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▶ サイバス オイローペ ベスローテン ヴェンノーツハップの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024123140
(43)【公開日】2024-09-10
(54)【発明の名称】遺伝子編集に基づく低フィトエストロゲンダイズ
(51)【国際特許分類】
A01H 6/54 20180101AFI20240903BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240903BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20240903BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240903BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20240903BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20240903BHJP
【ＦＩ】
A01H6/54 ZNA
C12N15/09 100
A01H1/00 A
C12N5/10
A01H5/10
A01H5/00 A
A01H6/54
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024099369
(22)【出願日】2024-06-20
(62)【分割の表示】P 2022517403の分割
【原出願日】2020-09-18
(31)【優先権主張番号】62/903,484
(32)【優先日】2019-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】511276161
【氏名又は名称】サイバス オイローペ ベスローテン ヴェンノーツハップ
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】プレスネイル， ジム
(72)【発明者】
【氏名】デモレスト， ザック
(72)【発明者】
【氏名】シャン， チウェイ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】対応する改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有する遺伝子編集ダイズ植物、植物部分、および植物細胞、ならびにそれらの生産の方法を提供する。
【解決手段】例えば、Ｍｙｂ２９遺伝子のコード領域、ＩＦＳ２プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ１プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ２遺伝子のコード領域、ＩＦＳ１遺伝子のコード領域、またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上の変異を導入することは、標的化ゲノム修飾を介して遺伝子編集植物、植物部分または植物細胞を生産するために使用される。
【選択図】図２
【解決手段】例えば、Ｍｙｂ２９遺伝子のコード領域、ＩＦＳ２プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ１プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ２遺伝子のコード領域、ＩＦＳ１遺伝子のコード領域、またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上の変異を導入することは、標的化ゲノム修飾を介して遺伝子編集植物、植物部分または植物細胞を生産するために使用される。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞と比較して低減したイソフラ
ボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記ダイズ植物、
植物部分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のコード
領域において１つ以上の変異を含み、前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記改変
されていないダイズ植物におけるＩＦＳ１またはＩＦＳ２遺伝子発現と比較して、前記１
つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子の低減した発現によって特徴付けられる、
ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
ボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記ダイズ植物、
植物部分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のコード
領域において１つ以上の変異を含み、前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記改変
されていないダイズ植物におけるＩＦＳ１またはＩＦＳ２遺伝子発現と比較して、前記１
つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子の低減した発現によって特徴付けられる、
ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
【請求項2】
改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞と比較して低減したイソフラ
ボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記ダイズ植物、
植物部分、または植物細胞が、Ｍｙｂ２９遺伝子のコード領域における変異のコード領域
において１つ以上の変異を含み、前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記改変され
ていないダイズ植物におけるＩＦＳ１またはＩＦＳ２遺伝子発現と比較して、１つまたは
両方のＩＦＳ２遺伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減した発現によって特徴付けられる、ダ
イズ植物、植物部分、または植物細胞。
ボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記ダイズ植物、
植物部分、または植物細胞が、Ｍｙｂ２９遺伝子のコード領域における変異のコード領域
において１つ以上の変異を含み、前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記改変され
ていないダイズ植物におけるＩＦＳ１またはＩＦＳ２遺伝子発現と比較して、１つまたは
両方のＩＦＳ２遺伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減した発現によって特徴付けられる、ダ
イズ植物、植物部分、または植物細胞。
【請求項3】
改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞と比較して低減したイソフラ
ボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記ダイズ植物、
植物部分、または植物細胞が、ＩＦＳ１プロモーターまたはＩＦＳ２プロモーターのＭＹ
ＢＣＯＲＥ結合モチーフのコード領域において１つ以上の変異を含み、前記植物、植物部
分、または植物細胞が、前記改変されていないダイズ植物におけるＩＦＳ１またはＩＦＳ
２遺伝子発現と比較して、１つまたは両方のＩＦＳ２遺伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減
した発現によって特徴付けられる、前記ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
ボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記ダイズ植物、
植物部分、または植物細胞が、ＩＦＳ１プロモーターまたはＩＦＳ２プロモーターのＭＹ
ＢＣＯＲＥ結合モチーフのコード領域において１つ以上の変異を含み、前記植物、植物部
分、または植物細胞が、前記改変されていないダイズ植物におけるＩＦＳ１またはＩＦＳ
２遺伝子発現と比較して、１つまたは両方のＩＦＳ２遺伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減
した発現によって特徴付けられる、前記ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
【請求項4】
前記１つ以上の変異が、レアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレ
アーゼを使用する標的化ゲノム修飾を使用して導入される、請求項１～３のいずれか一項
に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
アーゼを使用する標的化ゲノム修飾を使用して導入される、請求項１～３のいずれか一項
に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
【請求項5】
前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレア
ーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項４に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
ーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項４に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
【請求項6】
前記変異が、配列番号１または配列番号２内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含
むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１に記載のダイズ植物、植物部分、または植
物細胞。
むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１に記載のダイズ植物、植物部分、または植
物細胞。
【請求項7】
前記変異が、配列番号３または配列番号４内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含
むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項３に記載のダイズ植物、植物部分、または植
物細胞。
むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項３に記載のダイズ植物、植物部分、または植
物細胞。
【請求項8】
前記変異が、配列番号５内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使
用して導入される、請求項２に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
用して導入される、請求項２に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
【請求項9】
前記変異が、配列番号６～３５のうちの１つ以上に結合するＴＡＬエフェクターを含む
ＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１～３のいずれか一項に記載のダイズ植物、植
物部分、または植物細胞。
ＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１～３のいずれか一項に記載のダイズ植物、植
物部分、または植物細胞。
【請求項10】
前記植物、植物部分、または植物細胞が、導入遺伝子を含まない、請求項１～９のいず
れか一項に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
れか一項に記載のダイズ植物、植物部分、または植物細胞。
【請求項11】
前記植物部分が、種子である、先行請求項のいずれか一項に記載のダイズ植物、植物部
分、または植物細胞。
分、または植物細胞。
【請求項12】
前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記改変されていないダイズ植物、植物部分
、または植物細胞中のイソフラボンの含有量と比較して、約１０％、約２０％、約３０％
、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減するイソフラボンの前
記含有量を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のダイズ植物、植物部分、また
は植物細胞。
、または植物細胞中のイソフラボンの含有量と比較して、約１０％、約２０％、約３０％
、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減するイソフラボンの前
記含有量を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のダイズ植物、植物部分、また
は植物細胞。
【請求項13】
標的化ゲノム修飾を使用して、改変されていない植物、植物部分、または植物細胞と比
較してイソフラボンの減少した含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞を
生産するための方法であって、前記ダイズ植物、植物部分または植物細胞のＭｙｂ２９遺
伝子のコード領域、ＩＦＳ２プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ１プロ
モーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ２遺伝子のコード領域、ＩＦＳ１遺伝子
のコード領域、またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上の変異を導入することを含む
、方法。
較してイソフラボンの減少した含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞を
生産するための方法であって、前記ダイズ植物、植物部分または植物細胞のＭｙｂ２９遺
伝子のコード領域、ＩＦＳ２プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ１プロ
モーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ２遺伝子のコード領域、ＩＦＳ１遺伝子
のコード領域、またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上の変異を導入することを含む
、方法。
【請求項14】
前記１つ以上の変異が、レアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して導入される、
請求項１３に記載の方法。
請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮである、請求項１４に記載の
方法。
方法。
【請求項16】
前記１つ以上の変異が、配列番号１または配列番号２内の配列に結合するＴＡＬエフェ
クターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載
の方法。
クターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載
の方法。
【請求項17】
前記１つ以上の変異が、配列番号３または配列番号４内の配列に結合するＴＡＬエフェ
クターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載
の方法。
クターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載
の方法。
【請求項18】
前記１つ以上の変異が、配列番号１８内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴ
ＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
ＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記１つ以上の変異が、配列番号５～１７および１９～３５のうちの１つ以上に結合す
るＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいず
れか一項に記載の方法。
るＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される、請求項１３～１５のいず
れか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記イソフラボンの減少した含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞が
、導入遺伝子を含まない、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
、導入遺伝子を含まない、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体の参照によって本明細
書に組み込まれる、配列表を含む。２０２０年９月１８日に作成された該ＡＳＣＩＩコピ
ーは、１７０２＿０４２ＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、３３，３１８バイトのサ
イズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体の参照によって本明細
書に組み込まれる、配列表を含む。２０２０年９月１８日に作成された該ＡＳＣＩＩコピ
ーは、１７０２＿０４２ＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、３３，３１８バイトのサ
イズである。
【背景技術】
【0002】
ダイズは、ヒト消費のためのタンパク質の経済的かつ豊富な供給源である。ダイズ粕に
由来するタンパク質抽出物は、好ましいアミノ酸プロファイルおよび高いタンパク質含有
量を有する。ダイズ抽出物は、ダイズ全体と同様に、多種多様な消費者製品において使用
される。ダイズ抽出タンパク質は乳児フォーミュラの重要な成分であり、ダイズタンパク
質を含有する配合物は、例えば、乳糖不耐症を有する乳児に価値がある。
由来するタンパク質抽出物は、好ましいアミノ酸プロファイルおよび高いタンパク質含有
量を有する。ダイズ抽出物は、ダイズ全体と同様に、多種多様な消費者製品において使用
される。ダイズ抽出タンパク質は乳児フォーミュラの重要な成分であり、ダイズタンパク
質を含有する配合物は、例えば、乳糖不耐症を有する乳児に価値がある。
【0003】
植物は、通常の植物の発生および生理に不可欠な基本分子とともに、多種多様な二次化
学物質を産生する。イソフラボンは、多種多様な機能を有するマメ科植物によって産生さ
れた二次植物化学化合物の分類である。イソフラボンはまた、植物由来エストロゲン様化
合物であるため、フィトエストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）とも記載される。
このように、イソフラボンは、ヒトホルモンおよび発生系へのそれらの潜在的な影響につ
いて調査されている。ダイズタンパク質抽出物はまた、成人女性などの消費者集団に有益
であり、閉経期症状の予防における潜在的な利益を有する、多様なイソフラボン（具体的
にはゲニステインおよびダイゼイン）を含む二次植物代謝産物も含有する。しかしながら
、これらのエストロゲン様イソフラボンは、乳児およびタンパク質サプリメントの消費者
を含む他の集団にとって潜在的にあまり望ましくない。
学物質を産生する。イソフラボンは、多種多様な機能を有するマメ科植物によって産生さ
れた二次植物化学化合物の分類である。イソフラボンはまた、植物由来エストロゲン様化
合物であるため、フィトエストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）とも記載される。
このように、イソフラボンは、ヒトホルモンおよび発生系へのそれらの潜在的な影響につ
いて調査されている。ダイズタンパク質抽出物はまた、成人女性などの消費者集団に有益
であり、閉経期症状の予防における潜在的な利益を有する、多様なイソフラボン（具体的
にはゲニステインおよびダイゼイン）を含む二次植物代謝産物も含有する。しかしながら
、これらのエストロゲン様イソフラボンは、乳児およびタンパク質サプリメントの消費者
を含む他の集団にとって潜在的にあまり望ましくない。
【0004】
イソフラボノイドの産生は、リグニン、アントシアニン、およびスチルベンを含むいく
つかの他の重要な植物化学物質の生合成経路も含む、マメ科植物のフェニルプロパノイド
経路からの分岐を表す。イソフラボンは、根圏細菌の結節形成および病原体応答を含む他
の生物との相互作用に関与することが知られている。
つかの他の重要な植物化学物質の生合成経路も含む、マメ科植物のフェニルプロパノイド
経路からの分岐を表す。イソフラボンは、根圏細菌の結節形成および病原体応答を含む他
の生物との相互作用に関与することが知られている。
【0005】
植物におけるイソフラボンレベルの改変は、ゲノムにおける標的化誘導性局所病変（Ｔ
ＩＬＬＩＮＧ）、トランスジェニック過剰発現、またはトランスジェニック抑制などの技
法を使用してアプローチされている（例えば、米国特許第８，３２９，９９５号、米国特
許第５，９９４，０７５号、米国特許第７，０９８，０１１号を参照されたい）。しかし
ながら、これらの方法は、意図されない変異またはトランスジェニックＤＮＡ配列を含ま
ない生成物を送達することに失敗し、消費者需要および公衆の受け入れを満たすことに失
敗する。
ＩＬＬＩＮＧ）、トランスジェニック過剰発現、またはトランスジェニック抑制などの技
法を使用してアプローチされている（例えば、米国特許第８，３２９，９９５号、米国特
許第５，９９４，０７５号、米国特許第７，０９８，０１１号を参照されたい）。しかし
ながら、これらの方法は、意図されない変異またはトランスジェニックＤＮＡ配列を含ま
ない生成物を送達することに失敗し、消費者需要および公衆の受け入れを満たすことに失
敗する。
【0006】
既存品種と比較してイソフラボンのより少ない含有量を有するダイズ植物に対する需要
が、存在する。
が、存在する。
【発明の概要】
【0007】
本発明の態様は、標的化された変異誘発法、具体的にはゲノム編集を伴い、従来の育種
方法によって植物を生成することにのみ基づく実施形態を除外する（すなわち、植物およ
び植物材料生成物（種子を含む）は本質的生物学的プロセスの手段によって排他的に得ら
れず、プロセス特徴は本質的生物学的プロセスを定義しない）。本明細書に記載されるよ
うに、本明細書に開示されるダイズ植物、植物部分、および植物細胞におけるイソフラボ
ンのより低いまたは低減した含有量は、導入遺伝子の存在に起因しない。
方法によって植物を生成することにのみ基づく実施形態を除外する（すなわち、植物およ
び植物材料生成物（種子を含む）は本質的生物学的プロセスの手段によって排他的に得ら
れず、プロセス特徴は本質的生物学的プロセスを定義しない）。本明細書に記載されるよ
うに、本明細書に開示されるダイズ植物、植物部分、および植物細胞におけるイソフラボ
ンのより低いまたは低減した含有量は、導入遺伝子の存在に起因しない。
【0008】
一態様では、本明細書で提供されるのは、改変されていないダイズ植物、植物部分、ま
たは植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、ま
たは植物細胞であって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩ
ＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のコード領域において１つ以上の変異を含み、植物、植物部
分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子の低減した発現
によって特徴付けられる、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞である。
たは植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、ま
たは植物細胞であって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩ
ＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のコード領域において１つ以上の変異を含み、植物、植物部
分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子の低減した発現
によって特徴付けられる、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞である。
【0009】
別の態様では、本発明で提供されるのは、改変されていないダイズ植物、植物部分、ま
たは植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、ま
たは植物細胞であって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、Ｍｙｂ２９遺伝子の
コード領域における変異のコード領域において１つ以上の変異を含み、植物、植物部分、
または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ２遺伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減した発
現によって特徴付けられる、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞である。
たは植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、ま
たは植物細胞であって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、Ｍｙｂ２９遺伝子の
コード領域における変異のコード領域において１つ以上の変異を含み、植物、植物部分、
または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ２遺伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減した発
現によって特徴付けられる、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞である。
【0010】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、改変されていないダイズ植物、植物部分、
または植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、
または植物細胞であって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、ＩＦＳ１プロモー
ターまたはＩＦＳ２プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフのコード領域において１
つ以上の変異を含み、植物、植物部分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ２遺
伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減した発現によって特徴付けられる、ダイズ植物、植物部
分、または植物細胞である。
または植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、
または植物細胞であって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、ＩＦＳ１プロモー
ターまたはＩＦＳ２プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフのコード領域において１
つ以上の変異を含み、植物、植物部分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ２遺
伝子およびＩＦＳ１遺伝子の低減した発現によって特徴付けられる、ダイズ植物、植物部
分、または植物細胞である。
【0011】
本明細書に開示されるダイズ植物、植物部分、または植物細胞のいくつかの実施形態で
は、１つ以上の変異は、レアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレア
ーゼを使用する標的化ゲノム修飾を使用して導入される。いくつかの実施形態では、レア
カッティングエンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡ
ＬＥＮ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号１または配列番
号２内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される。い
くつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号３または配列番号４内の配列に結合
するＴＡＬエフェクターを含む１つ以上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの
実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号１８内の配列に結合するＴＡＬエフェクター
を含む１つ以上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上
の変異は、配列番号５～１７および１９～３５のうちの１つ以上に結合するＴＡＬエフェ
クターを含む１つ以上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。
は、１つ以上の変異は、レアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレア
ーゼを使用する標的化ゲノム修飾を使用して導入される。いくつかの実施形態では、レア
カッティングエンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡ
ＬＥＮ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号１または配列番
号２内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される。い
くつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号３または配列番号４内の配列に結合
するＴＡＬエフェクターを含む１つ以上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの
実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号１８内の配列に結合するＴＡＬエフェクター
を含む１つ以上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上
の変異は、配列番号５～１７および１９～３５のうちの１つ以上に結合するＴＡＬエフェ
クターを含む１つ以上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。
【0012】
本明細書に記載されるダイズ植物、植物部分、または植物細胞のいくつかの実施形態で
は、植物、植物部分、または植物細胞は、導入遺伝子を含まない。いくつかの実施形態で
は、植物部分は、種子である。
は、植物、植物部分、または植物細胞は、導入遺伝子を含まない。いくつかの実施形態で
は、植物部分は、種子である。
【0013】
いくつかの実施形態では、植物、植物部分、または植物細胞は、対応する改変されてい
ないダイズ植物、植物部分、または植物細胞におけるイソフラボンの含有量と比較して、
約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９
０％低減するイソフラボンの含有量を有する。
ないダイズ植物、植物部分、または植物細胞におけるイソフラボンの含有量と比較して、
約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９
０％低減するイソフラボンの含有量を有する。
【0014】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｍｙｂ２９遺伝子のコード領域、ＩＦＳ２
プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ１プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結
合モチーフ、ＩＦＳ２遺伝子のコード領域、ＩＦＳ１遺伝子のコード領域、またはそれら
の組み合わせに１つ以上の変異を導入することを含む、標的化ゲノム修飾を使用して、改
変されていない植物、植物部分、または植物細胞と比較してイソフラボンの減少した含有
量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞を生産するための方法である。
プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフ、ＩＦＳ１プロモーターのＭＹＢＣＯＲＥ結
合モチーフ、ＩＦＳ２遺伝子のコード領域、ＩＦＳ１遺伝子のコード領域、またはそれら
の組み合わせに１つ以上の変異を導入することを含む、標的化ゲノム修飾を使用して、改
変されていない植物、植物部分、または植物細胞と比較してイソフラボンの減少した含有
量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞を生産するための方法である。
【0015】
いくつかの実施形態では、変異は、レアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して導
入される。いくつかの実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ
Ｎである。
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号１または配列番号２内の配列に結
合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの実施形態
では、１つ以上の変異は、配列番号３または配列番号４内の配列に結合するＴＡＬエフェ
クターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の変
異は、配列番号１８内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して
導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号５～１７および１９
～３５のうちの１つ以上に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入
される。
入される。いくつかの実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ
Ｎである。
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号１または配列番号２内の配列に結
合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの実施形態
では、１つ以上の変異は、配列番号３または配列番号４内の配列に結合するＴＡＬエフェ
クターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の変
異は、配列番号１８内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して
導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号５～１７および１９
～３５のうちの１つ以上に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入
される。
【0016】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、ダイズ植物、植物部分、または
植物細胞は、導入遺伝子を含まない。
植物細胞は、導入遺伝子を含まない。
【0017】
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、添付の図面と併せて考慮される際に
、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるようになるため、より容
易に認められるであろう。
、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるようになるため、より容
易に認められるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1A】（Ａ）ダイズＩＦＳ１（配列番号１）および（Ｂ）ダイズＩＦＳ２（配列番号２）のコード配列を示す。
【図1B】（Ａ）ダイズＩＦＳ１（配列番号１）および（Ｂ）ダイズＩＦＳ２（配列番号２）のコード配列を示す。
【図2】標的配列に隣接する左および右の半分のＴＡＬＥＮによって標的化されたＩＦＳ配列を示す（より大きな分解能が分解図に示される）。図は、それぞれ、出現順に配列番号４４～４９を開示する。
【図3】Ｍｙｂ２９転写因子配列および関連するＴＡＬＥＮの例示である。図は、配列番号５０を開示する。
【図3-1】Ｍｙｂ２９転写因子配列および関連するＴＡＬＥＮの例示である。図は、配列番号５０を開示する。
【図3-2】Ｍｙｂ２９転写因子配列および関連するＴＡＬＥＮの例示である。図は、配列番号５０を開示する。
【図3-3】Ｍｙｂ２９転写因子配列および関連するＴＡＬＥＮの例示である。図は、配列番号５０を開示する。
【図3-4】Ｍｙｂ２９転写因子配列および関連するＴＡＬＥＮの例示である。図は、配列番号５０を開示する。
【図3-5】Ｍｙｂ２９転写因子配列および関連するＴＡＬＥＮの例示である。図は、配列番号５０を開示する。
【図3-6】Ｍｙｂ２９転写因子配列および関連するＴＡＬＥＮの例示である。図は、配列番号５０を開示する。
【図4】強調表示された４つのユニークなＭＹＢＣＯＲＥモチーフ（ＣＮＧＴＴＲ）を有するＩＦＳ１プロモーター配列（配列番号３）を示す。
【図5】ＭＹＢＣＯＲＥモチーフを有するＩＦＳ１プロモーターの例示である。
【図6】特定されたＭＹＢＣＯＲＥモチーフを有するＩＦＳ２プロモーター配列（配列番号４）を示す。
【図7】ＭＹＢＣＯＲＥおよびＴＡＬＥＮ結合部位を有するＩＦＳ２プロモーターの例示である。図は、配列番号５１を開示する。
【図8】Ｍｙｂ２９（配列番号１８）のコード配列を示す。
【図9】再生したＴ０植物からの確認された変異体プロファイル（－２５）の代表的なＩＦＳ１ ＤＮＡ配列を示す。図は、配列番号３６を開示する。
【図10】再生したＴ０植物からの確認された変異体プロファイル（－３４）の代表的なＩＦＳ１ ＤＮＡ配列を示す。図は、配列番号３７を開示する。
【図11】再生したＴ０植物からの確認された変異体プロファイル（－４）の代表的なＩＦＳ１ ＤＮＡ配列を示す。図は、配列番号３８を開示する。
【図12】再生したＴ０植物からの確認された変異体プロファイル（－４）の代表的なＩＦＳ２ ＤＮＡ配列を示す。図は、配列番号３９を開示する。
【図13】再生したＴ０植物からの確認された変異体プロファイル（－３８）の代表的なＩＦＳ２ ＤＮＡ配列を示す。図は、配列番号４０を開示する。
【図14】再生したＴ０植物からの「ＩＦＳ２．２」と称された、確認された変異体プロファイル（－４）の代表的なＩＦＳ２ ＤＮＡ配列を示す。「ＩＦＳ２．２」名称は、ユニークなバリアントを示す。この場合、欠失部位は、図１２に記載される－４ｎｔ欠失変異体とは異なる。図は、配列番号４１を開示する。
【図15】再生したＴ０植物からの確認された変異体プロファイル（－５）の代表的なＩＦＳ２ ＤＮＡ配列を示す。図は、配列番号４２を開示する。
【図16】再生したＴ０植物からの、「ＩＦＳ２．２」と称された、確認された変異体プロファイル（－５）の代表的なＩＦＳ２ ＤＮＡ配列を示す。欠失部位は、図１５に記載される－５ｎｔ欠失変異体とは異なる。図は、配列番号４３を開示する。
【図17】３つの変異体植物株（＃１～＃３と称された）の種子から抽出されたダイジン、グリシチン、およびゲニスチンの量を、乾燥植物材料のμｇ／ｍｇで表された野生型種子抽出物（対照）と比較するフィトエストロゲン分析の結果を示す。
【図19】３つの変異体植物株（＃１～＃３と称された）の種子から抽出された総フィトエストロゲン量を、乾燥植物材料のμｇ／ｍｇで表された野生型種子抽出物（対照）と比較するフィトエストロゲン含有量分析の結果を示す。
【図20】対照抽出物（上）および試料＃１抽出物（下）におけるイソフラボン成分の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。囲まれた領域は、それぞれ、ダイジン、グリシチン、およびゲニスチンに関連する吸光度ピークを示し、試料＃１と比較して、対照において顕著に大きい。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本開示は、イソフラボンの産生を担う最終生合成酵素、イソフラボン合成酵素（ＩＦＳ
１およびＩＦＳ２）、同様にＩＦＳ１およびＩＦＳ２の発現を制御する遺伝子（Ｍｙｂ２
９など）および制御配列（プロモーターなど）の選択的標的化に焦点を当てる。
１およびＩＦＳ２）、同様にＩＦＳ１およびＩＦＳ２の発現を制御する遺伝子（Ｍｙｂ２
９など）および制御配列（プロモーターなど）の選択的標的化に焦点を当てる。
【0020】
本開示は、より低いイソフラボン含有量を有するダイズタンパク質および油製品に対す
る消費者のニーズに対処する。本開示は、より低いイソフラボン含有量を有する非トラン
スジェニックダイズタンパク質および油製品に対する消費者ニーズにさらに対処する。
る消費者のニーズに対処する。本開示は、より低いイソフラボン含有量を有する非トラン
スジェニックダイズタンパク質および油製品に対する消費者ニーズにさらに対処する。
【0021】
したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、イソフラボン合成酵素（ＩＦＳ
）遺伝子、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２のコード領域において１つ以上の変異を含む本開示の
改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞、ダイズ植物、植物部分、およ
び植物細胞と比較して、低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、お
よび植物細胞である。本明細書に開示されるダイズ植物、植物部分、および植物細胞は、
導入遺伝子不含であり、標的ＩＦＳ１およびＩＦＳ２に対する相同性を有する遺伝子にお
いて修飾を含まない。
）遺伝子、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２のコード領域において１つ以上の変異を含む本開示の
改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞、ダイズ植物、植物部分、およ
び植物細胞と比較して、低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、お
よび植物細胞である。本明細書に開示されるダイズ植物、植物部分、および植物細胞は、
導入遺伝子不含であり、標的ＩＦＳ１およびＩＦＳ２に対する相同性を有する遺伝子にお
いて修飾を含まない。
【0022】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、遺伝子Ｍｙｂ２９、ＩＦＳ１およびＩＦＳ
２の制御された発現に重要な転写制御因子において１つ以上の変異を含む本開示の改変さ
れていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞、ダイズ植物、植物部分、および植物
細胞と比較して、低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、および植
物細胞である。
２の制御された発現に重要な転写制御因子において１つ以上の変異を含む本開示の改変さ
れていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞、ダイズ植物、植物部分、および植物
細胞と比較して、低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、および植
物細胞である。
【0023】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＩＦＳ１および／またはＩＦＳ２の制御領
域において１つ以上の変異を含む改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細
胞と比較して、低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、および植物
細胞である。いくつかの実施形態では、制御領域は、プロモーター領域である。
域において１つ以上の変異を含む改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細
胞と比較して、低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、および植物
細胞である。いくつかの実施形態では、制御領域は、プロモーター領域である。
【0024】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、改変されていないダイズ植物、植物部分、
または植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、
または植物細胞を生産する方法であって、ＩＦＳ１のコード領域、ＩＦＳ２のコード領域
、ＩＦＳ１の制御領域、ＩＦＳ２の制御領域、遺伝子Ｍｙｂ２９、またはそれらの組み合
わせに１つ以上の変異を導入することによって標的化遺伝子編集を含む、方法であり、こ
こで、ＩＦＳ１および／またはＩＦＳ２遺伝子の発現は、排除される。いくつかの実施形
態では、遺伝子編集は、イソフラボンがダイズに有益であるダイズ根における発現を妨げ
ることなく、ダイズ種子におけるＩＦＳ１および／またはＩＦＳ２遺伝子の発現を排除す
るために、遺伝子のＴＡＬＥＮ編集を使用して実行される。
または植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、
または植物細胞を生産する方法であって、ＩＦＳ１のコード領域、ＩＦＳ２のコード領域
、ＩＦＳ１の制御領域、ＩＦＳ２の制御領域、遺伝子Ｍｙｂ２９、またはそれらの組み合
わせに１つ以上の変異を導入することによって標的化遺伝子編集を含む、方法であり、こ
こで、ＩＦＳ１および／またはＩＦＳ２遺伝子の発現は、排除される。いくつかの実施形
態では、遺伝子編集は、イソフラボンがダイズに有益であるダイズ根における発現を妨げ
ることなく、ダイズ種子におけるＩＦＳ１および／またはＩＦＳ２遺伝子の発現を排除す
るために、遺伝子のＴＡＬＥＮ編集を使用して実行される。
【0025】
本発明者らは、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子配列が、ＴＡＬＥＮなどの単一のレアカ
ッティングエンドヌクレアーゼによって同時に標的化され得る領域を有することを発見し
た。本発明者らは、いくつかのダイズ品種からのイソフラボン合成酵素遺伝子配列をさら
に分析し、保存領域を特定して、ＴＡＬＥＮなどのレアカッティングエンドヌクレアーゼ
の標的部位にさらに焦点を当てた。したがって、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２の遺伝子編集の
ために検証された、ＴＡＬＥＮなどのレアカッティングエンドヌクレアーゼは、多種多様
な市販のダイズ株において使用され得る。ＴＡＬＥＮ編集の下流で生成された植物は、同
様の条件下で栽培された標準的なダイズ品種よりも明らか低減したイソフラボンを有する
。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるダイズ植物、植物部分、または植物細
胞は、対応する改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞におけるイソフ
ラボンの含有量と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約６０％、約７
０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％低減するイソフラボン
の含有量を有する。本明細書で使用される場合、「改変されていないダイズ」は、遺伝子
編集技法、例えば、本明細書に開示されるＴＡＬＥＮ編集によって改変されていないダイ
ズを指す。改変されていない植物は、野生型植物を含む。いくつかの実施形態では、ダイ
ズ植物部分は、ダイズ種子である。
ッティングエンドヌクレアーゼによって同時に標的化され得る領域を有することを発見し
た。本発明者らは、いくつかのダイズ品種からのイソフラボン合成酵素遺伝子配列をさら
に分析し、保存領域を特定して、ＴＡＬＥＮなどのレアカッティングエンドヌクレアーゼ
の標的部位にさらに焦点を当てた。したがって、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２の遺伝子編集の
ために検証された、ＴＡＬＥＮなどのレアカッティングエンドヌクレアーゼは、多種多様
な市販のダイズ株において使用され得る。ＴＡＬＥＮ編集の下流で生成された植物は、同
様の条件下で栽培された標準的なダイズ品種よりも明らか低減したイソフラボンを有する
。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるダイズ植物、植物部分、または植物細
胞は、対応する改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞におけるイソフ
ラボンの含有量と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約６０％、約７
０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％低減するイソフラボン
の含有量を有する。本明細書で使用される場合、「改変されていないダイズ」は、遺伝子
編集技法、例えば、本明細書に開示されるＴＡＬＥＮ編集によって改変されていないダイ
ズを指す。改変されていない植物は、野生型植物を含む。いくつかの実施形態では、ダイ
ズ植物部分は、ダイズ種子である。
【0026】
したがって、本開示は、ゲノム全体の他の位置における変異をもたらさず、かつ最終的
に選択された編集された株への外来物質の導入を伴わない様式で、ダイズの複数の品種に
わたってイソフラボン合成酵素遺伝子を特異的に標的化するための以前に知られていない
方法を提供する。さらに、遺伝子編集技術に由来する植物は、有利には、細胞生物学的再
生が困難であるエリート株に交配され得る。
に選択された編集された株への外来物質の導入を伴わない様式で、ダイズの複数の品種に
わたってイソフラボン合成酵素遺伝子を特異的に標的化するための以前に知られていない
方法を提供する。さらに、遺伝子編集技術に由来する植物は、有利には、細胞生物学的再
生が困難であるエリート株に交配され得る。
【0027】
ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子の発現は、少なくとも部分的に、Ｍｙｂ２９転写因子に
よって制御されることが示されている（Ｃｈｕ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎ
ｅｔ．１３（５）（２０１７））。Ｍｙｂ２９は、プロモーター領域におけるＭＹＢＣＯ
ＲＥ配列モチーフに結合し、ＩＦＳ１／ＩＦＳ２などの下流遺伝子の発現を上方制御する
、転写活性化因子である。したがって、本明細書に開示されるのは、Ｍｙｂ２９遺伝子へ
の変異の導入によって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞を生産し、それによって
、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のうちの１つ以上の発現を低減または排除する方法であ
る。さらに、本明細書に開示されるのは、Ｍｙｂ２９遺伝子において１つ以上の変異を含
むダイズ植物、植物部分、または植物細胞であり、ダイズ植物、植物部分、または植物細
胞は、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のうちの１つ以上の低減または排除された発現を有
する。
よって制御されることが示されている（Ｃｈｕ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎ
ｅｔ．１３（５）（２０１７））。Ｍｙｂ２９は、プロモーター領域におけるＭＹＢＣＯ
ＲＥ配列モチーフに結合し、ＩＦＳ１／ＩＦＳ２などの下流遺伝子の発現を上方制御する
、転写活性化因子である。したがって、本明細書に開示されるのは、Ｍｙｂ２９遺伝子へ
の変異の導入によって、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞を生産し、それによって
、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のうちの１つ以上の発現を低減または排除する方法であ
る。さらに、本明細書に開示されるのは、Ｍｙｂ２９遺伝子において１つ以上の変異を含
むダイズ植物、植物部分、または植物細胞であり、ダイズ植物、植物部分、または植物細
胞は、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のうちの１つ以上の低減または排除された発現を有
する。
【0028】
本発明者らは、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２のプロモーター領域におけるＭＹＢＣＯＲＥ配
列ならびにこれらの結合モチーフを除去するように設計されたＴＡＬＥＮを特定した。Ｉ
ＦＳ１および／またはＩＦＳ２プロモーターからのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフの除去は
、Ｍｙｂ２９遺伝子が、ＩＦＳ１および／またはＩＦＳ２のその調節を排除する間に改変
されず、かつ完全に機能的なままにされ、他の標的遺伝子を制御することができるため、
特に興味深い。
列ならびにこれらの結合モチーフを除去するように設計されたＴＡＬＥＮを特定した。Ｉ
ＦＳ１および／またはＩＦＳ２プロモーターからのＭＹＢＣＯＲＥ結合モチーフの除去は
、Ｍｙｂ２９遺伝子が、ＩＦＳ１および／またはＩＦＳ２のその調節を排除する間に改変
されず、かつ完全に機能的なままにされ、他の標的遺伝子を制御することができるため、
特に興味深い。
【0029】
本明細書に開示される方法、植物、植物部分、および植物細胞のいくつかの実施形態で
は、１つ以上の変異は、レアカッティングエンドヌクレアーゼを使用する標的化ゲノム修
飾を介して導入される。本明細書における「レアカッティングエンドヌクレアーゼ」とい
う用語は、約１２～４０ｂｐの長さ（例えば、１４～４０ｂｐの長さ）の認識配列（標的
配列）を有する核酸配列を対象とするエンドヌクレアーゼ活性を有する天然の、または操
作されたタンパク質を指す。典型的なレアカッティングエンドヌクレアーゼは、それらの
認識部位の内側で切断を引き起こし、３’ＯＨまたは５’ＯＨオーバーハングとともに４
つのヌクレオチドに段違い切断（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｃｕｔ）を残す。これらのレアカ
ッティングエンドヌクレアーゼは、より具体的には、ドデカペプチドファミリーに属する
、ホーミングエンドヌクレアーゼの野生型もしくはバリアントタンパク質などのメガヌク
レアーゼであり得るか（ＷＯ２００４／０６７７３６を参照されたい）、または切断活性
を有するＤＮＡ結合ドメインおよび触媒ドメインと会合する融合タンパク質から生じ得る
。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ
）は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインとのＤＮＡ結合ドメインの融合の例で
ある。レアカッティングエンドヌクレアーゼの概説については、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：２３－２６，２０１２を参照されたい。
は、１つ以上の変異は、レアカッティングエンドヌクレアーゼを使用する標的化ゲノム修
飾を介して導入される。本明細書における「レアカッティングエンドヌクレアーゼ」とい
う用語は、約１２～４０ｂｐの長さ（例えば、１４～４０ｂｐの長さ）の認識配列（標的
配列）を有する核酸配列を対象とするエンドヌクレアーゼ活性を有する天然の、または操
作されたタンパク質を指す。典型的なレアカッティングエンドヌクレアーゼは、それらの
認識部位の内側で切断を引き起こし、３’ＯＨまたは５’ＯＨオーバーハングとともに４
つのヌクレオチドに段違い切断（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｃｕｔ）を残す。これらのレアカ
ッティングエンドヌクレアーゼは、より具体的には、ドデカペプチドファミリーに属する
、ホーミングエンドヌクレアーゼの野生型もしくはバリアントタンパク質などのメガヌク
レアーゼであり得るか（ＷＯ２００４／０６７７３６を参照されたい）、または切断活性
を有するＤＮＡ結合ドメインおよび触媒ドメインと会合する融合タンパク質から生じ得る
。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ
）は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインとのＤＮＡ結合ドメインの融合の例で
ある。レアカッティングエンドヌクレアーゼの概説については、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：２３－２６，２０１２を参照されたい。
【0030】
「レアカッティングエンドヌクレアーゼ」はまた、本明細書で提供される方法において
使用され得るＲＮＡ誘導系を包含する。例えば、クラスター化した規則的な間隔の短い回
文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系は、ＲＮＡを使用してＤ
ＮＡ切断を指示する（例えば、Ｂｅｌａｈｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ９：３９，２０１３を参照されたい）。これらの系は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ
およびガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ
（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との間の複合体、またはｃｒＲＮＡの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ
の５’末端との間の合成融合体のいずれか）からなる。ガイドＲＮＡは、プロトスペーサ
ー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する配列に対するＣａｓ９結合およびＤＮＡ切断、例え
ば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９に対するＮＧＧを指
示する。標的ＤＮＡ配列にあると、Ｃａｓ９は、標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列
の３’末端から３つのヌクレオチドの位置でＤＮＡ二本鎖切断を生成する。Ｃａｓ９に加
えて、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）からのＣＲ
ＩＳＰＲ系が、変異を導入するために用いられ得る（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：７５９－７７１（２０１５）を参照されたい）。
使用され得るＲＮＡ誘導系を包含する。例えば、クラスター化した規則的な間隔の短い回
文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系は、ＲＮＡを使用してＤ
ＮＡ切断を指示する（例えば、Ｂｅｌａｈｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ９：３９，２０１３を参照されたい）。これらの系は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ
およびガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ
（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との間の複合体、またはｃｒＲＮＡの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ
の５’末端との間の合成融合体のいずれか）からなる。ガイドＲＮＡは、プロトスペーサ
ー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する配列に対するＣａｓ９結合およびＤＮＡ切断、例え
ば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９に対するＮＧＧを指
示する。標的ＤＮＡ配列にあると、Ｃａｓ９は、標的配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列
の３’末端から３つのヌクレオチドの位置でＤＮＡ二本鎖切断を生成する。Ｃａｓ９に加
えて、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）からのＣＲ
ＩＳＰＲ系が、変異を導入するために用いられ得る（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：７５９－７７１（２０１５）を参照されたい）。
【0031】
本明細書に開示される方法、植物、植物部分、および植物細胞のいくつかの実施形態で
は、１つ以上の変異は、配列番号１内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬ
ＥＮを使用して導入される（図１Ａ）。本明細書に開示される方法、植物、植物部分、お
よび植物細胞のいくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号２内の配列に結合
するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される（図１Ｂ）。本明細書に
開示される方法、植物、植物部分、および植物細胞のいくつかの実施形態では、１つ以上
の変異は、配列番号３内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用し
て導入される（図４）。本明細書に開示される方法、植物、植物部分、および植物細胞の
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号４内の配列に結合するＴＡＬエフ
ェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される（図６）。本明細書に開示される方法、
植物、植物部分、および植物細胞のいくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番
号１８内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される（
図８）。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、以下の表１に示される配列番号５
～１７および１９～３５から選択される配列に結合するＴＡＬエフェクターを含む１つ以
上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。
は、１つ以上の変異は、配列番号１内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬ
ＥＮを使用して導入される（図１Ａ）。本明細書に開示される方法、植物、植物部分、お
よび植物細胞のいくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号２内の配列に結合
するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される（図１Ｂ）。本明細書に
開示される方法、植物、植物部分、および植物細胞のいくつかの実施形態では、１つ以上
の変異は、配列番号３内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用し
て導入される（図４）。本明細書に開示される方法、植物、植物部分、および植物細胞の
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番号４内の配列に結合するＴＡＬエフ
ェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される（図６）。本明細書に開示される方法、
植物、植物部分、および植物細胞のいくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、配列番
号１８内の配列に結合するＴＡＬエフェクターを含むＴＡＬＥＮを使用して導入される（
図８）。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、以下の表１に示される配列番号５
～１７および１９～３５から選択される配列に結合するＴＡＬエフェクターを含む１つ以
上のＴＡＬＥＮを使用して導入される。
【表1】
【0032】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、本明細書に開示される配列の機能的バリアン
ト内の配列、例えば、配列番号１～４および１８に結合するＴＡＬエフェクターを含む。
「核酸またはタンパク質配列の機能的バリアント」という用語は、本明細書で使用される
場合、例えば、配列番号１～４および１８に関して、非バリアント遺伝子の生物学的機能
を保持する変異体遺伝子配列または遺伝子配列の一部を指す。機能的バリアントはまた、
例えば、非保存残基において、得られるタンパク質の機能に影響を及ぼさない配列改変を
有するポリペプチドをコードする目的の遺伝子のバリアントも含む。また、本明細書に示
される遺伝子の改変されていない、例えば、野生型核酸配列と実質的に同一である、すな
わち、例えば、非保存残基においていくつかの配列多様性のみを有し、生物学的に活性で
ある、バリアントも、包含される。本明細書で使用される場合、本発明の様々な態様によ
る特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列のバリアントは、配列番号１～４および１８の
うちの１つなどの、本明細書に開示される遺伝子の特定の非バリアントヌクレオチド配列
に対して、少なくとも約５０％～少なくとも約９９％、例えば、少なくとも約７５％、少
なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少
なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少
なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、ま
たは少なくとも約９９％以上の配列同一性を有し得る。配列同一性は、当該技術分野で周
知である配列アラインメントプログラムを使用して判定され得る。
ト内の配列、例えば、配列番号１～４および１８に結合するＴＡＬエフェクターを含む。
「核酸またはタンパク質配列の機能的バリアント」という用語は、本明細書で使用される
場合、例えば、配列番号１～４および１８に関して、非バリアント遺伝子の生物学的機能
を保持する変異体遺伝子配列または遺伝子配列の一部を指す。機能的バリアントはまた、
例えば、非保存残基において、得られるタンパク質の機能に影響を及ぼさない配列改変を
有するポリペプチドをコードする目的の遺伝子のバリアントも含む。また、本明細書に示
される遺伝子の改変されていない、例えば、野生型核酸配列と実質的に同一である、すな
わち、例えば、非保存残基においていくつかの配列多様性のみを有し、生物学的に活性で
ある、バリアントも、包含される。本明細書で使用される場合、本発明の様々な態様によ
る特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列のバリアントは、配列番号１～４および１８の
うちの１つなどの、本明細書に開示される遺伝子の特定の非バリアントヌクレオチド配列
に対して、少なくとも約５０％～少なくとも約９９％、例えば、少なくとも約７５％、少
なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少
なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少
なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、ま
たは少なくとも約９９％以上の配列同一性を有し得る。配列同一性は、当該技術分野で周
知である配列アラインメントプログラムを使用して判定され得る。
【0033】
ＴＡＬＥＮ遺伝子編集は、レシピエント植物細胞における発現に必要な適切なプロモー
ター、ターミネーター、および他の非コード配列を含む、プラスミドにコードされたＤＮ
Ａ認識ドメインおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含む２つの半ＴＡＬＥＮタ
ンパク質の遺伝子特異的標的化に基づく。ＦｏｋＩは二量体の組み合わせにおいてのみ活
性であり、２つの半分のＴＡＬＥＮが、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集に必要なエンドヌクレアー
ゼＤＮＡ切断を可能にするために必要である。ＴＡＬＥＮの細胞、例えば、ダイズＧｌｙ
ｃｉｎｅ ｍａｘの細胞への導入は、当業者に既知の複数の方法において達成され得る。
遺伝子編集ＴＡＬＥＮの導入の一般的な方法は、ＴＡＬＥＮ遺伝子カセットを含むプラス
ミドを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を用いたトランスフェクション、
ＴＡＬＥＮ配列カセットをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡを用いたバイオリスティ
ックボンバードメント、ＴＡＬＥＮ配列カセットをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡ
を用いたＰＥＧ媒介性形質転換、およびＰＥＧ媒介性トランスフェクションを含む複数の
方法によるＴＡＬＥＮタンパク質の導入を含む。
ター、ターミネーター、および他の非コード配列を含む、プラスミドにコードされたＤＮ
Ａ認識ドメインおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含む２つの半ＴＡＬＥＮタ
ンパク質の遺伝子特異的標的化に基づく。ＦｏｋＩは二量体の組み合わせにおいてのみ活
性であり、２つの半分のＴＡＬＥＮが、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集に必要なエンドヌクレアー
ゼＤＮＡ切断を可能にするために必要である。ＴＡＬＥＮの細胞、例えば、ダイズＧｌｙ
ｃｉｎｅ ｍａｘの細胞への導入は、当業者に既知の複数の方法において達成され得る。
遺伝子編集ＴＡＬＥＮの導入の一般的な方法は、ＴＡＬＥＮ遺伝子カセットを含むプラス
ミドを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を用いたトランスフェクション、
ＴＡＬＥＮ配列カセットをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡを用いたバイオリスティ
ックボンバードメント、ＴＡＬＥＮ配列カセットをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡ
を用いたＰＥＧ媒介性形質転換、およびＰＥＧ媒介性トランスフェクションを含む複数の
方法によるＴＡＬＥＮタンパク質の導入を含む。
【0034】
したがって、本明細書で提供される方法は、改変されていない植物からの対応する植物
部分または生成物と比較して、減少したイソフラボン含有量を有する植物部分（例えば、
種子）または植物生成物（例えば、粕、油）を生産するために使用され得る。本発明は、
特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載
される。
部分または生成物と比較して、減少したイソフラボン含有量を有する植物部分（例えば、
種子）または植物生成物（例えば、粕、油）を生産するために使用され得る。本発明は、
特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載
される。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のエンドヌクレアーゼ誘導変
異を有するダイズ植物の再生は、以下のように達成され得る。いくつかの実施形態では、
ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子は、両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２内の配列を標的化する
ように設計された１つのＴＡＬＥＮ（対）を送達することによってノックアウトされ得る
。このことを達成するために、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２ ＴＡＬＥＮは、好適なＤＮＡベ
クターにクローニングされる。かかるベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形
質転換によって、またはバイオリスティクスを使用することによって、植物細胞に送達さ
れ得る。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを発現するトランスジェニックダイズ植
物は、標準的な形質転換プロトコルを使用して生成され得る。植物は土壌に移され、およ
そ４週間の成長後、小さな葉はＤＮＡ抽出および遺伝子型決定のために各植物から採取さ
れる。各ＤＮＡ試料は、第１に、Ｔ－ＤＮＡの存在についてＰＣＲを使用してスクリーニ
ングされる。ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のさらなるＰＣＲベースの特徴付けは、変異
が生じたかどうかを評価するために使用される。
異を有するダイズ植物の再生は、以下のように達成され得る。いくつかの実施形態では、
ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子は、両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２内の配列を標的化する
ように設計された１つのＴＡＬＥＮ（対）を送達することによってノックアウトされ得る
。このことを達成するために、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２ ＴＡＬＥＮは、好適なＤＮＡベ
クターにクローニングされる。かかるベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形
質転換によって、またはバイオリスティクスを使用することによって、植物細胞に送達さ
れ得る。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを発現するトランスジェニックダイズ植
物は、標準的な形質転換プロトコルを使用して生成され得る。植物は土壌に移され、およ
そ４週間の成長後、小さな葉はＤＮＡ抽出および遺伝子型決定のために各植物から採取さ
れる。各ＤＮＡ試料は、第１に、Ｔ－ＤＮＡの存在についてＰＣＲを使用してスクリーニ
ングされる。ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のさらなるＰＣＲベースの特徴付けは、変異
が生じたかどうかを評価するために使用される。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＩＦＳ１またはＩＦＳ２プロモーターにおけるＭＹＢＣＯＲ
Ｅ要素のエンドヌクレアーゼ媒介性欠失を用いたダイズ植物の再生は、以下のように達成
され得る。ＩＦＳ１およびＩＦＳ２の上流領域の配列分析は、配列ＣＮＧＴＴＲを有する
ＭＹＢＣＯＲＥ要素を特定するために実行され、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり
、Ｒはプリン（ＧまたはＡ）である。例えば、ＩＦＳ１プロモーターについては、４つの
ＭＹＢＣＯＲＥモチーフが特定され、ＴＡＬＥＮ対が設計される（図５）。ＩＦＳ２プロ
モーターについては、例えば、１つのＭＹＢＣＯＲＥモチーフが特定され、ＴＡＬＥＮ対
が設計される（図７）。ＩＦＳ１プロモーターおよびＩＦＳ２プロモーター、または両方
のプロモーターを標的化するＴＡＬＥＮ対は、好適なＤＮＡベクターにクローニングされ
、トランスジェニック小植物へと再生する植物細胞に送達される。土壌中でのおよそ４週
間成長後、小さな葉はＤＮＡ抽出および遺伝子型決定のために各植物から採取される。各
ＤＮＡ試料は、第１に、Ｔ－ＤＮＡの存在についてＰＣＲを使用してスクリーニングされ
る。ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のプロモーター領域のさらなるＰＣＲベースの特徴付
けは、変異が生じたかどうかを評価するために使用される。
Ｅ要素のエンドヌクレアーゼ媒介性欠失を用いたダイズ植物の再生は、以下のように達成
され得る。ＩＦＳ１およびＩＦＳ２の上流領域の配列分析は、配列ＣＮＧＴＴＲを有する
ＭＹＢＣＯＲＥ要素を特定するために実行され、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり
、Ｒはプリン（ＧまたはＡ）である。例えば、ＩＦＳ１プロモーターについては、４つの
ＭＹＢＣＯＲＥモチーフが特定され、ＴＡＬＥＮ対が設計される（図５）。ＩＦＳ２プロ
モーターについては、例えば、１つのＭＹＢＣＯＲＥモチーフが特定され、ＴＡＬＥＮ対
が設計される（図７）。ＩＦＳ１プロモーターおよびＩＦＳ２プロモーター、または両方
のプロモーターを標的化するＴＡＬＥＮ対は、好適なＤＮＡベクターにクローニングされ
、トランスジェニック小植物へと再生する植物細胞に送達される。土壌中でのおよそ４週
間成長後、小さな葉はＤＮＡ抽出および遺伝子型決定のために各植物から採取される。各
ＤＮＡ試料は、第１に、Ｔ－ＤＮＡの存在についてＰＣＲを使用してスクリーニングされ
る。ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のプロモーター領域のさらなるＰＣＲベースの特徴付
けは、変異が生じたかどうかを評価するために使用される。
【0037】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｂ２９におけるエンドヌクレアーゼ誘導変異を有するダ
イズ植物の再生は、以下のように達成され得る。Ｍｙｂ２９のコード配列は分析され、Ｔ
ＡＬＥＮは、Ｍｙｂ２９がＩＦＳ１またはＩＦＳ２発現を誘導することを防止するであろ
う機能喪失型欠失を誘導するように設計される。Ｍｙｂ２９のエクソン２（例えば、配列
番号１８内）の標的配列に結合するように設計されたＴＡＬＥＮ対は、ダイズ細胞に送達
され、所望の変異を含む植物に再生する。
イズ植物の再生は、以下のように達成され得る。Ｍｙｂ２９のコード配列は分析され、Ｔ
ＡＬＥＮは、Ｍｙｂ２９がＩＦＳ１またはＩＦＳ２発現を誘導することを防止するであろ
う機能喪失型欠失を誘導するように設計される。Ｍｙｂ２９のエクソン２（例えば、配列
番号１８内）の標的配列に結合するように設計されたＴＡＬＥＮ対は、ダイズ細胞に送達
され、所望の変異を含む植物に再生する。
【0038】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、特許請求の範囲に記載される本発明
の範囲を限定しない。
の範囲を限定しない。
【実施例0039】
実験を、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２における変異を有するダイズ植物を作成するために行
った。このことを達成するために、ＧｍＩＦＳ１＿Ｔ０１ ＴＡＬエフェクターエンドヌ
クレアーゼ対（配列番号５および６（表１））を細菌ベクターにクローニングし、ＴＡＬ
エフェクターエンドヌクレアーゼ発現を、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーターによ
って駆動し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって、またはバイオリステ
ィクスを使用することによってダイズ植物細胞に送達した。
った。このことを達成するために、ＧｍＩＦＳ１＿Ｔ０１ ＴＡＬエフェクターエンドヌ
クレアーゼ対（配列番号５および６（表１））を細菌ベクターにクローニングし、ＴＡＬ
エフェクターエンドヌクレアーゼ発現を、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーターによ
って駆動し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって、またはバイオリステ
ィクスを使用することによってダイズ植物細胞に送達した。
【0040】
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを発現するトランスジェニックダイズ植物を、
標準的な形質転換プロトコルを使用して生成した。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアー
ゼ対をコードする配列を有する野生型ダイズ半分の子葉の形質転換に続いて、おそらくト
ランスジェニック植物を再生した。植物を土壌に移し、およそ４週間の成長後、小さな葉
をＤＮＡ抽出および遺伝子型決定のために各植物から採取した。複数のイベントを生成し
た。次いで、すべてのＴ０導入遺伝子陽性植物をアッセイして、ＴＡＬエフェクターエン
ドヌクレアーゼ認識部位に変異を有する植物を特定した。
標準的な形質転換プロトコルを使用して生成した。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアー
ゼ対をコードする配列を有する野生型ダイズ半分の子葉の形質転換に続いて、おそらくト
ランスジェニック植物を再生した。植物を土壌に移し、およそ４週間の成長後、小さな葉
をＤＮＡ抽出および遺伝子型決定のために各植物から採取した。複数のイベントを生成し
た。次いで、すべてのＴ０導入遺伝子陽性植物をアッセイして、ＴＡＬエフェクターエン
ドヌクレアーゼ認識部位に変異を有する植物を特定した。
【0041】
次いで、陽性植物のＩＦＳ１およびＩＦＳ２ ＰＣＲ増幅子を、クローニングベクター
に挿入し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に供して、変異体プロファイルを確認し、特徴付けた。
次いで、得られるリードを野生型配列に整列させて、対立遺伝子の種類を決定した。代表
的な配列を、図９～１６に示す（配列番号３６～４３）。
に挿入し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に供して、変異体プロファイルを確認し、特徴付けた。
次いで、得られるリードを野生型配列に整列させて、対立遺伝子の種類を決定した。代表
的な配列を、図９～１６に示す（配列番号３６～４３）。
【0042】
ダイズＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ誘導変
異から生産された種子に関するフィトエストロゲンプロファイルを決定するために、ダイ
ズ株を、成熟するまで栽培し、自家受精させ、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のホモ接合
変異体である種子を生じさせた。これらの種子を、総フィトエストロゲン含有量ならびに
ダイジン、グリシチン、およびゲニスチンの量を決定することによってフィトエストロゲ
ン含有量について分析した。簡単に述べると、３つの変異体植物株（＃１～＃３）および
野生型植物株（対照）からの個々のダイズ種子をモルタルおよび乳棒で粉砕し、フィトエ
ストロゲンを８０％メタノールで粉砕した組織から抽出した。変異体植物株からの抽出物
は、強い黄色の色合いを示したが、野生型種子抽出物は、クリーム色を有した（示さず）
。抽出物を遠心分離し、上清を濾過した。濾過された試料を加水分解して、定量的ＨＰＬ
Ｃ分析（標準吸収波長としての２６０ｎｍ）を使用して非エステル化フィトエストロゲン
形態を決定した。代表的なクロマトグラムを、図２０に示す。対照種子と比較して、分析
の結果は、各変異株は、総フィトエストロゲン（総フィトエストロゲンの５５～１００倍
の変化（図１７および１９））、ならびにダイジン、グリシチン、およびゲニスチンの各
々の顕著な低減を有する種子を生産したことを示す（図１７および１８）。例えば、試料
＃３種子は、野生型種子と比較して、ダイジンの９８．８７％低減、グリシチンの９７．
５６％低減、およびゲニスチンの９９．３０％低減を示した（図１７）。総フィトエスト
ロゲンは、試料＃１において９８．２５％、試料＃２において９８．５７％、試料＃３に
おいて９９．０７％低減した（図１９）。
異から生産された種子に関するフィトエストロゲンプロファイルを決定するために、ダイ
ズ株を、成熟するまで栽培し、自家受精させ、ＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のホモ接合
変異体である種子を生じさせた。これらの種子を、総フィトエストロゲン含有量ならびに
ダイジン、グリシチン、およびゲニスチンの量を決定することによってフィトエストロゲ
ン含有量について分析した。簡単に述べると、３つの変異体植物株（＃１～＃３）および
野生型植物株（対照）からの個々のダイズ種子をモルタルおよび乳棒で粉砕し、フィトエ
ストロゲンを８０％メタノールで粉砕した組織から抽出した。変異体植物株からの抽出物
は、強い黄色の色合いを示したが、野生型種子抽出物は、クリーム色を有した（示さず）
。抽出物を遠心分離し、上清を濾過した。濾過された試料を加水分解して、定量的ＨＰＬ
Ｃ分析（標準吸収波長としての２６０ｎｍ）を使用して非エステル化フィトエストロゲン
形態を決定した。代表的なクロマトグラムを、図２０に示す。対照種子と比較して、分析
の結果は、各変異株は、総フィトエストロゲン（総フィトエストロゲンの５５～１００倍
の変化（図１７および１９））、ならびにダイジン、グリシチン、およびゲニスチンの各
々の顕著な低減を有する種子を生産したことを示す（図１７および１８）。例えば、試料
＃３種子は、野生型種子と比較して、ダイジンの９８．８７％低減、グリシチンの９７．
５６％低減、およびゲニスチンの９９．３０％低減を示した（図１７）。総フィトエスト
ロゲンは、試料＃１において９８．２５％、試料＃２において９８．５７％、試料＃３に
おいて９９．０７％低減した（図１９）。
【0043】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、関連する値が、別段示されない限り、プラ
スまたはマイナス５パーセント（＋／－５％）修正され得、開示される実施形態の範囲内
に留まることを示す。
スまたはマイナス５パーセント（＋／－５％）修正され得、開示される実施形態の範囲内
に留まることを示す。
【0044】
本明細書に開示される本発明の代替的要素または実施形態のグループ化は、限定として
解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、またはグループの他のメンバ
ーまたは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで参照され、特許請求され
得る。グループの１つ以上のメンバーが、利便性および／または特許性の理由でグループ
に含まれるか、グループから削除され得ることが、予想される。任意のそのような包含ま
たは削除が生じる際、本明細書は、修正されたグループを含むように本明細書でみなされ
、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのＭａｒｋｕｓｈグルー
プの書面による記載を満たす。
解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、またはグループの他のメンバ
ーまたは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで参照され、特許請求され
得る。グループの１つ以上のメンバーが、利便性および／または特許性の理由でグループ
に含まれるか、グループから削除され得ることが、予想される。任意のそのような包含ま
たは削除が生じる際、本明細書は、修正されたグループを含むように本明細書でみなされ
、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのＭａｒｋｕｓｈグルー
プの書面による記載を満たす。
【0045】
別段示されない限り、核酸またはオリゴヌクレオチドは、５’から３’の配向で左から
右に書かれる。
右に書かれる。
【0046】
「本明細書」、「上記」、および「下記」という単語、ならびに同様の意味の単語は、
本出願において使用される際、別段示されない限り、本出願全体を指し、本出願の任意の
特定の部分を指すものではない。本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」と
いう単語は、記載された値の周り、通常は、記載された値の１０％以内などの標準的な誤
差の範囲内でのわずかな変動を含む。
本出願において使用される際、別段示されない限り、本出願全体を指し、本出願の任意の
特定の部分を指すものではない。本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」と
いう単語は、記載された値の周り、通常は、記載された値の１０％以内などの標準的な誤
差の範囲内でのわずかな変動を含む。
【0047】
本明細書で参照される参照特許、特許出願、および科学的文献は、各個々の刊行物、特
許または特許出願が、参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されているか
のように、それらの全体の参照によって本明細書に組み込まれる。
許または特許出願が、参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されているか
のように、それらの全体の参照によって本明細書に組み込まれる。
【0048】
本発明の好ましい実施形態が、例示され、記載されている一方で、様々な変更が本発明
の主旨および範囲から逸脱することなくその中で行われ得ることを理解されたい。
の主旨および範囲から逸脱することなくその中で行われ得ることを理解されたい。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図3-6】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変されていないダイズ植物、植物部分、または植物細胞と比較して低減したイソフラボン含有量を有するダイズ植物、植物部分、または植物細胞であって、前記ダイズ植物、植物部分、または植物細胞が、１つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子のコード領域において１つ以上の変異を含み、前記植物、植物部分、または植物細胞が、前記改変されていないダイズ植物におけるＩＦＳ１またはＩＦＳ２遺伝子発現と比較して、前記１つまたは両方のＩＦＳ１およびＩＦＳ２遺伝子の低減した発現によって特徴付けられる、ダイズ植物、植物部分、または植物細胞。