特開 2024-123125 肝臓に向けられた遺伝子補充療法によって重度のＰＫＵを処置するための改善されたヒトＰＡＨの生成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024123125

(43)【公開日】2024-09-10

(54)【発明の名称】肝臓に向けられた遺伝子補充療法によって重度のＰＫＵを処置するための改善されたヒトＰＡＨの生成

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/06 20060101AFI20240903BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240903BHJP

   C07K 14/475 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240903BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 38/44 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 38/51 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240903BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240903BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240903BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240903BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240903BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240903BHJP

【ＦＩ】

C12N9/06 Z ZNA

C12N15/53

C07K19/00

C07K14/475

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K38/44

A61K38/51

A61K45/00

A61K48/00

A61K47/60

A61K47/64

A61K35/76

A61K35/12

A61K31/519

A61P3/00

A61P43/00 111

A61P43/00 121

C12N9/06 Z

【審査請求】有

【請求項の数】23

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024098655

(22)【出願日】2024-06-19

(62)【分割の表示】P 2021519879の分割

【原出願日】2019-10-11

(31)【優先権主張番号】62/744,944

(32)【優先日】2018-10-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】シルッカ・キョスティオ－ムーア

(72)【発明者】

【氏名】パルタ・マナヴァラン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】内因性（野生型）ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）と比較して改善されたタンパク質安定性および酵素活性をもたらすｈＰＡＨを提供する。
【解決手段】一部の態様において、２つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドであって、該アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、前記バリアントＰＡＨポリペプチドが提供される。それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する、および／またはフェニルアラニンのレベルを低減する方法も提供される。さらに、それを必要とする個体においてバリアントＰＡＨポリペプチドを発現させるための、発現カセット、ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）、ウイルス粒子、医薬組成物およびキットも提供される。
【選択図】図１－１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドであって、該アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、前記バリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項2】

３つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドであって、該アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、前記バリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項3】

野生型ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６の部位に４つのアミノ酸置換を含む、バリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項4】

アミノ酸置換は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａの１つまたはそれ以上を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項5】

アミノ酸置換は、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＳ２５０Ｐを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項6】

アミノ酸置換は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項7】

Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項8】

野生型ヒトＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項9】

ヒトＰＡＨポリペプチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項10】

配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項11】

配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項12】

バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｇ３３Ａ、Ｇ４６Ａ、Ｇ４６Ｐ、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９Ａ、Ｇ１３９Ｐ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、およびＧ４４２Ａから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項13】

バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｐ９Ｇ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１９２Ｒ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ２０６Ｈ、Ｈ２２０Ｒ、Ｑ３３６Ｅ、Ｅ３６０Ｄ、Ｉ３７４Ｃ、Ｎ３７６Ｅ、Ｎ４０１Ｔ、Ｉ４２１Ｖ、Ｉ４４１Ｖ、Ｓ４４６Ｈから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、および４５３位におけるＳの付加をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項14】

バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｆ２４０Ｗ、Ａ２４６Ｐ、Ｇ２４７Ａ、Ｙ２６８Ｗ、Ｃ２８４Ｆ、Ｔ３２３Ｒ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３１９Ｐ、Ｉ３０６（Ｙ、Ｆ）、Ｋ１１３Ｐ、Ｇ１８８Ａ、Ｆ１９１Ｙ、Ｔ１９３Ｒ、Ｙ２０６Ｈ、Ｇ３３７Ｐ、およびＮ３７６Ｐから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項15】

野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｇ３３Ａ、Ｇ４６Ａ、Ｇ４６Ｐ、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９Ａ、Ｇ１３９Ｐ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、およびＧ４４２Ａから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、バリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項16】

野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｐ９Ｇ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１９２Ｒ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ２０６Ｈ、Ｈ２２０Ｒ、Ｑ３３６Ｅ、Ｅ３６０Ｄ、Ｉ３７４Ｃ、Ｎ３７６Ｅ、Ｎ４０１Ｔ、Ｉ４２１Ｖ、Ｉ４４１Ｖ、Ｓ４４６Ｈから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、および４５３位におけるＳの付加を含む、バリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項17】

野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｆ２４０Ｗ、Ａ２４６Ｐ、Ｇ２４７Ａ、Ｙ２６８Ｗ、Ｃ２８４Ｆ、Ｔ３２３Ｒ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３１９Ｐ、Ｉ３０６（Ｙ、Ｆ）、Ｋ１１３Ｐ、Ｇ１８８Ａ、Ｆ１９１Ｙ、Ｔ１９３Ｒ、Ｙ２０６Ｈ、Ｇ３３７Ｐ、およびＮ３７６Ｐから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、バリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項18】

Ｎ末端の短縮化を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項19】

Ｎ末端の短縮化は、Ｎ末端調節ドメインの短縮化を含む、請求項１８に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項20】

Ｎ末端の短縮化は、野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基１～１０２の短縮化を含む、請求項１８または１９に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項21】

Ｃ末端の短縮化を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項22】

Ｃ末端の短縮化は、四量体化ドメインの短縮化を含む、請求項２１に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項23】

Ｃ末端の短縮化は、野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基４２９～４５２の短縮化を含む、請求項２１または２２に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項24】

野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基１０３～４２８に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項25】

可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するような１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項26】

可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するような１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型ＰＡＨポリペプチドの２７０～２９５位および／または３８０～４０５位に配置されている、請求項２５に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項27】

肝臓標的化ポリペプチドに融合されている、請求項１～２６のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項28】

肝臓標的化ポリペプチドは、ＨＧＦもしくはそのフラグメントまたは肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する糖タンパク質である、請求項２７に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項29】

ペグ化および／またはニトロシル化されている、請求項１～２５のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項30】

Ｉ３７４Ｃアミノ酸置換を含み、３７４位におけるｃｙｓ残基は、ニトロシル化されている、請求項２６に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドを含む組成物。

【請求項32】

医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸。

【請求項34】

バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項３３に記載の単離された核酸。

【請求項35】

プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、ＬＰ１プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦｌ－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、改変されたニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたは配列番号１７、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、およびβ－アクチンプロモーターから選択される、請求項３４に記載の単離された核酸。

【請求項36】

プロモーターは、ＬＰ１プロモーターまたはｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項３４または３５に記載の単離された核酸。

【請求項37】

ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【請求項38】

ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫ ｐＡである、請求項３７に記載の単離された核酸。

【請求項39】

イントロンをさらに含む、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【請求項40】

イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、請求項３９に記載の単離された核酸。

【請求項41】

イントロンは、配列番号１５の改変されたニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、請求項３９に記載の単離された核酸。

【請求項42】

１つまたはそれ以上のＩＴＲをさらに含む、請求項３３～４１のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【請求項43】

スタッファー核酸をさらに含む、請求項３３～４２のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【請求項44】

スタッファー核酸は、ＡＴＧ配列が除去されるように最適化されている、請求項４３に記載の単離された核酸。

【請求項45】

スタッファー核酸は、配列番号１６のＡ１ＡＴイントロンスタッファー配列である、請求項４４に記載の単離された核酸。

【請求項46】

コドン最適化されている、ヒトＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸。

【請求項47】

核酸配列は、配列番号１４の核酸配列に少なくとも８０％同一である、請求項４６に記載の単離された核酸。

【請求項48】

配列番号１４の核酸配列を含む、請求項４６に記載の単離された核酸。

【請求項49】

ｍＲＮＡである、請求項３３に記載の単離された核酸。

【請求項50】

請求項３３～４９のいずれか１項に記載の核酸を含む組成物。

【請求項51】

医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項５０に記載の組成物。

【請求項52】

請求項３３～４９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。

【請求項53】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項５２に記載のベクター。

【請求項54】

１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した請求項３３～４１または４３～４９のいずれか１項に記載の核酸を含むｒＡＡＶベクター。

【請求項55】

請求項３３～４８のいずれか１項に記載の核酸は、２つのＡＡＶのＩＴＲと隣接してい
る、請求項５４に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項56】

ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項５４または５５に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項57】

ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項５４～５６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項58】

５’から３’に、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、イントロン、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸、スタッファー核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項５７に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項59】

プロモーターは、ｍ１Ａ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターまたはＬＰ１プロモーターである、請求項５８に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項60】

イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、請求項５８または５９に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項61】

ＰＡＨポリペプチドは、請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドである、請求項５８～５９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項62】

ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、請求項４６～４８のいずれか１項に記載のコドン最適化された核酸である、請求項５８～６０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項63】

スタッファー核酸は、ヒトアルファ１抗トリプシン遺伝子のイントロン由来の核酸を含む、請求項５８～６２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項64】

ヒトアルファ１抗トリプシン遺伝子のイントロンは、ＡＴＧ配列が除去されるように突然変異されている、請求項６３に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項65】

ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項５８～６４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項66】

自己相補性ベクターである、請求項５３～６５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項67】

ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる、請求項６６に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項68】

第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、該突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項６７に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項69】

請求項５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子。

【請求項70】

ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型のカプシドを含む、請求項６９に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項71】

ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む、請求項６９に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項72】

操作されたＡＡＶカプシドは、ＤＪカプシドまたはＬＫ０３カプシドである、請求項７１に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項73】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、同じＡＡＶ血清型由来である、請求項６９または７０に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項74】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、異なるＡＡＶ血清型由来である、請求項６９または７０に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項75】

ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８カプシドを含む、請求項６９～７０または７３～７４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項76】

ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８カプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項７４に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項77】

請求項６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。

【請求項78】

医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項７７に記載の組成物。

【請求項79】

請求項３３～４９のいずれか１項に記載の核酸または請求項５２もしくは５３に記載のベクターまたは請求項５４～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む細胞。

【請求項80】

バリアントＰＡＨポリペプチドを生産する方法であって、請求項７９に記載の細胞を、バリアントＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で培養することを含む、前記方法。

【請求項81】

バリアントＰＡＨポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドまたは請求項３１もしくは３２に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項83】

それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸または請求項３３、３４または４９に記載の核酸を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項84】

それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、
前記方法。

【請求項85】

それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項86】

それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項３１、３２、５０、５１、７７または７８に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項87】

それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項７９に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項88】

個体は、ＰＡＨ活性を欠如している、請求項８２～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドまたは請求項３１もしくは３２に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項90】

それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸または請求項３３、３４または４９に記載の核酸を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項91】

それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項92】

それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項93】

それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項３１、３２、５０、５１、７７または７８に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項94】

それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項７９に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項95】

処置の前における個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、同等の対応する対照個体の血液中のフェニルアラニンのレベルと比較して上昇している、請求項８９～９４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項96】

バリアントＰＡＨポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、組成物または細胞は、静脈内、動脈内、肝内、門脈内、腹腔内、または皮下に投与される、請求項８２～９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項97】

投与は、別の療法と組み合わされる、請求項８２～９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

別の療法は、テトラヒドロビオプテリンでの処置、フェニルアラニンアンモニアリアー
ゼ（ＰＡＬ）もしくはペグ化ＰＡＬでの処置、またはフェニルアラニンが制限された食事である、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

ＰＡＨポリペプチドを作製するための方法であって、請求項７９に記載の細胞を、ＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で培養することを含む、前記方法。

【請求項100】

ＰＡＨポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

請求項１～２４のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドを含むキット。

【請求項102】

請求項３３～４６のいずれか１項に記載の核酸、請求項５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、請求項６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項７７もしくは７８に記載の組成物を含むキット。

【請求項103】

使用説明書；緩衝液および／もしくは医薬的に許容される賦形剤；ならびに／またはボトル、バイアルおよび／もしくはシリンジをさらに含む、請求項１０１または１０２に記載のキット。

【請求項104】

肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該エンハンサーは、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含む、前記発現カセット。

【請求項105】

ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項１０４に記載の発現カセット。

【請求項106】

エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、請求項１０４または１０５に記載の発現カセット。

【請求項107】

肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該３’エレメントは、ヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはアルブミン３’エレメントである、前記発現カセット。

【請求項108】

ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項１０７に記載の発現カセット。

【請求項109】

３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている、請求項１０７または１０８に記載の発現カセット。

【請求項110】

肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該エンハンサーは、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改
変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み；該３’エレメントは、ヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはアルブミン３’エレメントである、前記発現カセット。

【請求項111】

ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項１１０に記載の発現カセット。

【請求項112】

エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、請求項１１０または１１１に記載の発現カセット。

【請求項113】

３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている、請求項１１０～１１２のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項114】

イントロンをさらに含む、請求項１０４～１１３のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項115】

イントロンは、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、請求項１１４に記載の発現カセット。

【請求項116】

ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１０４～１１５のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項117】

ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項１１６に記載の発現カセット。

【請求項118】

導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドまたはバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする、請求項１０４～１１７のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項119】

バリアントＰＡＨポリペプチドは、請求項１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドである、請求項１１８に記載の発現カセット。

【請求項120】

請求項１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。

【請求項121】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１２０に記載のベクター。

【請求項122】

１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した請求項１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むｒＡＡＶベクター。

【請求項123】

請求項１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットは、２つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している、請求項１２２に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項124】

ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項１２２または１２３に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項125】

ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項１２２～１２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項126】

自己相補性ベクターである、請求項１２２～１２５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項127】

ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる、請求項１２６に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項128】

第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、該突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項１２７に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項129】

請求項１２２～１２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子。

【請求項130】

ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型のカプシドを含む、請求項１２９に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項131】

ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む、請求項１３０に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項132】

操作されたＡＡＶカプシドは、ＤＪカプシドまたはＬＫ０３カプシドである、請求項１３１に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項133】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、同じＡＡＶ血清型由来である、請求項１３１または１３２に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項134】

ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、異なるＡＡＶ血清型由来である、請求項１３１または１３２に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項135】

請求項１２９～１３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。

【請求項136】

医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１３５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる２０１８年１０月１２日に出願された米国仮出願第６２／７４４，９４４号の優先権の利益を主張する。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：配列表のコンピューター読取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１６６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録した日付：２０１９年１０月１６日、サイズ：３３ＫＢ）。

【0003】

本発明の開示は、バリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼポリペプチドに関する。一部の態様において、本開示は、遺伝子治療を使用してフェニルケトン尿症を処置するための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0004】

フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のチロシン（Ｔｙｒ）への水酸化を触媒する肝臓酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝学的欠損である。この疾患は、北米で１：１０～１５，０００の全体的な発生率を有する最も一般的な先天性アミノ酸代謝異常であり、これは、ほとんどの先進国で新生児スクリーニングプログラムによって検出される。まったく処置を行わないと、ＰＫＵの重度の形態は、神経毒性であり重度の精神遅滞に関連する高度に上昇した血液Ｐｈｅレベルをもたらす（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。影響を受けたタンパク質であるＰＡＨは、Ｎ末端の調節性（１～１１７）、中央の触媒性（１１８～４１０）およびＣ末端の四量体化ドメイン（４１１～４５２）からなるマルチドメインタンパク質である（非特許文献４）。これまで５６０種を超える疾患を引き起こす突然変異が各ドメインにマッピングされており、触媒領域は、最も高頻度で影響を受ける部位である（非特許文献５）。ホモ多量体酵素は、基質ＰｈｅがＮ末端ドメインに結合することにより、リン酸化およびアロステリック活性化を用いた複雑な制御を受け、これは、酵素の様々な構造および多量体化の状態を変更することによってＰＡＨ酵素活性を微調整する（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。

【0005】

ＰＫＵのための現行の処置は、低タンパク質の食事と液状の医療調合食（ｍｅｄｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａ）を使用した生涯続くＰｈｅの食事制限である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。有効であるにもかかわらず、医療用食品の不十分な味と食品選択に対する厳しい制限が、食品の遵守を難しくしており、および小児期中に服薬不履行は徐々に増大し、十代後半までに患者のほぼ８０％が推奨レベルより高い血液Ｐｈｅレベルを有する（非特許文献９、非特許文献１０）。また、Ｐｈｅ制限食の優れた遵守にもかかわらず、多くの患者は、様々な神経認知および神経精神病学的機能の欠損を経験し、加えて、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）の高い発生率を有するという証拠も出現している。この理由は不明瞭であるが、考えられる説明としては、脳におけるアミノ酸不均衡、特定のビタミンおよび微量元素の栄養不足、加えて、肝臓ＰＡＨ活性によって通常安定に維持される血液Ｐｈｅレベルの変動が挙げられる（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。興味深いことに、ＰＫＵのより軽度の形態を有する患者の補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の合成形態（サプロプテリン二塩酸塩）での処置は、血液Ｐｈｅレベルを低くすることにおいて有効であることが示されただけでなく、ＡＤＨＤ症状の
低減などの神経学的転帰における改善も実証した（非特許文献１４）。この療法は、薬理学的なシャペロンとして作用することによって残留したＰＡＨ酵素活性を増加させ、したがって正常なＰｈｅが制御されたＰＡＨ活性を提供することによって遺伝学的欠陥の部分的な修正を提供することができる（非特許文献３）。近年承認された別の療法は、Ｐｈｅをトランス－ケイ皮酸に代謝する細菌フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）のペグ化形態を使用した酵素置換療法からなる。この療法は、血液Ｐｈｅレベルにおける顕著な低減をもたらすが、神経学的なエンドポイントに対する効果はそれほど高くないようである（非特許文献１５）。全身のＰｈｅレベルの調節因子およびＴｙｒのプロデューサーとしてのＰＡＨ機能の修正を行わずに主として血液Ｐｈｅレベルを低くすることに基づく、このまたは他のあらゆる療法が、食事を遵守するＰＫＵ患者でさえも観察される認知および神経精神病学的な問題に対処することができるかどうかは、不明瞭なままである。

【0006】

本明細書において引用される特許出願および広報を含む全ての参考文献は、参照によってそれら全体が本明細書に組み入れられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｋｏｃｈｈａｒ ＪＳら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ ２０１２、２：２２３～２３７

【非特許文献2】Ｈｏ Ｇ、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ Ｐｅｄｉａｔｒ ２０１４、４：４９～６２

【非特許文献3】Ｂｌａｕ Ｎ、Ｌｏｎｇｏ Ｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ２０１５、１６：７９１～８００

【非特許文献4】Ｆｌｙｄａｌ ＭＩ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ａ．ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ２０１３、６５：３４１～３４９

【非特許文献5】Ｅｒｌａｎｄｓｅｎ Ｈら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ２００３、１１２：１５５７～１５６５

【非特許文献6】Ｋｎａｐｐｓｋｏｇ ＰＭら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９６、２４２：８１３～８２１

【非特許文献7】Ｊａｆｆｅ Ｅら、 Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２０１３、５３０：７３～８２

【非特許文献8】Ａｒｔｕｒｏ ＥＣら、ＰＮＡＳ ２０１６、１１３：２３９４～２３９９

【非特許文献9】Ｗａｉｓｂｒｅｎ ＳＥら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２００７、９２：６３～７０

【非特許文献10】Ｔｈｏｍａｓ Ｊら、Ｊ Ｉｎｂｏｒｎ Ｅｒｒｏｒｓ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ５：１～９

【非特許文献11】Ｃｌｅａｒｙ Ｍら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｍｅｔａｂ ２０１３、１１０：４１８～４２３

【非特許文献12】Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＭＪら、ＳｅｍｉｎＰｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１６、２３：３３２～３４０

【非特許文献13】Ｖｏｇｅｌ ＫＲら、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１７、４０：２２７～２３５

【非特許文献14】Ｂｕｒｔｏｎ Ｂら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｍｅｔａｂ ２０１５、１１４：４１５～４２４

【非特許文献15】Ｌｏｎｇｏ Ｎら、Ｌａｎｃｅｔ ２０１４、３８４：３７～４４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、内因性ｈＰＡＨと比較して改善されたタンパク質安定性および酵素活性をもたらす４つのアミノ酸変化を含有する、ｈＰＡＨの改善されたバリアント、特定にはバリアント－１（Ｖ１）を発明者らが発見したことに少なくとも部分的に基づく。臨床的に意義のある用量のｒＡＡＶを使用した、このｈＰＡＨ－Ｖ１バリアントをコードするｃＤＮＡの肝臓への送達は、ヒトＰＫＵのモデルであるＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスにおいて様々な疾患のエンドポイントを改善し、改変されていないｈＰＡＨより有効であった。したがって、この新規のバリアントをコードするｒＡＡＶベクターは、低減されたベクター用量で効能をもたらすことにより、ＰＫＵ遺伝子治療への道を提供することが可能である。

【課題を解決するための手段】

【0009】

一部の態様において、本発明は、２つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドであって、アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、バリアントＰＡＨポリペプチドを提供する。一部の態様において、本発明は、３つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドであって、アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、バリアントＰＡＨポリペプチドを提供する。一部の態様において、本発明は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６の部位に４つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＳ２５０Ｐを含む。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、ヒトＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｇ３３Ａ、Ｇ４６Ａ、Ｇ４６Ｐ、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９Ａ、Ｇ１３９Ｐ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、およびＧ４４２Ａから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｐ９Ｇ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１９２Ｒ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ２０６Ｈ、Ｈ２２０Ｒ、Ｑ３３６Ｅ、Ｅ３６０Ｄ、Ｉ３７４Ｃ、Ｎ３７６Ｅ、Ｎ４０１Ｔ、Ｉ４２１Ｖ、Ｉ４４１Ｖ、Ｓ４４６Ｈから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、および４５３位におけるＳの付加をさらに含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｆ２４０Ｗ、Ａ２４６Ｐ、Ｇ２４７Ａ、Ｙ２６８Ｗ、Ｃ２８４Ｆ、Ｔ３２３Ｒ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３１９Ｐ、Ｉ３０６（Ｙ、Ｆ）、Ｋ１１３Ｐ、Ｇ１８８Ａ、Ｆ１９１Ｙ、Ｔ１９３Ｒ、Ｙ２０６Ｈ、Ｇ３３７Ｐ、およびＮ３７６Ｐから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｇ３３Ａ、Ｇ４６Ａ、Ｇ４６Ｐ、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９Ａ、Ｇ１３９Ｐ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２
Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、およびＧ４４２Ａから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。

【0010】

一部の態様において、本発明は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｐ９Ｇ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１９２Ｒ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ２０６Ｈ、Ｈ２２０Ｒ、Ｑ３３６Ｅ、Ｅ３６０Ｄ、Ｉ３７４Ｃ、Ｎ３７６Ｅ、Ｎ４０１Ｔ、Ｉ４２１Ｖ、Ｉ４４１Ｖ、Ｓ４４６Ｈ、および４５３位におけるＳの付加から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドを提供する。一部の態様において、本発明は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｆ２４０Ｗ、Ａ２４６Ｐ、Ｇ２４７Ａ、Ｙ２６８Ｗ、Ｃ２８４Ｆ、Ｔ３２３Ｒ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３１９Ｐ、Ｉ３０６（Ｙ、Ｆ）、Ｋ１１３Ｐ、Ｇ１８８Ａ、Ｆ１９１Ｙ、Ｔ１９３Ｒ、Ｙ２０６Ｈ、Ｇ３３７Ｐ、およびＮ３７６Ｐから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドを提供する。

【0011】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｎ末端の短縮化を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端の短縮化は、Ｎ末端調節ドメインの短縮化を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端の短縮化は、野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基１～１０２の短縮化を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｃ末端の短縮化を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端の短縮化は、四量体化ドメインの短縮化を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端の短縮化は、野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基４２９～４５２の短縮化を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基１０３～４２８に対応するアミノ酸配列を含む。

【0012】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するような１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するような１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型ＰＡＨポリペプチドの２７０～２９５位および／または３８０～４０５位に配置されている。

【0013】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、肝臓標的化ポリペプチドに融合されている。一部の実施形態において、肝臓標的化ポリペプチドは、ＨＧＦもしくはそのフラグメントまたは肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する糖タンパク質である。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、ペグ化および／またはニトロシル化されている。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｉ３７４Ｃアミノ酸置換を含み、３７４位におけるｃｙｓ残基は、ニトロシル化されている。

【0014】

一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。

【0015】

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（
ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、ＬＰ１プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦｌ－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、改変されたニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたは配列番号１７、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、およびβ－アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、ＬＰ１プロモーターまたはｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、核酸は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、核酸は、イントロンをさらに含む。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、配列番号１５の改変されたニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。一部の実施形態において、核酸は、１つまたはそれ以上のＩＴＲをさらに含む。一部の実施形態において、核酸は、スタッファー核酸をさらに含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ＡＴＧ配列が除去されるように最適化されている。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、配列番号１６のＡ１ＡＴイントロンスタッファー配列である。

【0016】

一部の態様において、本発明は、コドン最適化されている、ヒトＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸配列は、配列番号１４の核酸配列に少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、核酸は、配列番号１４の核酸配列を含む。一部の実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡである。一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される核酸を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。

【0017】

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される単離された核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した本明細書に記載される核酸を含む。一部の実施形態において、核酸は、２つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’に、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、イントロン、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸、スタッファー核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む。一部の実施形態において、プロモーターは、ｍ１Ａ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターまたはＬＰ１プロモーターである。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、コドン最適化された核酸である。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ヒトアルファ１抗トリプシン遺伝子のイントロン由来の核酸を含む。一部の実施形態において、ヒトアルファ１抗トリプシン遺伝子のイントロンは、ＡＴＧ配列が除去されるように突然変異されている。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、
ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔｉｎｇ）ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。

【0018】

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型のカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、操作されたＡＡＶカプシドは、ＤＪカプシドまたはＬＫ０３カプシドである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、同じＡＡＶ血清型由来である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、異なるＡＡＶ血清型由来である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８カプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８カプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む。

【0019】

一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ３血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ４血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ５血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ６血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、
少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ７血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１１血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１２血清型のカプシドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するカプシドを含む。

【0020】

一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ハイブリッドカプシドを含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ１／ＡＡＶ６、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６、ＡＡＶ３／ＡＡＶ６、ＡＡＶ４／ＡＡＶ６、ＡＡＶ５／ＡＡＶ６、ＡＡＶ７／ＡＡＶ６、ＡＡＶ８／ＡＡＶ６、ＡＡＶ９／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１１／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１２／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１／ＡＡＶ８、ＡＡＶ２／ＡＡＶ８、ＡＡＶ３／ＡＡＶ８、ＡＡＶ４／ＡＡＶ８、ＡＡＶ５／ＡＡＶ８、ＡＡＶ７／ＡＡＶ８、ＡＡＶ９／ＡＡＶ８、ＡＡＶ１０／ＡＡＶ８、ＡＡＶ１１／ＡＡＶ８、ＡＡＶ１２／ＡＡＶ８、またはＡＡＶ１／ＡＡＶ６／ＡＡＶ８ハイブリッドカプシドである。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ８／ＡＡＶ６ハイブリッドカプシドである。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ１／ＡＡＶ６／ＡＡＶ８ハイブリッドカプシドである。

【0021】

一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ハイブリッドカプシドを含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ１／ＡＡＶ６、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６、ＡＡＶ３／ＡＡＶ６、ＡＡＶ４／ＡＡＶ６、ＡＡＶ５／ＡＡＶ６、ＡＡＶ７／ＡＡＶ６、ＡＡＶ８／ＡＡＶ６、ＡＡＶ９／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１１／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１２／ＡＡＶ６、ＡＡＶ１／ＡＡＶ８、ＡＡＶ２／ＡＡＶ８、ＡＡＶ３／ＡＡＶ８、ＡＡＶ４／ＡＡＶ８、ＡＡＶ５／ＡＡＶ８、ＡＡＶ７／ＡＡＶ８、ＡＡＶ９／ＡＡＶ８、ＡＡＶ１０／ＡＡＶ８、ＡＡＶ１１／ＡＡＶ８、ＡＡＶ１２／ＡＡＶ８、またはＡＡＶ１／ＡＡＶ６／ＡＡＶ８ハイブリッドカプシドである。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ８／ＡＡＶ６ハイブリッドカプシドである。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ１／ＡＡＶ６／ＡＡＶ８ハイブリッドカプシドである。

【0022】

一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ１カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ２カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ３カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配
列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ４カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ５カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ６カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ７カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ８カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ９カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ１０カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッドカプシドは、ＡＡＶ１２カプシド配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、上記一部は、少なくとも１００アミノ酸、例えば少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００アミノ酸を含む。

【0023】

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。

【0024】

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される単離された核酸を含む細胞を提供する。一部の態様において、本発明は、バリアントＰＡＨポリペプチドを生産する方法であって、上述した細胞を、バリアントＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で培養することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、バリアントＰＡＨポリペプチドを精製する工程をさらに含む。

【0025】

一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドまたは本明細書に記載される組成物を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸または本明細書に記載される核酸を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載される組成物を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載される細胞を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、個体は、ＰＡＨ活性を欠如している。

【0026】

一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドを個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸または本明細書に記載される核酸を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載される組成物を個体に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、処置の前における個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、同等の対応する対照個体の血液中のフェニルアラニンのレベルと比較して上昇している。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載される細胞を個体に投与することを含む、方法を提供する。

【0027】

一部の実施形態において、核酸、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、組成物または細胞は、静脈内、動脈内、肝内、門脈内、腹膜内、または皮下に投与される。一部の実施形態において、投与は、別の療法と組み合わされる。一部の実施形態において、別の療法は、テトラヒドロビオプテリン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｉｂｉｏｐｔｅｒｉｎ）での処置、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）もしくはペグ化ＰＡＬでの処置、またはフェニルアラニンが制限された食事である。

【0028】

一部の態様において、本発明は、ＰＡＨポリペプチドを作製するための方法であって、本明細書に記載される細胞を、ＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で培養することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＰＡＨポリペプチドを精製することをさらに含む。

【0029】

一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドを含むキットを提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される核酸、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクター、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子、または本明細書に記載される組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、使用説明書；緩衝液および／もしくは医薬的に許容される賦形剤；ならびに／またはボトル、バイアルおよび／もしくはシリンジをさらに含む。

【0030】

一部の態様において、本発明は、肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーは、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニン（ｍｉｃｒｏｂｉｋｕｎｉｎ）エンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含む、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある。

【0031】

一部の態様において、本発明は、肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現
カセットであって、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、３’エレメントは、ヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはアルブミン３’エレメントである、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている。

【0032】

一部の態様において、本発明は、肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーは、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み；３’エレメントは、ヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはアルブミン３’エレメントである、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている。

【0033】

一部の実施形態において、発現カセットは、イントロンをさらに含む。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。一部の実施形態において、発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。

【0034】

一部の実施形態において、導入遺伝子は、 ＰＡＨポリペプチドまたはバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される発現カセットを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。

【0035】

一部の実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した本明細書に記載される発現カセットを含むｒＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、２つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。

【0036】

一部の実施形態において、ベクターは、自己相補性ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。

【0037】

一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型のカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、操作されたＡＡＶカプシドは、ＤＪカプシドまたはＬＫ０３カプシドである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、同じＡＡＶ血清型由来である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、異なるＡＡＶ血清型由来である。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1-1】図１Ａ～１Ｃは、肝臓プロモーターの最適化を示す図である。図１Ａは、プレウイルス（ｐｒｅｖｉｒａｌ）プラスミドコンストラクトの図表を示す。コンストラクトｍＴＴＲ４８２（＃１）を、様々な肝臓エンハンサーエレメント（コンストラクト＃２～６）または３’安定性エレメント（コンストラクト＃７～８）の付加によって改変した。ＣＢＡプロモーターを含有するコンストラクトを比較に使用した。全てのコンストラクトは、隣接するＩＴＲ、ハイブリッドイントロンおよびＳＥＡＰレポーターを含有していた。次いでコンストラクトを、Ｈｕｈ７細胞（図１Ｂ）またはＨｅｐＧ２細胞（図１Ｃ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、分泌型ＳＥＡＰ活性のレベルを測定し、コトランスフェクトされたＬａｃＺプラスミドからのｂ－ガラクトシダーゼレベルによって正規化した。各評価は、ｎ＝３～４／プラスミドを含有していた。

【図1-2】図１－１の続き。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、インビボにおけるＳＥＡＰ生産による肝臓プロモーターの評価を示す図である。図２Ａは、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＳＥＡＰレベルを示す。図２Ｂは、ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスにおけるＳＥＡＰレベルを示す。両方の実験において、プラスミドベクターを高容量の注射によって送達し、血漿を様々なタイムポイントでＳＥＡＰ活性に関して測定した。各処置グループは、ｎ＝３～６匹の動物を含有していた。

【図3-1】図３Ａ～３Ｄは、ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスにおける肝臓プロモーターの性能の比較を示す図である。ｓｃ－ＬＰ１またはｓｓ－Ａ１ＭＢ２－ｍＴＴＲプロモーター（リード）からｍＰＡＨを発現するｒＡＡＶ８ベクターを、雄ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスに４ｅ１０（Ｌ）または１ｅ１１（Ｍ）ＶＧ／マウスで投与した。図３Ａは、５６日の時間経過中の血液Ｐｈｅレベルを示す。レベルは、ナイーブ動物がｎ＝２での平均であることを除き、ｎ＝８／グループの平均である。図３Ｂは、５６日目の血液Ｐｈｅレベルを示す。４ｅ１０または１ｅ１１ＶＧ／マウスで投与された２つのコンストラクトで処置した動物または未処置の動物における血漿Ｐｈｅレベルが示される。図３Ｃは、血液Ｔｙｒレベルを示す。ベクター投与の前（プレブリード（ｐｒｅｂｌｅｅｄ））およびベクター投与の７および５６日後に、レベルを測定した。各値は、ｎ＝８／グループの平均である。図３Ｄは、５６日目の肝臓中のベクターゲノムを示す。ベクターのコピーをｑＰＣＲによって決定し、ｎ＝５／グループの平均が示される。

【図3-2】図３－１の続き。

【図4-1】図４Ａ～４Ｄは、ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスの脳の分析を示す図である。未処置の、ｓｓ－ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ（リード）コンストラクト（４ｅ１０および１ｅ１１ｖｇ／マウス）およびｓｃ－ＬＰ１（１ｅ１１ｖｇ／マウス）で処置したＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスからの５匹の動物を処置の５６日後に殺し、ＰＢＳで灌流し、分析のために脳を収集した。野生型対照（ＷＴ）としてＢａｌｂ／Ｃマウスを使用した。図４Ａは、脳のＰｈｅレベルを示す。図４Ｂは、血液および脳のＰｈｅレベルの相関を示す。図４Ｃは、脳のドーパミンレベルを示す。図４Ｄは、脳のセロトニンレベルを示す。全ての値は、ｎ＝５／グループの平均を表す（未処置のＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスではｎ＝２であることを除く）。図３Ａ～３Ｃに記載されたように研究を実行した。

【図4-2】図４－１の続き。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、ヒトＰＡＨ ｃＤＮＡのコドン最適化を示す図である。ＦＬＡＧでタグ付けされたｈＰＡＨをコードするｃＤＮＡを、ｍＴＴＲ４８２－ｈＰＡＨ－ＢＧＨｐＡ発現プラスミドにクローニングした。ｈＰＡＨ生産をインビトロとインビボの両方で試験した。図５Ａは、Ｈｕｈ７細胞におけるＦＬＡＧ－ｈＰＡＨレベルを示す。プラスミドをトランスフェクトし、４８時間後に細胞溶解産物を調製した。細胞溶解産物におけるＰＡＨタンパク質レベルをウェスタンブロットによって分析した。図５Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓中のＦＬＡＧ－ｈＰＡＨレベルを示す。プラスミドを水圧注射によって投与し、２４時間後に肝臓を収集した。肝臓溶解産物におけるＦＬＡＧでタグ付けされたｈＰＡＨのレベルをＦＬＡＧ－ＥＬＩＳＡを使用して定量化し、総タンパク質によって正規化した。値は、動物ｎ＝４～５／グループでの平均を表す。略語：Ｃ、陰性対照プラスミド；ＧＳ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＧＡ、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧＳ ＣｐＧ、ＣｐＧが除去されたＧｅｎｓｃｒｉｐｔ配列；ｎｏｎ、元のｈＰＡＨＤＮＡ配列；ナイーブ、未処置の動物。

【図6A】図６Ａは、異なるプロモーター（ｍＴＴＲ４８２、ＣＢＡ、およびＬＰ１）の制御下におけるヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｈＰＡＨ）およびマウスフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｍＰＡＨ）の発現を示すウェスタンブロットを示す図である。発現プラスミドを、Ｈｕｈ７細胞にトランスフェクトし、２日後に細胞溶解産物を、ＦＬＡＧに対する抗体を使用してＦＬＡＧ－ＰＡＨレベルに関して分析した。

【図6B】図６Ｂは、インビトロにおける全長（ＦＬ）および二重短縮化（ＤＴ）ヒトおよびマウスＰＡＨ発現の比較を示すウェスタンブロットを示す図である。分析は図６Ａの通りである。

【図6C】図６Ｃは、全長（ＦＬ）および二重短縮化（ＤＴ）形態の両方に関するｈＰＡＨおよびｍＰＡＨタンパク質レベルの比較を示す図である。発現プラスミドでのトランスフェクション後、ＦＬＡＧでタグ付けされたタンパク質のＥＬＩＳＡによる定量をＨｕｈ７細胞溶解産物で実行した。

【図6D】図６Ｄは、ｈＰＡＨおよびｍＰＡＨのｍＲＮＡレベルの比較を示す図である。図６Ｃで使用された材料に、ｑＰＣＲによるＲＮＡ分析を実行した。

【図6E】図６Ｅは、精製したｈＰＡＨおよびｍＰＡＨ（両方とも全長および二重短縮化形態として生成された）の分析を示すウェスタンブロットを示す図である。タンパク質をＦＬＡＧ－アフィニティーカラムによって精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中に泳動し、続いて抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。

【図6F】図６Ｆは、ＰＫＵマウスモデルにおけるｈＰＡＨまたはｍＰＡＨをコードするｒＡＡＶ８ベクターの効能を示す図である。ｈＰＡＨおよびｍＰＡＨの両方を、ＬＰ１プロモーター（ｓｃ－ＬＰ１）を有する自己相補性ベクターから発現させた。効能を、ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスへの単回のＩＶ注射後の血液Ｐｈｅレベルの低減として測定した。

【図7-1】図７Ａ～７Ｃは、マウス／ヒトハイブリッドＰＡＨコンストラクトの生成を示す図である。図７Ａは、マウス／ヒトハイブリッドＰＡＨコンストラクトの図解を示す。ヒト（緑色）およびマウス（灰色）ＰＡＨ由来の領域を示す。図７Ｂは、タンパク質発現レベルへのｈＰＡＨのＮ末端領域の置き換えの作用を示す。図７Ｃは、タンパク質発現レベルへのｈＰＡＨのＣ末端領域における変化の作用を示す。実験を、ＣＢＡ－ＰＡＨ発現カセットを有するプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって実行した。４８時間後、ＦＬＡＧ ＥＬＩＳＡによるＦＬＡＧ－ＰＡＨの定量のために細胞を収集した。

【図7-2】図７－１の続き。

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、インビトロにおける二重短縮化ｈＰＡＨ（ｈＰＡＨ－ＤＴ）バリアントのスクリーニングを示す図である。図８Ａは、プラスミドによって発現されたｈＰＡＨタンパク質バリアント（＃１～＃８）のタンパク質発現レベルを示す。図８Ｂは、プラスミドによって発現されたｈＰＡＨタンパク質バリアントのＰＡＨ活性レベルを示す。全てのバリアントを２９３細胞にトランスフェクトし、ＣＢＡプロモーターを有するプラスミドから発現させた。バリアントプラスミドからの結果を、ヒトまたはマウスＰＡＨを発現する類似のプラスミドと比較する。

【図9】図９Ａ～９Ｃは、インビトロにおけるＰＡＨ生産に関するｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体の特徴付けを示す図である。図９Ａは、ｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体のＰＡＨ活性レベルを示す。図９Ｂは、ｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体のＰＡＨタンパク質レベルを示す。図９Ｃは、ｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体の特異的なＰＡＨ活性を示す。結果は、トランスフェクトされた２９３細胞からの細胞溶解産物の分析に基づく。

【図10-1】図１０Ａ～１０Ｃは、インビトロにおけるＰＡＨ生産に関するｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体の反復分析を示す図である。図１０Ａは、選択されたｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体のＰＡＨ活性レベルを示す。図１０Ｂは、ｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体のＰＡＨタンパク質レベルを示す。図１０Ｃは、ｈＰＡＨ－Ｖ１－ＤＴ誘導体の特異的なＰＡＨ活性を示す。図８Ａおよび８Ｂに記載されたようにデータを作成した。図１０Ｄは、バリアント－１の３つの二重突然変異体バージョンのＰＡＨ活性を示す。図８Ａおよび８Ｂに記載されたようにデータを作成した。

【図10-2】図１０－１の続き。

【図11-1】図１１Ａ～１１Ｃは、インビトロにおける、全長ｈＰＡＨ－Ｖ１の、マウスＰＡＨ（ｍＰＡＨ）およびヒトＰＡＨ（ｈＰＡＨ）との比較を示す図である。図１１Ａは、タンパク質発現の分析ウェスタンブロットである。図１１Ｂは、ＦＬＡＧ－ＥＬＩＳＡによるＰＡＨタンパク質レベルを示す。図１１Ｃは、ＰＡＨ活性レベルを示す。肝臓プロモーターＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２を有し、全長ＰＡＨタンパク質をコードする発現プラスミドをＨｕｈ７にトランスフェクトし、続いて細胞溶解産物を分析することによって、データを作成した。Ｍは、マーカーのレーンを示す。

【図11-2】図１１－１の続き。

【図12-1】図１２Ａ～１２Ｃは、全長ｈＰＡＨ－Ｖ１を発現するｒＡＡＶベクターの効能の、ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスにおけるマウスおよびヒトＰＡＨの効能との比較を示す図である。図１２Ａは、血液中のフェニルアラニンのレベルを示す。図１２Ｂは、血液中のチロシンのレベルを示す。図１２Ｃは、血液中のフェニルアラニン代謝産物レベルを示す。Ｐ値は、^＊はＰ＜０．０５）であり、^＊＊はＰ＜０．０１であり、^＊＊＊はＰ＜０．００１であるとして示される。全ての処置グループは、肝臓プロモーターからのＦＬＡＧでタグ付けされたＰＡＨを発現するＡＡＶ８ベクターからなっていた。０日目に、ベクターを、ＩＶ経路によって、３ｅ１１（ｈＰＡＨ、ｈＰＡＨ－Ｖ１およびｍＰＡＨ）または１ｅ１２ｖｇ／マウス（ｈＰＡＨおよびｈＰＡＨ－Ｖ１）で注射した。ナイーブＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスおよびヘテロ接合型（ＨＥＴ）をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。

【図12-2】図１２－１の続き。

【図13】図１３Ａ～１３Ｃは、肝臓中のｒＡＡＶベクターゲノムおよび３ｘ－ＦＬＡＧ－ＰＡＨレベルの定量を示す図である。図１３Ａは、ＰＡＨタンパク質レベルを示す。図１３Ｂは、ＰＡＨ活性レベルを示す。図１３Ｃは、肝臓中のベクターゲノムコピーを示す。図１２Ａ～１２Ｃに記載されたように実験を実行し、ベクター投与の６９日後に肝臓収集した。各パネルにおいて、３ｅ１１ＶＧ／マウスの処置グループ（ｈＰＡＨ、ｈＰＡＨ－Ｖ１およびｍＰＡＨ）および１ｅ１２ｖｇ／マウスの処置グループ（ｈＰＡＨ、ｈＰＡＨ－Ｖ１）のデータが示される。Ｐ値、^＊＊＊は、＜０．００１である。

【図14】図１４Ａ～１４Ｄは、脳における様々なアミノ酸レベルの定量を示す図である。図１４Ａは、脳のフェニルアラニンレベルを示す。図１４Ｂは、脳のチロシンレベルを示す。図１４Ｃは、脳および血液中のフェニルアラニンのレベルの間の相関を示す。図１４Ｄは、脳のトリプトファンレベルを示す。図１２Ａ～１２Ｃに記載されたように実験を実行した。示されたデータは、３ｅ１１ＶＧ／マウス（ｎ＝５／グループ）（６９日目）で投与された処置グループからのものである。Ｐ値、^＊＊＊は、＜０．００１である。

【図15】図１５Ａ～１５Ｄは、脳中の神経伝達物質レベルを示す図である。図１５Ａは、脳のドーパミンレベルを示す。図１５Ｂは、ドーパミン代謝産物であるＤＯＰＡＣの脳のレベルを示す。図１５Ｃは、脳のセロトニンレベルを示す。図１５Ｄは、セロトニン代謝産物であるＨＩＡＡの脳のレベルを示す。図１２Ａ～１２Ｃに記載されたように実験を実行し、値は、３ｅ１１ＶＧ／マウスコホート（６９日目）からのものである。Ｐ値、^＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、^＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。

【図16】図１６Ａ～１６Ｂは、効能に関する３．８および４．６ｋｂのＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ－ｈＰＡＶ－Ｖ１ベクターゲノムの比較を示す図である。図１６Ａは、ベクターの図解を示す。図１６Ｂは、ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスにおける効能試験を示す。肝臓プロモーター（リード）からｈＰＡＨ－Ｖ１を発現するＡＡＶ８ベクターを、１ｅ１１ｖｇ／マウスで１回投与し、効能を血液Ｐｈｅレベルとして測定した。これらのベクターも、ｈＰＡＨ－Ｖ１を有しＮ末端タグを有さない４．６ｋｂのベクターと比較した（１ｅ１１および３ｅ１１ｖｇ／マウスで試験した）。

【図17】図１７Ａ～１７Ｃは、ｒＡＡＶベクターを用いた送達後の非ヒト霊長類肝臓におけるｈＰＡＨ－Ｖ１生産とｈＰＡＨ生産のインビボにおける比較を示す図である。図１７Ａは、それぞれ個々の動物の肝臓中のｒＡＡＶベクターゲノムのレベルを示す。図１７Ｂは、処置した各動物の肝臓および脾臓中のベクターから得られたｍＲＮＡのレベルを示す。ｍＲＮＡレベルを、各動物中のベクターゲノムコピーに正規化した。図１７Ｃは、肝臓ホモジネート中のＦＬＡＧでタグ付けされたＰＡＨタンパク質の検出を示す。等しい溶解産物のローディングは、ハウスキーピングタンパク質であるＧＡＰＤＨの検出を用いて確認された。Ａ１ＭＢ２－ｍＴＴＲプロモーターからのＦＬＡＧでタグ付けされたＰＡＨまたはＰＡＨ－Ｖ１を発現するｒＡＡＶベクターの５ｅ１２ｇ／ｋｇのＩＶ投与によって実験を実行した。肝臓中のベクターゲノム、ベクターから得られたｍＲＮＡおよびＰＡＨタンパク質の分析のために、２週間後、組織を収集した。

【発明を実施するための形態】

【0039】

一部の態様において、本明細書に記載される発明は、インビトロおよびインビボにおいて、野生型ｈＰＡＨと比較してより高いＰＡＨタンパク質および／または活性レベルを付与する、少なくとも２つ、４つのアミノ酸変化を含む、ヒトＰＡＨ（ｈＰＡＨ－Ｖ１）ポリペプチドのバリアントを提供する。他の態様において、本明細書に記載される発明は、インビトロおよびインビボにおいて、野生型ｈＰＡＨと比較してより高いＰＡＨタンパク質および／または活性レベルを付与する少なくとも２、３または４つのアミノ酸変化を含むヒトＰＡＨ（ｈＰＡＨ－Ｖ１）の改善されたバリアントを提供する。一部の態様において、本発明は、ヒトＰＡＨの前記バリアントをコードする核酸を提供する。一部の態様において、本発明は、発現カセット、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターおよびウイルス粒子、ならびに本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置するための方法であって；例えば、ＰＡＨ活性を増加させること、脳へのチロシンおよびトリプトファン輸送を増加させること、およびドーパミンおよびセロトニンなどの脳神経伝達物質レベルを正規化することによる、方法を提供する。さらなる追加の態様において、本発明は、本開示のバリアントＰＡＨを用いて個体におけるＰＫＵを処置するためのキットを提供する。

【0040】

Ｉ．全般的な技術
本明細書に記載または参照された技術および手順は、一般的によく理解されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ
Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３～８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）に記載される広く利用されている手法などの当業者により従来の方法論を使用して一般的に採用される。

【0041】

ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達しようとする核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。

【0042】

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ
ハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドのバックボーンは、糖およびリン酸基（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡに見出すことができる通り）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含んでいてもよい。代替として、ポリヌクレオチドのバックボーンは、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含んでいてもよく、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ－ＮＨ_２）または混成のホスホルアミデート－リン酸ジエステルオリゴマーであってもよい。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、鎖を適切な条件下でアニーリングすること、またはＤＮＡポリメラーゼを使用して適切なプライマーと共に相補鎖をデノボ合成することのいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から得ることができる。

【0043】

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小限の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、その例としては、これらに限定されないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、および多量体が挙げられる。全長タンパク質およびそのフラグメントはどちらも、この定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本開示の目的に関して、「ポリペプチド」は、タンパク質が望ましい活性を維持する限り、天然配列への欠失、付加、および置換（一般的に自然界において保存的な）などの改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によってなされるように計画的であってもよいし、または偶発的であってもよく、例えばタンパク質を生産する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーによって偶発的であってもよい。

【0044】

「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターのケースにおいて、組換え核酸は、少なくとも１つの、ある実施形態では２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。

【0045】

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つの、ある実施形態では２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、複製され、好適なヘルパーウイルスに感染した（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、およびＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶ ＲｅおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中に、または別のベクター例えばクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミド中に）取り込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、「プロベクター（ｐｒｏ－ｖｅｃｔｏｒ）」と称される場合もあり、これは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下で複製およびカプシド化により「レスキュー」することができる。ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内に封入された、およびウイルス粒子、特定にはＡＡＶ粒子中にカプシド化された、プラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれであってもよい。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。

【0046】

「異種」は、それが比較される、またはそれに導入されるかもしくは取り入れられる実体の残りのそれと遺伝的に別個の実体から誘導されていることを意味する。例えば、遺伝
子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（さらに発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに取り込まれる細胞性の配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、ベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。

【0047】

用語「導入遺伝子」は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され、任意選択で適切な条件下で翻訳および／または発現させることが可能なポリヌクレオチドを指す。態様において、これは、それが導入された細胞に望ましい特性を付与するか、またはそれ以外の方法で望ましい治療または診断結果をもたらす。

【0048】

「ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子番号３９６５２６によって表される、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ベータアクチン）由来のポリヌクレオチド配列を指す。「ニワトリβ－アクチンプロモーター」は、本明細書で使用される場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、ニワトリβ－アクチン遺伝子のプロモーターおよび第１のエクソンおよびイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含有するプロモーター、例えばＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９～７７に記載される配列を指す場合もある。用語「ＣＡＧプロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用することができる。用語「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用することができる。

【0049】

用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価体」、または「ゲノムコピー」は、ウイルスタイターへの言及において使用される場合、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物におけるゲノム粒子の数は、例えば、本明細書の実施例に、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１～１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２～２７８に記載されたような手順によって測定することができる。

【0050】

用語「ベクターゲノム（ｖｇ）」は、本明細書で使用される場合、ベクター、例えばウイルスベクターのポリヌクレオチド配列のセットを含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指す場合もある。ベクターゲノムは、ウイルス粒子中にカプシド化することができる。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよい。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターに関連する内因性配列、および／または組換え技術を介して特定のウイルスベクターに挿入されたあらゆる異種配列を含んでいてもよい。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ配列、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）、およびポリアデニル化配列を含んでいてもよい。完全なベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全なセットを含み得る。一部の実施形態において、ウイルスベクターの核酸のタイターは、ｖｇ／ｍＬの単位で測定することができる。このタイターを測定するのに好適な方法は、当業界において公知である（例えば、定量ＰＣＲ）。

【0051】

用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」は、ウイルスタイターへの言及において使用される場合、感染中心アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）によって測定した場合の、感染性の、および複製可能な組換えＡＡＶベクター粒子の数を指し、このアッセイはまた、複製中心アッセイ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）としても公知であり、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３～１９７３に記載される通りである
。

【0052】

用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、ウイルスタイターへの言及において使用される場合、機能アッセイで、例えば、本明細書に記載の実施例、または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３～１２４；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０～５３２（ＬＦＵアッセイ）に記載されたような機能アッセイで測定した場合の、機能的な導入遺伝子産物の生産をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

【0053】

「逆方向末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当業界においてよく理解されている用語であり、ウイルスゲノムの末端に見出される逆方向の相対的に短い配列を指す。

【0054】

「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、当業界においてよく理解されている用語であり、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、２つの択一的な方向のいずれかに存在していてもよく、異なるＡＡＶゲノム間、および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間に不均質性をもたらす。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性を有するいくつかのより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と名付けられた）も含有し、これは、ＩＴＲのこの部分内において鎖内の塩基対形成を可能にする。

【0055】

「末端分解配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製中にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶのＩＴＲのＤ領域中の配列である。突然変異末端分解配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に対して不応性である。

【0056】

「ＡＡＶヘルパー機能」は、宿主細胞によってＡＡＶを複製し、パッケージングすることを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、これらに限定されないが、ＡＡＶの複製およびパッケージングに役立つヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子などの多数の形態のいずれかで提供することができる。他のＡＡＶヘルパー機能は当業界において公知であり、例えば遺伝毒性物質などである。

【0057】

ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、宿主細胞によってＡＡＶ（これは欠損パルボウイルスである）を複製し、パッケージングすることを可能にするウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を提供する。多数のこのようなヘルパーウイルスが同定されており、その例としては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えばワクシニアおよびバキュロウイルスが挙げられる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳類および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスも、ＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能であり、その例としては、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。ＡＡＶの複製のためのアデノウイルスヘルパー機能の例としては、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能が挙げられる。受託機関から入手可能なバキュロウイルスとしては、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスが挙げられる。

【0058】

ｒＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子の感染性ヘルパーウイルス粒子に対する比率が、少なくとも約１０^２：１；少なくとも約１０^４：１、少なくとも約１０^６：１；または少なくとも約１０^８：１またはそれより高い比率である場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。一部の実施形態において、調製物はまた、等価な量のヘルパ
ーウイルスタンパク質（すなわち、上記したヘルパーウイルス粒子の不純物が崩壊した形態で存在する場合、このようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在すると予想されるタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質汚染は、ＳＤＳゲルにおけるクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）として一般的に観察することができる。

【0059】

参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮に入れない、参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一な候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業界における能力の範囲内の様々な方法で、例えば、公共的に利用可能なコンピューターソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、Ｓｕｐｐ．３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載され、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを含むものを使用して達成することができる。好ましいアライメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ペンシルバニア）である。当業者は、比較されている配列の全長にわたり最高のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書に記載の目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（これは、その代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それと、またはそれに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと言うことができる）は、Ｘ／Ｙの分数に１００をかけることによって計算され、式中Ｘは、配列アライメントプログラムによって、ＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて同一な一致とスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されると予想される。本明細書に記載の目的のために、所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％への、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｄ（これは、その代わりに、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する特定の核酸配列同一性％を有するかまたは含む所与の核酸配列Ｃと言うことができる）は、Ｗ／Ｚの分数に１００をかけることによって計算され、式中Ｗは、配列アライメントプログラムによって、ＣとＤのそのプログラムのアライメントにおいて同一な一致とスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する核酸配列同一性％は、ＤのＣに対する核酸配列同一性％と等しくないことが理解されると予想される。

【0060】

「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞は、それが、その天然環境の成分から、同定、分離および／または回収されていることを意味する。

【0061】

「有効量」は、臨床結果（例えば、症状の改善、臨床エンドポイントの達成など）を含む有益な、または望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数の投与で投与することができる。病気の状態に関して、有効量は、疾患を改善する、安定化する、またはその発症を遅延させるのに十分な量である。

【0062】

「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されな
いが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。

【0063】

「処置」は、本明細書で使用される場合、有益な、または望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。この開示の目的のために、有益な、または望ましい臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能かまたは検出不能かにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の低減、安定化された（例えば、悪化していない）疾患の状態、疾患の拡がり（例えば、転移）の防止、疾患進行の遅延または減速、病気の状態の改善または一時的緩和、および寛解（部分的かまたは全体かにかかわらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味する場合もある。

【0064】

用語「予防的処置」は、本明細書で使用される場合、個体が、障害を有することがわかっている、もしくはその疑いのある、または障害を有するリスクがあるが、障害の症状を呈示していないかまたは最小の症状しか呈示していない場合の処置を指す。予防的処置を受けている個体は、症状が発症する前に処置することができる。

【0065】

「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）」は、本明細書で使用される場合、フェニルアラニンの芳香族側鎖の水酸化を触媒してチロシンを生成する酵素（ＥＣ１．１４．１６．１）である。ＰＡＨは、触媒作用のためにテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４、プテリジン補因子）および非ヘム鉄を使用するモノオキシゲナーゼである。反応中、分子酸素は、ＢＨ４およびフェニルアラニン基質への１つの酸素原子の逐次的な取り込みによってヘテロリシスにより切断される。フェニルアラニンのチロシンへの水酸化は、フェニルアラニンの異化における律速工程であり、この酵素活性の欠損は、常染色体劣性障害であるフェニルケトン尿症を引き起こす。ＰＡＨはまた、ＰＨ、ＰＫＵ、またはＰＫＵ１と称される場合もある。ＰＡＨは、Ｎ末端調節（１～１１７）、中央触媒（１１８～４１０）およびＣ末端四量体化ドメイン（４１１～４５２）からなるマルチドメインタンパク質である。ヒトＰＡＨは、ＧｅｎＢａｎｋ；例えば、ＮＭ＿０００２７７、ＮＭ＿００８７７、ＮＭ＿００１３５４３０４、ＮＰ＿０００２６８、ＮＰ＿０３２８０３、ＮＰ＿００１３４１２３３、ＡＡＡ６００８２．１、ＡＡＨ２６２５１．１、ＡＡＣ５１７７２．１、およびＡＡＬ７８８１６．１（ＧＩ：１８７６５８８５）で提供される。ヒトＰＡＨの例は、配列番号１として提供される。

【0066】

「フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）」は、本明細書で使用される場合、肝臓酵素のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝学的欠損を指す。いかなる処置も行われなければ、ＰＫＵの重度の形態は、高度に上昇した血液Ｐｈｅレベルに至り、これは、神経毒性であり重度の精神遅滞に関連する。

【0067】

「ｍＴＴＲプロモーター」は、マウストランスチレチン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列を指す。ｍＴＴＲプロモーターの例であるｍＴＴＲ４８２は、Ｋｙｏｓｔｉｏ－Ｍｏｏｒｅ、（２０１６）およびＮａｍｂｉａｒ（２０１７）によって提供される。

【0068】

「改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｍＰｒＴ２）」は、ヒトプロトロンビン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列の２つのコピーを指す。ｍＰｒＴ２エンハンサーの例は、（ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ２００６、Ｊａｃｏｂｓ ２００８）によって提供される。ｍＰｒＴ２配列の例は、配列番号７によって提供される。

【0069】

「改変されたアルファ１－マイクロビクニン（ｍＡ１ＭＢ２）」は、ヒトアルファ１－ミクログロブリン／ビクニン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列の２つのコピーを指す。
ｍＡ１ＭＢ２の例は、（ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ２００６、Ｊａｃｏｂｓ ２００８）によるエンハンサーである。ｍＡ１ＭＢ２配列の例は、配列番号８によって提供される。

【0070】

「改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）」は、マウスアルブミン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列を指す。ｍＥａｌｂエンハンサーの例は、（Ｋｒａｍｅｒ ２００３）によって提供される。ｍＥａｌｂ配列の例は、配列番号９によって提供される。

【0071】

「Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）」は、ＰｒｅＣｏｒｅプロモーターの上流に配置されたＢ型肝炎ウイルス由来のポリヌクレオチド配列を指す。ｈＥＩＩエンハンサーの例は、（Ｋｒａｍｅｒ ２００３）によって提供される。ＨＥＩＩ配列の例は、配列番号１０によって提供される。

【0072】

「ＣＲＭ８」は、ヒトＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子からのポリヌクレオチド配列由来のシス作用性調節モジュールを指す（Ｃｈｕａｈ ２０１４）。ＣＲＭ８配列の例は、配列番号１１によって提供される。

【0073】

「Ａｌｂ３’」は、ヒトアルブミン遺伝子のコード領域に対して３’のポリヌクレオチド配列を指す。Ａｌｂ３’エレメントの例は、Ｗｏｏｄｄｅｌｌ（２００８）によって提供される。Ａｌｂ３’配列の例は、配列番号１２によって提供される。「Ａｌｂ３’／ＳＭＡＲ」は、ヒトアルファ１－抗トリプシン遺伝子（ＡＦ１５６５４２）の足場／マトリックス付着領域に連結されたＡｌｂ３’を指す。Ａｌｂ３’／ＳＭＡＲ配列の例は、配列番号１３によって提供される。

【0074】

本明細書において「約」の値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーターそのものに向けられた実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及している記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0075】

本明細書で使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の単数形は、別段の指定がない限り、複数形の対象を含む。

【0076】

本明細書に記載される開示の態様および実施形態は、「含む」、「からなる」、および／または「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。

【0077】

ＩＩＩ．ＰＡＨバリアント
一部の態様において、本発明は、個体で発現される場合、より高いＰＡＨ発現および／または活性レベルを付与するバリアントＰＡＨポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、Ｓ２５１、Ｈ２６４、Ｇ２５６、Ｇ２７２、Ｇ２７５、Ｐ２７９、Ｔ３２３およびＦ３２７から選択される部位にある。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｈ２６４およびＧ２７５に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、このアミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６の部位に４つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、Ｓ２５１、Ｇ２５６、Ｇ２７２およびＰ２７９に５つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、Ｇ２５６、Ｔ３２３およびＦ３２７に６つ
のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｈ２６４ＰおよびＧ２７５Ｈの少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａから選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＳ２５０Ｐを含むアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換であるアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、表１～３に提示されるバリアントＰＡＨポリペプチドのいずれか１つである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａであるアミノ酸置換を含み、少なくともおよその野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性を維持しながらさらなるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、アミノ酸置換の配置は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド；例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＰＡＨポリペプチドに基づく。

【0078】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、ヒトＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のいずれかで同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のいずれかで同一なアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％より大きい活性を有する。一部の実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のいずれかで同一なアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドは、配列番号１の野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％より大きい活性を有する。

【0079】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性を維持する短縮化されたＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、Ｎ末端の短縮化を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端の短縮化は、Ｎ末端調節ドメインの一部または全ての短縮化である。一部の実施形態において、Ｎ末端の短縮化は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１からおよそアミノ酸残基１０２の欠失である。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、Ｃ末端の短縮化を含む。一部の実施形態において、Ｃ末端の短縮化は、四量体化ドメインの一部または全ての短縮化である。一部の実施形態において、Ｃ末端の短縮化は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約４２９から４５２の欠失である。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｎ末端の短縮化およびＣ末端の短縮化を含む。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、Ｎ末端調節配列の一部または全ておよび四量体化ドメインの一部または全ての短縮化を含む。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）の、アミノ酸残基１からおよそアミノ酸残基１０２およびアミノ酸残基約４２９から約４５２の欠失を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約１０２～約４２８に対応す
るアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１０２～４２８に対応するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）の、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６の部位に４つのアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａから選択される４つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、短縮化されたバリアントＰＡＨポリペプチドは、表１～３に提示されるアミノ酸置換の組合せのいずれか１つをさらに含む。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）の活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％より大きい活性を有する。

【0080】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、以下の部位：Ｇ３３、Ｇ４６、Ｇ１０３、Ｇ１３９、Ｇ１４８、Ｇ１８８、Ｇ２１８、Ｇ２３９、Ｇ２４７、Ｇ２５７、Ｇ２７２、Ｇ２８９、Ｇ３０７、Ｇ３１２、Ｇ３３２、Ｇ３３７、Ｇ３４４、Ｇ３５２、またはＧ４４２の１つまたはそれ以上に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｇ３３Ａ、Ｇ４６（Ａ、Ｐ）、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９（Ａ、Ｐ）、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、またはＧ４４２Ａの１つを含む。一部の実施形態において、バリアント＃１のＰＡＨポリペプチドは、以下の部位：Ｇ３３、Ｇ４６、Ｇ１０３、Ｇ１３９、Ｇ１４８、Ｇ１８８、Ｇ２１８、Ｇ２３９、Ｇ２４７、Ｇ２５７、Ｇ２７２、Ｇ２８９、Ｇ３０７、Ｇ３１２、Ｇ３３２、Ｇ３３７、Ｇ３４４、Ｇ３５２、またはＧ４４２の１つまたはそれ以上に、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、バリアント＃１のＰＡＨポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｇ３３Ａ、Ｇ４６（Ａ、Ｐ）、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９（Ａ、Ｐ）、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、またはＧ４４２Ａの１つまたはそれ以上を含む。

【0081】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチド（例えば、バリアント＃１のＰＡＨポリペプチド）は、以下のアミノ酸置換：Ｐ９Ｇ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１９２Ｒ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ２０６Ｈ、Ｈ２２０Ｒ、Ｑ３３６Ｅ、Ｅ３６０Ｄ、Ｉ３７４Ｃ、Ｎ３７６Ｅ、Ｎ４０１Ｔ、Ｉ４２１Ｖ、Ｉ４４１Ｖ、Ｓ４４６Ｈの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチド（例えば、バリアント＃１）は、ヒトＰＡＨのＣ末端にセリン残基（Ｓｅｒ４５３）をさらに含む。

【0082】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチド（例えば、バリアント＃１のＰＡＨポリペプチド）は、以下のアミノ酸置換：Ｆ２４０Ｗ、Ａ２４６Ｐ、Ｇ２４７Ａ、Ｙ２６８Ｗ、Ｃ２８４Ｆ、Ｔ３２３Ｒ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３１９Ｐ、Ｉ３０６（Ｙ、Ｆ）、Ｋ１１３Ｐ、Ｇ１８８Ａ、Ｆ１９１Ｙ、Ｔ１９３Ｒ、Ｙ２０６Ｈ、Ｇ３３７Ｐ、Ｎ３７６Ｐの１つまたはそれ以上を含む。

【0083】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチド（例えば、バリアント＃１のＰＡＨポリペプチド）は、可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するようなあらゆるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するようなアミノ酸置換は、ＰＡＨフラグメント２７０～２９５および３８０～４０５の範囲内である。

【0084】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチド（例えば、バリアント＃１のＰＡＨポリペプチド）は、ヒトＰＡＨの安定性を強化するための翻訳後修飾を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、翻訳後修飾、例えば、外部のニトロシル化剤による、Ｃｙｓ残基、特定にはＩ３７４Ｃのペグ化およびニトロシル化を含む。

【0085】

ＩＩＩ．核酸
一部の態様において、本発明は、個体で発現される場合、より高いＰＡＨ活性レベルを付与するバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸は、少なくとも３つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードし、このアミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６の部位に４つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａから選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＳ２５０Ｐを含むアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換をさらに含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、表１～３に提示されるバリアントＰＡＨポリペプチドのいずれか１つであるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含み、少なくともおよその野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性を維持しながらさらなるアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸によってコードされたアミノ酸置換の配置は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド；例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＰＡＨポリペプチドに基づく。

【0086】

一部の実施形態において、核酸は、バリアントヒトＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のいずれかで同一なアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のいずれかで同一なアミノ酸配列を含み、野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％より大きい活性を有するバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のいずれかで同一なアミノ酸配列を含み、配列番号１の野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％より大きい活性を有するバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。

【0087】

一部の実施形態において、核酸は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性を維持する
短縮化されたＰＡＨポリペプチドであるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｎ末端の短縮化を含む短縮化されたＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｎ末端調節ドメインの一部または全ての短縮化であるＮ末端の短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１からおよそアミノ酸残基１０２の欠失を含むＮ末端の短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｃ末端の短縮化を含む短縮化されたＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、四量体化ドメインの一部または全ての短縮化であるＣ末端の短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約４２９から４５２の欠失を含むＣ末端の短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｎ末端の短縮化およびＣ末端の短縮化を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、Ｎ末端調節配列の一部または全ておよび四量体化ドメインの一部または全ての短縮化を含む。一部の実施形態において、短縮化されたＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）の、アミノ酸残基１からおよそアミノ酸残基１０２およびアミノ酸残基約４２９から約４５２の欠失を含む。一部の実施形態において、核酸は、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約１０２から約４２８に対応するアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１０２～４２８に対応するアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）の、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６の部位に４つのアミノ酸置換をさらに含む短縮化されたＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａから選択される４つのアミノ酸置換を含む短縮化されたＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、短縮化されたバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、表１～３に提示されるアミノ酸置換の組合せのいずれか１つをさらに含む。一部の実施形態において、核酸は、野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）の活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％より大きい活性を有する短縮化されたＰＡＨポリペプチドをコードする。

【0088】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、マウストランスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、ＬＰ１プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦｌ－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、ＬＰ１プロモーターまたはｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。

【0089】

一部の実施形態において、核酸は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫ ｐＡである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、Ｌｅｖｉｔｔ，Ｎら（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０１９～１０２５に記載されたような合成ポリアデニル化シグナルである。

【0090】

一部の実施形態において、核酸は、イントロンをさらに含む。本発明で使用するための様々なイントロンが当業者に公知であり、その例としては、ＭＶＭイントロン、Ｆ ＩＸ短縮化イントロン１、β－グロビンＳＤ／イムノグロビン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）重鎖ＳＡ、アデノウイルスＳＤ／イムノグロビンＳＡ、ＳＶ４０後期ＳＤ／ＳＡ（１９Ｓ／１６Ｓ）、およびハイブリッドアデノウイルスＳＤ／ＩｇＧ ＳＡが挙げられる。（Ｗｕら、２００８、Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９５、Ｃｈｏｉら、２０１４、Ｗｏｎｇら、１９８５、Ｙｅｗら、１９９７、Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ（１９９０）。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、誤った翻訳開始部位を最小化するために全てのＡＴＧ部位が除去されている、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドプロモーターおよびイントロンである（配列番号１５）。

【0091】

一部の実施形態において、核酸は、（１つまたはそれ以上の）スタッファー核酸を含んでいてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、レポーターポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。当業者により認識されると予想されるように、スタッファー核酸は、核酸内の様々な領域に配置されていてもよいし、核酸内の連続する配列（例えば、単一の場所における単一のスタッファー核酸）または複数の配列（例えば、１つより多くの場所（例えば、２つの場所、３つの場所など）における１つより多くのスタッファー核酸）で構成されていてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸配列の下流に配置されていてもよい。実施形態において、スタッファー核酸は、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸配列の上流に（例えば、プロモーターとバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸配列との間に）配置されていてもよい。同様に当業者により認識されると予想されるように、様々な核酸をスタッファー核酸として使用することができる。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ヒトアルファ－１－抗トリプシン（ＡＡＴ）スタッファー配列またはＣ１６Ｐ１第１６染色体Ｐ１クローン（ヒトＣ１６）スタッファー配列の全部または一部を含む。一部の実施形態において、スタッファー配列は、遺伝子の全部または一部を含む。例えば、スタッファー配列は、ヒトＡＡＴ配列の部分を含む。当業者は、スタッファーフラグメントとして遺伝子の異なる部分（例えば、ヒトＡＡＴ配列）を使用できることを認識していると予想される。例えば、スタッファーフラグメントは、遺伝子の５’末端、遺伝子の３’末端、遺伝子の中央、遺伝子の非コード部分（例えば、イントロン）、遺伝子のコード領域（例えばエクソン）、または遺伝子の非コード部分とコード部分との混合物からであってもよい。当業者はまた、スタッファー配列の全部または一部をスタッファー配列として使用できることも認識していると予想される。一部の実施形態において、スタッファー配列は、内部ＡＴＧコドンを除去するように改変されている。一部の実施形態において、スタッファー配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。

【0092】

一部の実施形態において、ヒトＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸は、コドン最適化されている。一部の実施形態において、ヒトＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸は、特定の細胞、例えば真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物の細胞であるか、またはそれ由来であってもよく、このような生物は、例えば哺乳動物であり、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット
、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類が挙げられる。一般的に、コドン最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子においてより高い頻度で、または最も高い頻度で使用されるコドンと置き換えることによって、目的の宿主細胞における発現の強化のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドン出現頻度表は、例えば「コドン出現頻度データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２を参照）。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、Ｐａ．）、ＤＮＡ２．０、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＧＡ）またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＧＳ）およびＣｐＧ含量の低減と組み合わせたＧＳアルゴリズムが利用可能である。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、 ＧＡアルゴリズムを使用してコドン最適化されている。一部の実施形態において、核酸配列は、配列番号１４の核酸配列に少なくとも８０％同一である。一部の実施形態において、核酸は、配列番号１４の核酸配列を含む。

【0093】

ＩＶ．肝臓特異的発現カセット
一部の態様において、本発明は、肝臓細胞において導入遺伝子を発現するための発現カセットであって、発現カセットが、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、プロモーターが、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーが、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｍＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含む、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’である。一部の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。

【0094】

一部の実施形態において、本発明は、肝臓細胞において導入遺伝子を発現するための発現カセットであって、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）、またはヒトα１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）である、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に位置する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。

【0095】

一部の実施形態において、本発明は、肝臓細胞内で導入遺伝子を発現するための発現カセットであって、発現カセットが、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーが、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｍＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）、またはＣＲＭ８エンハンサーを含み、３’エレメントが、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）、またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）である、発現カセットを提供する。一部の実
施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’である。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に位置する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。

【0096】

一部の実施形態において、発現カセットは、イントロンをさらに含む。一部の実施形態において、イントロンは、ＭＶＭイントロン、ＦＩＸ短縮化イントロン１、β－グロビンＳＤ／免疫グロビン重鎖ＳＡ、アデノウイルスＳＤ／免疫グロビンＳＡ、ＳＶ４０後期ＳＤ／ＳＡ（１９Ｓ／１６Ｓ）、またはハイブリッドアデノウイルスＳＤ／ＩｇＧ ＳＡである。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。

【0097】

一部の実施形態において、発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫ ｐＡである。

【0098】

一部の実施形態において、発現カセットは、ベクターに組み込まれる。一部の実施形態において、発現カセットは、ウイルスベクターに組み込まれる。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターである。

【0099】

Ｖ．ベクターおよびウイルス粒子
ある特定の態様において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ベクターに含まれる。一部の実施形態において、本発明は、ウイルス粒子、例えば、以下に記載されるウイルス粒子にパッケージングするためのバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸配列の導入のための組換えウイルスゲノムの使用を企図する。組換えウイルスゲノムは、バリアントＰＡＨポリペプチドの発現を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製起点を含み得る。ウイルス粒子についての例示的なウイルスゲノムエレメントおよび送達方法を、より詳細に以下に記載する。

【0100】

非ウイルス送達系
核酸を細胞または標的組織に導入するために、従来の非ウイルス遺伝子導入方法も使用される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および送達系に複合化される核酸が挙げられる。例えば、ベクターは、脂質（例えば、カチオン性もしくは中性脂質）、リポソーム、ポリカチオン、ナノ粒子、または核酸の細胞取り込みを増強する薬剤に複合化される。ベクターは、本明細書に記載される送達方法のいずれかに適した薬剤に複合化される。一部の実施形態において、核酸は、１つまたはそれ以上のウイルスＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）を含む。

【0101】

ウイルス粒子
一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、または組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。

【0102】

ｒＡＡＶ粒子
一部の実施形態において、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、１つまたは
それ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接している。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲと隣接しているバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、２つのＡＡＶ ＩＴＲと隣接している。

【0103】

一部の実施形態において、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、転写の方向の構成要素、転写開始および終了配列を含む制御配列と作動可能に連結され、それによって発現カセットを形成する。発現カセットは、５’端および３’端において、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接している。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングのために意図される通りに機能することを意味する。Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８～３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４～４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０～１６頁が参照され、これらは全て、参照により全体として本明細書に組み入れる。本発明の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、カプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に不可欠なＡＡＶの配列の全て、およびｒＡＡＶによる感染のための物理構造を少なくとも含む。本発明のベクターで使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列（例えば、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３～８０１頁に記載されるような配列）を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換による改変を有してもよく、またはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。４０種類を超えるＡＡＶの血清型が現在知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが引き続き特定されている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４～６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１～６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９～８１０頁を参照。

【0104】

任意のＡＡＶ血清型の使用が、本発明の範囲内とみなされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型に由来するベクターであり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲなどである。一部の実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶのＩＴＲを含む。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲ等である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。

【0105】

一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸を含んでもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードしてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸に対して３’に位置し得る。

【0106】

一部の態様において、本発明は、組換え自己相補性ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補性ベクターである。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、同第７，７６５，５８３号、同第７，７８５，８８８号、同第７，７９０，１５４号、同第７，８４６，７２９号、同第８，０９３，０５４号、および同第８，３６１，４５７号、ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記載されており、これらの
各々は、参照により全体として本明細書に組み入れる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、導入遺伝子の相補的コード鎖および非コード鎖）によって、迅速に二本鎖ＤＮＡ分子を形成する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子であって、ｒＡＡＶゲノムが、第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のバリアントＰＡＨポリペプチドのコード鎖）および第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドの非コード鎖またはアンチセンス鎖）を含み、第１の異種ポリヌクレオチド配列が、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２のポリヌクレオチド配列と鎖内塩基対を形成することができる、ＡＡＶウイルス粒子を提供する。

【0107】

一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対合を容易にする配列、例えば、ヘアピンＤＮＡ構造によって連結される。ヘアピン構造は、当該技術分野において公知であり、例えば、ｓｉＲＮＡ分子中にある。一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列とは、変異型ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結される。変異型ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムを複製すると、ｒｅｐタンパク質が、変異型ＩＴＲでウイルスゲノムを切断しないため、以下を５’から３’へ順に含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスカプシドにパッケージングされる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドに対して逆向きの第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ ＩＴＲ。

【0108】

一部の実施形態において、第１の異種核酸配列および第２の異種核酸配列は、変異型ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号１７）を含む。変異型ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムを複製すると、ｒｅｐタンパク質が、変異型ＩＴＲでウイルスゲノムを切断しないため、以下を５’から３’へ順に含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスカプシドにパッケージングされる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドに対して逆向きの第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ ＩＴＲ。

【0109】

一部の実施形態において、ベクターは、ウイルス粒子中にカプシド形成される。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。異なるＡＡＶ血清型が、特定の標的細胞の形質導入を最適化するために、または特定の標的組織（例えば、眼組織）内の特定の細胞型を標的とするために使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、本発明のＡＡＶ２カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含むことができるか、またはＡＡＶ２カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲを含むことができる。ｒＡＡＶ粒子の作製のためのＡＡＶ血清型の任意の組合せが、それぞれの組合せが本明細書に明示的に記載されているかのように、本明細書において提供される。一部の実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶ２カプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0110】

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド（例えば、野
生型ＡＡＶ６カプシド、または米国特許出願公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されるＳｈＨ１０などのバリアントＡＡＶ６カプシド）、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、または米国特許公出願公開第２０１３／０３２３２２６号に記載される改変ＡＡＶ９カプシド）、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、チロシンカプシド変異体、ヘパリン結合カプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９カプシド、または米国特許出願公開第２０１２／００６６７８３号に記載される任意の他のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１カプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開第２００３／０４２３９７号に記載されるＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、変異体カプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドを形成する能力を維持している。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５チロシン変異体カプシド（Ｚｈｏｎｇ Ｌ．ら、（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７～７８３２頁）を含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質（Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００４、７８（１２）：６３８１頁）を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質またはその変異体を含む。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質またはその変異体を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）カプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。一部の実施形態において、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０カプシドは、例えば、以下に記載されるチロシン変異またはヘパラン結合変異を含む。一部の実施形態において、カプシドは、肝臓標的化カプシドであり、例えば、限定されないが、ＬＫ０３カプシド、ＨＳＣ１５カプシド、または１７カプシドである。一部の実施形態において、カプシドは、操作されたＡＡＶカプシド（例えば、シャッフルされたカプシド）である。操作されたカプシドの例としては、ＤＪ（Ｇｒｉｍｍ Ｄら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、２００８、８２：５８８７～９１１頁）、ＬＫ０３（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４、５０６：３８２～６頁）ならびにＨＳＣ１５およびＨＳＣ１７（Ｓｍｉｔｈ ＬＪら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１４年９月；２２（９）：１６２５～３４頁）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0111】

ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８等）のカプシドは、３つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含むことが知られている。これらのタンパク質は、かなりの量の重複アミノ酸配列と、固有のＮ末端配列を含む。ＡＡＶ２カプシドは、正二十面体対称性（ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）によって配置される６０個のサブユニットを含む（Ｘｉｅ、Ｑ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（１６）：１０４０５～１０頁）。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、１：１：１０の比率で存在することがわかっている。

【0112】

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置において１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質と、ｂ）異種核酸および少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反
復を含むｒＡＡＶベクターとを含む。

【0113】

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を低減または除去するカプシドタンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで該１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１番号付けに基づく番号付けで４８４位、４８７位、５３２位、５８５位または５８８位にある。本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付け」とは、ＡＡＶ２のＶＰ１の列挙されたアミノ酸に対応する列挙されたカプシドタンパク質のアミノ酸をいう。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換がＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付けで３４７位、３５０位、３９０位、３９５位、４４８位、４５１位、４８４位、４８７位、５２７位、５３２位、５８５位および／または５８８位にある場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸３４７、３５０、３９０、３９５、４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８に対応する列挙されたカプシドタンパク質のアミノ酸にある。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１の４８４位、４８７位、５３２位、５８５位または５８８位にある。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付けで、ＡＡＶ３のＶＰ１の４８４位、４８７位、５３２位、５８５位または５８８位にある。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１番号付けに基づく番号付けで４８５位、４８８位、５２８位、５３３位、５８６位または５８９位にある。一部の実施形態において、アミノ酸５８５および／または５８８（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付け）に対応する位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸は、アルギニン残基によって置き換えられる（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６についてはＳ５８６および／またはＴ５８９、ＡＡＶ９についてはＳ５８６および／またはＡ５８９、ＡＡＶｒｈ８ＲについてはＡ５８６および／またはＴ５８９、ＡＡＶ８についてはＱ５８８および／またはＴ５９１、ならびにＡＡＶｒｈ１０についてはＱ５８８および／またはＡ５９１）。他の実施形態において、アミノ酸４８４、４８７、５２７および／または５３２（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付け）に対応する位置にある１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）は、アラニンなどの正に荷電されていないアミノ酸によって置き換えられる（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６についてはＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８および／またはＫ５３３；ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ８ＲについてはＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８および／またはＲ５３３；ならびにＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０についてはＲ４８７、Ｒ４９０、Ｋ５３０および／またはＲ５３５）。

【0114】

ＡＡＶ粒子の作製
ｒＡＡＶベクターの作製のための多数の方法が当該技術分野において知られており、例えば、トランスフェクション、安定細胞株作製、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ、ＪＥら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１（１１）：８７８０～８７８９頁）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｕｒａｂｅ、Ｍ．ら、（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１３（１６）：１９３５～１９４３頁；Ｋｏｔｉｎ、Ｒ．（２０１１）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０（Ｒ１）：Ｒ２～Ｒ６頁）を含む感染性ハイブリッドウイルス産生系が挙げられる。ｒＡＡＶウイルス粒子の作製のためのｒＡＡＶ産生培養は全て、１）好適な宿主細胞、２）好適なヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物、４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列（例えば、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードするＡＡＶゲノム）と隣接している核酸（治療用核酸など）、ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持するための好適な培地および培地成分を必要とする。一部の実施形態において、好適な宿主細胞は、霊長類宿主細胞である。一部の実施形態において、好適な宿主細胞は、ヒト由来細胞株、例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３、またはＰｅｒｃ．６細胞である。一部の実施形態において、好適なヘルパーウイルス
機能は、野生型または変異体アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。必ずではないが、一般に、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物は、ｒｅｐ遺伝子産物がｒＡＡＶゲノムの複製およびパッケージングに機能し得る限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型の遺伝子産物である。当該技術分野で公知の好適な培地が、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用される。これらの培地には、限定するものではないが、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって製造される培地、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されているものなどのカスタム調製物、ならびに米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地が含まれ、これらの各々は、特に組換えＡＡＶベクターの作製に使用するためのカスタム培地調製物に関係して、参照により全体として本明細書に組み入れる。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。

【0115】

ｒＡＡＶ粒子の作製のための方法の１つは、トリプルトランスフェクション法である。簡潔に述べると、ｒｅｐ遺伝子およびカプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドとともに、細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）にトランスフェクトし（例えば、リン酸カルシウム法を使用して）、ウイルスを回収して、場合により精製する。そのように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞へのトリプルトランスフェクションによって作製され、核酸の宿主細胞へのトランスフェクションにより、ｒＡＡＶ粒子を作製可能な宿主細胞が生成される。

【0116】

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、プロデューサー細胞株法によって作製される（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：２５３～２６９頁；米国特許出願公開第２００４／０２２４４１１号；およびＬｉｕ、Ｘ．Ｌ．ら、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：２９３～２９９頁）。簡潔に述べると、細胞株（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰｅｒｃ．６細胞株）を、ｒｅｐ遺伝子、カプシド遺伝子、およびプロモーター－異種核酸配列（例えば、バリアントＰＡＨポリペプチド）を含むベクターゲノムを含有するプラスミドで安定的にトランスフェクトしてもよい。細胞株を、ｒＡＡＶ産生のためのリードクローンを選択するためにスクリーニングしてもよく、次いで、生成バイオリアクターに拡張し、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶ）に感染させて、ｒＡＡＶ産生を開始してもよい。その後、ウイルスを収集し、アデノウイルスを不活化（例えば、熱によって）および／または除去してもよく、ｒＡＡＶ粒子を精製してもよい。そのように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸のうちの１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって作製した。本明細書に記載されるように、プロデューサー細胞株法は、トリプルトランスフェクション法と比較して、オーバーサイズのゲノムを有するｒＡＡＶ粒子の作製にとって有利であり得る。

【0117】

一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、プロデューサー細胞株において安定して維持される。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入されて、プロデ
ューサー細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドで安定的にトランスフェクトされた細胞株は、細胞株の複数の継代（例えば、細胞の５、１０、２０、３０、４０、５０または５０を超える継代）にわたってプラスミドを維持する。例えば、プラスミドは、細胞が複製するときに複製され、またはプラスミドは、細胞ゲノムに組み込まれる。プラスミドが細胞（例えば、ヒト細胞）内で自律的に複製することを可能にする様々な配列が同定されている（例えば、Ｋｒｙｓａｎ、Ｐ．Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：１０２６～１０３３頁）。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有し得る。哺乳類細胞において一般的に使用される選択マーカーとしては、ブラスチシジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ゼオシン、ピューロマイシン、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。核酸を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、限定されないが、ウイルス形質導入、カチオン性トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン等のカチオン性ポリマー、またはリポフェクタミン等のカチオン性脂質を使用）、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、エレクトロポレーション、およびナノ粒子トランスフェクションが挙げられる（詳細について、例えば、Ｋｉｍ、Ｔ．Ｋ．およびＥｂｅｒｗｉｎｅ、Ｊ．Ｈ．（２０１０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３９７：３１７３～３１７８頁を参照）。

【0118】

一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、プロデューサー細胞株に安定して組み込まれる。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入されて、プロデューサー細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有し得る。核酸を様々な宿主細胞株に安定に組み込むための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、反復選択を使用して（例えば、選択マーカーの使用を通じて）、選択マーカー（ならびにＡＡＶ
ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノム）を含む核酸を組み込んだ細胞が選択される。他の実施形態において、部位特異的様式で核酸を細胞株に組み込んで、プロデューサー細胞株を生成してもよい。いくつかの部位特異的組換え系は、ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１～１３５５頁参照）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．およびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６～５１７０頁参照）、およびｐｈｉ Ｃ３１－ａｔｔ（例えば、Ｇｒｏｔｈ，Ａ．Ｃ．ら、（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５～６０００頁参照）のように、当該技術分野において公知である。

【0119】

一部の実施形態において、プロデューサー細胞株は、霊長類細胞株（例えば、非ヒト霊長類細胞株、例えば、ＶｅｒｏまたはＦＲｈＬ－２細胞株）に由来する。一部の実施形態において、上記細胞株は、ヒト細胞株に由来する。一部の実施形態において、プロデューサー細胞株は、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞に由来する。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはオーバーサイズｒＡＡＶゲノムをコードする核酸を細胞株に導入および／または安定的に維持／組み込んでプロデューサー細胞株を生成する前に、細胞株は、ＨｅＬａ、２９３
、Ａ５４９、もしくはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞株、またはその誘導体である。

【0120】

一部の実施形態において、プロデューサー細胞株は、懸濁液中の増殖のために適合される。当該技術分野で公知であるように、アンカー依存細胞は、通常、マイクロキャリアビーズのような基板なしでは懸濁液中で増殖することができない。懸濁液中で増殖させるために細胞株を適合させることは、例えば、スピナー培養液中で攪拌パドルを用いて細胞株を増殖させること、凝集を防ぐためにカルシウムおよびマグネシウムイオンを欠く培地（および場合により消泡剤）を使用すること、シリコーン化化合物で被覆された培養容器を使用すること、ならびに各継代で培養液中の細胞（大きな凝集塊中にないまたは容器の側面上にない）を選択することを含み得る。さらなる説明については、例えば、ＡＴＣＣのよくある質問の文書（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｇｌｏｂａｌ／ＦＡＱｓ／９／１／Ａｄａｐｔｉｎｇ％２０ａ％２０ｍｏｎｏｌａｙｅｒ％２０ｃｅｌｌ％２０ｌｉｎｅ％２０ｔｏ％２０ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－４０．ａｓｐｘから入手可能）およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。

【0121】

一部の態様において、本明細書に開示される任意のｒＡＡＶ粒子の作製方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が作製される条件下で宿主細胞を培養する工程であり、宿主細胞が、（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であり、それぞれＡＡＶ複製および／またはカプシド形成タンパク質をコードしている、ＡＡＶパッケージ遺伝子と、（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲと隣接している本明細書に記載の異種核酸をコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクターと、（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能とを含む、培養する工程、ならびに（ｂ）宿主細胞によって作製されるｒＡＡＶ粒子を回収する工程、を含む方法が提供される。一部の実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲ等からなる群から選択される。例えば、一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、カプシド形成タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶカプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型カプシドタンパク質またはその変異体からなる群から選択される。一部の実施形態において、カプシド形成タンパク質は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む組換えゲノム、および治療用導入遺伝子／核酸をコードする核酸（例えば、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸）を含む。

【0122】

本発明の好適なｒＡＡＶ産生培養培地は、０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで血清または血清由来組換えタンパク質で補足してもよい。代替的に、当該技術分野で公知であるように、ｒＡＡＶベクターは、動物由来の生成物を有しない培地としても参照される無血清条件下で作製し得る。当業者であれば、ｒＡＡＶベクターの作製を支持するように設計された市販培地またはカスタム培地も、産生培養物中のｒＡＡＶの力価を増加させるために、当該技術分野で公知の１つまたはそれ以上の細胞培養成分、例えば、限定されないが、ブドウ糖、ビタミン、アミノ酸、および／または成長因子で補足してもよいことを理解し得る。

【0123】

ｒＡＡＶ産生培養は、利用される特定の宿主細胞に好適な様々な条件下（広い温度範囲、様々な時間の長さなど）で増殖させ得る。当該技術分野で公知であるように、ｒＡＡＶ産生培養としては、付着依存培養、例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルタ、マイクロキャリア、および充填床または流動床バイオリアクターのような好適な付着依存容器中で培養可能な培養が挙げられる。ｒＡＡＶベクター産生培養はまた、懸濁適合宿主細胞、例えば、スピナーフラスコ、攪拌タンクバイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムのような使い捨てシステムを含む様々な方法で培養可能なＨｅＬａ、２９３およびＳＦ－９細胞などを含んでもよい。

【0124】

本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、米国特許第６，５６６，１１８号でさらに完全に記載されているように、当該技術分野で公知の条件下で細胞を培養してｒＡＡＶ粒子をインタクトな細胞から培地へ放出させられるのであれば、産生培養物の宿主細胞の溶解によって、または産生培養物からの使用済み培地の収集によって、ｒＡＡＶ産生培養物から収集してもよい。好適な細胞溶解方法も、当該技術分野で公知であり、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに界面活性剤および／またはプロテアーゼのような化学物質を用いた処理が挙げられる。

【0125】

さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は精製される。本明細書で使用されるとき、用語「精製される」には、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在する場所または最初に調製される場所に存在する他の成分の少なくとも一部が除去された、ｒＡＡＶ粒子の調製物が含まれる。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解物または産生培養上清などの供給源混合物から濃縮精製技術を用いて調製される。濃縮は、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合による方法、もしくは感染性による方法などの様々な方法で測定することができ、または、濃縮は、混入物、例えば、産生培養混入物、もしくはヘルパーウイルス、培地成分等の工程内混入物等の、供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質に関係させて測定することができる。

【0126】

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養収集物は、宿主細胞デブリスを除去するために清澄化される。一部の実施形態において、産生培養収集物は、一連のデプスフィルタ、例えば、グレードＤＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄフィルタ、グレードＡ１ＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄフィルタ、および０．２μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ１０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ親水性膜フィルタなどを通じた濾過によって清澄化される。清澄化は、当該技術分野で公知の他の様々な標準技術、例えば、遠心分離または当該技術分野で公知の０．２μｍまたはそれ以上の孔径の酢酸セルロースフィルタを通じた濾過によっても達成される。

【0127】

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養収集物は、産生培養物中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化するために、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）でさらに処理される。一部の実施形態において、ベンゾナーゼ（登録商標）消化は、当該技術分野において公知の標準条件下、例えば、周囲温度～３７℃の温度範囲で３０分～数時間、最終濃度１～２．５ユニット／ｍｌのベンゾナーゼ（登録商標）の条件で実行される。

【0128】

ｒＡＡＶ粒子は、以下の精製工程：平衡遠心分離；フロースルー陰イオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するためのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝
液交換；ナノ濾過；および陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉、のうちの１つまたはそれ以上を使用して単離または精製される。これらの工程は、単独で、様々な組合せで、または異なる順序で使用される。一部の実施形態において、方法は、下記のような順序で全ての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製する方法は、例えば、Ｘｉａｏら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２頁；米国特許第６，９８９，２６４号および同第８，１３７，９４８号；ならびに国際公開第２０１０／１４８１４３号に見出される。

【0129】

ＶＩ．処置方法
本開示のある特定の態様は、それを必要とする個体においてフェニルケトン尿症を処置する方法および／またはフェニルアラニンのレベルを低減する方法に関する。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の欠損によって引き起こされ、脳に有毒である血液Ｐｈｅレベルの上昇が生じ、その後、処置なしでは重度の精神障害に至る。食事制限による現行の療法は有効であるものの、十代の若者や成人の非遵守が大きな問題となっている。

【0130】

ＰＫＵを処置する努力は、遺伝子療法ベクター由来のヒトＰＡＨの活性が低いことによって妨げられてきた。本発明の方法は、内在性ヒトＰＡＨポリペプチドと比較して改善されたタンパク質安定性および酵素活性を有するバリアントＰＡＨポリペプチドの発見に部分的に基づくものである。本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードするｒＡＡＶベクターを使用する遺伝子療法を介したＰＫＵの処置は、内在性ヒトＰＡＨをコードするベクターと比較して、血液中および脳Ｐｈｅレベルのより良好な低減を導く。さらに、ｈＰＡＨおよびｈＰＡＨ－Ｖ１の両方が、脳へのＴｙｒおよびＴｒｐの移行を改善したが、バリアントＰＡＨで処置した動物のみが、ドーパミンおよびセロトニンを含む脳神経伝達物質レベルを正常にし、Ｐｈｅに関与する機能に対して異なる感受性を示した。

【0131】

一部の実施形態において、本発明は、ＰＫＵを処置するための方法であって、それを必要とする個体に、治療有効量の本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドを投与する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドのＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドのＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６部位において４つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａから選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＳ２５０Ｐを含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、表１～３に提示されるバリアントＰＡＨポリペプチドのいずれか１つである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含み、少なくとも野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活
性をほぼ維持しながら、さらなるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、アミノ酸置換の位置は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＰＡＨポリペプチドに基づく。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、融合ポリペプチドである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、組織標的化ペプチドに融合された融合ポリペプチドである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、肝臓標的化ポリペプチドに融合された融合ポリペプチドである。肝臓標的化ポリペプチドとしては、限定されないが、ヒト肝臓細胞増殖因子の断片（Ｅａｖｒｉ ａｎｄ Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ－Ｇａｌｋｓｋｉ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００７、２８２：２３４０２～２３４０９頁）または肝臓細胞アシアロ糖タンパク質受容体に結合する糖タンパク質（Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１７、２８：２８３～２９５頁）が挙げられる。

【0132】

一部の実施形態において、本発明は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドの有効量を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。バリアントＰＡＨポリペプチドを、目的の特定の組織に投与してもよく、または全身的に投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドの有効量を、非経口的に投与してもよい。非経口投与経路としては、静脈内、腹腔内、骨内、動脈内、脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドの有効量を、１つの投与経路を介して投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドの有効量を、２つ以上の投与経路の組合せを介して投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドの有効量を、１つの場所に投与する。他の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドの有効量を、２つ以上の場所に投与してもよい。

【0133】

一部の実施形態において、本発明は、ＰＫＵを処置するための方法であって、それを必要とする個体に、治療有効量の、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を投与する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態において、核酸は、少なくとも３つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドであって、該アミノ酸置換が、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドのＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドのＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６部位において４つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａから選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９ＰおよびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９ＰおよびＳ２５０Ｐを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換をさらに含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、表１～３に提示されるバリアントＰＡＨポリペプチドのいずれか１つであるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａを含み、少なくとも野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をほぼ維持しながら、さらなるアミノ酸置換を含む、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸によってコードされ
るアミノ酸置換の位置は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＰＡＨポリペプチドに基づく。

【0134】

一部の実施形態において、核酸は、バリアントヒトＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％超を有するバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１の野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％超を有するバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。

【0135】

一部の実施形態において、核酸は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性を維持する短縮化ＰＡＨポリペプチドであるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｎ末端短縮化を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｎ末端調節ドメインの一部または全部の短縮化であるＮ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１～アミノ酸残基約１０２の欠失を含むＮ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｃ末端短縮化を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、四量体化ドメインの一部または全部の短縮化であるＣ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約４２９～４５２の欠失を含むＣ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｎ末端短縮化およびＣ末端短縮化を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、短縮化ＰＡＨポリペプチドは、Ｎ末端調節配列の一部または全部および四量体化ドメインの一部または全部の短縮化を含む。一部の実施形態において、短縮化ＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１～アミノ酸残基約１０２およびアミノ酸残基約４２９～４５２の欠失を含む。一部の実施形態において、核酸は、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約１０２～約４２８に対応するアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１０２～４２８に対応するアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０およびＧ２５６部位に４つのアミノ酸置換をさらに含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａから選択される４つのアミノ酸置換を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、短縮化バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、表１～３に提示されるアミノ酸置換の組合せのいずれか１つをさらに含む。一部の実施形態において、核酸は、野生型ＰＡＨ（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％超を有する短縮化ＰＡＨポリペプチドをコ
ードする。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、組織標的化ペプチドに融合された融合ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドは、肝臓標的化ペプチドに融合された融合ポリペプチドである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。

【0136】

一部の実施形態において、本発明は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、目的の特定の組織に投与してもよく、または全身的に投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を、非経口的に投与してもよい。非経口投与経路としては、静脈内、腹腔内、骨内、動脈内、脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、肝臓を越える組織からのバリアントＰＡＨの発現は、補因子ＢＨ４の存在を必要とし得る（例えば、全身的に送達されるか、または核酸から共発現される）Ｄｉｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００８、１６：６７３～６８１頁。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を、１つの投与経路を介して投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を、２つ以上の投与経路の組合せを介して投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を、１つの場所に投与する。他の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドの有効量を、２つ以上の場所に投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡである。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。

【0137】

本発明の一部の態様において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターによって個体に送達される。遺伝子療法のためのウイルスベクターは、当該技術分野で公知である。一部の態様において、本発明は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードするレンチウイルス粒子の有効量を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードするｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。ｒＡＡＶを、目的の特定の組織に投与してもよく、または全身的に投与してもよい。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、非経口的に投与してもよい。非経口投与経路としては、静脈内、腹腔内、骨内、動脈内、脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、１つの投与経路を介して投与してもよい。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、２つ以上の投与経路の組合せを介して投与してもよい。一部の実施形態においてｒＡＡＶの有効量を、１つの場所に投与する。他の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、２つ以上の場所に投与してもよい。

【0138】

ｒＡＡＶ（一部の実施形態では、粒子の形態の）の有効量を、処置の目的に応じて投与する。例えば、低いパーセンテージの形質導入により所望の治療効果を達成することができる場合、処置の目的は、概して、この形質導入レベルを満たすこと、またはそれを超えることである。一部の事例において、この形質導入レベルは、所望の組織型の標的細胞のわずか約１～５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約２０％、一部の実施形態において、少なくとも約５０％、一部の実施形態において、少なくとも約８０％、一部の実施形態において、少なくとも約９５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成される。ｒＡＡＶ組成物は、同じ処理の間に、または数日間、数週間、数ヶ月間、もしくは数年間間隔を置いて、
１回またはそれ以上の投与によって投与される。本明細書に記載される投与経路のいずれか１つまたはそれ以上を使用し得る。一部の実施形態において、ヒトを処置するために、複数のベクターを使用してもよい。

【0139】

ＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された細胞を同定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、免疫組織化学または増強緑色蛍光タンパク質のようなマーカーを使用して、ウイルス粒子、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むウイルス粒子、の形質導入を検出することができる。

【0140】

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、２つ以上の場所に同時にまたは連続して投与する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、１つの場所に２回以上投与する（例えば、繰り返す）。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間、または２４時間以下の間隔である。

【0141】

一部の実施形態において、本発明は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与することによって、ＰＫＵを有するヒトを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。

【0142】

一部の実施形態において、方法は、ＰＫＵの処置を必要とする個体において、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与して、ＰＫＵを処置することを含む。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１０×１０^１２、１１×１０^１２、１５×１０^１２、２０×１０^１２、２５×１０^１２、３０×１０^１２、または５０×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０^１２～６×１０^１２、６×１０^１２～７×１０^１２、７×１０^１２～８×１０^１２、８×１０^１２～９×１０^１２、９×１０^１２～１０×１０^１２、１０×１０^１２～１１×１０^１２、１１×１０^１２～１５×１０^１２、１５×１０^１２～２０×１０^１２、２０×１０^１２～２５×１０^１２、２５×１０^１２～３０×１０^１２、３０×１０^１２～５０×１０^１２、または５０×１０^１２～１００×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０^１２～１０×１０^１２、１０×１０^１２～２５×１０^１２、または２５×１０^１２～５０×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１０×１０^９、１１×１０^９、１５×１０^９、２０×１０^９、２５×１０^９、３０×１０^９、または５０×１０^９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０^９～６×１０^９、６×１０^９～７×１０^９、７×１０^９～８×１０^９、８×１０^９～９×１０^９、９×１０^９～１０×１０^９、１０×１０^９～１１×１０^９、１１×１０^９～１５×１０^９、１５×１０^９～２０×１０^９、２０×１０^９～２５×１０^９、２５×１０^９～３０×１０^９、３０×１０^９～５０×１０^９、または５０×１０^９～１００×１０^９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０^９～１０×１０^９、１０×１０^９～１５×１０^９、１５×１０^９～２５×１０^９、または２５×１０^９～５０×１０^９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１０×１０^１０、１１×１０^１０、１５×１０^１０、２０×１０^１０
、２５×１０^１０、３０×１０^１０、４０×１０^１０、または５０×１０^１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０^１０～６×１０^１０、６×１０^１０～７×１０^１０、７×１０^１０～８×１０^１０、８×１０^１０～９×１０^１０、９×１０^１０～１０×１０^１０、１０×１０^１０～１１×１０^１０、１１×１０^１０～１５×１０^１０、１５×１０^１０～２０×１０^１０、２０×１０^１０～２５×１０^１０、２５×１０^１０～３０×１０^１０、３０×１０^１０～４０×１０^１０、４０×１０^１０～５０×１０^１０または５０×１０^１０～１００×１０^１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０^１０～１０×１０^１０、１０×１０^１０～１５×１０^１０、１５×１０^１０～２５×１０^１０、または２５×１０^１０～５０×１０^１０感染単位／ｍＬのいずれかである。

【0143】

一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、少なくとも約１×１０^８～約６×１０^１３ゲノムコピー／ｋｇ体重である。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、約１×１０^８～約６×１０^１３ゲノムコピー／ｋｇ体重である。

【0144】

一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、少なくとも約１×１０^９～約１×１０^１４ゲノムコピーである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、約１×１０^９～約１×１０^１４ゲノムコピーである。

【0145】

本発明の組成物（例えば、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子）は、単独で、またはＰＫＵを処置するための１つまたはそれ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用することができる。連続する投与の間の間隔は、少なくとも数分、数時間もしくは数日（または、代替的に、数分、数時間もしくは数日未満）であり得る。

【0146】

ｒＡＡＶ（一部の実施形態では、粒子の形態の）の有効量を、処置の目的に応じて投与する。例えば、低いパーセンテージの形質導入により所望の治療効果を達成することができる場合、処置の目的は、概して、この形質導入レベルを満たすこと、またはそれを超えることである。一部の事例において、この形質導入レベルは、標的細胞のわずか約１～５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約２０％、一部の実施形態において、少なくとも約５０％、一部の実施形態において、少なくとも約８０％、一部の実施形態において、少なくとも約９５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成される。ｒＡＡＶ組成物は、同じ処理の間に、または数日間、数週間、数ヶ月間、もしくは数年間間隔を置いて、１回またはそれ以上の投与によって投与される。一部の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）を処置するために、複数のベクターを使用してもよい。

【0147】

一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、ヒトへの投与のために使用される。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、小児投与のために使用される。理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＫＵの症状の多くは本質的に発達上のもの（例えば、重度の精神障害）であるため、一生のうちのできるだけ早期にＰＫＵを処置することが特に有利であり得る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ（一部の実施形態において、粒子の形態の）の有効量は、生後１ヶ月未満、２ヶ月未満、３ヶ月未満、４ヶ月未満、５ヶ月未満、６ヶ月未満、７ヶ月未満、８ヶ月未満、９ヶ月未満、１０ヶ月未満、１１ヶ月未満、１年未満、１３ヶ月未満、１４ヶ月未満、１５ヶ月未満、１６ヶ月未満、１７ヶ月未満、１８ヶ月未満、１９ヶ月未満、２０ヶ月未満、２１ヶ月未満、２２ヶ月未満、２年未満、または３年未満の患者に投与される。

【0148】

一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、若年成人への投与のために使用される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ（一部の実施形態では、粒子の形態のｒＡＡＶ）の有効量は、１２歳未満、１３歳未満、１４歳未満、１５歳未満、１６歳未満、１７歳未満、１８歳未満、１９歳未満、２０歳未満、２１歳未満、２２歳未満、２３歳未満、２４歳未満、または２５歳未満の患者に投与される。

【0149】

一部の実施形態において、本発明は、ＰＫＵを処置するための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含む細胞の治療有効量を投与する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも３つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドであって、該アミノ酸置換が、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドのＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドのＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６部位において４つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａから選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、アミノ酸置換Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９ＰおよびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９ＰおよびＳ２５０Ｐを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、アミノ酸置換Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換をさらに含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、表１～３に提示されるバリアントＰＡＨポリペプチドのいずれか１つであるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、アミノ酸置換Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａを含み、少なくとも野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をほぼ維持しながら、さらなるアミノ酸置換を含む、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸によってコードされるアミノ酸置換の位置は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒトＰＡＨポリペプチドに基づく。

【0150】

一部の実施形態において、細胞中の核酸は、バリアントヒトＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％超を有するバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１の野生型ＰＡＨのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％超を有するバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。

【0151】

一部の実施形態において、細胞中の核酸は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性を維持する短縮化ＰＡＨポリペプチドであるバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、Ｎ末端短縮化を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、Ｎ末端調節ドメインの一部または全部の短縮化であるＮ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１～アミノ酸残基約１０２の欠失を含むＮ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、Ｃ末端短縮化を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、四量体化ドメインの一部または全部の短縮化であるＣ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約４２９～４５２の欠失を含むＣ末端短縮化をコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、Ｎ末端短縮化およびＣ末端短縮化を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、短縮化ＰＡＨポリペプチドは、Ｎ末端調節配列の一部または全部および四量体化ドメインの一部または全部の短縮化を含む。一部の実施形態において、短縮化ＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１～アミノ酸残基約１０２およびアミノ酸残基約４２９～約４５２の欠失を含む。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基約１０２～約４２８に対応するアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、野生型ＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のアミノ酸残基１０２～４２８に対応するアミノ酸配列を含むバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のＭ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０およびＧ２５６部位に４つのアミノ酸置換をさらに含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａから選択される４つのアミノ酸置換を含む短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、短縮化バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする細胞中の核酸は、表１～３に提示されるアミノ酸置換の組合せのいずれか１つをさらに含む。一部の実施形態において、細胞中の核酸は、野生型ＰＡＨ（例えば、配列番号１のＰＡＨポリペプチド）のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、または１００％超を有する短縮化ＰＡＨポリペプチドをコードする。

【0152】

一部の実施形態において、本発明は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含む細胞の有効量を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含む細胞は、目的の特定の組織に投与してもよく、または全身的に投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を、非経口的に投与してもよい。非経口投与経路としては、静脈内、腹腔内、骨内、動脈内、脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、細胞は、封入されるか、またはデバイス内にある。一部の実施形態において、肝臓外のＰＡＨ発現細胞は、外因的に付加されるかまたは共発現される補因子ＢＨ４を必要とし得る。一部の実施形態において、細胞は、ＢＨ４をさらに含んで封入されるかまたはＢＨ４をさらに含むデバイス内にある。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含む細胞の有効量を、１つの投与経路を介して投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を、２つ以上の投与経路の組合せを介して投与してもよい。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の有効量を、１つの場所に投与する。他の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドの有効量は、２つ以上の場所に投与してもよい。

【0153】

一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸を含む細胞は、肝臓細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、血液細胞、骨髄細胞、幹細胞、または誘導多能性幹細胞である。一部の実施形態において、細胞は、外因的に付加される補因子ＢＨ４および／または共発現される補因子ＢＨ４をさらに含む。

【0154】

一部の実施形態において、細胞は、細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株など）である。一部の実施形態において、本発明は、バリアントＰＡＨポリペプチドを作製するための方法であって、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸（例えば、バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする発現ベクター）を含む細胞を、バリアントＰＡＨポリペプチドを作製する条件下で培養する工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態において、バリアントＰＡＨポリペプチドを作製するための方法は、バリアントＰＡＨポリペプチドを精製する１つまたはそれ以上の工程をさらに含む。

【0155】

ＶＩＩ．キットまたは製造物品
本明細書に記載されるバリアントＰＡＨポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶベクター、粒子、および／または医薬組成物は、例えば、本明細書に記載される本発明の方法の１つで使用するように設計されたキットまたは製造物品内に含まれる。

【0156】

一般に、システムは、カニューレ、１つまたはそれ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、またはそれ以上）のシリンジ、および本発明の方法での使用に好適な１つまたはそれ以上（例えば、１個、２個、３個、４個またはそれ以上）の流体を含む。

【0157】

シリンジは、流体の送達のためにカニューレに接続可能であれば、任意の好適なシリンジであり得る。一部の実施形態において、システムは、１つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、２つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、３つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、４つまたはそれ以上のシリンジを有する。本発明の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載の流体、例えば、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のベクターの有効量をそれぞれ含む１つまたはそれ以上の流体、および１つまたはそれ以上の治療剤を含む１つまたはそれ以上の流体が挙げられる。

【0158】

一部の実施形態において、キットは、単一の流体（例えば、ベクターの有効量を含む医薬的に許容される流体）を含む。一部の実施形態において、キットは、２つの流体を含む。一部の実施形態において、キットは、３つの流体を含む。一部の実施形態において、キットは、４つまたはそれ以上の流体を含む。流体は、本開示のバリアントＰＡＨポリペプチドまたはｒＡＡＶベクター組成物を送達、希釈、安定化、緩衝、またはそれ以外の方法で輸送するために好適な、本明細書に記載されるかもしくは当該技術分野において公知の任意の希釈剤、緩衝剤、賦形剤、または他の液体を含み得る。一部の実施形態において、キットは、１つまたはそれ以上の緩衝液、例えば、ｐＨ緩衝水溶液を含む。緩衝液の例としては、リン酸、クエン酸、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳおよび他の有機酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。

【0159】

一部の実施形態において、キットは、容器を含む。好適な容器としては、例えば、バイアル、バッグ、シリンジ、およびボトルが挙げられる。容器は、ガラス、金属、またはプラスチックなどの材料の１つまたはそれ以上から作製される。一部の実施形態において、容器は、本開示のｒＡＡＶ組成物を保持するために使用される。一部の実施形態において、容器は、流体および／または他の治療剤を保持してもよい。

【0160】

一部の実施形態において、キットは、本開示のｒＡＡＶ組成物と共に追加の治療剤を含
む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、混合される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、別個に保持される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、同じ容器内にある。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、異なる容器内にある。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、同時に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、同じ日に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、追加の治療剤の投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週、３週、４週、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月以内に投与される。

【0161】

一部の実施形態において、キットは、ＡＡＶ投与の前に免疫系を一過的に抑制するための治療剤を含む。一部の実施形態において、患者は、ＡＡＶ粒子に対するＴ細胞の応答を阻害するために、ウイルスの注射の直前および直後に一過的に免疫抑制される（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：１８０～１８８頁、２０１４参照）。一部の実施形態において、キットは、シクロスポリン、マイコフェノール酸モフェチル、および／またはメチルプレドニゾロンをさらに提供する。

【0162】

本発明のｒＡＡＶ粒子および／または組成物を、使用説明書を含むキットにさらにパッケージングしてもよい。一部の実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物の送達（例えば、本明細書に記載される任意の種類の非経口投与）のためのデバイスをさらに含む。一部の実施形態において、使用説明書は、本明細書に記載される方法のうちの１つに係る使用説明書を含む。一部の実施形態において、説明書は、容器と共に（例えば、容器に貼付されて）提供されるラベルに印刷される。一部の実施形態において、使用説明書は、例えば、個体におけるＰＫＵを処置するために、個体（例えば、ヒト）に、ｒＡＡＶ粒子の有効量を投与するための説明書を含む。

【0163】

ＶＩＩＩ．例示的な実施形態
実施形態１．２つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドであって、該アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、前記バリアントＰＡＨポリペプチド。

【0164】

実施形態２．３つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドであって、該アミノ酸置換は、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６から選択される部位にある、前記バリアントＰＡＨポリペプチド。

【0165】

実施形態３．野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｍ１８０、Ｋ１９９、Ｓ２５０、およびＧ２５６の部位に４つのアミノ酸置換を含むバリアントフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチド。

【0166】

実施形態４．アミノ酸置換は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａの１つまたはそれ以上を含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0167】

実施形態５．アミノ酸置換は、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａ；Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＧ２５６Ａ；またはＭ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、およびＳ２５０Ｐを含む、実施形態１～４のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0168】

実施形態６．アミノ酸置換は、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０Ｐ、およびＧ２５６Ａを含む、実施形態１～５のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0169】

実施形態７．Ｈ２６４Ｐ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２７２Ｐ、Ｐ２７５Ｌ、Ｐ２７９Ｑ、Ｇ２７２ＰおよびＰ２７５Ｌ、またはＴ３２３ＲおよびＦ３２７Ｔアミノ酸置換をさらに含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0170】

実施形態８．野生型ヒトＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0171】

実施形態９．ヒトＰＡＨポリペプチドである、実施形態１～８のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0172】

実施形態１０．配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を含む、実施形態１～９のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0173】

実施形態１１．配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0174】

実施形態１２．バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｇ３３Ａ、Ｇ４６Ａ、Ｇ４６Ｐ、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９Ａ、Ｇ１３９Ｐ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、およびＧ４４２Ａから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む、実施形態１～１１のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨ。

【0175】

実施形態１３．バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｐ９Ｇ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１９２Ｒ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ２０６Ｈ、Ｈ２２０Ｒ、Ｑ３３６Ｅ、Ｅ３６０Ｄ、Ｉ３７４Ｃ、Ｎ３７６Ｅ、Ｎ４０１Ｔ、Ｉ４２１Ｖ、Ｉ４４１Ｖ、Ｓ４４６Ｈから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、および４５３位におけるＳの付加をさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨ。

【0176】

実施形態１４．バリアントＰＡＨポリペプチドは、野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｆ２４０Ｗ、Ａ２４６Ｐ、Ｇ２４７Ａ、Ｙ２６８Ｗ、Ｃ２８４Ｆ、Ｔ３２３Ｒ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３１９Ｐ、Ｉ３０６（Ｙ、Ｆ）、Ｋ１１３Ｐ、Ｇ１８８Ａ、Ｆ１９１Ｙ、Ｔ１９３Ｒ、Ｙ２０６Ｈ、Ｇ３３７Ｐ、およびＮ３７６Ｐから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む、実施形態１～１３のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨ。

【0177】

実施形態１５．野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｇ３３Ａ、Ｇ４６Ａ、Ｇ４６Ｐ、Ｇ１０３Ａ、Ｇ１３９Ａ、Ｇ１３９Ｐ、Ｇ１４８Ａ、Ｇ１８８Ａ、Ｇ２１８Ａ、Ｇ２３９Ａ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５７Ａ、Ｇ２７２Ａ、Ｇ２８９Ａ、Ｇ３０７Ａ、Ｇ３１２Ａ、Ｇ３３２Ａ、Ｇ３３７Ａ、Ｇ３４４Ａ、Ｇ３５２Ａ、およびＧ４４２Ａから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、バリアントＰＡＨポリペプチド。

【0178】

実施形態１６．野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｐ９Ｇ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１９２Ｒ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ２０６Ｈ、Ｈ２２０Ｒ、Ｑ３３６Ｅ、Ｅ３６０Ｄ、Ｉ３７４Ｃ、Ｎ３７６Ｅ、Ｎ４０１Ｔ、Ｉ４２１Ｖ、Ｉ４４１Ｖ、Ｓ４４６Ｈから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、および４５３位におけるＳの付加を含む、バリアントＰＡＨポリペプチド。

【0179】

実施形態１７．野生型ヒトＰＡＨポリペプチドの、Ｆ２４０Ｗ、Ａ２４６Ｐ、Ｇ２４７Ａ、Ｙ２６８Ｗ、Ｃ２８４Ｆ、Ｔ３２３Ｒ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３１９Ｐ、Ｉ３０６（Ｙ、Ｆ）、Ｋ１１３Ｐ、Ｇ１８８Ａ、Ｆ１９１Ｙ、Ｔ１９３Ｒ、Ｙ２０６Ｈ、Ｇ３３７Ｐ、およびＮ３７６Ｐから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、バリアントＰＡＨポリペプチド。

【0180】

実施形態１８．Ｎ末端の短縮化を含む、実施形態１～１７のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0181】

実施形態１９．Ｎ末端の短縮化は、Ｎ末端調節ドメインの短縮化を含む、実施形態１８に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0182】

実施形態２０．Ｎ末端の短縮化は、野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基１～１０２の短縮化を含む、実施形態１８または１９に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0183】

実施形態２１．Ｃ末端の短縮化を含む、実施形態１～２０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0184】

実施形態２２．Ｃ末端の短縮化は、四量体化ドメインの短縮化を含む、実施形態２１に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0185】

実施形態２３．Ｃ末端の短縮化は、野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基４２９～４５２の短縮化を含む、実施形態２１または２２に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0186】

実施形態２４．野生型ＰＡＨポリペプチドのアミノ酸残基１０３～４２８に対応するアミノ酸配列を含む、実施形態１～２３のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0187】

実施形態２５．可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するような１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１～２４のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0188】

実施形態２６．可能性のあるプロテアーゼ切断部位を消去するような１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型ＰＡＨポリペプチドの２７０～２９５位および／または３８０～４０５位に配置されている、実施形態２５に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0189】

実施形態２７．肝臓標的化ポリペプチドに融合されている、実施形態１～２６のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0190】

実施形態２８．肝臓標的化ポリペプチドは、ＨＧＦもしくはそのフラグメントまたは肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する糖タンパク質である、実施形態２７に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0191】

実施形態２９．ペグ化および／またはニトロシル化されている、実施形態１～２５のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0192】

実施形態３０．Ｉ３７４Ｃアミノ酸置換を含み、３７４位におけるｃｙｓ残基は、ニトロシル化されている、実施形態２６に記載のバリアントＰＡＨポリペプチド。

【0193】

実施形態３１．実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドを含む組成物。

【0194】

実施形態３２．医薬的に許容される担体をさらに含む、実施形態３１に記載の組成物。

【0195】

実施形態３３．実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸。

【0196】

実施形態３４．バリアントＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態３３に記載の単離された核酸。

【0197】

実施形態３５．プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーター、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、ＬＰ１プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦｌ－アルファ）プロモーター、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、改変されたニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたは配列番号１７、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３－アクチンプロモーターから選択される、実施形態３４に記載の単離された核酸。

【0198】

実施形態３６．プロモーターは、ＬＰ１プロモーターまたはｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、実施形態３４または３５に記載の単離された核酸。

【0199】

実施形態３７．ポリアデニル化シグナルをさらに含む、実施形態３３～３６のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【0200】

実施形態３８．ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫ ｐＡである、実施形態３７に記載の単離された核酸。

【0201】

実施形態３９．イントロンをさらに含む、実施形態３３～３８のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【0202】

実施形態４０．イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、実施形態３９に記載の単離された核酸。

【0203】

実施形態４１．イントロンは、配列番号１５の改変されたニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、実施形態３９に記載の単離された核酸。

【0204】

実施形態４２．１つまたはそれ以上のＩＴＲをさらに含む、実施形態３３～４１のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【0205】

実施形態４３．スタッファー核酸をさらに含む、実施形態３３～４２のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【0206】

実施形態４４．スタッファー核酸は、ＡＴＧ配列が除去されるように最適化されている、実施形態４３に記載の単離された核酸。

【0207】

実施形態４５．スタッファー核酸は、配列番号１６のＡ１ＡＴイントロンスタッファー配列である、実施形態４４に記載の単離された核酸。

【0208】

実施形態４６．コドン最適化されている、ヒトＰＡＨポリペプチドをコードする単離された核酸。

【0209】

実施形態４７．核酸配列は、配列番号１４の核酸配列に少なくとも８０％同一である、実施形態４６に記載の単離された核酸。

【0210】

実施形態４８．配列番号１４の核酸配列を含む、実施形態４６に記載の単離された核酸。

【0211】

実施形態４９．ｍＲＮＡである、実施形態３３に記載の単離された核酸。

【0212】

実施形態５０．実施形態３３～４９のいずれか１項に記載の核酸を含む組成物。

【0213】

実施形態５１．医薬的に許容される担体をさらに含む、実施形態５０に記載の組成物。

【0214】

実施形態５２．実施形態３３～４９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。

【0215】

実施形態５３．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、実施形態５２に記載のベクター。

【0216】

実施形態５４．１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した実施形態３３～４１または４３～４９のいずれか１項に記載の核酸を含むｒＡＡＶベクター。

【0217】

実施形態５５．実施形態３３～４８のいずれか１項に記載の核酸は、２つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している、実施形態５４に記載のｒＡＡＶベクター。

【0218】

実施形態５６．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、実施形態５４または５５に記載のｒＡＡＶベクター。

【0219】

実施形態５７．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、実施形態５４～５６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0220】

実施形態５８．５’から３’に、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、イントロン、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸、スタッファー核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、実施形態５７に記載のｒＡＡＶベクター。

【0221】

実施形態５９．プロモーターは、ｍ１Ａ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターまたは
ＬＰ１プロモーターである、実施形態５８に記載のｒＡＡＶベクター。

【0222】

実施形態６０．イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、実施形態５８または５９に記載のｒＡＡＶベクター。

【0223】

実施形態６１．ＰＡＨポリペプチドは、実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドである、実施形態５８～５９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0224】

実施形態６２．ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸は、実施形態４６～４８のいずれか１項に記載のコドン最適化された核酸である、実施形態５８～６０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0225】

実施形態６３．スタッファー核酸は、ヒトアルファ１抗トリプシン遺伝子のイントロン由来の核酸を含む、実施形態５８～６２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0226】

実施形態６４．ヒトアルファ１抗トリプシン遺伝子のイントロンは、ＡＴＧ配列が除去されるように突然変異されている、実施形態６３に記載のｒＡＡＶベクター。

【0227】

実施形態６５．ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、実施形態５８～６４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0228】

実施形態６６．自己相補性ベクターである、実施形態５３～６５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0229】

実施形態６７．ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる、実施形態６６に記載のｒＡＡＶベクター。

【0230】

実施形態６８．第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、該突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、実施形態６７に記載のｒＡＡＶベクター。

【0231】

実施形態６９．実施形態５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子。

【0232】

実施形態７０．ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型のカプシドを含む、実施形態６９に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0233】

実施形態７１．ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む、実施形態６９に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0234】

実施形態７２．操作されたＡＡＶカプシドは、ＤＪカプシドまたはＬＫ０３カプシドである、実施形態７１に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0235】

実施形態７３．ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、同じＡＡＶ血清型由来である、実施形態６９または７０に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0236】

実施形態７４．ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、異なるＡＡＶ血清型由来である、実施形態６９または７０に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0237】

実施形態７５．ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８カプシドを含む、実施形態６９～７０または７３～７４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0238】

実施形態７６．ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８カプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む、実施形態７４に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0239】

実施形態７７．実施形態６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。

【0240】

実施形態７８．医薬的に許容される担体をさらに含む、実施形態７７に記載の組成物。

【0241】

実施形態７９．実施形態３３～４９のいずれか１項に記載の核酸または請求項５２もしくは５３に記載のベクターまたは実施形態５４～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む細胞。

【0242】

実施形態８０．バリアントＰＡＨポリペプチドを生産する方法であって、実施形態７９に記載の細胞を、バリアントＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で培養することを含む、前記方法。

【0243】

実施形態８１．バリアントＰＡＨポリペプチドを精製する工程をさらに含む、実施形態８０に記載の方法。

【0244】

実施形態８２．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドまたは実施形態３１もしくは３２に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【0245】

実施形態８３．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸または実施形態３３、３４または４９に記載の核酸を個体に投与することを含む、前記方法。

【0246】

実施形態８４．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、前記方法。

【0247】

実施形態８５．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。

【0248】

実施形態８６．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態３１、３２、５０、５１、７７または７８に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【0249】

実施形態８７．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態７９に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。

【0250】

実施形態８８．個体は、ＰＡＨ活性を欠如している、実施形態８２～８７のいずれか１項に記載の方法。

【0251】

実施形態８９．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドまたは請求項３１もしくは３２に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【0252】

実施形態９０．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする核酸または実施形態３３、３４または４９に記載の核酸を個体に投与することを含む、前記方法。

【0253】

実施形態９１．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、前記方法。

【0254】

実施形態９２．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。

【0255】

実施形態９３．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態３１、３２、５０、５１、７７または７８に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【0256】

実施形態９４．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態７９に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。

【0257】

実施形態９５．処置の前における個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、同等の対応する対照個体の血液中のフェニルアラニンのレベルと比較して上昇している、実施形態８９～９４のいずれか１項に記載の方法。

【0258】

実施形態９６．バリアントＰＡＨポリペプチド、核酸、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、組成物または細胞は、静脈内、動脈内、肝内、門脈内、腹腔内、または皮下に投与される、実施形態８２～９５のいずれか１項に記載の方法。

【0259】

実施形態９７．投与は、別の療法と組み合わされる、実施形態８２～９６のいずれか１項に記載の方法。

【0260】

実施形態９８．別の療法は、テトラヒドロビオプテリンでの処置、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）もしくはペグ化ＰＡＬでの処置、またはフェニルアラニンが制限された食事である、実施形態９７に記載の方法。

【0261】

実施形態９９．ＰＡＨポリペプチドを作製するための方法であって、実施形態７９に記載の細胞を、ＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で培養することを含む、前記方法。

【0262】

実施形態１００．ＰＡＨポリペプチドを精製することをさらに含む、実施形態９９に記載の方法。

【0263】

実施形態１０１．実施形態１～２４のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドを含むキット。

【0264】

実施形態１０２．実施形態３３～４６のいずれか１項に記載の核酸、実施形態５３～６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、実施形態６９～７６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子、または実施形態７７もしくは７８に記載の組成物を含むキット。

【0265】

実施形態１０３．使用説明書；緩衝液および／もしくは医薬的に許容される賦形剤；ならびに／またはボトル、バイアルおよび／もしくはシリンジをさらに含む、実施形態１０１または１０２に記載のキット。

【0266】

実施形態１０４．肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該エンハンサーは、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含む、前記発現カセット。

【0267】

実施形態１０５．ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、実施形態１０４に記載の発現カセット。

【0268】

実施形態１０６．エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、実施形態１０４または１０５に記載の発現カセット。

【0269】

実施形態１０７．肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該３’エレメントは、ヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはアルブミン３’エレメントである、前記発現カセット。

【0270】

実施形態１０８．ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、実施形態１０７に記載の発現カセット。

【0271】

実施形態１０９．３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている、実施形態１０７または１０８に記載の発現カセット。

【0272】

実施形態１１０．肝臓細胞において導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該エンハンサーは、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み；該３’エレメントは、ヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはアルブミン３
’エレメントである、前記発現カセット。

【0273】

実施形態１１１．ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、実施形態１１０に記載の発現カセット。

【0274】

実施形態１１２．エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、実施形態１１０または１１１に記載の発現カセット。

【0275】

実施形態１１３．３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている、実施形態１１０～１１２のいずれか１項に記載の発現カセット。

【0276】

実施形態１１４．イントロンをさらに含む、実施形態１０４～１１３のいずれか１項に記載の発現カセット。

【0277】

実施形態１１５．イントロンは、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、実施形態１１４に記載の発現カセット。

【0278】

実施形態１１６．ポリアデニル化シグナルをさらに含む、実施形態１０４～１１５のいずれか１項に記載の発現カセット。

【0279】

実施形態１１７．ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、実施形態１１６に記載の発現カセット。

【0280】

実施形態１１８．導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドまたはバリアントＰＡＨポリペプチドをコードする、実施形態１０４～１１７のいずれか１項に記載の発現カセット。

【0281】

実施形態１１９．バリアントＰＡＨポリペプチドは、実施形態１～３０のいずれか１項に記載のバリアントＰＡＨポリペプチドである、実施形態１１８に記載の発現カセット。

【0282】

実施形態１２０．実施形態１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。

【0283】

実施形態１２１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、実施形態１２０に記載のベクター。

【0284】

実施形態１２２．１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した実施形態１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むｒＡＡＶベクター。

【0285】

実施形態１２３．実施形態１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットは、２つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している、実施形態１２２に記載のｒＡＡＶベクター。

【0286】

実施形態１２４．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、実施形態１２２または１２３に記載のｒＡＡＶベクター。

【0287】

実施形態１２５．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、実施形態１２２～１２４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0288】

実施形態１２６．自己相補性ベクターである、実施形態１２２～１２５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。

【0289】

実施形態１２７．ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる、実施形態１２６に記載のｒＡＡＶベクター。

【0290】

実施形態１２８．第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、該突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、実施形態１２７に記載のｒＡＡＶベクター。

【0291】

実施形態１２９．実施形態１２２～１２７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子。

【0292】

実施形態１３０．ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２
Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型のカプシドを含む、実施形態１２９に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0293】

実施形態１３１．ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む、実施形態１３０に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0294】

実施形態１３２．操作されたＡＡＶカプシドは、ＤＪカプシドまたはＬＫ０３カプシドである、実施形態１３１に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0295】

実施形態１３３．ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、同じＡＡＶ血清型由来である、実施形態１３１または１３２に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0296】

実施形態１３４．ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびカプシドは、異なるＡＡＶ血清型由来である、実施形態１３１または１３２に記載のｒＡＡＶ粒子。

【0297】

実施形態１３５．実施形態１２９～１３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。

【0298】

実施形態１３６．医薬的に許容される担体をさらに含む、実施形態１３５に記載の組成物。

【0299】

実施形態１３７．実施形態１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットまたは実施形態１２０～１２８のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。

【0300】

実施形態１３８．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットを個体に投与することを含む、前記方法。

【0301】

実施形態１３９．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための
方法であって、実施形態１２２～１２８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、前記方法。

【0302】

実施形態１４０．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態１２９～１３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。

【0303】

実施形態１４１．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態１３５または１３６に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【0304】

実施形態１４２．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態１３７に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。

【0305】

実施形態１４３．個体は、ＰＡＨ活性を欠如している、実施形態１３８～１４２のいずれか１項に記載の方法。

【0306】

実施形態１４４．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセットを個体に投与することを含む、前記方法。

【0307】

実施形態１４５．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１２２～１２８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを個体に投与することを含む、前記方法。

【0308】

実施形態１４６．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１２９～１３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。

【0309】

実施形態１４７．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１３５または１３６に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【0310】

実施形態１４８．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１３７に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。

【0311】

実施形態１４９．処置の前における個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、同等の対応する対照個体の血液中のフェニルアラニンのレベルと比較して上昇している、実施形態１４４～１４８のいずれか１項に記載の方法。

【0312】

実施形態１５０．核酸、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、組成物または細胞は、静脈内、動脈内、肝内、門脈内、腹腔内、または皮下に投与される、実施形態１３８～１４９のいずれか１項に記載の方法。

【0313】

実施形態１５１．投与は、別の療法と組み合わされる、実施形態１３８～１５０のいずれか１項に記載の方法。

【0314】

実施形態１５２．別の療法は、テトラヒドロビオプテリンでの処置、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）もしくはペグ化ＰＡＬでの処置、またはフェニルアラニン
が制限された食事である、実施形態１５１に記載の方法。

【0315】

実施形態１５３．実施形態１０４～１１９のいずれか１項に記載の発現カセット、実施形態１２２～１２８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター、実施形態１２９～１３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子、または実施形態１３５もしくは１３６に記載の組成物を含むキット。

【0316】

実施形態１５４．使用説明書；緩衝液および／もしくは医薬的に許容される賦形剤；ならびに／またはボトル、バイアルおよび／もしくはシリンジをさらに含む、実施形態１５３に記載のキット。

【実施例0317】

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は例示目的にすぎないこと、ならびに様々な修正または変更が、本明細書に記載される実施例および実施形態に照らして当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の実施形態の範囲内に含まれることが理解される。

【実施例0318】

肝臓特異的発現カセットの生成
以下の研究は、個体の肝臓における導入遺伝子の発現のための強発現コンストラクトを開発するために実施した。

【0319】

実施例１～３の材料および方法
ＰＡＨ発現カセットおよびｒＡＡＶベクターの構築
肝臓プロモーターの強さを増加させるために、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター、内在性ｍＴＴＲエンハンサー、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｐＡ）部位を含有するプラスミドｍＴＴＲ４８２－ＨＩ－ｈＦＶＩＩＩ－ＢＧＨｐＡを使用して、追加の改変が行われた（Ｋｙｏｓｔｉｏ－Ｍｏｏｒｅ ２０１６、Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）。このプラスミドでは、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするｃＤＮＡに置き換え、既存のイントロンを１０６９ｂｐのニワトリｂ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンに置き換えた。様々な肝臓エンハンサー配列が、ｍＴＴＲ４８２エンハンサーの上流にクローニングされた。これらには、改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｍＰｒＴ２、２コピー）、改変されたアルファ１－マイクロビクニン（ｍＡ１ＭＢ２、２コピー）（ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ２００６、Ｊａｃｏｂｓ ２００８）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）（Ｋｒａｍｅｒ ２００３）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（Ｅ１１）（Ｋｒａｍｅｒ ２００３）、およびＣＲＭ８（Ｃｈｕａｈ ２０１４）が含まれた。さらに、２つの３’エレメント、すなわち、アルブミン（Ａｌｂ３’）（Ｗｏｏｄｄｅｌｌ ２００８）およびアルブミンプラスヒトＡ１ＡＴ１ ＳＭＡＲエレメント（ＡＦ１５６５４２）（Ａｌｂ３’／ＳＭＡＲ）を試験し、ＢＧＨ ｐＡの下流でクローニングした（図１Ａ）。一部のエンハンサーにおける改変は、以前にｍＴＴＲ４８２に対して行われたものと同様に（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７；補遺１）、肝臓核因子（ＨＮＦ）３および４結合部位を親和性のより高い配列に変更することから構成された。

【0320】

ヒトまたはマウスＰＡＨプラスミド発現カセットを生成するために、完全長ＰＡＨ（アミノ酸１～４５２）をコードする対応するｃＤＮＡが３つの発現プラスミドにクローニングされた。これらのプラスミドは、肝臓特異的（ＬＰ１；Ｎａｔｈｗａｎｉ ２０１１）
、Ａ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２またはＣＢＡプロモーター、ハイブリッドイントロンおよびｐＡ配列（ＢＧＨまたはサルウイルス４０［ＳＶ４０］ｐＡ）（Ｎａｔｈｗａｎｉ ２０１１、Ｋｙｏｓｔｉｏ－Ｍｏｏｒｅ ２０１６）を含んだ。全ての発現プラスミドは、隣接したＡＡＶ２ ＩＴＲを含んだ。ｍＴＴＲ４８２（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）を、ｈＰＡＨをコードする様々なｃＤＮＡを評価するための骨格として使用した。ＤＮＡ２．０、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＧＡ）またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＧＳ）からのアルゴリズムおよびＣｐＧ含有量の減少と組み合わせたＧＳアルゴリズムによって、４つのコドン最適化ｃＤＮＡを生成した。各発現プラスミドにおいて、検出および定量化を目的として、ＰＡＨタンパク質にＮ末端２２アミノ酸３×ＦＬＡＧペプチド（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１８）でタグ付けした。

【0321】

肝臓プロモーター、ハイブリッドイントロン、ＰＡＨ ｃＤＮＡ、およびＢＧＨｐＡを有する、選択されたＡＡＶ２ ＩＴＲ含有プラスミドを、ｒＡＡＶベクター作製のために使用した。ＡＡＶ８血清型カプシドを有するｒＡＡＶベクターを、トリプルトランスフェクション法、続いてＣｓＣｌ２精製（Ｕｎｉｖ． Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｒｅ）を使用して生成した。ベクターロットを、ＢＧＨｐＡに対するｑＰＣＲによって定量した（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）。

【0322】

インビトロ細胞培養
全ての組織培養試薬は、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。一過性トランスフェクションのために、ヒト２９３またはヒト肝臓癌細胞（Ｈｕｈ７またはＨｅｐＧ２）（８×１０^５細胞／ウェル）を、高グルコース、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０ｍＬ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１０ユニット／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、６ウェルディッシュに播種した。プラスミド（２μｇ）をリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。細胞溶解物または培養培地を、ＰＡＨ分析またはＳＥＡＰ活性のために、それぞれ４８時間後または７２時間後に収集した。

【0323】

ＳＥＡＰ活性の定量
条件培地または血清を回収し、試料を６５℃で３０分間加熱して、内在性アルカリホスファターゼを不活化した。ＳＥＡＰ活性をアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）－ＳＬ試薬（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定し、試料を１０分間～２時間インキュベートし、続いて４０５ｎｍで吸光度を読み取った。ヒトアルカリホスファターゼＨＰＡＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を標準として使用した。ＳＥＡＰ活性は、試料の値を換算係数０．１０３ｍＵ／ｎｇで割ることによってｕｇ／ｍｌとして表した。

【0324】

ＰＡＨタンパク質および活性の定量
溶解緩衝液またはＲＩＰＡ緩衝液中の細胞を溶解することによって４８時間後に全細胞溶解物を生成した。加えて、一部の実験において、超音波処理または剪断を用いて細胞溶解を増強した。解凍したら、溶解物を１４，０００ｇで３０分間スピンしてからアッセイした。ＦＬＡＧ融合タンパク質レベルの定量を、製造業者の説明書に従ってＦＬＡＧ ＥＬＩＳＡ（ＳＥ００２－ｆｌａｇ；ＡＢＳｂｉｏ）により測定し、キット標準または自家精製３×ＦＬＡＧ－ｍＰＡＨ－ＦＬのいずれかをタンパク質標準として使用した。インビボ試料は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定された総タンパク質含有量によって正規化した。ＰＡＨタンパク質の酵素活性は、Ｙｅｗら、２０１３において先に記載されているように、但しいくつかの軽微な変更を加えて、測定した。ＰＡＨ検出のためのウェスタンブロッティングを、抗ｈＰＡＨ抗体（ＬＳ－Ｃ３４４１４５；ＬＳＢｉｏ）または抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆ１８０４；Ｓｉｇｍａ）を使用して、標準的なプロトコルを用いて行った。

【0325】

インビボ試験
ＢＴＢＲ－ＰＡＨ^ｅｎｕ２／ＪマウスのコロニーをＴａｃｏｎｉｃ（ＭｃＤｏｎａｌｄ
１９９６）で維持した。ホモ接合（ＨＯＭ）およびヘテロ接合（ＨＥＴ）雄マウスを８～１２週齢で得て、動物の管理および使用に関する人道的指針（ｈｕｍａｎｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ）に従って収容および維持した。ＳＥＡＰ発現プラスミド分析のために、滅菌生理食塩水中のプラスミド（１０μｇ／匹）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に、被験試料当たり少なくともｎ＝８で、流体力学的高体積注射によって投与した。組換えＡＡＶ８ベクターを、尾静脈を介して静脈内経路によって投与した（６～１０匹／処置）。ほとんどの研究において、動物を８～１０週間後にイソフルラン麻酔によって屠殺した。全血を、後眼窩洞よりＥＤＴＡ採取チューブに回収し、スピンし、分析まで凍結保存した。一部の動物は、左心室をＰＢＳで灌流した後、組織回収を行った。肝臓試料を回収し、分析まで凍結した。脳の分析のために、全脳を、頭蓋骨から収集し、秤量し、矢状に切断し、分析まで－８０℃で凍結した。

【0326】

血液および組織分析
血漿ＰｈｅおよびＴｙｒレベルは、ＡＰＩ４０００トリプル四重極型質量分析計（ＡＢ
ＳＣＩＥＸ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ）にハイフンで繋いだ（ｈｙｐｈｅｎａｔｅｄ）Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ）を備えたＴｒａｎｓｃｅｎｄ ＩＩ ＬＸ４多重システムを使用して、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。Ｌ－ＰｈｅおよびＬ－Ｔｙｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ＵＳＡ）を用いて標準溶液を調製し、標識されたＬ－Ｐｈｅ－１３Ｃ９、１５Ｎおよび標識されたＬ－Ｔｙｒ－１３Ｃ９、１５Ｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を内部標準として使用した。ＭＳ／ＭＳ検出は、ポジティブイオンモードで実施した。分析は、勾配分離を伴うＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×３０ｍｍ）を使用して行った。勾配分離は、１０秒間の９８％移動相Ａ（水中０．１％ギ酸）の保持、続いて３０秒間の２～４５％移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸）勾配、１５秒間の７５％Ｂへの増加、１０秒間の７５％Ｂでの洗浄、および１分間の０．５ｍＬ／分の流速で９８％Ａでの再平衡を含んだ。ＭＳ／ＭＳトランジションは、Ｐｈｅについては１６６．１／１２０．１、Ｔｙｒについては１８２．１／１３６．１、標識Ｐｈｅについては１７６．１／１２９．１、および標識Ｔｙｒについては１９２．１／１４５．１であった。

【0327】

脳神経伝達物質の定量のために、Ｋａｎｋａａｎｐａａ ２００１に記載されるように、但し軽微な変更を加えて、脳を処理した。簡潔に述べると、矢状に切断されたＰＢＳ灌流脳の半分を、氷冷溶解緩衝液（１ｍＭシュウ酸、３ｍＭシステイン、０．１Ｍ酢酸）中で、Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ ２４（Ｏｍｎｉ）と共に、４℃で２０秒間、４．８５ｍ／秒でホモジナイズした。試料を１４Ｋで１０分間スピンし、その後、上清を凍結した。次いで、脳ホモジネート（２００ｍｇ／ｍＬ）を、ＡＰＩ５０００トリプル四重極型質量分析計（ＡＢ ＳＣＩＥＸ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ）にハイフンで繋いだＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ ＵＳＡ）を使用して、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、Ｌ－ドーパ、ドーパミン、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、セロトニン、５－ヒドロキシトリプトファン（５－ＨＴＰ）、５－ヒドロキシインドール酢酸（５－ＨＩＡＡ）およびノルエピネフリンレベルについて定量した。神経伝達物質の安定性を高めるために、試料希釈緩衝液として、０．１％ギ酸（ＦＡ）およびアセトニトリル中の３００ｎｇ／ｍＬシステインを使用した。各分析物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の標準および標準液については、上記の通りに試料と同様に調製した。ＭＳ／ＭＳ検出はポジティブイオンモードで実施した（ＨＶＡはネガティブイオンモードで検出した）。分析は、勾配分離を伴うＡｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢ（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）を使用して行った。勾配分離は、０．５分間の
９８％移動相Ａ（水中０．１％ＦＡ）の保持、続いて３．５分間の２～４０％移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％ＦＡ）勾配、０．１分間の９５％Ｂへの増加、０．５分間の９５％Ｂでの洗浄、および２．４分間の０．５ｍＬ／分の流速で９８％Ａでの再平衡を含んだ。ポジティブイオンＭＳ／ＭＳトランジションは、Ｌ－ドーパについては１９８／１５２、セロトニンについては１７７／１６０．１、ドーパミンについては１５４／１３７．１、５－ＨＩＡＡについては１９２／１４６、ノルエピネフリンについては１７０．１／１０７、５－ＨＴＰについては２２１．１／２０１であった。ＨＶＡ検出は、勾配の初期相保持を除いたこと以外は、上述した方法と同様に、ネガティブイオンモードで実施した。ネガティブイオンモードでのＨＶＡについてのＭＳ／ＭＳトランジションは、１８１．１／１３７．１であった。レベルは、μｇ／ｍＬホモジネートまたはｕＭで表した。脳ＰｈｅおよびＴｙｒレベルは、上記セクションで記載した通りに定量した。

【0328】

肝臓試料について、ベクターゲノム、ＰＡＨ活性およびタンパク質レベルを定量した。ベクターゲノムのコピーは、ｑＰＣＲによって定量した（Ｍａｒｔｉｎ ２０１３）。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質の定量は、以下のように行った。肝臓試料を、ビーズ（１５－３４０－１５３；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えるチューブ内で、１×プロテアーゼ阻害剤を含む１×ＰＢＳまたはＲＩＰＡ緩衝液中で、ホモジナイザー（Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ２４；Ｏｍｎｉ）において４℃で２０～３０秒間、５．６５ｒｐｍにてホモジナイズした。試料を、４℃で３０分間、１４，０００ｇでスピンした。次いで、上清を使用して、ＦＬＡＧ ＥＬＩＳＡアッセイによるＰＡＨ定量を行い、総タンパク質によって正規化した（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅ）。肝臓ホモジネートにおけるＰＡＨタンパク質活性は、上記の通りに行った。

【0329】

結果
マウストランスチレチンコアプロモーターならびにＨＮＦ－３および－４結合部位に改変を有するその５’エンハンサーエレメントを含有する肝臓ｍＴＴＲ４８２プロモーターは、以前に記載されていた（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１６）。本研究の目的は、プロモーターの強度をさらに高めることであった。このプロモーターの上流にある様々な肝臓ベースのエンハンサーまたはＢＧＨ ｐＡの下流にある３’安定性エレメントを発現カセットに加え、次いで、インビトロで２つのヒト肝臓株におけるレポーターとして分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レベルを測定した（図１Ａ）。Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２細胞へのＳＥＡＰプラスミドの一過性トランスフェクションは、ｍＡ１ＭＢ２エンハンサー（＃３）を有する発現カセットが、培養培地において最も高いＳＥＡＰレベルをもたらし、両方の細胞株で、親のｍＴＴＲ４８２コンストラクトよりもおよそ２倍高かったことを示した（図１Ｂ、１Ｃ）。正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの流体力学的注射によるプレウイルスプラスミドのインビボ評価も、ｍＡ１ＭＢ２エンハンサーを含有するプラスミドによる最も高くかつ最も持続的なＳＥＡＰ発現を示した。ＳＥＡＰレベルは、１日目、７日目、１４日目、および２８日目において、親ｍＴＴＲ４８２－ＳＥＡＰプラスミドで処置した動物において検出されたレベルよりも、それぞれ、２．８倍、４．４倍、４倍、および３．６倍高かった（図２Ａ）。ＰＡＨ^ｅｎｕ２マウスにおいて、ｍＡ１ＭＢ２エンハンサー有りまたは無しのｍＴＴＲ４８２プレウイルスプラスミドを評価した（図２Ｂ）。ｍＡ１ＭＢ２エンハンサー含有プラスミドは、親のｍＴＴＲ４８２コンストラクトを用いて得られたレベルよりも一貫して２倍高い血漿ＳＥＡＰレベルを生じた。ＳＥＡＰは２８日間の研究を通して安定的に分泌されたが、ＰＫＵマウスにおけるＳＥＡＰレベルは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでこれらのプラスミドを用いて得られたレベルよりも、およそ１０倍低かった。このデータに基づき、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターを肝臓プロモーター候補として選択した。