0078】

抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号２、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、又は欠失は、可変領域外の領域内で生じうる。

【0079】

抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、又は配列番号６１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する軽鎖は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、又は欠失は、可変領域外の領域内で生じうる。

【0080】

抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号４、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、又は配列番号６６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、又は欠失は、可変領域外の領域内で生じうる。

【0081】

代替的に、抗体は、ＣＭＬ－ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニンをコンジュゲートしたカルボキシメチルリシン：carboxymethyl lysine conjugated with keyhole limpet hemocyanin）に対して惹起された、市販のマウス抗糖化反応最終産物抗体であって、R&D Systems, Inc.社から入手可能な抗体（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）である、
カルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）の相補性決定領域を有しうる。

【0082】

抗体は、対象の免疫系による、標的とする細胞の破壊を可能とする定常領域を有しうるか、又は含みうる。

【0083】

ＡＧＥ型が２以上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体の混合物もまた、使用されうる。

【0084】

２つの異なるエピトープに向けられた抗ＡＧＥ抗体である二重特異性抗体もまた、使用されうる。このような抗体は、１つの抗ＡＧＥ抗体の可変領域に由来する可変領域（又は相補性決定領域）、及び異なる抗体に由来する可変領域（又は相補性決定領域）を有するであろう。

【0085】

抗体断片は、全抗体の代わりに使用されうる。例えば、免疫グロブリンＧは、酵素による消化を介して、小型断片に分解されうる。パパイン消化は、重鎖間ジスルフィド架橋のＮ末端側を切断して、Ｆａｂ断片をもたらす。Ｆａｂ断片は、軽鎖と、重鎖の、２つのＮ末端ドメインのうちの１つとを含む（また、Ｆｄ断片としても公知である）。ペプシン消化は、重鎖間ジスルフィド架橋のＣ末端側を切断して、Ｆ（ａｂ’）_２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、軽鎖、及びジスルフィド架橋により連結された、２つのＮ末端ドメインの両方を含む。ペプシン消化はまた、Ｆｖ（可変断片：fragment variable）及び
Ｆｃ断片（結晶性断片）も形成しうる。Ｆｖ断片は、２つのＮ末端可変ドメインを含有する。Ｆｃ断片は、細胞上の免疫グロブリン受容体、及び補体カスケードの最初の要素と相互作用するドメインを含有する。ペプシンはまた、重鎖の第３定常ドメイン（Ｃ_Ｈ３：third constant domain of the heavy chain）の前で、免疫グロブリンＧを切断して、大型断片であるＦ（ａｂｃ）と、小型断片であるｐＦｃ’とをもたらす場合もある。抗体断片は、代替的に、組換えによりもたらされる場合もある。好ましくは、このような抗体断片は、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を引き起こす薬剤にコンジュゲートされうる。

【0086】

さらなる抗体が所望される場合、これらは、周知の方法を使用して作製されうる。例えば、哺乳動物宿主において、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は、免疫原と、所望の場合、アジュバントとの、１回又は２回以上の注射により惹起されうる。典型的に、免疫原（及びアジュバント）は、哺乳動物において、皮下注射又は腹腔内注射により注射されうる。免疫原は、ＡＧＥ－抗トロンビンIII、ＡＧＥ－カルモジュリン、ＡＧＥ－インスリン、
ＡＧＥ－セルロプラスミン、ＡＧＥ－コラーゲン、ＡＧＥ－カテプシンＢ、ＡＧＥ－ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ－ＢＳＡ）、ＡＧＥ－ヒト血清アルブミン、及びオボアルブミンなどのＡＧＥ－アルブミン、ＡＧＥ－クリスタリン、ＡＧＥ－プラスミノーゲン活性化因子、ＡＧＥ－内皮細胞膜タンパク質、ＡＧＥ－アルデヒドレダクターゼ、ＡＧＥ－トランスフェリン、ＡＧＥ－フィブリン、ＡＧＥ－銅／亜鉛ＳＯＤ、ＡＧＥ－ａｐｏ Ｂ、ＡＧＥ－フィブロネクチン、ＡＧＥ－膵リボース、ＡＧＥ－ａｐｏ Ａ－Ｉ及びII、ＡＧＥ－ヘモグロビン、ＡＧＥ－Ｎａ^＋／Ｋ^＋－ＡＴＰアーゼ、ＡＧＥ－プラスミノーゲン、ＡＧＥ－ミエリン、ＡＧＥ－リゾチーム、ＡＧＥ－免疫グロブリン、ＡＧＥ－赤血球Ｇｌｕ輸送タンパク質、ＡＧＥ－β－Ｎ－アセチルヘキソミナーゼ、ＡＧＥ－ａｐｏ Ｅ、ＡＧＥ－赤血球膜タンパク質、ＡＧＥ－アルドースレダクターゼ、ＡＧＥ－フェリチン、ＡＧＥ－赤血球スペクトリン、ＡＧＥ－アルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＧＥ－ハプトグロビン、ＡＧＥ－チューブリン、ＡＧＥ－甲状腺ホルモン、ＡＧＥ－フィブリノーゲン、ＡＧＥ－β_２－マイクログロブリン、ＡＧＥ－ソルビトールデヒドロゲナーゼ、ＡＧＥ－α_１－抗トリプシン、ＡＧＥ－炭酸デヒドラターゼ、ＡＧＥ－ＲＮアーゼ、ＡＧＥ－低密度リポタンパク質、ＡＧＥ－ヘキソキナーゼ、ＡＧＥ－ａｐｏ Ｃ－Ｉ、ＡＧＥ－ＲＮアーゼ、ＡＧＥ－ヒトヘモグロビンなどのＡＧＥ－ヘモグロビン、ＡＧＥ－低密度リポタンパク質（ＡＧＥ－ＬＤＬ）、及びＡＧＥ－コラーゲンIVなど、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質でありうる。ＡＧＥ修飾全赤血球、ＡＧＥ修飾溶解赤血球、又はＡＧＥ修飾部分消化赤血球などのＡＧＥ修飾細胞もまた、ＡＧＥ抗原として使用されうる。アジュバントの例は、フロイント完全、モノホスホリルリピドＡ合成トレハロースジコリノミコレート、アルミニウム水酸化物（アラム）、熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０又はＨＳＰ９６、モノホスホリルリピドＡを含有するスクアレンエマルジョン、α２－マクログロブリン、並びに油エマルジョン、プルロニック（pleuronic）ポリオール、ポリアニオン、及びジニトロフェノ
ールを含む表面活性物質を含む。免疫応答を改善するために、免疫原は、ＫＬＨ（keyhole limpethemocyanin）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、コレラ毒素、不安定
性エンテロトキシン、シリカ粒子、又はダイズトリプシン阻害剤など、宿主において免疫原性のポリペプチドにコンジュゲートされうる。好ましい免疫原コンジュゲートは、ＡＧＥ－ＫＬＨである。代替的に、ｐＡｂは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリにおいて作製されうる。

【0087】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ：monoclonal antibody）はまた、宿主又は宿主に由来す
るリンパ球を免疫化し、ｍＡｂを分泌する（又はｍＡｂを潜在的に分泌する）リンパ球を採取し、これらのリンパ球を、不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）に融合させ、所望のｍＡｂを分泌する細胞を選択することによっても作製されうる。ＥＢＶハイブリドーマ法など、他の技法も使用されうる。非ヒト抗体は、抗体を、非ヒト抗体の構成要素と、ヒト抗体の構成要素との組合せを含有するように改変することにより、ヒトに対して免疫原性でなくされうる。キメラ抗体は、非ヒト抗体の可変領域を、ヒト定常領域と組み合わせることにより作製されうる。ヒト化抗体は、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）を、非ヒト抗体のＣＤＲで置きかえることにより作製されうる。同様に、抗体は、アミノ酸レベルで、実質的にネコ、イヌ、ウマ、ラクダ又はアルパカ、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギなど、所与の動物「化」されることにより、他の種に対しても免疫原性でなくされうる。所望の場合、ｍＡｂは、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫酸アンモニウム沈殿、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の手順により、培養培地又は腹水から精製されうる。加えて、ヒトモノクローナル抗体は、第３のコピーである、ヒトＩｇＧのトランス遺伝子座と、サイレンシングされた、内因性のマウスＩｇ遺伝子座とを含有する、トランスジェニックマウスの免疫化により作出される場合もあり、ヒトトランスジェニックマウスを使用することにより作出される場合もある。ヒト化モノクローナル抗体及びその断片の作製はまた、ファージディスプレイ法を介してもなされうる。

【0088】

「薬学的に許容される担体」は、医薬の投与に適合性のものなど、任意の溶媒及び全ての溶媒、任意の分散媒及び全ての分散媒、任意のコーティング及び全てのコーティング、任意の抗菌剤及び抗真菌剤並びに全ての抗菌剤及び抗真菌剤、任意の等張剤及び全ての等張剤、並びに任意の吸収遅延剤及び全ての吸収遅延剤を含む。好ましい、このような担体又は希釈剤の例は、水、生理食塩液、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む。補足的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれうる。非経口投与のために使用されうる溶液及び懸濁液は、注射用水、生理食塩液溶液、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなど、等張性を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整されうる。非経口調製物は、ガラス製又はプラスチック製の、アンプル、ディスポーザブルのシリンジ、又は複数回投与用のバイアルに封入されうる。

【0089】

抗体は、静脈内注射などの注射により投与される場合もあり、関節への関節内注射など、局所投与される場合もある。注射に適切な医薬組成物は、滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液の即席調製物のための、滅菌水溶液又は水性分散液を含む。注射に適切な抗体による医薬組成物中には、多様な賦形剤が含まれうる。適切な担体は、生理食塩液、静菌水、CREMOPHOR EL（登録商標）（BASF社製；Parsippany、NJ）、又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）を含む。いずれの場合も、組成物は、滅菌でな
ければならず、シリンジを使用して投与されるように、流体であるものとする。このような組成物は、製造時及び保管時に、安定であるものとし、細菌及び真菌などの微生物による汚染に対して保護されなければならない。多様な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールが、微生物汚染を封じ込めうる。組成物中には、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムなどの等張剤が含まれうる。吸収を遅延させうる組成物は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤を含む。滅菌注射用溶液は、抗体と、他の任意の治療成分とを、適切な溶媒中に、要求される成分のうちの１つ又は組合せと共に、要求量で組み込むことに続き、滅菌を行うことにより調製されうる。滅菌注射用溶液を調製するために、滅菌固体を調製する方法は、固体をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥を含む。

【0090】

吸入による投与のために、抗体は、噴霧器又は適切な高圧ガス、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する高圧容器からのエアゾールスプレーとして送達されうる。抗体はまた、例えば、iSPERSE（商標）吸入型薬物送達プラットフォーム（PULMATRIX社製、Lexington、Mass.）を使用する乾燥粉末として、吸入を介しても送達されうる。ニワトリ抗体（ＩｇＹ）である、抗ＡＧＥ抗体の使用は、吸入により投与された場合、ヒトを含む、様々な動物において、非免疫原性でありうる。

【0091】

各種の抗体の、適切な投与量レベルは、一般に、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１～５００ｍｇであろう。好ましくは、投与量レベルは、約０．１～約２５０ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは、約０．５～約１００ｍｇ／ｋｇであろう。適切な投与量レベルは、約０．０１～２５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５～１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１～５０ｍｇ／ｋｇでありうる。この範囲内で、投与量は、０．０５～０．５、０．５～５又は５～５０ｍｇ／ｋｇでありうる。各種の抗体は、毎日１回又は２回など、毎日１～４回のレジメンで投与されうるが、抗体は、典型的に、長いインビボ半減期を有する。したがって、各種の抗体は、毎日１回、毎週１回、隔週１回、３週間ごとに１回、毎月１回、又は６０～９０日間ごとに１回投与されうる。

【0092】

投与及び投与量の均一性を容易とするように、単位投与量形態（Unit dosage forms）
が創出されうる。単位投与量形態とは、治療される対象のための、単回の投与量として適し、要求される医薬担体と会合させた、治療有効量の、１種又は２種以上の抗体を含有する、物理的に個別の単位を指す。好ましくは、単位投与量形態は、密封容器に入れられ、滅菌されている。

【0093】

超音波の印加及び抗ＡＧＥ抗体の投与を施される対象は、治療が、ＡＧＥ修飾細胞を死滅させるのに効果的であったのかどうかを決定するように調べられうる。対象は、後続の測定の間において、又は時間経過にわたり、１又は２以上の、ＡＧＥ障害の症状の低減を裏付ける場合、効果的な治療を施されたと考えられうる。例えば、神経膠芽腫に罹患している対象は、腫瘍サイズの低減に基づき、効果的な治療を施されたと考えられうる。代替的に、老化細胞の濃度及び／又は数が、時間経過にわたり測定される場合もある。治療、及び後続の検査は、所望の治療結果が達成されるまで反復されうる。

【0094】

本明細書に記載される方法により、任意の哺乳動物が治療されうる。ヒトは、治療に好ましい哺乳動物である。治療されうる、他の哺乳動物は、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、及びイヌ又はネコなどの愛玩動物を含みうる。代替的に、上記で同定された、哺乳動物又は対象のうちのいずれも、炎症と関連する疼痛治療を必要とする患者集団から除外されうる。方法はまた、細胞培養物又は組織培養物に適用されるなど、インビトロにおいても適用されうる。

【0095】

対象は、ＡＧＥ障害を有することの診断に基づき、治療を必要とする対象として同定されうる。ＡＧＥ障害の例は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ：amyotrophic lateral sclerosis又はルー・ゲーリック病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：chronic obstructive pulmonary disease）、ハンチントン舞踏病、特発性肺線維症、筋ジストロフィー（ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、及び山本型筋ジストロフィーを含む）、黄斑変性、白内障、糖尿病網膜症、パーキンソン病、早老症（ウェルナー症候群及びハッチソン－ギルフォード早老症を含む）、白斑、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節炎（骨関節炎、関節リウマチ、及び若年性関節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬化、がん及び転移性がん（例えば、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肺がん、黒色腫、結腸がん、腎細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、直腸がん、食道がん、肝がん、口腔咽頭がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、胃がん、膵がん、及び網膜芽細胞腫を含む）、がん治療と関連する身体機能障害又はがん治療の副作用、高血圧症、緑内障、骨粗相症、サルコペニア、悪液質、脳卒中、心筋梗塞、心房細動、移植拒絶、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、放射線曝露、ＨＩＶ治療の副作用、化学兵器曝露、中毒、炎症、腎症、レビー小体認知症、プリオン病（ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト－ヤコブ病、スクレピー、慢性消耗性疾患、クールー病、及び致死性家族性不眠症を含む）、前彎後彎症、自己免疫障害、脂肪組織の減少、乾癬、クローン病、喘息、老化の生理学的影響（しわ、しみ、脱毛、皮下脂肪組織の低減、及び皮膚の菲薄化などの「美容的」影響を含む）、特発性ミオパシー（例えば、特発性炎症性筋障害、特発性炎症性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、散発性封入体筋炎、及び若年性筋炎を含む）、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ：neuromyelitis optica、デビック病、又はデビック症候群）、てんかん、及び副腎皮質ジストロフィー（ＡＬＤ：adrenoleukodystrophy、Ｘ染色体連鎖型副腎白質委縮症、Ｘ－ＡＬＤ、大脳型ＡＬＤ、又はｃＡＬＤ）を含む。

【0096】

特に、好ましい治療群は、体内の制限部位に影響を及ぼすＡＧＥ障害に罹患していると診断された対象を含む。体内の制限部位に影響を及ぼすＡＧＥ障害の例は、脳腫瘍（退形成性星状細胞腫、多形性神経膠芽腫、希突起神経膠腫、及びびまん性内因性橋神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、及び神経鞘腫瘍などの神経膠腫を含む）、髄膜炎、脳／大脳膿瘍、後期神経性トリパノソーマ症（睡眠障害）、脳浮腫、プリオン病、脳炎、狂犬病、関節炎／骨関節炎、変性性関節疾患、滑膜炎、滑液包炎、前立腺がん、眼がん、及び眼障害を含む。

【0097】

本出願は、本明細書と共に出願される配列表内の、６６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のバリアントが可能である。公知のバリアントは、配列番号４、配列番号１６、及び配列番号２０に示される配列に対する、置換、欠失、及び付加を含む。配列番号４では、１２８位におけるアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）残基は、省かれてもよい。配列番号１６では、１２３位におけるアラニン残基が、セリン残基で置きかえられること、及び／又は１２４位におけるチロシン残基が、フェニルアラニン残基で置きかえられることがなされてもよい。配列番号２０は、１２３及び１２４位において、配列番号１６と同じ置換を含んでもよい。加えて、配列番号２０は、末端のバリン残基の後に、１つのさらなるリシン残基を含有してよい。
［実施例］

【実施例0098】

抗糖化反応最終産物抗体の投与についてのインビボ研究
抗糖化反応最終産物抗体の効果について検討するために、抗体を、老齢ＣＤ１（ＩＣＲ）マウス（CharlesRiver Laboratories社製）に、３週間にわたり、毎週１回（１、８、及び１５日目に）、１日に２回、静脈内注射により投与するのに続き、１０週間にわたる治療休止期間を設けた。被験抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンをコンジュゲートしたカルボキシメチルリシンに対して惹起された、市販のマウス抗糖化反応最終産物抗体である、R&D Systems, Inc.社（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）から入手可能なカ
ルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）であった。生理食塩液による対照参照は、対照動物において使用した。

【0099】

「若齢」と称されるマウスが、８週齢であったのに対し、「老齢」と称されるマウスは、８８週（±２日）齢であった。抗体の投与に由来する有害事象は、認められなかった。研究で使用した異なる動物群を、表１に示す。

【0100】

【表1】

【0101】

老化細胞についてのマーカーであるＰ１６^{ＩＮＫ４ａ} ｍＲＮＡを、群の脂肪組織内で、リアルタイムｑＰＣＲにより定量した。結果を、表２に示す。表中、ΔΔＣｔ＝対照群におけるΔＣｔ平均値（２）－被験群（１、３、５）におけるΔＣｔ平均値であり；発現倍数＝２^{－ΔΔＣｔ}である。

【0102】

【表2】

【0103】

上記の表は、予測される通り、非治療老齢マウス（対照群２）が、非治療若齢マウス（対照群１）の２．５５倍のｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ} ｍＲＮＡを発現することを指し示す。これは、８５日目における回収の終了時に安楽死させられた、群２の非治療老齢マウスを、２２日目における治療の終了時に安楽死させられた、群１の非治療若齢マウスと比較する場合に観察された。群２の非治療老齢マウスからの結果を、８５日目に安楽死させられた、群３の治療老齢マウスからの結果と比較したところ、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ} ｍＲＮＡは、群２において、群３の１．２３倍であることが観察された。したがって、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}
ｍＲＮＡの発現レベルは、老齢マウスを、１週間毎、毎日２回、１グラム当たり２．５μｇの抗体で治療した場合に低下した。

【0104】

群２（対照）の非治療老齢マウスからの結果を、２２日目に安楽死させられた、群５（１グラム当たり５μｇ）の治療老齢マウスからの結果と比較したところ、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ} ｍＲＮＡは、群２（対照）において、群５（１グラム当たり５μｇ）の３．０３倍であることが観察された。この比較は、群５の動物のｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ} ｍＲＮＡ発現レベルが、１週間毎、毎日２回、１グラム当たり５．０μｇで治療した場合に低下することを指し示したことから、若齢非治療マウス（すなわち、群１）の発現レベルと同等な、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ} ｍＲＮＡ発現レベルを提示する。８５日目における回収の終了時に安楽死させられた、群３（１グラム当たり２．５μｇ）のマウスと異なり、群５マウスは、２２日目における治療の終了時に安楽死させられた。

【0105】

これらの結果は、抗体の投与が、老化細胞の殺滅を結果としてもたらしたことを指し示す。

【0106】

また、抗体投与の、サルコペニアに対する効果を決定するように、腓腹筋量も測定した。結果を、表３に提示する。結果は、抗体の投与が、筋肉量を、対照と比較して増大させたが、これは、１週間毎、毎日２回、１グラム当たり５．０μｇの高投与量における投与に限られたことを指し示す。

【0107】

【表3】

【0108】

これらの結果は、細胞のＡＧＥに結合する抗体の投与が、老化のバイオマーカーである、ｐ１６^{Ｉｎｋ４ａ}を発現する細胞の低減を結果としてもたらしたことを裏付ける。データは、老化細胞の低減が、老齢マウスにおける筋肉量の増大を、直接もたらすことを示す。これらの結果は、サルコペニアの古典的徴候である、筋肉量の減少が、細胞のＡＧＥに結合する抗体の投与により治療されうることを指し示す。

【実施例0109】

被験抗体のアフィニティー及び反応速度
Ｎα，Ｎα－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－リシントリフルオロ酢酸塩（Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO）を、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質についてのモデル基質として使用して、実施例１で使用した被験抗体の、アフィニティー及び反応速度を解析した。ブランクとして設定されたＦｃ１、及び被験抗体（分子量を１５０，０００Ｄａとする）を固定化したＦｃ２を伴う、Series S sensor chip CM5（GE Healthcare社、Pittsburgh、PA
）を、BIACORE（商標）T200（GE Healthcare社、Pittsburgh、PA）上で使用して、無標識相互作用解析を実行した。ランニング緩衝液は、温度を２５℃とする、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のP-20、ｐＨ７．４）であった。ソフトウェアは、BIACORE（商標）T200 evaluation software, version 2.0であった。解析では、二重参照（Ｆｃ２－１及び緩衝液だけの注射）を使用し、データは、ラングミュア１：１結合モデルに当てはめた。

【0110】

【表4】

【0111】

時間に対応する応答のグラフを、図１に例示する。以下の値：ｋ_ａ（１／Ｍ秒）＝１．８５７×１０^３；ｋ_ｄ（１／秒）＝６．７８１×１０^－３；Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝３．６５１×１０^－６；Ｒ_ｍａｘ（ＲＵ）＝１９．５２；及びχ^２＝０．１１４は、解析から決定した。当てはめのχ^２値が、Ｒ_ｍａｘの１０％未満であるため、当てはめは信頼できる。